KR20230143803A - Method for detecting presence of residual magnetic particles in the isolated cell composition - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적 시료로부터 자성 입자를 이용하여 목적하는 세포를 분리 및 선별한 뒤 얻어진 세포 조성물 내에 상기 자성 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for separating and selecting cells of interest from a biological sample using magnetic particles and then measuring the presence or amount of the magnetic particles remaining in the resulting cell composition.
Description
본 발명은 자성 입자를 이용하여 생물학적 시료로부터 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축한 뒤 얻어진 세포 조성물 내에 상기 자성 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 측정 또는 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for measuring or evaluating the presence or amount of magnetic particles remaining in a cell composition obtained after selecting, separating, or concentrating desired cells from a biological sample using magnetic particles.
자연살해세포(natural killer cell, NK cell)는 병원균 및 암 세포를 제거하는 선천성 면역(innate immunity)에 관여하며, 인터페론-감마(IFN-γ), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β) 및 그 외 적응성 면역(adaptive immunity)을 매개하는 물질들을 분비하는 것으로 알려져 있다. NK 세포가 다른 세포를 만나면, NK 세포의 MHC가 분자 작용을 통해 암 세포처럼 MHC Class 1이 없거나 바이러스에 감염된 세포와 같이 MHC Class 1의 형태가 비정상적인 경우 NK 세포 내부로 신호를 보내 이러한 비정상 세포를 공격하는 시스템을 갖고 있다. 그러나, 여러 종류의 암에서는 이러한 NK 세포의 기능 및 분화 능력에 결함이 있는 것으로 보고되어, 암 세포의 생존과 NK 세포의 활성이 밀접한 관련이 되어 있음이 알려져 있다. 또한, 암 환자의 체내에 존재하는 자연살해세포의 경우, 암 세포의 면역회피 기전에 의해 자연살해세포의 기능적 결함이 존재한다. 따라서, 자연살해세포를 치료제로써 이용하기 위해서는 자연살해세포를 활성화시키는 것이 매우 중요하다. 또한, 체내에 존재하는 자연살해세포의 세포 수는 한정되어 있으므로, 정상인의 혈액 또는 환자의 혈액의 자연살해세포를 대량으로 증식시키는 기술의 개발이 필수적이고, 혈액 시료로부터 자연살해세포를 분리 또는 농축하기 위하여 자성 비드 등의 입자가 흔히 사용되고 있다. Natural killer cells (NK cells) are involved in innate immunity that eliminates pathogens and cancer cells, and include interferon-gamma (IFN-γ), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), It is known to secrete phagocyte inflammatory protein-1β (MIP-1β) and other substances that mediate adaptive immunity. When an NK cell encounters another cell, the MHC of the NK cell uses molecular action to send a signal to the inside of the NK cell if it does not have MHC Class 1, such as a cancer cell, or has an abnormal form of MHC Class 1, such as a virus-infected cell, and kills these abnormal cells. We have an attack system. However, it has been reported that many types of cancer have defects in the function and differentiation ability of NK cells, and it is known that the survival of cancer cells and the activity of NK cells are closely related. In addition, in the case of natural killer cells present in the body of cancer patients, functional defects of natural killer cells exist due to the immune evasion mechanism of cancer cells. Therefore, in order to use natural killer cells as a therapeutic agent, it is very important to activate natural killer cells. In addition, since the number of natural killer cells existing in the body is limited, it is essential to develop technology to multiply natural killer cells in the blood of normal people or patients' blood in large quantities, and to isolate or concentrate natural killer cells from blood samples. For this purpose, particles such as magnetic beads are commonly used.
이러한 자성 비드 등의 입자는 항체 등과 같은 친화성 시약을 포함하며, 생체 분자의 고정화를 위하여 사용되며, 세포의 검출, 선별, 농축, 분리 및/또는 자극을 위한 다양한 방법에 적용되고 있다. 그런데 이러한 공정 후 상기한 입자가 불완전하게 제거되어, 얻어진 세포 조성물 내에 상기한 입자가 잔존하게 되면, 이를 세포 치료제로써 환자에게 투여하게 될 경우 부작용이나 세포 독성의 문제가 발생될 수 있다. 이에 따라, 세포 치료제로 제조하기 전에 얻어진 세포 조성물 내에 상기 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 검출하여야 한다. 하지만, 현재까지는 높은 정확도나 고효율로 입자의 잔존 유무를 검출하는 방법이 알려진 바 없고, 기존에 알려진 방법들은 시간 소모적이거나 많은 노동력을 요구하거나 혹은 정확도가 떨어지는 문제점이 있었다. Particles such as magnetic beads contain affinity reagents such as antibodies, are used for immobilization of biomolecules, and are applied to various methods for detection, selection, concentration, separation and/or stimulation of cells. However, if the above particles are incompletely removed after this process and the above particles remain in the obtained cell composition, side effects or cytotoxicity problems may occur when the particles are administered to a patient as a cell therapy agent. Accordingly, the presence or amount of the particles remaining in the obtained cell composition must be detected before manufacturing it as a cell therapeutic agent. However, to date, there is no known method for detecting the presence or absence of particles with high accuracy or high efficiency, and existing known methods have problems such as being time-consuming, requiring a lot of labor, or having low accuracy.
따라서, 세포 조성물 내 자성 비드 등의 입자의 잔존 유무나 잔존량을 간단하지만 높은 정확도로, 그리고 효율적으로 측정할 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다. Therefore, there is a need for a simple but highly accurate and efficient method of measuring the presence or absence of particles such as magnetic beads in the cell composition and the remaining amount.
본 발명의 일 목적은 자성 입자를 이용하여 생물학적 시료로부터 목적하는 세포, 특히는 자연살해세포를 선별, 분리 또는 농축한 후 얻어진 세포 조성물 내 상기 자성 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 측정 또는 평가하는 방법에 관한 것이다. One object of the present invention is a method of selecting, separating or concentrating target cells, especially natural killer cells, from biological samples using magnetic particles, and then measuring or evaluating the presence or absence of the remaining magnetic particles or the remaining amount of the magnetic particles in the obtained cell composition. It's about.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세 사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Various embodiments described herein are described below with reference to the drawings. In the following description, various specific details, such as specific forms, compositions, and processes, are set forth in order to provide a thorough understanding of the invention. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details or in conjunction with other known methods and forms. In other instances, well-known processes and manufacturing techniques are not described in specific detail so as not to unnecessarily obscure the invention. Reference throughout this specification to “one embodiment” or “an embodiment” means that a particular feature, form, composition or characteristic described in connection with the embodiment is included in one or more embodiments of the invention. Accordingly, the phrases “in one embodiment” or “an embodiment” expressed in various places throughout this specification do not necessarily refer to the same embodiment of the invention. Additionally, particular features, shapes, compositions, or properties may be combined in any suitable way in one or more embodiments.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless there is a special definition within the present invention, all scientific and technical terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art in the technical field to which the present invention pertains.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 목적하는 세포가 포함된 세포 조성물에 대하여 덱스트란(dextran) 또는 덱스트란 유도체의 존재 여부 또는 존재하는 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 조성물 내 자성 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. According to one embodiment of the present invention, the residual magnetic particles in the cell composition comprising measuring the presence or level of dextran or dextran derivatives in the cell composition containing the desired cells. It relates to a method for measuring the presence or residual amount.
본 발명에서 상기 목적하는 세포의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 면역 세포일 수 있고, 구체적으로는 자연살해세포(natural killer cells; NK cells), T 세포, B 세포, 큰포식세포, 중성구 또는 수지상 세포 등일 수 있고, 바람직하게는 자연살해세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the type of the target cell is not particularly limited, but for example, it may be an immune cell, and specifically, natural killer cells (NK cells), T cells, B cells, macrophages, It may be a neutrophil or dendritic cell, and preferably a natural killer cell, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 세포 조성물은 목적하는 개체 유래의 생물학적 시료로부터 얻어진 것일 수 있다. 여기서 상기 목적하는 개체의 종류를 특별히 제한하지 않으나, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질로, 예를 들어, 액체 생검을 의미하며, 예를 들면 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the cell composition may be obtained from a biological sample derived from the subject of interest. Here, the type of object of interest is not particularly limited, but may mean mammals such as human or non-human primates, mice, dogs, cats, horses, and cows, but is not limited thereto. In addition, the biological sample refers to any material obtained from or derived from an individual, for example, a liquid biopsy, and may be, for example, blood, serum, or plasma, but is not limited thereto.
본 발명의 일 예시에서, 상기 목적하는 세포는 자연살해세포이고, 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the cells of interest may be natural killer cells, and the biological sample may be blood, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 세포 조성물은 자성 입자를 이용하여 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물로부터 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축하여 얻어진 것일 수 있다. In the present invention, the cell composition may be obtained by selecting, separating, or concentrating desired cells from biological samples, fractions thereof, or cultures thereof using magnetic particles.
본 발명에서 상기 자성 입자는 비드(beads) 또는 미세구(microspheres) 등의 고형 구체 입자로, 자기(magnetic) 또는 초자기(magnetic)의 성질을 가진 내부 코어(core)를 포함하는 것이다. 여기서, 상기 코어는 금속 성분을 포함하고 있거나 금속 성분으로 이루어진 것일 수 있고, 이때 상기 금속 성분은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄, 망간, 탄탈륨, 아연, 지르코늄 또는 이들의 조합을 포함하는 금속; 또는 산화 철 등의 금속 산화물; 또는 망간 페라이트, 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 등의 페라이트(ferrites); 헤마타이트(hematite); 또는 CoTaZr 등의 금속 합금; 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the magnetic particles are solid spherical particles such as beads or microspheres, and include an internal core with magnetic or supermagnetic properties. Here, the core may contain or be made of a metal component, where the metal component is a metal including iron, nickel, copper, cobalt, gadolinium, manganese, tantalum, zinc, zirconium, or a combination thereof; or metal oxides such as iron oxide; or ferrites such as manganese ferrite, cobalt ferrite, and nickel ferrite; hematite; or metal alloys such as CoTaZr; It may include, but is not limited to, etc.
본 발명에서 상기 자성 입자의 내부 코어는 필요에 따라서는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 중합체는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리글루타르알데하이드(polyglutaraldehyde), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리스티렌(polystyrene), 사이클로-올레핀 폴리머(cyclo-olefin polymer; COP) 또는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 다당류는 키토산, 아가로스, 전분, 덱스트란 또는 덱스트란 유도체를 포함할 수 있고, 상기 단백질은 알부민일 수 있으며, 상기 탄소는 아크릴아마이드 또는 말레산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the inner core of the magnetic particle may further include polymer, polysaccharide, silica, fatty acid, protein, carbon, or a combination thereof, if necessary. Here, the polymer is polyethylene glycol, poly(lactic-co-glycolic acid), polyglutaraldehyde, polyurethane, polystyrene, It may include, but is not limited to, cyclo-olefin polymer (COP) or polyvinyl alcohol. Additionally, the polysaccharide may include chitosan, agarose, starch, dextran or a dextran derivative, the protein may be albumin, and the carbon may be acrylamide or maleic acid, but are not limited thereto.
본 발명에서 상기 자성 입자는 상기 내부 코어 상에 형성되는 1층 이상의 코팅층과, 상기 목적하는 세포에 결합할 수 있는 결합 분자를 더 포함할 수 있다. 이때 상기 코팅층은 상기 결합 분자에 커플링, 결합 또는 컨쥬게이션할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. In the present invention, the magnetic particle may further include one or more coating layers formed on the inner core and a binding molecule capable of binding to the target cell. At this time, the coating layer may include a material that can couple, bind, or conjugate to the binding molecule.
본 발명의 목적 상 상기 코팅층은 덱스트란 또는 덱스트란 유도체를 필수로 포함한다. 하지만, 본 발명에서 상기 자성 입자의 코팅층은 덱스트란 또는 덱스트란 유도체 외에도, 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 중합체는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리글루타르알데하이드(polyglutaraldehyde), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리스티렌(polystyrene), 사이클로-올레핀 폴리머(cyclo-olefin polymer; COP) 또는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 다당류는 키토산, 아가로스 또는 전분을 포함할 수 있고, 상기 단백질은 알부민일 수 있으며, 상기 탄소는 아크릴아마이드 또는 말레산 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. For the purpose of the present invention, the coating layer essentially includes dextran or a dextran derivative. However, in the present invention, the coating layer of the magnetic particle may further include polymers, polysaccharides, silica, fatty acids, proteins, carbon, or combinations thereof in addition to dextran or dextran derivatives. Here, the polymer is polyethylene glycol, poly(lactic-co-glycolic acid), polyglutaraldehyde, polyurethane, polystyrene, It may include, but is not limited to, cyclo-olefin polymer (COP) or polyvinyl alcohol. Additionally, the polysaccharide may include chitosan, agarose, or starch, the protein may include albumin, and the carbon may include acrylamide or maleic acid, but are not limited thereto.
본 발명에서 상기 자성 입자에 포함되는 결합 분자는 목적하는 세포에 결합할 수 있는 분자로서, RNA, DNA, 단백질(예를 들어 효소), 항원, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 항체 단편, 카보하이드레이트, 지질 렉틴, 또는 원하는 표적을 위한 친화성(예를 들어 친화성 시약)을 갖는 임의의 다른 친화성 시약(예를 들어 스트렙타비딘)을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 결합 분자, 예를 들어 친화성 시약은, 공지 및 이용가능한 다양한 방법에 의해서 상기 입자(예를 들어 비드 입자)에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 상기 부착은 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성일 수 있으며, 예를 들어 화학적 수단, 기계적 수단, 또는 효소적 수단을 비롯한 다양한 부착 수단에 의해서 달성될 수 있다. In the present invention, the binding molecule included in the magnetic particle is a molecule capable of binding to a target cell, such as RNA, DNA, protein (e.g., enzyme), antigen, polyclonal antibody, monoclonal antibody, antibody fragment, or carboxylic acid. hydrates, lipid lectins, or any other affinity reagent (e.g., streptavidin) that has affinity for the desired target (e.g., an affinity reagent). The one or more binding molecules, e.g., affinity reagents, may be attached directly or indirectly to the particles (e.g., bead particles) by a variety of methods known and available. The attachment may be covalent, non-covalent, electrostatic or hydrophobic and may be achieved by a variety of attachment means including, for example, chemical, mechanical, or enzymatic means.
본 발명에서 상기 항체로는 다클론성 항체, 단클론성 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체를 포함한다), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중 특이적 항체(예를 들어 이중특이 항체, 다이아바디 및 단쇄 분자, 및 항체 단편(예를 들어 Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 친화성 시약은 항체 단편(항원-결합 단편을 포함), 예를 들어 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 비롯한 본원에 상정된 항체용으로 임의의 이소타입의 불변 영역이 이용될 수 있고 이러한 불변 영역은 인간 또는 동물 종(예를 들어 쥐 종)으로부터 얻을 수 있는 것으로 이해될 수 있을 것이다.In the present invention, the antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (including full-length antibodies having an immunoglobulin Fc region), antibody compositions with polyepitope specificity, and multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies, diamond body and single chain molecules, and antibody fragments (e.g. Fab, F(ab')2, and Fv). In some embodiments, affinity reagents include antibody fragments (including antigen-binding fragments), e.g. For example, a Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, or (Fab')2 fragment. Constant regions of any isotype for antibodies contemplated herein, including IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE constant regions. It will be understood that such constant regions may be obtained from human or animal species (e.g., rat species).
본 발명의 일 예시에서, 상기 결합 분자는 생물학적 시료 내에 존재하는 목적하는 세포, 혹은 목적하지 않는 세포에 결합할 수 있는 분자 또는 그 단편으로, 상세하게는 세포 상에 존재하는 하나 이상의 거대 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 분자일 수 있고, 예를 들면, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54(ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD -1, OX40, CD27L(CD70), 4-1BB(CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, CD18/CD1la(LFA-1), CD62L(L-셀렉틴), CD29/CD49d(VLA-4), 노치 리간드(예를 들어 델타-유사 1/4, 재기드 1/2 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7 및 CXCR3 또는 이들 거대분자 또는 이의 단편에 상응하는 리간드를 포함하는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the binding molecule is a molecule or fragment thereof capable of binding to a desired cell or an undesired cell present in a biological sample, and is specifically specific to one or more macromolecules present on the cell. It may be a molecule capable of binding to, for example, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD -1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL- 15R; IFN-gammaR, TNF-alphaR, IL-4R, IL-10R, CD18/CD1la (LFA-1), CD62L (L-selectin), CD29/CD49d (VLA-4), Notch ligands (e.g. delta -pseudo 1/4, jagged 1/2, etc.), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7 and CXCR3 or fragments thereof, including ligands corresponding to these macromolecules or fragments thereof. It may be a binding molecule, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 자성 입자의 직경은 특별히 제한하지 않으나, 0.001 ㎛ 초과, 0.01 ㎛ 초과, 0.1 ㎛ 초과, 1.0 ㎛ 초과, 10 ㎛ 초과, 50 ㎛ 초과, 100 ㎛ 초과 또는 1000 ㎛ 초과의 직경을 가질 수 있고, 구체적으로는 1.0 ㎛ 내지 500 ㎛, 1.0 ㎛ 내지 150 ㎛, 1.0 ㎛ 내지 30 ㎛, 1.0 ㎛ 내지 10 ㎛ 또는 1.0 ㎛ 내지 5.0 ㎛의 직경을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the diameter of the magnetic particles is not particularly limited, but may have a diameter greater than 0.001 ㎛, 0.01 ㎛, 0.1 ㎛, 1.0 ㎛, 10 ㎛, 50 ㎛, 100 ㎛, or 1000 ㎛. and, specifically, may have a diameter of 1.0 ㎛ to 500 ㎛, 1.0 ㎛ to 150 ㎛, 1.0 ㎛ to 30 ㎛, 1.0 ㎛ to 10 ㎛, or 1.0 ㎛ to 5.0 ㎛, but is not limited thereto.
본 발명의 일 예시에서, 상기 자성 입자는 EasySepTM Direct RapidSpheresTM 50300일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the magnetic particle may be EasySep TM Direct RapidSpheres TM 50300, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 자성 입자를 이용하여 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물로부터 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축하는 방법은, 상기 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물에 자성 입자를 첨가한 뒤 자석의 존재 하에서 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축할 수 있다. In the present invention, the method of selecting, separating, or concentrating desired cells from a biological sample, a fraction thereof, or a culture thereof using the magnetic particles includes adding magnetic particles to the biological sample, a fraction thereof, or a culture thereof, and then using a magnet. In the presence of , cells of interest can be selected, separated, or concentrated.
본 발명에서 상기 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물에 자성 입자를 첨가하는 경우 자성 입자 내 결합 분자가 목적하는 세포 또는 목적하지 않는 세포의 표면에서 발현되거나 표면 상에 존재하는 하나 이상의 거대분자(예를 들어 세포 표면 수용체)에 특이적으로 결합될 수 있고, 자석을 이용하여 자성 입자가 결합된 목적하는 세포를 회수하거나, 혹은 자성 입자가 결합된 목적하지 않는 세포를 제거함으로써 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축할 수 있다. In the present invention, when magnetic particles are added to the biological sample, fraction thereof, or culture thereof, the binding molecule in the magnetic particle is expressed on the surface of the desired cell or the non-desired cell, or is expressed on the surface of one or more macromolecules (e.g. For example, it can bind specifically to a cell surface receptor) and selects the desired cells by using a magnet to recover the desired cells to which the magnetic particles are bound, or to remove undesired cells to which the magnetic particles are bound. Can be separated or concentrated.
본 발명에서 상기 자석을 이용하여 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축하는 방법은 자성 입자가 첨가된 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물을 자석의 존재 하에서 배양한 뒤 상층액을 회수, 분리 또는 제거할 수 있고, 혹은 자성 입자가 첨가된 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물을 자석을 포함하는 컬럼을 통과시키며 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the method of selecting, separating, or concentrating the desired cells using the magnet is to culture a biological sample to which magnetic particles have been added, a fraction thereof, or a culture thereof in the presence of a magnet, and then recover, separate, or remove the supernatant. Alternatively, the method may be performed by passing a biological sample to which magnetic particles have been added, a fraction thereof, or a culture thereof through a column containing a magnet, but the method is not limited thereto.
본 발명의 일 예시에서, 상기 목적하는 세포는 자연살해세포일 수 있고, 목적하지 않는 세포는 적혈구 세포일 수 있으며, 생물학적 시료로 혈액에 자성 입자를 첨가하면 자성 입자 내 결합 분자가 적혈구 세포의 표면에서 발현되는 거대분자에 특이적으로 결합되고, 자석의 존재 하에서 자성 입자가 첨가된 혈액을 배양한 뒤 상층액만을 취하여 목적하지 않는 세포인 적혈구 세포를 제거할 수 있고, 혹은 자석이 포함된 컬럼에 상기 자성 입자가 첨가된 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물을 통과시켜 컬럼을 통과한 자연살해세포를 회수할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, the desired cells may be natural killer cells, and the non-desired cells may be red blood cells. When magnetic particles are added to blood as a biological sample, the binding molecules in the magnetic particles are attached to the surface of the red blood cells. It is specifically bound to macromolecules expressed in the blood, and after culturing blood with added magnetic particles in the presence of a magnet, only the supernatant can be taken to remove red blood cells, which are undesirable cells, or placed in a column containing a magnet. Natural killer cells that have passed through the column can be recovered by passing the biological sample to which the magnetic particles have been added, a fraction thereof, or a culture thereof, but the method is not limited thereto.
본 발명에서는 필요에 따라서는 상기와 같이 자성 입자를 이용하여 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물로부터 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축하는 공정의 전 또는 후에, 목적하는 세포의 수를 증폭하기 위하여, 상기 목적하는 세포를 배양하거나 활성화하는 공정을 수행할 수 있다. 이때 상기 세포의 배양 또는 활성화 조건은 특별히 제한하지 않으며, 목적하는 세포의 종류에 따라 그 증폭을 위하여 당해 기술분야에 일반적으로 알려진 방법이라면 제한 없이 본 발명에 포함될 수 있다.In the present invention, if necessary, magnetic particles are used as described above to amplify the number of desired cells before or after the process of selecting, separating, or concentrating the desired cells from biological samples, fractions thereof, or cultures thereof. , the process of culturing or activating the desired cells can be performed. At this time, the conditions for culturing or activating the cells are not particularly limited, and any method generally known in the art for amplification depending on the type of the target cell may be included in the present invention without limitation.
본 발명의 일 예시에서, 상기와 같이 선별, 분리 또는 농축된 목적하는 세포를 사이토카인(cytokine)이 포함된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 여기서, 상기 사이토카인의 종류를 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18 또는 이들을 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있고, 특히 IL-2, IL-15 또는 IL-21이 자연살해세포로의 분화 및 증식에 탁월한 효과가 있는 사이토카인으로 알려져 있으므로, 이들 사이토카인을 이용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 IL-2일 수 있다. 또한, 상기 사이토카인은 배양 배지 내 500 내지 1500 IU/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 800 내지 1200 IU/ml의 양으로 포함될 수 있다. In one example of the present invention, the desired cells selected, separated, or concentrated as described above can be cultured in a culture medium containing cytokines. Here, the type of the cytokine is not particularly limited, but for example, IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18, or a mixture of two or more types thereof. In particular, IL-2, IL-15 or IL-21 are known as cytokines with excellent effects on differentiation and proliferation into natural killer cells, so it is preferable to use these cytokines, and most preferably, It could be IL-2. Additionally, the cytokine may be preferably included in the culture medium in an amount of 500 to 1500 IU/ml, and more preferably in an amount of 800 to 1200 IU/ml.
본 발명의 일 예시에서, 상기 선별, 분리 또는 농축된 목적하는 세포를 배양 배지에서 배양하는 방법과 관련하여, 상기 배양 배지의 구체적인 조성은 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면, Cell Science & Technology Institute inc. (CSTI)의 AlyS505NK-AC(Cat.# 01600P02), AlyS505NK-AC1000(Cat.# 01610P02), AlyS505NK-EX(Cat.# 01400P10) 또는 AlyS505NK-EX1000(Cat.# 01410P10)의 배양 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one example of the present invention, with regard to the method of culturing the selected, separated or concentrated cells of interest in a culture medium, the specific composition of the culture medium is not particularly limited, for example, Cell Science & Technology Institute inc. . (CSTI) AlyS505NK-AC (Cat.# 01600P02), AlyS505NK-AC1000 (Cat.# 01610P02), AlyS505NK-EX (Cat.# 01400P10), or AlyS505NK-EX1000 (Cat.# 01410P10) culture medium can be used. , but is not limited to this.
본 발명의 일 예시에서, 상기 선별, 분리 또는 농축된 목적하는 세포를 배양하는 방법과 관련하여, 상기 배양은 15 내지 30일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 상기 세포를 배양 배지가 10 내지 30 ml의 양으로 포함된 T75 플라스크에서 10 내지 15일 동안 배양한 뒤, T175 플라스크로 이동시켜 5 내지 15일 동안 추가로 배양하며 수행할 수 있다. 또한, 상기 배양은 정치배양(stationary culture) 또는 부유배양(suspension culture) 방법을 사용할 수 있고, 정치배양은 배양기에 교반(agitating) 또는 진탕(shaking) 없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며, 부유배양은 통기(aeration)나 교반 등을 통해 세포들이 반응기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다. 또한, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있다. 예를 들어, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반응기에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 부유배양 방식으로 배양하는 것이 가능하며, 상이한 종류의 배양기를 사용하는 경우에는 정치배양이 완료된 후에 배양물을 부유배양을 위한 반응기로 옮겨 부유배양 할 수 있다.In one example of the present invention, with regard to the method of culturing the selected, separated or concentrated desired cells, the culture may be performed for 15 to 30 days, and preferably the cells are cultured in a culture medium of 10 to 30 days. It can be cultured for 10 to 15 days in a T75 flask contained in an amount of ml, then transferred to a T175 flask and further cultured for 5 to 15 days. In addition, the culture may use stationary culture or suspension culture, and stationary culture refers to culturing in a state in which the incubator is left without agitating or shaking. Culture means culturing the cells in a suspended state without attaching to the lower or side parts of the reactor through aeration or stirring. Additionally, the reactor for stationary culture and the reactor for suspended culture may be the same or different. For example, if the reactor for stationary culture and the reactor for suspension culture are the same, after stationary culture is completed in the same reactor, medium containing necessary nutrients such as cytokines is additionally supplied and culture is performed in suspension culture. It is possible to do so, and when using a different type of culture medium, the culture can be transferred to a reactor for suspension culture after stationary culture is completed and cultured in suspension.
본 발명에서는 상기와 같이 자성 입자를 이용하여 분리, 선별 또는 농축된 목적하는 세포를 포함하는 세포 조성물 내 자성 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. The present invention may include the step of measuring the presence or amount of magnetic particles remaining in a cell composition containing the desired cells separated, selected, or concentrated using magnetic particles as described above.
본 발명에서 상기 자성 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 측정하는 단계는 상기 세포 조성물에 대하여 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 발현 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. In the present invention, the step of measuring the remaining presence or amount of the magnetic particles may be performed by measuring the expression level of dextran or dextran derivatives in the cell composition.
본 발명에서 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 존재 여부 또는 존재하는 수준의 측정은 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 제제를 이용하여 수행될 수 있다. In the present invention, the presence or presence of the dextran or dextran derivative is measured using antibodies, oligopeptides, ligands, PNA (peptide nucleic acid), and aptamers that specifically bind to the dextran or dextran derivative. It can be performed using a preparation containing one or more types selected from the group consisting of aptamer).
본 발명에서 상기 "올리고펩타이드"는 펩타이드로 2 내지 20 개의 아미노산으로 구성되며 디 펩티드, 트리 펩티드, 테트라 펩티드 및 펜타 펩티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the “oligopeptide” is a peptide composed of 2 to 20 amino acids and may include dipeptide, tripeptide, tetrapeptide, and pentapeptide, but is not limited thereto.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.In the present invention, "Peptide Nucleic Acid (PNA)" refers to an artificially synthesized polymer similar to DNA or RNA, and was first introduced by Professors Nielsen, Egholm, Berg and Buchardt at the University of Copenhagen, Denmark in 1991. While DNA has a phosphate-ribose sugar backbone, PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases its binding force and stability to DNA or RNA, making it useful in molecular biology. , is used in diagnostic analysis and antisense therapy. PNA was described in Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500] is disclosed in detail.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다. 본 발명에서 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 덱스트란에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당 업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.In the present invention, the “aptamer” is an oligonucleic acid or peptide molecule, and general details of aptamers are described in Bock LC et al., Nature 355(6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. “An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727 (1998)]. In the present invention, the “antibody” refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction. For the purposes of the present invention, antibody refers to an antibody that specifically binds to the dextran. Antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies. The antibody can be easily produced using techniques well known in the art. For example, polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art, including the process of injecting the protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody. These polyclonal antibodies can be produced from any animal, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cows, dogs, etc. In addition, monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), which is well known in the art, or phage antibody library technology (Clackson et al, Nature, 352 :624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991). Antibodies prepared by the above method can be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. Additionally, antibodies of the invention include intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, and Fv.
본 발명에서 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 존재 여부 또는 존재하는 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있다. In the present invention, the presence or level of the dextran or dextran derivative can be measured using protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Ouchteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis. Analysis, to be performed by liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (LC-MS/MS), Western blotting, or ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). You can.
본 발명에서 바람직하게는 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 존재 여부 또는 존재하는 수준은 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 ELISA 키트를 이용하여 수행될 수 있다. In the present invention, preferably, the presence or level of the dextran or dextran derivative can be determined using an ELISA kit containing an antibody that specifically binds to the dextran or dextran derivative.
본 발명에서 상기 "ELISA 키트"는 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.In the present invention, the “ELISA kit” includes an antibody specific for the dextran or dextran derivative. Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for a marker protein and almost no cross-reactivity to other proteins, and may be monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. Additionally, ELISA kits may include antibodies specific for control proteins. Other ELISA kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and their substrates or those that can bind to antibodies. It may contain other substances, etc.
본 발명에서 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 존재 여부 또는 존재하는 수준은 Lifespan Technologies의 S-7500 Dextran ELISA kit를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the presence or level of the dextran or dextran derivative can be determined using the S-7500 Dextran ELISA kit from Lifespan Technologies, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 세포 조성물 내 자성 입자의 잔존 유무를 평가하기 위한 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 발현 수준의 컷-오프(cut-off) 값은 0.1 내지 5 ㎍/ml의 유리수, 1 내지 4 ㎍/ml의 유리수 또는 2 내지 4 ㎍/ml의 유리수일 수 있고, 바람직하게는 또는 3 ㎍/ml일 수 있다. In the present invention, the cut-off value of the expression level of dextran or dextran derivatives for evaluating the presence or absence of magnetic particles remaining in the cell composition is 0.1 to 5 μg/ml of rational water, 1 to 4 μg/ml. It may be ml of free water or 2 to 4 μg/ml of free water, preferably 3 μg/ml.
본 발명에서 상기 세포 조성물에 대하여 측정된 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 발현 수준이 0.1 내지 5 ㎍/ml의 유리수, 1 내지 4 ㎍/ml의 유리수, 2 내지 4 ㎍/ml의 유리수, 또는 3 ㎍/ml 이하인 경우, 상기 세포 조성물 내에 자성 입자가 실질적으로 잔존하지 않는 것으로 평가할 수 있다. The expression level of dextran or dextran derivative measured for the cell composition in the present invention is 0.1 to 5 μg/ml of free water, 1 to 4 μg/ml of free water, 2 to 4 μg/ml of free water, or 3 μg of free water. When /ml or less, it can be evaluated that magnetic particles do not substantially remain in the cell composition.
본 발명에서 상기 세포 조성물에 대하여 측정된 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 발현 수준이 0.1 내지 5 ㎍/ml의 유리수, 1 내지 4 ㎍/ml의 유리수, 2 내지 4 ㎍/ml의 유리수, 또는 3 ㎍/ml 초과인 경우, 상기 세포 조성물 내에 자성 입자가 잔존하는 것으로 평가하여 자성 입자 또는 자성 입자가 결합된 세포 또는 물질을 분리 또는 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. The expression level of dextran or dextran derivative measured for the cell composition in the present invention is 0.1 to 5 μg/ml of free water, 1 to 4 μg/ml of free water, 2 to 4 μg/ml of free water, or 3 μg of free water. If it exceeds /ml, it is assessed that magnetic particles remain in the cell composition, and an additional step of separating or removing the magnetic particles or the cells or materials to which the magnetic particles are bound may be performed.
최근에는 암 등의 다양한 질환을 치료하기 위하여 자연살해세포와 같은 면역 세포를 이용한 세포 치료제에 대한 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있다. 그런데 이러한 면역 세포를 세포 치료제로 적용하기 위해서는 생물학적 시료 내 존재하는 상기 면역 세포의 수를 증폭하는 것이 필요하고, 이를 위하여 자성 입자 등의 물질을 이용해 세포의 분리, 선별 또는 농축하는 과정이 필수적으로 수반되고 있다. Recently, research and development on cell therapeutics using immune cells such as natural killer cells are being actively conducted to treat various diseases such as cancer. However, in order to apply these immune cells as cell therapy, it is necessary to amplify the number of immune cells present in a biological sample, and for this, a process of separating, selecting, or concentrating cells using materials such as magnetic particles is essential. It is becoming.
그런데 이러한 자성 입자가 최종 얻어진 세포 조성물로부터 불완전하게 제거된다면 이를 환자에게 적용하였을 시에 부작용 또는 독성의 문제점이 발생될 수 있다. 따라서, 상기한 세포 조성물을 세포 치료제로 활용하기 전에, 상기 조성물 내 자성 입자의 잔존 유무 또는 잔존량을 확인하는 것이 매우 중요하다. 하지만 현재까지는 자성 입자의 잔존 유무나 잔존량을 효율적이면서도 높은 정확도로 측정할 수 있는 방법이 알려진 바가 없다. However, if these magnetic particles are incompletely removed from the final cell composition, side effects or toxicity problems may occur when applied to patients. Therefore, before using the cell composition as a cell therapeutic agent, it is very important to check whether or not the magnetic particles remain in the composition or the amount remaining. However, to date, there is no known method to efficiently and highly accurately measure the residual presence or amount of magnetic particles.
본 발명에서는 세포 치료제로 적용될 수 있는 세포 조성물 내 자성 입자의 잔존 유무, 나아가서는 잔존량을 높은 정확도와 고효율로 평가할 수 있는 방법을 제공하는 데에 의의가 있다. The significance of the present invention is to provide a method that can evaluate with high accuracy and efficiency the presence or absence of magnetic particles remaining in a cell composition that can be applied as a cell therapeutic agent, and further, the remaining amount.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 Plate 1에 대하여 덱스트란의 농도별 표준 용액의 O.D 값의 평균을 구한 뒤, 덱스트란의 농도를 X 축, 각 표준 O.D 값을 Y축으로 하여 얻어진 표준 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 Plate 2에 대하여 덱스트란의 농도별 표준 용액의 O.D 값의 평균을 구한 뒤, 덱스트란의 농도를 X 축, 각 표준 O.D 값을 Y축으로 하여 얻어진 표준 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 상기 Plate 1에 대하여 얻어진 표준 그래프에 각 시료(자연살해세포 1차 내지 3차 세척액, 완제품, MP-kit)의 O.D 값을 대입하여 각 시료에 포함되는 덱스트란의 농도를 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 상기 Plate 2에 대하여 얻어진 표준 그래프에 각 시료(자연살해세포 1차 내지 3차 세척액, 완제품, MP-kit)의 O.D 값을 대입하여 각 시료에 포함되는 덱스트란의 농도를 계산한 결과를 나타낸 것이다. Figure 1 is a standard graph obtained by calculating the average of the OD values of standard solutions for each concentration of dextran for Plate 1 in Example 1 of the present invention, with the concentration of dextran as the X axis and each standard OD value as the Y axis. It represents.
Figure 2 is a standard graph obtained by calculating the average of the OD values of standard solutions for each concentration of dextran for Plate 2 in Example 1 of the present invention, with the concentration of dextran as the X axis and each standard OD value as the Y axis. It represents.
Figure 3 shows the Dex contained in each sample by substituting the OD value of each sample (natural killer cell 1st to 3rd washing solution, finished product, MP-kit) into the standard graph obtained for Plate 1 in Example 1 of the present invention. This shows the results of calculating the concentration of Tran.
Figure 4 shows the Dex contained in each sample by substituting the OD value of each sample (natural killer cell 1st to 3rd washing solution, finished product, MP-kit) into the standard graph obtained for Plate 2 in Example 1 of the present invention. This shows the results of calculating the concentration of Tran.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
[준비예 1 내지 3] 자연살해세포 치료제(SMT-NK주) 및 그 세척액의 준비[Preparation Examples 1 to 3] Preparation of natural killer cell therapeutic agent (SMT-NK strain) and its washing solution
덱스트란으로 코팅된 자성 미세구(microsphere)를 포함하고 있는 EasySepTM Direct RapidSpheresTM 50300 (STEMCELL Technologies, Canada)를 이용하여 건강한 혈액공여자의 전혈로부터 비-자연살해세포, 즉 적혈구 세포(RBC) 등을 제거하여 자연살해세포를 농축 및 선별하였다. 구체적으로 전혈 시료 60ml을 2개의 50ml 튜브에 30ml씩 옮기고, 분리 칵테일 50 μl/ml를 첨가한 뒤 상온에서 5 분간 인큐베이션 하였다. RapidSpheresTM를 30초간 볼텍싱한 뒤 시료에 50 μl/ml의 양을 첨가 후 상온에서 5 분간 인큐베이션 하였다. 이후, 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline; DPBS)를 총 용량이 45ml이 되도록 첨가한 후 자석(EasySepTM magnet) 상에 튜브를 놓고 상온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 이후 자석과 튜브의 위치를 바꾼 뒤, 농축 세포 현탁액을 새로운 튜브에 부었다. RapidSpheresTM를 초기 전혈 시료 양 (ml)에 대한 50 μl/ml의 양으로 첨가하여, 따라서 전단계에서 넣었던 RapidSpheresTM와 동일한 양을 첨가하고 상온에서 5분간 인큐베이션한 뒤 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's phosphate-buffered saline; DPBS)를 총 용량이 40 ml이 되도록 첨가한 후 자석 상에 튜브를 놓고 상온에서 5분간 인큐베이션 하였다. 이후 자석과 튜브의 위치를 바꾼 뒤, 농축 세포 현탁액을 새로운 튜브에 부었다. 2차 농축된 세포 현탁액을 자석의 존재 하에서 5분간 인큐베이션한 뒤 자석과 튜브의 위치를 바꾼 후 3차 농축 세포 현탁액을 회수하였다. 3차 농축 세포 현탁액에서는 대부분의 적혈구 세포가 제거되고 목적하는 자연살해세포(CD3-CD56+ 세포)가 농축 및 선별되어 포함되어 있었다. 이후 3차 농축 세포 현탁액에, 동량의 DPBS를 첨가하여 1500 rpm으로 5분간의 세척 공정을 3회 수행하였다. 농축된 자연살해세포를 NK 증폭 배지(ALyS505NK-IL2 1000 IU/ml, Cell Science & Technology Inst) 20ml를 포함하는 T75 플라스크에서 배양하였다. 3일마다 IL-2 활성화된 자연살해세포에 신선한 배지를 추가하였고, 배양 12~14일 후에 T175 플라스크로 이동시켜 7~10일 동안 추가로 배양하였다. 자연살해세포의 배양물에 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가한 후 상온에서 1500 rpm의 조건 하에서 5분 간 원심분리하는 세척 공정을 1회 내지 3회 반복 수행하여, 각기 1차 내지 3차 세척액을 준비하고, 마지막으로 멸균생리식염수에 세포를 풀어서 자연살해세포 완제품(SMT-NK 완제 의약품)을 준비하였다. Non-natural killer cells, i.e. red blood cells (RBCs), were extracted from whole blood of healthy blood donors using EasySep TM Direct RapidSpheres TM 50300 (STEMCELL Technologies, Canada) containing magnetic microspheres coated with dextran. After removal, natural killer cells were concentrated and selected. Specifically, 60 ml of whole blood sample was transferred to two 50 ml tubes, 30 ml each, and 50 μl/ml of separation cocktail was added and incubated at room temperature for 5 minutes. After vortexing RapidSpheres TM for 30 seconds, 50 μl/ml was added to the sample and incubated at room temperature for 5 minutes. Afterwards, Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) was added to a total volume of 45 ml, and then the tube was placed on a magnet (EasySep TM magnet) and incubated at room temperature for 10 minutes. After changing the positions of the magnet and tube, the concentrated cell suspension was poured into the new tube. RapidSpheres TM was added in an amount of 50 μl/ml relative to the initial whole blood sample amount (ml), so the same amount of RapidSpheres TM added in the previous step was added, incubated at room temperature for 5 minutes, and then added in Dulbecco's phosphate-buffered saline (Dulbecco's phosphate-buffered saline). After adding buffered saline (DPBS) to a total volume of 40 ml, the tube was placed on a magnet and incubated for 5 minutes at room temperature. After changing the positions of the magnet and tube, the concentrated cell suspension was poured into the new tube. The second concentrated cell suspension was incubated for 5 minutes in the presence of a magnet, the positions of the magnet and tube were changed, and the third concentrated cell suspension was recovered. In the third concentrated cell suspension, most red blood cells were removed and the desired natural killer cells (CD3-CD56+ cells) were concentrated and selected. Afterwards, the same amount of DPBS was added to the third concentrated cell suspension, and a washing process was performed three times for 5 minutes at 1500 rpm. Concentrated natural killer cells were cultured in a T75 flask containing 20ml of NK amplification medium (ALyS505NK-IL2 1000 IU/ml, Cell Science & Technology Inst). Fresh medium was added to the IL-2 activated natural killer cells every 3 days, and after 12 to 14 days of culture, they were transferred to a T175 flask and further cultured for 7 to 10 days. After adding phosphate-buffered saline (PBS) to the culture of natural killer cells, the washing process of centrifugation for 5 minutes at room temperature at 1500 rpm was repeated 1 to 3 times, respectively, to produce the 1st to 3rd washing solution. Finally, the cells were dissolved in sterilized saline solution to prepare a natural killer cell product (SMT-NK finished pharmaceutical product).
[실시예 1] 자연살해세포 세척액 및 완제품 내의 자성 미세구 입자의 잔존 유무 평가[Example 1] Evaluation of residual magnetic microspheres in natural killer cell washing solution and finished product
S-7500 Dextran ELISA kit(Lifespan Technologies, Texas, US)를 이용하여 앞서 준비한 자연살해세포 1차, 2차, 3차 세척액과 완제품 내에 자성 미세구 입자의 잔존 유무를 분석하였다. 구체적인 실험 과정은 다음과 같다:Using the S-7500 Dextran ELISA kit (Lifespan Technologies, Texas, US), we analyzed the presence or absence of magnetic microspheres remaining in the previously prepared natural killer cell first, second, and third washing solutions and finished products. The specific experimental process is as follows:
1. 시약의 준비1. Preparation of reagents
상기 키트 내에 존재하는 10X 세척 버퍼를 증류수로 희석하고, 20X TBS를 증류수에 희석하였다. 본 실험에 사용되는 검체로는 상기 준비한 자연살해세포 1차, 2차, 3차 세척액과 완제품과, 양성 대조군으로는 EasySep™ Direct RapidSpheres™ 50300의 1:100 희석액, 음성 대조군으로는 멸균 생리식염수를 준비하였다. 표준 용액으로는 덱스트란 40kDa United States Pharmacopeial(USP) 표준 시료를 5mL DPBS에 녹여서 10mg/mL 스탁 용액을 제조한 뒤, 하기 표 1과 같이 연속 희석하였다. The 10X wash buffer present in the kit was diluted with distilled water, and 20X TBS was diluted with distilled water. The samples used in this experiment were the natural killer cell first, second, and third washing solutions and finished products prepared above, a 1:100 dilution of EasySep™ Direct RapidSpheres™ 50300 as a positive control, and sterile physiological saline as a negative control. Ready. As a standard solution, dextran 40kDa United States Pharmacopeial (USP) standard sample was dissolved in 5mL DPBS to prepare a 10mg/mL stock solution, and then serially diluted as shown in Table 1 below.
2. 실험 방법2. Experimental method
준비된 검체와 표준 용액을 덱스트란 ELISA 플레이트 웰에 50 μl씩 넣어 주었다. 검체와 표준 용액에 대한 실험은 모두 3회 반복 수행하였다. 검출-효소 복합 용액(Detector-Enzyme Conjugated Solution)을 블랭크 웰을 제외하고 나머지 웰들에 50 μl씩 넣어주었다. 잘 흔들어 주고 플레이트 실러를 사용하여 플레이트를 덮고 상온에서 30분간 배양하였다. 웰에 들어있는 용액을 제거하고 300 μL 세척 버퍼(1X)로 3번씩 세척하였다. 이때 웰이 마르지 않도록 주의하고, 세척이 끝난 후에는 즉시 다음 단계를 실행하였다. 100 μL의 TMB를 넣고 차광 상태에서 제로 덱스트란 웰(Zero Dextran well)의 용액의 색이 어두운 파란색이 될 때까지 반응시켰다. 정지 용액(Stop Solution)을 50 μL 넣은 뒤 반응 정지 후 즉시 450nm의 필터가 장착된 마이크로플레이트 리더(microplate reader)기를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 50 μl of the prepared sample and standard solution were added to each well of the dextran ELISA plate. All experiments on samples and standard solutions were repeated three times. 50 μl of Detector-Enzyme Conjugated Solution was added to each well except for the blank well. Shake well, cover the plate using a plate sealer, and incubate at room temperature for 30 minutes. The solution in the well was removed and washed three times with 300 μL washing buffer (1X). At this time, care was taken to prevent the wells from drying out, and after the washing was completed, the next step was immediately performed. 100 μL of TMB was added and reacted under light blocking conditions until the color of the solution in the Zero Dextran well became dark blue. After adding 50 μL of Stop Solution and stopping the reaction, the absorbance was immediately measured using a microplate reader equipped with a 450 nm filter.
3. 실험 결과3. Experimental results
상기 2.에서 실험한 농도별 표준 O.D 값의 평균을 구하고, 덱스트란의 농도를 X 축, 각 표준 O.D 값을 Y축으로 하여 표준 그래프를 얻은 뒤 R2 값과 그래프에 대한 수식을 차트에 표시하였다(도 1 및 도 2). 각 시료 별 얻어진 O.D 값을 상기 그래프의 Y 값에 대입하여 각 시료 별 덱스트란의 농도를 계산하였다. 그 결과는 하기 표 2와 도 3 및 4에 나타내었다. 단, 하기 표 2에서 MP kit는 EasySep™ Direct RapidSpheres™ 50300을 1:100으로 희석한 시료이다. The average of the standard O.D. values for each concentration tested in step 2 above was calculated, and a standard graph was obtained with the concentration of dextran on the (Figures 1 and 2). The O.D value obtained for each sample was substituted into the Y value in the above graph to calculate the concentration of dextran for each sample. The results are shown in Table 2 and Figures 3 and 4 below. However, in Table 2 below, the MP kit is a 1:100 diluted sample of EasySep™ Direct RapidSpheres™ 50300.
(μg/mL)density
(μg/mL)
기준Cut-off
standard
각 시료 내 덱스트란을 포함하는 자성 미세구 입자의 잔존 유무를 판독하기 위한 덱스트란 농도의 컷-오프 값은 3 ㎍/ml로 설정하였다. 실험 결과, 자연살해세포 완제품과 세척액의 덱스트란 농도의 최소값이 0.721 ㎍/ml, 최대값이 2.547 ㎍/ml로 컷-오프 값보다 낮게 검출되었다. 또한, EasySep™ Direct RapidSpheres™ 50300 kit(MP 1:100) 농도 값을 100%로 하여 MP 대비 자연살해세포 1차 내지 3차 세척액 및 완제품 내에서의 자성 미세구 입자의 잔류량 비율을 확인한 결과, 약 0.5 내지 0.1 %까지 감소함을 확인하였다.The cut-off value of dextran concentration to determine whether magnetic microspheres containing dextran remain in each sample was set at 3 μg/ml. As a result of the experiment, the minimum dextran concentration of the finished natural killer cell product and the washing solution was detected as 0.721 ㎍/ml and the maximum as 2.547 ㎍/ml, which was lower than the cut-off value. In addition, the concentration value of the EasySep™ Direct RapidSpheres™ 50300 kit (MP 1:100) was set to 100% and the ratio of the residual amount of magnetic microspheres in the natural killer cell first to third washing solutions and finished products compared to MP was checked, and the results were found to be approx. It was confirmed that it decreased to 0.5 to 0.1%.
상기 실험 결과를 통해 자연살해세포 치료제를 제조하는 과정 중에 사용된 자성 미세구 입자가 제거되어, 실질적으로 잔존하지 않는 것을 확인할 수 있었다. Through the above experimental results, it was confirmed that the magnetic microspheres used during the process of manufacturing the natural killer cell therapeutic agent were removed and did not substantially remain.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (11)
상기 덱스트란(dextran) 또는 덱스트란 유도체의 존재 여부 또는 존재하는 수준을 측정하는 단계는 상기 덱스트란 또는 덱스트란 유도체에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 키트를 이용하여 수행되는, 측정 방법. According to paragraph 1,
The step of measuring the presence or level of the dextran or dextran derivative is performed using an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) kit containing an antibody that specifically binds to the dextran or dextran derivative. How to measure.
상기 목적하는 세포는 자연살해세포(natural killer cells; NK cells), T 세포, B 세포, 큰포식세포, 중성구 또는 수지상 세포인, 측정 방법.According to paragraph 1,
The cells of interest are natural killer cells (NK cells), T cells, B cells, macrophages, neutrophils, or dendritic cells.
상기 자성 입자는 자기(magnetic) 또는 초자기(magnetic) 코어(core)를 포함하고, 상기 코어 상에 1층 이상의 코팅층을 포함하며, 상기 코팅층은 덱스트란 또는 덱스트란 유도체를 포함하는 것인, 측정 방법. According to paragraph 1,
The magnetic particle includes a magnetic or supermagnetic core, and includes one or more coating layers on the core, and the coating layer includes dextran or a dextran derivative. method.
상기 세포 조성물은 자성 입자를 이용하여 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물로부터 목적하는 세포가 선별, 분리 또는 농축된 것을 포함하는, 측정 방법. According to paragraph 1,
The cell composition is a measurement method comprising selecting, separating, or concentrating the desired cells from a biological sample, a fraction thereof, or a culture thereof using magnetic particles.
상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장인, 측정 방법. According to clause 5,
A measurement method, wherein the biological sample is blood, serum or plasma.
상기 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축하는 방법은 상기 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물에 자성 입자를 첨가한 뒤 자석의 존재 하에서 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축하는 것인, 측정 방법. According to clause 5,
The method of selecting, separating, or concentrating the desired cells is a measurement method that involves adding magnetic particles to the biological sample, a fraction thereof, or a culture thereof, and then selecting, separating, or concentrating the desired cells in the presence of a magnet.
상기 목적하는 세포를 선별, 분리 또는 농축하는 방법은 상기 자성 입자가 첨가된 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물을 자석의 존재 하에서 배양한 뒤 상층액을 회수, 분리 또는 제거하거나, 혹은 자성 입자가 첨가된 생물학적 시료, 이의 분획물 또는 이의 배양물을 자석을 포함하는 컬럼을 통과시키며 수행되는, 측정 방법. In clause 7,
The method of selecting, separating, or concentrating the desired cells involves culturing a biological sample, a fraction thereof, or a culture thereof to which the magnetic particles have been added in the presence of a magnet, and then recovering, separating, or removing the supernatant, or removing the magnetic particles. A measurement method performed by passing the added biological sample, its fraction, or its culture through a column containing a magnet.
상기 세포 조성물은 생물학적 시료 내 목적하는 세포를 배양 또는 활성화한 뒤 자성 입자를 이용하여 목적하는 세포가 분리, 선별 또는 농축된 것을 포함하거나, 선별, 분리 또는 농축된 목적하는 세포를 배양 또는 활성화시킨 것을 포함하는 것인, 측정 방법. According to clause 5,
The cell composition includes culturing or activating the desired cells in a biological sample and then separating, selecting, or concentrating the desired cells using magnetic particles, or culturing or activating the selected, separated, or concentrated desired cells. Methods of measurement, including:
상기 세포 조성물 내 자성 입자의 잔존 유무를 평가하기 위한 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 발현 수준의 컷-오프(cut-off) 값은 0.1 내지 5의 유리수인, 측정 방법.According to paragraph 1,
The cut-off value of the expression level of dextran or dextran derivatives for evaluating the presence or absence of magnetic particles remaining in the cell composition is a rational number of 0.1 to 5.
상기 세포 조성물에 대하여 측정된 덱스트란 또는 덱스트란 유도체의 발현 수준이 0.1 내지 5 ㎍/ml의 유리수의 값 이하인 경우, 상기 세포 조성물 내에 자성 입자가 실질적으로 잔존하지 않는 것으로 평가하는, 측정 방법. According to paragraph 1,
When the expression level of dextran or dextran derivative measured for the cell composition is below the rational number value of 0.1 to 5 μg/ml, it is evaluated that magnetic particles do not substantially remain in the cell composition. A measurement method.
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