KR20230143670A - 락토바실러스 살리바리우스 mg242를 포함하는 항산화용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 살리바리우스 mg242를 포함하는 항산화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기탁번호(KCTC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242)의 활성에 대한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 살리바리우스 MG242는 우수한 항산화 활성을 보일 뿐만 아니라, 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포의 NO 생성 및 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 바, 이를 항산화 또는 항염증을 위한 식품 조성물, 건강보조식품, 화장료 조성물, 사료첨가용 조성물 등의 다양한 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

락토바실러스 살리바리우스 MG242를 포함하는 항산화용 조성물{Composition for anti-oxidant comprising Lactobacillus salivarius MG242}
본 발명은 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 살리바리우스 균주에 대한 것이다.
염증은 신체의 외부 신체적 상해 또는 미생물의 생체 내 감염으로부터 신체를 보호하기 위한 비특이적 방어 작용이다. 이원자 자유 라디칼인 산화질소(nitric oxide; NO)는 염증반응의 대표적인 지표이다. 산화질소는 생체 내 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase; NOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성된 고반응성의 자유 라디칼이다. 산화질소는 생리적 현상, 혈압 조절 및 신경 전달 물질로서 작용하며, 혈전 면역 기능으로 작용하는 것으로 알려져 있다.
그러나 산화질소가 필요 이상으로 생성되면 염증반응을 일으키고 면역계의 조직 파괴 및 이상을 나타낸다. 산화질소는 염증반응을 위한 매개체이며, 시간이 지남에 따라 아질산염(nitrite, NO2), 질산염(nitrate, NO3)과 같은 안정한 화합물로 존재하는 것으로 알려져 있는데, 여기서 퍼옥시나이트라이트 음이온(ONOO-)은 염증성이며, 세포 내 독소를 유발하고, 이는 조직 손상의 원인이 된다[Szabo et al., 1996].
또한, 신체의 과도한 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)는 산화 스트레스를 유발하고 염증 질환, 패혈증, 암, 노화, 피부 노화, 근감소증, 자가면역 질환, 폐질환 (천식, 만성 기관지염), 신장질환 (신장염, 만성 심부전), 관절질환 (류마티즘, 관절염), 뇌질환 (알츠하이머, 파킨슨병, 기억감퇴, 우울증, 뇌졸증), 눈질환 (백내장, 망막질환), 심혈관질환(동맥경화, 고혈압, 허혈, 심근증, 심정지), 태아이상 (임신중독증, 자궁내성장저하), 신경퇴행성 질환을 비롯한 수많은 질병을 촉진한다고 알려졌다.
한편, 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스(probiotics)라고 한다. 프로바이오틱스로서 효과가 있기 위해서는 경구로 섭취될 때, 대부분이 소장에 도달해서 장 표면에 부착되어야 하므로, 기본적으로 내산성, 내담즙성 및 장 상피세포 부착능력이 우수하여야 한다. 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당하기 때문에 프로바이오틱스로 사용된다. 유산균은 장내 정상균총의 유지, 장내 균총의 개선, 항당뇨 및 항고지혈증 효과, 발암 억제, 대장염 억제, 그리고 숙주의 면역체계의 비특이적 활성 등의 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 그 중에서도 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질 내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래전부터 알려져 왔고 미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 락토바실러스 균주 모두 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정수준(Bio-safty Level) 1'로 분류되어 있다.
이러한 유산균의 다양한 생리활성이 알려지면서, 최근 인체에 안전하면서도 기능이 우수한 유산균 균주를 개발하고 이를 의약품 또는 기능성 식품으로 적용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
본 발명자들은 한국 여성의 질에서 분리한 락토바실러스 균주 중 특정 균주가 우수한 항산화 활성을 보이며, 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포의 NO 생성 및 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 효과를 보이는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 항산화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항산화용 건강보조식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항산화용 건강기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항산화 활성 증대를 위한 사료첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항산화용 건강보조식품을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항산화용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화 활성 증대를 위한 사료첨가용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화 활성 증대를 위한 사료첨가용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 기탁번호(KFCC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242)는 우수한 항산화 활성을 보일 뿐만 아니라, 산화 스트레스(oxidative stress) 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포의 NO 생성 및 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 바, 이를 항산화 또는 항염증을 위한 다양한 용도로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포에 본 발명에 따른 균주를 처리한 후, 산화질소(Nitrogen oxide, NO) 생산을 확인한 결과이다(*** P<0.001, LPS 실험군 대비).
도 2는 본 발명에 따른 균주의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 3은 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포에 본 발명에 따른 균주를 처리한 후, 염증 관련 인자의 발현을 확인한 결과로, 도 3 중 A는 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 발현을 확인한 결과이고, 도 3 중 B는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현을 확인한 결과이며, 도 3 중 C는 COX-2(cyclooxygenase 2)의 mRNA 발현을 확인한 결과이다(* P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001, LPS 실험군 대비).
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항산화용 식품 조성물, 항산화용 건강보조식품 및 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 수탁번호 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주는 한국 여성의 질에서 분리된 락토바실러스 속 균주이다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 살리바리우스 MG242는 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 또는 ABTS(2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))에 대하여 우수한 라디탈 소거능을 보인 바, 본 발명에 따른 조성물은 DPPH 또는 ABTS 라디칼 소거 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 상기 락토바실러스 살리바리우스 MG242는 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포에 처리시 증가된 산화질소(Nitric oxide) 생성을 억제하는 효과를 보였다.
더불어 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식 세포에 상기 락토바실러스 살리바리우스 MG242를 처리시 염증 관련 인자인 TNF-α(tumor necrosis factor-α), iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase 2)의 발현을 현저히 억제시키는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따른 락토바실러스 살리바리우스 MG242는 iNOS 및 COX-2의 하향 조절을 통해 NO 생성을 억제할 수 있다.
그러므로 본 발명은 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242), 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 균주는 생균 뿐만 아니라 사균체의 형태로 포함될 수 있다. 상기 "사균체"란 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균과 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태를 의미한다. 사균체는 세포질(cytoplasm), 세포벽(cell wall), 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류(polysaccharide), 및/또는 유기산 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 열처리를 통해 사균체를 수득하여 이의 항염증 효과를 확인하였다.
본 발명에 있어서, "배양액"은 락토바실러스 살리바리우스 MG242 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 상등액, 이들의 추출물 및 분획물을 모두 포함하는 개념이다. 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액" 또는 “무세포 상등액”이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 발효물을 포함할 수 있다. 일 예에서 상기 배양물은 상기 균주를 배지에서 배양한 발효물일 수 있다. 상기 "발효물"은 미생물을 이용한 유기물질의 효소적 또는 대사적 분해의 결과물을 의미한다. 본 발명에 있어서, "발효"는 미생물을 이용한 유기물질의 효소적 또는 대사적 분해를 포함하는 모든 활성 또는 과정 중 부패 반응이 아닌 것을 의미할 수 있다. 상기 배양액은 그 자체로 사용할 수도 있으며, 공지의 여과, 농축 및 건조 과정을 수행하여 수득한 것일 수 있다. 상기와 같이 건조 과정을 거쳐 수분을 완전히 제거시킨 분말 형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기의 공지의 여과 방법은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 여과망, 마이크로필터를 이용한 여과, 원심분리 또는 분액깔대기를 이용한 여과 방법일 수 있다.
상기의 공지의 농축 방법은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 침전농축, 증발농축, 감압농축, 한외여과법, 역삼투법 또는 원심분리법일 수 있다.
상기의 공지의 건조 방법은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 동결 건조, 분무 건조 또는 열풍건조 방법일 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 분말제, 정제, 캡슐제, 환제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 형태로 제형화 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 자체를 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취하거나 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명의 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 항산화 활성이 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마멀레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242), 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 항산화용 식품 조성물에 있어, 상기 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상은 바람직하게 식품 조성물 대비 0.00001~50 중량%로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
또한, 본 발명의 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 음료로 제조될 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 있어서, “건강보조식품” 또는 '건강기능식품'이란 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
더불어 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242), 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 균주는 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능이 우수한 바, 세포의 손상을 감소시켜 피부의 노화 방지 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 염증 반응에 의해 증가된 NO의 생성 및 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 바, 항염증 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 항산화 활성 또는 항염증 활성을 나타내는 성분을 비롯하여 피부 상태 개선에 도움을 주는 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 성분은 히알루론산, 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol), 글리세린(Glycerin), 아미노산(amino acid), 트레할로스(trehalose), 코지산(kojic acid) 및 이의 유도체, 알부틴(arbutin), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 이의 유도체, 하이드로퀴논(hydroquinone) 및 이의 유도체, 레조르시놀(resorcinol), 2,7-디니트로인다졸(2,7-dinitroindazole), 아데노신(adenosine), 레티놀(retinol), 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate), 폴리에톡실레이티드레틴아마이드(polyethoxylated retinamide), 효모, 다이펩타이드(dipeptide), 팔미토일 올리고펩타이드(Palmitoyl oligopeptide) & 팔미토일 테트라펩타이드-7(Palmitoyl Tripeptide-7), 아세틸 헥사펩타이드(acetyl hexapeptide), EGF(epidermal growth factor) 또는 덩굴귤, 쌀, 감초, 시어버터, 알로에 베라, 코코넛, 올리브, 아보카도와 같은 식물 추출물 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 팩에 포함되어 제공될 수 있다. 상기 팩은 마스크(mask)팩, 수면팩, 클렌징(cleansing)팩, 워시 오프 팩(wash off) 및 필 오프(peel off) 팩 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조된 것이 바람직하지만 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화 활성 증대를 위한 사료첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "사료"란, 동물이 먹는 임의의 천연 또는 인공 구정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미하며, 본 발명에 따른 항산화 활성 증대를 위한 사료 첨가용 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계에 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 바람직하게는 농후 사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 용어, “사료첨가용 조성물”은 “사료첨가제”를 의미할 수 있으며, 이는 동물에 있어 질병 증상의 완화, 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다.
본 발명의 사료첨가용 조성물은 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 A D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 사료 중 농후사료로는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물(液狀物)을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분(肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류가 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 사료 중 조사료로는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 특수사료에는 굴껍데기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제가 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 사료첨가용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 본 발명에 따른 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 제조 가능하다.
또한 본 발명에 따른 사료첨가용 조성물은 항산화 활성 증대를 목적으로 하는 개체라면 제한없이 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물, 조류 및 어류 등 어느 개체에도 적용이 가능하다.
본 발명에 따른 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상은 우수한 항산화 활성과 더불어 염증 반응에 의해 증가된 NO의 생성 및 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 활성을 보인다.
따라서 본 발명은 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 염증성 질환은 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, 패혈증, 다발성연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염 및 인플루엔자 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 1000㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 본 발명에 따른 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 이외에, 항염증 효과의 상승, 보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 염증성 질환의 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
더불어 본 발명의 약학 조성물은 염증성 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 균주 준비
항산화 활성이 있는 유산균을 확인하기 위해 한국 여성의 질에서 분리한 락토바실러스 균주 중 기탁번호(KCTC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) MG242 및 기탁번호(KFCC 11650P)로 기탁된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG989를 선별하였다. 상기 균주들은 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe) 배지(BD Biosciences, Frankin Lakes, NJ, USA)를 이용해 37℃에서 배양하였고, 20%(v/v) 글리세롤(glycerol)을 이용해 -80℃에서 보관하였다.
실험예 2. 균주들의 항산화 특성 확인
상기 실험예 1의 균주들의 항산화 특성을 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능(radical scavenging) 분석으로 확인하였다. 먼저 균주 배양물을 PBS(pH 7.4)를 이용하여 OD600값을 대략 1.0으로 조정하고 0.05 mM DPPH 용액을 첨가하고 잘 혼합하였다(1:2 v/v). 그런 후, 암실에서 30분 동안 혼합물을 실온에 방치하였다. 대조 반응(control reaction)은 DPPH 용액에 첨가된 에탄올을 포함하였다. 각 혼합물의 흡광도는 517nm에서 측정하였다. 각 샘플의 분석은 3회 반복 수행하였으며, 결과는 10 μg/mL의 아스코르빅산(ascorbic acid)과 비교하였다. 더불어 항산화 활성은 하기 수학식 1을 통해 산출하였다.
[수학식 1]
소거 효과(Scavenging effect) (%) = (Ac-As)/Ac × 100
상기 수학식 1에 있어서, As는 517nm에서의 샘플의 흡광도이며, Ac는 517nm에서의 대조군의 흡광도이다.
더불어 ABTS(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 라디칼 소거 활성을 확인하였다. 먼저, 7mM의 ABTS와 2.45mM의 과황산칼륨(potassium persulfate)를 혼합하고(1:1 v/v) 암실에서 24시간동안 실온에 방치하여 라디칼 양이온(cation)을 준비하였다. 그후 선별된 50 μL의 균주 배양액과 100 μL의 ABTS 용액을 혼합하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 혼합물의 흡광도는 734 nm에서 측정하였다. 각 샘플의 분석은 3회 반복 수행하였으며, 소거율(scavenging rate)는 하기 수학식 2를 통해 산출하였다.
[수학식 2]
소거율(Scavenging rate) (%) = (Ac-As)/Ac × 100
상기 수학식 2에 있어서, As는 734nm에서의 샘플의 흡광도이며, Ac는 734nm에서의 대조군의 흡광도이다.
실험예 3. 대식세포에 대한 균주의 효과 확인
3-1. 대식세포 배양
쥐의 대식 세포(murine macrophage)인 RAW 264.7 세포주를 KCLB(Korean Cell Line Bank, (Korea))에서 입수하였다. 이를 10% FBS(Fetal bovine serum, (Gibco))와 1% 100 units/mL의 페니실린(penicillin)/100 μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지(BD Biosciences)를 이용하여 5% CO2, 37℃의 조건으로 배양하였다. 세포는 95%의 컨플루언시(confluency)가 될 때까지 3일마다 계대배양(sub-culture)하였다.
3-2. 산화질소(Nitrogen oxide, NO) 생산
NO 생산은 그리스(Griess) 반응을 통해 배양 배지에서 NO 합성의 지표인 아질산염(nitrite)의 축적을 기반으로 감지하였다.
먼저 균주들을 밤새 배양한 후, 이를 90℃에서 30분 동안 가열해 사멸시켰다(heat-killed). 그 후 12,000x g의 속도로 5분간 원심분리한 후, 세포 펠렛을 PBS(with phosphate-buffered saline)로 3번 세척하고 DMEM(Dulbecco's modified Eagle media)에 600nm(OD600)에서의 흡광도에 따라 5 × 108 cells/mL의 농도가 되게끔 재현탁하였다. 96웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 웰당 2 × 105 cells/well 넣고 1 μg/ml의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 자극한 후, 상기와 같이 준비한 각 균주 109 cells/well을 추가하였다. 이를 24시간 배양한 후, 그리스 시약을 이용해 세포 배양 상등액으로부터 아질산염의 양을 측정하여 NO 농도를 결정하였다. 더불어 Epoch 2 마이크로플레이트 리더기(Epoch 2 microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA))를 이용하여 550 nm의 파장에서 흡광도를 확인하였다. 신선한 배양 배지는 모든 실험에 대한 블랭크(blank) 대조군으로 사용하였다.
3-3. 세포 독성(Cytotoxicity) 확인
MTT(3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma, USA)) 분석을 수행하여 본 발명에 따른 균주를 처리한 RAW 264.7 세포의 생존율을 확인하였다. RAW 264.7 세포를 PBS를 이용해 2번 세척한 후, PBS에 용해된 100 μL의 MTT 시약(0.5 mg/mL)을 각 웰에 첨가하였다. 1시간 배양한 후, MTT 시약을 제거하고 100 Μl의 DMSO(dimethyl sulfoxide, (Sigma, USA))를 첨가하여 MTT 시약과 생존 세포의 대사물(metabolite) 사이의 반응물(reatant)로서 형성된 포르마잔(formazan)을 용해시켰다. 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고 음성대조군(균주 무처리 배지)의 결과와 비교하여 하기 수학식 3을 통해 산출하였다.
[수학식 3]
세포 생존율(Cell viability) (%) = (A sample/A negative control) × 100
상기 수학식 3에 있어서, A는 570 nm에서 측정한 흡광도이다.
3-4. 반 정량적(Semi-quantitative) RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)
RT-PCR을 수행하여 iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase 2), TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 mRNA 발현을 분석하였다. TRI REGENT™ (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 RAW 264.7세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 더불어 RT-PCR 수행을 위하여, iNOS, COX-2 및 TNF-α에 대한 프라이머를 디자인하였다. 이때 GAPDH(Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)를 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로서 사용하였다.
RT-PCR은 ONE-STEP RT-PCR PreMix kit™ (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 각 프라이머와 1 μg의 RNA 주형(template)을 ONE-STEP RT-PCR PreMix™와 혼합하였다. 이 샘플들을 RT-PCR을 통해 증폭하고, 다음과 같은 조건으로 반응을 수행하였다.
95℃로 5분간 역전사 반응(reverse transcription reaction); 95℃로 45초, 60℃로 45초(COX-2 및 GAPDH)의 30 사이클(cycle), 및 72℃로 1분 또는 95℃로 45초, 63℃로 45초(iNOS 및 TNF-α)의 35 사이클, 및 72℃로 1분; 및 72℃로 5분간 최종 신장 단계(final elongation step). iNOS, COX-2, 및 TNF-α mRNA 발현 수준은 농도계(densitometer) 및 Quantity One 소프트웨어(Quantity One software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA))를 사용하여 정량화하였다.
실험예 4. 균주 배양 배지에서 SCFA(Short-chain fatty acid)의 존재 확인
헤드스페이스 고체상 미세 추출 방법(headspace solid-phase microextraction method)을 사용하여 가스 크로마토그래피-질량 분석법(gas chromatography-mass spectrometry (QP2020 NXW/ORP230; Shimadzu, Japan))을 통해 균주 배양액의 SCFA를 분석하였다.
먼저 샘플들을 Stabilwax-DA 컬럼(Stabilwax-DA column (60 m × 0.32 mm × 0.25 μm, Shimadzu)을 이용하여 분리하였다. 그후 다음의 조건 하에 분석을 수행하였다: 오븐을 50℃에서 2분간 유지하고, 10℃/min으로 100℃, 2℃/min으로 200℃로 온도를 올린 후, 20℃/min으로 220℃까지 올린 다음 2분간 유지하였다. 이때 비분할 모드(splitless mode)를 사용하였으며, 헬륨은 2mL/min의 흐름(flow)에서 운반 기체(carrier gas)로 사용하였다. 질량 분석기(mass spectrometer)는 65eV에서 전자-충격 모드(electron-impact mode)로 작동하였다. 스캔 범위(scan range)는 40-200 m/z였고, 스캔 속도(scan rate)는 0.2 s/scan이었으며, 전자 에너지(electron energy)는 70 eV였다. 이온화 소스(ionization source) 및 쿼드 온도(quad temperature)는 각각 200℃ 및 150℃였다. 각각 추출된 샘플 피크 면적(peak area)는 정량화(quantification)한 후 샘플의 초기 부피(initial volume)로 표준화하였다(normalized). 각 분석 물질에 대한 선형 회귀 방정식(linear regression equation)은 피크 면적 대비 분석 물질 농도(μmol)의 보정 곡선(calibration curve)를 사용하여 계산하였다.
실험예 5. 통계학적 분석(Statistical analysis)
결과는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차(mean ± standard deviation)로 표시하였다. 실험군 간의 차이는 스튜던트 테스트(student's test)를 이용하여 평가하였으며, P 값이 <0.05 미만이면 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1. 본 발명에 따른 균주들의 시험관 내 항산화 특성 확인
기탁번호(KCTC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) MG242 및 기탁번호(KFCC 11650P)로 기탁된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG989의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정함으로써, 상기 균주의 항산화 활성을 확인하였다.
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 기탁번호(KCTC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 MG242의 DPPH 라디칼 소거능은 56.9±6.0이었고, ABTS 라디칼 소거능은 97.1±0.4이었다. 더불어 기탁번호(KFCC 11650P)로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 MG989의 DPPH 라디칼 소거능은 59.4±3.8이었고, ABTS 라디칼 소거능은 98.9±0.5이었다. 따라서 본 발명에 따른 균주들은 우수한 ABTS 라디칼 소거능을 가짐을 확인하였다.
실시예 2. 본 발명에 따른 균주들의 NO 생성에 미치는 영향 및 세포 독성 확인
NO는 다기능 매개체(multi-functional mediator)이며, 염증 활동에 대한 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 따라서 본 발명에 따른 두 종의 락토바실러스 균주가 산화 스트레스 환경의, 염증 반응이 유도된 대식세포에 있어서, NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, LPS가 처리된 대식세포의 NO가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 하지만 본 발명에 따른 락토바실러스 균주를 처리하는 경우, NO 생성이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로 기탁번호(KCTC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 MG242는 14.60 μM의 NO 생산을 보였고, 기탁번호(KFCC 11650P)로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 MG989는 19.60 μM의 NO 생산을 보였다.
따라서 본 발명에 따른 2 종의 락토바실러스 균주는 대식세포의 산화 스트레스 자극에 의하여 증가된 NO 생산을 현저히 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
또한 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 2 종의 락토바실러스 균주는 대식세포에 대하여 세포 독성을 보이지 않음을 확인하였다(세포 생존력(Cell viability): 80% 이상).
실시예 3. 본 발명에 따른 균주들의 염증 관련 인자 발현에 미치는 영향 확인
RT-PCR을 통해 본 발명에 따른 2 종의 균주가 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포에 있어서, 염증 관련 인자인 iNOS, COX-2 및 TNF-α mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, LPS 처리에 의해 iNOS, COX-2 및 TNF-α mRNA 발현이 증가되었으나, 본 발명에 따른 기탁번호(KCTC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 기탁번호(KFCC 11650P)로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 MG989의 처리에 의하여 하향 조절되었다. 이때 하우스키핑 유전자인 GAPDH는 본 발명에 따른 균주 처리에 의하여 영향받지 않았다.
따라서 본 발명에 따른 2 종의 락토바실러스 균주는 iNOS 및 COX-2의 하향 조절을 통해 NO 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 본 발명에 따른 균주 배양액내의 SCFAs 분석
탄수화물의 미생물 발효의 주요산물인 SCFA는 병원성 장내 세균의 성장을 억제하고 지질 대사와 면역체계를 조절할 수 있다. 또한 SCFA는 장의 pH를 낮추고 마그네슘 및 칼슘과 같은 미네랄의 생체 이용률을 촉진하여 박테리아의 성장을 억제한다.
이에 본 발명에 따른 균주 배양액내의 SCFAs를 분석하여 하기 표 3에 나타내었다.
상기 표 3에 있어서, AA는 아세트산(acetic acid)이고, PA는 프로피온산(propionic acid)이며, BA는 뷰티르산(butyric acid)이다. 상기 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다(n=3). 상기 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 균주 배양액내의 SCFAs에 있어서, AA가 가장 풍부하였다.
종합적으로 본 발명은 기탁번호(KCTC 18554P)로 기탁된 락토바실러스 살리바리우스 MG242 및 기탁번호(KFCC 11650P)로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 MG989의 활성에 대한 것으로, 본 발명에 따른 상기 2 종의 락토바실러스 균주는 우수한 항산화 활성을 보일 뿐만 아니라, 산화 스트레스 환경의 염증 반응이 유도된 대식세포의 NO 생성 및 염증 관련 인자의 발현을 억제하는 바, 이를 항산화 또는 항염증을 위한 다양한 용도로 유용하게 활용할 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC18554P 20170222

Claims (12)

  1. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항산화용 식품 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 또는 ABTS(2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 라디탈 소거 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 산화질소(Nitric oxide) 생성 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 TNF-α(tumor necrosis factor-α), iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase 2)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  5. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항산화용 건강보조식품.
  6. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 항산화용 건강기능 식품 조성물.
  7. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화용 화장료 조성물.
  8. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화 활성 증대를 위한 사료첨가용 조성물.
  9. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  11. 수탁번호 KCTC18554P인 락토바실러스 살리바리우스 MG242(Lactobacillus salivarius MG242) 균주, 이의 배양액, 이의 추출물 및 이의 무세포 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, 패혈증, 다발성연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염 및 인플루엔자 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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