KR20230143877A - 형상복원능을 갖는 콜라겐 기반 하이드로겔의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형상복원능을 갖는 하이드로겔의 제조방법 및 이의 용도 등에 관한 것이다. 본 발명의F-gel제조 방법에 의한 하이드로겔은 높은 세포활성도, 형상 고정능, 및 형상복원능을 가진다. 또한, Cryo-gel 제조 방법과 F-gel 제조 방법을 융합한 제조 방법에 의한 본 발명의 생체복합체는 Cryo-gel 보다 뛰어난 세포활성도 및 형상 고정능을 갖고, F-gel 보다 뛰어난 형상복원속도를 가지며, 높은 형상복원능을 가지는 것을 확인하였다. 또한, F-gel과 생체복합체 제조 방법을 활용하여 고분자, 세라믹, 금속성 물질이 포함된 하이드로겔을 제작할 경우에도 모두 형상기억 특성을 유지하고 있고, 하이드로겔이 어떠한 제작 공정(3D 프린팅)을 거치더라도 동일한 후처리 과정을 거치면 모든 구조체에서 우수한 형상복원능을 가지는 것을 실험적으로 확인하였다. 따라서, 형상복원능을 가진 3차원 구조체의 제작이 가능하고, 변형된 구조체를 인체나 다른 수중 공간에 쉽게 주입할 수 있는 비침습적 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

형상복원능을 갖는 콜라겐 기반 하이드로겔의 제조방법 및 이의 용도{Method for Manufacturing collagen based shape memorable hydrogel and uses thereof}
본 발명은 형상복원능을 갖는 콜라겐 기반 하이드로겔의 제조방법 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
하이드로겔은 많은 양의 물을 담고 있는 가교된 3D 고분자 네트워크이다. 이는 세포 배양과 물질의 효율적인 수송을 용이하게 하는 투과성을 지원할 수 있는 능력으로 인해 조직 공학, 바이오센서 또는 생물 작용기, 약물 전달, 유기체 제조 및 생물 물리학 분석을 포함한 다양한 용도에 사용될 수 있다. 최근 연구는 골적합을 유도하는 자가 맞춤 스캐폴드, 조직 재생을 위한 최소 침습 수술 등 정밀 의학에 하이드로겔의 적용을 확대하기 위해 생체 활성도가 높은 형태 기억 하이드로겔(SMH; shape memorable hydrogel)에 초점을 맞추고 있다.
생물 의학 분야에서 사용하기 위해, 생물 활성 하이드로겔은 일반적으로 적절한 물리적 특성; 세포 부착과 증식을 유도하기 위한 세포 친화적인 모티프를 제공하는 뛰어난 생물 활성; 및 통제 가능한 생분해성을 필요로 한다. 따라서 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 같은 포유류에서 추출된 천연 생체고분자는 폴리 에틸렌 글리콜, 플루론 F-127과 같은 합성 하이드로겔보다 더 유망하다.
　단백질 기반의 하이드로겔 중 콜라겐은 피부, 힘줄, 뼈, 각막, 그리고 심장과 같은 기관과 조직에 가장 풍부한 구조 단백질이다. 콜라겐 단량체는 오른손 방향 삼중 나선(길이 300nm, 지름 1.5nm)이며, 각 사슬은 특징적인 반복 시퀀스(Gly-X-Y)를 가지고, X와 Y는 각각 프롤린(Pro)과 하이드록시프롤린(Hyp)이 주를 이룬다. 또한 콜라겐 단량체는 생리적 환경에서 '콜라겐 섬유형성'이라고 불리는 독특한 자기 조립 특성을 가지고 있다. 생체 내에서 콜라겐은 섬유아세포에서 합성되어 분비될 수 있고, 단량체는 콜라겐 조직을 형성하는 콜라겐 섬유나 섬유조직으로 조립될 수 있다. 콜라겐 섬유형성은 pH, 온도 및 이온 강도를 조절하여 체외에서 복제할 수 있으며, 이를 통해 콜라겐 겔을 생성할 수 있다. 콜라겐 겔은 세포 매개 콜라겐 섬유 리모델링, 유기체 제작 및 조직 공학 스캐폴드에 사용되어 세포 외 기질의 섬유 미세 환경을 모델링할 수 있다.
거대/미세 다공성 콜라겐 기반의 크라이오겔은 최근 얼음 결정의 형성에 의해 발생하는 용매(물)와 용질(폴리머, 크로스링커)의 상분리를 사용하여 제조한다. 이는 형상 기억 특성을 보였을 뿐만 아니라, 주입식 스캐폴드, 연골 재생, 산소 운반체, 세포 이식, 약물 전달, 그리고 심지어 면역 요법을 포함한 다양한 응용 분야에 광범위하게 사용될 수 있다.
콜라겐을 주 소재로 하여 형상복원능을 가지는 다양한 형상의 하이드로겔 제조 방법의 연구가 미비한 상태인 바, 본 발명자들은 형상복원능을 갖는 콜라겐 기반 하이드로겔 제조 방법을 연구하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허공보 제10-0692608호
본 발명자들은 본 발명의 F-gel 제조 방법에 의한 하이드로겔이 높은 세포활성도, 형상 고정능, 형상복원능을 가지며, Cryo-gel 제조 방법과 F-gel 제조 방법의 융합에 의해 제조된 생체복합체는 Cryo-gel 보다 뛰어난 세포활성도, 형상 고정능을 갖고, F-gel 보다 뛰어난 형상복원속도를 가지며, 높은 형상복원능을 가지는 것을 확인하였다. 또한, F-gel과 생체복합체 제조 방법을 활용하여 고분자, 세라믹, 금속성 물질이 포함된 하이드로겔을 제작할 경우에도 모두 형상기억 특성을 유지하고 있고, 하이드로겔이 어떠한 제작 공정(3D 프린팅)을 거치더라도 동일한 후처리 과정을 거치면 모든 구조체에서 우수한 형상복원능을 가지는 것을 실험적으로 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는, 방법으로 제조된 형상기억 하이드로겔로서,
상기 하이드로겔은 하기의 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔을 제공하는 것이다:
(i) 세포 부착 및 증식 효과를 증가시킴; 및
(ii) 형상 고정 능력의 증가.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
(c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
(d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 (a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
(c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
(d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 형상기억 하이드로겔을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 형상기억 하이드로겔로서,
상기 하이드로겔은 하기의 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔을 제공한다:
(i) 세포 부착 및 증식 효과를 증가시킴; 및
(ii) 형상 고정 능력의 증가.
또한, 본 발명은 (a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
(c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
(d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
(c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
(d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 형상기억 하이드로겔을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 출발물질은 고분자 물질, 세라믹 물질, 및 금속성 물질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로 상기 가교용액은 EDC/NHS[(N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)], 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 탄닌산(tannic acid), 게니핀(genipin), 폼알데하이드(formaldehyde), 및 LOX(lysyl oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 하이드로겔은 탈린(TLN; talin), 팍실린(PXN; paxillin), 빈쿨린(VCL; vinculin), 국소 부착 키나제(FAK; focal adhesion kinase), 및 RhoA 키나제로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자는 이를 포함하는 세포를 배양할 경우 배양된 세포에서 세포-기질 간 부착 관련 단백질을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 광경화성 고분자는 메타크릴레이트 콜라겐인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 출발물질은 콜라겐 및 광경화성 고분자가 0.1 : 3.9 내지 2 : 2의 질량비(w/w %)로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 단계 (a)의 출발물질은 고분자 물질, 세라믹 물질, 및 금속성 물질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 하이드로겔은 하기 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: (i) 세포 부착 및 증식 효과를 증가시킴; 및 (ii) 형상복원속도의 증가.
본 발명의 또 다른 구현예로 상기 하이드로겔은 상기 단계 (a) 및 (b) 사이에 3D 프린팅하는 단계를 더 포함하는 제조방법으로 제조된 형상기억 하이드로겔 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 F-gel 제조 방법에 의한 하이드로겔은 높은 세포활성도, 형상 고정능, 및 형상복원능을 가진다. 또한, Cryo-gel 제조 방법과 F-gel 제조 방법을 융합한 제조 방법에 의한 본 발명의 생체복합체는 Cryo-gel 보다 뛰어난 세포활성도, 형상 고정능을 갖고, F-gel 보다 뛰어난 형상복원속도를 가지며, 높은 형상복원능을 가지는 것을 확인하였다. 또한, F-gel과 생체복합체 제조 방법을 활용하여 고분자, 세라믹, 금속성 물질이 포함된 하이드로겔을 제작할 경우에도 모두 형상기억 특성을 유지하고 있고, 하이드로겔이 어떠한 제작 공정(3D 프린팅)을 거치더라도 동일한 후처리 과정을 거치면 모든 구조체에서 우수한 형상복원능을 가지는 것을 실험적으로 확인하였다. 따라서, 형상복원능을 가진 3차원 구조체의 제작이 가능하고, 변형된 구조체를 인체나 다른 수중 공간에 쉽게 주입할 수 있는 비침습적 활용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 콜라겐 기반 소재를 활용한 형상복원 하이드로겔 제작 방식으로, 구체적으로, 저온공정을 사용한 Cryo-gel, 콜라겐의 섬유화 특성을 활용한 F-gel, 두 가지 공정을 융합하여 제작된 Composite gel(C2CM2 및 C1CM3) 제작 방식을 나타낸 것이다. 또한, 상기 세 가지 하이드로겔의 형상 복원 테스트 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 제작된 네 가지 하이드로겔(Cryo-gel; F-gel; 소재 비율에 따른 Composite gel(C2CM2 및 C1CM3))에 따른 형상복원 특성 평가 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, (A) 80%의 변형을 가한 뒤 구조 형상 및 수분 재공급을 통한 형상 복원된 구조의 이미지; (B) 변형 후 구조체 내부에서 빠져나간 수분의 비율 및 (C) 변형된 구조 비율; (D) 형상 복원 후 구조체 내부로 다시 흡수된 수분의 비율; 및 (E) 형상복원 비율; (F) 형상 복원에 소요되는 시간; (G) 20, 40, 60, 80%의 압축-복원 test에 따른 응력-변형률 곡선; (H) 80%의 변형률을 가하고 10회 반복하였을 때의 응력-변형률 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 (A) 인체 지방유래 줄기세포(human adipose derived stem cells; hASCs)를 사용하여 평가한 세포증식 데이터; (B) 면역형광염색을 활용한 세포 골격 단백질(F-actin)의 이미지; (C) F-액틴 영역; (D) F-액틴의 종횡비; (E) 세포 표면 부착 단백질 관련 유전자(paxillin, talin, vinculin)의 상대적 발현 정도; (F) 세포복원능, 세포증식 및 부착능에 따른 구조체의 특성 평가 데이터를 나타낸 것이다.
도 4는 고분자 소재(heparin; HEP), 세라믹 소재(hydroxyapatite; HA), 또는 금속성 소재(산화철; Fe2O3)가 포함된 F-gel 기반 복합 구조체를 제작한 후, (A) F-gel 기반 복합 구조체의 형상 복원 테스트 이미지; (B) 형상 복원에 소요되는 시간 데이터; (C) 5회 반복 압축 테스트를 진행하였을 때 복원률을 나타낸 것이다.
도 5는 F-gel 제작 기술과 3D 프린팅 기술을 활용한 구조체 제작한 후, 3D 프린팅 된 F-gel 구조체의 (A) 광학이미지 및 (B) SEM 이미지; (C) 3D 프린팅된 F-gel 구조체를 변형하여 주사기에 넣고, 이를 다시 방출하였을 때 형상 복원되는 이미지; (D) 3D 프린팅 된 F-gel 구조체의 형상 변형 및 복원 이미지; (E) 3D 프린팅 기술을 통해 세라믹 물질(hydroxyapatite, HA)와 고분자 물질(heparin, Hep)이 포함된 F-gel 제작한 후, 이의 광학이미지, SEM 이미지, 및 형상 변형 및 복구 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 고분자 소재(heparin; Hep) 및 세라믹(hydroxyapatite; HA)이 함유된 생체 복합체의 특성을 나타낸 것으로, 구체적으로, (A) 알키안-블루-염색 된 생체 복합체-Hep 하이드로겔의 광학이미지와 SEM 이미지; (B) 알리자린-레드-S-염색 된 생체 복합체-HA 하이드로겔의 광학이미지와 SEM 이미지; (C) 두 구조체의 형상복원능을 나타낸 것이다.
도 7은 생체 복합체 제작 기술과 3D 프린팅 기술을 활용한 구조체 제작하고 난 후, (A) 3D 프린팅 된 생체 복합체 구조체의 광학이미지 및 SEM 이미지; (B) 3D 프린팅된 생체 복합체 구조체의 형상 변형 및 복원 이미지; (C) 3D 프린팅된 구조체를 변형하여 주사기에 넣고, 이를 다시 방출하였을 때 형상 복원되는 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 Cryo-gel 제작 기술과 3D 프린팅 기술을 활용하여 구조체를 제작하고, 상기 구조체의 변형 및 형상 복원데이터를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 F-gel제조 방법에 의한 하이드로겔이 높은 세포활성도, 형상 고정능, 형상복원능을 가지며, Cryo-gel 제조 방법과 F-gel 제조 방법의 융합에 의해 제조된 생체복합체는 Cryo-gel 보다 뛰어난 세포활성도, 형상고정능을 갖고, F-gel 보다 뛰어난 형상복원속도를 가지며, 높은 형상복원능을 가지는 것을 확인하였다. 또한, F-gel과 생체복합체 제조 방법을 활용하여 고분자, 세라믹, 금속성 물질이 포함된 하이드로겔을 제작할 경우에도 모두 형상기억 특성을 유지하고 있고, 하이드로겔은 어떠한 제작 공정(3D 프린팅)을 거치더라도 동일한 후처리 과정을 거치면 모든 구조체에서 우수한 형상복원능을 가지는 것을 실험적으로 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서, F-gel은 형상 복원 능력이 우수하고, 수화 의존적 형상 복원을 하며, 효율적인 세포 부착 및 증식을 하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 생체복합체(C2CM2 및 C1CM3)가 F-gel 보다 형상복원속도가 빠르고, F-gel 만큼의 효율적인 세포 부착 및 증식 능력을 가지는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 고분자 소재, 세라믹 소재, 또는 금속성 물질을 포함시켜 제작한 F-gel 및 생체복합체(C2CM2 및 C1CM3)는 상기 물질이 포함되지 않은 F-gel, 및 생체복합체와 유사한 형상 복원 특성이 확인되었을 뿐만 아니라, 3D 프린팅된 F-gel 및 생체복합체의 형상 복원 능력이 우수함을 확인하였다(실시예 2 및 3 참조).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “형상기억 하이드로겔(shape memorable hydrogel)”은 초기의 형상을 기억하여 유체의 유입에 의해 변형된 형태로부터 본래의 모습으로 되돌아오는 하이드로겔을 의미한다. 상기 자극은 수분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 출발물질은 고분자 물질, 세라믹 물질, 및 금속성 물질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 고분자 물질은 콜라겐과 화학적 또는 물리적으로 결합할 수 있는 고분자일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 헤파린(Heparin, 6-[6-[6-[5-acetamido-4,6-dihydroxy-2-(sulfooxymethyl)oxan-3-yl]oxy-2-carboxy-4-hydroxy-5-sulfooxyoxan-3-yl]oxy-2-(hydroxymethyl)-5-(sulfoamino)-4-sulfooxyoxan-3-yl]oxy-3,4-dihydroxy-5-sulfooxyoxane-2-carboxylic acid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 세라믹 물질은 콜라겐 용액과 혼합되어 활용될 수 있는 무기물 소재일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 수산화인회석(hydroxyapatite, pentacalcium, hydroxide, triphosphate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 금속성 물질은 콜라겐 용액과 혼합되어 활용될 수 있는 금속성 소재일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 산화철(Fe2O3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 가교용액은 EDC/NHS[(N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)], 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 탄닌산(tannic acid), 게니핀(genipin), 폼알데하이드(formaldehyde), 및 LOX(lysyl oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 형상기억 하이드로겔로서,
상기 하이드로겔은 하기의 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔을 제공한다:
(i) 세포 부착 및 증식 효과를 증가시킴; 및
(ii) 형상 고정 능력의 증가.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하여 섬유화시키는 단계; 및
(c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는, 방법으로 제조된 형상기억 하이드로겔을 F-gel이라고 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서, 영하 10도 이하 온도에서 냉각시키고, 가교결합 용액을 통해 가교시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 하이드로겔을 Cryo-gel이라고 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔은 탈린(TLN; talin), 팍실린(PXN; paxillin), 빈쿨린(VCL; vinculin), 국소 부착 키나제(FAK; focal adhesion kinase), 및 RhoA 키나제로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔은 수분에 의해 복구되는 형상복원능을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 하이드로겔은 세포활성도 및 형상 고정능(fixity ratio)이 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 형상 고정능은 변형된 형상을 유지할 수 있는 능력이다.
본 발명은 (a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
(c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
(d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 광경화성 고분자는 메타크릴레이트 콜라겐(methacrylate collagen), 메타크릴레이트 젤라틴(methacrylate gelatin), 또는 메타크릴레이트 알지네이트(methacrylate alginate)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 출발물질은 콜라겐 및 광경화성 고분자가 0.1 : 3.9 내지 2 : 2, 0.2 : 3.8 내지 2 : 2, 0.3 : 3.7 내지 2 : 2, 0.4 : 3.6 내지 2 : 2, 0.5 : 3.5 내지 2 : 2, 0.6 : 3.4 내지 2 : 2, 0.7 : 3.3 내지 2 : 2, 0.8 : 3.2 내지 2 : 2, 0.9 : 3.1 내지 2 : 2, 1 : 3 내지 2 : 2, 또는 1.5 : 2.5 내지 2 : 2의 질량비(w/w %)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 광경화성 고분자는 파장 200 내지 400nm, 250 내지 400nm, 300 내지 400nm, 310 내지 400nm, 320 내지 400nm, 330 내지 400nm, 340 내지 400nm, 또는 350 내지 400nm의 광에 의해 광경화가 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)의 동결은 영하의 온도로 수행될 수 있으며, -50 내지 0℃, -40 내지 0℃, -30 내지 0℃, -50 내지 -5℃, -40 내지 -5℃, -30 내지 -5℃, -50 내지 -10℃, -40 내지 -10℃, 또는 -30 내지 -10℃의 온도로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단계 (b)에서 수분이 모두 얼음결정이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (e)의 2차 가교는 25 내지 40℃, 또는 30 내지 40℃의 온도로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 단계 (a)의 출발물질은 고분자 물질, 세라믹 물질, 및 금속성 물질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 가교용액은EDC/NHS[(N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)], 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 탄닌산(tannic acid), 게니핀(genipin), 폼알데하이드(formaldehyde), 및 LOX(lysyl oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법을 사용한 구조체는 형상복원능을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 형상기억 하이드로겔을 제공한다:
(a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
(b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
(c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
(d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
(e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법에 의해 제조된 하이드로겔을 C1CM3 또는 C2CM2와 같이 콜라겐과 광경화성 고분자의 질량비를 이용하여 칭할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔은 (1) 형상 복원 비율(Rr), (2) 형상 고정 비율(Rf), (3) 형상 복구 시간, (4) 세포 증식, 및 (5) 세포 부착의 5가지 매개변수를 이용한 오각형 다이어그램에서 50 내지 100%, 50 내지 80%, 또는 50 내지 70%의 영역을 차지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔은 하기 특징 중 어느 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: (i) 세포 부착 및 증식 효과를 증가시킴; 및 (ii) 형상복원속도의 증가. 또한, 상기 하이드로겔은 탈린(TLN; talin), 팍실린(PXN; paxillin), 및 빈쿨린(VCL; vinculin)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 하이드로겔은 수분에 의해 복구되는 형상복원능을 가질 수 있다. 또한, 상기 하이드로겔은 세포활성능, 또는 형상 고정능이 증가 할 수 있으며, F-gel에 비하여 형상복원속도가 증가 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 단계 (a) 및 (b) 사이 다음으로, 3D 프린팅하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 3D 프린팅하는 단계는 상기 출발 물질을 프린팅 용액 배럴에 주입하고 프린트하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 프린팅 단계의 온도는 0℃ 이하, -50 내지 -10℃, -40 내지 -15℃, -35 내지 -25℃, 또는 -20℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배럴의 온도는 0 내지 10℃, 1 내지 8℃, 2 내지 6℃, 또는 4℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 콜라겐 용액 준비 및 분석
돼지 피부 유래 제1형 콜라겐(MS바이오, 대한민국)을 사용하였다. 콜라겐 용액(4 wt%, 8 wt%)은 0.1 M 아세트산(pH 4.0)에 콜라겐 분말을 용해하여 제조하였고, 4 wt% 중화 콜라겐 용액(pH 7.8)은 8 wt% 콜라겐 용액을 0.25 M NaHCO3과 1:1 비율로 혼합하여　제조하였다.
산성 및 중화 콜라겐(4 wt%)의 유동학적 특성[저장 계수(G')과 손실 계수(G'')]은 회전 콘 및 플레이트 레오미터(rheometer)로 측정하였다(Bohlin Gemini HR Nano, Malvern Instruments, U.K.; 직경 40 mm; 원뿔각도 4°; gap 150 μm). 또한, 온도 스위프(2℃/min에서 약 5~55℃)는 1% 변형률로 1Hz 주파수에서 수행하였다.
Circular dichroism spectroscopy(J-815, JASCO, Japan)를 이용하여 콜라겐 알파나선 구조를 분석하였다. 또한, 산성 콜라겐(pH 4.0)과 중화 콜라겐(pH 7.8)을 최종 농도 0.3mg/mL로 제조하였다. 350 μL 샘플을 쿼츠 큐벳(1 mm 경로 길이; 110-QS, Hellma, USA)에 적재하고 원자외선 스펙트럼(파장 범위: ~200-260 nm)을 측정하였다. 모든 타원율 측정값은 버퍼 스펙트럼에 의해 수정되었고, 평균 몰 잔류 타원율(MRE; mean molar residue ellipticity)을 얻기 위해 정규화하였다.
2. 콜라겐 기반 하이드로겔 준비 및 특성화
하이드로겔 제조에는 3D 프린팅된 원통형 몰드(재질: ABS, 직경: 5mm, 높이: 2.5mm)를 사용하였다. 산성 콜라겐(4 wt%, pH 4.0)과 중화 콜라겐(4 wt%, pH 7.8)을 몰드에 넣은 후, 200 mM EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)/50 mM NHS(N-hydroxy-succinimide)와 가교시켜 각각 C-gel과 uF-gel을 얻었다. Cryo-gel 준비를 위해, 산성 콜라겐을 -20℃에서 동결하였다. 그런 다음, 냉동된 콜라겐을 -20℃로 75 % EtOH에서 용해된 200 mM EDC/50 mM NHS에 24시간 동안 담가 가교 시켰다. 그 후, 얼음 결정을 녹이기 위해, 가교된 겔을 냉장고(4℃)에 넣었다. 섬유화된 F-gel을 얻기 위해, 중화된 콜라겐을 몰드에 붓고, PBS(phosphate-buffered saline)에 담궈 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. EDC/NHS 가교는 37℃에서 4시간 동안 수행하였다(75% EtOH에서 용해된 100mM EDC/25mM NHS). 모든 하이드로겔은 삼중 증류수(3DW; triple-distilled water)로 세척되었다. 샘플의 표면 및 내부 구조는 주사전자현미경(SNE-3000M, SEC Inc., South Korea)을 이용하여 분석하였다.
하이드로겔에서 유리 아민 잔기의 정량화는 2,2-dihydroxy-1,3-indanedione(닌하이드린 어세이)을 사용하여 가교의 정도(n = 6)를 분석하였다. 간단히 말해서, 0.16 w/v% tin II chloride 의 시트르산 200 mM을 3DW로 조제하고, 10 M NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 5.0으로 조정하였다. 또한, 닌하이드린 분말은 2-에톡시에탄올(4 w/v%)에 용해하였다. 이 두 용액을 1:1로 혼합하여 반응 용액을 만들었다. 블랭크(w/o collagen), 3mg의 콜라겐 스폰지, 및 4가지 유형의 동결 하이드로겔(C-gel, Cryo-gel, uF-gel. 및 F-gel) 각각 3mg을 1.5 mL 미세관에 넣어 반응용액 1 mL를 가하였다. 샘플을 100℃의 가열 챔버에 15분 동안 가열하였다. 반응이 끝난 후, 시료를 4℃에서 5분간 냉각시키고 마이크로튜브마다 50%(v/v) 2-프로판올 250 μL를 첨가하였다. 각 샘플의 200μL를 9-웰 플레이트에 넣고, 광학 밀도(OD)를 570nm에서 마이크로플레이트 판독기(EL800, BioTek, United States)로 측정하였다. 가교 정도(%)는 하기 식 1로 계산하였다.
[식 1]
가교 정도(%) = [1 - (ODsample - ODblank)/(ODcollagen sponge - ODblank)] × 100
제작된 하이드로겔(n = 5)의 공극률(%)은 하기 식 2로 계산하였다. Wsample은 동결시료의 중량, ρcollagen은 밀도, Vsample 은 구조물의 부피이다.
[식 2]
공극률(%) = [1 - (Wsample/ρcollagen) / Vsample] × 100
하이드로겔(n = 5)의 누수(water leakage)를 평가하기 위해 universal testing machine(Top-tech; Chemilab, South Korea)을 사용하여 하이드로겔에 6 mm/min의 속도로 다양한 압축 변형률(ε= 20, 40, 60, 80%)을 적용하였다. 각 변형률마다 하이드로겔에서 짜낸 물은 티슈로 제거하였다. 누수율(%)은 하기 식 3으로 계산하였다. Whydrogel, initial 및 Whydrogel, ε는 배출된 물을 제거하기 전과 제거한 후의 하이드로겔의 무게를 각각 나타낸다.
[식 3]
누수율(%) = [(Whydrogel, initial - Whydrogel, ε) / Whydrogel, initial] × 100
공극률 측정기(porosimeter, Autopore V 9620; Micromeritics Inc., United States)를 사용하여 하이드로겔의 공극 크기 분포를 분석하였다. 정규화된 공극 부피 밀도는 공극 직경 및 누적 부피 데이터를 사용하여 식 4로 계산하였다.
ΔVi, Δri 및 Vmax는 각각 증가된 공극 부피, 공극 반경 간격 및 최대 누적 공극 부피를 나타낸다.
[식 4]
공극 부피 밀도 = ΔVi / (Δri × Vmax)
수분 흡수를 측정하기 위해, 직육면체(폭: 5mm, 깊이: 1mm, 높이: 6mm) Cryo-gel 및 F-gel을 위에서 설명한 프로토콜에 따라 몰드에서 준비하였다. 샘플을 클립으로 고정하고, 하단 표면(1 mm)을 로다민 염료 용액(Sigma-Aldrich)에 담갔다. 각 시점에서 광학 이미지를 촬영하고, FiJi 소프트웨어(National Institutes of Health(NIH), USA)를 사용하여 흡수 거리를 측정하였다.
형상 고정 비율(Rf, Shape fixity ratio) 및 형상 복구 비율(Rr, shape-recovery ratio)은 하기 식 5 및 6으로 계산하였다. εD 및 εR은 각각 변형 후 변형률[(hi - hD)/hi] 및 재수화 후 변형률[(hi - hR)/hi]을 나타내고, εm은 변형률이다.
[식 5]
Rf = εD/εm
[식 6]
Rr = (εm - εR)/εm
3. 하이드로겔의 역학적 특성
원통형 하이드로겔(직경: 5mm, 높이: 2.5mm, n = 4)은 universal testing machine(UTM; Top-tech)을 사용하여 6mm/min의 속도로 압축 테스트를 하였다. 압축 계수는 응력-변형률 곡선(stress-strain curve)의 선형 영역에서 계산하였다. 주기적 압축 테스트는 일정한 속도(6 mm/min)로 UTM을 사용하여 수행되었고, 이러한 압축 해제 테스트 중 높이 복원은 비디오 녹화에서 측정하였고, FiJi 소프트웨어(NIH, USA)로 분석하였다.
4. 콜라겐의 메타크릴화
콜라겐의 메타크릴화를 수행하여 광가교성 콜라겐(photo-crosslinkable collagen)을 얻었다. 간단히 말해서, 3.75 mg/mL의 콜라겐 용액을 교반된 0.5 M 아세트산을 사용하여 제조하였다. 콜라겐이 완전히 용해된 후, 4℃에서 10 M NaOH를 방울별로 추가하여 용액의 pH를 8.0로 조정하였다. 메타크릴산 무수물(MAA; Methacrylic anhydrides, Sigma-Aldrich)을 콜라겐 용액(콜라겐 용액 1mL당 MAA 7.5μL)에 3일 동안 첨가하여 콜라겐 메타크릴레이트(Col-ma, 메타크릴레이트 콜라겐)를 얻었다. 반응 후, Col-ma를 아세톤으로 침전시키고 70% 에탄올로 5회 세척하였다. 세척된 Col-ma는 투석 튜브(dialysis tubing, 3.5 kDa, Spectrum Chemical Mfg. Corp., United States)를 사용하여 3DW에서 7일 동안 투석되었다. 그 후, 동결(FD8505, IlshinBioBase, South Korea)하여 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. Col-ma의 메타크릴화율은 64.8 ± 0.8%였으며, 위에서 설명한 프로토콜에 따라 닌히드린 분석으로 측정하였다.
5. Col-ma/collagen 복합 하이드로겔 제조
콜라겐 및 Col-ma 용액은 0.1 M 아세트산(pH 4.0, 8 wt%)으로 제조하였다. 각 용액은 0.25 M NaHCO3와 1:1 혼합하여 중화하였으며, 최종 농도는 4 wt% (pH 7.8)이었다. 광개시제[lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP; Sigma-Aldrich)]를 중화된 Col-ma 용액에 용해시켰다(Col-ma 용액 1mL당 LAP 3mg). Col-ma와 콜라겐(Col) 용액을 다양한 비율로 혼합하여 Col/Col-ma 복합 용액을 제조하였다.
Col/Col-ma 복합 하이드로겔의 제조를 위해, 전구체 용액을 원통형 몰드(직경: 5mm, 높이: 2.5mm)에 넣었다. 그 후, -20℃에서 4시간 동안 동결하였고, -20℃에서 UV 가교(365 nm, 120초 동안 200 mW/cm2)를 수행하였다. 그 후, 하이드로겔을 PBS에 담근 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS를 제거하고, 2차 가교를 위해 75% EtOH에서 용해된 100 mM EDC/25 mM NHS를 첨가하였다(37℃, 4시간).　모든 제작된 하이드로겔은 삼중 증류수(3DW)로 세척되었고, 표면 형태, 기계적 특성, 형상 복원 특성은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 분석하였다.
6. In vitro 테스트
인간 지방 유래 줄기세포(hASC, PT-5006, Lonza, Basel, Switzerland)는 10% FBS(fetal bovine serum, Biowest, France)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(PS, Thermific Fisher)으로 보충된 DMEM 저포도당(HyClone; 미국)에서 5% CO2, 37℃의 조건으로 배양하였다. 세포를 다양한 하이드로겔(1.0 × 103 cells/scaffolds)에 접종하고 배지를 2일마다 교체하였다.
세포 증식(n = 5)은 제조업체의 프로토콜에 따라 CCK-8 분석(Dojindo, 일본)을 사용하여 분석하였다. 간단히 말해서, CCK-8 assay 용액과 세포 배양액을 1:9의 비율로 혼합하고, 세포 배양 시점마다 200 μL의 용액을 각 샘플에 주입하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 96-웰 플레이트에 반응물을 피펫팅하여 450nm에서 마이크로 플레이트 리더(EL800)로 흡광도를 측정하였다.
하이드로겔에서 배양된 hASC의 형태를 시각화하기 위해, 세포를 3.7% 포름알데히드(Sigma-Aldrich)로 고정하였다. 비특이적 항체 결합의 투과 및 차단을 위해, 하이드로겔을 2% BSA(bovine serum albumin, Sigma-Aldrich)을 함유하는 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 2시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 샘플을 항-빈쿨린(vinculin) 1차 항체(5 μg/ml, Abcam, 미국)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 검체를 PBS로 2회 헹군 후, diamidino-2-phenylinodole(DAPI, PBS에서 1:100 희석, Invitrogen, USA), Alexa Fluor 594 phalloidin(PBS에서 1:100 희석, Invitrogen), 및 Alexa Fluor 488-접합 2차 항체(PBS에서 1:50, Invitrogen)를 사용하여 1시간 동안 세포 핵, F-액틴 및 빈쿨린을 각각 시각화하였다. 염색된 세포는 공초점 현미경(LSM700, Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다. 또한 FiJi 소프트웨어를 사용하여 세포의 F-액틴 영역과 종횡비를 측정하였다.
실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(실시간 RT-PCR)을 수행하여 탈린(TLN; talin), 팍실린(PXN; paxillin), 빈쿨린(VCL; vinculin), 국소접착 키네이스(FAK; focal adhesion kinase), RhoA(ras homolog family member A)의 상대적인 유전자 발현 수준을 측정하였다. 배양된 hASC의 총 RNA는 TRI 시약(Sigma-Aldrich) 처리로 추출하였고, 분리된 RNA의 농도는 분광광도계(FLX800T; Biotek, USA)를 이용하여 측정하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Toyobo Co., Ltd., Japan)를 사용하여 cDNA(Complementary DNA)를 합성하였다. 정량적 RT-PCR을 수행하기 위해, StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)과 Thunderbird® SYBR® qPCR Mix(Toyobo, Japan)를 사용하였고, 유전자 발현 수준은 하우스키핑 유전자(베타-액틴(ACTB))의 발현 수준에 의해 정규화되었다. 유전자 특이적 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
서열 서열번호
human ACTB 정방향 ctcgcctttgccgatcc 1
역방향 tctccatgtcgtcccagttc 2
human TLN 정방향 gccatcaagaaaaagctggt 3
역방향 ctgcagcgatggtctgtg 4
human PXN 정방향 tcgctgtcggatttcaagat 5
역방향 atgaaccctccctcgtcct 6
human VCL 정방향 cgattacgaacctgagctgc 7
역방향 tggtagcttcccgatgcaag 8
human FAK 정방향 gctcccttgcatcttccagt 9
역방향 attgcagcccttgtccgtta 10
human RhoA 정방향 gtccacggtctggtcttcag 11
역방향 cagccattgctcaggcaac 12
7. 고분자, 세라믹, 또는 금속성 물질을 함유하는 복합 하이드로겔 제조
광개시제(LAP)를 포함하는 Col 2%/Col-ma 2% 용액을 C2CM2-Hep 및 C2CM2-HA 복합 하이드로겔 제조에 사용하였다. C2CM2-Hep 하이드로겔 제조를 위해, 0.04mg의 헤파린을 1mL의 용액과 혼합하였다. 또한, C2CM2-HA 하이드로겔 제조를 위해, 0.08g의 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 1mL의 용액과 혼합하였다. 용액을 원통형 몰드에 넣고 -20℃에서 4시간 동안 동결시킨 후, -20℃에서 UV 가교(365nm, 120초 동안 200mW/cm2)를 수행하였다. 하이드로겔을 PBS에 담근 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, PBS를 제거하고 75% EtOH에서 용해된 100mM EDC/25mM NHS를 추가 가교를 위해 첨가하였다(37℃, 4시간). 제작된 하이드로겔은 모두 3DW로 세척되었으며, 표면 형태 및 형상 복원 특성은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 분석하였다.
8. 3D 프린팅을 이용한 형상 복원 하이드로겔 제작
온도 제어 시스템과 결합된 디스펜싱 시스템(AD-3000C; Ugin-tech, 한국)이 장착된 3축 프린팅 시스템(three-axis printing system, DTR3-2210 T-SG; DASA Robot, 한국)을 사용하였다. 3D 프린트된 C2CM2 스캐폴드(C2CM2print) 제작을 위해, Col 2 wt%/Col-ma 2 wt%(pH 7.8, 3 mg/mL LAP와 혼합)를 프린팅 용액 배럴에 주입하였다. 프린팅 단계 온도는 -20℃, 배럴 온도는 4℃로 설정하였다. 메쉬 구조는 고정된 프린팅 매개변수(노즐 직경: 250μm, 공압: 100kPa, 인쇄 속도: 10mm/s)로 프린트되었다. 프린트된 C2CM2 구조는 -20℃에서 UV 조사(120초 동안 200mW/cm2)로 가교되었고, PBS에 담근 후 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 그 후, 구조는 37℃에서 75 % EtOH에서 용해된 100 mM EDC/25 mM NHS로 4시간 동안 가교되었으며, 모든 검체는 3DW로 세척하였다.
F-gel 제작을 위하여, 중화된 Col 4wt% 용액을 배럴에 주입한 뒤, 디스펜서와 3D 프린터를 활용하여 3 차원 구조체를 제작하였다. 배럴의 온도는 5 내지 10℃로 세팅하였으며, 프린팅 스테이지의 온도는 30 내지 40℃의 범위로 진행하였다. 프린팅 이후 구조체는 EDC/NHS를 통해 가교되었으며, 구조체는 3DW로 세척하였다.
Cryo-gel 제작을 위하여 산에 용해된 4 wt%의 콜라겐 혹은 4 wt%의 광경화성 콜라겐(Col-ma) 용액을 배럴에 주입하고, 디스펜서와 3D 프린터를 통해 3차원 구조체를 제작하였다. 제작된 구조체는 -80℃ 환경에서 EDC/NHS 용액에서 가교를 진행하거나, Col-ma 구조체의 경우 UV를 조사하여 광경화를 진행시켰다.
9. 통계 분석
데이터는 평균±표준편차로 표현하였으며, 통계분석은 SPSS 소프트웨어(SPSS, Inc., USA)를 이용하여 수행하였다. 두 그룹 간의 비교를 위해 t-test가 사용되었다. 세 개 이상의 그룹을 비교하기 위해, 단일 인자 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 HSD post-hoc test가 사용되었고, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
[실시예]
실시예 1. Cryo-gel의 형상 복원 특성과 F-gel의 세포 활성 특성을 갖는 생체복합체
Cryo-gelcol-ma, F-gel, 및 생체복합체(C1CM3 및 C2CM2)의 변형 및 재수화로 인한 기하학적 변화를 확인하였다. 그 결과는 도 2의 (A) 내지 (E)에 나타내었다.
도 2의 (A) 내지 (C)에 나타난 바와 같이, 압축 후 C2CM2 및 F-gel의 수분 함량은 Cryo-gelcol-ma 및 C1CM3보다 약간 낮았다(Cryo-gelcol-ma = 77.7 ± 2.4%; C1CM3 = 78.4 ± 2.6%; C2CM2 = 75.1 ± 4.4%, F-gel = 72.4 ± 2.0%). 그러나 Col 중량 비율이 증가함에 따라 형상 고정 비율이 증가하였다(Rf, Cryo-gel col-ma = 3.9 ± 3.4%; Rf, C1CM3 = 38.5 ± 9.7%; Rf, C2CM2 = 68.8 ± 7.7%, 및 Rf, F-gel = 94.8 ± 5.1%). 또한, 재수화 후 모든 하이드로겔은 비슷한 수준으로 수분을 흡수하여 형상을 복원하였다(Rr, Cryo-gelcol-ma = 98.6 ± 6.6%, Rr, C1CM3 = 97.4 ± 5.7%, Rr, C2CM2 = 99.2 ± 4.0%, Rr, F-gel = 99.6 ± 1.5%).
본 발명자들은 F-gel이 Cryo-gel보다 복원 속도가 느리다는 것을 확인하였다. 이에 생체복합체의 복원 속도를 분석하였다. 그 결과는 도 2의 (F)에 나타내었다.
도 2의 (F)에 나타난 바와 같이, 생체복합체(C2CM2 및 C1CM3)는 F-gel보다 훨씬 빠르게 형상이 복원되고, Cryo-gel(또는 Cryo-gelcol-ma)만큼 빠르게 형상이 복원되었다. 이는 도 2의 (H)에 나타난 바와 같이, 생체복합체의 Col-ma 영역에서 상대적으로 더 큰 공극을 통한 효율적인 수분 흡수의 결과이다.
또한, 생체복합체(C1CM3 및 C2CM2), Cryo-gelcol-ma, 및 F-gel의 형상 복구 특성은 다양한 압축 변형률(ε = 20, 40, 60, 80%)과 압축-복귀 주기 수(1, 5, 10)에 대해 평가되었다. 그 결과는 도 2의 (G) 및 (H)에 나타내었다.
도 2의 (G) 및 (H)에 나타난 바와 같이, 다양한 주기적 압축조건이 적용됐지만 생체복합체는 이력현상 없이 형상 복원이 우수하였다. 따라서, 연골이나 근육, 뼈에 변형력이 가해지는 주사식 스캐폴드나 조직공학 생체반응기에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Cryo-gelcol-ma, F-gel, 및 두 가지 생체복합체에서 배양된 hASC의 세포 증식은 CCK-8 분석을 사용하여 확인하였다. 그 결과는 도 3의 (A)에 나타내었다.
도 3의 (A)에 나타난 바와 같이, F-gel과 C2CM2 복합체에서 7일째 생존한 세포의 수는 Cryo-gelcol-ma 및 C1CM3보다 훨씬 많았다. 이는 F-gel과 C2CM2가 ECM과 더 유사한 나노섬유 구조의 미세환경을 제공한 것을 의미한다.
또한, 각 하이드로겔에서 1일 동안 배양된 세포의 DAPI/팔로이딘 이미지, 및 F-액틴 영역, 종횡비를 도 3의 (B) 내지 (D)에 나타내었다.
도 3의 (B) 내지 (D)에 나타난 바와 같이, C2CM2 생체복합체에서 배양된 세포 형태는 F-gel에서 배양된 세포 형태와 훨씬 유사하였다.
또한, RT-PCR을 사용하여 세포 배양 7일 후 국소 부착 유전자인 탈린(TLN), 팍실린(PXN), 빈쿨린(VCL)의 발현을 측정하였다. 이때, Cryo-gelcol-ma으로 정규화하였으며, 그 결과는 도 3의 (E)에 나타내었다.
도 3의 (E)에 나타난 바와 같이, F-gel에서 배양된 세포의 유전자 발현량이 가장 높았고, C2CM2 생체복합체에서 배양된 세포의 경우 Cryo-gelcol-ma 및 C1CM3에서 배양된 세포보다 유전자 발현량이 훨씬 높았다.
요약하면, 생체복합체의 형상 복원 특성과 세포활성을 비교하기 위해, (1) 형상 복원 비율(Rr), (2) 형상 고정 비율(Rf), (3) 형상 복구 시간, (4) 세포 증식, 및 (5) 세포 부착의 5가지 매개 변수를 사용하였다. 형상 복원 시간은 최소값으로 정규화되었고, 다른 매개변수는 각 최대값으로 정규화되었다. 그 결과는 도 3의 (F)에 나타내었다.
도 3의 (F)에 나타난 바와 같이, C2CM2 생체복합체가 오각형 다이어그램의 가장 큰 영역을 차지하였다(Cryo-gelcol-ma = 21.7%, C1CM3 = 42.4%, C2CM2 = 68.8%, F-gel = 61.8%). 이는 C2CM2가 F-gel보다 더 나은 형상 복원 특성을 갖고, Cryo-gel 및 C1CM3보다 더 큰 세포활성을 지원한다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 빠른 형상복원속도를 가지는 Cryo-gel과 높은 세포활성도를 가지는 F-gel의 장점을 병합하였다. 영하의 온도에서 동결된 후에, 추가적으로 가교를 진행하는 것은 실험적으로 큰 어려움이 있다. 그러나, 본 발명은 동결 후에 추가로 가교를 진행하여 형상복원속도가 빠르고, 세포활성도가 높은 하이드로겔 제조방법을 제안하였는바, 현저히 우수한 발명이다.
실시예 2. F-gel 기반 복합 구조체의 응용
다양한 조직 공학 적용을 위한 F-gel 생체복합체의 활용을 위해, 헤파린, 하이드록시아파타이트(HA; hydroxyapatite), Fe2O3를 생체복합체의 첨가제로 사용하였다. 헤파린은 세포 외 기질에서 널리 분포하며, 정전기 상호작용을 통해 음전하의 방출을 지연시킬 수 있기 때문에 성장 인자의 지속적인 방출에 널리 사용되어 왔다.　 또한, HA는 뼈의 주성분 중 하나로, 골조직 재생에서 골유착 및 골전도에 널리 사용된다. 산화철(Fe2O3)은 금속성 소재의 하나로 사용되었다.
따라서 (1) 헤파린 결합 F-gel 생체복합체(F-GEL-HEP, 1 μg heparin/ Col 1 mg), (2) HA 결합 F-gel 생체복합체(F-GEL-HA, HA 2mg/Col 1 mg), (3) 산화철 결합 F-gel 생체복합체(F-GEL-Fe2O3, Fe2O3 0.1 mg/Col 1 mg)의 세 가지 다른 유형을 제조하였다. 그 후, 형상 복원 특성 분석을 하였다. 그 결과는 도 4의 (A) 내지 (C)에 나타내었다.
도 4의 (A) 내지 (C)에 나타난 바와 같이, 500g 추를 활용하여 압착 및 변형을 진행하였으며, 압축이 제거된 후 초기 형상으로 복귀되는 것을 확인할 수 있었다.
F-gel 제작 기술을 활용하여 3차원 다공성 구조를 제작하기 위해, 3D 프린팅을 통해 printed F-gel(PF-gel) scaffold를 제작하였다. 중화된 콜라겐을 활용하여 16×16×2mm3 구조를 제작하였으며(도 5의 (A)) 제작된 구조체의 SEM 분석 결과 표면이 섬유 구조로 이루어진 것을 확인할 수 있었다(도 5의 (B)). 이를 주입 가능한 구조체로 활용할 수 있는지 확인하기 위하여 노즐을 통해 주입 테스트를 진행하였으며, 변형된 구조체가 수분 주입 시 초기 디자인으로 다시 복구되는 것을 확인할 수 있었다(도 5의 (C)). 또한, 변형 회복능을 다시 확인하기 위하여 500g 추를 활용하여 압착 및 변형을 진행하였으며, 다시 수분에 주입한 결과 초기 형상으로 복귀되는 것 역시 확인할 수 있었다(도 5의 (D)).
또한, (1) 헤파린 결합 F-gel 생체복합체(PF-GEL-HEP, 1 μg heparin/ Col 1 mg) 및 (2) HA 결합 F-gel 생체복합체(PF-GEL-HA, HA 2mg/Col 1 mg)의 두 가지 다른 유형을 제조하였다. 그 후, 염색, SEM 이미지, 및 형상 복원 특성 분석을 하였다. 그 결과는 도 5의 (E)에 나타내었다.
도 5의 (E)에 나타난 바와 같이, 알키안-블루-염색 PF-GEL-HEP 및 알리자린-레드-S-염색 PF-GEL-HA는 생체복합체 전체에 헤파린과 HA가 잘 분포되어 있음을 보여주었다. 또한, SEM 이미지는 C2CM2 복합체의 전형적인 공극 구조를 나타내었다. 또한, PF-GEL 복합체와 유사한 형상 복원 특성이 두 생체복합체(PF-GEL-HEP, PF-GEL-HA) 모두에서 관찰되었다.
실시예 3. C2CM2 생체복합체의 응용
다양한 조직 공학 적용을 위한 C2CM2 생체복합체의 활용을 위해, 헤파린과 하이드록시아파타이트(HA; hydroxyapatite)를 생체복합체의 분산제로 사용하였다. 헤파린은 세포 외 기질에서 널리 분포하며, 정전기 상호작용을 통해 음전하의 방출을 지연시킬 수 있기 때문에 성장 인자의 지속적인 방출에 널리 사용되어 왔다.　 또한, HA는 뼈의 주성분 중 하나로, 골조직 재생에서 골유착 및 골전도에 널리 사용된다.
따라서 (1) 헤파린 결합 C2CM2 생체복합체(C2CM2-Hep, 1 μg heparin/ Col 0.5mg 및 Col-ma 0.5mg) 및 (2) HA 결합 C2CM2 생체복합체(C2C2-HA, HA 2mg/Col 0.5mg 및 Col-ma 0.5mg)의 두 가지 다른 유형을 제조하였다. 그 후, 염색, SEM 이미지, 및 형상 복원 특성 분석을 하였다. 그 결과는 도 6의 (A) 내지 (C)에 나타내었다.
도 6의 (A) 및 (B)에 나타난 바와 같이, 알키안-블루-염색 C2CM2-Hep 및 알리자린-레드-S-염색 C2CM2-HA는 생체복합체 전체에 헤파린과 HA가 잘 분포되어 있음을 보여주었다. 또한, SEM 이미지는 C2CM2 복합체의 전형적인 공극 구조를 나타내었다. 또한, 도 6의 (C)에 나타난 바와 같이, C2CM2 복합체와 유사한 형상 복원 특성이 두 생체복합체(C2CM2-Hep, C2CM2-HA) 모두에서 관찰되었다.
3D 프링팅은 C2CM2 생체복합체의 또 다른 중요한 응용 분야이다. 저온 프린팅 단계(-20℃)와 가교/콜라겐-섬유화 프로세스(UV 가교, 섬유 발생, 및 EDC/NHS 가교)의 3D 프린팅 시스템을 사용하여, 메쉬 구조(C2CM2print)를 제작하고 프린트하였다. 이 메쉬 구조의 형상 복원 특성 등은 도 7의 (A) 내지 (C)에 나타내었다.
도 7의 (A)에 나타난 바와 같이, 광학 이미지에 표시된 C2CM2 프린트 메쉬워크(12×12×2mm3)와 SEM 이미지를 나타내었다.
또한, C2CM2print의 형상 변형과 복원을 보여주는 광학이미지를 도 7b에 나타내었다.
도 7의 (B)에 나타난 바와 같이, C2CM2print가 탈수에 의해 균열 없이 변형되었고, 물을 다시 흡수한 후 잘 복원되었음을 나타낸다.
또한, C2CM2print를 주사용 스캐폴드로 실현 가능성을 확인하기 위해, 인쇄된 직육면체 메쉬 스캐폴드(10×10×1 mm3)를 변형하여 얇은 원통형 구조를 제작하였고, 이를 14 G 노즐(내경: 1.54 mm)에 넣었다. 그 후 형상 복원 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 7의 (C)에 나타내었다.
도 7의 (C)에 나타난 바와 같이, 물이 채워진 주사기를 사용하여 노즐에서 스캐폴드를 배출하였고, 인쇄된 생체복합체는 즉시 원래 모양을 복원하였다. 이 결과는 인쇄된 C2CM2 구조가 주사 가능한 스캐폴드로 사용될 수 있음을 의미한다.
실시예 4. Cryo-gel의 응용
다양한 조직 공학 적용을 위한 Cryo-gel의 활용을 위해, 3D 프린팅 시스템을 사용하여, 메쉬 구조(Pcryo-gel)를 제작하고 프린트하였다. 이 메쉬 구조의 형상 복원의 광학 이미지를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, Pcryo-gel 가 탈수에 의해 균열 없이 변형되었고, 물을 다시 흡수한 후 잘 복원되었음을 나타낸다.
종합하면, 본 발명의 F-gel 제조 방법에 의한 하이드로겔은 높은 세포활성도, 형상 고정능, 및 형상복원능을 가질 뿐만 아니라, Cryo-gel 제조 방법과 F-gel 제조 방법을 융합한 제조 방법에 의한 본 발명의 생체복합체는 Cryo-gel 보다 뛰어난 세포활성도 및 형상 고정능을 갖고, F-gel 보다 뛰어난 형상복원속도를 가지며, 높은 형상복원능을 가진다. 도 1에 나타난 바와 같이, 콜라겐의 섬유화 특성을 활용한 F-gel; 및 Cryo-gel 과 F-gel 이 융합된 제조 방법에 의해 제조된 생체복합체는 90%의 압축 변형을 가한 뒤에도 초기의 형상으로 복원되는 바, 본 발명은 형상복원능이 현저히 뛰어난 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (14)

  1. (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
    (b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
    (c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 출발물질은 고분자 물질, 세라믹 물질, 및 금속성 물질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가교용액은 EDC/NHS[(N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)], 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 탄닌산(tannic acid), 게니핀(genipin), 폼알데하이드(formaldehyde), 및 LOX(lysyl oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  4. (a) 콜라겐을 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
    (b) 상기 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
    (c) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 형상기억 하이드로겔로서,
    상기 하이드로겔은 하기의 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔:
    (i) 세포 부착 및 증식 효과를 증가시킴; 및
    (ii) 형상 고정 능력의 증가.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 탈린(TLN; talin), 팍실린(PXN; paxillin), 빈쿨린(VCL; vinculin), 국소 부착 키나제(FAK; focal adhesion kinase), 및 RhoA 키나제로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔.
  6. (a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
    (b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
    (c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
    (d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
    (e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계를 포함하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 광경화성 고분자는 메타크릴레이트 콜라겐인 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 출발물질은 콜라겐 및 광경화성 고분자가 0.1 : 3.9 내지 2 : 2의 질량비(w/w %)로 포함되는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 출발물질은 고분자 물질, 세라믹 물질, 및 금속성 물질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 가교용액은 EDC/NHS[(N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)], 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 탄닌산(tannic acid), 게니핀(genipin), 폼알데하이드(formaldehyde), 및 LOX(lysyl oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔 제조방법.
  11. (a) 콜라겐, 및 광경화성 고분자를 포함하는 출발물질을 준비하는 단계;
    (b) 상기 출발물질을 동결시키는 단계;
    (c) 상기 동결된 출발물질을 광경화시켜 1차 가교결합시키는 단계;
    (d) 상기 1차 가교결합된 출발물질에 PBS를 첨가하고 30 내지 40℃ 환경에서 섬유화시키는 단계; 및
    (e) 상기 섬유화된 출발물질을 가교용액을 이용해서 2차 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 형상기억 하이드로겔.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 하기 특징 중 어느 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔:
    (i) 세포 부착 및 증식 효과를 증가시킴; 및
    (ii) 형상복원속도의 증가.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 탈린(TLN; talin), 팍실린(PXN; paxillin), 및 빈쿨린(VCL; vinculin)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 형상기억 하이드로겔.
  14. 제4항 또는 제11항에 있어서,
    상기 단계 (a) 및 (b) 사이에 3D 프린팅하는 단계를 더 포함하는 제조방법으로 제조된, 형상기억 하이드로겔.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100692608B1 (ko) 2004-11-29 2007-03-13 주식회사 덴티움 생체 이식용 불화아파타이트/콜라겐 복합체 및 그제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100692608B1 (ko) 2004-11-29 2007-03-13 주식회사 덴티움 생체 이식용 불화아파타이트/콜라겐 복합체 및 그제조방법

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