KR20230153258A - Composition for preventing or treating coronavirus infectious disease comprising hotspot-oriented peptide-nucleic acids hybrid - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자가 SARS-CoV-2 VOC(알파, 베타, 감마, 델타, 및 오미크론)의 RBD에 대한 결합 친화도가 높은 것을 확인하였고, 특히, 가장 변이가 심한 오미크론에서 가장 큰 결합 내성을 보인 것을 확인하였다. 아울러, 상기 하이브리드 분자가 RBD-결합 핵산 앱타머, 마크로시클릭 펩타이드, 단일 클론 항체 등과의 경쟁에서도 RBD 결합 친화도가 높은 것을 확인하였다. 또한, 우수한 뉴클레아제 저항성 및 혈청 안정성을 보였는 바, SARS-CoV-2 뿐만 아니라 바이러스 중화제로서의 잠재력이 우수한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating coronavirus infection, including a hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecule. It was confirmed that the in vitro evolution-based hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecule produced through the production method of the present invention has high binding affinity to the RBD of SARS-CoV-2 VOC (alpha, beta, gamma, delta, and omicron). In particular, it was confirmed that Omicron, which had the greatest variation, showed the greatest binding resistance. In addition, it was confirmed that the hybrid molecule had high RBD binding affinity even in competition with RBD-binding nucleic acid aptamers, macrocyclic peptides, and monoclonal antibodies. In addition, it showed excellent nuclease resistance and serum stability, showing excellent potential as a virus neutralizing agent not only for SARS-CoV-2.
Description
본 발명은 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating coronavirus infection, including a hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecule.
감염이 일어날 때, 많은 바이러스가 숙주 세포로 진입하는 동안 세포막 단백질을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 수천 개의 스파이크 단백질로 덮여 있으며 막 수용체인 인간 안지오텐신 전환 효소 2(hACE2)에 강하게 결합하여 막 융합이 일어난다. SARS-CoV-2를 포함한 바이러스는 전염성을 높이기 위해 돌연변이가 발생해 시간이 지남에 따라 바이러스 전파력을 강화시키고 면역 회피가 일어난다. SARS-CoV-2가 2019년에 처음 보고된 이후 현재까지 많은 변종이 등장했으며, 우려 변이(variant of concern, VOC)로 알파(B.1.1.7), 베타(B.1.351), 감마(P.1), 델타(B.1.617.2), 및 오미크론(B.1.1.529)이 서로 다른 대륙에서 독립적으로 발생하였다. 특정 hACE2 인식에 기여하는 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)은 많은 일반적인 돌연변이를 포함하는 것으로 알려져 있다. 특히 결합 핫스팟에 위치한 일부 위치 돌연변이(예: N501Y)는 표적 hACE2에 대한 RBD의 결합 친화성을 증가시켜 SARS-CoV-2의 전염성을 높이는 것으로 확인되었다.When infection occurs, many viruses specifically recognize membrane proteins during entry into host cells. For example, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is covered with thousands of spike proteins and binds strongly to the membrane receptor human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2), resulting in membrane fusion. Viruses, including SARS-CoV-2, mutate to increase transmissibility, enhancing viral transmissibility over time and causing immune evasion. Since SARS-CoV-2 was first reported in 2019, many variants have emerged, with alpha (B.1.1.7), beta (B.1.351), and gamma (P) variants of concern (VOC). .1), Delta (B.1.617.2), and Omicron (B.1.1.529) occurred independently on different continents. The receptor binding domain (RBD) of the spike protein, which contributes to specific hACE2 recognition, is known to contain many common mutations. In particular, some positional mutations located in binding hotspots (e.g. N501Y) were found to increase the binding affinity of RBD to the target hACE2, thereby increasing the infectivity of SARS-CoV-2.
변이체의 빈번한 발생은 항바이러스 예방 및 치료 연구에 큰 걸림돌이 될 수 있다. 친화성 시약(affinity reagents)의 사용은 바이러스와 숙주 세포 사이의 특정 상호작용을 차단함으로써 바이러스 감염 회피에 효과적인 방법이 될 수 있다. SARS-CoV-2에 대해 스파이크 단백질의 다양한 에피토프를 인식하기 위해 다수의 중화 친화성 시약이 개발되었으며, 그 중 일부는 hACE2 접촉 표면과 부분적으로 겹치는 것으로 알려져 있다. 그러나 회피 돌연변이는 스파이크 단백질의 구조적 변화를 일으키기 때문에 친화성 시약이 결합 부위를 특이적으로 인식하지 못하여 중화 효능이 저하될 수밖에 없다. 대안으로 비경쟁 친화성 시약을 함께 투여할 수 있으며, 미국 식품의약국(FDA)은 SARS-CoV-2 변종의 급속한 출현으로 REGN-COV2와 같은 항체 칵테일의 긴급 사용 승인을 발표하였다. 회피 돌연변이를 축적하며 바이러스 변이체는 숙주 세포 수용체와의 결합 상호 작용이 더욱 강화되고, 항체 혼합물에 대해 내성이 강화되는 경향이 있다. 따라서, 표적 바이러스에 대한 높은 친화성과 함께, 변이체에 대한 결합 내성을 고려하여 효과적이고 효율적인 중화제를 개발해야 한다.The frequent occurrence of variants can be a major obstacle to antiviral prevention and treatment research. The use of affinity reagents can be an effective way to avoid viral infection by blocking specific interactions between the virus and host cells. A number of neutralizing affinity reagents have been developed for SARS-CoV-2 to recognize various epitopes of the spike protein, some of which are known to partially overlap with the hACE2 contact surface. However, because avoidance mutations cause structural changes in the spike protein, the affinity reagent cannot specifically recognize the binding site, which inevitably reduces neutralization efficacy. Alternatively, non-competitive affinity reagents can be administered together, and the US Food and Drug Administration (FDA) has issued emergency use authorization for antibody cocktails such as REGN-COV2 due to the rapid emergence of SARS-CoV-2 variants. By accumulating escape mutations, viral variants tend to have stronger binding interactions with host cell receptors and become more resistant to antibody mixtures. Therefore, an effective and efficient neutralizing agent must be developed by considering binding resistance to variants along with high affinity for the target virus.
이에 본 발명자들은 바이러스 변이체의 향상된 수용체 인식에 영감을 받아 표적 바이러스 및 그 변이체와 강력하게 상호 작용할 수 있는 수용체 모방 합성 시약의 생성을 새롭게 발명하였다. 구체적으로, 바이러스-수용체 인터페이스의 중심에서 결합 자유 에너지에 크게 기여하는 숙주 세포 수용체의 펩타이드 모티프에 집중하였다. 안정적이지만 불용성인 막투과 도메인이 없으면 짧은 핫스팟 펩타이드는 표적 바이러스에 대한 최적의 결합 능력을 유지할 수 없다. 이 과정에서 구조적 안정제 역할뿐만 아니라 결합 협력자(binding cooperator) 역할을 할 수 있는 가용성인 핵산과 상승적으로 통합하였다. 수많은 핫스팟 펩타이드 결합 무작위 핵산(~1014)에서 핫스팟 상호작용을 최대화하는 앱타머 유사 스캐폴드를 선택적으로 분리 증폭하여 하이브리드 리간드를 쉽게 제조할 수 있으며, 이는 바이러스 변이체에 대한 강한 결합으로 이어질 수 있다.Accordingly, the present inventors, inspired by the improved receptor recognition of virus variants, invented a new creation of a receptor-mimicking synthetic reagent that can strongly interact with the target virus and its variants. Specifically, we focused on peptide motifs of host cell receptors that contribute significantly to the binding free energy at the center of the virus-receptor interface. Without a stable but insoluble transmembrane domain, short hotspot peptides cannot maintain optimal binding ability to target viruses. In this process, it was synergistically integrated with a soluble nucleic acid that could act not only as a structural stabilizer but also as a binding cooperator. Hybrid ligands can be easily prepared by selectively isolating and amplifying aptamer-like scaffolds that maximize hotspot interactions from numerous hotspot peptide-binding random nucleic acids (~10 14 ), which can lead to strong binding to viral variants.
또한, 본 발명자들은 SARS-CoV-2의 핫스팟과 직접 상호 작용하는 hACE2 수용체 모방 하이브리드 리간드를 성공적으로 만들었다. 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드 사이의 상승적 상호 작용은 보고된 친화성 시약(예: 펩타이드, 앱타머 또는 중화 항체)보다 RBD에 더 효과적으로 결합하여 SARS-CoV-2을 효율적으로 차단하였다. 아울러, 다양한 SARS-CoV-2 변종(Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron)을 인식할 때 핫스팟 결합 hACE2 모방체는 결합 능력에 변화가 없었으며 결합 내성을 유지한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Additionally, the present inventors successfully created an hACE2 receptor mimic hybrid ligand that directly interacts with the hotspot of SARS-CoV-2. The synergistic interaction between the hotspot peptide and the aptamer scaffold efficiently blocked SARS-CoV-2 by binding to the RBD more effectively than reported affinity reagents (e.g., peptides, aptamers, or neutralizing antibodies). In addition, the present invention was completed by confirming that the hotspot binding hACE2 mimetic had no change in binding ability and maintained binding resistance when recognizing various SARS-CoV-2 variants (Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron). .
따라서, 본 발명의 목적은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물로, Therefore, the object of the present invention is a composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고, The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.The nucleic acid provides a composition for preventing or treating coronavirus infection, which includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다: Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by a method comprising the following steps:
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;(a) preparing a peptide-nucleic acid hybrid by site-specific combining a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a random nucleic acid library;
(b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및(b) mixing and cultivating the target protein-coated magnetic beads and the peptide-nucleic acid hybrid of step (a); and
(c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.(c) Selecting peptide-nucleic acid hybrid molecules that bind to the target protein using a magnet.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 억제용 의약외품 조성물로, Another object of the present invention is a quasi-drug composition for preventing or suppressing coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고, The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 억제용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.The nucleic acid provides a quasi-drug composition for preventing or suppressing coronavirus infection, which includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로,Another object of the present invention is to provide an antiviral composition against coronavirus, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고, The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.The aim is to provide an antiviral composition against coronavirus, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스에 대한 중화용 조성물로,Another object of the present invention is a composition for neutralizing coronaviruses, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고, The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스에 대한 중화용 조성물을 제공하는 것이다.The aim is to provide a composition for neutralizing coronavirus, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used herein are for descriptive purposes only and should not be construed as limiting. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, terms such as “comprise” or “have” are intended to designate the presence of features, numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof described in the specification, but are not intended to indicate the presence of one or more other features. It should be understood that this does not exclude in advance the possibility of the existence or addition of elements, numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless otherwise defined, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as generally understood by a person of ordinary skill in the technical field to which the embodiments belong. Terms defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related technology, and unless explicitly defined in the present application, should not be interpreted in an ideal or excessively formal sense. No.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물로,The present invention is a composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고,The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.The nucleic acid provides a composition for preventing or treating coronavirus infection, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 다음의 방법을 통해 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: In the present invention, the peptide-nucleic acid hybrid molecule can be prepared through the following method, but is not limited to this:
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;(a) preparing a peptide-nucleic acid hybrid by site-specific combining a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a random nucleic acid library;
(b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및(b) mixing and cultivating the target protein-coated magnetic beads and the peptide-nucleic acid hybrid of step (a); and
(c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.(c) Selecting peptide-nucleic acid hybrid molecules that bind to the target protein using a magnet.
또한, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:Additionally, the method may further include, but is not limited to, the following steps:
(d) 상기 단계 (c)에서 선별된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 핵산 부분을 선택적으로 증폭하고 복제하는 단계;(d) selectively amplifying and replicating the nucleic acid portion of the peptide-nucleic acid hybrid molecule selected in step (c);
(e) 상기 단계 (d)에서 생성된 이중 가닥 DNA를 핵산 가수분해효소를 이용하여 단일 가닥 DNA로 제조하여 정제하는 단계; 및(e) purifying the double-stranded DNA produced in step (d) into single-stranded DNA using nucleic acid hydrolase; and
(f) 상기 단계 (e)의 단일 가닥 DNA로 구성된 새로운 무작위 핵산 라이브러리를 제조하여, 상기 단계 (a) 내지 (f)의 선별, 증폭, 및 정제 과정을 반복하는 단계.(f) preparing a new random nucleic acid library composed of the single-stranded DNA of step (e) and repeating the selection, amplification, and purification processes of steps (a) to (f).
본 발명에 있어서, 상기 핫스팟(hotspot) 유래 펩타이드는 표적 단백질 및 이의 수용체 사이의 결합과 매우 관련이 있는 것으로 여겨지는 펩타이드 잔기를 의미한다. 상기 핫스팟 유래 펩타이드는 표적 단백질 및 이의 수용체 사이의 결합 부위의 아미노산일 수 있으며, 표적 단백질 서열 중 해당 결합 부위에 관여하는 아미노산 전부 또는 일부; 또는 수용체 서열 중 해당 결합 부위에 관여하는 아미노산 전부 또는 일부일 수 있다. 본 발명에서는 상기 핫스팟 유래 펩타이드의 바람직한 일 구현예로 hACE2 유래 핫스팟 펩타이드, 또는 hACE2 유래 RBD 결합 펩타이드를 이용하였으며, 구체적으로 hACE2의 RBD 접촉 잔기 중에서, L351에서 R357까지(LGKGDFR, 서열번호 15)의 7개 아미노산 단편을 핫스팟 유래 펩타이드로 이용하였으며, 상기 핫스팟 유래 펩타이드는 서열번호 15와 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the hotspot-derived peptide refers to a peptide residue that is believed to be highly related to binding between a target protein and its receptor. The hotspot-derived peptide may be an amino acid in the binding site between the target protein and its receptor, and may include all or part of the amino acids involved in the binding site in the target protein sequence; Alternatively, it may be all or part of the amino acids involved in the binding site in the receptor sequence. In the present invention, an hACE2-derived hotspot peptide or an hACE2-derived RBD-binding peptide was used as a preferred embodiment of the hotspot-derived peptide. Specifically, among the RBD contact residues of hACE2, 7 from L351 to R357 (LGKGDFR, SEQ ID NO. 15) A dog amino acid fragment was used as a hotspot-derived peptide, and the hotspot-derived peptide may include a sequence having 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100% identity with SEQ ID NO: 15, but is limited thereto. It doesn't work.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 코로나 바이러스의 스파이크 단백질의 수용체 결합 부위(receptor binding domain, RBD)에 결합할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 RBD 결합 친화성 시약과 경쟁에 있어서도 RBD와 우수한 결합력을 나타낼 수 있으며, 스파이크 단백질의 결합 부위(RBD)에 돌연변이가 생긴 경우에도 우수한 결합력을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 코로나 바이러스의 RBD와 hACE2(human angiotensin-converting enzyme 2) 수용체의 상호작용을 억제할 수 있으며, 코로나 바이러스를 중화시킬 수 있으며, 코로나 바이러스의 VOC(variant of concern)도 중화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the peptide-nucleic acid hybrid molecule can bind to the receptor binding domain (RBD) of the spike protein of the coronavirus. In addition, the peptide-nucleic acid hybrid molecule can exhibit excellent binding affinity to RBD even in competition with RBD binding affinity reagents, and can exhibit excellent binding affinity even when mutations occur in the binding site (RBD) of the spike protein. Therefore, the peptide-nucleic acid hybrid molecule can inhibit the interaction between the RBD of the coronavirus and the hACE2 (human angiotensin-converting enzyme 2) receptor, neutralize the coronavirus, and reduce the VOC (variant of concern) of the coronavirus. It can also be neutralized, but is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 RBD는 야생형(서열번호 23) 또는 돌연변이형일 수 있으며, 상기 돌연변이는 N501Y, E484K, K417N, K417T, T478K, L452R, E484A, G339D, S371L, S373P, S375F, N440K, S477N, G446S, Q493R, G496S, Q498R, 및 Y505H로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the RBD may be wild type (SEQ ID NO. 23) or mutant, and the mutations include N501Y, E484K, K417N, K417T, T478K, L452R, E484A, G339D, S371L, S373P, S375F, N440K, S477N, G446S. , Q493R, G496S, Q498R, and Y505H, but is not limited thereto.
[[ RBDRBD 서열: SARS- Sequence: SARS- CoVCoV -2 스파이크 단백질 중 [319-537] 아미노산 서열][319-537] amino acid sequence among -2 spike proteins]
319 - rv qptesivrfp nitnlcpf g e vfnatrfasv yawnrkrisn cvadysvlyn s a s f s tfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi apgqtg k iad ynyklpddft gcviawnsn n ldskv g gnyn y l yrlfrksn lkpferdist eiyqag st pc ngv e gfncyf pl q sy g f q pt n gvg y qpyrv vvlsfellha patvcgpkks tnlvknk - 537(서열번호 23)319 - rv qptesivrfp nitnlcpf g e vfnatrfasv yawnrkrisn cvadysvlyn s a s f s tfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi apgqtg k iad ynyklpddft gcviawnsn n ldskv g gnyn y l yrlfrksn lkpferdist eiy qag st pc ngv e gfncyf pl q sy g f q pt n gvg y qpyrv vvlsfellha patvcgpkks tnlvknk - 537 (SEQ ID NO: 23)
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 뉴클레아제 저항성 또는 혈청 안정성의 특징을 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 치료 목적 및 제제화 방법에 따라 다양한 투여 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여에 따라 투여될 수 있으나, 바람직하게는 정맥 또는 호흡기로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 하이브리드 리간드, 핫스팟 펩타이드 결합 앱타머 스캐폴드, 수용체-모방 하이브리드 리간드, 또는 hACE2-모방 하이브리드 리간드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the peptide-nucleic acid hybrid molecule may satisfy the characteristics of nuclease resistance or serum stability, but is not limited thereto. Additionally, peptide-nucleic acid hybrid molecules can be administered through various administration routes depending on the therapeutic purpose and formulation method. For example, oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal injection, intravaginal injection, ocular administration, ear administration, nasal administration. It may be administered by administration, inhalation, spray through the mouth or nose, dermal administration, or transdermal administration, but is preferably administered intravenously or through the respiratory tract, but is not limited thereto. Additionally, the peptide-nucleic acid hybrid molecule may be, but is not limited to, a hybrid ligand, a hotspot peptide binding aptamer scaffold, a receptor-mimetic hybrid ligand, or an hACE2-mimetic hybrid ligand.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 핫스팟 유래 펩타이드와 클릭 반응으로 결합되어 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 핫스팟 펩타이드와 위치 특이적으로 연결된 수많은 다른 핵산 라이브러리에서 선택 및 증폭의 반복 주기에 의해 시험관 내에서 분리될 수 있고, 선택 및 증폭의 반복 주기를 통해 펩타이드-핵산 하이브리드 분자로 보다 높은 결합력을 제공할 수 있는 핵산이 선별될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 스파이크 단백질과 이의 수용체 사이의 결합 부위(RBD)에 대한 결합력 및 수용성을 증가시킬 수 있으며, hACE2 유래 RBD 결합 펩타이드를 구조적으로 안정화시킬 수 있다. 또한, 상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함할 수 있으며, 상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 핵산은 헥시닐 변형 ssDNA, 앱타머 스캐폴드, 또는 핫스팟 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the nucleic acid can be used to prepare a peptide-nucleic acid hybrid molecule by combining with a hotspot-derived peptide through a click reaction. Additionally, the nucleic acid can be isolated in vitro by repeated cycles of selection and amplification from numerous other nucleic acid libraries site-specifically linked to the hotspot peptide, and converted into a peptide-nucleic acid hybrid molecule through repeated cycles of selection and amplification to obtain a higher molecular weight. Nucleic acids that can provide binding capacity can be selected. In addition, the nucleic acid can increase the binding force and solubility of the binding site (RBD) between the spike protein and its receptor of the peptide-nucleic acid hybrid molecule, and can structurally stabilize the hACE2-derived RBD binding peptide. In addition, the nucleic acid may include one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20, and the nucleic acid may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20. It may include, but is not limited to, a sequence having 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100% identity with the selected base sequence. Additionally, the nucleic acid may be hexynyl modified ssDNA, an aptamer scaffold, or a hotspot peptide-supported aptamer scaffold, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 앱타머 스캐폴드는 두 개 이상의 분자를 결합해 해당 분자를 기능적인 단위로 묶어주며, 특정 분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드라고도 불리며, 핫스팟 유래 펩타이드와 결합되어 바이러스 중화 기능을 가지고, 펩타이드와 앱타머 스캐폴드의 하이브리드 분자가 스파이크 단백질에 결합할 수 있다.In the present invention, an aptamer scaffold refers to a nucleic acid that combines two or more molecules to bind the molecules into a functional unit and can specifically and strongly bind to a specific molecule. In one embodiment of the present invention, also called a peptide-supported aptamer scaffold, it has a virus neutralizing function by combining with a hotspot-derived peptide, and the hybrid molecule of the peptide and the aptamer scaffold can bind to the spike protein.
본 발명에 있어서, 상기 코로나 바이러스는 인간 코로나 바이러스 229E(HCoV-229E), 인간 코로나 바이러스 OC43(HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나 바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤븐 코로나 바이러스), 인간 코로나 바이러스 HKU1, 중동호흡기증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스 2(SARS-Cov-2), 및 이들의 변이종으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있으며, 상기 SARS-Cov-2의 변이종은 알파(α), 베타(β), 감마(γ), 델타(δ), 및 오미크론(ο) 변이종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the coronavirus is human coronavirus 229E (HCoV-229E), human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), human coronavirus NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus), human coronavirus HKU1, Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-Cov-2), and variants thereof. In addition, the variant of SARS-Cov-2 may be any one selected from the group consisting of alpha (α), beta (β), gamma (γ), delta (δ), and omicron (ο) variants. Not limited.
본 발명에 있어서, "코로나바이러스"는 니도바이러스목, 코로나바이러스과, 코로나바이러스아과 혹은 Torovirinae에 포함된 바이러스속인 종에 해당한다. 코로나바이러스는 +ssRNA와 나선형 대칭형 뉴클레오펩시드로 감싸진 바이러스이다. 또한, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 지금까지 사람을 감염시키는 7번째 코로나바이러스이고, 나머지는 인간 코로나바이러스 229E(HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 OC43(HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤븐 코로나바이러스), 인간 코로나바이러스 HKU1, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 이다. 코로나바이러스들의 전반적인 구조에 기여하는 단백질들은 스파이크, 외피 및 뉴클레오켑시드(Nucleocapsid)이다. SARS 코로나바이러스의 경우, 스파이크(spike(S)) 위에 있는 확정된 결합수용기 도메인이 바이러스의 부착부분을 이것의 세포 수용기인 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)로 중재한다. 몇몇 코로나바이러스(특히, 베타코로나바이러스 하위집단 구성원)는 또한 항체 에스테라아제라고 불리는 단백질 같은 짧은 스파이크를 가진다. 코로나바이러스는 바이러스성 폐렴이나 2차적인 세균성 폐렴을 일으킬 수 있으며, 직접적인 바이러스성 기관지염이나 2차적인 세균성 기관지염도 일으킬 수 있다. 2003년에 발견된 인간 코로나바이러스는 중증급성호흡기증후군(SARS)를 일으키는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)로, 상부 및 하부 호흡기 감염을 유발한다. In the present invention, “coronavirus” corresponds to a species of the virus genus included in the Nidovirus order, Coronaviridae, Coronaviridae, or Torovirinae. Coronaviruses are viruses enveloped in +ssRNA and a helical symmetric nucleopeside. Additionally, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the seventh coronavirus to infect humans so far, the others being human coronavirus 229E (HCoV-229E) and human coronavirus OC43 (HCoV-OC43). , severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), human coronavirus NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus), human coronavirus HKU1, and Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). The proteins that contribute to the overall structure of coronaviruses are the spike, envelope, and nucleocapsid. In the case of the SARS coronavirus, a defined binding receptor domain on the spike (S) mediates attachment of the virus to its cellular receptor, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). Some coronaviruses (particularly members of the betacoronavirus subgroup) also have short spike-like proteins called antibody esterases. Coronaviruses can cause viral pneumonia or secondary bacterial pneumonia, and can also cause direct viral bronchitis or secondary bacterial bronchitis. The human coronavirus discovered in 2003 is severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), which causes upper and lower respiratory tract infections.
또한, 본 발명에 있어서, 사용된 용어 "SARS-CoV-2"는, 신종 코로나바이러스를 지칭하는 것으로서, RNA 바이러스로서 사스와 메르스의 변종을 나타낸다. SARS-CoV-2는 사스와 약 79.7%의 서열 동일성을, 메르스와 약 50% 공유한다. 하지만, 사스와 메르스와는 대조적으로, 2019-nCoV의 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)은 1 개의 RBD domain이 위로 돌출된 형태의 구조를 형성하며, 이로 인해 타겟 리셉터(receptor)인 ACE2(angiotensin)와 100 내지 1,000배 더 강력한 결합력을 나타낸다. 이러한 강력한 결합력은 세포 내로 침투를 더욱 더 용이하게 하여 전염력을 높이는 원인으로 작용한다.Additionally, in the present invention, the term "SARS-CoV-2" used refers to a new coronavirus, which is an RNA virus and represents a variant of SARS and MERS. SARS-CoV-2 shares approximately 79.7% sequence identity with SARS and approximately 50% with MERS. However, in contrast to SARS and MERS, the spike glycoprotein of 2019-nCoV forms a structure with one RBD domain protruding upward, which causes it to interact with the target receptor, ACE2 (angiotensin). It exhibits a binding force that is 100 to 1,000 times stronger. This strong binding force makes it easier to penetrate into cells and increases infectiousness.
또한, 본 발명에서 있어서, 상기 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-Cov-2)의 변이종은 코로나19 변이바이러스와 동일한 의미이다. 상기 변이 바이러스는 주요 변이바이러스[우려변이(VOC, Variant of Concern)]와 기타 변이바이러스(VOI, Variant of Interest)로 나뉘며, 지역유래 명칭의 사용 방지 및 원활한 소통을 위해 그리스 알파벳(알파, 베타, 감마 등)으로 변이바이러스를 명명하고 있다. 상기 주요 변이바이러스는 전파력 증가 혹은 역학적으로 부정적 변화가 확인되고, 병원성 증가 혹은 임상적으로 질환 중증도 변화가 확인되거나, 진단, 백신, 치료제 등의 유효성 저하가 확인된 변이 바이러스를 말한다. 현재 VOC는 오미크론 변이종이며, 과거에는 알파, 베타, 감마, 델타 변이종 등이 있었다. 구체적으로, SARS-Cov-2의 알파(α) 변이종은 2020년 9월 영국에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.1.7이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 베타(β) 변이종은 2020년 5월 남아프리카 공화국에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.351이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 감마(γ) 변이종은 2020년 11월 브라질에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 P.1이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 델타(δ) 변이종은 2020년 10월 인도에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.617.2이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 오미크론() 변이종은 2021년 11월 다수 국가에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.1.529이다.Additionally, in the present invention, the variant of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-Cov-2) has the same meaning as the variant COVID-19 virus. The above mutant viruses are divided into major mutant viruses (VOC, Variant of Concern) and other mutant viruses (VOI, Variant of Interest), and to prevent the use of names of regional origin and to facilitate communication, the Greek alphabet (alpha, beta, Mutant viruses are named (gamma, etc.). The above-mentioned major mutant viruses refer to mutant viruses that have been confirmed to have increased transmissibility or negative epidemiological changes, increased pathogenicity or clinically confirmed changes in disease severity, or reduced effectiveness of diagnostics, vaccines, and treatments. Currently, VOC is an omicron variant, and in the past, there were alpha, beta, gamma, and delta variants. Specifically, the alpha (α) variant of SARS-Cov-2 was discovered in the UK in September 2020, and its classification system is B.1.1.7. In addition, the beta (β) variant of SARS-Cov-2 was discovered in South Africa in May 2020, and its classification system is B.1.351. In addition, the gamma (γ) variant of SARS-Cov-2 was discovered in Brazil in November 2020, and its classification system is P.1. In addition, the delta (δ) variant of SARS-Cov-2 was discovered in India in October 2020, and its classification system is B.1.617.2. In addition, the omicron of SARS-Cov-2 ( ) The variant was discovered in multiple countries in November 2021, and its lineage classification system is B.1.1.529.
본 발명에서, 상기 코로나바이러스 감염증은 코로나 바이러스 호흡기 감염 질환일 수 있다. 상기 바이러스성 호흡기 감염질환은 기침, 재채기, 두통, 코막힘, 인후통, 설사, 손가락 또는 발가락의 변색, 결막염, 고열, 천명, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 천식, 후각 및 미각 상실, 및 호흡기 부전 등의 증상을 나타낼 수 있다. 상기 코로나 바이러스가 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-Cov-2)인 경우에는, 발열과 호흡기 증상(기침, 인후통, 호흡곤란)을 주요 증상으로 하고, 이와 더불어 두통, 근육통, 객혈과 오심, 오한, 가슴 통증, 설사 등의 증상을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 코로나바이러스 감염증은 코로나바이러스 감염증 19(COVID-19)일 수 있다.In the present invention, the coronavirus infection may be a coronavirus respiratory infection disease. The above viral respiratory infectious diseases include coughing, sneezing, headache, nasal congestion, sore throat, diarrhea, discoloration of fingers or toes, conjunctivitis, high fever, wheezing, bronchitis, bronchiolitis, pneumonia, asthma, loss of smell and taste, and respiratory failure. Symptoms may appear. If the coronavirus is Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-Cov-2), the main symptoms are fever and respiratory symptoms (cough, sore throat, difficulty breathing), along with headache, muscle pain, hemoptysis, and nausea. Symptoms may include chills, chest pain, and diarrhea. Additionally, the coronavirus infection may be coronavirus disease 19 (COVID-19).
본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다: The present invention provides a composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by a method comprising the following steps:
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;(a) preparing a peptide-nucleic acid hybrid by site-specific combining a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a random nucleic acid library;
(b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및(b) mixing and cultivating the target protein-coated magnetic beads and the peptide-nucleic acid hybrid of step (a); and
(c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.(c) Selecting peptide-nucleic acid hybrid molecules that bind to the target protein using a magnet.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:In the present invention, the method may further include, but is not limited to, the following steps:
(d) 상기 단계 (c)에서 선별된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 핵산 부분을 선택적으로 증폭하고 복제하는 단계;(d) selectively amplifying and replicating the nucleic acid portion of the peptide-nucleic acid hybrid molecule selected in step (c);
(e) 상기 단계 (d)에서 생성된 이중 가닥 DNA를 핵산 가수분해효소를 이용하여 단일 가닥 DNA로 제조하여 정제하는 단계; 및(e) purifying the double-stranded DNA produced in step (d) into single-stranded DNA using nucleic acid hydrolase; and
(f) 상기 단계 (e)의 단일 가닥 DNA로 구성된 새로운 무작위 핵산 라이브러리를 제조하여, 상기 단계 (a) 내지 (f)의 선별, 증폭, 및 정제 과정을 반복하는 단계.(f) preparing a new random nucleic acid library composed of the single-stranded DNA of step (e) and repeating the selection, amplification, and purification processes of steps (a) to (f).
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 (a) 단계 이후, 펩타이드-핵산 하이브리드를 열 변성 및 냉각하여 핵산의 3D 폴딩을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 단계를 통해 핫스팟 펩타이드를 올바른 위치와 방향으로 배치할 수 있으며, 수용체와 유사하거나 더욱 강한 결합 특성을 유지할 수 있는 안정적인 3D 압타머 스캐폴드가 제조될 수 있다. In the present invention, the method may further include the step of inducing 3D folding of the nucleic acid by heat denaturing and cooling the peptide-nucleic acid hybrid after step (a). Through this step, the hotspot peptide can be placed in the correct position and orientation, and a stable 3D aptamer scaffold can be fabricated that can maintain binding properties similar to or stronger than those of the receptor.
상기 (a) 단계는 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계로, 상기 핫스팟 유래 펩타이드는 단리 된 핫스팟 유래 펩타이드의 C 말단 또는 N 말단에 클릭 화학 반응에 사용될 수 있는 모든 작용기가 결합된 펩타이드일 수 있으며, 예를 들어, 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 아자이드(azide), 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 펩타이드일 수 있고, 바람직하게는 C 말단 또는 N 말단에 아자이드가 결합(태그)된 펩타이드일 수 있으며, 더 바람직하게 아자이드-태그 LGKGDFR(L351에서 R357, 서열번호 15) 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The step (a) is a step of preparing a peptide-nucleic acid hybrid, and the hotspot-derived peptide may be a peptide in which all functional groups that can be used in a click chemical reaction are bound to the C-terminus or N-terminus of the isolated hotspot-derived peptide, For example, Azido lysine, Azidobutanoic acid, and Azinoacetic acid, azide, hexynyl, 5-octadiynyl (5- It may be a peptide to which one or more functional groups selected from the group consisting of octadiynyl) and alkyne are bound, and preferably, it may be a peptide to which azide is bound (tagged) to the C-terminus or N-terminus, and more preferably, It may be, but is not limited to, an azide-tagged LGKGDFR (L351 to R357, SEQ ID NO: 15) peptide.
상기 (a) 단계의 무작위 핵산 라이브러리는 5' 말단에 클릭 화학반응에 사용될 수 있는 모든 작용기가 결합된 핵산일 수 있으며, 예를 들어, 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 알카인(alkyne), 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 단일 가닥 핵산을 포함하며, 바람직하게는 5' 말단에 헥시닐이 결합된 핵산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 핫스팟 유래 펩타이드와 핵산 라이브러리에 결합된 작용기는 상호 교환될 수 있다. 또한, 상기 무작위 핵산 라이브러리는 하기와 같은 구조를 갖는 무작위 핵산들을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:The random nucleic acid library in step (a) may be a nucleic acid in which all functional groups that can be used in click chemistry are bound to the 5' end, for example, hexynyl, 5-octadiynyl, ), alkyne, Azido lysine, Azidobutanoic acid, and Azinoacetic acid, and at least one functional group selected from the group consisting of azide is combined It includes a single-stranded nucleic acid, preferably a nucleic acid with hexynyl bound to the 5' end, but is not limited thereto. Additionally, the hotspot-derived peptide and the functional group bound to the nucleic acid library can be interchanged. Additionally, the random nucleic acid library may be characterized as containing random nucleic acids having the following structure:
5'-작용기-정방향 프라이머-[Nx] -역방향 프라이머-3',5'-functional group-forward primer-[N x ]-reverse primer-3',
상기 작용기는 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 알카인(alkyne), 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이며,The functional groups include hexynyl, 5-octadiynyl, alkyne, Azido lysine, Azidobutanoic acid, Azinoacetic acid, And selected from the group consisting of azide,
여기에서 N 은 A, T, C 또는 G이고, x 는 25 내지 100 의 정수.where N is A, T, C or G, and x is an integer from 25 to 100.
상기 무작위 핵산 라이브러리의 길이는 10nm 미터 이하의 직경을 갖는 표적 단백질에 정교하게 결합하기 위해 최소화되며, 라이브러리의 다양성을 최대화하기 위한 적절성을 만족하는 길이일 수 있으나, 구체적으로, 상기 무작위 핵산 라이브러리의 염기서열 개수는 55 내지 130, 55 내지 110, 55 내지 90, 55 내지 80, 60 내지 130, 60 내지 110, 60 내지 90, 60 내지 80, 65 내지 130, 65 내지 110, 65 내지 90, 65 내지 80, 65 내지 75, 또는 70일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The length of the random nucleic acid library is minimized to precisely bind to a target protein with a diameter of 10 nm meters or less, and may be a length that satisfies the appropriateness for maximizing the diversity of the library, but specifically, the bases of the random nucleic acid library The sequence numbers are 55 to 130, 55 to 110, 55 to 90, 55 to 80, 60 to 130, 60 to 110, 60 to 90, 60 to 80, 65 to 130, 65 to 110, 65 to 90, 65 to 80. , may be 65 to 75, or 70, but is not limited thereto.
또한, 상기 x는 25 내지 100, 25 내지 80, 25 내지 60, 25 내지 50, 30 내지 100, 30 내지 80, 30 내지 60, 30 내지 50, 35 내지 100, 35 내지 80, 35 내지 60, 35 내지 50, 35 내지 45, 또는 40일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, x is 25 to 100, 25 to 80, 25 to 60, 25 to 50, 30 to 100, 30 to 80, 30 to 60, 30 to 50, 35 to 100, 35 to 80, 35 to 60, 35 It may be from 50 to 50, 35 to 45, or 40, but is not limited thereto.
본 발명의 바람직한 일 구현예서는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하였으며, 상기 무작위 핵산 라이브러리에는 다음과 같은 구조식의 무작위 핵산들이 포함된다: GGAAGAGATGGCGAC-N40-AGCTGATCCTGATGG.In a preferred embodiment of the present invention, the forward primer represented by SEQ ID NO: 1 and the reverse primer represented by SEQ ID NO: 2 were used, and the random nucleic acid library includes random nucleic acids with the following structural formula: GGAAGAGATGGCGAC-N 40 - AGCTGATCTGATGG.
상기 단계 (d)의 핵산 부분의 선택적 증폭은 5' 말단에 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 정방향 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 정방향 프라이머에 작용기가 결합되므로, 증폭되는 모든 PCR 생산물(product)은 5'말단에 작용기가 붙어있는 형태로 제작할 수 있으며, 이로 인하여 클릭반응에 의한 위치 특이적 결합을 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Selective amplification of the nucleic acid portion in step (d) is performed by adding at least one functional group selected from the group consisting of hexynyl, 5-octadiynyl, and alkyne to the 5' end. Amplification may be performed using a forward primer, but is not limited thereto. Since a functional group is attached to the forward primer, all amplified PCR products can be produced with a functional group attached to the 5' end, which allows site-specific binding through a click reaction, but is not limited to this. .
본 발명에 있어서, 상기 핫스팟 유래 펩타이드 및 상기 단일 가닥 핵산은 클릭반응에 의해 위치 특이적 결합되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 클릭반응은 핫스팟 유래 펩타이드의 작용기와 핵산의 작용기가 서로 짧은 시간 안에 화학적으로 가교결합 또는 구리-촉매 첨가환화(cycloaddition)에 의해 결합되는 반응일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the hotspot-derived peptide and the single-stranded nucleic acid may be site-specifically bound by a click reaction, but are not limited thereto. The click reaction may be, but is not limited to, a reaction in which the functional group of a hotspot-derived peptide and the functional group of a nucleic acid are combined within a short period of time by chemical cross-linking or copper-catalyzed cycloaddition.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions. The excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, humectants, film-coating materials, and controlled-release additives.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared as powder, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, solutions, eye drops, ellipsis, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese according to conventional methods. , tablets, sustained-release tablets, enteric-coated tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric-coated capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, liquid extracts, injections, capsules, perfusate, It can be formulated and used in the form of external preparations such as warning agents, lotions, pasta preparations, sprays, inhalants, patches, sterilized injection solutions, or aerosols, and the external preparations include creams, gels, patches, sprays, ointments, and warning agents. , it may have a dosage form such as lotion, liniment, pasta, or cataplasma.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, and calcium. These include phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 폴리에칠렌글리콜 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.Additives to tablets, powders, granules, capsules, pills, and troches according to the present invention include corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, white sugar, glucose, fructose, di-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, and phosphoric acid. Calcium monohydrogen, calcium sulfate, sodium chloride, sodium bicarbonate, purified lanolin, microcrystalline cellulose, dextrin, sodium alginate, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, kaolin, urea, colloidal silica gel, hydroxypropyl starch, hydroxypropylmethyl. Excipients such as cellulose (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate, and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin, stearic acid, sodium carboxymethyl cellulose, sodium methyl cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin. , hydroxycellulose, hydroxypropyl starch, hydroxymethylcellulose, refined shellac, starch, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, etc. binders can be used, Hydroxypropyl methyl cellulose, corn starch, agar powder, methyl cellulose, bentonite, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, sodium alginate, calcium carboxymethyl cellulose, calcium citrate, sodium lauryl sulfate, silicic acid anhydride, 1-hydroxy Propylcellulose, dextran, ion exchange resin, polyvinyl acetate, formaldehyde-treated casein and gelatin, alginic acid, amylose, guar gum, sodium bicarbonate, polyvinylpyrrolidone, calcium phosphate, gelled starch, gum arabic, Disintegrants such as amylopectin, pectin, sodium polyphosphate, ethyl cellulose, white sugar, magnesium aluminum silicate, di-sorbitol solution, light anhydrous silicic acid; Calcium stearate, magnesium stearate, stearic acid, hydrogenated vegetable oil, talc, lycopodium, kaolin, petrolatum, sodium stearate, cocoa fat, sodium salicylate, magnesium salicylate, polyethylene glycol 4000, polyethylene glycol 6000, liquid paraffin, hydrogenated soybean oil. (Lubri wax), aluminum stearate, zinc stearate, sodium lauryl sulfate, magnesium oxide, Macrogol, synthetic aluminum silicate, silicic anhydride, higher fatty acids, higher alcohol, silicone oil, paraffin oil, polyethylene glycol fatty acid ether, starch, Lubricants such as sodium chloride, sodium acetate, sodium oleate, dl-leucine, and light anhydrous silicic acid may be used.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.Additives for the liquid according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc. can be used.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.A solution of white sugar, other sugars, or sweeteners, etc. may be used in the syrup according to the present invention, and if necessary, flavoring agents, colorants, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickening agents, etc. may be used.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.Purified water can be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. can be used as needed.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.The suspension according to the present invention may include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose, HPMC 1828, HPMC 2906, and HPMC 2910. Surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3), 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV solution, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV solution, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil - sesame oil. solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristic acid, and benzene benzoate; Solubilizers such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, Tween, nicotinic acid amide, hexamine, and dimethylacetamide; Weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and buffering agents such as gums; Isotonic agents such as sodium chloride; Stabilizers such as sodium bisulfite (NaHSO 3 ), carbon dioxide gas, sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 ), sodium sulfite (Na 2 SO 3 ), nitrogen gas (N 2 ), and ethylenediaminetetraacetic acid; Sulfurizing agents such as sodium bisulfide 0.1%, sodium formaldehyde sulfoxylate, thiourea, disodium ethylenediaminetetraacetate, and acetone sodium bisulfite; Analgesics such as benzyl alcohol, chlorobutanol, procaine hydrochloride, glucose, and calcium gluconate; It may contain suspending agents such as CM sodium, sodium alginate, Tween 80, and aluminum monostearate.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.Suppositories according to the present invention include cacao oil, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, lecithin, Lanet wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydrocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), Hydro Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Massaupol, Masupol-15, Neosupostal-N, Paramound-B, Suposiro (OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), suppositories type IV (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), Supostal (N, Es), Wecobi (W, R, S, M, Fs), Tegestor triglyceride base (TG-95, MA, 57) and The same mechanism can be used.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, and sucrose. ) or prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups. In addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. there is. Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat the disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, drug activity, and It can be determined based on factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to an individual through various routes. All modes of administration are contemplated, including oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal injection, vaginal injection. It can be administered by internal insertion, ocular administration, ear administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, etc.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.The pharmaceutical composition of the present invention is determined depending on the type of drug as the active ingredient along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, gender, weight, and severity of the disease.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.In the present invention, “individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cows, etc. refers to mammals of
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. In the present invention, “administration” means providing a given composition of the present invention to an individual by any appropriate method. In the present invention, “prevention” refers to any action that suppresses or delays the onset of the desired disease, and “treatment” refers to the improvement or improvement of the desired disease and its associated metabolic abnormalities by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to all actions that are beneficially changed, and “improvement” refers to all actions that reduce parameters related to the target disease, such as the degree of symptoms, by administering the composition according to the present invention.
본 발명은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 억제용 의약외품 조성물로,The present invention is a quasi-drug composition for preventing or suppressing coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고, The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 억제용 의약외품 조성물을 제공한다.The nucleic acid provides a quasi-drug composition for preventing or suppressing coronavirus infection, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
또한, 상기 의약외품은 피부외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.Additionally, the quasi-drugs may include external skin preparations and personal hygiene products. For example, it may be a disinfectant cleaner, shower foam, garnish, wet tissue, detergent soap, hand wash, or ointment, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 상기 의약외품 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.When using the quasi-drug composition according to the present invention as a quasi-drug additive, the composition can be added as is or used together with other quasi-drugs or quasi-drug components, and can be used appropriately according to conventional methods. The mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use.
본 발명의 의약외품 조성물은 일 예로, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조된 것일 수 있다. 예를 들어, 로션 등과 같은 유액, 크림, 연고, 스프레이, 오일젤, 젤, 오일, 에어로졸, 연막제와 같은 제형을 가질 수 있으나, 본 발명의 해충 방제 유도 효과를 나타내는 것이라면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 또한 상기 의약외품 조성물은 각각의 제형에 일반적으로 의약외품 조성물에 배합되는 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 또는 향료 등을 필요에 따라 적절히 배합하여 사용할 수 있다.For example, the quasi-drug composition of the present invention may be manufactured in the form of a general emulsified formulation or solubilized formulation. For example, it may have a formulation such as lotion, cream, ointment, spray, oil gel, gel, oil, aerosol, or smoke screen, but can be used without limitation as long as it exhibits the pest control inducing effect of the present invention. . In addition, the above-mentioned quasi-drug compositions are appropriately mixed with oil, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols with 1 to 4 carbon atoms, thickeners, chelating agents, colorants, preservatives or fragrances, etc., which are generally mixed in quasi-drug compositions, in each dosage form as needed. You can use it.
본 발명은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로,The present invention is an antiviral composition against coronavirus, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고, The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.The nucleic acid provides an antiviral composition against coronavirus, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
본 발명에 있어서, “항바이러스”는 체내에서 바이러스의 증식을 억제하여 체내에 침입한 바이러스의 작용을 약하게 하거나 소멸하게 하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 바이러스의 핵산 합성과정, 유전자 발현 과정, 또는 바이러스 복제 과정 등을 저해함으로써 바이러스의 증식을 억제하는 것을 의미하고, 본 발명에서는 코로나바이러스를 대상으로 한다In the present invention, “antiviral” means suppressing the proliferation of viruses in the body to weaken or eliminate the action of viruses that have invaded the body. More specifically, it refers to the nucleic acid synthesis process, gene expression process, or It means suppressing the proliferation of viruses by inhibiting the viral replication process, etc., and the present invention targets coronaviruses.
본 발명에 있어서, 상기 항바이러스용 조성물은 인간 코로나바이러스 229E(HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 OC43(HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤븐 코로나바이러스), 인간 코로나바이러스 HKU1, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 및 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-Cov-2 또는 2019 novel coronavirus 또는 2019-nCoV)에 대한 항바이러스 활성을 가질 수 있다.In the present invention, the antiviral composition is human coronavirus 229E (HCoV-229E), human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), and human coronavirus NL63 (HCoV- Antiviral against human coronavirus HKU1 (NL63, New Haven coronavirus), Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-Cov-2 or 2019 novel coronavirus or 2019-nCoV) It can be active.
본 발명은 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는, 코로나 바이러스에 대한 중화용 조성물로,The present invention is a composition for neutralizing coronaviruses, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고, The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스에 대한 중화용 조성물을 제공한다.The nucleic acid provides a composition for neutralizing coronavirus, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
이하 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 억제용 의약외품 조성물, 코로나 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물, 코로나 바이러스에 대한 중화용 조성물에 관한 설명은 앞서 기재된 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물에서 설명한 내용을 동일하게 적용할 수 있으며, 명세서 기재상의 복잡성을 피하기 위하여 중복 기재는 생략한다. Hereinafter, the description of the quasi-drug composition for preventing or suppressing coronavirus infection, the antiviral composition for coronavirus, and the composition for neutralizing coronavirus can be applied in the same way as the content described in the composition for preventing or treating coronavirus infection described above. In order to avoid complexity in the description of the specification, duplicate descriptions are omitted.
본 발명의 제조방법을 통해 제조된 시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자가 SARS-CoV-2 VOC(알파, 베타, 감마, 델타, 및 오미크론)의 RBD에 대한 결합 친화도가 높은 것을 확인하였고, 특히, 가장 변이가 심한 오미크론에서 가장 큰 결합 내성을 보인 것을 확인하였다. 아울러, 상기 하이브리드 분자가 RBD-결합 핵산 앱타머, 마크로시클릭 펩타이드, 단일 클론 항체 등과의 경쟁에서도 RBD 결합 친화도가 높은 것을 확인하였다. 또한, 우수한 뉴클레아제 저항성 및 혈청 안정성을 보였는 바, SARS-CoV-2 뿐만 아니라 바이러스 중화제로서의 잠재력이 우수한 것이다.It was confirmed that the in vitro evolution-based hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecule produced through the production method of the present invention has high binding affinity to the RBD of SARS-CoV-2 VOC (alpha, beta, gamma, delta, and omicron). In particular, it was confirmed that Omicron, which had the greatest variation, showed the greatest binding resistance. In addition, it was confirmed that the hybrid molecule had high RBD binding affinity even in competition with RBD-binding nucleic acid aptamers, macrocyclic peptides, and monoclonal antibodies. In addition, it showed excellent nuclease resistance and serum stability, showing excellent potential as a virus neutralizing agent not only for SARS-CoV-2.
도 1a는 핫스팟 펩타이드와 바이러스 RBD와의 안정적인 결합을 유도하는 핵산 스캐폴드의 역할을 나타낸 것이다.
도 1b는 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드로 구성된 수용체 모방 하이브리드 리간드의 시험관 내 진화의 도식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 hACE2 수용체와 SARS-CoV-2 RBD 사이의 접촉 잔기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 hACE2에 더 높은 결합 친화도를 갖게 하는 RBD의 N501Y 돌연변이를 나타낸 것이다.
도 2c는 핫스팟 펩타이드 결합 라운드 7(R7) 풀의 RBD 결합을 정량적으로 평가한 결과를 나타낸 것이다(핫스팟 펩타이드와 결합된 무작위 DNA 라이브러리(밝은 회색), 핫스팟 펩타이드가 없는 R7 ssDNA 풀(진한 회색) 및 핫스팟 펩타이드와 결합된 R7 ssDNA 풀(녹색)).
도 3a는 R7-01, R7-02, R7-03, 및 하이브리드 무작위 라이브러리의 RBD 결합 분율 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 R7-02의 RBD 결합 친화도 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다(RBD 및 혈청 알부민 코팅 비드(각각 녹색 및 회색), 베어 비드(검은색)).
도 3c는 R7-01 및 R7-03의 RBD 결합 친화도 특성(Kd 값)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 분자 도킹 시뮬레이션을 통해 RBD에 결합된 R7-02의 에너지 최소화 구조를 나타낸 것이다(LGKGDFR 펩타이드(빨간색), hACE2(흰색), RBD(파란색), 앱타머 스캐폴드(녹색)).
도 3e 및 3f는 하이브리드 리간드를 RBD-결합 핵산 앱타머(CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), 마크로시클릭 펩타이드(Peptide 4), 또는 단일 클론 항체(P05Dhu, AM122)와 공동 배양하고, 경쟁적 결합을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3g는 RBD-결합 핵산 앱타머(CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), 마크로시클릭 펩타이드(Peptide 4), 또는 단일 클론 항체(P05Dhu, AM122)의 평형 해리 상수 Kd 값을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 알파, 베타, 감마, 델타 및 오미크론 VOC(variants of concern)의 돌연변이 도식도 및 목록을 나타낸 것이다.
도 4b는 R7-02의 알파, 베타, 감마, 델타 및 오미크론 VOC에 대한 Kd 값을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 야생형 및 오미크론 VOC에 대해서 R7-02 및 여러 유형의 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)의 RBD 결합 분율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4d는 유세포 분석을 통해 야생형 및 오미크론 VOC에 대한 R7-02 및 여러 유형의 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)의 결합 분율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 R7-02의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통한 RBD-hACE2 결합 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5b는 LGKGDFR 펩타이드, R7-02 DNA 도메인, R7-02, 무작위 DNA 라이브러리, 및 hACE2의 RBD-hACE2 상호작용 억제율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 슈도 타입 SARS-CoV-2 기반 중화 분석의 개략도를 나타낸 것이다.
도 5d 및 5f는 슈도 타입 SARS-CoV-2 감염 hACE2-293T를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다(도 5d: LGKGDFR 펩타이드, R7-02 DNA 도메인, R7-02; 도 5f: CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
도 5e 및 5g는 총 hACE2-293T 세포에 대한 GFP-발현 슈도 타입 SARS-CoV-2 감염 세포의 백분율을 나타낸 것이다(도 5e: LGKGDFR 펩타이드, R7-02 DNA 도메인, R7-02; 도 5g: CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
도 5h는 R7-02의 뉴클레아제 안정성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.Figure 1a shows the role of the nucleic acid scaffold in inducing stable binding between the hotspot peptide and the viral RBD.
Figure 1b shows a schematic diagram of the in vitro evolution of a receptor-mimicking hybrid ligand composed of a hotspot peptide and an aptamer scaffold.
Figure 2a shows the results of analyzing contact residues between the hACE2 receptor and SARS-CoV-2 RBD.
Figure 2b shows the N501Y mutation in RBD resulting in higher binding affinity to hACE2.
Figure 2c shows the results of quantitative evaluation of RBD binding of hotspot peptide-bound Round 7 (R7) pools (random DNA library combined with hotspot peptides (light gray), R7 ssDNA pool without hotspot peptides (dark gray), and R7 ssDNA pool combined with hotspot peptide (green).
Figure 3a shows the results of comparing the RBD binding fractions of R7-01, R7-02, R7-03, and hybrid random libraries.
Figure 3b shows the results of analyzing the RBD binding affinity characteristics of R7-02 (RBD and serum albumin coated beads (green and gray, respectively), bare beads (black)).
Figure 3c shows the results of analyzing the RBD binding affinity characteristics (K d value) of R7-01 and R7-03.
Figure 3d shows the energy-minimized structure of R7-02 bound to RBD through molecular docking simulation (LGKGDFR peptide (red), hACE2 (white), RBD (blue), aptamer scaffold (green)).
Figures 3e and 3f show hybrid ligands co-conjugated with RBD-binding nucleic acid aptamers (CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), macrocyclic peptides (Peptide 4), or monoclonal antibodies (P05Dhu, AM122). The results of culturing and competitive binding analysis are shown.
Figure 3g shows the equilibrium dissociation constant K d values of RBD-binding nucleic acid aptamers (CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), macrocyclic peptides (Peptide 4), or monoclonal antibodies (P05Dhu, AM122). It shows the results of the analysis.
Figure 4A shows a schematic diagram and listing of alpha, beta, gamma, delta, and omicron variants of concern (VOC).
Figure 4b shows the results of analyzing K d values for alpha, beta, gamma, delta, and omicron VOCs of R7-02.
Figure 4c shows the results of analyzing the RBD binding fraction of R7-02 and several types of RBD binders (Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu, and AM122) for wild type and omicron VOC.
Figure 4d shows the results of analyzing the binding fraction of R7-02 and several types of RBD binders (Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu, and AM122) to wild-type and omicron VOCs through flow cytometry.
Figure 5a shows the inhibitory effect of RBD-hACE2 binding through ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) of R7-02.
Figure 5b shows the results confirming the inhibition rate of RBD-hACE2 interaction of LGKGDFR peptide, R7-02 DNA domain, R7-02, random DNA library, and hACE2.
Figure 5c shows a schematic diagram of the pseudotyped SARS-CoV-2 based neutralization assay.
Figures 5d and 5f show the results of confocal microscopy observation of pseudotype SARS-CoV-2 infected hACE2-293T (Figure 5d: LGKGDFR peptide, R7-02 DNA domain, R7-02; Figure 5f: CoV2-RBD -1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
Figures 5E and 5G show the percentage of GFP-expressing pseudotype SARS-CoV-2 infected cells relative to total hACE2-293T cells (Figure 5E: LGKGDFR peptide, R7-02 DNA domain, R7-02; Figure 5G: CoV2 -RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
Figure 5h shows the results of analyzing the nuclease stability of R7-02.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Below, preferred embodiments are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided only to make the present invention easier to understand, and the content of the present invention is not limited by the following examples.
[실험방법][Experimental method]
1. 실험 재료1. Experimental materials
DNA 올리고뉴클레오티드는 Bioneer(Korea)에서 합성 및 정제하였다. 본 발명에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기 표 1에 나타내었다. C-말단-(4-아지도부타노일(lysine))-태그 LGKGDFR 펩타이드(with and without N-말단 FITC 변형)는 Peptron(Korea)에서 합성 및 정제하였다. EDC(1-ethyl-3-(3-365 dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), NHS(N-hydroxysuccinimide), 1M 염화 마그네슘 용액, 인간 안지오텐신 전환 효소 2(human angiotensin-converting enzyme 2, hACE2), 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 고포도당 DMEM, 트윈-20, DMSO(dimethyl sulfoxide), THPTA(tris(3-hydroxypropyl-triazolylmethyl)amine) 및 황산구리 5수화물(copper(II) sulfate pentahydrate)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. L 아스코르브산 나트륨염(L-Ascrobic acid sodium salt)은 Alfa Aesar에서 구입하였다. 람다 엑소뉴클레아제 효소 및 10x 람다 엑소뉴클레아제 완충액은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. 1M Tris-HCl(pH 7.4)은 Bioneer(Korea)에서 구입하였다. 10x PBS, 8M 요소수(urea solution), 10x TBE 및 뉴클레아제-free 정제수는 T&I(Korea)에서 구입하였다. 1x PBSMT를 결합 완충액으로 사용하였다(2.5mM MgCl2 및 0.02% 트윈-20(v/v)을 함유하는 1x PBS, pH 7.4로 구성됨). 야생형, 알파(B.1.1.7), 베타(B.1.351), 감마(P.1) 및 델타(B.1.617.2)의 SARS-CoV-2 RBD를 발현 및 정제하였다. 오미크론(B.1.1.529)의 SARS-CoV-2 RBD는 Abbexa(영국)에서 구입하였다. Alexa-488 표지된 단클론 RBD-결합 항체(P05DHu) 및 Alexa Fluor 488 마이크로스케일 단백질 표지 키트는 Invitrogen에서 구입하였다. 단일 클론 RBD-결합 항체(AM122)는 ACROBiosystems에서 구입하였다. N-말단 클로로아세틸-변형 D-티로신(N-terminal chloroacetyl-modified D-tyrosine)이 있는 매크로시클릭 펩타이드(macrocyclic peptide, Peptide 4)는 Peptron(Korea)에서 선형 합성하였다. 1 mg의 선형 펩타이드 4를 3 μL의 N, N-디이소프로필에틸아민과 함께 86 μL의 DMSO에 용해시켜 고리화하고, 60℃에서 24시간 동안 배양하였다.DNA oligonucleotides were synthesized and purified by Bioneer (Korea). The sequences of all oligonucleotides used in the present invention are shown in Table 1 below. C-terminally-(4-azidobutanoyl(lysine))-tagged LGKGDFR peptide (with and without N-terminal FITC modification) was synthesized and purified by Peptron (Korea). EDC (1-ethyl-3-(3-365 dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), NHS (N-hydroxysuccinimide), 1M magnesium chloride solution, human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2), bovine serum albumin ( bovine serum albumin (BSA), high glucose DMEM, Tween-20, dimethyl sulfoxide (DMSO), tris(3-hydroxypropyl-triazolylmethyl)amine (THPTA), and copper(II) sulfate pentahydrate were from Sigma-Aldrich. Purchased. L-Ascorbic acid sodium salt was purchased from Alfa Aesar. Lambda exonuclease enzyme and 10x Lambda exonuclease buffer were purchased from Thermo Fisher Scientific. 1M Tris-HCl (pH 7.4) was purchased from Bioneer (Korea). 10x PBS, 8M urea solution, 10x TBE, and nuclease-free purified water were purchased from T&I (Korea). 1×PBSMT was used as binding buffer (consisting of 1×PBS containing 2.5mM MgCl 2 and 0.02% Tween-20 (v/v), pH 7.4). The SARS-CoV-2 RBDs of wild type, alpha (B.1.1.7), beta (B.1.351), gamma (P.1), and delta (B.1.617.2) were expressed and purified. SARS-CoV-2 RBD from Omicron (B.1.1.529) was purchased from Abbexa (UK). Alexa-488 labeled monoclonal RBD-binding antibody (P05DHu) and Alexa Fluor 488 microscale protein labeling kit were purchased from Invitrogen. Monoclonal RBD-binding antibody (AM122) was purchased from ACROBiosystems. A macrocyclic peptide (Peptide 4) with N-terminal chloroacetyl-modified D-tyrosine was linearly synthesized by Peptron (Korea). 1 mg of linear peptide 4 was cyclized by dissolving in 86 μL of DMSO with 3 μL of N, N-diisopropylethylamine and incubated at 60°C for 24 hours.
DNA domainR7-01
DNA domain
DNA domainR7-02 (TAMRA)
DNA domain
DNA domainR7-03
DNA domain
modified R7-022'-O-Methyl, 2'-F
modified R7-02
(2'-OMe(A))(2'OMe(T))(2'-F(G))G[FAM][Hexynyl]G(2'-OMe(G))(2'-OMe-(A))(2'-OMe(A))(2'-OMe(G))AGATGGCGACA CGCAATCGTGGGTTGGGGATATAATGGTAAGCTGATCCT(2'-OMe-( G))
(2'-OMe(A))(2'OMe(T))(2'-F(G))G[FAM]
modified R7-02Phosphorothioate (*)
modified R7-02
2. 2. 아자이드Azide -태그 -tag 핫스팟hotspot 펩타이드peptide (( azideazide -tagged hotspot peptide)와 -tagged hotspot peptide) and 헥시닐hexynyl 변형 transform ssDNAssDNA 사이의 위치 특이적 결합 site-specific binding between
초고효율 구리 촉매 알킨-아자이드 첨가 환화(cycloaddition)를 위해 50mM의 구리(II) 황산염 수용액 1μL와 150mM의 THPTA 수용액 1.67μL를 접합(conjugation) 10분 전에 미리 혼합하였다. DMSO 3 μL, 10x PBS 1 μL, 0.1 mM의 헥시닐 변형 ssDNA 수용액 3 μL, 2.5 mM 아자이드-태그 LGKGDFR 펩타이드 1 μL, 프리믹스 2.67 μL(구리(II) 황산염 및 THPTA), 및 500mM 아스코르브산 나트륨 수용액 1μL(신선하게 준비)를 순서대로 첨가하여 완전히 혼합하였다. 용액을 실온에서 밤새 진탕하고, 에탄올 침전으로 정제하였다.For ultra-high efficiency copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition, 1 μL of a 50mM copper(II) sulfate aqueous solution and 1.67 μL of a 150mM THPTA aqueous solution were mixed in advance 10 minutes before conjugation. 3 µL DMSO, 1 µL 10x PBS, 3 µL 0.1 mM aqueous hexynyl-modified ssDNA solution, 1 µL 2.5 mM azide-tagged LGKGDFR peptide, 2.67 µL premix (copper(II) sulfate and THPTA), and 500 mM aqueous sodium ascorbate solution. 1 μL (freshly prepared) was added sequentially and mixed thoroughly. The solution was shaken overnight at room temperature and purified by ethanol precipitation.
3. 3. 펩타이드peptide -- ssDNAssDNA 결합 Combination 하이브리드hybrid 라이브러리 확인 Check your library
펩타이드-ssDNA 접합의 형성은 FITC-변형-아자이드-태그 LGKGDFR 펩타이드를 접합 후 형광을 통해 확인하였다. 반응 생성물(~50 ng) 1 μL, 8M 요소수 7 μL 및 6x 로딩 염료 1 μL를 혼합하고, 95 ℃에서 10분 동안 열 변성시켰다. 변성된 산물을 1x TBE 버퍼에서 40분 동안 300V로 10% 우레아 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 통해 분석하고, Azure C600(Azure Biosystems)으로 이미지화하였다. 같은 양의 접합되지 않은 헥시닐-변형 ssDNA 라이브러리를 10,000x SYBR 금 염색 염료(Invitrogen)로 염색하고 동시에 이미지화하였다.The formation of the peptide-ssDNA junction was confirmed through fluorescence after conjugation with the FITC-modified-azide-tagged LGKGDFR peptide. 1 μL of reaction product (~50 ng), 7 μL of 8 M urea and 1 μL of 6x loading dye were mixed and heat denatured at 95 °C for 10 min. Denatured products were analyzed by electrophoresis on a 10% urea polyacrylamide gel at 300 V for 40 min in 1x TBE buffer and imaged with an Azure C600 (Azure Biosystems). Equal amounts of unconjugated hexynyl-modified ssDNA libraries were stained with 10,000x SYBR gold stain (Invitrogen) and imaged simultaneously.
4. HOLD (Hotspot-Oriented 4. HOLD (Hotspot-Oriented) LigandLigand Display) Display)
펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리를 95°C에서 10분 동안 열 변성시킨 다음, 가장 안정적인 3D 구조의 형성을 위해 얼음에서 급속 냉각하였다. 그 후, 열 처리된 하이브리드 라이브러리를 실온에서 1시간 동안 RBD 코팅 비드와 함께 부드러운 회전(gentle rotation)으로 배양하였다. RBD 코팅 비드를 준비할 때 제조업체의 프로토콜을 사용하여 EDC-NHS 커플링 프로세스를 통해 Dynabeads M-270 카르복실산(Invitrogen)에 표적 RBD를 고정한 다음, NanoOrange 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific)로 정량화하였다. 배양 후, 자기 비드를 1x PBSMT로 철저히 세척하여, 결합되지 않은 하이브리드 분자를 제거하고, 자기 비드-결합 하이브리드 리간드를 DynaMag-2 자석(Invitrogen)으로 선택적으로 분리하였다. 분리된 하이브리드 리간드 후보의 DNA 도메인만을 5'-헥시닐-변형 정방향 프라이머 및 5'-인산화 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다(상기 표 1). 최적의 PCR 사이클 수는 파일럿 PCR 프로세스에 의해 결정하였다. PCR로 증폭된 dsDNA를 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 다음, 람다 핵산가수분해효소(Lambda exonuclease)로 분해하여 다음 HOLD 라운드를 위한 헥시닐-변형 ssDNA 풀(pool)을 생성하였다. ssDNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, 260nm에서 UV-vis 측정으로 정량화하였다. 각 HOLD 라운드에 대해 동일한 형식의 하이브리드 라이브러리 풀을 제공하기 위해, 아자이드-태그 LGKGDFR 펩타이드와 정제된 헥시닐-변형 ssDNA 풀 사이의 클릭 반응을 매 라운드의 HOLD에 대해 반복하였다.The peptide-nucleic acid hybrid library was heat denatured at 95°C for 10 min and then rapidly cooled on ice to ensure the formation of the most stable 3D structure. Afterwards, the heat-treated hybrid library was incubated with RBD-coated beads for 1 hour at room temperature with gentle rotation. When preparing RBD-coated beads, the target RBD was immobilized on Dynabeads M-270 carboxylic acid (Invitrogen) via the EDC-NHS coupling process using the manufacturer's protocol, and then quantified with the NanoOrange protein quantification kit (Thermo Fisher Scientific). . After incubation, magnetic beads were washed thoroughly with 1×PBSMT to remove unbound hybrid molecules, and magnetic bead-bound hybrid ligands were selectively separated with a DynaMag-2 magnet (Invitrogen). Only the DNA domain of the isolated hybrid ligand candidate was PCR amplified using a 5'-hexinyl-modified forward primer and a 5'-phosphorylated reverse primer (Table 1 above). The optimal number of PCR cycles was determined by a pilot PCR process. The PCR-amplified dsDNA was purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen) and then digested with Lambda exonuclease to generate a hexynyl-modified ssDNA pool for the next HOLD round. ssDNA was purified by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation and quantified by UV-vis measurement at 260 nm. To provide a hybrid library pool of the same format for each HOLD round, the click reaction between the azide-tagged LGKGDFR peptide and the purified hexynyl-modified ssDNA pool was repeated for each round of HOLD.
5. Volume dilution challenge5. Volume dilution challenge
VDC(volume dilution challenge) 기술은 결합되지 않은 하이브리드 분자를 매우 효율적으로 제거하는 데 사용하였다. 비드 결합 하이브리드 라이브러리의 1시간 배양 및 후속 세척 후, 즉시 증가된 부피(100-500x)의 1x PBSMT로 희석하고 추가로 30분 동안 배양하여, 고율(high rate) 해리 상수(koff) 값으로 이 과정에서 쉽게 분리되는 하이브리드 분자를 제거하였다. VDC 후, 비드를 모으고 200 μL 1x PBSMT로 3회 세척하였다.The volume dilution challenge (VDC) technique was used to remove unbound hybrid molecules very efficiently. After 1 hour incubation and subsequent washing of the bead-bound hybrid libraries, they were immediately diluted in increased volumes (100-500x) of 1x PBSMT and incubated for an additional 30 min, resulting in high rate dissociation constant (k off ) values. Hybrid molecules that were easily separated during the process were removed. After VDC, beads were collected and washed three times with 200 μL 1x PBSMT.
6. 6. 고친화성High affinity 하이브리드hybrid 리간드를 풍부하게 하는 DNA 도메인 증폭 DNA domain amplification to enrich for ligands
100 μL PCR 반응 혼합물은 5 unit의 태그 폴리머라제(Taq polymerase, T&I, Korea), 0.5 μL의 0.1 mM 5'-헥시닐-변형 정방향 프라이머 및 5'-인산화 역방향 프라이머, 8 μL의 10 mM dNTP (T&I, Korea), 10x PCR 버퍼(T&I, Korea) 2 μL, 수집된 하이브리드 리간드 10 μL, 및 추가 뉴클레아제-free 정제수(최대 100 μL)를 함유하였다. PCR 반응 혼합물을 95 ℃에서 600초 동안 사전 변성시킨 후, 95 ℃에서 30초 변성(denaturation), 51 ℃에서 30초 어닐링(annealing), 72 ℃에서 60초 연장(extension)의 주기를 반복하였다. 5 μL의 PCR 혼합물을 수집하고 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 용해하여, 부산물이 최소화된 최적의 PCR 증폭 주기 수를 결정하였다(파일럿 PCR). HOLD의 모든 라운드에서 수집된 하이브리드 리간드의 DNA 도메인은 최적화된 사이클 수로 PCR 증폭되었다.The 100 μL PCR reaction mixture contained 5 units of Taq polymerase (T&I, Korea), 0.5 μL of 0.1 mM 5'-hexynyl-modified forward primer and 5'-phosphorylated reverse primer, and 8 μL of 10 mM dNTP ( T&I, Korea), 2 μL of 10x PCR buffer (T&I, Korea), 10 μL of collected hybrid ligand, and additional nuclease-free purified water (up to 100 μL). The PCR reaction mixture was pre-denatured at 95°C for 600 seconds, followed by repeated cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 51°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 60 seconds. 5 μL of PCR mixture was collected and resolved on a 10% polyacrylamide gel to determine the optimal number of PCR amplification cycles with minimal by-products (pilot PCR). The DNA domains of the hybrid ligands collected from all rounds of HOLD were PCR amplified with an optimized number of cycles.
7. 7. ssDNAssDNA 생성 produce
PCR 증폭 후, 헥시닐-변형 이중 가닥 DNA(double-stranded DNAs, dsDNAs)를 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고, 정제된 dsDNA 2.5 μg을 50 μL에서 5 unit의 람다 핵산가수분해효소(Thermo Fisher Scientific)로 분해하였다. 혼합물을 37 ℃에서 10분, 80 ℃에서 10분 동안 배양한 후, 헥시닐-변형 ssDNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, 260 nm에서 UV-vis 측정으로 정량화하였다.After PCR amplification, hexynyl-modified double-stranded DNAs (dsDNAs) were purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen), and 2.5 μg of purified dsDNA was incubated with 5 units of lambda nuclease in 50 μL. (Thermo Fisher Scientific). After incubating the mixture for 10 min at 37 °C and 10 min at 80 °C, hexynyl-modified ssDNA was purified by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation and quantified by UV-vis measurement at 260 nm.
8. R7 풀의 상대적 결합 분석8. Relative binding analysis of the R7 pool
7 라운드의 HOLD 후, 하이브리드 리간드 풀의 상대적인 결합 능력을 비교하였다. 핫스팟 펩타이드와 결합된 동일한 양의 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리, 핫스팟 펩타이드가 없는 R7 ssDNA 풀, 및 핫스팟 펩타이드와 결합된 R7 ssDNA 풀을 95 ℃에서 10분 동안 열 변성시킨 다음 얼음에서 급속 냉각하였다. 열 변성 후, 실온에서 1시간 동안 RBD 코팅된 자기 비드로 챌린지(challenge)하고, 이어서 1x PBSMT로 3회 세척하였다. RBD 결합량은 정량적 PCR(LightCycler 480, Roche)로 분석하였다. 각 PCR 반응에는 10μL의 Light cycler 480 SYBR green I master(Roche), 0.1μL의 0.1mM 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 2μL의 RBD 결합 리간드 및 7μL의 뉴클레아제-free 정제수를 포함하였다. 이전에 얻은 표준 곡선을 기반으로 임계값 주기는 RBD 결합 리간드의 양으로 추정하였다.After 7 rounds of HOLD, the relative binding abilities of the hybrid ligand pools were compared. Equal amounts of the peptide-nucleic acid hybrid library coupled with the hotspot peptide, the R7 ssDNA pool without the hotspot peptide, and the R7 ssDNA pool coupled with the hotspot peptide were heat denatured at 95°C for 10 minutes and then rapidly cooled on ice. After heat denaturation, the beads were challenged with RBD-coated magnetic beads for 1 hour at room temperature, followed by washing three times with 1×PBSMT. The amount of RBD binding was analyzed by quantitative PCR (LightCycler 480, Roche). Each PCR reaction contained 10 μL of Light cycler 480 SYBR green I master (Roche), 0.1 μL of 0.1mM forward and reverse primers, 2 μL of RBD binding ligand, and 7 μL of nuclease-free purified water. Based on the previously obtained standard curve, the threshold period was estimated as the amount of RBD-bound ligand.
9. 고-처리량 시퀀싱(High-throughput sequencing)9. High-throughput sequencing
7 라운드의 선택 후, 풍부한 풀은 어댑터 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머로 PCR 증폭되었고, 최적화된 PCR 사이클 수는 파일럿 PCR에 의해 결정되었다. 이러한 PCR 산물은 젤 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 후, SYSGENLAB(한국)의 Illumina MiSeq Next Generation Sequencing으로 시퀀싱하였다. 시퀀싱 라이브러리는 Illumina Novaseq6000 플랫폼에서 101-bp PE(paired-end) 시퀀싱 모드로 분석되었다. 시퀀싱 리드 품질은 FastQC tool로 측정되었으며, 어댑터 시퀀스는 -e 0.1 -j 20 옵션이 있는 cutadapt trimmer로 제거되었습니다. 완벽하게 일치하는 리드 쌍(matched-paired reads)만 추가 분석에 사용하였다. 고품질 시퀀싱 리드는 FASTX 툴킷(RRID:SCR_005534)의 fastq_품질_필터(≥Q30)를 통과하였다.After seven rounds of selection, the enriched pool was PCR amplified with forward and reverse primers containing adapter sequences, and the optimized number of PCR cycles was determined by pilot PCR. These PCR products were purified using a gel extraction kit (Qiagen) and then sequenced by Illumina MiSeq Next Generation Sequencing at SYSGENLAB (Korea). Sequencing libraries were analyzed in 101-bp paired-end (PE) sequencing mode on an Illumina Novaseq6000 platform. Sequencing read quality was measured with the FastQC tool, and adapter sequences were removed with cutadapt trimmer with the -e 0.1 -j 20 options. Only matched-paired reads were used for further analysis. High-quality sequencing reads passed the fastq_quality_filter (≥Q30) of the FASTX toolkit (RRID:SCR_005534).
10. 10. 하이브리드hybrid 리간드의 친화도 및 특이성 분석 Affinity and specificity analysis of ligands
야생형 RBD 및 그 변이체에 대한 하이브리드 리간드의 결합 친화도를 평가하기 위해, R7-02의 DNA 서열을 핫스팟 펩타이드 컨쥬게이션을 위한 5'-헥시닐 그룹 및 유세포 분석 기반 결합 분석을 위한 3'-FAM으로 합성하였다. 1x PBSMT의 FAM 라벨 R7-02는 열 변성 및 급속 냉각하였다. 열 변성 후, 다양한 농도의 R7-02를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전시키면서 RBD-코팅된 비드로 챌린지하였다. 비드를 1x PBSMT로 2회 세척하여 비특이적 결합을 배제한 다음, 비드 결합 R7-02를 DynaMag-2 자석(Invitrogen)으로 수집하였다. 수집된 비드를 1x PBSMT에 재현탁하고, CytoFLEX S(Beckman Coulter)를 사용하여 비드의 평균 형광을 측정하여 분석하였다. 각 측정에 대해, 15,000개의 경우를 분석하였다. 마지막으로, 비선형 회귀 분석(Prism 소프트웨어, GraphPad Prism 버전 9.3.1)을 사용하여 Kd를 계산하였다. 이들의 결합 특이성을 확인하기 위해, BSA로 코팅된 비드와 코팅되지 않은 비드(베어 비드)에 대해 유사한 특성화 과정을 동시에 수행하였다. 코팅되지 않은 비드를 준비할 때, Dynabeads M-270 카르복실산 비드는 실온에서 15분 동안 50mM Tris·HCl(pH 7.4)에서 Tris-차단되었다. 밀도가 높은 서열 패밀리(R7-01 및 R7-03) 및 보고된 RBD-결합 친화도 시약에 대해 유사한 특성화 프로세스를 수행하였다; Aptamer-1, CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Peptide 4, P05DHu 및 AM122.To assess the binding affinity of the hybrid ligands to wild-type RBD and its variants, the DNA sequence of R7-02 was quantified with a 5′-hexynyl group for hotspot peptide conjugation and 3′-FAM for flow cytometry-based binding assays. synthesized. FAM labeled R7-02 in 1x PBSMT was heat denatured and rapidly cooled. After heat denaturation, various concentrations of R7-02 were challenged with RBD-coated beads with gentle rotation for 1 h at room temperature. Beads were washed twice with 1×PBSMT to exclude non-specific binding, and then bead-bound R7-02 was collected with a DynaMag-2 magnet (Invitrogen). The collected beads were resuspended in 1x PBSMT and analyzed by measuring the average fluorescence of the beads using CytoFLEX S (Beckman Coulter). For each measurement, 15,000 cases were analyzed. Finally, K d was calculated using nonlinear regression analysis (Prism software, GraphPad Prism version 9.3.1). To confirm their binding specificity, a similar characterization process was performed simultaneously on BSA-coated and uncoated beads (bare beads). When preparing uncoated beads, Dynabeads M-270 carboxylic acid beads were Tris-blocked in 50mM Tris·HCl (pH 7.4) for 15 min at room temperature. A similar characterization process was performed for the dense sequence families (R7-01 and R7-03) and reported RBD-binding affinity reagents; Aptamer-1, CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Peptide 4, P05DHu and AM122.
11. 11. RBD와RBD and 복합체를 이루는 R7-02의 분자 도킹 시뮬레이션 Molecular docking simulation of R7-02 in complex
RBD에 대한 R7-02의 높은 결합 친화도를 분석하기 위해, 분자 도킹 시뮬레이션을 사용하여 RBD와 복합체를 이루는 R7-02의 분자 구조를 구축하였다. hACE2 유래 핫스팟 펩타이드, LGKGDFR 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단일 RBD의 결정 구조는 RBD의 단일 부위 돌연변이(N501Y)가 있는 RCSB PDB 데이터뱅크(PDB ID: 6M0J)에서 얻었다. R7-02(표 1)에서 앱타머 스캐폴드의 2차 구조는 mfold 웹 서버를 사용하여 예측하였으며, 이는 3D 구조를 위해 RNAcomposer에 공급되었다. R7-02의 펩타이드-핵산 하이브리드 구조는 접힌 DNA의 헥시닐-변형 5' 말단과 핫스팟 펩타이드의 부탄아미드-변형 라이신 C-말단 사이에 트리아졸-변형 링커 잔기를 부착하여 구성하였다. 분자 도킹 시뮬레이션은 핫스팟 펩타이드와 RBD를 결정 위치로 제한하면서, RBD에 대한 핫스팟 펩타이드 결합 앱타머 스캐폴드의 가장 적합한 핏을 찾기 위해 후속적으로 수행하였다. 결과 구조는 분자 동역학 시뮬레이션 패키지 OpenMM 버전 7.4를 활용하는 AMBER14 역장(force field)을 사용하여 에너지를 최소화하였다.To analyze the high binding affinity of R7-02 to RBD, the molecular structure of R7-02 in complex with RBD was constructed using molecular docking simulation. The crystal structures of the hACE2-derived hotspot peptide, LGKGDFR, and the single RBD of the SARS-CoV-2 spike protein were obtained from the RCSB PDB databank (PDB ID: 6M0J) with a single site mutation (N501Y) in the RBD. The secondary structure of the aptamer scaffold in R7-02 (Table 1) was predicted using the mfold web server, which was fed into RNAcomposer for 3D structure. The peptide-nucleic acid hybrid structure of R7-02 was constructed by attaching a triazole-modified linker residue between the hexynyl-modified 5' end of the folded DNA and the butanamide-modified lysine C-terminus of the hotspot peptide. Molecular docking simulations were subsequently performed to find the best fit of the hotspot peptide-binding aptamer scaffold to the RBD, constraining the hotspot peptide and RBD to determined positions. The resulting structure was energy minimized using the AMBER14 force field utilizing the molecular dynamics simulation package OpenMM version 7.4.
12. 보고된 12. Reported RBDRBD -결합 친화성 시약을 사용한 경쟁적 결합 -Competitive binding using binding affinity reagents 분석analyze
경쟁적 결합 분석을 위해, R7-02 및 보고된 RBD-결합 앱타머를 각각 FAM 및 TAMRA로 변형하였다. 구체적으로, 열 변성 및 급속 냉각 후 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전하면서 5nM RBD 비드(최종 부피: 100μL)와 공동 배양하였다. 비드를 3회 세척하고, 신호 보상(signal compensation) 후 CytoFLEX S(Beckman Coulter)로 분석하기 위해 100 μL의 1x PBSMT에 재현탁하였다. 경쟁적 RBD-결합 분율은 경쟁이 없는(자유 결합) 평균 형광 강도에 대한 경쟁이 있는 평균 형광 강도의 비율로 계산하였다. 보고된 RBD-결합 고리형 펩타이드 및 항체와의 경쟁적 결합을 위해, TAMRA-변형 R7-02를 FAM-변형 펩타이드 또는 Alexa-488 변형 RBD-항체와 공동 배양하고, 동일한 방법으로 분석하였다.For competitive binding assays, R7-02 and the reported RBD-binding aptamers were modified with FAM and TAMRA, respectively. Specifically, after heat denaturation and rapid cooling, they were co-incubated with 5 nM RBD beads (final volume: 100 μL) with gentle rotation for 1 h at room temperature. The beads were washed three times, and after signal compensation, they were resuspended in 100 μL of 1x PBSMT for analysis with CytoFLEX S (Beckman Coulter). The competitive RBD-bound fraction was calculated as the ratio of the average fluorescence intensity with competition to the average fluorescence intensity without competition (free binding). For competitive binding with reported RBD-binding cyclic peptides and antibodies, TAMRA-modified R7-02 was co-incubated with FAM-modified peptide or Alexa-488 modified RBD-antibody and analyzed in the same manner.
13. 야생형과 13. Wild type 오미크론Omicron RBDRBD 간의 결합 분율 비교 Comparison of combined fractions between
선택된 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)에서 SARS-CoV-2 변이체에 대한 결합 내성을 분석하기 위해, 야생형 및 Omicron RBD에 대한 결합 분율을 10nM의 R7-02 및 항체(P05DHu 및 AM122); 및 100 nM의 앱타머(Aptamer-1) 및 사이클릭 펩타이드(펩타이드 4)에서 정량적으로 측정하였다. 각각의 바인더와 함께 RBD-코팅 자기 비드를 1시간 동안 실온에서 부드러운 회전으로 배양한 후, 비드를 3회 세척하고 100 μL의 1x PBSMT에 재현탁시켰다. 야생형과 Omicron RBD에 대한 각 바인더의 결합 분율은 CytoFLEX S(Beckman Coulter)로 직접 측정하였다.To analyze the binding resistance to SARS-CoV-2 variants on selected RBD binders (Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu and AM122), the binding fractions to wild-type and Omicron RBD were mixed with 10 nM of R7-02 and antibodies (P05DHu and AM122); and quantitatively measured at 100 nM of aptamer (Aptamer-1) and cyclic peptide (peptide 4). After incubating RBD-coated magnetic beads with the respective binders with gentle rotation at room temperature for 1 h, the beads were washed three times and resuspended in 100 μL of 1x PBSMT. The binding fraction of each binder to wild type and Omicron RBD was measured directly with CytoFLEX S (Beckman Coulter).
14. ELISA 기반 14. ELISA-based RBDRBD -- hACE2hACE2 결합 억제 시험 Binding inhibition test
억제 효율을 특성화하기 위해, 제조업체의 프로토콜에 따라 SARS-CoV-2 억제제 스크리닝 키트(ACROBiosystems)를 사용하였다. 마이크로플레이트는 hACE2로 프리(pre)-코팅되어 있었고, 다양한 농도의 R7-02(1pM ~ 1μM)를 플레이트에 추가한 후. HRP-결합 SARS-CoV-2 야생형 RBD를 즉시 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양 후, 웰을 3회 세척하고 기질을 첨가하여 RBD-hACE2 결합을 정량화하였다. 정지 용액(stop solution)을 첨가하여 반응을 종결시키고, 마이크로플레이트 판독기(Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. RBD-hACE2 결합의 R7-02-유래 억제에 대한 최대 억제 농도의 절반(IC50) 값은 시그모이드 용량 반응 비선형 회귀 분석(Prism 소프트웨어, GraphPad Prism 버전 9.3. 1)을 사용하여 하이브리드 리간드 농도의 로그 변환 후에 결정하였다. 동일한 방식으로, RBD-hACE2 상호작용 억제에서 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드 사이의 상승적 상호작용을 분석하기 위해 3 μM의 개별 리간드(LGKGDFR 펩타이드, R7-02의 DNA 도메인, 및 R7-02)를 첨가한 후 RBD-hACE2 억제를 비교하였다.To characterize the inhibition efficiency, the SARS-CoV-2 Inhibitor Screening Kit (ACROBiosystems) was used according to the manufacturer's protocol. Microplates were pre-coated with hACE2, after which various concentrations of R7-02 (1 pM to 1 μM) were added to the plates. HRP-conjugated SARS-CoV-2 wild type RBD was added immediately. After 1 hour of incubation at room temperature, the wells were washed three times and substrate was added to quantify RBD-hACE2 binding. The reaction was terminated by adding a stop solution, and the absorbance was measured at 450 nm with a microplate reader (Tecan). The half-maximal inhibitory concentration (IC 50 ) value for R7-02-derived inhibition of RBD-hACE2 binding was calculated as a function of the hybrid ligand concentration using sigmoid dose-response nonlinear regression analysis (Prism software, GraphPad Prism version 9.3.1). Determination was made after log transformation. In the same way, 3 μM of individual ligands (LGKGDFR peptide, DNA domain of R7-02, and R7-02) were added to analyze the synergistic interaction between hotspot peptide and aptamer scaffold in inhibiting RBD-hACE2 interaction. Afterwards, RBD-hACE2 inhibition was compared.
15. 세포 배양 및 샘플 준비15. Cell culture and sample preparation
hACE2-293T 세포주는 Takara(일본)에서 입수하였다. hACE2-293T 세포는 37℃, 5% CO2 대기에서 10% 태아 소 혈청(Gibco) 및 1% 피루브산나트륨(Sigma Aldrich)이 보충된 고포도당 DMEM(Sigma Aldrich)에서 배양하였다. 그 후, hACE2-293T의 5-15 계대를 슈도 타입 SARS-CoV-2 중화 분석에 사용하였다.The hACE2-293T cell line was obtained from Takara (Japan). hACE2-293T cells were cultured in high-glucose DMEM (Sigma Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) and 1% sodium pyruvate (Sigma Aldrich) at 37°C in a 5% CO 2 atmosphere. Afterwards, passages 5-15 of hACE2-293T were used in the pseudotype SARS-CoV-2 neutralization assay.
16. 16. 슈도pseudo 타입 SARS- Type SARS- CoVCoV -2의 중화 분석Neutralization assay of -2
R7-02의 중화 능력을 확인하기 위해, 슈도 타입 SARS-CoV-2의 중화 분석을 수행하였다. hACE2-293T 세포(~4Х103)를 96-웰 플레이트에 미리 접종하고 밤새 배양하였다. 24시간 후, 5 μL의 GFP-리포팅 슈도 타입 SARS-CoV-2(mL당 4Х105 형질도입 단위, BPS bioscience)를 1x PBSM(2.5mM 마그네슘이 포함된 1x PBS)에서 3 μM의 R7-02와 실온에서 30분 동안 사전 배양하였다. 미리 접종된 hACE2-293T 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고, 세포를 미리 데운 1x PBSM으로 두 번 세척하였다. 세척 후 슈도바이러스와 R7-02의 혼합물을 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 6시간 동안 감염시켰다. 감염 후, 1X PBSM을 신선한 세포 배양 배지로 교체하고, 세포를 37 ℃에서 48시간 더 배양하였다. 마지막으로 공초점 현미경(Leica DMi8, 소스 파장: 488nm)을 사용하여 GFP 형광 이미지와 명시야 이미지를 관찰하였다. 전체 hACE2-293T 세포에 대한 GFP-발현 감염된 세포의 백분율은 CellProfiler 버전 4.2.1로 전산 분석하였다. 동일한 방법으로 다른 RBD 결합 리간드(aptamer-1, CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, P05DHu, AM122 및 펩타이드 4)의 중화 효능을 분석하였다.To confirm the neutralization ability of R7-02, a neutralization analysis of pseudotype SARS-CoV-2 was performed. hACE2-293T cells (~4Х10 3 ) were pre-seeded in 96-well plates and cultured overnight. After 24 hours, 5 μL of GFP-reporting pseudotype SARS-CoV-2 (4Х10 5 transduction units per mL, BPS bioscience) was incubated with 3 μM of R7-02 in 1x PBSM (1x PBS with 2.5mM magnesium). Pre-incubate for 30 minutes at room temperature. Cell culture medium was removed from pre-seeded hACE2-293T cells, and cells were washed twice with pre-warmed 1x PBSM. After washing, a mixture of pseudovirus and R7-02 was added to the cells and infected at 37°C for 6 hours. After infection, 1X PBSM was replaced with fresh cell culture medium, and cells were cultured for another 48 hours at 37°C. Finally, GFP fluorescence images and bright field images were observed using a confocal microscope (Leica DMi8, source wavelength: 488 nm). The percentage of GFP-expressing infected cells relative to total hACE2-293T cells was computationally analyzed with CellProfiler version 4.2.1. The neutralization efficacy of other RBD binding ligands (aptamer-1, CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, P05DHu, AM122, and peptide 4) was analyzed using the same method.
17. 혈청 안정성 분석17. Serum stability analysis
혈청 안정성을 특성화하기 위해, 37℃, 10% 태아 소 혈청에서 최대 24시간 동안 뉴클레아제가 FAM-표지 R7-02를 분해하도록 하였다. 비교를 위해, 포스포로티오에이트 백본 도입, 및 2'-O-메틸 및 2'-F 변형과 같은 다른 변형이 있는 R7-02; 및 기타 변형되지 않은 단일 가닥 DNA를 함께 테스트하였다. 4 μL의 10 μM 샘플을 10x PBS(4 μL), 태아 소 혈청(4 μL), 및 뉴클레아제가 없는 물(28 μL)과 혼합하였다. 37℃에서 0, 0.5, 2, 4, 8, 18, 및 24시간 인큐베이션 후, 상이한 혼합물로부터의 각 분취량 5μL를 즉시 90℃에서 5분 동안 처리하고, 분석 전에 얼음에 보관하였다. 분취량은 1x TBE 완충액의 10% 우레아 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 통해 분석되었고, 10,000x SYBR 금 염색 염료(Invitrogen)로 염색한 후 Azure C600(Azure Biosystems)에 의해 이미지화 하였다.To characterize serum stability, FAM-labeled R7-02 was allowed to be digested by nucleases for up to 24 hours in 10% fetal bovine serum at 37°C. For comparison, R7-02 with phosphorothioate backbone introduction and other modifications such as 2'-O-methyl and 2'-F modifications; and other unmodified single-stranded DNA were tested together. 4 μL of 10 μM sample was mixed with 10x PBS (4 μL), fetal bovine serum (4 μL), and nuclease-free water (28 μL). After 0, 0.5, 2, 4, 8, 18, and 24 h of incubation at 37°C, 5 μL of each aliquot from the different mixtures was immediately treated at 90°C for 5 min and stored on ice prior to analysis. Aliquots were analyzed by electrophoresis on 10% urea polyacrylamide gels in 1x TBE buffer, stained with 10,000x SYBR gold stain (Invitrogen), and imaged by Azure C600 (Azure Biosystems).
[[ 실시예Example ]]
실시예Example 1. 수용체-모방 1. Receptor-mimicry 하이브리드hybrid 리간드 및 Ligand and 핫스팟hotspot 유래 체외 선택 Derived in vitro selection
적절한 폴딩을 통해, 핵산은 핫스팟 펩타이드를 올바른 위치와 방향으로 배치하여 수용체와 유사한 결합 특성을 유지할 수 있는 매우 안정적이고 수용성인 3D 스캐폴드를 제공할 수 있다. 이 과정은 도 1a에 나타내었다. 특정 RBD-hACE2 상호작용의 경우, 몇 가지 핫스팟 펩타이드가 길이가 대략 30개 이하의 아미노산인 것으로 보고되어 있으나, 불용성 hACE2 막관통 수용체와는 별도로 유연한 모티프는 RBD(receptor-binding domain)의 핫스팟 표면에 강하게 결합할 수 없다. 무시할 수 있는 면역원성(immunogenicity)과 함께, 핵산은 인산염 백본의 극성 특성으로 인해 예외적으로 친수성이라는 것은 잘 알려져 있다. 더욱이 체계적으로 설계된 선택 및 증폭의 반복 주기는 hACE2-유래 RBD 결합 펩타이드를 구조적으로 안정화할 수 있는 고유한 핵산의 시험관 내 선택으로 이어질 수 있다. 다량의 불용성 도메인이 없으면, 컴팩트하고 가용성이 높은 펩타이드 안정제는 바이러스 중화를 위한 고용량 정맥 투여가 가능하다. 더욱이, 핵산의 역할은 표적 RBD와 협력적으로 상호작용하게 하는 핫스팟 결합 인핸서로서 더욱 확장될 수 있다. 즉, 1가 펩타이드 결합을 중심으로 추가 앱타머 유사 상호작용이 있을 수 있으며, hACE2-모방 하이브리드 리간드의 핫스팟 결합 능력을 더욱 향상시킬 수 있다.Through proper folding, nucleic acids can provide a highly stable and water-soluble 3D scaffold capable of positioning hotspot peptides in the correct position and orientation, thereby maintaining receptor-like binding properties. This process is shown in Figure 1a. For specific RBD-hACE2 interactions, several hotspot peptides have been reported to be approximately 30 amino acids or less in length, but apart from the insoluble hACE2 transmembrane receptor, flexible motifs are present on the hotspot surface of the receptor-binding domain (RBD). cannot be strongly combined. It is well known that, with negligible immunogenicity, nucleic acids are exceptionally hydrophilic due to the polar nature of the phosphate backbone. Moreover, systematically designed iterative cycles of selection and amplification can lead to in vitro selection of unique nucleic acids capable of structurally stabilizing hACE2-derived RBD binding peptides. Without large amounts of insoluble domains, compact, highly soluble peptide stabilizers allow for high-dose intravenous administration for virus neutralization. Moreover, the role of nucleic acids can be further expanded as hotspot binding enhancers that allow them to cooperatively interact with target RBDs. In other words, there may be additional aptamer-like interactions centered on the monovalent peptide bond, which may further improve the hotspot binding ability of the hACE2-mimetic hybrid ligand.
핫스팟 펩타이드와 위치 특이적으로 연결된 수많은 다른 핵산(~1014)에서 핫스팟 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드는 선택 및 증폭의 반복 주기에 의해 시험관 내에서 분리될 수 있다. 이는 도 1b에 나타내었다.Hotspot peptide-supported aptamer scaffolds can be isolated in vitro by repeated cycles of selection and amplification from a large number of different nucleic acids (~10 14 ) site-specifically linked to hotspot peptides. This is shown in Figure 1b.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 초기에, 펩타이드의 아자이드-태그 C-말단은 고효율 구리-촉매 첨가환화(cycloaddition)에 의해 단일 가닥 DNA(ssDNA) 라이브러리의 5'-헥시닐 말단에 위치 특이적으로 접합될 수 있다(도 1b의 1단계). 정제 및 열 변성 후, 개별 ssDNA의 고유한 3D 폴딩을 위해 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리를 급속 냉각시켰다. RBD-코팅 자기 비드를 도입하면 RBD 표면은 하이브리드 리간드 후보의 핫스팟 상호작용을 끌어당기고, 자기 분리는 결합되지 않은 펩타이드-DNA 접합체가 체계적으로 분리되도록 하였다(도 1b의 2-3단계). 그 후, 비드 결합 하이브리드 리간드의 DNA 도메인은 5'-헥시닐-변형 정방향 프라이머 및 5'-인산화 역방향 프라이머를 사용한 PCR에 의해 선택적으로 증폭되었다(도 1b, 4단계). 람다 핵산가수분해효소를 사용하여, 5'-헥시닐-변형 ssDNA를 생성하였고, 아자이드 태그 핫스팟 펩타이드와의 클릭 반응은 진화된 HOLD 과정의 다음 라운드를 위해 동일한 형식의 하이브리드 라이브러리 풀을 다시 제공한다(도 1b, 5단계).As shown in Figure 1b, initially, the azide-tagged C-terminus of the peptide was site-specifically linked to the 5'-hexynyl terminus of a single-stranded DNA (ssDNA) library by high-efficiency copper-catalyzed cycloaddition. It can be conjugated (step 1 in Figure 1b). After purification and heat denaturation, the peptide-nucleic acid hybrid library was rapidly cooled for unique 3D folding of individual ssDNAs. Upon introduction of RBD-coated magnetic beads, the RBD surface attracted the hotspot interactions of the hybrid ligand candidates, and magnetic separation led to the systematic separation of unbound peptide-DNA conjugates (steps 2–3 in Figure 1b). Afterwards, the DNA domain of the bead-bound hybrid ligand was selectively amplified by PCR using a 5′-hexinyl-modified forward primer and a 5′-phosphorylated reverse primer (Figure 1B, step 4). Using lambda nuclease, 5'-hexynyl-modified ssDNA was generated, and click reaction with azide-tagged hotspot peptide again provided a pool of hybrid libraries of the same format for the next round of the evolved HOLD process. (Figure 1b, step 5).
실시예Example 2. SARS- 2.SARS- CoVCoV -2 -2 RBDRBD 결합 Combination 핫스팟hotspot 펩타이드peptide , 및 , and hACE2hACE2 모방체mimic 제조 manufacturing
hACE2의 RBD 접촉 잔기 중에서, L351에서 R357까지(LGKGDFR, 서열번호 15)의 7개 아미노산 단편을 SARS-CoV-2의 RBD와 강한 핫스팟 상호작용으로 인해 무작위 DNA 라이브러리와 융합되도록 선택하였다. 짧고 연속적인 사슬 내에서, 4개의 아미노산(K353, G354, D355 및 R357)은 초저온 전자 현미경(cryo-EM) 관찰에 의해 RBD 표면에 직접 접촉하는 것으로 확인하였다(도 2a). 상기 핫스팟 영역이 SARS-CoV-2 VOC(variants of concern)의 결합 친화력과 관련이 있다는 것이 중요한 것이다. RBD의 N501Y 돌연변이로 인해 VOC는 hACE2에 더 단단하고 강력하게 결합하는데, 이는 선택한 핫스팟 펩타이드의 중앙 아미노산인 hACE2의 K353이 치환된 티로신과 예상하지 못한 소수성 상호작용을 하기 때문이다(도 2b). 또한, 이 LGKGDFR 펩타이드는 2개의 소수성 및 2개의 양전하 아미노산을 포함하고 있으며, 이는 완전한 친수성 및 음전하 DNA의 성질을 제공할 수 없다. 따라서, 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리는 SARS-CoV-2의 RBD에 대해 높은 친화도를 가지도록 진화하는 과정에서 매우 다양한 정전기적 상호 작용을 제공할 것이다.Among the RBD contact residues of hACE2, a 7 amino acid fragment from L351 to R357 (LGKGDFR, SEQ ID NO: 15) was selected for fusion with a random DNA library due to its strong hotspot interaction with the RBD of SARS-CoV-2. Within the short, continuous chain, four amino acids (K353, G354, D355, and R357) were confirmed to be in direct contact with the RBD surface by cryo-electron microscopy (cryo-EM) observation (Figure 2a). It is important to note that the hotspot region is related to the binding affinity of SARS-CoV-2 variants of concern (VOC). Due to the N501Y mutation in the RBD, VOC binds to hACE2 more tightly and strongly because K353 of hACE2, the central amino acid of the selected hotspot peptide, makes an unexpected hydrophobic interaction with the substituted tyrosine (Figure 2b). Additionally, this LGKGDFR peptide contains two hydrophobic and two positively charged amino acids, which cannot provide the properties of fully hydrophilic and negatively charged DNA. Therefore, the hotspot peptide-nucleic acid hybrid library will provide a wide variety of electrostatic interactions in the process of evolving to have high affinity for the RBD of SARS-CoV-2.
점진적으로 증가된 엄격성(stringency)과 함께 7 라운드의 시험관 선택에서, 하이브리드 리간드 풀은 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드 간 상승 효과로 인해 RBD에 대한 강한 결합 친화성을 갖도록 성공적으로 강화되었다. 그 결과는 도 2c에 나타내었다. 또한, 각 라운드의 HOLD에서 파라미터는 하기 표 2에 나타내었다.In seven rounds of in vitro selection with progressively increased stringency, the hybrid ligand pool was successfully enriched to have strong binding affinity to the RBD due to the synergistic effect between the hotspot peptide and the aptamer scaffold. The results are shown in Figure 2c. Additionally, the parameters in HOLD for each round are shown in Table 2 below.
hybrid hybrid
ligandligand
concentrationconcentration
(200pmol)4ug
(200 pmol)
+ Washing (200 uL, 3 times)Washing (200 uL, 3 times) + VDC (500x dilution, 30 min)
+ Washing (200 uL, 3 times)
+ Washing (200 uL, 3 times)Washing (200 uL, 3 times) + VDC (500x dilution, 30 min)
+ Washing (200 uL, 3 times)
+ Washing (200 uL, 3 times)Washing (200 uL, 3 times) + VDC (500x dilution, 30 min)
+ Washing (200 uL, 3 times)
도 2c에 나타난 바와 같이, 상대적 결합 분석에서 핫스팟 펩타이드 연결 라운드 7(R7) 풀의 RBD 결합을 정량적으로 평가하였다. 핫스팟 펩타이드의 연결에도 불구하고, 무작위 DNA 라이브러리는 상당히 낮은 수준의 RBD 결합을 나타내었다. 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리(Hybrid random library)가 RBD-코팅 자기 비드로 챌린지되었을 때, 결합 분율은 0.38%에 불과했으며 이는 핫스팟 펩타이드가 안정적인 스캐폴드 없이는 RBD에 강력하게 결합할 수 없음을 나타내는 것이다. LGKGDFR 펩타이드가 없는 경우, R7 풀은 RBD 결합을 약간 증가시켜 5.74%의 결합 분율을 나타냈는데, 이는 자체 앱타머 결합 효과 때문인 것으로 추정된다. 반면에, 펩타이드-지지 R7 풀은 RBD에 대한 친화력을 극적으로 향상시켰고, 이의 결합 분율(22.6%)은 랜덤 DNA-펩타이드 접합체 및 펩타이드-결핍 R7 풀보다 각각 59.37배 및 3.94배 더 증가하였다. 이러한 RBD 결합의 현저한 개선은 핫스팟 펩타이드와 새롭게 진화된 앱타머 스캐폴드 사이의 상승적 상호작용에 의한 것이다.As shown in Figure 2C, RBD binding of the hotspot peptide-linked round 7 (R7) pool was quantitatively assessed in a relative binding assay. Despite ligation of hotspot peptides, random DNA libraries showed significantly lower levels of RBD binding. When the peptide-nucleic acid hybrid library (hybrid random library) was challenged with RBD-coated magnetic beads, the binding fraction was only 0.38%, indicating that the hotspot peptide cannot bind strongly to the RBD without a stable scaffold. In the absence of the LGKGDFR peptide, the R7 pool slightly increased RBD binding, resulting in a binding fraction of 5.74%, which is likely due to its own aptamer binding effect. On the other hand, the peptide-supported R7 pool dramatically improved its affinity for RBD, and its binding fraction (22.6%) was 59.37- and 3.94-fold more than that of the random DNA-peptide conjugate and the peptide-deficient R7 pool, respectively. This significant improvement in RBD binding is due to the synergistic interaction between the hotspot peptide and the newly evolved aptamer scaffold.
실시예Example 3. 3. 펩타이드peptide -지지 -support 앱타머Aptamer 스캐폴드의of scaffold 식별 및 특성 확인 Identification and characterization
가장 최적의 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드는 고-처리량 시퀀싱 및 유세포 분석 기반 결합 분석을 사용하여 R7 하이브리드 리간드 풀에서 확인하였다. 400만 개 이상의 DNA가 R7 풀에서 시퀀싱되었을 때, 가장 풍부한 3개의 시퀀스 패밀리가 높은 점유율(>18%)을 차지하는 것으로 밝혀졌다. 이는 하기 표 3에 나타내었다(서열번호 16 내지 22). 3개의 서열 패밀리 중에서, 가장 대표적인 DNA 서열을 위치 특이적 펩타이드 결합을 위한 5'-헥시닐 그룹과 유세포 분석 기반 결합 분석을 위한 3'-FAM 염료로 합성하였다. 5'-연결 핫스팟 펩타이드의 경우 두 번째로 풍부한 DNA 서열(R7-02의 DNA 도메인)이 RBD 결합에서 가장 강했다. 상대적 결합 분석에서 R7-02의 RBD 결합 분율은 R7-01 및 R7-03보다 각각 약 5배 및 8배 더 컸다(도 3a).The most optimal peptide-supported aptamer scaffold was identified in the R7 hybrid ligand pool using high-throughput sequencing and flow cytometry-based binding analysis. When more than 4 million DNAs were sequenced from the R7 pool, the three most abundant sequence families were found to occupy a high share (>18%). This is shown in Table 3 below (SEQ ID NOs: 16 to 22). Among the three sequence families, the most representative DNA sequence was synthesized with a 5'-hexynyl group for site-specific peptide binding and a 3'-FAM dye for flow cytometry-based binding analysis. For the 5'-linked hotspot peptides, the second most abundant DNA sequence (DNA domain of R7-02) was the strongest for RBD binding. In relative binding assays, the RBD binding fraction of R7-02 was approximately 5- and 8-fold greater than that of R7-01 and R7-03, respectively (Figure 3A).
rank rank
sequencessequences
the sequence familythe sequence family
hACE2 모방체 역할을 하기 위해, 가장 강력한 하이브리드 리간드인 R7-02는 hACE2가 결합할 수 있는 올바른 위치에서 RBD에 대해 높은 친화성과 특이성을 나타냈다. R7-02의 Kd를 정량적으로 측정했을 때, RBD의 경우 5.702 nM이었고(도 3b, 녹색), R7-01(27.01 nM) 및 R7-03(93.8 nM)의 Kd 값은 R7-02보다 훨씬 높았다(도 3c).To serve as an hACE2 mimetic, the most potent hybrid ligand, R7-02, showed high affinity and specificity for the RBD at the correct position for hACE2 to bind. When the K d of R7-02 was quantitatively measured, it was 5.702 nM for RBD (Figure 3b, green), and the K d values of R7-01 (27.01 nM) and R7-03 (93.8 nM) were lower than those of R7-02. was much higher (Figure 3c).
또한, 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하였고, 그 결과는 도 3d에 나타내었다.Additionally, molecular docking simulation was performed, and the results are shown in Figure 3d.
도 3d에 나타난 바와 같이, RBD에 대한 R7-02의 높은 결합 친화력이 실제로 협동 결합 효과에 영향을 미친다고 예측하였다. 에너지 최소화 시뮬레이션 스냅샷에서 LGKGDFR 펩타이드(빨간색)는 원래 hACE2(흰색)와 RBD(파란색)의 결합 핫스팟에 정확하게 위치하며, 결합은 컨쥬게이트된 앱타머 스캐폴드(녹색)로 효과적으로 안정화된다. 3' 말단의 DNA 폴딩은 RBD의 루프 구조(A475-N487)(노란색 화살표)에 추가 결합 모티프를 제공하여, R7-02의 강력하고 특이적인 RBD 결합을 유도한다. RBD와 hACE2 사이의 인터페이스에서 R7-02의 정확한 위치는 생리학적 체액의 낮은 나노몰 농도에서 SARS-CoV-2 중화 가능성을 입증한다.As shown in Figure 3d, it was predicted that the high binding affinity of R7-02 to RBD indeed influences the cooperative binding effect. In energy minimization simulation snapshots, the LGKGDFR peptide (red) is positioned precisely at the binding hotspot of native hACE2 (white) and RBD (blue), and the binding is effectively stabilized by the conjugated aptamer scaffold (green). DNA folding at the 3' end provides an additional binding motif in the loop structure (A475-N487) of the RBD (yellow arrow), leading to strong and specific binding of R7-02 to the RBD. The precise location of R7-02 at the interface between RBD and hACE2 demonstrates its SARS-CoV-2 neutralization potential at low nanomolar concentrations in physiological body fluids.
이전에 알려진 RBD 결합 친화성 시약과의 경쟁에서도 R7-02는 RBD의 표적 표면에 지속 가능한 유지된 결합을 나타냈다(도 3e 및 3f). RBD 결합 경쟁을 유도하기 위해, 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드의 하이브리드 리간드를 RBD-결합 핵산 앱타머(CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), 마크로시클릭 펩타이드(Peptide 4), 또는 단일 클론 항체(P05DHu 및 AM122)과 공동 배양하였다. 이들 중 대부분은 RBD와 hACE2 사이의 결합 인터페이스를 차단하는 것으로 알려져 있다(도 3e). 또한, R7-02에 대해 동일한 조건에서 다양한 RBD 바인더의 Kd 값을 확인하였다(도 3g).Even in competition with previously known RBD binding affinity reagents, R7-02 exhibited sustained and sustained binding to the target surface of the RBD (Figures 3e and 3f). To induce competition for RBD binding, hybrid ligands of hotspot peptides and aptamer scaffolds were synthesized with RBD-binding nucleic acid aptamers (CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), macrocyclic peptides (Peptide 4), or co-incubated with monoclonal antibodies (P05DHu and AM122). Most of these are known to block the binding interface between RBD and hACE2 (Figure 3e). Additionally, the K d values of various RBD binders were confirmed under the same conditions for R7-02 (Figure 3g).
경쟁적 결합을 평가하기 위해, 잠재적인 결합 경쟁자가 있거나 없는 R7-02의 RBD 결합 분율을 측정하고, RBD 결합의 감소를 다른 친화성 시약의 감소와 정량적으로 비교하였다(도 3f). RBD-결합 앱타머 또는 사이클릭 펩타이드와 1시간 동안 공동 배양한 후에도, R7-02는 RBD 결합을 유지할 수 있었고, 자유 결합에 대한 경쟁적 결합의 비율이 낮은 수준(약 6.8%) 감소하였다. 한편, 다른 모든 앱타머와 사이클릭 펩타이드의 RBD 결합은 경쟁적 결합과 자유 결합 사이의 비율이 최대 77.2% 감소하여 유의미하게 억제되었으며, 이는 단량체 앱타머와 사이클릭 펩타이드의 결합이 협동적 하이브리드 리간드와의 경쟁에 대해 제한적인 RBD 결합 위치를 차지하기에는 상대적으로 약하다는 것을 의미한다. 또한, 상이한 결합 위치로 인해, R7-02와 P05DHu 및 AM122 항체 간 경쟁은 무의미 하였다.To assess competitive binding, we measured the RBD binding fraction of R7-02 with and without potential binding competitors, and quantitatively compared the reduction in RBD binding with that of other affinity reagents (Figure 3f). Even after co-incubation with RBD-binding aptamers or cyclic peptides for 1 hour, R7-02 was able to maintain RBD binding, and the ratio of competitive binding to free binding was reduced to a low level (about 6.8%). Meanwhile, the RBD binding of all other aptamers and cyclic peptides was significantly inhibited with a maximum decrease of 77.2% in the ratio between competitive binding and free binding, which indicates that the binding of monomeric aptamers to cyclic peptides is similar to that of cooperative hybrid ligands. This means that it is relatively weak to occupy the limited RBD binding site against competition. Additionally, due to the different binding sites, competition between R7-02 and the P05DHu and AM122 antibodies was insignificant.
실시예Example 4. SARS- 4.SARS- CoVCoV -2 -2 VOC(variants of concern)에VOC (variants of concern) 대한 About hACE2hACE2 모방체의mimetic 결합 내성 combined resistance
핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자(R7-02)는 결합에 있어서 변이체 내성이 크기 때문에, SARS-CoV-2의 보고된 모든 VOC에 강력하게 결합하는 것으로 확인하였다. 처음에는 HOLD 프로세스를 통해 야생형 RBD에 결합하도록 진화했지만, 하이브리드 리간드의 결합 능력은 VOC의 고도로 돌연변이된 RBD의 인식도 가능하다. 이로 인하여 RBD의 핫스팟 인터페이스와 강력하게 상호 작용할 수 있다. VOC는 하이브리드 리간드에서 LGKGDFR 펩타이드의 라이신과 높은 상호작용을 하는 N501Y를 포함하여 몇 가지 주요 돌연변이를 가짐으로써 hACE2 수용체에 대한 결합 및 숙주 세포로의 전달성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(도 4a).The hotspot peptide-nucleic acid hybrid molecule (R7-02) was confirmed to strongly bind to all reported VOCs of SARS-CoV-2 due to its high variant resistance in binding. Although it initially evolved to bind to the wild-type RBD through the HOLD process, the binding ability of the hybrid ligand also allows recognition of the highly mutated RBD of VOC. This allows powerful interaction with RBD's hotspot interface. VOC was found to have several key mutations, including N501Y, which results in a high interaction with the lysine of the LGKGDFR peptide in the hybrid ligand, thereby improving binding to the hACE2 receptor and transduction into host cells (Figure 4A).
R7-02의 5가지 VOC에 대한 결합을 정량적으로 평가했을 때, R7-02의 Kd 값(알파, 베타, 감마, 델타, 및 오미크론; 5.486 nM, 3.376 nM, 1.614 nM, 2.757 nM 및 1.209 nM)은 야생형 RBD(5.702nM)보다 낮은 바, 모든 변이체에 대한 R7-02의 결합 내성을 확인하였다(도 4b). 흥미롭게도, RBD 돌연변이가 가장 많은 Omicron은 R7-02에 의해 가장 강력하게 인식되는 반면, 선택된 여러 유형의 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)는 심한 돌연변이에 의해 RBD 결합 능력을 잃었다(도 4c 및 4d).When quantitatively evaluating the binding of R7-02 to five VOCs, the K d values of R7-02 (alpha, beta, gamma, delta, and omicron; 5.486 nM, 3.376 nM, 1.614 nM, 2.757 nM, and 1.209 nM) was lower than that of wild-type RBD (5.702nM), confirming the binding resistance of R7-02 to all variants (Figure 4b). Interestingly, Omicron with the highest number of RBD mutations was recognized most strongly by R7-02, whereas several types of selected RBD binders (Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu and AM122) lost their RBD binding ability by severe mutations. (Figures 4c and 4d).
이를 통해, SARS-CoV-2 VOC에 대한 R7-02의 결합 내성이 현저히 우수하다는 것을 확인하였다. 또한, 이는 핫스팟 펩타이드 유래 RBD 결합이 SARS-COV-2 VOC에 의한 개선된 hACE2 인식 메커니즘에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 의미한다.Through this, it was confirmed that the binding resistance of R7-02 to SARS-CoV-2 VOC was significantly excellent. Additionally, this suggests that hotspot peptide-derived RBD binding may be affected by the improved hACE2 recognition mechanism by SARS-COV-2 VOC.
실시예Example 5. 5. RBDRBD -- hACE2hACE2 상호작용 억제 및 interaction inhibition and 슈도pseudo 타입 SARS- Type SARS- CoVCoV -2 중화-2 neutralize
RBD에 대한 강한 결합으로 인해, 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 SARS-CoV-2의 RBD와 hACE2 수용체 사이의 상호작용을 나노몰 농도에서도 효율적으로 억제하였다. 억제 효율의 특성화를 위해, R7-02의 농도를 1pM에서 1μM로 변화시키면서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였고, R7-02는 RBD-hACE2 결합 억제에 대해 138.9 nM의 절반-최대 억제 농도(half-maximal inhibitory concentration, IC50)를 나타내었다(도 5a).Due to its strong binding to the RBD, the hotspot peptide-nucleic acid hybrid molecule efficiently inhibited the interaction between the RBD of SARS-CoV-2 and the hACE2 receptor even at nanomolar concentrations. To characterize the inhibition efficiency, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed by varying the concentration of R7-02 from 1 pM to 1 μM, and R7-02 showed a half-maximal inhibitory concentration of 138.9 nM for inhibition of RBD-hACE2 binding. (half-maximal inhibitory concentration, IC 50 ) was shown (Figure 5a).
한편, R7-02의 RBD 억제는 체계적으로 결합된 핫스팟 펩타이드와 시험관 내에서 진화된 앱타머 스캐폴드의 상승 효과에 의해 가이드되었다; R7-02의 개별 성분인 LGKGDFR 펩타이드와 앱타머 스캐폴드는 3μM 농도에서 각각 11.69%와 26.82%의 RBD-hACE2 상호작용 억제율을 보인 반면, R7-02의 전체 구조는 89.60%의 억제율을 보였다. aptameric behavior의 증거로서, DNA 스캐폴드 단독 실험군은 무작위 DNA 라이브러리(억제율 3.77%)에 비해 더 나은 억제 효율을 나타내었다(도 5b).Meanwhile, RBD inhibition of R7-02 was guided by the synergistic effect of the systemically coupled hotspot peptide and the in vitro evolved aptamer scaffold; The LGKGDFR peptide and aptamer scaffold, which are individual components of R7-02, showed an inhibition rate of RBD-hACE2 interaction of 11.69% and 26.82%, respectively, at a concentration of 3 μM, while the overall structure of R7-02 showed an inhibition rate of 89.60%. As evidence of aptameric behavior, the DNA scaffold alone experimental group showed better inhibition efficiency compared to the random DNA library (inhibition rate 3.77%) (Figure 5b).
이전에는 여러 RBD-결합 친화성 시약이 RBD 표면의 정확한 hACE2 접촉 잔기를 차단할 수 없었기 때문에, RBD-hACE2 상호작용을 효과적으로 억제하지 못하였다. 대조적으로, R7-02의 핫스팟-유래 RBD 결합은 hACE2 결합에서 RBD의 효율적인 억제를 입증하여 SARS-CoV-2 중화에 대한 큰 잠재력을 나타내었다.Previously, several RBD-binding affinity reagents did not effectively inhibit RBD-hACE2 interaction because they were unable to block the precise hACE2 contact residues on the RBD surface. In contrast, hotspot-derived RBD binding of R7-02 demonstrated efficient inhibition of RBD in hACE2 binding, indicating great potential for SARS-CoV-2 neutralization.
이에, 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 SARS-CoV-2 중화 능력을 추가로 확인하였다. 중화 분석을 위해, SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 녹색 형광 단백질(GFP)을 모두 발현하지만 자가 복제 기능이 없는 슈도 타입 SARS-CoV-2를 준비하였다. 슈도 타입 SARS-CoV-2에 의해 감염된 세포에서만 발현되는 GFP의 형광 강도를 측정하여 R7-02의 중화 효율을 형광으로 분석하였다(도 5c). 간략하게, hACE2-과발현 HEK-293T 세포주(hACE2-293T)를 밤새 마이크로플레이트에 미리 접종한 후, 바이러스 감염을 위해 6시간 동안 슈도 타입 SARS-CoV-2(0.5 다중 감염, MOI)로 챌린지하였다. 그 결과는 도 5d 및 5e에 나타내었다.Accordingly, the SARS-CoV-2 neutralizing ability of the hotspot peptide-nucleic acid hybrid molecule was further confirmed. For neutralization analysis, a pseudotype SARS-CoV-2 expressing both the SARS-CoV-2 spike protein and green fluorescent protein (GFP) but lacking the self-replication function was prepared. The neutralization efficiency of R7-02 was analyzed by fluorescence by measuring the fluorescence intensity of GFP expressed only in cells infected by pseudotype SARS-CoV-2 (Figure 5c). Briefly, hACE2-overexpressing HEK-293T cell line (hACE2-293T) was pre-inoculated into microplates overnight and then challenged with pseudotyped SARS-CoV-2 (0.5 multiplicity of infection, MOI) for 6 h for viral infection. The results are shown in Figures 5d and 5e.
도 5d 및 5e에 나타낸 바와 같이, RBD 억제제가 없는 경우, hACE2-293T는 슈도 타입 SARS-CoV-2에 감염되었으며, 정량적으로 전체 세포의 58.4%가 성공적인 바이러스 감염의 증거로 강한 녹색 형광을 방출하였다. 한편, R7-02를 구성하는 핫스팟 펩타이드 또는 앱타머 스캐폴드가 있는 경우, RBD 결합 수준이 제한되어 슈도 타입 SARS-CoV-2의 감염율이 각각 22.0%와 12.6%로 감소하였다. 또한, 핫스팟 펩타이드 지지 앱타머 스캐폴드인 R7-02는 무시할 수 있는 녹색 형광을 보이며, 현저히 낮은 감염된 세포의 백분율(1.9%)을 나타내었다.As shown in Figures 5D and 5E, in the absence of RBD inhibitor, hACE2-293T was infected with pseudotype SARS-CoV-2, and quantitatively, 58.4% of total cells emitted strong green fluorescence as evidence of successful virus infection. . Meanwhile, in the presence of the hotspot peptide or aptamer scaffold constituting R7-02, the level of RBD binding was limited, and the infection rate of pseudotype SARS-CoV-2 was reduced to 22.0% and 12.6%, respectively. Additionally, R7-02, a hotspot peptide-supported aptamer scaffold, showed negligible green fluorescence and a significantly lower percentage of infected cells (1.9%).
다양한 많은 RBD 바인더의 바이러스 감염율과 비교했을 때 R7-02의 바이러스 감염율이 상당히 낮거나 비슷한 것으로 나타났다(도 5f 및 5g). 한편, 가장 일반적으로 사용되는 중화 항체와 달리, 본 발명의 하이브리드 리간드는 완전히 합성된 것임을 고려해야 한다. 즉, 본 발명은 단클론 항체의 10분의 1 수준인 낮은 분자량(20 kDa)을 가지면서도 효율적인 감염 억제의 효과를 확인할 수 있다. 또한, 추가 변형 없이 펩타이드-앱타머 하이브리드 리간드의 키메라 구조는 잘 알려진 올리고뉴클레오티드 변형(예: 포스포로티오에이트 백본, 2'-O-메틸 및 2'-F 변형)(도 5h)에 비해 좋은 뉴클레아제 저항성 및 혈청 안정성을 보였으며, SARS-CoV-2 중화제로서의 큰 잠재력을 나타내었다.Compared to the viral infection rates of many different RBD binders, the viral infection rate of R7-02 was found to be significantly lower or similar (Figures 5f and 5g). Meanwhile, it should be considered that, unlike the most commonly used neutralizing antibodies, the hybrid ligand of the present invention is completely synthetic. In other words, the present invention can confirm the effect of efficient infection inhibition even though it has a low molecular weight (20 kDa), which is one-tenth of that of a monoclonal antibody. Additionally, the chimeric structure of the peptide-aptamer hybrid ligand without additional modifications provides good new oligonucleotide modifications compared to well-known oligonucleotide modifications (e.g., phosphorothioate backbone, 2′-O-methyl, and 2′-F modifications) (Figure 5h). It showed clease resistance and serum stability, and showed great potential as a SARS-CoV-2 neutralizer.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.The description of the present invention described above is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical idea or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not restrictive.
Claims (21)
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물.
A composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
A composition for preventing or treating coronavirus infection, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 다음의 방법을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는, 조성물:
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;
(b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및
(c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.
According to paragraph 1,
A composition, characterized in that the peptide-nucleic acid hybrid molecule is prepared through the following method:
(a) preparing a peptide-nucleic acid hybrid by site-specific combining a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a random nucleic acid library;
(b) mixing and cultivating the target protein-coated magnetic beads and the peptide-nucleic acid hybrid of step (a); and
(c) Selecting peptide-nucleic acid hybrid molecules that bind to the target protein using a magnet.
상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
(d) 상기 단계 (c)에서 선별된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 핵산 부분을 선택적으로 증폭하고 복제하는 단계;
(e) 상기 단계 (d)에서 생성된 이중 가닥 DNA를 핵산 가수분해효소를 이용하여 단일 가닥 DNA로 제조하여 정제하는 단계; 및
(f) 상기 단계 (e)의 단일 가닥 DNA로 구성된 새로운 무작위 핵산 라이브러리를 제조하여, 상기 단계 (a) 내지 (f)의 선별, 증폭, 및 정제 과정을 반복하는 단계.
According to paragraph 2,
The composition, characterized in that the method further comprises the following steps:
(d) selectively amplifying and replicating the nucleic acid portion of the peptide-nucleic acid hybrid molecule selected in step (c);
(e) purifying the double-stranded DNA produced in step (d) into single-stranded DNA using nucleic acid hydrolase; and
(f) preparing a new random nucleic acid library composed of the single-stranded DNA of step (e) and repeating the selection, amplification, and purification processes of steps (a) to (f).
상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 코로나 바이러스의 스파이크 단백질의 수용체 결합 부위(receptor binding domain, RBD)에 결합하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to paragraph 1,
A composition wherein the peptide-nucleic acid hybrid molecule binds to the receptor binding domain (RBD) of the spike protein of the coronavirus.
상기 RBD는 야생형 또는 돌연변이형인 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to paragraph 4,
A composition, characterized in that the RBD is wild type or mutant type.
상기 돌연변이는 N501Y, E484K, K417N, K417T, T478K, L452R, E484A, G339D, S371L, S373P, S375F, N440K, S477N, G446S, Q493R, G496S, Q498R, 및 Y505H로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to clause 5,
The mutation includes one or more selected from the group consisting of N501Y, E484K, K417N, K417T, T478K, L452R, E484A, G339D, S371L, S373P, S375F, N440K, S477N, G446S, Q493R, G496S, Q498R, and Y505H. doing A composition, characterized in that.
상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 코로나 바이러스를 중화시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to paragraph 1,
A composition characterized in that the peptide-nucleic acid hybrid molecule neutralizes the coronavirus.
상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 코로나 바이러스의 RBD와 hACE2(human angiotensin-converting enzyme 2) 수용체의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to paragraph 1,
A composition wherein the peptide-nucleic acid hybrid molecule inhibits the interaction between the RBD of the coronavirus and the hACE2 (human angiotensin-converting enzyme 2) receptor.
상기 핵산은 상기 스파이크 단백질의 RBD에 대한 결합력 및 수용성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to paragraph 1,
A composition wherein the nucleic acid increases the binding force and water solubility of the spike protein to the RBD.
상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 하기 특징 중 어느 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
(a) 뉴클레아제 저항성; 및
(b) 혈청 안정성.
According to paragraph 1,
A composition characterized in that the peptide-nucleic acid hybrid molecule satisfies any one of the following characteristics:
(a) Nuclease resistance; and
(b) Serum stability.
상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 정맥 또는 호흡기 투여용인, 조성물.
According to paragraph 1,
A composition wherein the peptide-nucleic acid hybrid molecule is for intravenous or respiratory administration.
상기 코로나 바이러스는 인간 코로나 바이러스 229E(HCoV-229E), 인간 코로나 바이러스 OC43(HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나 바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤븐 코로나 바이러스), 인간 코로나 바이러스 HKU1, 중동호흡기증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스 2(SARS-Cov-2), 및 이들의 변이종으로 이루어지는 군으로부터 하나 이상 선택된 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to paragraph 1,
The coronaviruses include human coronavirus 229E (HCoV-229E), human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), and human coronavirus NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus). , a composition characterized by one or more selected from the group consisting of human coronavirus HKU1, Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-Cov-2), and variants thereof.
(a) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;
(b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및
(c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.
A composition for preventing or treating coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by a method comprising the following steps:
(a) preparing a peptide-nucleic acid hybrid by site-specific combining a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a random nucleic acid library;
(b) mixing and cultivating the target protein-coated magnetic beads and the peptide-nucleic acid hybrid of step (a); and
(c) Selecting peptide-nucleic acid hybrid molecules that bind to the target protein using a magnet.
상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물:
(d) 상기 단계 (c)에서 선별된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 핵산 부분을 선택적으로 증폭하고 복제하는 단계;
(e) 상기 단계 (d)에서 생성된 이중 가닥 DNA를 핵산 가수분해효소를 이용하여 단일 가닥 DNA로 제조하여 정제하는 단계; 및
(f) 상기 단계 (e)의 단일 가닥 DNA로 구성된 새로운 무작위 핵산 라이브러리를 제조하여, 상기 단계 (a) 내지 (f)의 선별, 증폭, 및 정제 과정을 반복하는 단계.
According to clause 13,
The composition, characterized in that the method further comprises the following steps:
(d) selectively amplifying and replicating the nucleic acid portion of the peptide-nucleic acid hybrid molecule selected in step (c);
(e) purifying the double-stranded DNA produced in step (d) into single-stranded DNA using nucleic acid hydrolase; and
(f) preparing a new random nucleic acid library composed of the single-stranded DNA of step (e) and repeating the selection, amplification, and purification processes of steps (a) to (f).
상기 방법은 상기 (a) 단계 이후, 펩타이드-핵산 하이브리드를 열 변성 및 냉각하여 핵산의 3D 폴딩을 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to clause 13,
The method further comprises the step of inducing 3D folding of the nucleic acid by heat denaturing and cooling the peptide-nucleic acid hybrid after step (a).
상기 (a) 단계의 핫스팟 유래 펩타이드는 C 말단 또는 N 말단에 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 펩타이드이며,
상기 (a) 단계의 무작위 핵산 라이브러리는 5' 말단에 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 단일 가닥 핵산을 포함하며,
상기 핫스팟 유래 펩타이드 및 단일 가닥 핵산은 클릭반응에 의해 위치 특이적 결합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to clause 13,
The hotspot-derived peptide in step (a) consists of azido lysine, Azidobutanoic acid, Azinoacetic acid, and azide at the C-terminus or N-terminus. It is a peptide to which one or more functional groups selected from the group are bound,
The random nucleic acid library in step (a) is a single strand with one or more functional groups selected from the group consisting of hexynyl, 5-octadiynyl, and alkyne bound to the 5' end. Contains nucleic acids,
A composition characterized in that the hotspot-derived peptide and the single-stranded nucleic acid are site-specifically bound by a click reaction.
상기 (a) 단계의 핫스팟 유래 펩타이드는 C 말단 또는 N 말단에 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 펩타이드이며,
상기 (a) 단계의 무작위 핵산 라이브러리는 5' 말단에 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 단일 가닥 핵산을 포함하며,
상기 핫스팟 유래 펩타이드 및 단일 가닥 핵산은 클릭반응에 의해 위치 특이적 결합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
According to clause 13,
The hotspot-derived peptide in step (a) has at least one functional group selected from the group consisting of hexynyl, 5-octadiynyl, and alkyne bound to the C-terminus or N-terminus. It is a peptide,
The random nucleic acid library in step (a) is from the group consisting of Azido lysine, Azidobutanoic acid, Azinoacetic acid, and azide at the 5' end. It contains a single-stranded nucleic acid to which one or more selected functional groups are bound,
A composition characterized in that the hotspot-derived peptide and the single-stranded nucleic acid are site-specifically bound by a click reaction.
상기 무작위 핵산 라이브러리는 하기와 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물:
5'-작용기-정방향 프라이머-[Nx] -역방향 프라이머-3',
상기 작용기는 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 알카인(alkyne), 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이며,
여기에서 N 은 A, T, C 또는 G이고, x 는 25 내지 100 의 정수.
According to clause 13,
A composition wherein the random nucleic acid library has the following structure:
5'-functional group-forward primer-[N x ]-reverse primer-3',
The functional groups include hexynyl, 5-octadiynyl, alkyne, Azido lysine, Azidobutanoic acid, Azinoacetic acid, And selected from the group consisting of azide,
where N is A, T, C or G, and x is an integer from 25 to 100.
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스 감염증 예방 또는 억제용 의약외품 조성물.
A quasi-drug composition for preventing or suppressing coronavirus infection, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
A quasi-drug composition for preventing or suppressing coronavirus infection, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물.
An antiviral composition against coronavirus, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
An antiviral composition against coronavirus, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
상기 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 핫스팟 유래 펩타이드이고,
상기 핵산은 서열번호 7, 8, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종의 염기서열을 포함하는 것인, 코로나 바이러스에 대한 중화용 조성물.A composition for neutralizing coronaviruses, comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule,
The peptide is a hotspot-derived peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15,
A composition for neutralizing coronavirus, wherein the nucleic acid includes one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 8, 18, 19, and 20.
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