KR20230144890A - 호르몬 불응성 전립선암의 새로운 표적 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

호르몬 불응성 전립선암의 새로운 표적 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호르몬 불응성 전립선암의 새로운 표적 유전자 및 이의 용도 등에 관한 것이다. 본 발명자들은 RNA 시퀀싱, 기능 강화 분석, PPI 분석, 허브 유전자 식별 및 검증을 이용하여, ASNS, ATF4, DDIT3, 또는 VEGFA 유전자가 호르몬 불응성 전립선암과 밀접하게 연관되어 있는 것을 규명하였는 바, 상기 바이오 마커는 호르몬 불응성 전립선암의 진단 또는 발병 예측을 위한 진단 시약 또는 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

호르몬 불응성 전립선암의 새로운 표적 유전자 및 이의 용도{New target genes of castration resistant prostate cancer and use thereof}
본 발명은 호르몬 불응성 전립선암의 새로운 표적 유전자 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
전립선암(PCa)은 남성에게 가장 흔한 악성 종양 중 하나로 지난 수십년 동안 발병률이 지속적으로 증가하고 있다. PCa 환자는 일반적으로 능동 감시, 근치적 전립선 절제술, 방사선 요법, 또는 안드로겐 차단 요법(ADT; androgen deprivation therapy) 등의 치료를 받는다. 근치적 전립선 절제술 또는 방사선 요법은 국소 전립선암의 초기 치료에 사용된다. ADT는 진행성 PCa 및 전이성 PCa에 대한 표준 치료 방법이다. ADT가 환자에게 가장 효과적인 초기 치료이지만, 거의 모든 환자가 궁극적으로 호르몬 불응성 전립선암(CRPC; Castration Resistant Prostate Cancer)으로 진행하게 된다.
CRPC 환자의 생존 기간은 15-36개월이며, 예후가 좋지 않다. 지난 10년 동안 탁산 기반 화학요법은 CRPC 환자의 선택 치료였으나, 최근에는 아비라테론 아세테이트(abiraterone acetate), 엔잘루타미드(enzlutamide), 아팔루타미드(apalutamide), 다로루타미드(darolutamide)와 같은 새로운 안드로겐 수용체(AR)의 표적 제제가 미국 식품의약국(FDA)에서 개발 및 승인되었다. 2세대 항안드로겐 치료제의 개발은 CRPC 환자의 전체 생존 기간을 상당히 연장시켰다. 그러나, 2세대 항안드로겐 치료에 대한 반응은 일시적이며, 내성이 빠르게 생겨 질병의 임상적 진행을 초래하게 된다.
한편, CRPC로의 진행에 대한 식별 메커니즘에 대한 연구가 미비한 바, CRPC 진행에 대한 식별 메커니즘과 새로운 표적 식별을 이용한 CPPC 치료 전략의 연구가 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2021-0148037호
본 발명자들은 호르몬 불응성 전립선암과 밀접하게 연관되어 있는 유전자 또는 단백질을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 ASNS(Asparagine Synthetase), ATF4(Activating Transcription Factor 4), DDIT3(DNA Damage Inducible Transcript 3), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료 중 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 시료의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 호르몬 불응성 전립선암으로 진단하는 단계를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 호르몬 불응성 전립선암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:
(a) 호르몬 불응성 전립선암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 시료의 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하여, ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 호르몬 불응성 전립선암 치료제로 판정하는 단계.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ASNS(Asparagine Synthetase), ATF4(Activating Transcription Factor 4), DDIT3(DNA Damage Inducible Transcript 3), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료 중 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 시료의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 호르몬 불응성 전립선암으로 진단하는 단계를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다,
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 호르몬 불응성 전립선암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 호르몬 불응성 전립선암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 시료의 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하여, ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 호르몬 불응성 전립선암 치료제로 판정하는 단계.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 제제는 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현 예로, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 ASNS(Asparagine Synthetase), ATF4(Activating Transcription Factor 4), DDIT3(DNA Damage Inducible Transcript 3), 및 VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는 조성물의 호르몬 불응성 전립선암의 진단 용도를 제공한다.
본 발명은 ASNS(Asparagine Synthetase), ATF4(Activating Transcription Factor 4), DDIT3(DNA Damage Inducible Transcript 3), 및 VEGFA(Vascular endothelial growth factor A)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는 조성물의 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료 중 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 시료의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 호르몬 불응성 전립선암으로 진단하는 단계를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단 방법을 제공한다.
본 발명자들은 RNA 시퀀싱, 기능 강화 분석, PPI 분석, 허브 유전자 식별 및 검증을 이용하여, ASNS, ATF4, DDIT3, 또는 VEGFA 유전자가 호르몬 불응성 전립선암과 밀접하게 연관되어 있는 것을 규명하였는 바, 상기 바이오 마커는 호르몬 불응성 전립선암의 진단 또는 발병 예측을 위한 진단 시약 또는 치료제를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 전립선암(Pca; Prostate cancer)에서 비칼루타미드(bicalutamide) 내성, 즉, 호르몬 불응성 전립선암으로의 진행과 관련된 중요한 유전자를 조사하기 위한 실험 과정을 도식도로 나타낸 것이다.
도 2a는 LNCaP 및 Bical R 세포에 다양한 농도의 비칼루타미드(1-40 μM)를 처리하고 세포 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 LNCaP 및 Bical R 세포에 비칼루타미드(20 μM)를 처리한 후 콜로니 형성 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 LNCaP와 Bical R 세포 사이의 차등적으로 발현된 유전자(DEG; differentially expressed genes)를 식별하기 위해 RNA-seq 분석을 수행하고 컷오프 값(|log FC|>2.0)을 사용하여 DEG를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b 및 3c는 DAVID를 사용하여 GO 농축 및 KEGG 경로를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Cytoscape 플러그인 ClueGO의 기능 분석을 사용하여 각 모듈의 KEGG 경로를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 7개의 허브 유전자(ASNS, AGT, ATF3, ATF4, DDIT3, EFNA5 및 VEGFA)는 클러스터 1에 포함된다는 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 STRING에 의해 허브 유전자의 PPI 네트워크 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b 및 6c는 LNCaP(안드로겐 또는 비칼루타미드 민감성 세포주), Bical R(LNCaP유래 비칼루타미드 내성 세포주), 22RV1(AR 발현하는 CRPC 세포주), 및 DU145(AR null인 CRPC 세포주)에서 허브 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 GSE32269 및 GSE28403 데이터 세트에서 in vitro 실험에 의해 선택된 4개 유전자(ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA)의 차등 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 4개 유전자(ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA)의 임상적 유용성을 설명하기 위해 생존 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시 예에서는 Bical R 세포의 경우, 비칼루타미드가 세포 생존율에 영향을 미치지 않았으며, 콜로니 수가 부모 LNCaP 세포보다 유의하게 높았는 바, Bical R 세포가 비칼루타미드 내성 세포로 성공적으로 구축되었음을 확인하였다(실시 예 1 참조).
본 발명의 다른 실시 예에서는 7개의 허브 유전자(ASNS, AGT, ATF3, ATF4, DDIT3, EFNA5 및 VEGFA)를 동정하였고, 그 중, ASNS, ATF4, DDIT3 및 VEGFA의 발현이 호르몬 민감성 전립선암 세포주(LNCaP)에 비해 다양한 호르몬 불응성 전립선암 세포주(Bical R, 22RV1, DU145)에서 더 높은 것을 확인하였다. 또한, 공공 데이터를 이용해 분석한 결과 ASNS 및 DDIT3의 높은 mRNA 발현이 불량한 무병 생존율과 관련 있음을 확인하였다(실시 예 4 및 5 참조).
이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.
본 발명은 ASNS(Asparagine Synthetase), ATF4(Activating Transcription Factor 4), DDIT3(DNA Damage Inducible Transcript 3), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 진단 마커로 검출한다.
본 발명에 있어서, 상기 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 이의 RNA 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 증가하면 호르몬 불응성 전립선암으로 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자, 이의 RNA 또는 단백질의 발현은 호르몬 민감성 전립선암 세포주에 비해 호르몬 불응성 전립선암 세포주에서 더 높을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자 또는 단백질은 PERK 매개 펼쳐진 단백질 반응; 코티솔 합성과 분비; MAPK 신호전달 경로; 또는 PI3K-Akt 신호전달 경로와 연관되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 ASNS, 및 DDIT3으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현의 증가는 PCa 환자의 무병 생존율을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자는 호르몬 불응성 전립선암의 새로운 표적 유전자로서 호르몬 불응성 전립선암의 치료 표적으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “전립선암”은 대부분 초기에 호르몬 치료를 잘 받아들이는 호르몬 민감성(또는 의존성) 전립선암(HSPC; hormone　sensitive　prostate　cancer)이지만, 시간이 지남에 따라 재발하여 남성호르몬 저항(또는 비의존성) 상태로 진행된다. 이를 거세저항성 전립선암 또는 호르몬 불응성 전립선암이라 한다. 상기 호르몬 불응성 전립선암(CRPC; Castration Resistant Prostate Cancer)은 혈중 테스토스테론의 양이 매우 낮은 수준으로 감소된 경우에도 계속 성장하는 전립선암이다.
본 발명에 있어서, “비칼루타미드(bicalutamide)”는 전립선암 치료에 주로 사용되는 항안드로겐 약물이다. 이는 전이성(metastatic) 전립선암에 대해 황체형성호르몬-방출호르몬(LHRH) 작용제와 병용하거나 또는 거세 수술과 함께 경구투여되고, 국소(localized) 혹은 국소 진행성(locally advanced) 전립선암에 대해 단독 경구투여되거나 전립선 근치절제술(radical prostatectomy) 혹은 방사선 요법(radiation therapy)의 보조요법으로 경구투여된다.
본 발명에 있어서, “검출”은 목적하는 물질의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명에서 상기 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것은 발현 또는 활성 여부를 측정하는 것(즉, 발현 또는 활성 유무를 측정하는 것), 또는 상기 유전자 또는 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 유전자 또는 단백질 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 유전자 또는 단백질의 수준 비교 방식은 당 업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브; 또는 상기 단백질을 검출할 수 있는 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)과 온도 조건에서, 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 유전자의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 본 발명에 따른 검출 제제인 프라이머쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 유전자를 검출하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.
본 발명에 있어서, “프로브(probe)”는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 프로브는 공개된 한국인 유전자 칩 디자인을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 키트는 지시서를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 키트는 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 마커의 증폭을 통해 확인하거나, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인함으로써 호르몬 불응성 전립선암의 발병을 예측 또는 조기 진단할 수 있다.
상기 RT-PCR 키트는 상기 유전자를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 정량대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 유전자 부위를 포함하는 핵산이 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지시서는 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 이용하여 호르몬 불응성 전립선암의 진단 또는 발병 예측을 하는 단계가 기재되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료 중 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 시료의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 호르몬 불응성 전립선암으로 진단하는 단계를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 시퀀싱(sequencing), 엑솜 시퀀싱(exome sequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화(microarray hybridization), 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization), PCR 연장 분석, 및 Taqman 기법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 조성물의 호르몬 불응성 전립선암의 진단 용도를 제공한다.
본 발명에 있어서, “개체” 또는 “대상체”는 진단을 하기 위한 피험자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “시료”는 발병 예측 또는 진단하고자 하는 대상체로부터 채취된 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물 및 소변으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 신장 조직 또는 신장 사구체 조직일 수 있다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 모두 포함하는 개념이다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 조기 진단 또는 발병 예측을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 호르몬 불응성 전립선암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 호르몬 불응성 전립선암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 시료의 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하여, ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 호르몬 불응성 전립선암 치료제로 판정하는 단계.
상기 (b) 단계의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 수준으로 회복되는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 호르몬 불응성 전립선암의 치료 방법을 제공할 수 있다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 유전자 또는 단백질의 활성 수준이 대조군의 유전자 또는 단백질의 활성 수준에 비교하여 증가된 경우, 호르몬 불응성 전립선암으로 진단하는 단계; 및
(c) 호르몬 불응성 전립선암을 치료하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 치료는 약물치료, 수술치료, 방사선치료, 양성자치료, 냉동치료, 또는 열치료 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 도세탁셀(Docetaxel), 카바지탁셀(Cabazitaxel). 엔잘루타미드(Enzalutamide), 및 아비라테론(Abiraterone)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물일 수 있으며, 탁솔(taxol)계의 항암제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 치료는 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 통해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 세포 배양
LNCaP 및 DU145 세포는 Korean Cell Line Bank(Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였다. 22RV1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC; Rockville, MD)에서 구입하였다. LNCaP 및 22RV1 세포를 10% FBS 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)에서 배양하였다. 한편, 12개월 동안 비칼루타미드(bicalutamide, 20μM)에 지속적으로 노출시켜 LNCaP에서 유래된 비칼루타미드 내성 세포(Bical R)를 생성하였다. Bical R은 내성을 유지하기 위해 10 μM 비칼루타미드에서 배양되었다. DU145 세포를 10% FBS 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Gibco)에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO2 및 습도가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였다.
2. WST 어세이 및 콜로니 형성 어세이를 통한 약물 민감도 분석
시험관내 약물 민감도는 WST 어세이 및 콜로니 형성 어세이를 사용하여 결정하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고 안정화를 위해 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 48시간 동안 상이한 용량의 비칼루타미드(1-40 μM)로 처리하였다. 그리고 제조사의 지시에 따라 EZ-CYTOX(Daeil Lab Service Co. Ltd, Seoul, Korea)를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
콜로니 생존 분석을 위해, 세포를 5000개 세포로 6-웰 플레이트에 분주하고 비칼루타미드를 처리하였다. 3일에 한 번씩 일반 배지를 교체하고, 세포를 2주 동안 배양하였다. 그 후, 콜로니를 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 그 후, 생존 가능한 콜로니를 계수하였다.
3. mRNA 시퀀싱
제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol® 시약(Invitrogen Life Technologies; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)을 사용하여 각 세포주에서 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 SMARTer Stranded RNA-Seq Kit(Clontech Laboratories, Inc., San Francisco, CA)를 사용하여 라이브러리로 변환하였다. 또한, mRNA의 분리는 Poly(A) RNA Selection Kit(LEXOGEN, Inc., Vienna, Austria)를 사용하여 수행하였다. 분리된 mRNA는 제조사의 지시에 따라 cDNA 합성 및 전단(shearing)에 사용하였다. 또한, Illumina 인덱스 1-12를 사용하여 인덱싱을 수행하였다. HiSeq X10(Illumina, Inc., San Diego, CA)을 사용하여 페어드 엔드 100 시퀀싱(paired-end 100 sequencing)으로 고처리율 시퀀싱(High-throughput sequencing)을 수행하였다.
4. DEG(differential expressed gene) 분석
원시(raw) 시퀀싱 데이터의 품질 관리는 FastQC 소프트웨어(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용하였다. 어댑터 및 저품질 리드(read)(<Q20)는 FASTX_Trimmer 및 BBMap을 사용하여 제거하였다. 그런 다음, 잘린 리드를 TopHat을 사용하여 참조 게놈에 매핑하였다. 또한, 유전자 발현 수준은 FPKM(Fragment per kb per million reads)을 사용하여 측정하였다. FPKM 값은 Bioconductor를 사용하여 R 내에서 EdgeR을 사용하는 Quantile normalization 방법에 따라 처리하였다. 또한, LNCaP와 Bical R 샘플 간의 차등 발현 유전자(DEG; differential expressed genes)를 분석하고(|Log2FC| > 2.0), ExDEGA(E-biogen, Inc., Seoul, 대한민국)를 사용하여 그래픽 시각화를 수행하였다.
5. DEG의 GO(Gene ontology) 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 분석
선별된 DEG의 GO 및 KEGG 경로 분석은 Database of Annotation Visualization and Integrated Discover(DAVID; https://david.ncifcrf.gov)를 사용하여 수행하였다. GO는 분자 기능(MF; molecular function), 세포 기작(BP; biological processes) 및 세포 내의 위치(CC; cellular component)를 포함한 세 가지 범주를 포함한다. P <0.05인 경우, 통계적으로 유의한 결과로 간주하였다. 또한, ClueGO tool(플러그인 Cytoscape)을 이용하여 KEGG 경로를 한 번 더 분석하였다. KEGG 경로 분석은 p-vale <0.05의 컷오프 값을 기반으로 하였다.
6. PPI(Protein-protein interaction) 네트워크 분석
Bical R 세포에서 상향 조절된 유전자의 PPI 네트워크를 설정하기 위해 STRING을 수행하였으며, 신뢰도 점수 > 0.4인 검증된 상호작용을 유의미한 것으로 선택하였다. 그 후, 유전자를 Cytoscape(버전 3.8.0)로 가져왔다. Molecular Complex Detection(MCODE; 플러그인 Cytoscape) 앱을 사용하여 PPI 네트워크에서 가장 중요한 모듈(a degree cut-off = 2, haircut on, fluff on, node score cut-off = 0.2, K-Core = 2, and max. Depth = 100.)을 찾았다. MCODE 점수 ≥4 및 nodes ≥6는 중요한 모듈로 식별하였다. CytoHubba 앱은 dgree, MNC, EPC, EcCentricity 및 MCC로 순위를 지정하여, PPI 네트워크에서 허브 유전자(hub gene)를 찾는 데 사용하였다.
7. qRT-PCR(Quantitative Real time-PCR)
세포의 총 RNA를 TRIzol® 시약(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)으로 추출하였다. PrimeScript™ RT 시약 키트(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 총 RNA(1 μg)를 cDNA로 역전사하고, DreamTaq™ Green PCR Mast Mix(Thermo science)를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머 쌍은 하기 표 1에 나타내었다. 상대적인 유전자 발현 수준은 2-ΔΔCT 방법을 사용하였다.
8. 웨스턴 블롯
세포를 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)으로 용해시켰다. 동량의 단백질을 Bolt bis-Tris plus Gels(Thermo science)에 로딩(loading)하여 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막으로 전이하였다. ASNS(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX), ATF4(1:1000, Santa Cruz), DDIT3(1:1000, proteintech, Rosemont, IL), VEGFA(1:500, proteintech) 및 βactin(1:10000, Santa Cruz) 항체에 넣어 반응하였다. 다음날, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 반응하였다. ECL Kit(DoGenBio, Seoul, Republic of Korea)를 사용하여 X선 필름에 감광하여 결과를 확인하였다.
9. 공공 데이터세트의 유전자 발현
데이터 세트는 국립 생명 공학 정보 센터 GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 다운로드하였다. 기존 유전자 발현 프로파일은 GSE32269 및 GSE28403 데이터 세트에서 얻었다. GSE32269는 22개의 국소 PCa(호르몬 민감성) 및 29개의 골 전이성 CRPC로 구성되었고, GSE28403은 4개의 진행성 PCa(호르몬 민감성 및 샘플은 원격 전이 부위에서 수집됨) 및 9개의 CRPC(2개의 샘플은 원격 전이 부위에서 수집됨)로 구성되었다. 이러한 데이터 세트는 Affymatrix Human Genome U133A 및 U133 Plus 2.0 array에 의해 생성되었다. 상기 데이터 세트의 기존 발현 데이터는 처음에 Affy 패키지가 있는 R 소프트웨어를 사용하여 분석(배경 수정, 사분위수 정규화, 및 유전자 발현 측정으로 변환)하였다. PCa(Prostate cancer) 및 CRPC(castration-resistant prostate cancer) 조직에서 각 유전자의 발현 수준은 ggplot2 패키지와 함께 R 소프트웨어를 사용하여 시각화하였다.
10. TCGA-PRAD 데이터세트의 생존 분석
유전자 발현 프로파일 상호 분석(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA2, http://gepia2.cancer-pku.cn/)은 TCGA 및 GTEx 데이터베이스에서 차등 유전자, 생존 및 유사한 유전자의 식별을 포함하는 유전자 발현 분석을 위한 웹 서버이다. GEPIA2를 적용하여 TCGA-PRAD 및 PCa 환자의 무병 생존율과 각 유전자의 발현 사이의 관계를 표시된 유전자의 발현의 상위 및 하위 사분위수로 분류하여 평가하였다.
11. 통계적 분석
qRT-PCR 데이터는 평균 ± SD(표준편차)로 표시되며, IBM SPSS 버전 24.0 소프트웨어(SPSS, Inc., Chicago, IL)를 사용하여 분석하였다. 두 가지 유형의 세포주 간의 통계적 비교는 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. GSE 데이터 세트의 유전자 발현에서 샘플 하위 그룹을 비교하기 위해, 각 유전자에 대해 Welch의 t-검정을 수행하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 무병 생존 분석을 위해 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 곡선을 그리고 로그 순위 테스트를 사용하여 두 그룹 간의 생존을 평가했으며, 95% 신뢰 구간을 점선으로 추가하였다. 위험 비율(Hazard Ratio)은 Cox 비례 위험 모델(Cox Proportional Hazard Model)에 의해 계산하였다.
[실시 예]
실시 예 1. Bical R 세포의 비칼루타미드 내성 확인
전립선암(PCa; Prostate cancer)에서 비칼루타미드 내성과 관련된 중요한 유전자를 조사하기 위해, LNCaP에서 유래된 비칼루타미드 내성 세포(Bical R)를 구축하고 RNA 시퀀싱, 기능 강화 분석, PPI 분석, 허브 유전자 식별 및 검증을 수행하였다. 그 과정은 도 1에 나타내었다.
먼저, Bical R 세포가 LNCaP 부모 세포에 비해 비칼루타미드에 대한 내성을 획득했는지 확인하기 위해, 부모 LNCaP 세포 및 Bical R 세포에 다양한 농도의 비칼루타미드(1-40 μM)를 처리하고 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과는 도 2a에 나타내었다.
도 2a에 나타난 바와 같이, LNCaP 세포의 경우, 세포 생존율이 비칼루타미드의 용량 의존적으로 감소하였다. 반면에, Bical R 세포의 경우, 비칼루타미드가 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다.
또한, 부모 LNCaP 세포 및 Bical R 세포에 비칼루타미드(20 μM)를 처리한 후 콜로니 형성 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 2b에 나타내었다.
도 2b에 나타난 바와 같이, Bical R 세포의 콜로니 수가 부모 LNCaP 세포보다 유의하게 높았다.
따라서, 세포 생존율 및 콜로니 형성 분석 결과 모두 Bical R 세포가 비칼루타미드 내성 세포로 성공적으로 구축되었음을 의미한다.
실시 예 2. DAVID 기반 기능 강화 분석
LNCaP와 Bical R 사이의 차등적으로 발현된 유전자(DEG; differentially expressed genes)를 식별하기 위해 RNA-seq 분석을 수행하고 컷오프 값(|log FC|>2.0)을 사용하여 DEG를 확인하였다. 산점도(Scatter plot)는 배수 변화(fold change)에 의한 DEG 분포를 표시하였다. 그 결과는 도 3a에 나타내었다.
도 3a에 나타난 바와 같이, LNCaP 샘플과 비교하여 Bical R 샘플에서 302개의 상향 조절된 유전자(빨간색 점)와 329개의 하향 조절된 유전자(녹색 점)를 포함하여 총 24424개의 DEG가 확인되었다.
또한, DAVID를 사용하여 GO 농축 및 KEGG 경로 분석을 수행하였다. 농축된 GO 용어 및 KEGG 경로는 도 3b 및 3c에 나타내었다.
도 3b 및 3c에 나타난 바와 같이, 분자 기능(MF; Molecular function)의 경우, 상향 조절된 유전자는 RNA 전사 과정, 혈관 내피 성장 인자 결합, bHLH 전사 인자 결합, 철 이온 결합, 및 세린 유형 펩티다제 활성에서 유의하게 풍부하였다. 반면에, 하향 조절된 유전자는 단백질 이종이량체화(heterodimerization) 활성, 단백질-결합 과정, 지질-결합 과정, DNA-결합 과정, 및 글루쿠로노실트랜스퍼라제(glucuronosyltransferase) 활성에서 유의하게 풍부하였다.
세포 내의 위치(CC; cellular component)의 경우, 상향 조절된 유전자는 주로 세포 해부학적 개체 용어인 CHOP-ATF4 복합체 및 CHOP-ATF3 복합체였으며 하향 조절된 유전자는 뉴클레오좀, 세포외 영역, 세포외 공간, 사상위족(filopodium), 혈소판 알파 과립 내강, 핵 염색질, 및 핵 염색체였다.
세포 기작(BP; biological process)의 경우, 상향 조절된 유전자는 PERK 매개 펼쳐진(unfolded) 단백질 반응, 전사 DNA 주형, 신경 분포(innervation), 저산소증에 대한 반응, 골격근 세포 분화, 단백질 티로신 키나제 활성의 양성 조절, 전사 및 유전자 발현의 양성 조절이었다. 하향 조절된 유전자는 뉴클레오솜 조립, 세포 단백질 대사 과정, 항균성 체액성 반응, rDNA에서 염색질 침묵(silencing), 텔로미어 조직, DNA 복제 의존성 뉴클레오좀 조립, 유전자 발현 조절, 면역계 과정이었다.
KEGG 경로 분석에 따르면, 상향 조절된 유전자는 PI3K-Akt 신호 전달 경로, 축삭 인도(Axon guidance) 및 MAPK 신호 경로에서 유의하게 풍부하였다. 반면에, 하향 조절된 유전자는 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 알코올 중독, 바이러스성 발암, 아스코르브산염 및 알다레이트 대사, 오탄당 및 글루쿠로네이트 상호전환, 약물 대사, 암에서의 전사 오조절, 레티놀 대사, 포르피린 및 엽록소 대사, 및 사이토크롬 P450에 의한 생체이물의 대사에서 풍부하였다. 상향 조절(표 2) 및 하향 조절(표 3)된 유전자의 GO 농축의 상위 10개를 하기 표 2 및 3에 나타내었다. 또한, 상향 조절 및 하향 조절된 유전자의 KEGG 경로 농축을 하기 표 4에 나타내었다.
Category GO_Term P-Value Associated Genes
BP PERK-mediated unfolded protein response 0.0004 ATF4, ATF3, ASNS, DDIT3
mRNA transcription from RNA polymerase II promoter 0.0012 SREBF1, ATF4, LMO2, DDIT3
innervation 0.0014 SERPINE2, RNF165, GABRA5, POU4F1
response to hypoxia 0.0015 VEGFB, ASCL2, PLOD2, VEGFA, APOLD1, WTIP, CD24, DDIT4, CITED2
skeletal muscle cell differentiation 0.0032 MYOD1, HLF, ATF3, NUPR1, CITED2
regulation of transcription from RNA polymerase II promoter 0.0038 SREBF1, MYOD1, HTATIP2, TCEAL2, ATF4, ATF3, NUPR1, SMARCD3, ZNF783, DBP, JUND, VEGFA, MAMLD1, POU4F1
positive regulation of protein tyrosine kinase activity 0.0041 SRCIN1, AGT, RELN, CD24
positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
in response to endoplasmic reticulum stress		 0.0095 ATF4, ATF3, DDIT3
positive regulation of gene expression 0.0173 SPRY2, STOX1, ATF4, VIM, VEGFA, POU4F1, PTGFR, FOXD1, CITED2
gluconeogenesis 0.0175 ATF4, ATF3, ENO2, PCK2
MF E-box binding 0.0008 ASCL2, MYOD1, LMO2, BHLHE40, BHLHE41
RNA polymerase II regulatory region sequence-specific DNA binding 0.0011 MYOD1, HLF, STOX1, ATF4, ATF3,
HMX1, LMO2, DBP, ZNF711, ALX4
transcription corepressor activity 0.0036 BATF3, ATF3, CBX4, BHLHE40, WTIP,
BASP1, BHLHE41, DDIT3, CITED2
RNA polymerase II activating transcription factor binding 0.0112 LMO2, BEX1, BHLHE40, BHLHE41
vascular endothelial growth factor receptor 1 binding 0.0244 VEGFB, VEGFA
RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding 0.0312 ASCL2, BATF3, SREBF1, MYOD1, ATF4,
ATF3, JUND, BHLHE41, FOXD1, DDIT3
bHLH transcription factor binding 0.0320 LMO2, BHLHE40, BHLHE41
iron ion binding 0.0402 PLOD2, HBQ1, CYP2E1, SCD5, HBE1, FTH1
serine-type peptidase activity 0.0422 HTRA1, KLK4, RELN, PRSS16
transcription factor activity, RNA polymerase II distal enhancer sequence-specific binding 0.0474 MYOD1, POU4F1, BHLHE40, BHLHE41
CC postsynaptic membrane 0.0040 CNKSR2, SRCIN1, GRIN2C, NLGN4X, GABRA5,
GABBR1, NSG1, HTR3A, LIN7A
neuron projection 0.0078 CNKSR2, ATF4, RAB39B, VIM, MAP2, POU4F1,SLC30A3, RGS17, LIN7A
cell junction 0.0094 SRCIN1, GABRA5, PTPRR, GABBR1, BASP1, RGS17, KCNK1, TMEM163, GRIN2C, NLGN4X, SMAGP, SLC30A3, HTR3A
extracellular region 0.0099 LTBP1, GABBR1, SERPINE2, VWDE, NPTX2, HTRA1, AGT, SPATA6,CRIM1, SRGN, STC2, RNASE4, KLK4, CA11, APOLD1, FGF21, PTGFR,
COL5A1, EPHA3, VEGFB, MUCL1, CD163L1, FBLN2, LAMC3, C5ORF38, VEGFA, EGFL8, SUSD4, TMSB4X, EFNA5, IGFBP5
filopodium 0.0104 SRCIN1, FSCN1, ABI2, IQGAP2, CD302
proteinaceous extracellular matrix 0.0156 SMOC2, LTBP1, GPC3, FBLN2, LAMC3, GPC6, VEGFA, RELN, COL5A1
integral component of plasma membrane 0.0189 IL27RA, GABBR1, TSPAN7, LPAR3, FXYD5, GPC3, BEST1, ROBO1,GRIN2C, GPC6, SLC18B1, SMAGP, SLC39A8, SLC30A3, SLC4A4,
GABRA5, NPR3, PCDH7, KCNK1, PTGFR, ABCG1, EPHA3, SEMA6B,
EPHA6, NLGN4X, SGCE, BMPR1B
postsynaptic density 0.0235 CNKSR2, SRCIN1, FYN, GRIN2C, MAPT, NLGN4X, LIN7A
CHOP-ATF4 complex 0.0238 ATF4, DDIT3
CHOP-ATF3 complex 0.0238 ATF3, DDIT3
Category GO_Term P-Value Associated Genes
BP Nucleosome assembly 3.05E-17 HIST4H4, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H1C, HIST1H2BF, HIST1H2BG, NAP1L5, HIST2H3D, HIST2H2BC, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST2H2BE, HIST2H2BF, HIST1H2BJ, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST3H2BB, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H
Cellular protein metabolic process 1.60E-10 ODAM, HIST4H4, KLK3, ADORA2A, IGF1, HIST2H3D, TTR, APP, SAA1, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H
Antibacterial humoral response 1.09E-08 APP, HIST1H2BC, HIST1H2BD, ADM, HIST1H2BK, HIST1H2BF, HIST2H2BE, HIST1H2BG, HIST1H2BJ, SLPI
Chromatin silencing at rDNA 4.61E-08 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H, HIST2H3D
Telomere organization 8.46E-08 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H
DNA replication-dependent nucleosome assembly 3.01E-07 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H
Negative regulation of gene expression, epigenetic 5.45E-07 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H, HIST2H3D
Innate immune response in mucosa 1.21E-06 HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BK, HIST1H2BF, HIST2H2BE, HIST1H2BG, HIST1H2BJ
Protein heterotetramerization 2.14E-06 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H
Positive regulation of gene expression, epigenetic 2.95E-06 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H, HIST2H3D
MF Protein heterodimerization activity 2.61E-11 HIST1H2AC, HIST2H2AA4, HIST4H4, HIST1H2AE, SDCBP2, TTR, BAK1, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BJ, ADRA2A, HIST1H4E, HIST3H2BB, HIST1H4J, HIST1H4H, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BF, HIST1H2BG, H2AFJ, HIST2H3D, HIST2H2BE, HIST2H2BF, HIST1H3A, HIST1H2AI, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H2AM, HIST1H2AL, HIST1H3H
Histone binding 6.38E-05 HIST4H4, TONSL, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H, HIST2H3D
Heparin binding 4.94E-04 APP, NRP1, SAA1, MMP7, ADAMTS1, FSTL1, SERPIND1, THBS1, FN1, CXCL10
Nucleosomal DNA binding 0.004133 HIST1H3A, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3H, HIST2H3D
Glucuronosyltransferase activity 0.007985 UGT2B17, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B28
Glycoprotein binding 0.013904 AZGP1, PIP, ACE2, HSPA5, THBS1
Phosphatidylserine binding 0.015621 SYT4, OSBPL8, SYTL2, THBS1
MHC class II protein complex binding 0.02135 ATP1B1, CD74, HLA-DRA
Enzyme binding 0.021971 DDC, APP, THRB, ADORA2A, HIST1H2AI, SLPI, HSPA5, HIST1H2AM, HIST1H2AL, SLC27A2, GBP1
Cytokine binding 0.029586 NRP1, CD74, GBP1
CC Nucleosome 1.10E-23 HIST1H2AC, HIST2H2AA4, HIST4H4, HIST1H2AE, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BJ, HIST1H4E, HIST1H4J, HIST1H4H, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H1C, HIST1H2BF, HIST1H2BG, H2AFJ, HIST2H3D, HIST2H2BE, HIST1H3A, HIST1H2AI, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H2AM, HIST1H2AL, HIST1H3H
Nuclear nucleosome 8.21E-16 HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BF, HIST1H2BG, HIST2H2BC, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST2H2BE, HIST2H2BF, HIST1H2BJ, HIST1H3A, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST3H2BB, HIST1H3H
Extracellular exosome 1.31E-13 SNCG, ATP1B1, HIST2H2AA4, HIST4H4, THRB, PGC, CRABP2, UCHL1, MMP7, ECHDC1, FSTL1, SDCBP2, ASAH1, ACTG2, TTR, AZGP1, APP, SAA2, HIST1H2BL, SAA1, PLA1A, DPP4, KCNMA1, TMEM205, DDC, ACTA2, PROSC, H2AFJ, PIGR, NAPRT, SMO, NPC1, HIST2H2BE, HIST2H2BF, PLA2G2A, SLPI, LAMC1, SLC27A2, LCP1, HLA-DRA, MVP, COASY, HIST1H2AC, CAB39L, HIST1H2AE, CLU, UGDH, BROX, MME, CD74, CBR1, FAM213A, HIST1H4E, PIP, TSTA3, HSPA5, FGL1, THBS1, HIST1H4J, HIST1H4H, FN1, HIST1H2BC, HIST1H2BD, S100P, KLK3, HIST1H2BF, HIST1H2BG, VTA1, FUCA2, PSMB8, ACPP, HIST2H3D, LCN2, CBLC, PRADC1, LAMA3, PI3, HIST1H3A, HBZ, ACE2, HIST1H2AI, HIST1H3D, FCGBP, HIST1H3E, SERPIND1, HIST1H2AM, HPGD, HIST1H2AL, HIST1H3H
Extracellular space 2.84E-08 ODAM, NRP1, MSMB, PGC, CLU, MMP7, HFE, FSTL1, ASAH1, SPINK8, CXCL10, AZGP1, TTR, ACTG2, APP, HIST1H2BK, SAA2, SAA1, HIST1H2BJ, PIP, THBS1, ANGPT2, FN1, HIST1H2BC, HIST1H2BD, CES1, ACTA2, KLK3, HIST1H2BF, HIST1H2BG, IGF1, PIGR, FUCA2, ACPP, LCN2, GCG, F5, SEMA4G, ADM, HIST2H2BE, ACE2, PLA2G2A, SLPI, LAMC1, SERPIND1, AGR2, LCP1
Extracellular region 4.47E-06 ODAM, HIST4H4, CLU, MMP7, IFI30, FSTL1, FGF13, JAG1, CXCL10, AZGP1, TTR, COL26A1, APP, SAA1, HIST1H4E, PIP, PLA1A, THBS1, HIST1H4J, ANGPT2, HIST1H4H, FN1, TMEFF2, DEFB132, KLK3, GNRH2, MUC20, IGF1, HIST2H3D, LCN2, GCG, PRADC1, NPC1, LAMA3, F5, ADM, HIST1H3A, VSTM2L, ACE2, PLA2G2A, PLA2G7, HIST1H3D, HIST1H3E, SERPIND1, LAMC1, HIST1H3H, GBP1
Nuclear chromosome 1.00E-05 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H
Filopodium 5.36E-04 FAM65B, ACTG2, DNALI1, ACTA2, FGF13, LCP1, ACPP
Platelet alpha granule lumen 0.001125 APP, F5, CLU, IGF1, THBS1, FN1
Nuclear chromatin 0.001904 POLR3G, HIST1H2AC, HIST2H2AA4, THRB, HIST1H2AE, HIST1H2AI, H2AFJ, HIST1H2AM, HIST1H2AL, NRIP1
Nuclear chromosome, telomeric region 0.002704 HIST4H4, HIST1H3A, HIST1H4E, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4J, HIST1H3H, HIST1H4H
KEGG Pathway P-Value Associated Genes
Up-regulation
PI3K-Akt signaling pathway 0.0082 VEGFB, ATF4, LAMC3, VEGFA, LPAR3, RELN, EFNA5, FGF21, PCK2, COL5A1, DDIT4
Axon guidance 0.0183 SEMA6B, EPHA6, FYN, ROBO1, EFNA5, EPHA3
MAPK signaling pathway 0.0324 ATF4, MAPT, JUND, PTPRR, FGF21, GADD45B, DDIT3, PLA2G4D
Down-regulation
Systemic lupus erythematosus 6.33E-20 HIST1H2AC, HIST2H2AA4, HIST4H4, HIST1H2AE, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BJ, HIST1H4E, HIST3H2BB, HIST1H4J, HIST1H4H, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BF, HIST1H2BG, H2AFJ, HIST2H3D, HIST2H2BE, HIST2H2BF, HIST1H3A, HIST1H2AI, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H2AM, HIST1H2AL, HIST1H3H, HLA-DRA
Alcoholism 7.68E-18 HIST1H2AC, HIST2H2AA4, HIST4H4, ADORA2A, HIST1H2AE, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BJ, HIST1H4E, HIST3H2BB, HIST1H4J, HIST1H4H, DDC, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BF, HIST1H2BG, H2AFJ, HIST2H3D, HIST2H2BE, HIST2H2BF, HIST1H3A, HIST1H2AI, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H2AM, HIST1H2AL, HIST1H3H
Viral carcinogenesis 5.81E-06 HIST4H4, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BF, STAT5A, HIST1H2BG, BAK1, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST2H2BE, HIST2H2BF, HIST1H2BJ, HIST1H4E, HIST3H2BB, HIST1H4J, HIST1H4H
Ascorbate and aldarate metabolism 0.001483 UGT2B17, UGT2B11, UGDH, UGT2B15, UGT2B28
Pentose and glucuronate interconversions 0.003169 UGT2B17, UGT2B11, UGDH, UGT2B15, UGT2B28
Drug metabolism - other enzymes 0.010485 UGT2B17, CES1, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B28
Transcriptional misregulation in cancer 0.012943 MAF, HIST1H3A, ETV1, IGF1, HIST1H3D, HIST1H3E, HPGD, HIST1H3H, HIST2H3D
Retinol metabolism 0.031594 DHRS3, UGT2B17, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B28
Porphyrin and chlorophyll metabolism 0.043511 UGT2B17, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B28
Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 0.049686 CBR1, UGT2B17, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B28
실시 예 3. ClueGO 기반 모듈의 기능 강화 분석
CRPC(castration-resistant prostate cancer)로의 진행에 관련된 핵심 유전자를 명확히 하기 위해, LNCaP 세포와 비교하여 Bical R 세포에서 상향 조절된 유전자에 초점을 두었다. Cytoscape 플러그인 ClueGO의 기능 분석을 사용하여 각 모듈의 KEGG 경로를 분석하였다. 각 모듈의 KEGG 경로 분석에 대한 자세한 정보는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 모듈 1과 2에서 공통적으로 중요한 경로는 'MAPK 신호 경로', 'PI3k/Akt 신호 경로', '초점 접착(Focal adhesion)', 'Ras 신호 경로', 'Rap1 신호 경로', '축삭 인도(Axon guidance) ' 및 '암에서 전사 오조절'에서 강화되었다.
실시 예 4. PPI 네트워크 구축
상향 조절된 유전자의 PPI 네트워크는 STRING 온라인 데이터베이스(상호작용 점수 >0.4)를 사용하여 구성하고, Cytoscape로 시각화하였다. 총 210개의 노드(node)와 1,422개의 에지(edge)를 얻었다. 플러그인 MCODE를 적용하여 PPI 네트워크에서 중요한 모듈을 식별한 결과, 두 개의 클러스터(클러스터 1, MCODE 점수 = 10.563l; 클러스터 2, MCODE 점수=5.795)를 확인하였다. 클러스터 1은 102개의 유전자를 포함하고 클러스터 2는 77개의 유전자를 포함하고 있다.
실시 예 5. 허브(Hub) 유전자의 동정
Degree, MNC, EPC, EcCentricity 및 MCC 방법에 따라 노드의 점수를 매기고 순위를 매기는 플러그인 Cytohubba를 사용하여 각각 20개의 허브 형성 유전자를 식별하였다. 그런 다음 Cytohubba에서 5가지 방법에 따라 겹치는 유전자(ASNS, AGT, ATF3, ATF4, DDIT3, EFNA5 및 VEGFA)를 허브 유전자로 선택하였다. 이는 표 5에 나타내었다. 7개의 허브 유전자(ASNS, AGT, ATF3, ATF4, DDIT3, EFNA5 및 VEGFA)는 클러스터 1에 포함되었고, 이는 도 5에 나타내었다. 또한, 클러스터 2에는 6개의 허브 유전자(ASNS, AGT, ATF3, ATF4, DDIT3 및 EFNA5)가 포함되었다.
허브 유전자의 PPI 네트워크 분석은 STRING에 의해 수행하였다. 그 결과는 도 6a에 나타내었다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 허브 유전자의 GO 및 KEGG 경로 분석은 이러한 유전자가 'PERK 매개 펼쳐진 단백질 반응', '코티솔 합성 및 분비', 'MAPK 신호전달 경로' 및 'PI3K-Akt 신호전달 경로'와 연관되어 있음을 나타낸다. 종합적으로, 상기 결과는 7개 유전자의 기능을 보여주었고, 허브 유전자가 CRPC로 진행하는 데 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.
Method
Degree MNC EPC EcCentricity MCC
Rank Gene Rank Gene Rank Gene Rank Gene Rank Gene
1 VEGFA 1 ATF4 1 VEGFA 1 DDIT3 1 GPC3
2 ATF4 2 GPC3 2 ATF4 1 ATF4 2 LTBP1
3 ATF3 3 EFNA5 3 DDIT3 1 CTH 2 IGFBP5
3 FYN 3 DDIT3 4 ATF3 1 ATF3 4 STC2
3 AGT 3 ATF3 5 FYN 1 ASNS 5 FAM20C
3 SREBF1 3 AGT 6 AGT 1 CYP2E1 5 RCN1
7 EFNA5 7 FYN 7 ENO2 1 ALDH2 5 MXRA8
7 DDIT3 7 LTBP1 8 MYOD1 1 VEGFA 8 ATF4
7 GPC3 7 IGFBP5 9 EFNA5 1 ENO2 9 ATF3
10 LTBP1 10 VEGFA 10 ASNS 1 PCK2 10 DDIT3
10 IGFBP5 10 FAM20C 11 DDIT4 1 GABBR1 11 VEGFA
10 GAD1 10 STC2 12 GPC3 1 AGT 11 AGT
13 ENO2 10 RCN1 13 GABBR1 1 SMARCD3 13 GABBR1
13 GABBR1 10 MXRA8 14 GAD1 1 MYOD1 14 EFNA5
13 MYOD1 15 EPHA3 15 IGFBP5 1 CHAC1 14 ASNS
16 ASNS 15 ASNS 16 LTBP1 1 DDIT4 16 ACKR3
16 RELN 15 SRGN 17 SREBF1 17 GABRA5 16 LPAR3
16 STC2 15 ACKR3 18 RELN 17 BEST1 18 CHAC1
19 CYP2E1 15 LPAR3 19 ACKR3 17 EFNA5 18 PCP2
19 FAM20C 15 GAD1 20 FAM20C 17 FSCN1 20 EPHA3
실시 예 6. 허브 유전자의 검증
CRPC로의 진행과 관련된 허브 유전자의 발현을 검증하기 위해, LNCaP(안드로겐 또는 비칼루타미드 민감성 세포주), Bical R(LNCaP의 비칼루타미드 내성 변이체), 22RV1(AR가 발현하는 CRPC 세포), 및 DU145(AR null인 CRPC 세포주)에서 허브 유전자의 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 6b 및 6c에 나타내었다.
도 6b 및 6c에 나타난 바와 같이, qRT-PCR 및 웨스턴 블로팅 분석은 ASNS, ATF4, DDIT3 및 VEGFA의 발현이 LNCaP에 비해 Bical R, 22RV1 및 DU145에서 더 높음을 나타내었다.
또한, GSE32269 및 GSE28403 데이터 세트에서 in vitro 실험에 의해 선택된 4개 유전자(ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA)의 차등 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 7a에 나타내었다.
도 7a에 나타난 바와 같이, 22개의 국소성 PCa와 29개의 전이성 CRPC 샘플로 구성된 GSE32269 데이터 세트에서 ASNS(p <0.001) 및 DDIT3(p <0.001)의 발현이 CRPC 샘플에서 상향 조절되었다. 또한, GSE28403 데이터 세트에서 DDIT3 및 ASNS 발현도 CRPC에서 상향 조절되어 있었으나, DDIT3의 발현 차이만 통계적 유의성을 갖고 있었다. 이것은 적은 수의 환자(4 PCa 및 9 CRPC 샘플) 때문일 수 있으며 일부 샘플은 원격 전이 부위에서 수집되었다.
4가지 유전자의 임상적 유용성을 설명하기 위해 생존 분석을 수행하였다. TCGA 데이터베이스의 PCa 환자의 무병 생존율은 표시된 유전자 발현의 상위 및 하위 사분위수에 따라 얻었다. 그 결과는 도 7b에 나타내었다.
도 7b에 나타난 바와 같이, ASNS(log rank p=0.0079) 및 DDIT3(log rank p= 0.0006)의 높은 mRNA 발현이 불량한 무병 생존율과 관련이 있음을 보여주었다(그림 8). 그러나 ATF4와 VEGFA의 발현은 무병 생존율과 상관관계를 보이지 않았다.
상기 실시 예에 따라 호르몬 불응성 전립선암에서 임상적 유의성이 있다고 판단되는 유전자 또는 단백질들이 선별되었는 바, 본 발명의 유전자 또는 단백질은 호르몬 불응성 전립선암의 조기 진단, 발병 예측 및 새로운 치료표적에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> New target genes of castration resistant prostate cancer and use thereof <130> MP21-264 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGT_F <400> 1 aatgaccgca tcagggtgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AGT_R <400> 2 ggttcagggt cacctccaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASNS_F <400> 3 aagccgagga ggagagtgag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASNS_R <400> 4 tctcatttct ggtggcagag ac 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3_F <400> 5 atgtcctctg cgctggaatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3_R <400> 6 ttgtttcggc actttgcagc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4_F <400> 7 atgggttctc cagcgacaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF4_R <400> 8 agggcatcca agtcgaactc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDIT3_F <400> 9 ttgcctttct ccttcgggac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDIT3_R <400> 10 aagcagggtc aagagtggtg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFNA5_F <400> 11 atgggaatgt aaccggcctc 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EFNA5_R <400> 12 tgggattgca gaggagatgt ag 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_F <400> 13 cttcaagcca tcctgtgtgc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_R <400> 14 tatgtgctgg ccttggtgag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 15 gctacagcaa cagggtggtg 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 16 ggtctacatg gcaactgtga gg 22

Claims (7)

  1. ASNS(Asparagine Synthetase), ATF4(Activating Transcription Factor 4), DDIT3(DNA Damage Inducible Transcript 3), 및 VEGFA(Vascular Endothelial Growth Factor A)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물.
  2. ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제제는 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 검출하는 제제를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 호르몬 불응성 전립선암의 진단용 키트.
  6. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료 중 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 시료의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군 시료보다 높은 경우 호르몬 불응성 전립선암으로 진단하는 단계를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 하기 단계를 포함하는 호르몬 불응성 전립선암 치료제 스크리닝 방법:
    (a) 호르몬 불응성 전립선암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 시료의 ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 후보물질 비처리군과 비교하여, ASNS, ATF4, DDIT3, 및 VEGFA로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 감소한 경우에, 상기 후보물질을 호르몬 불응성 전립선암 치료제로 판정하는 단계.
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