KR20230144034A - 개선된 세포 반응 검출을 위한 디바이스 - Google Patents
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Abstract
바이러스 안전성, 및 세포 변성 효과의 식별을 위한 생물제제, 백신, 세포 및 유전자 치료법과 같은 생물학적 제제를 모니터링하기 위한 개선된 생물제조 디바이스, 장치 및 이를 사용하기 위한 방법이 개시되었다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명은 우발성 바이러스, 박테리아 및 마이코플라즈마를 포함하는 우발성 인자의 객관적인 분석을 가능하게 한다.
Description
본 개시내용의 구현예는 일반적으로 세포 반응 또는 다른 속성을 측정함으로써 검출될 미량의 분석물을 함유하는 비례적으로 더 큰 부피의 샘플 유체에 세포를 노출시키도록 설계된 디바이스에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 구현예는 우발성 바이러스(adventitious virus), 박테리아 및 마이코플라즈마를 포함하는 다양한 우발성 인자(adventitious agent)의 객관적인 분석 및 개선된 성능을 가능하게 한다. 임의의 이러한 종(species)의 검출은 종합적으로 우발성 인자 검사(AAT;adventitious agent testing)로 지칭된다.
감염성 분석(infectivity assay)(예로서, 중화 분석, TCID50 및 임상 샘플 조작)과 같은 생물학적 세포 및 시스템의 특징화를 위해 현재 이용가능한 절차 및 분석 방법론은 광범위한 희석, 잠재적으로 해로운 태깅 절차를 필요로 하며 실험 간 및 실험 내의 시험적 비교를 어렵게 만들고 하류의 세포 응용이 제한되게 하는 매우 가변적인 결과를 산출한다. 특히, 바이러스 안전성을 위한 생물학적 제제(biologic product)(생물제제(biologics), 백신, 세포 및 유전자 치료법)의 검사는 특히 어려우며 14일에 걸쳐 모니터링된 보완 세포주(complement of cell line)에서의 세포 변성 효과의 시각적 식별에 의존하며 추가 14일 동안 감염성 바이러스 인자의 임의의 추가적인 징후를 포착한다. 우발성 인자 검사(adventitious agent testing, AAT)로도 지칭되는 이러한 바이러스 안전성 검사는 생물학적 약물, 치료 및 요법의 출시 과정에서 중요한 부분이다. 분석 시간을 감소시키는 기능은 제품 출시를 신속화할 수 있으며 민감도의 증가는 보다 나은 분석 결과를 생성하여 생명을 구하는 이러한 제품을 보다 안전하게 만들고 지속적인 지속적인 이용가능성을 보장할 수 있다. 본 명세서에 개시된 본 발명은 (관련 세포주로부터) 특정 수의 리포터 세포(reporter cell)를 일정 부피의 생물반응기 유체(조건 배지(condition media))에 노출시키도록 설계된 유체 디바이스의 사용을 통해 이러한 모든 목표를 달성하고자 한다. 노출된 세포는 조건 배지와 함께 배양된 다음 레이저 힘 세포학 또는 기타 검출 방법론을 이용하여 추후 분석을 위해서 방출된다.
본 발명은 우발성 인자의 검출을 개선하기 위한 신규한 디바이스를 제공함으로써 종래기술의 한계를 극복한다.
도 1은 세포 제한 영역, 하나 이상의 유체 저장소 및 이들을 연결하는 채널의 네트워크를 나타내는, 전체 디바이스의 일 구현예를 제공한다.
도 2는 세포 제한 영역을 통해 세포 배양 배지와 같은 샘플 유체를 펌핑하기 위한 루프(loop)를 포함하는 대안적인 구현예를 제공한다.
도 3은 세포 배양 배지에 더하여 시약을 도입하기 위한 다수의 저장소(reservoir)를 포함하는, 디바이스의 동작의 추가적인 세부사항을 제공한다. 이 시약은 단일 세포 분석 또는 다른 기기에 의한 직접 샘플링을 위해서 세포를 방출시키도록 사용될 수 있다.
도 4는 세포 함유 영역에 유체를 전달하기 위해 매니폴드(manifold)가 사용되는 구현예를 제공한다.
도 5는 다수의 세포 함유 영역이 직렬로 또는 병렬로 사용되는 구현예를 제공한다.
도 6은 사전 배양된 세포를 함유하는 일회용 삽입체(disposable insert)를 사용하여 배양된 세포를 디바이스에 도입하기 위한 디바이스의 양태의 일 구현예를 제공하며, 여기서 유체층은 삽입체가 부착하는 표면 근처에 있다.
도 7은 사전 배양된 세포를 함유하는 일회용 삽입체를 사용하여 배양된 세포를 디바이스에 도입하기 위한 디바이스의 양태의 일 구현예를 제공하며, 유체층은 삽입체의 상부 영역을 통해 진입하고 유체는 세포 함유 영역을 통해 아래로 이동하여 밖으로 나간다.
도 8은 플라스틱 유체 디바이스에 나사로 고정되거나 압입(press-fit)되는, 사전 배양된 세포를 함유하는 일회용 삽입체를 사용하여 배양된 세포를 디바이스에 도입하기 위한 디바이스의 양태의 일 구현예를 제공한다. 유체층은 삽입체의 상부 영역을 통해 진입하고 유체는 세포 함유 영역을 통해 아래로 이동하여 밖으로 나간다.
도 9는 조건 배지가 주입되고 오일에 의해 캡슐화되는 오일 함유 주사기를 도시한다. 이것은 주사기의 플라스틱 또는 유리 벽으로부터 분리된 상태로 유지하여 잠재적으로 용기 벽으로의 접착으로 인한 바이러스 손실을 피할 수 있다.
도 10은 분석물을 세포 상에 집중시키도록 세포 제한 영역이 주변 채널보다 좁은 디바이스의 구현예를 제공한다. 투과성 멤브레인(permeable membrane) 또는 장벽(barrier)은 세포 지지부(cell support)를 제한하지만 유체 및 분석물이 자유롭게 흐를 수 있게 한다. 세포 제한 영역의 여러 구현예가 또한 표시되었다.
도 10a 및 10b는 제한 영역으로부터 세포 지지부를 제거하기 위한 다양한 구현예를 제공한다.
도 11은 유체 흐름이 통과하는 동안 중앙 영역에 세포를 포함하도록 (광학적, 자기적, 동전기적 등의) 힘을 사용하는 구현예를 제공한다.
도 12는 제한 영역 내에 위치된 세포에 분석물을 집중시키고 이를 채널 및 다른 벽에 접근하지 못하게 하기 위해서 차동 힘을 사용하도록 설계된 디바이스의 구현예를 제공한다.
도 13은 디바이스 벽으로부터 떨어져 유체 디바이스에서 검사될 조건 배지 또는 기타 유체를 농축하기 위해 유상(oil phase) 내의 수상(aqueous phase)에 집중한 유체역학적 흐름.
도 2는 세포 제한 영역을 통해 세포 배양 배지와 같은 샘플 유체를 펌핑하기 위한 루프(loop)를 포함하는 대안적인 구현예를 제공한다.
도 3은 세포 배양 배지에 더하여 시약을 도입하기 위한 다수의 저장소(reservoir)를 포함하는, 디바이스의 동작의 추가적인 세부사항을 제공한다. 이 시약은 단일 세포 분석 또는 다른 기기에 의한 직접 샘플링을 위해서 세포를 방출시키도록 사용될 수 있다.
도 4는 세포 함유 영역에 유체를 전달하기 위해 매니폴드(manifold)가 사용되는 구현예를 제공한다.
도 5는 다수의 세포 함유 영역이 직렬로 또는 병렬로 사용되는 구현예를 제공한다.
도 6은 사전 배양된 세포를 함유하는 일회용 삽입체(disposable insert)를 사용하여 배양된 세포를 디바이스에 도입하기 위한 디바이스의 양태의 일 구현예를 제공하며, 여기서 유체층은 삽입체가 부착하는 표면 근처에 있다.
도 7은 사전 배양된 세포를 함유하는 일회용 삽입체를 사용하여 배양된 세포를 디바이스에 도입하기 위한 디바이스의 양태의 일 구현예를 제공하며, 유체층은 삽입체의 상부 영역을 통해 진입하고 유체는 세포 함유 영역을 통해 아래로 이동하여 밖으로 나간다.
도 8은 플라스틱 유체 디바이스에 나사로 고정되거나 압입(press-fit)되는, 사전 배양된 세포를 함유하는 일회용 삽입체를 사용하여 배양된 세포를 디바이스에 도입하기 위한 디바이스의 양태의 일 구현예를 제공한다. 유체층은 삽입체의 상부 영역을 통해 진입하고 유체는 세포 함유 영역을 통해 아래로 이동하여 밖으로 나간다.
도 9는 조건 배지가 주입되고 오일에 의해 캡슐화되는 오일 함유 주사기를 도시한다. 이것은 주사기의 플라스틱 또는 유리 벽으로부터 분리된 상태로 유지하여 잠재적으로 용기 벽으로의 접착으로 인한 바이러스 손실을 피할 수 있다.
도 10은 분석물을 세포 상에 집중시키도록 세포 제한 영역이 주변 채널보다 좁은 디바이스의 구현예를 제공한다. 투과성 멤브레인(permeable membrane) 또는 장벽(barrier)은 세포 지지부(cell support)를 제한하지만 유체 및 분석물이 자유롭게 흐를 수 있게 한다. 세포 제한 영역의 여러 구현예가 또한 표시되었다.
도 10a 및 10b는 제한 영역으로부터 세포 지지부를 제거하기 위한 다양한 구현예를 제공한다.
도 11은 유체 흐름이 통과하는 동안 중앙 영역에 세포를 포함하도록 (광학적, 자기적, 동전기적 등의) 힘을 사용하는 구현예를 제공한다.
도 12는 제한 영역 내에 위치된 세포에 분석물을 집중시키고 이를 채널 및 다른 벽에 접근하지 못하게 하기 위해서 차동 힘을 사용하도록 설계된 디바이스의 구현예를 제공한다.
도 13은 디바이스 벽으로부터 떨어져 유체 디바이스에서 검사될 조건 배지 또는 기타 유체를 농축하기 위해 유상(oil phase) 내의 수상(aqueous phase)에 집중한 유체역학적 흐름.
본 발명은 다양한 특징을 갖는 구체적인 구현예를 참조하여 기술된다. 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 본 발명을 실시함에 있어 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 이들 특징이 주어진 적용 또는 설계의 요건 및 사양에 기초하여 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 당업자는 본 발명의 시스템 및 디바이스가 본 발명의 임의의 방법과 함께 사용될 수 있으며 본 발명의 임의의 방법이 본 발명의 임의의 시스템 및 디바이스를 사용하여 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 특징을 포함하는 구현예는 또한 그러한 다양한 특징으로 구성되거나 본질적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 당업자에게 명백할 것이다. 제공된 본 발명의 설명은 사실상 단지 예시적인 것이며, 따라서, 본 발명의 본질에서 벗어나지 않는 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 이하의 설명에서 제시되거나 도면에 도시된 구성요소의 구성 및 배치의 세부사항에 대한 적용으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구현예가 가능할 수 있으며 또는 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 표현 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한적인 것으로 간주되어서는 안됨을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 이러한 기술 및 방법론에 포함된 당업자에 의해 일반적으로 이해되거나 사용될 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 1은 바이러스, 박테리아, 마이코플라즈마, 또는 독소를 포함하는 우발성 인자 또는 다른 샘플 분석물(115)에 대해 검사될 조건 배지 또는 다른 유체를 위한 저장소(135, 145) 및 마이크로캐리어, 세포 성장 디스크 또는 다른 세포 성장 캐리어와 같은 세포 지지부(110)에 존재하는 디바이스의 표면에 부착된 세포의 노출을 위한 세포 제한 영역(100)을 갖는 유체 디바이스를 도시한다. 이러한 지지부는 다양한 크기, 조성 및 구조일 수 있다. 이러한 지지부는 화학적 또는 물리적 수단을 통해 용해될 수 있으며, 광학적, 음향적 또는 자기적인 힘을 이용하여 움직일 수 있다. 유체 흐름(150)은 세포 반응을 유도하기 위해 세포 제한 영역 위로 조건 배지 또는 다른 유체를 통과시키도록 사용될 것이다.
도 2는 우발성 바이러스에 대해 검사될 조건 배지 또는 다른 유체를 위한 저장소(135, 145) 및 마이크로캐리어(110), 또는 세포 성장 디스크, 또는 다른 세포 성장 캐리어 상에 존재하는 디바이스의 표면에 부착된 세포 노출을 위한 영역(100)을 갖는 유체 디바이스를 도시한다. (연동식 또는 다른 유형의) 펌프의 추가는 세포 영역 위에서 배지의 순환을 가능하게 한다.
도 3은 우발성 바이러스에 대해 검사될 조건 배지 또는 다른 유체를 위한 저장소(135, 145) 및 마이크로캐리어(110), 또는 세포 성장 디스크, 또는 다른 세포 성장 캐리어 상에 존재하는 디바이스의 표면에 부착된 세포의 노출을 위한 영역(100)을 갖는 유체 디바이스를 도시한다. 다른 저장소의 추가는 성장 캐리어로부터 세포를 제거하기 위한 트립신과 같은 시약 첨가를 허용한다. 추가로, 사문석(serpentine)의 존재는 마이크로캐리어를 수용하고 단일 세포 분석(광학력, 세포측정법), 핵산 분석(PCR 또는 시퀀싱(sequencing)), 또는 단백질 분석(질량 분광분석법)을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 분석 기기로 전달하기 위해 디바이스로부터 세포를 제거하기 위한 값에 앞서 분리 영역으로서의 역할을 하기에 충분히 크다.
도 4. 위의 도면들과 개념이 유사하지만 보다 낮은 속도로 세포 영역에 더 많은 유체를 전달하는 매니폴드를 포함하는 동시에 마이크로캐리어의 탈출을 허용하지 않고 추가로 클로깅(clogging)을 제한하는 더 작은 채널을 활용한다. 도 4a는 메인 채널로부터 세포 노출 영역까지의 매니폴드를 도시한다. 도 4b는 입력 저장소를 세포 노출 영역에 직접 연결하는 채널을 도시한다. 3개의 채널이 도시되었지만, 실제로는 마이크로- 유체 내지 밀리- 유체 크기까지 임의의 수가 사용될 수 있다.
도 5는 하나의 디바이스에서 직렬 또는 병렬로 다수의 서로 다른 세포 유형을 사용하는 것을 도시한다.
도 6. 위로부터 삽입될 세포 및 유체를 위한 영역이 있는 유체 칩 및 유체 흐름 내에 정착한 세포 캐리어를 도시한다. 추가될 세포 및 유체는 동결될 수 있으며 해동되어 유체 또는 조건 배지에 노출되기 전에 유체 디바이스에서 직접 사용될 수 있다.
도 7. 유체 흐름이 세포 홀더(700)의 상단 영역으로 들어가고 세포 캐리어를 가로질러 아래쪽으로 흐르며 홀더(700) 영역 밖으로 흐르는 것을 제외하고는 도 6과 유사하다.
도 8. 삽입체가 일회용일 수 있고 유체 칩(820)이 재사용 가능하거나 일회용일 수 있도록 세포를 함유하는 삽입체 및 세포 홀더(800)에 대한 동작의 개념. 원통형 세포 홀더는 유체 디바이스에 나사로 고정되어 디바이스 내의 유체와 홀더(800) 내의 세포(810) 사이의 유체 접촉을 이룬다. 흐름은 다시 홀더로 진입하여 세포를 가로질러 다른 쪽 상의 출구를 향해 아래쪽으로 이동하여 세포(810)와의 우수한 체류 시간을 보장한다.
도 9. 주사기 내부 또는 유체 디바이스에서 오일상(oil phase)으로 CM 유체를 빼내는 주사기. 이는 CM과 비리온(virions)이 접착할 수 있는 벽에 접촉하지 않게 유지하며 용액으로부터 제거되도록 한다. 이는 소수성 코팅을 사용하여 획득될 수도 있다.
도 10은 채널(1000)이 세포 지지부보다 큰 지름을 갖는 대안적인 구현예를 도시한다. 이것은 샘플 분석물을 세포 제한 영역(1010) 및 세포 지지부(110)에 집중시키는 것을 도울 수 있다. 이러한 구현예의 추가적인 특징은 세포 지지부를 세포 제한 영역으로 제한하기 위해 하나 이상의 반투과성 장벽(1020)을 사용한다는 것이다. 이러한 장벽은 세포 지지부가 제한 영역을 떠나는 것을 방지하지만 샘플 분석물을 포함하는 액체가 세포 제한 영역을 통해 자유롭게 흐르며 세포 지지부 상에 있는 세포와 상호작용하는 한은, 멤브레인, 프릿(frit), 필터, 또는 기둥이나 둑과 같은 채널의 기하학적 특징일 수 있다. 대안적으로, 세포 지지부는 채널 벽 또는 바닥에 부착하거나 둘 모두에 부착하는 방식으로 설계될 수 있으며, 따라서 장벽(1020)을 사용하지 않고 고정될 수 있다. 화학적, 물리적 또는 다른 결합이 세포 지지부를 부착하고 세포 제한 영역으로부터 벗어나는 것을 방지하도록 사용될 수 있다. 이전에 나열된 다른 특징 및 구현예는 또한, 도 2의 루프 펌핑(looped pumping), 도 4 및 5에 도시된 평행한 채널과 다중 세포 유형 및 도 6 내지 8에 도시된 세포 삽입 디바이스를 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 설계와 함께 사용될 수 있다. 세포 제한 영역의 단면의 여러 구현예가 도면의 하단 부분에 또한 도시되었다. 변형(1050)은 세포 제한 영역의 양측에 장벽(1020)을 가지며, 따라서 중력에 대해 수평 또는 수직으로 배향될 수 있고 흐름은 어느 방향으로든 될 수 있다. 변형(1051)은 한쪽에만 장벽(1020)을 가지므로 입자는 유체 흐름(150), 중력(중력에 대해 수직으로 채널을 배향함으로써 그리고 도시된 바와 같이 하단의 장벽을 이용하여), 또는 광학적, 자기적, 음향적, 또는 유체적인 것과 같은 일부 다른 힘에 의해서 장벽에 대해 능동적으로 고정될 수 있다. 변형(1052)은 또한 중력에 대해 수직으로 배향된 세포 제한 영역을 갖는 오직 하나의 장벽(1020)을 갖지만, 장벽은 상단에 있으므로, 유체 흐름(150)은 세포 지지부(110)를 제한 영역(1010)에 제한한 채로 유지시키기 위해 중력에 의한 정착력을 극복해야만 한다. 이 설계는 유체 흐름을 중단시키고 세포 지지부(110)가 중력에 대항하여 정착되도록 함으로써 세포 복구를 위한 세포 지지부의 손쉬운 제거를 용이하게 한다. 마지막으로, 변형(1053)은 장벽을 갖지 않으며 중력에 대해 수직으로 배향된다. 이러한 경우, 세포 지지부(110)의 정착력은 유체 흐름의 힘과 정확히 균형을 이루며 순 이동은 0이거나 또는 0에 근접한다. 이것은 이들을 제한 영역(1010) 내에 유지시킨다.
도 11a 및 11b는 제한 영역(1010)으로부터 세포 지지부(110)를 수확하기 위한 다양한 구현예를 도시한다. 구현예(1151)에서, 힘(1100)은 장벽(1010) 중 하나를 파괴하거나, 제거하거나, 또는 제거할 수 있게 한다. 이러한 힘은 광학적, 전기적, 기계적, 열적, 음향적 또는 자기적일 수 있다. 장벽들 중 하나가 제거되면, 유체 흐름(150)은 세포 지지체(110)를 제한 영역 밖으로 그리고 수확 영역 또는 디바이스(1120)로 밀어낼 수 있다. 구현예(1152)에서, 힘(1100)은 유체 흐름에 직각인 채널 벽(1110) 중 하나를 제거한다. 이는 수확(1120)을 위해 세포 지지부를 운반하도록 사용될 수 있는 새로운 측면 채널을 생성한다. 도 11b에서, 구현예(1153)는 바닥 장벽(1020)을 제거하는 힘(1100)을 도시한다. 이는 세포 지지부(110)가 중력으로 인해 정착하며 수확 영역(1120)으로 쉽게 운반되도록 한다. 마지막으로, 구현예(1154)에서, 전체 세포 제한 영역이 디바이스 밖으로 이동되어 수확 영역 또는 디바이스(1120)로 운반된다.
도 12는 디바이스의 성능을 향상시키기 위해 하나 이상의 외력을 사용하는 개념을 나타낸다. 이러한 힘은 전기적, 자기적, 광학적, 음향적, 화학적, 열적 또는 유체적일 수 있다. 구현예(1250)는 세포가 분석물에 반응할 가능성을 최대화하기 위해 세포 지지부(110)와의 상호작용 시간을 증가시키기 위해 세포 제한 영역(1210) 내에 샘플 분석물(115)을 집중시키거나 또는 우선적으로 위치시키기 위한 힘의 사용을 도시한다. 이것은 또한 세포 제한 영역 둘레의 채널에 대한 물리적 수정(1225)을 포함할 수 있다. 도시된 일 구현예는 유전체 포커싱을 향상시키기 위해 톱니 구조를 사용하는 것을 도시한다. 다른 구현예(1251)에서, 채널은 샘플 분석물(115)을 접근하지 못하게 하는 방식으로 수정되어, 예를 들어 미량의 바이러스 또는 박테리아가 채널 벽에 달라붙어 제한 영역(1210) 내의 세포와 상호작용하지 않을 가능성을 감소시킨다. 이것은 샘플 분석물이 접근하지 못하게 할 수 있는 물리적 또는 화학적 코팅(예로서 소수성) 뿐만 아니라 능동적인 힘의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 도 12. 구현예는 펌프(135, 145)를 사용하여 앞뒤로 세포를 가로지르는 조건 배지 또는 다른 유체의 흐름으로 인해 세포가 손실되지 않도록 세포를 위치시키기 위해 (광학적, 자기적, 동전기학적, 음향적 등의) 외력을 사용할 수 있는 상호작용 영역/구역을 가진다.
도 13. 구현예는 오일 외피 내에 수성상(aqueous phase)(조건 배지/검사 유체)을 함유하기 위해 3D 유체역학적 포커싱을 사용하는 것을 포함한다. 포커싱된 영역은 유체 채널에서 확장(원형, 정사각형, 피라미드형, 원추형 또는 다른 형태)을 겪을 것이다. 세포는 스캐폴드(scaffold) 또는 대형 마이크로캐리어에 고정되어, 표면에 부착됨으로써 이러한 영역에 포함될 수 있다. 외부 영역으로 퍼진 오일 및 세포를 커버하는 수성상은 세포 함유 영역 위에서 앞뒤로 세포를 흐르게 함으로써 노출을 허용한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 백신 및 세포 그리고 유전자 치료제와 같은 생물학적 제제(biological product)의 제조와 연관된 한 가지 심각한 우려는 우발성 인자(내인성 또는 외인성)의 부주의한 도입이다. 생물반응기 조건 배지 또는 생물제조에 사용되는 다른 유체에서 우발성 인자(AA)를 검출하기 위해 LFC를 사용하여 획득된 것과 같은 광학적 힘 기반 측정의 사용은, 본 명세서에 기술된 신규한 방법론의 중요한 기능이다. 본 발명의 방법은 품질의 비판적 평가 및 박테리아, 바이러스, 또는 다른 복제/살아있는 오염 물질이 약물의 생산을 위태롭게 하는 것을 방지할 수 있게 한다. LFC를 사용하는 개선된 AAT의 궁극적인 목표는 잠재적인 환자의 감염으로 이어질 수 있는 약품 내에 포함될 가능성을 저지하고 제한하는 것이다. 생물제조에서 바이러스 감염성을 측정하기 위해 LFC를 사용하기 위한 전반적인 프로세스가 도 4에 도시되었으며, 여기에서 생물반응기 또는 다른 제조 프로세스로부터의 조건 배지(CM)는 현탁 또는 부착 배양에서 성장하는 세포와 혼합되고 현재 방법보다 더 짧은 기간 동안 배양되며 이는 현재 FDA 지침 하에 14일 이상 소요된다. 대조군으로 블랭크 샘플을 사용하여 동일한 세포가 모니터링된다. 세포가 조건 배지에 노출되는 시간은 분석 최적화의 일부로서 조정될 수 있다.
일 구현예에서, AA를 모니터링하기 위해 LFC를 사용할 때 제1 방어선은 LFC를 사용하여 측정될 수 있는 반응성 세포로서 직접 생물생산에 사용되는 CHO 또는 다른 세포주를 사용하는 것이다. 모든 바이러스가 CHO 세포(및 다른 생산 세포주)에서 세포 변성 효과를 유발하는 것은 아니지만 많은 바이러스가 그러하며, 이는 생산 중에 CHO 세포에서의 변화를 실시간으로 모니터링하기 위한 기초를 형성한다. LFC를 사용하여 측정된 변수의 편차는 AA에 의한 잠재적인 오염의 지표로서 사용될 수 있다. 이것은 Radiance™/LFC를 사용하는 AAT에 대한 전반적인 전략이 주어진 도 5에 도시되었다. 생산에 사용되는 CHO 세포는 AA를 모니터링하는 방식으로 고유의 속성의 변화를 측정하기 위해 세포를 제거하고 LFC 분석을 위해 Radiance™에 도입하는 샘플링 시스템에 의해 지속적으로 모니터링된다. CPE는 AA가 존재하는 경우 볼 수 있으며 이것은 단백질 생산을 모니터링하는 데에 사용되는 LFC 측정 변수의 임의의 변화와는 다르다. 온라인 분석과는 반대로 샘플은 또한 생물반응기로부터 제거될 수 있으며 LFC를 사용하여 Radiance™에서 개별적으로 실행할 수 있다. 조건 배지(CM)는 제거되고 농축되거나 농축되지 않은 세포와 함께 배양될 수 있다(예로서, 잠재적인 AA를 농축하기 위한 원심분리). 인큐베이션 기간 후에 또는 인큐베이션 기간에 걸쳐서, 세포에 대해 AA의 징후가 모니터링될 수 있다. Radiance™/LFC는 잠재적으로 감염된 세포를 분류하고 이들을 분광기(형광, 라만 등), PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄 반응), NGS(next generation sequencing, 차세대 시퀀싱), MS(mass spectrometry, 질량 분광 분석), 세포 분석(cytometry)(흐름, 형광, 질량, 또는 이미지) 또는 다른 방법을 포함하는 다른 방법을 이용하여 분석을 위해 수집할 수 있다.
CHO 세포에서 세포 변성 효과를 발생시키지 않는 바이러스의 경우, 다른 세포주가 검출에 사용될 수 있다. 도 6은 바이러스의 일부 목록을 도시하며 세포 변성 효과 및 복제에 따라 이들을 분류한다. 이것은 4개의 세포주가 잠재적인 바이러스의 적절한 커버리지를 제공할 수 있음을 나타낸다: Vero 세포, 아기 햄스터 신장 세포(BHK), MRC-5 세포, 및 인간 신장 섬유아세포(324K). 패널은 이들 4개의 세포주에 제한되지 않으며 다른 기존 세포주뿐만 아니라 특정 감수성에 대해 수정된 새로 개발된 세포주도 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 데이터의 특정 패턴에 기초하여 바이러스 또는 다른 AA를 분류하는 데에 사용될 수 있다. 이를 위해 인공 신경망(ANN), 패턴 인식, 또는 다른 예측 분석 방법을 포함하는 여러 방법이 사용될 수 있다. LFC 데이터를 사용하는 구체적인 데이터 예시는 도 22에 도시되었다. 여기에서, ANN은 대략 17개의 LFC 파라미터를 입력으로서 사용하여 검사 샘플을 세 가지 잠재적인 바이러스 중 하나로 분류하는 데에 사용된다.
소정의 구현예에서, 속도 분석을 위해, 조건 배지(CM) 또는 다른 분석물을 사용하여 다수의 세포주를 시험관 내 센티넬(sentinel) 세포주와 동시에 실행할 수 있다. 소정의 구현예에서, 센티넬 세포는 모니터링 또는 검출되는 조건(바이러스, 박테리아, 마이코플라즈마, 감염, 또는 기타 AA)에 민감한 세포이며 이들의 반응은 LFC를 사용하여 측정될 수 있다. 도 7은 각각의 웰(well) 또는 바이오샘플링 시스템에서 다수의 시험관 내 센티넬 세포주를 사용하는 다중 분석을 도시한다. 파라미터 공간에 의해 또는 다른 태그, 형광, 시각적 명시야 현미경 식별, 또는 다른 수단을 사용함으로써 Radiance™/LFC에서 세포를 구별하는 능력은 세포가 함께 배양되게 하고 동시에 실행할 수 있게 하여 처리량을 크게 증가시킬 것이다. 서로 혼동되지 않도록 Radiance™/LFC에서 서로 다른 파라미터를 갖도록 조작된 세포는 분석을 다중화하는 데에 사용될 수 있다. 서로 다른 속성을 갖도록 세포를 수정하여 다중화하기 위한 방법은: 형광 기반 - 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 대식세포주 또는 다른 세포주에 통합된 다른 유전적 변형을 포함하지만 이것으로 제한되지는 않으며 따라서 AA로 인해 어떤 것이 세포 변성 또는 다른 영향의 존재를 보고하는지를 결정할 수 있다. LFC를 사용하여 분석된 세포는 또한 단지 예로서, 얼룩, 염료, 항체 접합 비드 라벨, 친화성 결합된 비드 또는 분자, 나노입자(Au, Ag, Pt, 유리, 다이아몬드, 중합체 또는 다른 물질)로 라벨링될 수도 있다. 나노입자는 두 가지 목표: 1) 세포로의 다양한 진입, 및 2) LFC를 사용하여 측정 가능한 광학적 힘의 변경을 달성하기 위해 서로 다른 형태(구형, 사면체, 정이십면체, 막대 또는 입방체 형태 등) 및 크기를 가질 수 있다.
소정의 구현예에서, 나노입자는 세포와 함께 배양될 수 있고 흡수는 세포 유형에 대해 정상적으로 일어날 수 있거나 또는 대안적으로 나노입자 흡수가 나노입자 흡수 비율을 향상시키기 위해 화학적 또는 물리적으로(예로서 전기천공에 의해 또는 리포좀에 의해 촉진되어) 증가될 수 있다. 세포는 검사될 나노입자 및 바이러스와 함께 배양될 것이고 세포로의 바이러스 흡수의 증가된 차이는 LFC를 사용하여 측정된 광학적 힘에서의 보다 큰 차이로 이어지며, 따라서 바이러스 검출 감응도를 향상시킬 것이다. 다른 구현예에서, 나노입자는 세포에 노출되기 전에 바이러스와 함께 배양될 수 있다.
추가의 대안적인 구현예에서, 지정된 수의 비드(bead)를 삼키는 대식세포는 LFC에서 상이한 속성을 갖지만 여전히 AA의 존재를 보고할 수 있다. 추가로, 핵, 미토콘드리아, 또는 기타 소기관과 같은 세포의 특정 부분만이 분석될 수 있다. 이것은 AA뿐만 아니라 감염성을 포함하는 다른 세포 기반 분석의 성능을 향상시키는 데에 사용될 수 있다.
양태에서, 세포는 시험관내 센티넬 세포로서 사용하기 위해 서로 다른 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 다른 AA 감수성을 갖도록 유전적으로 조작될 수 있으며, 구현예에서 Radiance™/LFC와 함께 사용되는 패널에서 AA 검출에 대한 맞춤형 접근법을 허용할 것이다. 특정 유전자를 세포주 내로 통합하거나 또는 세포주로부터 제거하는 것은 세포주가 특정 분류의 바이러스, 박테리아, 또는 다른 AA로 감염되기 쉽게 만들 수 있으므로, 병원체 유형을 선택하여 신속한 검출을 제공한다. 이것은 LFC를 사용하여 가능한 광범위한 바이러스 식별과 결합하여 바이러스, 박테리아, 또는 다른 유형의 AA를 보다 잘 식별할 수 있게 한다.
본 명세서에 기술된 신규한 방법은 AAT가 도 8에 도시된 바와 같이 LFC/Radiance™(810)를 사용하여 즉시 분석을 통해 생산 생물반응기(800)로부터 제거된 세포에서 직접 발생할 수 있음을 입증한다. 생산 세포주(CHO 또는 기타)에서 CPE 또는 다른 효과를 생성하지 않는 AA에 있어서, 생산 생물반응기 내에 존재하는 임의의 AA로 성장 및 감염을 촉진하기 위해 추가의 현탁 세포주가 소형 분석 생물반응기(910)에서 사용될 수 있다.
예를 들어, Radiance™(920)를 사용한 후속 샘플링을 위해 소형 생물반응기(910)에서 성장한 세포주는 도 9에 도시된 바와 같이 AA에 대해 CM을 검사하는 데에 사용될 수 있다. CM의 샘플은 우발성 인자가 존재하는지 확인하기 위해 주기적으로 LFC 기술(920)(예로서, Radiance™)을 사용하여 샘플링될 수 있는 대형 공정 생물반응기(900)로부터 소형 생물반응기로 펌핑된다. 필요한 경우 생산 공정 내의 서로 다른 시점에서 샘플링하도록 다수의 생물반응기가 사용될 수 있다. 소형 생물반응기(들)는 양태에서 바이러스 감염 또는 마이코플라즈마, 또는 프리온(prion), 또는 박테리아, 진균, 또는 원생동물(protozoan) 감염의 식별을 제공하는 데에 사용될 수 있는 감염의 징후에 대한 세포주의 분광학적 분석을 위한 광학 창을 가질 것이다.
도 10은 CM에 존재하는 AA의 검출을 위한, 이 예에서는 시험관 내 센티넬 세포(sentinel cell)로서의 대식세포(macrophage cell)(바이러스, 박테리아, 식물성 포자 및 거의 모든 임의의 다른 물질을 포함하는 이물질을 삼키는 백혈구)의 사용을 도시한다. 대식세포는 LFC를 통해 검출 가능한 고유한 방식으로 이물질의 존재에 반응하고 또한 이물질(바이러스, 바이러스 봉입체, 박테리아 포자 또는 영양 세포(vegetative cell), 엑소솜(exosome) 또는 임의의 다른 생물학적 물질)을 삼킬 수 있으며 따라서 삼킬 때 자신의 멤브레인 내부의 AA를 농축함으로써 자신의 굴절률을 증가시킨다. 이것은 AA에 대한 LFC 반응을 증가시키고 또한 대식세포를 사전 농축된 AA를 분류하여 추가 분석을 위해 다른 기술로 전달하기 위한 LFC를 위한 편리하고 검출 가능한 용기 또는 운반자로 만드는 역할을 한다. 이러한 응용에서 생체 생산 세포(bioproduction cell)(CHO 또는 기타)가 대식세포에 의해 삼켜져서 분석 결과에 영향을 미치지 않도록 이를 제외하는 것이 중요할 것이다. 아마도 CHO 세포2는 대식세포3와 크기가 같거나 더욱 크기 때문에 일반적으로 삼켜지지 않을 것이다. 대안적인 대식세포 활성화(특히 플레이트 결합, 플레이트 조성, 배지 첨가제, 리포폴리사카라이드(LPS), 박테리아 또는 바이러스 단백질을 포함하는 생체 분자의 첨가와 같은 알려진 활성자)는 유전자 또는 단백질 발현에서의 변화를 포함하는 식세포 활성(phagocytic activity) 또는 표현형 상태(phenotypic state)를 선택적으로 제어하는 데에 사용될 수 있다.
크기, (광학적인 힘에 관한) 속도, 크기 정규화 속도, 세포 부피, 유효 굴절률, 이심률, 변형성, 세포 입도, 회전, 배향, 광학적 복잡도, 멤브레인 그레이스케일, 또는 LFC/Radiance™을 사용하여 측정된 다른 파라미터를 포함하는, LFC/Radians™이 측정하는 다수의 파라미터를 사용하여 바이러스, 박테리아 또는 다른 유기체 검출의 특이성이 가능해진다. 이것은 AAT 스크리닝 목적을 위해 바이러스 또는 다른 유기체의 분류를 정의하기 위해 이미지를 포함하는 다변수 파라미터 공간의 사용을 나타낸다. 광학 분광법과 결합하면 라만(Raman), 형광, 화학발광, 원편광 이색성(circular dichroism), 또는 다른 방법을 포함하는 추가적인 특이성을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법 및 디바이스는 미국 특허 출원 번호: 15,853,763(2017년 12월 23일 출원), 16/349,530(2020년 12월 22일 출원), 16/982,935(2020년 9월 21일 출원), 16/378,067(2019년 4월 8일 출원), 17/016,079(2020년 9월 9일 출원) 및 미국 가 특허 출원 번호: 63/049,499(2020년 7월 8일 출원)에 기술 및 청구된 발명과 함께 사용될 수 있으며, 이들 특허 출원 각각은 그 전체로서 본 명세서에 완전히 통합된다.
당업자는 개시된 특징이 단독으로, 임의의 조합으로 사용될 수 있거나, 또는 주어진 응용 또는 설계의 요건 및 사양에 기초하여 생략될 수 있음을 인식할 것이다. 구현예가 소정의 특징을 "포함한다"고 지칭할 때, 이는 구현예가 대안적으로 임의의 하나 이상의 특징으로 "이루어질 수 있음" 또는 "기본적으로 이루어질 수 있음"으로 이해되어야 한다. 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.
특히 본 명세서에서 값의 범위가 제공되는 경우, 해당 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 값이 또한 구체적으로 개시된다는 점에 유의한다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있다. 단수 형태의 표현은 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 형태의 인용을 포함한다. 본 명세서와 예는 본질적으로 예시적인 것으로 간주되며 본 발명의 본질로부터 벗어나지 않는 변형은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 또한, 본 개시내용에 인용된 모든 참조문헌은 그 전체가 참조에 의해 각각 개별적으로 본 명세서에 포함되며 그와 같이 본 발명의 개시내용을 가능하게 하는 보완의 효율적인 방법을 제공할 뿐만 아니라 당업자의 수준을 상세하게 설명하는 배경을 제공하도록 의도된다.
Claims (1)
- 생물학적 제제(biological product)의 제조를 위한 장치로서,
상기 장치는 우발성 인자(adventitious agent)의 도입을 방지하고, 생물반응기(bioreactor)에서 우발성 인자를 검출하기 위한 광학적 힘 기반 측정(optical force-based measurement)의 사용을 포함하며, 이러한 장치에서 광학적 힘 기반 측정을 사용하기 위한 프로세스(process)가 실질적으로 도 4에 도시된, 장치.
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