KR20230155047A - Anticancer composition comprising nanoparticles-core and CpG-oligodeoxynucleotide coated on the surface - Google Patents
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Abstract
본 발명은 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 및 표면에 코팅된 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 암 치료 및 예방에서 본 발명의 조성물을 이용하는 경우 대상의 면역세포를 활성화시킬 수 있으므로 효과적인 면역 요법을 수행할 수 있다.The present invention relates to an anticancer composition comprising a nanoparticle core containing manganese and tannic acid and CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface. When the composition of the present invention is used in cancer treatment and prevention, effective immunotherapy can be performed because the target's immune cells can be activated.
Description
본 발명은 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 및 표면에 코팅된 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an anticancer composition comprising a nanoparticle core containing manganese and tannic acid and CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface.
암 치료에 있어서 면역세포의 활성 조절은 중요하다. 암 면역 요법은 면역 체계를 이용해 암을 치료하는 것이다. 면역 요법은 암 전이와 재발을 줄이는 데 상당한 이점이 있다. Controlling the activity of immune cells is important in cancer treatment. Cancer immunotherapy uses the immune system to treat cancer. Immunotherapy has significant benefits in reducing cancer metastasis and recurrence.
항원제시세포(antigen presenting cell, APC)의 한 유형인 대식세포는 감염과 암에 대한 1차 방어선을 활성화하는 데 도움이 되는 타고난 면역 체계에서 중요한 역할을 한다. 인터페론 유전자 자극기(Stimulator of interferon genes, STING) 경로를 통한 대식세포의 자극을 포함하여 대식세포의 M1 분극화를 위한 다양한 면역자극제가 효과적인 면역요법에 사용될 수 있다. 대식세포의 소포체 표면에 위치한 STING 단백질은 TBK1, IRF3 및 NF-κB를 포함한 경로를 활성화하여 타입1 인터페론을 방출한다.Macrophages, a type of antigen presenting cell (APC), play an important role in the innate immune system, helping to activate the first line of defense against infection and cancer. A variety of immunostimulants for M1 polarization of macrophages, including stimulation of macrophages via the stimulator of interferon genes (STING) pathway, can be used for effective immunotherapy. STING protein, located on the surface of the endoplasmic reticulum of macrophages, activates pathways including TBK1, IRF3, and NF-κB to release type 1 interferons.
타입1 인터페론은 암 세포 증식 억제, 수지상 세포 성숙, NK 세포 활성화 및 기억 면역 세포 확장과 같은 암 면역 요법에서 다양한 생물학적 역할을 수행한다. Mn 이온은 최근 cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)를 직접 활성화하는 것으로 밝혀졌다. 반면에 Mn 이온의 종양내 직접 주사는 APC에 효과적으로 분포하기 어렵고 다른 조직 및 기관으로 빠르게 확산될 수 있어 전신 손상의 위험이 증가한다. 결과적으로 나노 입자를 사용하여 APC에 Mn 이온을 전달하면 APC 프라이밍의 효율성을 높이면서 부작용을 최소화할 수 있다.Type 1 interferons play diverse biological roles in cancer immunotherapy, such as inhibiting cancer cell proliferation, dendritic cell maturation, NK cell activation, and memory immune cell expansion. Mn ions were recently found to directly activate cyclic GMP-AMP synthase (cGAS). On the other hand, direct intratumoral injection of Mn ions is difficult to effectively distribute to APCs and can rapidly spread to other tissues and organs, increasing the risk of systemic damage. As a result, delivering Mn ions to APC using nanoparticles can increase the efficiency of APC priming while minimizing side effects.
암 치료를 위한 면역요법에서 면역세포의 활성화를 위해 많은 양의 면역활성인자를 주입해주어야 하는데, 이는 체내에서 사이토카인 스톰을 유발할 수 있다는 임상적 한계가 있다. In immunotherapy for cancer treatment, a large amount of immune activating factors must be injected to activate immune cells, but this has a clinical limitation in that it can cause a cytokine storm in the body.
기존의 이러한 암 면역 치료의 한계를 극복하기 위해, 암-면역 주기를 시작하기 위한 항원제시세포의 프라이밍이 중요하다. 따라서 면역세포를 활성화시킬 수 있는 금속 이온 및 핵산을 세포내에 효과적으로 전달할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.To overcome these limitations of existing cancer immunotherapy, priming of antigen-presenting cells to initiate the cancer-immunity cycle is important. Therefore, there is a need to develop technology that can effectively deliver metal ions and nucleic acids that can activate immune cells into cells.
본 발명자들은 효과적인 암 면역 요법을 위해 대상에 투여하여 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 나노입자를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드로 코팅된, 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어를 대상에 투여하는 경우, 대상의 면역 반응을 활성화시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have made extensive research efforts to develop nanoparticles that can activate immune responses by administering to a subject for effective cancer immunotherapy. As a result, the present invention was completed by demonstrating that the immune response of a subject can be activated when a nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-oligodeoxynucleotide is administered to the subject.
따라서, 본 발명의 목적은 배위 결합된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어; 및 상기 나노입자-코어의 표면에 코팅된 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is a nanoparticle-core comprising coordinated manganese and tannic acid; and CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface of the nanoparticle-core.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 배위 결합된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어; 및 상기 나노입자-코어의 표면에 코팅된 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a nanoparticle-core comprising coordinated manganese and tannic acid; and CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface of the nanoparticle-core.
본 발명자들은 효과적인 암 면역 요법을 위해 대상에 투여하여 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 나노입자를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어를 대상에 투여하는 경우, 대상의 면역 반응을 활성화시킬 수 있음을 규명하였다.The present inventors have made extensive research efforts to develop nanoparticles that can activate immune responses by administering to a subject for effective cancer immunotherapy. As a result, it was found that when a nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) is administered to a subject, the subject's immune response can be activated.
본 명세서 상의 실시예에 사용된 용어 "CMP(CpG-ODN coated Mn-phenolic network) 나노입자"는 "CpG-올리고디옥시뉴클레오티드로 코팅된, 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어"를 의미한다. As used in the examples herein, the term “CMP (CpG-ODN coated Mn-phenolic network) nanoparticle” means “nanoparticle-core comprising manganese and tannic acid, coated with CpG-oligodeoxynucleotide” .
본 명세서 상의 실시예에 사용된 용어 "Mn-PN 나노입자"는 "망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어"를 의미한다. The term "Mn-PN nanoparticle" used in the examples herein means "nanoparticle-core containing manganese and tannic acid."
본 발명의 나노입자-코어에 포함되는 "망간"은 이온화된 상태인 것을 포함하고, 보다 구체적으로 2가 양이온 상태일 수 있다. 망간 양이온 입자는 탄닌산에 포함된 히드록시기와 배위결합을 형성하고, 이를 통해 구형상의 코어 입자를 형성할 수 있다. 상술한 구형상의 코어 입자는 나노 사이즈를 가지며, 상기 나노 사이즈는 구체적으로 예를 들면, 수 나노미터 내지 수십 나노미터의 사이즈를 의미한다. “Manganese” included in the nanoparticle-core of the present invention may be in an ionized state, and more specifically, may be in a divalent cation state. Manganese cation particles form a coordination bond with the hydroxyl group contained in tannic acid, and through this, spherical core particles can be formed. The spherical core particles described above have a nano size, and the nano size specifically refers to a size of several nanometers to tens of nanometers, for example.
본 발명의 나노입자-코어에 포함되는 "탄닌산"은 폴리페놀의 일종인 탄닌의 특정 형태를 말하며 복수의 페놀 그룹을 가진다. 탄닌산의 히드록시기는 망간 이온과 배위 결합하여 구형의 나노입자-코어를 형성할 수 있고, 나노입자-코어 표면의 탄닌산의 히드록시기는 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드와 수소결합을 형성하여 나노입자-코어가 코팅될 수 있다.“Tannic acid” included in the nanoparticle-core of the present invention refers to a specific form of tannin, a type of polyphenol, and has a plurality of phenol groups. The hydroxyl group of tannic acid can form a spherical nanoparticle-core by coordinating with manganese ions, and the hydroxyl group of tannic acid on the surface of the nanoparticle-core forms a hydrogen bond with CpG-oligodeoxynucleotide and the nanoparticle-core is coated. It can be.
본 발명의 나노입자-코어에 포함된 Mn 이온과 탄닌산의 몰비는 예를 들면, 3:1 내지 1:3일 수 있다. 더욱 구체적으로 예를 들면, 상기 Mn 이온과 탄닌산의 몰비는 2:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 또는 3:1 내지 1:2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The molar ratio of Mn ions and tannic acid included in the nanoparticle-core of the present invention may be, for example, 3:1 to 1:3. More specifically, for example, the molar ratio between Mn ions and tannic acid may be 2:1 to 1:3, 2:1 to 1:2, or 3:1 to 1:2, but is not limited thereto.
본 발명의 나노입자-코어는 Mn 이온과 탄닌산이 혼합된 상태에서 pH를 상승시킴으로서 입자화시켜 제조할 수 있다. 보다 구체적으로 예를 들면, pH를 7 내지 9로 증가시켜 제조할 수 있고, 보다 더 구체적으로 pH를 7 내지 8.5, 7내지 8, 또는 7내지 7.5로 증가시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The nanoparticle-core of the present invention can be manufactured by granulating a mixture of Mn ions and tannic acid by increasing the pH. More specifically, for example, it can be prepared by increasing the pH to 7 to 9, and more specifically, the pH can be increased to 7 to 8.5, 7 to 8, or 7 to 7.5, but is not limited thereto.
본 발명의 나노입자-코어는 세포내에 유입된 후 세포내 pH 구배에 의해 분해될 수 있다. 구체적으로, pH가 감소함에 따라 나노입자-코어가 분해되어 망간 이온을 방출할 수 있다. 더욱 구체적으로 감소된 pH는 5 내지 7.5, 5 내지 7, 또는 5 내지 6일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The nanoparticle-core of the present invention can be decomposed by intracellular pH gradient after being introduced into cells. Specifically, as pH decreases, the nanoparticle-core may decompose and release manganese ions. More specifically, the reduced pH may be 5 to 7.5, 5 to 7, or 5 to 6, but is not limited thereto.
본 발명의 항암용 조성물에 포함되는 "CpG-올리고디옥시뉴클레오타이드(CpG-Oligodeoxynucleotide, CpG-ODN)"는, 시토신 삼인산 디옥시뉴클레오타이드(C), 구아닌 삼인산 데옥시뉴클레오티드(G), 및 연속적인 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 연결(p)을 포함하는 짧은 단일 가닥 합성 DNA 분자를 말한다. CpG 모티프는 미생물 지놈에는 풍부하지만 척추동물 지놈에서는 드물기 때문에 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)으로 간주되고, CpG PAMP는 패턴 인식 수용체인 Toll-Like Receptor 9(TLR9)에 의해 인식되어 면역반응을 유도할 수 있다. 예를 들면, 구체적으로 대식세포 M1 분극을 유도해 면역반응을 유도할 수 있다.“CpG-Oligodeoxynucleotide (CpG-ODN)” included in the anti-cancer composition of the present invention includes cytosine triphosphate deoxynucleotide (C), guanine triphosphate deoxynucleotide (G), and consecutive nucleotides. refers to a short, single-stranded synthetic DNA molecule containing phosphodiester linkages (p) between CpG motifs are abundant in microbial genomes but rare in vertebrate genomes, so they are considered pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), and CpG PAMPs are recognized by Toll-Like Receptor 9 (TLR9), a pattern recognition receptor. It can induce an immune response. For example, an immune response can be induced by specifically inducing macrophage M1 polarization.
본 명세서의 용어 "항암용 조성물"이란 암의 예방, 개선, 또는 치료에 사용될 수 있는 조성물을 말한다.As used herein, the term “anti-cancer composition” refers to a composition that can be used to prevent, improve, or treat cancer.
본 명세서의 용어 '예방'은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서의 용어 '치료'는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.The term 'prophylaxis' herein refers to the prevention or protective treatment of a disease or disease state. The term 'treatment' herein means reducing, suppressing, soothing or eradicating a disease state.
본 발명의 항암용 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the anticancer composition of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, Includes, but is limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. It doesn't work.
본 발명의 항암용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.In addition to the above components, the anticancer composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 항암용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The anti-cancer composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
본 발명의 조성물이 항암용 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 유효성분의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량% 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.When the composition of the present invention is used as an anti-cancer composition, the content of the active ingredient in the composition can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the patient's condition, etc., for example, 0.0001 to 99.9 based on the total weight of the composition. It may be included in weight percent, but is not limited thereto. The content ratio is a value based on the dry amount with the solvent removed.
본 발명의 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)는 나노입자-코어의 표면 상에 코팅되는 것을 특징으로 한다. 나노입자-코어의 표면 상에 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)가 코팅된다는 것의 의미는 구형의 나노입자-코어 외측의 탄닌산이 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드와 결합함을 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 상기 결합은 화학적 결합 또는 소수성상호작용일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) of the present invention is characterized in that it is coated on the surface of the nanoparticle-core. The fact that CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) is coated on the surface of the nanoparticle-core means that the tannic acid on the outside of the spherical nanoparticle-core binds to the CpG-oligodeoxynucleotide. Specifically, for example, the bond may be a chemical bond or a hydrophobic interaction, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CpG-ODN은 상기 나노입자-코어의 표면에 수소 결합에 의해 결합된 것이다. 본 발명의 수소 결합은 본 발명의 CpG-ODN에 포함된 인산염 부분의 산소 원자와 탄닌산에 포함된 히드록시기 사이에 형성된 수소 결합일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the CpG-ODN is bound to the surface of the nanoparticle-core by hydrogen bonding. The hydrogen bond of the present invention may be a hydrogen bond formed between the oxygen atom of the phosphate moiety contained in the CpG-ODN of the present invention and the hydroxy group contained in tannic acid, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CpG-ODN에 대한 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 중량비는 예를 들어, 1.0 내지 10.0인 것이다. 더 구체적으로 CpG-ODN에 대한 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 중량비는 1.0 내지 10.0, 1.0 내지 9.5, 1.0 내지 9.0, 1.0 내지 8.5, 1.0 내지 8.0, 1.0 내지 7.5, 1.0 내지 7.0, 1.0 내지 6.5, 1.0 내지 6.0, 1.0 내지 5.5, 1.0 내지 5.0, 1.0 내지 4.5, 1.0 내지 4.0, 1.0 내지 3.5, 1.0 내지 3.0, 1.0 내지 2.5, 1.0 내지 2.0, 1.0 내지 1.5, 1.5 내지 10.0, 2.0 내지 10.0, 2.5 내지 10.0, 3.0 내지 10.0. 3.5 내지 10.0, 4.0 내지 10.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 10.0, 5.5 내지 10.0, 6.0 내지 10.0, 6.5 내지 10.0, 7.0 내지 10.0, 7.5 내지 10.0, 8.0 내지 10.0, 8.5 내지 10.0, 9.0 내지 10.0, 또는 9.5 내지 10.0 일 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the weight ratio of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid to the CpG-ODN is, for example, 1.0 to 10.0. More specifically, the weight ratio of nanoparticle-core comprising manganese and tannic acid to CpG-ODN is 1.0 to 10.0, 1.0 to 9.5, 1.0 to 9.0, 1.0 to 8.5, 1.0 to 8.0, 1.0 to 7.5, 1.0 to 7.0, 1.0. to 6.5, 1.0 to 6.0, 1.0 to 5.5, 1.0 to 5.0, 1.0 to 4.5, 1.0 to 4.0, 1.0 to 3.5, 1.0 to 3.0, 1.0 to 2.5, 1.0 to 2.0, 1.0 to 1.5, 1.5 to 10.0, 2.0 to 10.0 , 2.5 to 10.0, 3.0 to 10.0. 3.5 to 10.0, 4.0 to 10.0, 4.5 to 10.0, 5.0 to 10.0, 5.5 to 10.0, 6.0 to 10.0, 6.5 to 10.0, 7.0 to 10.0, 7.5 to 10.0, 8.0 to 10.0, 8.5 to 10.0, 9.0 to 10.0, or 9.5 It may be from 10.0 to 10.0. However, it is not limited to this.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 코팅된 CpG-ODN에 대한 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 중량비는 2.0 내지 2.5인 것이다. 상술한 중량비의 범위에서 CpG-ODN이 코팅된 나노입자-코어가 성공적으로 형성될 수 있다. 더 구체적으로 예를 들면, 상술한 중량비의 범위에서 CpG-ODN이 코팅된 나노입자-코어를 높은 수율로 획득할 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the weight ratio of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid to the coated CpG-ODN is 2.0 to 2.5. In the range of the above-mentioned weight ratio, CpG-ODN-coated nanoparticle-cores can be successfully formed. More specifically, for example, CpG-ODN-coated nanoparticle-cores can be obtained in high yield within the above-described weight ratio range. However, it is not limited to this.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CpG-ODN으로 코팅된 나노입자-코어의 지름은 40 내지 50 nm인 것이다. 코팅되지 않는 나노입자-코어의 지름은 약 40nm로, CpG-ODN으로 나노입자-코어를 코팅하더라도 입자의 크기가 크게 변하지 않아 여전히 세포내에 유입되어 면역반응을 활성화시킬 수 있음을 의미한다.In one embodiment of the present invention, the nanoparticle-core coated with CpG-ODN The diameter is 40 to 50 nm. The diameter of the uncoated nanoparticle-core is about 40 nm, which means that even if the nanoparticle-core is coated with CpG-ODN, the size of the particle does not change significantly, so it can still enter the cell and activate the immune response.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암용 조성물은 면역세포를 활성화하는 것이다. In one embodiment of the present invention, the anti-cancer composition activates immune cells.
본 명세서의 용어 "면역세포를 활성화"의 의미는 예를 들면, 면역세포내로 유효물질의 성공적인 유입, 항원제시 세포의 프라이밍, 대식세포의 분극 활성, 면역세포의 사이토카인 또는 케모카인의 분비, 면역세포에 의한 종양 세포의 면역성 세포사(IDC) 유도, 종양 미세환경의 억제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 구체적으로 사이토카인은 인터페론일 수 있다. 본 명세서의 용어 "타입1 인터페론(IFN)"은 염증, 면역 조절, 종양 세포 인식 및 T 세포 반응에서 중요한 역할을 하는 사이토카인을 말한다. 타입1 인터페론은 암 치료에서 면역 치료제의 작용과 관련이 있다.The term “activating immune cells” in the present specification means, for example, successful entry of an effective substance into immune cells, priming of antigen-presenting cells, polarization activity of macrophages, secretion of cytokines or chemokines of immune cells, and immune cells. It may be, but is not limited to, induction of immune cell death (IDC) of tumor cells and suppression of the tumor microenvironment. More specifically, the cytokine may be interferon. The term “type 1 interferon (IFN)” herein refers to a cytokine that plays an important role in inflammation, immune regulation, tumor cell recognition, and T cell response. Type 1 interferons are associated with the action of immunotherapeutics in cancer treatment.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암용 조성물을 적용할 수 있는 암은 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암으로 이루어진 군에서 선택되는 암인 것이다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the cancers to which the anti-cancer composition can be applied are breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, and cervical cancer. , it is a cancer selected from the group consisting of brain cancer, prostate cancer, bone cancer, head and neck cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, and ureteral cancer. However, it is not limited to this.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암용 조성물은 비가역적 전기천공법(Irreversible Electroporation, IRE) 치료 대상(subject)에 적용하기 위한 것인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the anti-cancer composition is characterized in that it is applied to a subject treated by irreversible electroporation (IRE).
본 명세서의 용어 "비가역적 전기천공법(Irreversible Electroporation, IRE)"은 몇 마이크로초의 짧은 고전압 전기 펄스를 사용하는 비열 제거 기술로, 암세포막에 영구적인 나노크기 구멍을 생성하여 암세포 사멸을 유도하는 기술을 말한다. IRE는 면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death, ICD)을 유도하여 종양 세포에서 종양 관련 항원(tumor-associated antigens, TAA) 및 손상 분자 패턴(damage-associated molecular pattern, DAMP)의 방출을 유도할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 비가역적 전기천공법(IRE)는 양극성 또는 단극성 일 수 있으며, 40 내지 80 펄스 일 수 있다.The term "irreversible electroporation (IRE)" herein is a non-thermal removal technology that uses short high-voltage electric pulses of a few microseconds, a technology that induces cancer cell death by creating permanent nano-sized holes in the cancer cell membrane. says IRE can induce immunogenic cell death (ICD), leading to the release of tumor-associated antigens (TAA) and damage-associated molecular patterns (DAMPs) from tumor cells. . Specifically, in the present invention, irreversible electroporation (IRE) may be bipolar or unipolar, and may have 40 to 80 pulses.
본 명세서에서 IRE 치료 대상에 적용된다는 것의 의미는 IRE 치료를 받은 대상, IRE 치료를 받을 예정인 대상, 또는 IRE 치료를 받았고 향후 추가적인 IRE 치료를 받을 예정인 대상에 적용되는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 항암용 조성물은 독성이 없는 범위에서의 IRE 치료를 받았거나 또는 IRE 치료가 예정된 환자에 대해 독성이 없는 범위의 CpG-ODN으로 코팅된 나노입자-코어를 처리했을 때, 개별 IRE 처리 또는 CpG-ODN으로 코팅된 나노입자-코어 단독 처리에서 나타나지 않았던 독성 또는 부작용이 나타나지 않음을 확인하였고, 또한, 개별 IRE 처리 또는 CpG-ODN으로 코팅된 나노입자-코어 단독 처리보다 치료효과가 높아짐을 확인하였다. In this specification, applying to a subject of IRE treatment means applying to a subject who has received IRE treatment, a subject who is scheduled to receive IRE treatment, or a subject who has received IRE treatment and is scheduled to receive additional IRE treatment in the future. The anti-cancer composition according to an embodiment of the present invention is used when treating patients who have received IRE treatment in a non-toxic range or are scheduled for IRE treatment with a nanoparticle-core coated with CpG-ODN in a non-toxic range. , it was confirmed that no toxicity or side effects that did not appear in individual IRE treatment or CpG-ODN-coated nanoparticle-core treatment alone were observed. In addition, it was confirmed that treatment was more effective than individual IRE treatment or CpG-ODN-coated nanoparticle-core treatment alone. It was confirmed that the effect increased.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암용 조성물은 대상(subject)이 비가역적 전기천공법 치료를 받은 시점으로부터 48시간 전후 이내에 대상에 투여되기 위한 것인 것을 특징으로 한다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 항암용 조성물은 대상(subject)이 비가역적 전기천공법 치료를 받은 시점으로부터 36시간 전후 이내, 32시간 전후 이내, 28시간 전후 이내, 26시간 전후 이내, 또는 24시간 전후 이내에 투여될 수 있다. 보다 더 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 항암용 조성물은 대상이 IRE 치료를 받은 시점으로부터 30분 내지 48시간 전, 30분 내지 36시간 전, 30분 내지 32시간 전, 30분 내지 28시간 전, 30분 내지 26시간 전, 또는 30분 내지 24시간 전에 사전 투여될 수 있다. 또는 본 발명의 항암용 조성물은 대상이 IRE 치료를 받은 시점으로부터 30분 내지 48시간 후, 30분 내지 36시간 후, 30분 내지 32시간 후, 30분 내지 28시간 후, 30분 내지 26시간 후, 또는 30분 내지 24시간 후에 사후 투여될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the anti-cancer composition is intended to be administered to a subject within 48 hours or less from the time the subject receives irreversible electroporation treatment. Specifically, for example, the anticancer composition of the present invention is applied within 36 hours, within 32 hours, 28 hours, 26 hours, or 24 hours from the time the subject receives irreversible electroporation treatment. It may be administered within an hour or so. More specifically, for example, the anti-cancer composition of the present invention is applied 30 minutes to 48 hours before, 30 minutes to 36 hours before, 30 minutes to 32 hours before, or 30 minutes to 28 hours before the subject receives IRE treatment. , may be pre-administered 30 minutes to 26 hours in advance, or 30 minutes to 24 hours in advance. Alternatively, the anticancer composition of the present invention is applied 30 minutes to 48 hours, 30 minutes to 36 hours, 30 minutes to 32 hours, 30 minutes to 28 hours, or 30 minutes to 26 hours from the time the subject receives IRE treatment. , or can be administered 30 minutes to 24 hours later.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항암용 조성물의 투여는 단회 또는 복수회 투여인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 항암용 조성물은 IRE 치료 대상에 대해 상술한 시간 범위 내에서 사전 또는 사후 투여될 수 있으며, 상기 사전 또는 사후 투여는 IRE 치료 전 또는 후에 택일적으로 단회 투여될 수 있고, IRE 치료 전 및/또는 후에 복수회 투여될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the anticancer composition of the present invention is administered single or multiple times. The anti-cancer composition of the present invention may be administered pre- or post-administration within the above-described time range for the IRE treatment target, and the pre- or post-administration may be alternatively administered as a single dose before or after IRE treatment, and before and after IRE treatment. /Or it may be administered multiple times later.
본 발명에 따른 IRE 적용대상에 대한 항암용 조성물의 투여는 IRE 적용 전후 48시간, 36시간, 24시간 이내에 투여 일 수 있고, 복수회 투여인 경우, 적어도 1회의 투여가 상술한 시간내에 투여되는 것으로 족하며, 전부 상술한 시간 내에 투여될 필요는 없고, 상술한 시간 범위 외의 시점에서도 추가적인 약물 투여가 이루어질 수 있다. The anti-cancer composition for IRE application according to the present invention may be administered within 48 hours, 36 hours, or 24 hours before or after IRE application, and in the case of multiple administrations, at least one administration is administered within the above-mentioned time. It is sufficient, and it is not necessary to administer all of them within the above-mentioned time, and additional drug administration may be performed at times outside the above-mentioned time range.
본 발명의 항암용 조성물은 IRE 치료와 병행시 면역 치료 요법상의 이점을 갖는다. 구체적으로 예를 들면, 개별 IRE 치료 또는 CpG-ODN으로 코팅된 나노입자-코어의 투여보다 대상의 면역 기능 활성화 능력이 뛰어날 수 있다. 더 구체적으로 활성화된 면역세포의 양이 증가할 수 있으며, 종양으로 유입되는 면역세포의 유입량이 늘어날 수 있으며, 종양에 유입된 면역세포의 체류시간이 늘어날 수 있으며, 각 장기에서 망간 이온의 잔류 시간이 증가할 수 있으며, 종양의 성장 속도가 감소할 수 있으며, 면역세포가 분비하는 사이토 카인 및 케모카인의 분비량이 증가할 수 있으며, 대상의 생존율이 증가할 수 있다. 다만, 이에 한정되지는 않는다. The anti-cancer composition of the present invention has advantages in immunotherapy when combined with IRE treatment. Specifically, for example, the ability to activate a subject's immune function may be superior to that of individual IRE treatment or administration of nanoparticle-cores coated with CpG-ODN. More specifically, the amount of activated immune cells may increase, the amount of immune cells flowing into the tumor may increase, the residence time of immune cells flowing into the tumor may increase, and the residence time of manganese ions in each organ may increase. may increase, the growth rate of the tumor may decrease, the amount of cytokines and chemokines secreted by immune cells may increase, and the subject's survival rate may increase. However, it is not limited to this.
본 발명에 항암용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수해/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. In the present invention, the anti-cancer composition is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, an effective amount refers to an amount sufficient to treat a disease with a reasonable harm/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level refers to the type of patient's disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, and administration. This may depend on factors including time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
상기 항암용 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 나이, 성별, 체중, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 따라 달라질 수 있으며, 나노입자가 암 치료에 유용한 혈중 농도가 되도록 충분한 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 본 발명의 항암용 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. The dosage of the anticancer composition may vary depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, gender, weight, pathological condition, food, administration time, excretion rate, and reaction sensitivity, and the nanoparticles may be used to control cancer. A sufficient amount can be administered once or several times daily to achieve a blood concentration useful for treatment. The dosage of the anticancer composition of the present invention is preferably 0.001-1000 mg/kg (body weight) per day. However, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
상기 조성물의 유효성분인 배위 결합된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어; 및 상기 나노입자-코어의 표면에 코팅된 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)의 농도는 예를 들면, 1 내지 10μg/mL 투여될 수 있다. 다만 이에 한정되는 것은 아니다.Nanoparticle-core containing coordinated manganese and tannic acid, which are active ingredients of the composition; And the concentration of CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface of the nanoparticle-core may be administered, for example, from 1 to 10 μg/mL. However, it is not limited to this.
본 발명의 항암용 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 뇌내 투여, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 불점막 투여, 직장 내삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 본 발명의 항암용 조성물은 비경구 투여시, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주사 방법(injection)으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.The anti-cancer composition of the present invention can be administered to an individual through various routes. All modes of administration are contemplated, including intracerebral administration, oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, intramucosal administration, and intrarectally. It can be administered by insertion, vaginal insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, etc. The anti-cancer composition of the present invention can be administered parenterally, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or local administration. In the case of intraperitoneal administration for ovarian cancer and the portal vein for liver cancer, it can be administered by injection; in the case of breast cancer, it can be administered by direct injection into the tumor mass; and in the case of colon cancer, it can be administered directly through an enema. It can be administered by injection, and in the case of bladder cancer, it can be administered by direct injection into a catheter.
본 발명에 따른 항암용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The anti-cancer composition according to the present invention may be administered as an individual treatment or in combination with other treatments, may be administered sequentially or simultaneously with conventional treatments, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
본 발명은 배위 결합된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어; 및 상기 나노입자-코어의 표면에 코팅된 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다. 암 치료 및 예방에서 본 발명의 조성물을 이용하는 경우 대상의 면역세포를 활성화시킬 수 있으므로 효과적인 면역 요법을 수행할 수 있다.The present invention relates to a nanoparticle-core comprising coordinated manganese and tannic acid; and CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface of the nanoparticle-core. When the composition of the present invention is used in cancer treatment and prevention, effective immunotherapy can be performed because the target's immune cells can be activated.
도 1은 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 제작 방법과 IRE 치료 대상에 대한 항암용 조성물의 작용 방법 및 작용 기작을 나타낸 모식도이다.
도 2는 CpG-올리고디옥시뉴클레오티드(CpG-ODN)로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 특성을 나타낸다. a)는 다양한 금속이온을 통한 면역세포에서의 타입1 인터페론 분비량을 확인한 것이다. b)는 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 형태를 확인한 것이다. c) Mn 이온과 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 타입1 인터페론 분비 유도 효과 확인한 것이다. d)는 겔 지연을 통한 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 CpG-ODN의 접합비율을 확인한 것이다. e)는 CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 형태를 확인한 것이다. f)는 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 표면전하를 확인한 것이다 g)는 pH에 따른 CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 Mn 이온 방출을 확인한 것이다.
도 3은 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어에 의한 대식세포의 시험관 내 활성화를 나타낸다. a)는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 면역세포 독성을 평가한 것이다. b)는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 타입1 인터페론 분비 유도 효과를 확인한 것이다. c) Mn 이온과 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 세포내 유입을 확인한 것이다. d)는 CpG-ODN과 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 세포내 유입을 확인한 것이다. e)는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 면역세포 활성화 정도를 확인한 것이다. f)는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 면역세포 사이토카인 방출을 확인한 것이다.
도 4는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어에 의한 골수 수지상 세포(BMDC)의 시험관 내 활성화를 나타낸다. a)는 BMDC의 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 다양한 농도의 망간(Mn)에서 세포 생존력을 시험한 것이다. b)는 B16-Blue IFN-α/β 리포터 세포 분석을 사용한 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어에 의한 타입1 인터페론 분비를 정량적으로 평가한 것이다. C)는 BMDC에서 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 처리에 의한 BMDC 활성화 마커를 측정한 것이다.
도 5는 비가역적 전기천공법(IRE)에 의한 세포독성 및 면역원성 세포 사멸(ICD) 유도를 나타낸다. a)는 IRE 조건별 암세포의 독성을 확인한 것이다. b)는 IRE 조건별 암세포 독성범위를 확인한 것이다. c)는 IRE 조건별 DAMPs 방출을 확인한 것이다. d)는 in vivo 종양모델에서의 IRE 조건별 유전자 발현을 확인한 것이다.
도 6은 마우스 종양 모델에서 1000V의 단극성 및 양극성 비가역적 전기천공법(IRE)에 의한 면역 세포 및 암세포 증식과 관련된 유전자 발현의 히트맵을 나타낸다.
도 7은 마우스 CT26 종양 모델에서 단극성 또는 양극성 펄스 하에서 비가역적 전기천공(IRE)의 생체내 항종양 치료 효과를 나타낸다. a)는 단극성 및 양극성 IRE의 생체 내 IRE 치료 일정을 나타낸다. b)는 IRE 치료 후 개별 종양 성장 정도를 측정한 것이다. c)는 단극성 또는 양극성 IRE 치료 후 생존율을 측정한 것이다. d)는 마우스 CT26 종양 모델에서 단극성 또는 양극성 IRE 치료 중 마우스의 생체내 평균 체중의 변화를 나타낸다.
도 8은 마우스 종양 모델에서 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 생체 종양 내 체류시간을 나타낸다. a)는 in vivo 종양 모델에서의 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 체류시간을 나타낸다. b)는 in vivo 종양 모델에서의 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 체류를 형광을 이용해 정량한 것이다. c)는 in vivo 종양 모델에서의 Mn 이온의 체류 시간을 확인한 것이다.
도 9는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 양극성 비가역 전기천공법(IRE)의 조합 처리 후 다양한 장기에서 Mn 이온의 생체 분포를 분석한 것이다. Mn 이온의 생체 분포는 처리 72시간 후에 분석되었다.
도 10은 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 양극성 비가역적 전기천공법(IRE)의 조합에 의한 생체 내 항종양 치료 효과를 측정한 것이다. a)는 동물실험 일정을 나타낸다. b) 및 c)는 그룹별 종양성장을 확인한 것이다. d)는 그룹별 생존율을 확인한 것이다.
도 11은 마우스 CT26 종양 모델에서 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 양극성 비가역적 전기천공법(IRE)의 조합 처리 중 마우스의 생체내 평균 체중의 변화를 측정한 것이다.
도 12는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 양극성 비가역 전기천공법(IRE)을 함께 처리한 후 혈액을 생화학 분석한 것이다.
도 13은 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 및 양극성 비가역적 전기천공법(IRE)의 적용 후 종양 침투 면역 세포의 생체 내 분석을 나타낸다. a)는 IRE 치료를 위한 생체 내 실험 일정을 나타낸다. b)는 IRE 처리 후 종양 조직에서 죽은세포(Zombie+), 대식세포(CD11b+), 죽은 대식세포(CD11b+Zombie+)의 비율을 나타낸 것이다. c)는 IRE, CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어, IRE와 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 병용 치료에 대한 생체 내 실험 일정을 나타낸다. d)는 처리 후 종양 조직에서 대식세포(CD11b+) 및 M1 극성화된 대식세포(CD11b+CD80+ 또는 CD11b+CD86+)의 비율을 나타낸다. e)는 cGAS/STING 경로의 개략도를 나타낸다. f)는 IRE, CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어, IRE와 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 조합 처리 후 종양 용해물의 면역블롯팅을 나타낸다. g)는 치료(IRE, CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어, 또는 IRE와 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 조합 치료) 후 종양 조직에서 방출되는 타입1 인터페론의 정량적 평가를 나타낸다. h)는 IRE와 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 조합 처리 후 종양 조직에서 CD80 양성 면역 세포의 공초점 현미경 이미지이다.
도 14는 CpG-ODN 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 및 양극성 비가역적 전기천공법(IRE) 적용 후 종양 침투 면역 세포의 생체 내 분석을 나타낸다.Figure 1 is a schematic diagram showing the method of manufacturing a nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) and the method and mechanism of action of the anti-cancer composition for IRE treatment targets.
Figure 2 shows the properties of nanoparticle-cores containing manganese and tannic acid coated with CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN). a) confirms the amount of type 1 interferon secretion from immune cells through various metal ions. b) confirms the shape of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid. c) The effect of the nanoparticle-core containing Mn ions, manganese, and tannic acid in inducing type 1 interferon secretion was confirmed. d) confirms the conjugation ratio of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and CpG-ODN through gel retardation. e) confirms the shape of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN. f) confirms the surface charge of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN. g) shows the surface charge of the manganese and tannic acid coated with CpG-ODN according to pH. The release of Mn ions from the nanoparticle-core containing tannic acid was confirmed.
Figure 3 shows in vitro activation of macrophages by CpG-ODN coated nanoparticle-cores containing manganese and tannic acid. a) evaluates the immune cell toxicity of the CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid. b) confirms the type 1 interferon secretion inducing effect of the CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid. c) Intracellular influx of the nanoparticle-core containing Mn ions and CpG-ODN coated manganese and tannic acid was confirmed. d) confirms the intracellular influx of CpG-ODN and CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid. e) confirms the degree of immune cell activation of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN. f) confirms the release of immune cell cytokines from the CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid.
Figure 4 shows in vitro activation of bone marrow dendritic cells (BMDCs) by CpG-ODN coated nanoparticle-cores containing manganese and tannic acid. a) is a test of cell viability at various concentrations of manganese (Mn) on CpG-ODN-coated manganese and tannic acid-containing nanoparticle-core of BMDCs. b) is a quantitative evaluation of type 1 interferon secretion by CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid using the B16-Blue IFN-α/β reporter cell assay. C) Measures BMDC activation markers by treatment of nanoparticle-cores containing CpG-ODN coated manganese and tannic acid in BMDCs.
Figure 5 shows induction of cytotoxic and immunogenic cell death (ICD) by irreversible electroporation (IRE). a) confirms the toxicity of cancer cells according to IRE conditions. b) confirms the cancer cell toxicity range by IRE condition. c) confirms the release of DAMPs according to IRE conditions. d) confirms gene expression by IRE condition in an in vivo tumor model.
Figure 6 shows a heatmap of gene expression associated with immune cell and cancer cell proliferation by 1000 V unipolar and bipolar irreversible electroporation (IRE) in a mouse tumor model.
Figure 7 shows the in vivo antitumor therapeutic effect of irreversible electroporation (IRE) under unipolar or bipolar pulses in the mouse CT26 tumor model. a) shows the in vivo IRE treatment schedule for unipolar and bipolar IRE. b) is a measurement of individual tumor growth after IRE treatment. c) is a measure of survival after unipolar or bipolar IRE treatment. d) shows changes in the in vivo average body weight of mice during unipolar or bipolar IRE treatment in the mouse CT26 tumor model.
Figure 8 shows the retention time of CpG-ODN-coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid in a mouse tumor model in vivo. a) shows the retention time of the CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid in an in vivo tumor model. b) shows the retention of CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid in an in vivo tumor model quantified using fluorescence. c) confirms the residence time of Mn ions in the in vivo tumor model.
Figure 9 analyzes the biodistribution of Mn ions in various organs after combined treatment of CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid with anodic irreversible electroporation (IRE). The biodistribution of Mn ions was analyzed after 72 hours of treatment.
Figure 10 shows the in vivo antitumor treatment effect measured by the combination of CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and bipolar irreversible electroporation (IRE). a) represents the animal testing schedule. b) and c) confirm tumor growth by group. d) confirms the survival rate by group.
Figure 11 shows changes in the average body weight of mice in vivo during combined treatment of a CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and bipolar irreversible electroporation (IRE) in the mouse CT26 tumor model.
Figure 12 shows biochemical analysis of blood after treatment with CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and bipolar irreversible electroporation (IRE).
Figure 13 shows in vivo analysis of tumor infiltrating immune cells after application of CpG-ODN coated nanoparticle-cores containing manganese and tannic acid and bipolar irreversible electroporation (IRE). a) shows the in vivo experimental schedule for IRE treatment. b) shows the ratio of dead cells (Zombie+), macrophages (CD11b+), and dead macrophages (CD11b+Zombie+) in tumor tissue after IRE treatment. c) shows the in vivo experimental schedule for the combined treatment of nanoparticle-core containing IRE, CpG-ODN coated manganese and tannic acid, and nanoparticle-core containing IRE and CpG-ODN coated manganese and tannic acid. d) shows the proportion of macrophages (CD11b+) and M1 polarized macrophages (CD11b+CD80+ or CD11b+CD86+) in tumor tissue after treatment. e) shows a schematic diagram of the cGAS/STING pathway. f) Immunoblotting of tumor lysates after combined treatment of IRE, nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN, and nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with IRE and CpG-ODN. indicates. g) Release in tumor tissue after treatment (IRE, nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN, or combination treatment of IRE and nanoparticle-core containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN) It represents the quantitative evaluation of type 1 interferon. h) Confocal microscopy image of CD80 positive immune cells in tumor tissue after combined treatment of IRE and CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid.
Figure 14 shows in vivo analysis of tumor infiltrating immune cells after CpG-ODN coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and application of bipolar irreversible electroporation (IRE).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.Throughout this specification, “%” used to indicate the concentration of a specific substance means (weight/weight) % for solid/solid, (weight/volume) % for solid/liquid, and Liquid/liquid is (volume/volume) %.
실시예 1: 실험방법Example 1: Experimental method
1-1. CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어(CMP)의 준비1-1. Preparation of nanoparticle-core (CMP) containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN.
CMP 나노입자는 다음과 같이 합성되었다. 먼저, 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어를 제조하기 위해 TA(100 mg)와 염화망간(7.4 mg)을 탈이온수(DW, 10 mL)에 녹인 후 3분간 교반하였다. 중탄산나트륨(50 mg/mL)으로 pH를 7.5로 조정하였다. 10,000g에서 10분간 원심분리한 후 미반응 화합물을 증류수로 3회 세척하였다. 이후, CMP 나노입자를 제조하기 위해 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 CpG-ODN을 2.3:1(w/w)의 비율로 혼합하여 상온에서 15분간 배양하였다. 10,000g에서 10분간 원심분리한 후 미반응 CpG-ODN을 PBS로 3회 세척하였다. 최종 CMP 나노입자를 증류수(10mL)에 재분산시켰다.CMP nanoparticles were synthesized as follows. First, to prepare nanoparticle-cores containing manganese and tannic acid, TA (100 mg) and manganese chloride (7.4 mg) were dissolved in deionized water (DW, 10 mL) and stirred for 3 minutes. The pH was adjusted to 7.5 with sodium bicarbonate (50 mg/mL). After centrifugation at 10,000 g for 10 minutes, unreacted compounds were washed three times with distilled water. Then, to prepare CMP nanoparticles, the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and CpG-ODN were mixed at a ratio of 2.3:1 (w/w) and incubated at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 10,000 g for 10 minutes, unreacted CpG-ODN was washed three times with PBS. The final CMP nanoparticles were redispersed in distilled water (10 mL).
1-2. B16-Blue IFN-α/β 리포터 유전자 분석(B16-Blue IFN-α/β reporter gene assay)1-2. B16-Blue IFN-α/β reporter gene assay
RAW 264.7 세포(3×105 세포/웰)를 48웰 플레이트에 접종했다. 12시간 후, 다양한 이온(망간, 염화망간, 염화아연, 염화알루미늄, 염화칼슘, 염화철)과 나노입자(망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어, 및 CMP 나노입자)를 0.001 mg/mL에서 0.625 mg/mL까지 다양한 농도로 처리하였다. 양성 대조군인 STING 애고니스트(agonist)는 10μg으로 처리하였다. 24시간 후, CCK-8 분석을 사용하여 RAW 264.7 세포의 세포독성을 확인하였다. B16-Blue IFN-α/β 세포(3×105개 세포/웰)를 48웰 플레이트에 접종했다. 그 다음, 무독성 범위의 RAW 264.7 세포의 배지를 B16-Blue IFN-α/β 세포로 처리하였다. 24시간 후, QUANTI-Blue Solution을 사용하여 방출된 타입1 인터페론을 정량화했다.RAW 264.7 cells (3×10 5 cells/well) were seeded in a 48-well plate. After 12 hours, various ions (manganese, manganese chloride, zinc chloride, aluminum chloride, calcium chloride, iron chloride) and nanoparticles (nanoparticle-core containing manganese and tannic acid, and CMP nanoparticles) were added from 0.001 mg/mL to 0.625 mg. It was treated at various concentrations up to /mL. As a positive control, STING agonist was treated at 10 μg. After 24 hours, cytotoxicity of RAW 264.7 cells was confirmed using the CCK-8 assay. B16-Blue IFN-α/β cells (3 × 10 5 cells/well) were seeded in a 48-well plate. Next, the medium of RAW 264.7 cells in the non-toxic range was treated with B16-Blue IFN-α/β cells. After 24 hours, the released type 1 interferon was quantified using QUANTI-Blue Solution.
치료 후 종양 조직으로부터 분비된 타입1 인터페론의 양을 결정하기 위해, 수확된 종양 조직을 단일 세포로 해리시켰다. 단일 세포(3×105개 세포/웰)를 48웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 종양 세포의 배양 배지를 B16-Blue IFN-α/β 세포로 처리하였다. 마지막으로 QUANTI-Blue Solution을 사용하여 분비된 타입1 인터페론을 정량화했다.To determine the amount of type 1 interferon secreted from tumor tissue after treatment, harvested tumor tissue was dissociated into single cells. Single cells (3×10 5 cells/well) were seeded in a 48-well plate. After 24 hours, the culture medium of tumor cells was treated with B16-Blue IFN-α/β cells. Finally, secreted type 1 interferon was quantified using QUANTI-Blue Solution.
1-3. 골수 수지상 세포(BMDC)의 추출 1-3. Extraction of bone marrow dendritic cells (BMDC)
BMDC는 마우스에서 분리되었다. BALB/c 마우스를 사용하여 뒷다리 뼈를 얻었다. 뼈는 PBS로 헹구기 전에 3분 동안 70% 에탄올로 세척되었다. 뒷다리 뼈 내부의 세포는 뼈의 상부와 하부를 약간 절단한 후 1mL 주사기를 사용하여 원추형 튜브에 수집하였다. 세포를 250g에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, RBC 용해 완충액(Sigma Aldrich) 4℃에서 1분 동안 유지하였다. RBC 용해 완충액을 PBS로 희석한 후 250g에서 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, BMDC(1 x 106 개 세포)를 GM-CSF를 포함하는 RPMI 배지에서 150개의 파이 접시에 분배했다. 부유 세포를 격일로 수집하여 재분산시켰다. 일주일 후, BMDC로 분화된 세포를 이용하여 시험관내 세포 실험을 수행하였다.BMDCs were isolated from mice. Hind limb bones were obtained using BALB/c mice. Bones were washed in 70% ethanol for 3 min before rinsing with PBS. Cells inside the hind limb bones were collected in a conical tube using a 1 mL syringe after slightly cutting the top and bottom of the bone. The cells were centrifuged at 250 g for 3 minutes to remove the supernatant, and then maintained in RBC lysis buffer (Sigma Aldrich) at 4°C for 1 minute. The RBC lysis buffer was diluted with PBS and centrifuged at 250g for 3 minutes. After removing the supernatant, BMDCs (1 x 10 6 cells) were distributed into 150 pie dishes in RPMI medium containing GM-CSF. Suspended cells were collected every other day and redispersed. One week later, in vitro cell experiments were performed using cells differentiated into BMDCs.
1-4. 나노입자의 특성 분석1-4. Characterization of nanoparticles
산란전자현미경(SEM, S-4800, Hitachi)과 투과전자현미경(TEM, H-7600, Hitachi)을 이용하여 나노입자의 크기와 형태를 분석하였다. 동적 광산란 장비(DLS, Malvern Nano ZS, Malvern Instruments)를 사용하여 나노 입자의 크기와 표면 제타 전위를 측정했다. 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 CpG-ODN의 최적 비율을 결정하기 위해 겔 지연(gel retardation)을 수행하였다. 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 CpG-ODN을 실온에서 15분 동안 다양한 비율로 혼합하고 1% 아가로스 겔에 1μg 로딩 스타(loading star)를 로딩했다. 30분간 전기영동을 하였고, 겔 영상 시스템(XR + Imaging system, Bio-Rad)으로 겔을 분석하였다. 나노입자의 pH에 따른 방출을 확인하기 위해 PBS의 pH를 1N HCl을 사용하여 7.4, 6.5, 5.5로 낮추었다. 나노입자를 시간 경과에 따라 원심분리하여 상층액을 생성하고 동량의 PBS 용액을 추가로 첨가하였다. ICP-MS(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 상층액에 포함된 Mn 이온의 양을 측정하였다.The size and shape of nanoparticles were analyzed using scattering electron microscopy (SEM, S-4800, Hitachi) and transmission electron microscopy (TEM, H-7600, Hitachi). The size and surface zeta potential of the nanoparticles were measured using a dynamic light scattering instrument (DLS, Malvern Nano ZS, Malvern Instruments). Gel retardation was performed to determine the optimal ratio of nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and CpG-ODN. Nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and CpG-ODN were mixed at various ratios for 15 minutes at room temperature, and 1 μg loading star was loaded on a 1% agarose gel. Electrophoresis was performed for 30 minutes, and the gel was analyzed using a gel imaging system (XR + Imaging system, Bio-Rad). To check the pH-dependent release of nanoparticles, the pH of PBS was lowered to 7.4, 6.5, and 5.5 using 1N HCl. The nanoparticles were centrifuged over time to produce a supernatant, and an equal amount of PBS solution was additionally added. The amount of Mn ions contained in the supernatant was measured using ICP-MS (Thermo Fisher Scientific, USA).
1-5. 망간 이온과 CMP 나노입자의 세포내 유입량 측정1-5. Measurement of intracellular influx of manganese ions and CMP nanoparticles
RAW 264.7 세포(3×105 세포/웰)를 48-웰 플레이트에 시딩하여 Mn 이온 및 CMP 나노입자의 세포 유입을 분석했다. 12시간 후, Mn 이온과 CMP 나노입자를 2.4㎍/mL의 망간으로 처리하였다. 세포를 원심분리하여 시간에 따라 수집하고 5% 질산 용액에 1시간 동안 용해시켰다. 이온화된 Mn 이온은 ICP-MS를 사용하여 정량화되었다.RAW 264.7 cells (3 × 10 5 cells/well) were seeded in 48-well plates to analyze the cellular influx of Mn ions and CMP nanoparticles. After 12 hours, Mn ions and CMP nanoparticles were treated with 2.4 μg/mL of manganese. Cells were collected over time by centrifugation and lysed in 5% nitric acid solution for 1 h. Ionized Mn ions were quantified using ICP-MS.
1-6. 공초점 이미지 분석(confocal imaging)1-6. Confocal imaging
RAW 264.7 세포(1x 105 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 시딩하여 CpG-ODN 및 CMP 나노입자의 세포 유입을 분석했다. 12시간 후, CpG-ODN 및 CMP 나노입자를 2시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 4% PFA 용액으로 15분 동안 고정하였다. PBS로 세포를 3회 세척한 후 DAPI 마운팅 용액(mounting solution)이 마운팅된 세포를 공초점 현미경(Zeiss LSM 880, Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.RAW 264.7 cells (1x10 5 cells/well) were seeded in 24-well plates to analyze the cellular uptake of CpG-ODN and CMP nanoparticles. After 12 hours, CpG-ODN and CMP nanoparticles were treated for 2 hours. Cells were washed three times with PBS and fixed with 4% PFA solution for 15 minutes. After washing the cells three times with PBS, the cells mounted with DAPI mounting solution were observed using a confocal microscope (Zeiss LSM 880, Zeiss).
1-7. CMP 나노입자에 의한 RAW 264.7 대식세포의 M1 마커 발현 및 분비1-7. Expression and secretion of M1 marker in RAW 264.7 macrophages by CMP nanoparticles
RAW 264.7 세포(3×105 cells/well)를 48-웰 플레이트에 접종하여 CMP 나노입자에 의한 M1 마커의 발현 및 분비를 확인하였다. 12시간 후, CpG-ODN, Mn 이온, 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어, 및 CMP 나노입자를 동일한 망간 농도 2.4μg/mL로 처리하였다. 24시간 후, 세포 펠렛과 세포 배지를 각각 수집하였다. 세포 펠렛을 PBS로 3회 세척하고 APC 항-CD80, PE 항-CD86 항체(1:1000 희석)로 1시간 동안 처리하여 세포 표면에 발현된 CD80 및 CD86을 염색하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS에 재분산시키고 유세포분석기로 분석하였다. 그런 다음, 세포 배지의 사이토카인을 TNF-α, IL-6 ELISA 키트(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 정량화했다.RAW 264.7 cells (3×10 5 cells/well) were inoculated into a 48-well plate to confirm expression and secretion of M1 marker by CMP nanoparticles. After 12 hours, CpG-ODN, nanoparticle-core containing Mn ions, manganese, and tannic acid, and CMP nanoparticles were treated with the same manganese concentration of 2.4 μg/mL. After 24 hours, the cell pellet and cell medium were collected respectively. The cell pellet was washed three times with PBS and treated with APC anti-CD80 and PE anti-CD86 antibodies (1:1000 dilution) for 1 hour to stain CD80 and CD86 expressed on the cell surface. After washing the cells three times with PBS, the cells were resuspended in PBS containing 2% FBS and analyzed by flow cytometry. Then, cytokines in the cell medium were quantified using TNF-α and IL-6 ELISA kits (R&D system, Minneapolis, MN, USA).
1-8. 단극성 및 양극성 비가역적 전기천공법(IRE)의 독성 검증1-8. Toxicity verification of unipolar and bipolar irreversible electroporation (IRE)
CT26 세포(1×106 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 접종하여 IRE에 의한 세포독성을 검증하였다. 12시간 후, 세포를 IRE 단극 및 양극 펄스(전압: 1000V, 펄스 지속 시간: 100μs, 전극 공간: 5mm)로 처리했다. 4시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 CCK-8 용액을 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 리더(Synergy H1, BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 CCK-8 분석을 수행하고 SoftmaxPro 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 분석했다.CT26 cells (1×10 6 cells/well) were inoculated into a 24-well plate to verify cytotoxicity by IRE. After 12 h, cells were treated with IRE monopolar and bipolar pulses (voltage: 1000 V, pulse duration: 100 μs, electrode space: 5 mm). After 4 hours, cells were washed with PBS and CCK-8 solution was added. After incubation for 2 h, CCK-8 analysis was performed using a microplate reader (Synergy H1, BioTek, Winooski, USA) and analyzed with SoftmaxPro software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
1-9. 라이브 셀 이미지 분석 (live cell imaging)1-9. live cell imaging
CT26 세포(1×106 세포/웰)를 12-웰 plate에 접종하여 IRE에 따른 살아있는 세포 또는 죽은 세포의 범위를 관찰했다. 12시간 후, 세포를 IRE 단극 및 양극(전압: 1000V, 펄스 지속 시간: 100μs, 전극 간격: 5mm)으로 처리했다. 4시간 후 PBS로 3회 세척하고 살아있는 세포를 calcein-AM으로 염색하였다. 30분 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% PFA로 15분 동안 고정하였다. 488 nm의 자극(excitation) 및 517 nm의 방출(emission)에서 살아있는 세포의 범위는 마이크로플레이트 판독기의 영역 스캔 모드를 사용하여 관찰되었다.CT26 cells (1×10 6 cells/well) were inoculated into a 12-well plate and the range of live or dead cells according to IRE was observed. After 12 h, cells were treated with IRE monopolar and bipolar (voltage: 1000 V, pulse duration: 100 μs, electrode spacing: 5 mm). After 4 hours, the cells were washed three times with PBS, and viable cells were stained with calcein-AM. After 30 minutes, cells were washed three times with PBS and fixed with 4% PFA for 15 minutes. The extent of live cells at excitation at 488 nm and emission at 517 nm was observed using the area scan mode of the microplate reader.
1-10. DAMP 발현 분석1-10. DAMP expression analysis
CT26 세포(1×106 세포/웰)를 12-웰 플레이트에 접종하여 IRE에 의한 DMAP의 발현을 분석했다. 12시간 후, 세포를 단극성 및 양극성 IRE(1000V, 100μs, 5mm)으로 처리했다. 24시간 후, 세포 펠렛을 PBS로 3회 세척하고 FITC 항칼레티쿨린 항체(1:1000 희석)로 1시간 동안 처리하여 세포 표면에 발현된 칼레티쿨린을 염색하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS에 재분산시키고 유세포분석기로 분석하였다. 그런 다음, 세포 배지의 사이토카인을 TNF-α, IL-6 ELISA 키트(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 정량화하였다. 위와 같은 방법으로 단극성 및 양극성 IRE(1000 V, 100 μs, 5 mm)로 세포를 처리하였다. 1시간 후, ATP 생물발광 키트(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 세포 배지에서 방출된 ATP를 정량화했다.CT26 cells (1×10 6 cells/well) were seeded in a 12-well plate and the expression of DMAP by IRE was analyzed. After 12 h, cells were treated with unipolar and bipolar IRE (1000 V, 100 μs, 5 mm). After 24 hours, the cell pellet was washed three times with PBS and treated with FITC anti-calreticulin antibody (1:1000 dilution) for 1 hour to stain calreticulin expressed on the cell surface. After washing the cells three times with PBS, the cells were resuspended in PBS containing 2% FBS and analyzed by flow cytometry. Then, cytokines in the cell medium were quantified using TNF-α and IL-6 ELISA kits (R&D system, Minneapolis, MN, USA). Cells were treated with unipolar and bipolar IRE (1000 V, 100 μs, 5 mm) in the same manner as above. After 1 h, the ATP released in the cell medium was quantified using an ATP bioluminescence kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA).
1-11. 생체 내 실험1-11. in vivo experiments
모든 생체 내 실험은 가톨릭대학교 동물병원 동물관리위원회(대한민국, CUK-IACUC-2021-017-01) 및 서울아산병원의 승인된 프로토콜 지침 (대한민국, 2020-13-349)에 따라 수행되었다. 8주령 암컷 BALB/c 및 BABL/c 누드마우스를 1주일 동안 안정화시킨 후 동물 실험에 사용하였다. 마우스 종양 모델을 확립하기 위해, 9주령 BALB/c 누드 마우스의 우측 옆구리에 CT26 세포(2Х106 개)를 피하 접종하였다. 8일 후 평균 종양 부피가 100 mm3에 도달했을 때 마우스를 실험에 사용하였다. 마우스를 isoflurane으로 완전히 마취시킨 후 IRE를 처리했다. 종양 부피는 너비 Х 너비 Х 길이 Х 0.5으로 계산되었다. 종양 접종 28일 후, 종양 크기가 2,000 mm3를 초과하면 마우스를 CO2 가스로 희생시켰다.All in vivo experiments were performed in accordance with the approved protocol guidelines of the Catholic University Animal Hospital Animal Care Committee (South Korea, CUK-IACUC-2021-017-01) and Asan Medical Center in Seoul (South Korea, 2020-13-349). Eight-week-old female BALB/c and BABL/c nude mice were stabilized for one week and then used in animal experiments. To establish the mouse tumor model, CT26 cells (2Х10 6 cells) were inoculated subcutaneously into the right flank of 9-week-old BALB/c nude mice. After 8 days, when the average tumor volume reached 100 mm 3 , mice were used for the experiment. Mice were completely anesthetized with isoflurane and then treated with IRE. Tumor volume was calculated as width Х width Х length Х 0.5. Twenty-eight days after tumor inoculation, mice were sacrificed with CO 2 gas when the tumor size exceeded 2,000 mm 3 .
1-12. 마우스 종양 모델에서 IRE에 의한 DAMP, 사이토카인 및 케모카인 관련 유전자 발현 확인1-12. Confirmation of DAMP, cytokine, and chemokine-related gene expression by IRE in a mouse tumor model
CT26 세포(2 Х 106 세포)는 9주 된 BALB/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종되었다. 8일 후, 종양의 평균 부피가 100 mm3에 도달했을 때 마우스를 다음 그룹에서 테스트했다: 그룹 1, 대조군; 그룹 2, 단극성 IRE 40펄스 처리; 그룹 3, 단극성 IRE 80펄스 처리; 그룹 4, 양극성 IRE 40펄스 처리; 그룹 5, 양극성 IRE 80펄스처리. IRE 처리 후 3일째에 종양을 획득하였다. 유전자 발현은 PhileKorea Technology(서울, 대한민국)에서 마우스 IO 360 유전자 발현 패널을 사용하여 분석하였다.CT26 cells (2 Х 10 6 cells) were inoculated subcutaneously into the right flank of 9-week-old BALB/c mice. After 8 days, when the average volume of tumors reached 100 mm 3 , mice were tested in the following groups: group 1, control; Group 2, unipolar IRE 40-pulse treatment; Group 3, unipolar IRE 80 pulse treatment; Group 4, bipolar IRE 40-pulse treatment; Group 5, bipolar IRE 80 pulse treatment. Tumors were obtained 3 days after IRE treatment. Gene expression was analyzed using the mouse IO 360 gene expression panel at PhileKorea Technology (Seoul, Korea).
1-13. 시간 경과에 따른 CMP 나노입자의 종양에서의 체류시간 분석1-13. Analysis of retention time of CMP nanoparticles in tumor over time
종양에서 CMP 나노입자의 보유를 조사하기 위해, Cy5 표지된 CpG-ODN 및 CMP 나노입자를 CT26 종양 보유 BALB/c 누드 마우스에 종양내 주사하였다. 0, 1, 6시간에 형광표지된 생물체 바이오이미징 기기(FOBI, Neo-Science, 수원, 대한민국)를 통해 영상을 얻었다. Mn 이온은 주입 후 2일 차에 ICP-MS 장비를 정량화했다. 종양에서 CMP 나노입자의 T1 강조 MR 영상 능력을 조사하기 위해 CMP 나노입자를 CT26 종양을 지닌 BABL/c 마우스에 종양 내 주사했다. 2시간 후, 9.4-T/160-mm 동물 MRI 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 통해 이미지를 얻었다.To investigate retention of CMP nanoparticles in tumors, Cy5-labeled CpG-ODN and CMP nanoparticles were intratumorally injected into CT26 tumor-bearing BALB/c nude mice. Images were obtained using a fluorescently labeled organism bioimaging device (FOBI, Neo-Science, Suwon, Korea) at 0, 1, and 6 hours. Mn ions were quantified using ICP-MS equipment on the second day after injection. To investigate the T 1 -weighted MR imaging ability of CMP nanoparticles in tumors, CMP nanoparticles were intratumorally injected into BABL/c mice bearing CT26 tumors. After 2 h, images were acquired via a 9.4-T/160-mm animal MRI system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
1-14. IRE의 종양 억제 검증1-14. Validation of tumor inhibition by IRE
IRE 최적화는 다음 그룹(n=5)에서 수행되었다: 그룹 1, PBS만 처리; 그룹 2, 단극성 IRE 처리; 그룹 3, 양극성 IRE 처리. 단극성 및 양극성 IRE는 특정 전기장 조건(전압: 1000V, 펄스 지속 시간: 100μs, 전극 간격: 5 mm)에서 처리되었다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼스를 사용하여 2-3일마다 측정되었다.IRE optimization was performed in the following groups (n=5): group 1, treated with PBS only; Group 2, unipolar IRE treatment; Group 3, bipolar IRE treatment. Unipolar and bipolar IRE were processed under specific electric field conditions (voltage: 1000 V, pulse duration: 100 μs, electrode spacing: 5 mm). Tumor size was measured every 2-3 days using vernier calipers.
1-15. CMP 나노입자와 양극성 IRE 병용처리의 종양 억제 검증1-15. Verification of tumor inhibition by combination of CMP nanoparticles and bipolar IRE
종양 성장 억제는 다음 그룹(n=10)에서 평가되었다: 그룹 1, PBS만 처리; 그룹 2, CpG-ODN만 처리; 3그룹, Mn 이온 처리; 그룹 4, CMP 나노입자 처리; 그룹 5, CMP 나노입자 및 양극성 IRE 병용처리. IRE는 특정 전기장 조건에서(전압: 1000V, 펄스 지속 시간: 100μs, 전극 간격: 5mm), 접종 후 9일째에 CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에서 8개의 펄스, 10회 처리되었다. CpG-ODN, Mn 이온 및 CMP 나노입자는 동일한 용량으로 접종 후 8일, 10일 및 12일째에 CT26 종양 보유 BALB/c 마우스에 종양 내 주사하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼스를 사용하여 2-3일마다 측정되었다.Tumor growth inhibition was assessed in the following groups (n=10): group 1, treated with PBS only; Group 2, CpG-ODN treatment only; Group 3, Mn ion treatment; Group 4, CMP nanoparticle treatment; Group 5, combined treatment with CMP nanoparticles and anodic IRE. IRE was treated 8 pulses, 10 times, in CT26 tumor-bearing BALB/c mice on day 9 after inoculation under specific electric field conditions (voltage: 1000 V, pulse duration: 100 μs, electrode gap: 5 mm). CpG-ODN, Mn ions, and CMP nanoparticles were intratumorally injected at the same dose into CT26 tumor-bearing BALB/c mice on days 8, 10, and 12 after inoculation. Tumor size was measured every 2-3 days using vernier calipers.
1-16. 양극성 IRE 처리 후 종양 유입 면역세포 분석1-16. Analysis of tumor inflow immune cells after bipolar IRE treatment.
IRE는 특정 전기장 조건(전압: 1000V, 펄스 지속 시간: 100μs, 전극 간격: 5mm)에서 접종 후 8일째에 CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에서 8개의 펄스, 10회 처리되었다. IRE 처리 1일 후에 종양을 획득했다. 획득한 종양 조직은 물리적으로 단일 세포로 분해되었다. 단일 세포를 FACS 완충액(2% FBS 및 1mM EDTA를 포함하는 PBS)에 분산시켰다. 그 후 70μm cell strainer를 이용하여 세포 외 물질을 제거한 후 다시 FACS buffer에 분산시켰다. 그 후, 세포를 RBC 용해 완충액(Sigma Aldrich)에서 4℃에서 1분 동안 인큐베이션하였다. RBC 용해 완충액을 PBS로 희석한 후 250g에서 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 세포를 다음 항체로 염색했다: 살아있는 세포의 경우 BV510-컨쥬게이션된 Zombie aqua(카탈로그 번호: 77477, 희석: 1:100); 및 대식세포용 FITC 접합 CD11b(카탈로그 번호: 101205, 희석액: 1:100).IRE was treated 8 pulses, 10 times, in CT26 tumor-bearing BALB/c mice on day 8 after inoculation under specific electric field conditions (voltage: 1000 V, pulse duration: 100 μs, electrode spacing: 5 mm). Tumors were obtained 1 day after IRE treatment. The obtained tumor tissue was physically disassembled into single cells. Single cells were dispersed in FACS buffer (PBS containing 2% FBS and 1mM EDTA). Afterwards, extracellular material was removed using a 70μm cell strainer and dispersed again in FACS buffer. Afterwards, cells were incubated in RBC lysis buffer (Sigma Aldrich) for 1 min at 4°C. The RBC lysis buffer was diluted with PBS and centrifuged at 250g for 3 minutes. After removal of the supernatant, cells were stained with the following antibodies: BV510-conjugated Zombie aqua (catalog number: 77477, dilution: 1:100) for live cells; and FITC-conjugated CD11b for macrophages (catalog number: 101205, dilution: 1:100).
세포를 FACS 완충액에서 30분 동안 항체로 염색하고 CytExpert 소프트웨어(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)가 있는 유세포 분석기(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 분석했다.Cells were stained with antibodies for 30 min in FACS buffer and analyzed using a flow cytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) with CytExpert software (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).
1-17. CMP 및 양극성 IRE 처리 후 종양 유입 면역세포 분석1-17. Analysis of tumor inflow immune cells after CMP and bipolar IRE treatment.
IRE는 특정 전기장 조건(전압: 1000V, 펄스 지속 시간: 100μs, 전극 간격: 5mm)에서 접종 후 9일째에 CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에서 8개의 펄스, 10회 처리되었다. CMP 나노입자는 8일, 10일 및 12일에 CT26 종양이 있는 BALB/c 마우스에 종양 내 주사되었다. 종양은 치료 3일 후에 획득했다. 획득한 종양 조직을 위와 동일한 방법으로 단일 세포로 분해한 후 다음 항체로 염색하였다: FITC-conjugated CD11b (카탈로그 번호: 101205, 희석: 1:100), APC-conjugated anti-CD80 (카탈로그 번호: 104714, 희석: 1:100), 대식세포용 PE-접합된 항-CD86(카탈로그 번호: 105008, 희석: 1:100); 및 DC의 경우 PerCp/Cy5.5-접합된 항-CD11c(카탈로그 번호: 117328, 희석: 1:100). 세포를 30분 동안 염색한 후 상기와 동일한 조건에서 유세포분석기를 이용하여 분석하였다.IRE was treated 8 pulses, 10 times, in CT26 tumor-bearing BALB/c mice on day 9 after inoculation under specific electric field conditions (voltage: 1000 V, pulse duration: 100 μs, electrode gap: 5 mm). CMP nanoparticles were injected intratumorally into CT26 tumor-bearing BALB/c mice on days 8, 10, and 12. Tumors were obtained 3 days after treatment. The obtained tumor tissue was digested into single cells in the same manner as above and then stained with the following antibodies: FITC-conjugated CD11b (catalog number: 101205, dilution: 1:100), APC-conjugated anti-CD80 (catalog number: 104714, dilution: 1:100), PE-conjugated anti-CD86 for macrophages (catalog number: 105008, dilution: 1:100); and PerCp/Cy5.5-conjugated anti-CD11c for DC (catalog number: 117328, dilution: 1:100). Cells were stained for 30 minutes and then analyzed using a flow cytometer under the same conditions as above.
1-18. 처리 후 종양 조직의 면역형광염색1-18. Immunofluorescence staining of tumor tissue after treatment.
종양 조직 슬라이드는 실온에서 1시간 동안 4% 소 혈청 알부민(BSA) 용액에서 차단(blocked)되었다. 항-CD80 항체(카탈로그 번호: ab254579, 희석: 1:1000)를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, TRITC-conjugated affinipure donkey anti-rabbit IgG(카탈로그 번호: 711-025-152)를 1시간 동안 반응시킨 후, DAPI 마운팅 용액(Abcam, Cambridge, USA)으로 슬라이드를 마운팅하였다.Tumor tissue slides were blocked in 4% bovine serum albumin (BSA) solution for 1 hour at room temperature. Anti-CD80 antibody (catalog number: ab254579, dilution: 1:1000) was incubated overnight at 4°C. The next day, TRITC-conjugated affinipure donkey anti-rabbit IgG (catalog number: 711-025-152) was reacted for 1 hour, and then the slide was mounted with DAPI mounting solution (Abcam, Cambridge, USA).
1-19. 통계학적 분석1-19. statistical analysis
GraphPad Prism 8 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD) 또는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 평가되었다. ANOVA는 3개 이상의 그룹을 조사하는 데 사용되었고 t-test는 2개 그룹을 조사하는 데 사용되었다. Shapiro-Wilk 테스트를 이용하여 데이터의 정규성을 확인하였다. 그림 범례는 p-값의 유의 수준을 나타낸다.Statistical analyzes were performed using GraphPad Prism 8 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). All data were evaluated as mean ± standard deviation (SD) or mean ± standard error of the mean (SEM). ANOVA was used to examine three or more groups and t-test was used to examine two groups. The normality of the data was confirmed using the Shapiro-Wilk test. The figure legend indicates the significance level of the p-value.
실시예 2. CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어(CMP)의 합성Example 2. Synthesis of nanoparticle-core (CMP) comprising manganese and tannic acid coated with CpG-ODN
2-1. 금속 이온의 면역 활성효과 검증2-1. Verification of the immune activation effect of metal ions
타입1 인터페론(IFN)은 염증, 면역 조절 및 T 세포 반응에서 중요한 역할을 하는 조절 단백질이다. 다양한 금속 이온으로 인한 타입1 인터페론 방출 패턴을 B16-Blue IFN-α/β reporter cells assay를 통해 분석하였다 (도 2의 a)). 실험은 세포독성을 나타내지 않는 금속 농도범위(0.078~0.625 mg/mL)에서 수행되었다. 타입1 인터페론의 분비량이 Mn, Zn, Al또는 Ca 이온을 처리한 군에서 음성 대조군에 비해 증가하였다. 그 중 Mn 이온의 경우 대조군에 비해 3 - 5 배 이상 타입1 인터페론 분비량이 증가하여 가장 많은 양의 인터페론 증가량을 보여주었다. 이는 금속 이온, 그 중에서도 Mn 이온이 면역 세포를 활성화하여 다양한 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. Type 1 interferon (IFN) is a regulatory protein that plays an important role in inflammation, immune regulation, and T cell responses. The type 1 interferon release pattern caused by various metal ions was analyzed through B16-Blue IFN-α/β reporter cells assay (Figure 2a)). The experiment was performed in a metal concentration range (0.078~0.625 mg/mL) that does not show cytotoxicity. The secretion amount of type 1 interferon increased in the group treated with Mn, Zn, Al, or Ca ions compared to the negative control group. Among them, in the case of Mn ions, the secretion of type 1 interferon increased by more than 3 to 5 times compared to the control group, showing the largest increase in interferon. This indicates that metal ions, especially Mn ions, can induce various immune responses by activating immune cells.
2-2. 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 제작 및 면역 활성효과 검증2-2. Fabrication of nanoparticle-core containing manganese and tannic acid and verification of immune activation effect
금속 이온의 면역 반응 유도 효과에도, 금속 이온은 세포막 투과성이 낮고 장기간 종양 부위에 잔류하지 않기 때문에 금속 이온을 면역 보조제로 사용하는 것은 어렵다. 따라서 본 연구에서는 폴리페놀과 Mn 이온의 배위를 기반으로 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어를 형성하여 효과적인 나노 보조제를 형성하였다. 탄닌산(Tannic acid, TA)는 다양한 식물에서 발견되는 폴리페놀 생체분자이다. Mn 이온과 TA의 몰비가 1:1 인 상태에서 pH를 7.5로 증가시켜 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어를 제조하였다. 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어는 주사전자현미경(SEM), 동적 광산란(DLS), 및 투과전자현미경(TEM)으로 분석한 결과 약 40nm의 구형의 형태이다(도2의 b)).Despite the immune response-inducing effect of metal ions, it is difficult to use metal ions as immune adjuvants because they have low cell membrane permeability and do not remain in the tumor site for a long period of time. Therefore, in this study, an effective nano-auxiliary agent was formed by forming a nanoparticle-core containing manganese and tannic acid based on the coordination of polyphenol and Mn ion. Tannic acid (TA) is a polyphenol biomolecule found in various plants. Nanoparticle-cores containing manganese and tannic acid were prepared by increasing the pH to 7.5 with a molar ratio of Mn ions and TA of 1:1. The nanoparticle-core containing manganese and tannic acid has a spherical shape of about 40 nm as a result of analysis by scanning electron microscopy (SEM), dynamic light scattering (DLS), and transmission electron microscopy (TEM) (Figure 2b)).
망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 경우 유리 Mn 이온에 비해 더 낮은 농도(0.009 ~ 0.001mg/mL)에서 타입1 인터페론의 분비를 유도하였다(도2의 c)). 반면에 TA 단독 처리만으로는 타입1 인터페론의 분비를 유도하지 않았으므로, 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어에서 Mn 이온이 타입1 인터페론 분비를 유도한 주된 요인으로 판단된다.In the case of nanoparticle-core containing manganese and tannic acid, secretion of type 1 interferon was induced at a lower concentration (0.009 ~ 0.001 mg/mL) compared to free Mn ion (Figure 2c)). On the other hand, since TA treatment alone did not induce secretion of type 1 interferon, it is believed that Mn ions in the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid are the main factor that induced secretion of type 1 interferon.
2-3.2-3. CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 (CMP)의 제조Preparation of nanoparticle-core (CMP) containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN
항종양 면역의 효능을 높이기 위해 단일 가닥 DNA인 CpG-ODN을 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 표면에 코팅하였고 이를 CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 (CpG-coated Mn-PN, CMP)로 명명하였다. 탄닌산은 수소 결합을 통해 핵산과 상호작용할 수 있다(도 1의 a)). CpG-ODN은 대식세포 M1 분극을 유도할 수 있으므로 면역보조제로 활용할 수 있다.To increase the efficacy of anti-tumor immunity, single-stranded DNA, CpG-ODN, was coated on the surface of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid, which was then coated with CpG-ODN-coated nanoparticle-core containing manganese and tannic acid (CpG-ODN). coated Mn-PN, CMP). Tannic acid can interact with nucleic acids through hydrogen bonding (Figure 1a)). CpG-ODN can induce macrophage M1 polarization, so it can be used as an adjuvant.
CpG-ODN과 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어가 복합체를 형성하는 적절한 중량비를 확인하기 위해 겔 지연 시험을 수행하였다(도 2의 d)). CpG-ODN에 대한 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어의 중량비가 1.1 보다 높은 경우 유리 CpG-ODN 밴드가 사라지고 성공적인 복합체 형성을 나타낸다. 이후의 실험에서는 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어와 CpG-ODN의 중량비를 2.3:1로 하여 CMP 나노입자를 제조하였다.A gel retardation test was performed to confirm the appropriate weight ratio at which CpG-ODN and the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid form a complex (Figure 2d)). When the weight ratio of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid to CpG-ODN is higher than 1.1, the free CpG-ODN band disappears, indicating successful complex formation. In the subsequent experiment, CMP nanoparticles were prepared by setting the weight ratio of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid to CpG-ODN at 2.3:1.
CMP 나노입자는 약 46nm로 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어보다 약간 크며 구형의 모양을 유지하였다(도 2의 e)). CMP 나노입자의 제타 전위는 약 -30mV로 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어보다 약간 낮았다(도 2의 f)). 또한, CMP 나노입자는 다양한 분산액에서 우수한 콜로이드 안정성을 보여주었다. 일반적으로 MPN에서 금속과 폴리페놀 사이의 배위결합은 pH변화에 크게 영향을 받는다. CMP 나노입자에서 방출된 Mn 이온을 결합 플라즈마 질량분석기(Coupled Plasma Mass Spectroscopy, ICP-MS)를 이용해 정량한 결과 pH가 감소함에 따라 나노입자에서 Mn 이온이 비교적 빠르게 방출되었다 (도 2의 g)). 이는 CMP 나노입자가 높은 수소이온 농도 조건에 놓일 때 금속-폴리페놀 상호작용이 약해짐을 나타낸다. 즉, CMP 나노입자는 세포내 pH 구배에 의해 시간이 지남에 따라 분해될 수 있음을 나타낸다.The CMP nanoparticle was approximately 46 nm, slightly larger than the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid, and maintained a spherical shape (e) in Figure 2). The zeta potential of the CMP nanoparticle was about -30 mV, which was slightly lower than that of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid (Figure 2f)). Additionally, CMP nanoparticles showed excellent colloidal stability in various dispersions. In general, the coordination bond between metals and polyphenols in MPN is greatly affected by pH changes. As a result of quantifying the Mn ions released from CMP nanoparticles using Coupled Plasma Mass Spectroscopy (ICP-MS), Mn ions were released relatively quickly from the nanoparticles as the pH decreased (Figure 2g)) . This indicates that the metal-polyphenol interaction is weakened when CMP nanoparticles are placed under high hydrogen ion concentration conditions. In other words, this indicates that CMP nanoparticles can be decomposed over time due to intracellular pH gradients.
실시예 3. CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 (CMP)의 대식세포 활성화 능력 검증Example 3. Verification of macrophage activation ability of nanoparticle-core (CMP) containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN
3-1. CMP 나노입자의 세포독성 및 인터페론 분비 촉진 효과 검증3-1. Verification of cytotoxicity and interferon secretion promotion effect of CMP nanoparticles
CMP 나노입자의 세포독성을 확인하기 위해 대식세포 세포주(RAW 264.7 세포)와 1차 골수 수지상 세포(primary bone marrow dendritic cells, BMDC)에서 서로 다른 나노입자 농도에서 CCK-8 assay를 수행하였다(도 3의 a) 및 도 4의 a)). RAW 264.7 세포에서 CMP 나노입자의 농도가 4.9 μg/mL 이상인 경우, BMDC에서 CMP 나노입자의 농도가 0.75μg/mL이상인 경우 각각 독성이 있었다. 이는 BMDC가 RAW 264.7 세포보다 CMP 나노입자 독성에 더 민감하다는 것을 나타낸다. RAW 264.7 세포가 있는 B16-Blue IFN-α/β 리포터 세포에서 CMP 나노입자에 의한 타입1 인터페론의 분비량은 대조군에 비해 4배 이상 증가했다. 고농도 CMP 나노입자의 세포독성으로 인해 CMP 나노입자의 농도가 9.8 μg/mL 이상 증가함에 따라 타입1 인터페론의 분비량이 감소하는 경향이 있었다(도 3의 b)). RAW 264.7 세포에서 타입1 인터페론의 최대 분비량은 2.4μg/mL 농도의 CMP 나노입자에서 나타났다(도 3의 b)). BMDC에서 타입1 인터페론의 최대 분비량은 무독성 농도 범위인 18ng/mL 농도의 CMP 나노입자에서 나타났다(도 4의 b)). To confirm the cytotoxicity of CMP nanoparticles, CCK-8 assay was performed on macrophage cell line (RAW 264.7 cells) and primary bone marrow dendritic cells (BMDC) at different nanoparticle concentrations (Figure 3 a) in and a) in Figure 4 . When the concentration of CMP nanoparticles was higher than 4.9 μg/mL in RAW 264.7 cells, it was toxic when the concentration of CMP nanoparticles was higher than 0.75 μg/mL in BMDC. This indicates that BMDCs are more sensitive to CMP nanoparticle toxicity than RAW 264.7 cells. In B16-Blue IFN-α/β reporter cells containing RAW 264.7 cells, the secretion amount of type 1 interferon by CMP nanoparticles increased more than 4-fold compared to the control group. Due to the cytotoxicity of high-concentration CMP nanoparticles, the secretion amount of type 1 interferon tended to decrease as the concentration of CMP nanoparticles increased above 9.8 μg/mL (Figure 3b)). The maximum secretion amount of type 1 interferon in RAW 264.7 cells was observed at a concentration of 2.4 μg/mL of CMP nanoparticles (Figure 3b). The maximum secretion amount of type 1 interferon from BMDC was found at CMP nanoparticles at a concentration of 18 ng/mL, which is the non-toxic concentration range (Figure 4b)).
3-2.3-2. CMP 나노입자의 세포내 유입 능력 검증Verification of cell entry ability of CMP nanoparticles
APC에서 CMP의 세포 유입을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에서 CMP 나노 입자를 처리한 후 ICP-MS를 사용하여 시간이 지남에 따라 세포에 유입된 Mn을 정량화했다(도 3의 c)). 처리 후 2시간까지는 차이가 없었으나 CMP 나노입자의 세포 유입은 유리 Mn 이온(Free Mn ion)에 비해 최대 48시간까지 유의하게 증가하였다. 이 결과는 CMP 나노입자가 유리 Mn 이온보다 APC에 더 효과적으로 유입됨을 나타낸다. Mn 산화물 나노입자는 Mn 이온보다 더 높은 세포 내재화 거동을 보였다. CMP 나노입자에 의한 CpG-ODN의 세포 유입을 확인하기 위해 Cy5 표지 CpG-ODN을 포함한 CMP 나노입자로 처리된 RAW 264.7 세포를 공초점 현미경을 사용하여 관찰했다(도 3의 d)). 유리 CpG-ODN 그룹과 비교하여 CMP 나노입자 그룹에서 더 많은 적색 형광 신호가 관찰되었다. 이러한 결과는 CMP 나노입자가 Mn 이온과 CpG-ODN을 APC에 효과적으로 전달할 수 있음을 나타내는데, 이는 나노입자가 일반적으로 세포내이입(endocytosis) 경로를 통해 내재화되기 때문인 것으로 생각된다.To confirm the cellular influx of CMP in APC, we treated RAW 264.7 cells with CMP nanoparticles and then quantified the Mn introduced into the cells over time using ICP-MS (Figure 3c)). There was no difference up to 2 hours after treatment, but the cell influx of CMP nanoparticles significantly increased up to 48 hours compared to free Mn ions. These results indicate that CMP nanoparticles are more effectively introduced into APC than free Mn ions. Mn oxide nanoparticles showed higher cellular internalization behavior than Mn ions. To confirm the cellular influx of CpG-ODN by CMP nanoparticles, RAW 264.7 cells treated with CMP nanoparticles containing Cy5-labeled CpG-ODN were observed using a confocal microscope (Figure 3d)). More red fluorescence signals were observed in the CMP nanoparticle group compared to the free CpG-ODN group. These results indicate that CMP nanoparticles can effectively deliver Mn ions and CpG-ODN to APC, which is believed to be because nanoparticles are generally internalized through the endocytosis pathway.
3-3.3-3. CMP 나노입자의 면역세포 활성화 효과 검증Verification of immune cell activation effect of CMP nanoparticles
CMP 나노입자 처리 후 대식세포의 M1 분극화 및 BMDC 활성화를 평가하여 CMP 나노입자에 의한 APC의 프라이밍을 확인했다(도 3의 e), 도 4의 c)). M1 극성화된 대식세포는 병원체 및 종양 세포 제거에 직접적인 역할을 하며 CD8+ T 세포와 같은 면역 세포 활성화에도 관여한다. CMP 나노입자 처리에 의해 대식세포 M1 분극 마커 CD80 및 CD86는 유의하게 증가되었으며, 이는 유리 CpG-ODN 및 유리 Mn 이온보다 유의하게 높았다. BMDC에서도 CMP 나노 입자 처리 그룹은 높은 수준의 BMDC 활성화 표면 마커 CD80, CD86 및 MHC II를 보여주었다(도 4의 c)). 또한, RAW 246.7 세포에서 CMP 나노 입자 처리에 의해 유발되는 염증성 사이토카인, TNF-α 및 IL-6의 분비를 측정했다(도 3의 f)). APC에서 분비되는 TNF-α와 IL-6의 양은 CMP 나노입자 처리에 의해 유의하게 증가하였다. 종합하면, CMP 나노입자를 통해 Mn 및 CpG-ODN이 APC에 효율적으로 전달되어 APC에서 염증성 사이토카인을 활성화 및 분비함으로써 항종양 면역을 활성화할 가능성이 있다.After CMP nanoparticle treatment, M1 polarization of macrophages and BMDC activation were evaluated to confirm priming of APC by CMP nanoparticles (Figure 3 e), Figure 4 c)). M1 polarized macrophages play a direct role in eliminating pathogens and tumor cells and are also involved in activating immune cells such as CD8+ T cells. Macrophage M1 polarization markers CD80 and CD86 were significantly increased by CMP nanoparticle treatment, which was significantly higher than that of free CpG-ODN and free Mn ions. In BMDCs, the CMP nanoparticle treatment group also showed high levels of BMDC-activated surface markers CD80, CD86, and MHC II (Figure 4c)). In addition, the secretion of inflammatory cytokines, TNF-α, and IL-6 induced by CMP nanoparticle treatment in RAW 246.7 cells was measured (Figure 3f)). The amounts of TNF-α and IL-6 secreted from APC were significantly increased by CMP nanoparticle treatment. Taken together, it is possible that Mn and CpG-ODN can be efficiently delivered to APCs through CMP nanoparticles, thereby activating antitumor immunity by activating and secreting inflammatory cytokines in APCs.
실시예 4. 양극성 비가역적 전기천공법(IRE)으로 인한 세포독성 및 면역성 세포사 확인Example 4. Confirmation of cytotoxicity and immune cell death caused by bipolar irreversible electroporation (IRE)
IRE에 의한 세포 사멸 유도를 확인하기 위해 CT26 세포의 시험관 내 세포 생존 능력을 1000V의 다양한 펄스 조건에서 테스트했다. 최근 개발된 양극성 펄스 기반 IRE는 단극성 펄스 기반 IRE에 비해 근육 수축 및 심장 부정맥의 위험을 낮출 수 있다. 단극 또는 양극 조건에서 CT26 세포에 40 또는 80 펄스의 전기장을 가했을 때 세포 독성은 펄스 의존적으로 증가했다. 40펄스 조건에서는 양극성 IRE가 단극성 IRE보다 더 높은 독성을 보였으나 80펄스 조건에서는 단극성 펄스와 양극성 펄스에 의한 세포독성에 차이가 없었다(도 5의 a)). To confirm the induction of apoptosis by IRE, the in vitro cell viability of CT26 cells was tested under various pulse conditions at 1000 V. Recently developed bipolar pulse-based IRE can reduce the risk of muscle contraction and cardiac arrhythmias compared to unipolar pulse-based IRE. When 40 or 80 pulses of electric field were applied to CT26 cells under unipolar or bipolar conditions, cytotoxicity increased in a pulse-dependent manner. In the 40-pulse condition, bipolar IRE showed higher toxicity than unipolar IRE, but in the 80-pulse condition, there was no difference in cytotoxicity between unipolar and bipolar pulses (Figure 5a)).
IRE에 의한 시험관내 세포독성을 살아있는 세포 및 죽은 세포 분석을 통해 단극 및 양극 전기장 조건에서 확인하였다(도 5의 b)). 파란색과 보라색 영역은 절제 영역을 나타낸다. 80펄스의 전기장을 가했을 때 단극 조건과 양극 조건에서 절제 영역의 면적에는 차이가 없었으나 40펄스의 양극 전기장에 의한 절제 영역은 단극 조건에서보다 훨씬 더 넓었다. 이 결과는 시험관 내 세포독성 데이터와 일치하며, 이는 양극성 IRE가 낮은 펄스에서도 단극성 IRE보다 더 효과적으로 암세포를 절제할 수 있음을 의미한다. IRE는 면역성 세포사(immunogenic cell death, ICD)를 유도하기 때문에 암 면역치료에 유리할 수 있다. 일반적으로 면역성 세포사(ICD)의 유도는 칼레티쿨린(calreticulin, CRT)의 발현과 ATP의 분비를 수반한다. 단극성 및 양극성 IRE 모두 펄스 수 의존 방식으로 CRT 발현과 ATP 분비를 증가시켰지만(도 5의 c)), 양극성 IRE는 모든 펄스 조건에서 단극성 IRE보다 더 큰 ATP 발현을 보였다. 또한 생체 내 종양 모델에서 다른 그룹에 비해 양극성 IRE의 80 펄스에서 DAMP, 사이토카인, 케모카인 및 면역 세포 마커의 더 높은 유전자 발현이 관찰되었다(도 5의 d) 및 도 6). 다른 그룹과 비교하여 암 세포 증식과 관련된 유전자 발현은 양극성 IRE의 80 펄스에서 감소했다(도 6). 동물 모델에서 단극성 및 양극성 IRE(1000V 및 80펄스) 조건에서 종양 성장 억제 및 장기 생존율을 검증하였을 때(도 7의 b) 및 도 7의 c)), 양극성 IRE는 종양 성장에서 단극성 IRE보다 약간 더 우수했다. 양극성 IRE는 근육 수축 및 심장 부정맥의 위험이 낮기 때문에 양극성 IRE를 처리한 그룹이 단극성 IRE를 처리한 그룹보다 빠르게 회복되고 움직이는 것으로 관찰되었다. 또한, 대조군과 비교하여 단극성 IRE 및 양극성 IRE 치료군 모두에서 시간 경과에 따른 체중 변화가 없었다(도 7). 종합하면, 이러한 결과는 양극성 IRE가 안전하게 암 면역 반응을 효과적으로 유도함을 시사한다.In vitro cytotoxicity by IRE was confirmed under unipolar and bipolar electric field conditions through live and dead cell analysis (Figure 5b)). Blue and purple areas indicate ablation areas. When an 80-pulse electric field was applied, there was no difference in the area of the ablation area between unipolar and bipolar conditions, but the ablation area by a 40-pulse bipolar electric field was much wider than that in the unipolar condition. These results are consistent with in vitro cytotoxicity data, indicating that bipolar IRE can ablate cancer cells more effectively than unipolar IRE, even at low pulses. IRE may be advantageous for cancer immunotherapy because it induces immunogenic cell death (ICD). In general, induction of immune cell death (ICD) involves the expression of calreticulin (CRT) and secretion of ATP. Both unipolar and bipolar IRE increased CRT expression and ATP secretion in a pulse number-dependent manner (Figure 5c)), but bipolar IRE showed greater ATP expression than unipolar IRE under all pulse conditions. Additionally, in the in vivo tumor model, higher gene expression of DAMPs, cytokines, chemokines, and immune cell markers was observed at 80 pulses of bipolar IRE compared to the other groups (Figure 5d) and Figure 6). Compared with other groups, expression of genes related to cancer cell proliferation was decreased at 80 pulses of bipolar IRE (Figure 6). When tumor growth inhibition and long-term survival rate were verified under unipolar and bipolar IRE (1000V and 80 pulses) conditions in animal models (Figure 7b) and Figure 7c), bipolar IRE was more effective than unipolar IRE in tumor growth. slightly better. Because bipolar IRE has a lower risk of muscle contractions and cardiac arrhythmias, the group treated with bipolar IRE was observed to recover and move faster than the group treated with unipolar IRE. Additionally, there was no change in body weight over time in both the unipolar IRE and bipolar IRE treatment groups compared to the control group (Figure 7). Taken together, these results suggest that bipolar IRE safely and effectively induces cancer immune responses.
실시예 5. CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 (CMP)의 종양내 체류시간 검증Example 5. Verification of intratumoral residence time of nanoparticle-core (CMP) containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN
면역보강제를 종양내 투여하는 경우, 주입된 면역보강제의 급속한 확산으로 인해 전신 부작용의 위험이 있다. 나노입자는 소분자 약물이나 단백질 약물에 비해 조밀한 종양 세포외 기질에 장기간 체류할 수 있고 APC에 쉽게 포획될 수 있다는 점에서 치료적 이점이 있다. CMP 나노입자의 체류 시간을 확인하기 형광 분자(Cy5)로 표지된 CMP 나노 입자를 제조하고 나노 입자가 주입된 종양의 형광 신호를 시간 경과에 따라 모니터링했다(도 8의 a) 및 도 8의 b)). 종양내 주사 1시간 후, 유리 CpG-ODN과 CMP 나노입자의 형광 강도 사이에는 유의한 차이가 없었다. 그러나 6시간 후에는 CMP 나노입자의 초기 형광 강도의 약 60%가 종양에 남아 있는 반면 유리 CpG-ODN의 형광 신호는 종양에서 거의 관찰되지 않았다. 또한, ICP-MS를 이용하여 종양에 잔류한 Mn 이온을 정량적으로 분석한 결과(도 8의 c)), 48시간 후에도 주입량의 약 35%가 종양에 잔류하는 것으로 나타났다. 주요 장기에 축적된 망간 이온의 양도 치료 3일 후에 ICP-MS를 사용하여 측정되었다(도 10). 치료 후에도 다른 장기에 비해 종양에서 가장 많은 양의 CMP 나노입자가 검출되었다. 이러한 결과는 종양내 주사시 나노입자 제형이 종양 조직의 체류 시간을 증가시켜 나노입자의 효능을 증가시키고 전신적 부작용을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.When adjuvants are administered intratumorally, there is a risk of systemic side effects due to rapid diffusion of the injected adjuvant. Nanoparticles have therapeutic advantages over small molecule drugs or protein drugs in that they can remain in the dense tumor extracellular matrix for a long period of time and can be easily captured by APCs. To determine the retention time of CMP nanoparticles, CMP nanoparticles labeled with a fluorescent molecule (Cy5) were prepared and the fluorescence signal of the tumor injected with the nanoparticles was monitored over time (Figure 8a) and Figure 8b. )). One hour after intratumoral injection, there was no significant difference between the fluorescence intensities of free CpG-ODN and CMP nanoparticles. However, after 6 hours, approximately 60% of the initial fluorescence intensity of CMP nanoparticles remained in the tumor, whereas the fluorescence signal of free CpG-ODN was barely observed in the tumor. In addition, as a result of quantitative analysis of Mn ions remaining in the tumor using ICP-MS (Figure 8c)), it was found that about 35% of the injected amount remained in the tumor even after 48 hours. The amount of manganese ions accumulated in major organs was also measured using ICP-MS after 3 days of treatment (Figure 10). Even after treatment, the highest amount of CMP nanoparticles was detected in the tumor compared to other organs. These results indicate that upon intratumoral injection, nanoparticle formulations can increase the residence time in tumor tissue, increasing the efficacy of nanoparticles and reducing systemic side effects.
Mn은 자기공명영상(MRI) 조영제로 암 진단에 널리 사용되었다. T1 강조 영상을 위한 CMP 나노입자의 능력을 평가하기 위해 다양한 농도에서 CMP 나노입자의 T1-가중 이미지(T1-weighted image)를 조사했다. 도 8의 d)에 도시된 바와 같이, CMP 나노입자의 T1-가중 신호는 농도 의존적으로 증가하였다. 종양에 주입된 CMP 나노입자의 T1-가중 이미지를 대조군과 비교했을 때(도 8의 e)), 종양에 주입된 CMP 나노입자의 T1-가중 신호가 종양 부위에서 명확하게 관찰되었다. 이 결과는 CMP 나노입자를 사용한 이미지 유도 요법의 잠재력을 보여준다.Mn has been widely used in cancer diagnosis as a magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent. To evaluate the ability of CMP nanoparticles for T 1 -weighted imaging , T 1 -weighted images of CMP nanoparticles at various concentrations were examined. As shown in Figure 8 d), the T 1 -weighted signal of CMP nanoparticles increased in a concentration-dependent manner. When comparing the T 1 -weighted image of the CMP nanoparticles injected into the tumor with the control group (Figure 8 e)), the T 1 -weighted signal of the CMP nanoparticles injected into the tumor was clearly observed at the tumor site. These results demonstrate the potential of image-guided therapy using CMP nanoparticles.
실시예 6. CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 (CMP) 및 양극성 비가역적 전기천공법(IRE) 조합의 항암 치료 효과 검증Example 6. Verification of anticancer therapeutic effect of combination of nanoparticle-core (CMP) containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN and bipolar irreversible electroporation (IRE)
CT26 결장암 세포를 BALB/c 마우스에 접종하여 CMP 나노입자와 양극성 IRE의 조합 처리에 의한 생체내 종양 성장 억제를 시험하기 위한 종양 모델을 확립하였다. 평균 종양 크기가 100 mm3 이상인 경우 PBS, 유리 CpG-ODN, 유리 Mn 이온 및 CMP 나노입자를 2일마다 종양 내 주사하였다. 9일째에 양극성 IRE를 80펄스의 1000V 전기장 조건에서 종양에 적용했다. 자세한 동물 실험 일정은 도 10의 a)에 나타내었다. 모든 실험군 간에 체중 변화에는 차이가 없었다(도 11). 또한 혈액 생화학 검사(도 12)에서 IRE와 CMP 나노입자의 병용 치료는 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 CMP 나노입자 및 양극성 IRE 처리에 의해 전신 독성이 유발되지 않았음을 의미한다. 개별 마우스 종양 성장 그래프(도 10의 b))에서 PBS, 유리 CpG-ODN 또는 유리 Mn 이온으로 처리한 그룹에서는 종양 성장 억제 효과가 나타나지 않았다. 그러나 CMP 나노입자군에서 완치된 마우스 2마리, 병용 치료군에서 완치된 마우스 4마리가 관찰되었다. 시간 경과에 따른 평균 종양 크기 변화를 살필 때 PBS, 유리 CpG-ODN 또는 유리 Mn 이온 처리 그룹은 빠른 종양 성장을 보였으나 CMP 나노입자 그룹과 병용 치료군에서 현저히 감소된 종양 성장이 관찰되었다 (도 10의 c)). 특히, CMP 나노입자와 양극성 IRE의 병용 치료군은 다른 군에 비해 유의하게 느린 종양 성장 속도를 보였다. 장기 생존율을 평가한 결과, 병용 치료군이 다른 군에 비해 더 긴 생존율을 보였다(도 10의 c)). 대조군은 모든 마우스가 40일 이전에 사망했지만, 병용 치료군은 50일 동안 90%의 생존율을 보였다. 이러한 결과는 CMP 나노입자와 양극성 IRE의 조합이 우수한 항종양 억제 활성을 나타냄을 시사한다. 시험관 내 데이터(도 3 및 도 5)에서 볼 수 있듯이 CMP 나노 입자에 의해 유발된 타입1 인터페론 분비 및 APC 활성화 및 양극성 IRE에 의한 면역성 세포사(ICD)의 상승 효과 때문인 것으로 생각된다. 또한, 종양에서 CMP 나노입자의 장시간의 체류는 이 치료의 효능과 안전성을 크게 향상시킬 수 있다.CT26 colon cancer cells were inoculated into BALB/c mice to establish a tumor model to test in vivo tumor growth inhibition by combined treatment of CMP nanoparticles and bipolar IRE. When the average tumor size was greater than 100 mm 3 , PBS, free CpG-ODN, free Mn ions, and CMP nanoparticles were injected intratumorally every 2 days. On day 9, bipolar IRE was applied to the tumor under 80 pulses of 1000V electric field. The detailed animal experiment schedule is shown in Figure 10a). There was no difference in body weight change between all experimental groups (FIG. 11). Additionally, in the blood biochemistry test (FIG. 12), the combined treatment of IRE and CMP nanoparticles showed no significant difference from the control group. These results indicate that systemic toxicity was not induced by treatment with CMP nanoparticles and anodic IRE. In the individual mouse tumor growth graph (b) of Figure 10), no tumor growth inhibition effect was observed in the groups treated with PBS, free CpG-ODN, or free Mn ions. However, 2 mice completely cured in the CMP nanoparticle group and 4 mice completely cured in the combination treatment group were observed. When looking at the change in average tumor size over time, the group treated with PBS, free CpG-ODN, or free Mn ions showed rapid tumor growth, but significantly reduced tumor growth was observed in the CMP nanoparticle group and the combination treatment group (Figure 10) c)). In particular, the combination treatment group of CMP nanoparticles and bipolar IRE showed a significantly slower tumor growth rate than the other groups. As a result of evaluating the long-term survival rate, the combination treatment group showed a longer survival rate than the other groups (Figure 10c)). In the control group, all mice died before 40 days, but the combination treatment group showed a 90% survival rate for 50 days. These results suggest that the combination of CMP nanoparticles and amphiphilic IRE exhibits excellent antitumor inhibition activity. As shown in the in vitro data (Figures 3 and 5), this is thought to be due to the synergistic effects of type 1 interferon secretion and APC activation and bipolar IRE-induced immune cell death (ICD) induced by CMP nanoparticles. Additionally, the prolonged retention of CMP nanoparticles in tumors can greatly improve the efficacy and safety of this treatment.
실시예 7. CpG-ODN으로 코팅된 망간 및 탄닌산을 포함하는 나노입자-코어 (CMP) 및 양극성 비가역적 전기천공법(IRE) 조합의 종양내 유입 및 면역세포 활성화 검증Example 7. Verification of intratumoral entry and immune cell activation of nanoparticle-core (CMP) containing manganese and tannic acid coated with CpG-ODN and bipolar irreversible electroporation (IRE) combination.
CT26 결장암 세포를 BALB/c 마우스에 주입하여 CMP 나노입자와 양극성 IRE에 의한 종양 침윤 면역 세포의 생체 내 활성화를 테스트하기 위한 종양 모델을 생성했다. 동물 실험에 대한 자세한 일정은 도 13의 c)에 나타내었다. 종양에서 M1 극성 대식세포를 평가하기 위해 유세포 분석을 사용하여 치료 3일 후 종양에서 분리된 세포를 분석했다(도 13의 d)). 다른 그룹과 비교하여 양극성 IRE와 CMP 나노입자 병용 치료 그룹에서 대부분의 대식세포가 종양에 유입했을 뿐만 아니라 해당 대식세포에서 가장 높은 수준으로 M1 분극 마커 CD80 및 CD86를 발현했다. 또한 종양에 침투하는 DC의 양은 대식세포의 양보다 적었지만 활성화 마커를 발현하는 DC의 수는 대식세포와 유사하게 병용 치료군에서 가장 높았다(도 14).CT26 colon cancer cells were injected into BALB/c mice to generate a tumor model to test in vivo activation of tumor-infiltrating immune cells by CMP nanoparticles and bipolar IRE. A detailed schedule for animal experiments is shown in Figure 13c). To assess M1 polarized macrophages in the tumor, cells isolated from the tumor were analyzed 3 days after treatment using flow cytometry (Figure 13d)). Compared with the other groups, not only did most macrophages in the bipolar IRE and CMP nanoparticle combination treatment group enter the tumor, but those macrophages also expressed the M1 polarization markers CD80 and CD86 at the highest levels. In addition, although the amount of DCs infiltrating the tumor was less than the amount of macrophages, the number of DCs expressing activation markers was highest in the combination treatment group, similar to macrophages (Figure 14).
cGAS/STING 경로가 복합 치료 중 활성화되었는지 확인하기 위해 Western blot 분석을 통해 cGAS/STING 경로에 있으며 타입1 인터페론을 분비할 수 있는 인터페론 조절 인자 3(IRF3) 단백질의 발현을 확인했다(도 13의 e)). 특히, 병용 치료 그룹에서 기본 IRF3 발현은 떨어졌지만 인산화된 IRF3(pIRF3) 수준은 상당히 증가했다(도 13의 f)). 생체 내 처리 후 종양 조직을 수확하고 종양 내로 분비된 타입1 인터페론의 양을 결정했다(도 13의 g)). 타입1 인터페론의 발현은 대조군에 비해 모든 치료군에서 더 높게 확인되었으며, 가장 높은 타입1 인터페론 분비는 병용 치료군에서 확인되었다(p < 0.0001).To confirm whether the cGAS/STING pathway was activated during combined treatment, the expression of interferon regulatory factor 3 (IRF3) protein, which is in the cGAS/STING pathway and can secrete type 1 interferon, was confirmed through Western blot analysis (Figure 13 e )). In particular, in the combination treatment group, basal IRF3 expression fell, but the level of phosphorylated IRF3 (pIRF3) increased significantly (Figure 13f)). After in vivo treatment, tumor tissue was harvested and the amount of type 1 interferon secreted into the tumor was determined (Figure 13g)). The expression of type 1 interferon was confirmed to be higher in all treatment groups compared to the control group, and the highest type 1 interferon secretion was confirmed in the combination treatment group (p < 0.0001).
병용 치료군의 종양 내 유입성 면역 세포를 면역형광 염색으로 분석하였다(도 13의 h)). 종양내 CD80 발현은 대조군보다 병용 치료군에서 유의하게 더 높았다. 이 결과는 도 13의 d) 및 도 14의 유세포 분석 데이터와 일치하며, 이는 IRE 및 CMP 나노입자를 사용한 병용 치료가 종양에서 M1 극성 대식세포 및 성숙한 DC의 수를 증가시킨다는 것을 나타낸다.Inflowing immune cells into the tumor of the combination treatment group were analyzed by immunofluorescence staining (Figure 13h)). Intratumoral CD80 expression was significantly higher in the combination treatment group than in the control group. This result is consistent with the flow cytometry data in Figure 13d) and Figure 14, which indicates that combined treatment with IRE and CMP nanoparticles increases the number of M1 polarized macrophages and mature DCs in tumors.
종합하면, IRE는 DAMP 및 TAA를 생성하는 ICD에 의해 종양으로의 대식세포 유입을 촉진한다. CMP 나노입자를 종양에 투여하면 유입하는 면역 세포의 IRF3 인산화가 유도되어 타입1 인터페론이 분비된다. 결과적으로, CMP 나노입자와 IRE의 조합은 종양 세포의 면역성 세포사(ICD) 및 APC 프라이밍을 통해 종양 미세 환경을 조절함으로써 효율적인 면역 요법이 될 수 있다.Taken together, IRE promotes macrophage influx into tumors by ICDs producing DAMPs and TAAs. When CMP nanoparticles are administered to a tumor, IRF3 phosphorylation is induced in incoming immune cells and type 1 interferon is secreted. As a result, the combination of CMP nanoparticles and IRE can be an efficient immunotherapy by modulating the tumor microenvironment through immunogenic cell death (ICD) of tumor cells and APC priming.
Claims (10)
Nanoparticle-core comprising coordinated manganese and tannic acid; And an anti-cancer composition comprising CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface of the nanoparticle-core.
The anti-cancer composition according to claim 1, wherein the CpG-ODN is bound to the surface of the nanoparticle-core by hydrogen bonding.
The anti-cancer composition according to claim 1, wherein the weight ratio of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid to the CpG-ODN is 1.0 to 10.0.
The anti-cancer composition according to claim 1, wherein the weight ratio of the nanoparticle-core containing manganese and tannic acid to the CpG-ODN is 2.0 to 2.5.
The method of claim 1, wherein the nanoparticle-core; And an anti-cancer composition, wherein the CpG-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) coated on the surface of the nanoparticle-core has a diameter of 40 to 50 nm.
The anti-cancer composition according to claim 1, wherein the anti-cancer composition activates immune cells.
According to claim 1, the cancers to which the anti-cancer composition can be applied include breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, lung cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, An anticancer composition for cancer selected from the group consisting of prostate cancer, bone cancer, head and neck cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, and ureteral cancer.
The anti-cancer composition according to claim 1, wherein the anti-cancer composition is intended to be applied to a subject treated by irreversible electroporation (IRE).
The anti-cancer composition according to claim 8, wherein the anti-cancer composition is intended to be administered to the subject within 48 hours or less from the time the subject receives irreversible electroporation treatment.
The anti-cancer composition according to claim 9, wherein the administration is single or multiple administration.
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| KR101766302B1 (en) | 2015-04-21 | 2017-08-09 | 한국과학기술원 | Cell coating method using a compound, which contains gallate group, and a metal of the lanthanoid series salts or transition metal salts |
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2022
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