KR20230138649A - Microbial Agent comprising Lactobacillus acidophilus and Manufacuring Method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus, 기탁번호 KCTC11906BP)를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 락토바실러스 아시도필루스를 이용함으로써 공기조화설비에서 발생하는 악취를 저감시키는 효과를 기대할 수 있으며, 안 자극, 피부자극 및 흡입 독성으로부터 안전성을 제공하는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus (Accession No. KCTC11906BP), which has excellent biofilm-forming ability, and a method for producing the same. More specifically, it relates to a biomaterial selection process and a method for producing the same. By using Lactobacillus acidophilus obtained through this process, the effect of reducing bad odors generated from air conditioning equipment can be expected, and the microbial agent that provides safety from eye irritation, skin irritation, and inhalation toxicity and its manufacturing method are expected to be effective. will be.
Description
본 발명은 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus, 기탁번호 KCTC11906BP)를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 락토바실러스 아시도필루스를 이용함으로써 공기조화설비에서 발생하는 악취를 저감시키는 효과를 기대할 수 있으며, 안 자극, 피부자극 및 흡입독성으로부터 안전성을 제공하는 미생물 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus (Accession No. KCTC11906BP), which has excellent biofilm-forming ability, and a method for producing the same. More specifically, it relates to a biomaterial selection process and a method for producing the same. By using Lactobacillus acidophilus obtained through this process, the effect of reducing bad odors generated from air conditioning facilities can be expected, and the microbial agent that provides safety from eye irritation, skin irritation, and inhalation toxicity and its manufacturing method are expected to be effective. will be.
공기조화(Air Conditioning)은 온도, 습도, 기류, 청정 및 환기 등의 제어가 필요한 열린 혹은 닫힌 공간에서 있는 사람 혹은 물품 등에 있어 알맞은 조건을 유지하는 것을 말한다.Air conditioning refers to maintaining appropriate conditions for people or items in open or closed spaces that require control of temperature, humidity, air flow, cleanliness, and ventilation.
그 중 온도는 계절 별 기온이나 여러 환경요건에 따라 가장 민감하게 느껴지는 요소로 이를 기준으로 냉방 혹은 난방이라 분류하고 있으나 습도, 기류, 청정 및 환기를 배제하고는 완전한 공기조화라고 부를 수 없다.Among them, temperature is the most sensitive factor depending on seasonal temperatures and various environmental conditions, and is classified as cooling or heating based on this. However, it cannot be called complete air conditioning without humidity, airflow, cleanliness, and ventilation.
즉, 공기조화시설은 광범위하게 사람 혹은 물품에 대한 요구 조건에 대하여 온도를 비롯한 여러 요소에 대한 제어가 가능한 설비를 의미한다. 따라서 공기조화설비를 일컬어 HVAC(Heating, Ventilation and Air Conditioning)이라 표현한다.In other words, air conditioning facilities broadly refer to facilities that can control various factors, including temperature, in relation to the requirements of people or goods. Therefore, air conditioning equipment is referred to as HVAC (Heating, Ventilation and Air Conditioning).
공기조화를 구성하는 여러 요소 중 가장 크게 체감하는 온도는 특히, 기온과 습도가 높아지는 여름철에 냉방 시설을 의미하는 에어컨(Air Conditioner)을 통하여 온도를 제어함으로서 쾌적한 실내 환경을 조성한다.Among the many elements that make up air conditioning, the temperature that is felt the most is created by controlling the temperature through an air conditioner, which is a cooling facility, especially in the summer when temperature and humidity rise. This creates a comfortable indoor environment.
에어컨(Air Conditioner)은 압축기, 응축기, 팽창기, 증발기로 이루어지는 냉매의 냉동사이클을 이용하여 실내를 냉난방 시키거나 공기를 정화시키는 설비이며, 상승된 실내 온도 및 습도를 낮추기 위하여 가동하게 된다.An air conditioner is a device that cools and heats the room or purifies the air using a refrigerant refrigerant cycle consisting of a compressor, condenser, expander, and evaporator. It operates to lower the elevated indoor temperature and humidity.
과거 사회와 달리 미세먼지, 초미세먼지 등으로 대기의 질이 점점 나빠지고 있는 현재 사회에서 깨끗한 공기는 건강과 웰빙에 기본적인 요구사항으로 인식되고 있고, 최근 고객 감성품질 증대에 따라 냄새와 같은 항목에 대한 관심이 크게 증가하고 있으며, 에어컨을 비롯한 공조설비에서 발생하는 악취는 공조 분야 품질 지수에서 매년 발생하는 대표적이며 고질적인 소비자 불만사항으로 보고되고 있는 실정이다.Unlike the past society, in the current society where air quality is getting worse due to fine dust and ultrafine dust, clean air is recognized as a basic requirement for health and well-being, and with the recent increase in customer emotional quality, items such as smell are Interest in air conditioning equipment is increasing significantly, and bad odors from air conditioning equipment, including air conditioners, are reported as a representative and chronic consumer complaint that occurs every year in the quality index of the air conditioning field.
일반적으로 에어컨 냄새는 크게 2가지 이유로 발생하게 된다.In general, air conditioner odors occur for two main reasons.
첫 번째는 저온의 냉매와 이보다 높은 공기가 서로 열 교환을 수행하게 됨에 따라 증발기 내부에 위치한 냉각핀 표면의 결로 현상으로 인해 물방울이 맺히게 되고, 외부로부터 유입되는 먼지를 비롯한 각종 세균이나 곰팡이가 증식하기 좋은 환경이 된다.First, as low-temperature refrigerant and higher-temperature air exchange heat with each other, water droplets form due to condensation on the surface of the cooling fins located inside the evaporator, and various bacteria and mold, including dust introduced from the outside, proliferate. It becomes a good environment.
이러한 환경에서 증식한 세균이나 곰팡이의 증식과정에서 발생하는 휘발성유기화합물(VOCs, Volatile ornagin compounds)을 포함하는 공기가 실내로 송풍되어 사용자로 하여금 악취를 감지하게 된다. 냄새가 발생하는 두 번째 이유는 사용 환경에 따라 차이가 있으나, 증발기 표면으로 악취를 발생시킬 수 있는 물질의 고착에 기인한다.In this environment, air containing volatile organic compounds (VOCs) generated during the growth of bacteria or mold is blown into the room, causing users to perceive a bad odor. The second reason for the occurrence of odor varies depending on the usage environment, but is due to the adhesion of substances that can generate odor to the surface of the evaporator.
이를 해결하기 위해서 제조사는 생산과정에서 악취 유발을 방지하기 위하여 안전문제가 발생하지 않는 범위에서 명확하게 규명이 되는 화학물질을 활용하여 선 도포를 시행하고 있는 것으로 알려져 있다.To solve this problem, manufacturers are known to be applying pre-application using clearly identified chemicals to the extent that they do not cause safety issues in order to prevent bad odors during the production process.
또한, 일반 소비자의 경우, 온/오프라인 매장을 통하여 곰팡이, 악취 제거제, 살균제 및 방향제를 사용하게 되는데 정확하게 악취가 발생하는 원인을 제거할 수 없는 한계점을 가지기에 완전한 해결책이라 보기 어렵다.In addition, general consumers use mold, odor removers, disinfectants, and air fresheners through online and offline stores, but they have the limitation of not being able to accurately remove the cause of the odor, so it is difficult to see it as a complete solution.
더불어 화학적 살생물질의 사용하는 제품은 잠재적으로 인체에 유해할 가능성이 높으며 과도한 사용은 항생제 내성균이나 슈퍼박테리아에 관한 문제를 야기할 수 있기 때문에 사용에 신중을 기해야하지만 이조차 일반소비자가 파악하기에는 어려움이 많은 실정이다.In addition, products using chemical biocides are potentially harmful to the human body, and excessive use can cause problems with antibiotic-resistant bacteria or super bacteria, so care must be taken when using them, but even this is difficult for general consumers to understand. There are many situations.
나아가, 화학적 살생물질을 포함하는 제품사용으로 인해 발생한 인명피해로 국내/외에서 화학물질에 대한 법적 규제가 강화되는 동시에 소비자 역시 안전 문제에 대한 관심도가 높아졌기 때문에 이를 대체할 수 있는 기술개발 및 제품화가 필요한 실정이다.Furthermore, legal regulations on chemical substances have been strengthened both at home and abroad due to casualties caused by the use of products containing chemical biocides, and at the same time, consumers have also become more interested in safety issues, so there is a need for technology development and commercialization to replace them. This is the situation.
이를 위해 천연물 혹은 미생물을 활용한 EM(Effective microorganism)발효액 등의 탈취제를 출시하였으나, 오히려 곰팡이가 발생하는 등의 문제점을 나타내고 있다.To this end, deodorants such as EM (Effective microorganism) fermentation liquid using natural products or microorganisms have been released, but they are showing problems such as the growth of mold.
미생물은 보호기작으로서 생물막(biofilm)을 형성하는데, 이는 하나 또는 여러 유형의 표면부착 미생물과 그들이 생성한 다량체 기질을 비롯한 다당류, 단백질, 지질 및 세포 외 고분자 물질(EPS, extracellular polymeric substances)로 구성된 점액질의 3차원적 구조물로 미생물군집에 의한 사회적 집단행동(social group behavior)으로 보고되고 있으며, 가장 대표적인 예로는 치아의 표면에 형성되는 치석(dental plaque)을 들 수 있다.As a protective mechanism, microorganisms form biofilms, which are composed of one or several types of surface-attached microorganisms and the multimeric substrates they produce, as well as polysaccharides, proteins, lipids, and extracellular polymeric substances (EPS). It is a three-dimensional structure made of mucus and is reported to be a social group behavior caused by a microbial community. The most representative example is dental plaque, which forms on the surface of teeth.
생물막을 생성하는 미생물의 종류로는 세균(bacteria), 곰팡이(fungi), 원생생물(protists)이 있으며, 이를 통한 이점은 영양분을 서로 공유하고 저 영양, 높고 낮은 온도, 항생제 등의 다양한 유해환경요인으로부터 보호를 받는 동시에 미생물이 자랄 수 있는 요건을 충족시킬 때 다시금 활성화되어 성장을 할 수 있다는 것이다.Types of microorganisms that create biofilms include bacteria, fungi, and protists. The advantage of this is that they share nutrients with each other and protect against various harmful environmental factors such as low nutrition, high and low temperatures, and antibiotics. When the requirements for microorganisms to grow are met while being protected from the elements, they can be activated again and grow.
실제로 미생물에 의한 생물막은 거의 모든 종류의 고체 표면에서 형성될 수 있기 때문에 종래에는 감염 과정에서 상피세포, 치아, 혈관내벽 등을 비롯해 카테터(catheter), 각종 삽입 보형물(implant) 같은 의료분야에 문제를 일으키기도 하며 수도관, 하수관, 정수기, 공기 정화시설 등 미생물이 접근할 수 있는 모든 종류의 인공 시설물에도 생물막이 형성된다고 보고되고 있다.In fact, because biofilms caused by microorganisms can be formed on almost any type of solid surface, they have traditionally caused problems in the medical field such as epithelial cells, teeth, and vascular walls, as well as catheters and various implants, during the infection process. It is also reported that biofilms are formed on all types of artificial facilities that microorganisms can access, such as water pipes, sewer pipes, water purifiers, and air purification facilities.
이렇게 형성된 생물막은 감염의 만성화와 여러 시설물들의 부식 및 기능저하를 유발하기 때문에 생물막은 미생물학뿐만 아니라 의학, 치의학, 약학 등을 비롯해 토목, 건축, 도시, 환경 공학 등 광범위한 분야에서 높은 관심을 받고 있으며 필수적으로 제거되어야 하는 대상으로 통용되고 있다.Because biofilms formed in this way cause chronic infection and corrosion and deterioration of various facilities, biofilms are receiving great attention and are essential in a wide range of fields, including not only microbiology but also medicine, dentistry, pharmacy, civil engineering, architecture, urban engineering, and environmental engineering. It is commonly regarded as an object that must be eliminated.
더불어 우점(prevalent)은 주로 생물학 관련 분야에서 사용되며, 우선적으로 혹은 우위를 점하여 특정 환경에서 가장 많은 개체수를 이룬 군집이나 종의 상태를 말한다.In addition, dominant is mainly used in biology-related fields, and refers to the state of a community or species that has the largest population in a specific environment by being preferential or dominant.
우점 상태의 대표적인 예로 발효식품의 경우, 식품 내에 유익균이 우점되도록 유도하여 인체에 무해한 혹은 더 나아가 유산균과 같이 유익한 미생물이 우위를 점하게 하여 부패를 일으키는 것과 같은 해로운 균종 발생 및 증식을 억제하여 원래의 상태보다 저장 기간이 늘어나며 섭취 시 장내 미생물 구성을 유익한 쪽으로 돕는 등의 효과를 얻을 수 있다.A representative example of the dominance state is in the case of fermented foods, which induces beneficial bacteria to become dominant in the food, allowing beneficial microorganisms such as lactic acid bacteria, which are harmless to the human body, to dominate, suppressing the occurrence and proliferation of harmful bacterial species such as those that cause spoilage, thereby suppressing the original The storage period is longer than the original condition, and when consumed, effects such as helping the composition of intestinal microorganisms in a beneficial way can be obtained.
이렇듯 공기조화설비에서 발생하는 악취를 저감시키기 위해 화학적 살생물질을 사용하지 않고, 미생물이 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 악취가 발생하는 근본적인 문제에 대한 해결방안 마련이 요구된다.In this way, in order to reduce odors generated from air conditioning facilities, chemical killing substances are not used, and the fundamental problem of odors generated by artificially creating a dominant environment is solved by taking advantage of the biofilm that microorganisms form on their own. A solution is required.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 락토바실러스 아시도필루스를 이용함으로써 화학적 살생물질을 사용하지 않고, 미생물이 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 공기조화설비에서 악취가 발생하는 근본적인 문제를 해결할 수 있도록 하는 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.The present invention was created to solve the above-mentioned problems. The purpose of the present invention is to use Lactobacillus acidophilus obtained through the process, including the bio material selection process, without using chemical biocides and allowing microorganisms to self-generate. Air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus, which has excellent biofilm forming ability and can solve the fundamental problem of bad odors in air conditioning equipment by creating an artificially dominant environment and the advantages of biofilm forming by artificially forming a prevalent environment. A microbial agent for reducing odor and a method for producing the same can be provided.
본 발명은 종래 화학적살생물질을 사용하는 제품이 가지는 짧은 지속성과 안전성 문제를 해결하여 안 자극, 피부자극 및 흡입독성으로부터 안전성을 제공하여 가정용, 차량용, 산업용 등 공조설비를 활용하는 다양한 상업용 공기조화 설비로 적용할 수 있는 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제 및 이의 제조방법을 제공할 수 있다.The present invention solves the short-lasting and safety problems of products using conventional chemical biocides and provides safety from eye irritation, skin irritation, and inhalation toxicity, and is used in various commercial air conditioning facilities for home, automotive, and industrial use. It is possible to provide a microbial preparation for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus, which has excellent biofilm-forming ability, and a method for manufacturing the same, which can be applied as.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 지닌 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The objects of the present invention are not limited to the objects mentioned above, and other objects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위해서, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus, 기탁번호: KCTC11906BP)를 영양배지에서 배양하여 배양 시드를 제조하는 배양시드제조단계; 상기 배양시드를 발효기로 접종하여 본배양을 통해 락토바실러스 아시도필루스 배양액을 대량으로 제조하는 대량생산단계; 원심분리 기를 이용하여 상기 대량생산단계에서 수득한 상기 락토바실러스 아시도필루스 배양액에서 락토바실러스 아시도필루스 균체를 회수하는 균체회수단계; 상기 균체회수단계에 서 회수된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 700mtorr 압력 조건에서 -65 내지 -70℃에서부터 5 내지 10℃ 간격으로 승온시키며 일정 시간동안 동결건조시키는 동결건조단계; 및 상기 동결건조단계를 통해 동결건조된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 1 내지 3mm의 입도를 갖도록 분쇄하여 미생물소재를 형성하며, 상기 미생물 소재 95 내지 99 중량%와 갈락토사민 1 내지 5 중량%을 혼합하여 미생물 제제를 제조하는 동결원료화단계;를 포함하는 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법을 제공할 수 있다.In order to achieve the above object, the present invention includes a culture seed preparation step of culturing Lactobacillus acidophilus (Accession Number: KCTC11906BP) in a nutrient medium to produce a culture seed; A mass production step of inoculating the culture seed into a fermenter and producing a large quantity of Lactobacillus acidophilus culture through main culture; A cell recovery step of recovering Lactobacillus acidophilus cells from the Lactobacillus acidophilus culture medium obtained in the mass production step using a centrifuge; A freeze-drying step of freeze-drying the Lactobacillus acidophilus cells recovered in the cell recovery step for a certain period of time while raising the temperature from -65 to -70°C at intervals of 5 to 10°C under 700 mtorr pressure conditions; And the Lactobacillus acidophilus cells freeze-dried through the freeze-drying step are pulverized to have a particle size of 1 to 3 mm to form a microbial material, comprising 95 to 99% by weight of the microbial material and 1 to 5 weight% of galactosamine. It is possible to provide a method for manufacturing a microbial preparation for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus with excellent biofilm forming ability, including a frozen raw material preparation step of producing a microbial preparation by mixing %.
이때, 상기 락토바실러스 아시도필루스를 영양배지에 순수배양하여 생성한 배양액 시료에 대하여 관능 평가, 저영양 평가, 생물막 형성능 평가 및 생물막 분산도 평가를 통해 우수균종을 선별하는 우수균종 선별 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.At this time, a selection step of selecting excellent bacterial species through sensory evaluation, low-nutrition evaluation, biofilm-forming ability evaluation, and biofilm dispersion evaluation for the culture fluid sample produced by pure culturing the Lactobacillus acidophilus on a nutrient medium; It is characterized by including more.
여기서, 상기 우수균종선별단계는, 상기 락토바실러스 아시도필루스의 순수배양과정에서 발생하는 상기 배양액 시료의 냄새 세기를 관능평가하여 상기 배양액 시료 내에서 우수균종을 선별하는 관능평가 우수균종 선별단계와, 상기 관능평가 우수균종선별단계에서 우수균종으로 선별된 상기 배양액 시료를 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 1차 배양과정에서 이용된 상기 고체영양배지보다 20 내지 75% 감소된 고체영양배지에 1차 배양된 상기 배양액 시료를 획선도말(Streaking)하여 1차 배양과정과 동일한 조건으로 2차 배양하며, 2차 배양된 상기 배양액 시료 내에서 가장 크게 형성된 집락(Colony)을 우수균종으로 선별하는 저영양 생장성 우수균종 선별단계와, 상기 저영양 생장성 우수균종선별단계에서 우수균종으로 선별된 상기 배양액 시료를 아미노글리코사이드계 항생제 및 베타-락탐계(β-lactam) 항생제를 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 배양한 후, 생물막의 형성정도를 관찰하여 생물막의 형성능이 높은 상기 배양액 시료를 우수균종으로 선별하는 생물막 형성능 우수균종 선별단계와, 상기 생물막 형성능 우수균종선별단계에서 우수균종으로 선별된 상기 배양액 시료를 숙신산염, 글루탐산염 및 포도당을 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 생물막의 분산정도를 관찰하여 생물막의 분산도가 높은 상기 배양액 시료를 우수균종으로 선별하는 생물막 분산도 우수균종선별단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.Here, the excellent bacterial species selection step includes a sensory evaluation excellent bacterial species selection step of selecting excellent bacterial species in the culture fluid sample by sensory evaluation of the odor intensity of the culture sample generated during the pure culture process of Lactobacillus acidophilus. , the culture sample selected as an excellent bacterial species in the sensory evaluation excellent bacterial species selection step is spread on a solid nutrient medium and first cultured for 2 to 5 days at 24 to 28 ℃ conditions, and then the solid nutrients used in the primary culture process are The culture sample, which was first cultured on a solid nutrient medium reduced by 20 to 75% compared to the medium, was streaked and cultured secondarily under the same conditions as the first culture process. A selection step of selecting large colonies as excellent bacterial species with excellent low-nutrient growth, and the culture sample selected as an excellent bacterial species in the low-nutrient growth excellent bacterial species selection step are treated with aminoglycoside antibiotics and beta-lactams. After plating on a solid nutrient medium containing β-lactam antibiotics and culturing at 24 to 28°C for 2 to 5 days, the degree of biofilm formation was observed and the culture samples with high biofilm formation ability were selected as excellent bacterial species. In the step of selecting bacterial species with excellent biofilm-forming ability, and the step of selecting excellent bacterial species with excellent biofilm-forming ability, the culture sample selected as an excellent bacterial species was spread on a solid nutrient medium containing succinate, glutamate, and glucose, and incubated for 2 to 2 minutes under conditions of 24 to 28°C. After primary culture for 5 days, the degree of dispersion of the biofilm is observed and the culture sample with a high degree of dispersion of the biofilm is selected as an excellent species of bacteria.
이와 더불어 상기 동결건조단계 이전에 상기 균체회수단계에서 회수된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 -65 내지 -75℃에서 24시간 동안 예비동결 시키는 예비동결단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.In addition, the method further includes a pre-freezing step of pre-freezing the Lactobacillus acidophilus cells recovered in the cell recovery step at -65 to -75°C for 24 hours before the freeze-drying step.
한편, 상기한 제조방법에 의해 제조된 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제를 제공할 수 있다.Meanwhile, it is possible to provide a microbial preparation for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus, which has excellent biofilm-forming ability, prepared by the above-described production method.
이때, 미생물 제제 0.001 내지 5중량%를 칼슘 0.1 내지 1.5중량%가 첨가된 멸균증류수 93.5 내지 99.899 중량%와 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한 다.At this time, it is characterized in that 0.001 to 5% by weight of the microbial agent is mixed with 93.5 to 99.899% by weight of sterilized distilled water to which 0.1 to 1.5% by weight of calcium is added.
본 발명은 바이오 소재 선별공정을 비롯하여 그 과정을 통해 얻은 락토바실러스 아시도필루스를 이용함으로써 화학적 살생물질을 사용하지 않고, 미생물이 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 공기조화설비에서 악취가 발생하는 근본적인 문제를 해결할 수 있다는 이점이 있다.The present invention uses the biomaterial selection process and Lactobacillus acidophilus obtained through the process, without using chemical biocides, and has the advantage of biofilm formed by microorganisms on their own and artificially dominates (prevalent). It has the advantage of being able to solve the fundamental problem of bad odors from air conditioning facilities by creating an environment.
또한, 본 발명은 종래 화학적살생물질을 사용하는 제품이 가지는 짧은 지속성과 안전성 문제를 해결하여 안 자극, 피부자극 및 흡입독성으로부터 안전성을 제공하여 가정용, 차량용, 산업용 등 공조설비를 활용하는 다양한 상업용 공기조화설비적용할 수 있다는 이점이 있다.In addition, the present invention solves the short-lasting and safety problems of products using conventional chemical biocides, providing safety from eye irritation, skin irritation, and inhalation toxicity, and provides safety from various commercial air conditioning facilities such as household, automotive, and industrial use. There is an advantage in that it can be applied to harmony facilities.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법을 나타낸 공정순서도.
도 2는 도 1에 우수균종선별단계를 세부적으로 나타낸 공정순서도.Figure 1 is a process flow chart showing a method for manufacturing a microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus with excellent biofilm forming ability according to a preferred embodiment of the present invention.
Figure 2 is a process flow chart showing in detail the excellent bacterial species selection step in Figure 1.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms. The present embodiments only serve to ensure that the disclosure of the present invention is complete and that common knowledge in the technical field to which the present invention pertains is not limited. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.
아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.Specific details for implementing the present invention will be described in detail with reference to the drawings attached below. Regardless of the drawings, the same reference numerals refer to the same elements, and “and/or” includes each and all combinations of one or more of the mentioned items.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.The terminology used herein is for describing embodiments and is not intended to limit the invention. As used herein, singular forms also include plural forms, unless specifically stated otherwise in the context. As used in the specification, “comprises” and/or “comprising” does not exclude the presence or addition of one or more other elements in addition to the mentioned elements.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used in this specification may be used with meanings that can be commonly understood by those skilled in the art to which the present invention pertains. Additionally, terms defined in commonly used dictionaries are not interpreted ideally or excessively unless clearly specifically defined.
본 발명의 공조설비 악취저감용 미생물 제제는 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus, 기탁번호 KCTC11906BP)를 포함하여 락토바실러스 아시도필루스가 자체적으로 형성하는 생물막(biofilm)의 이점과 인위적으로 우점(prevalent)환경을 조성하여 공기조화설비에서 악취가 발생하는 근본적인 문제를 해결할 수 있는 것으로, 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.The microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment of the present invention includes Lactobacillus acidophilus (Accession No. KCTC11906BP), which has excellent biofilm-forming ability, and has the advantages of the biofilm that Lactobacillus acidophilus forms on its own. It is possible to solve the fundamental problem of bad odors occurring in air conditioning facilities by artificially creating a dominant environment. Hereinafter, a preferred embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the attached drawings.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법을 나타낸 공정순서도이다.Figure 1 is a process flow chart showing a method for manufacturing a microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus, which has excellent biofilm forming ability, according to a preferred embodiment of the present invention.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 미생물 제제를 제조하기 위하여 우수균종선별단계(S10), 배양시드제조단계(S20), 대량생산단계(S30), 균체회수단계(S40), 동결건조단계(S50) 및 동결원료화단계(S60)를 순차적으로 실시한다.As shown in Figure 1, in order to manufacture the microbial preparation, an excellent bacterial species selection step (S10), a culture seed preparation step (S20), a mass production step (S30), a cell recovery step (S40), and a freeze-drying step (S50). ) and frozen raw material conversion step (S60) are performed sequentially.
우선, 상기 우수균종선별단계(S10)는 상기 미생물 제제 악취저감 효과를 보다 높이기 위해 상기 미생물 제제 제조에 이용되는 상기 락토바실러스 아시도필루스의 우수균종을 선별하는 단계로서, 상기 락토바실러스 아시도필루스를 영양배지에 순수배양하여 생성한 배양액 시료에 대하여 관능 평가, 저영양 평가, 생물막 형성능 평가 및 생물막 분산도 평가를 통해 우수균종을 선별한다.First, the excellent bacterial species selection step (S10) is a step of selecting excellent bacterial species of Lactobacillus acidophilus used in manufacturing the microbial preparation in order to further increase the odor reduction effect of the microbial preparation. Excellent bacterial species are selected through sensory evaluation, low-nutrition evaluation, biofilm-forming ability evaluation, and biofilm dispersion evaluation on the culture fluid sample produced by pure culturing Loose on nutrient medium.
상기 우수균종선별단계(S10)에 선별된 락토바실러스 아시도필루스의 우수균종은 상기 배양시드제조단계(S20)에서 영양배지에서 배양되어 배양시드로 제조된다.The excellent bacterial species of Lactobacillus acidophilus selected in the excellent bacterial species selection step (S10) are cultured in a nutrient medium in the culture seed preparation step (S20) to produce culture seeds.
상기 배양시드제조단계(S20)는 상기 대량생산공정(S30)을 진행하기에 앞서 발효기를 이용한 미생물 배양에 기초가 되는 시드(Seed) 미생물 즉, 배양시드를 제조하는 단계로, 1,000L의 최종 부피(working volume)에 대해 0.25% 내지 1%에 해당하는 부피를 갖는 상기 배양시드를 제조하기 위하여 락토바실러스 아시도필루스의 우수균종을 상기 영양배지에 1,500L 내지 5,000L plant scale 발효기로 접종하고자 한다.The culture seed manufacturing step (S20) is a step of manufacturing seed microorganisms, that is, culture seeds, which are the basis for microbial culture using a fermenter prior to proceeding with the mass production process (S30), with a final volume of 1,000 L. In order to produce the culture seed having a volume corresponding to 0.25% to 1% of the working volume, the superior bacterial species of Lactobacillus acidophilus is intended to be inoculated into the nutrient medium using a 1,500L to 5,000L plant scale fermentor. .
구체적으로는, 우선, 상기 락토바실러스 아시도필루스의 호기성 대사를 감안하여 상기 우수균종선별단계(S10)에 선별된 상기 우수균종에 해당하는 상기 배양액 시료를 상기 배양시드의 최종배양용량(working volume) 1,000L를 기준으로 0.25 내지 0.5%의 부피를 갖는 것 1 내지 3개와 0.7 내지 1%의 부피를 갖는 것 3 내지 5개로 나누어 접종을 준비한다.Specifically, first, considering the aerobic metabolism of Lactobacillus acidophilus, the culture sample corresponding to the excellent bacterial species selected in the excellent bacterial species selection step (S10) was adjusted to the final culture capacity (working volume) of the culture seed. ) Prepare inoculation by dividing into 1 to 3 pieces with a volume of 0.25 to 0.5% and 3 to 5 pieces with a volume of 0.7 to 1% based on 1,000 L.
이때, 바람직하게는 0.5%의 배양시드 2개와 1%의 배양시드 4개로 나누어 접종을 준비한다.At this time, preferably prepare for inoculation by dividing into two 0.5% culture seeds and four 1% culture seeds.
또한, 5L 용량의 삼각 플라스크를 복수 개를 준비하고, 나누어진 상기 배양시드에 대응하는 상기 영양배지를 제조한 후, 멸균기(Autoclave)를 이용하여 120 내지 125℃의 온도조건으로 15 내지 25분간 멸균을 진행한다.In addition, prepare a plurality of Erlenmeyer flasks with a capacity of 5L, prepare the nutrient medium corresponding to the divided culture seeds, and then sterilize for 15 to 25 minutes at a temperature of 120 to 125°C using an autoclave. proceed.
이때, 멸균조건은 121℃의 온도에서 20분간 유지되는 것이 바람직하다.At this time, the sterilization conditions are preferably maintained at a temperature of 121°C for 20 minutes.
또한, 상기 영양배지는 효모 추출물(Yeast extract) 1 내지 2중량부, 글루코스(Glucose) 0.5 내지 1 중량부, 갈락토사민(galactosamine) 0.1 내지 0.5 중량부, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.01 내지 0.1중량부, 황산제일철7수화물(Ferrous sulfate heptahydrate) 0.01 내지 0.1중량부, 포타슘하이드로겐포스 페이트(Potassium hydrogen phosphate) 0.01 내지 0.1중량부, 포타슘디하이드로겐 포스페이트(Potassium dihydrogen phosphate) 0.01 내지 0.1중량부 및 인산칼슘(Calcium phosphate) 0.01 내지 0.1중량부를 포함하는 것이며, 바람직하게는 효모 추출물(Yeast extract) 1.5중량부, 글루코스(Glucose) 0.5중량, 갈락토사민(galactosamine) 0.5중량, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.05중량부, 황산 제일철7수화물(Ferrous sulfate heptahydrate) 0.05중량부, 포타슘하이드로겐포스페이트(Potassium hydrogen phosphate) 0.05중량부, 포타슘디하이드로겐포스페이트(Potassium dihydrogen phosphate) 0.1중량부 및 인산칼슘(Calcium phosphate) 0.03 중량부를 포함할 수 있다.In addition, the nutrient medium contains 1 to 2 parts by weight of yeast extract, 0.5 to 1 part by weight of glucose, 0.1 to 0.5 parts by weight of galactosamine, and 0.01 to 0.1 parts by weight of magnesium sulfate. 0.01 to 0.1 part by weight of ferrous sulfate heptahydrate, 0.01 to 0.1 part by weight of potassium hydrogen phosphate, 0.01 to 0.1 part by weight of potassium dihydrogen phosphate, and phosphoric acid. It contains 0.01 to 0.1 parts by weight of calcium phosphate, preferably 1.5 parts by weight of yeast extract, 0.5 parts by weight of glucose, 0.5 parts by weight of galactosamine, and 0.05 parts by weight of magnesium sulfate. Parts by weight, 0.05 parts by weight of ferrous sulfate heptahydrate, 0.05 parts by weight of potassium hydrogen phosphate, 0.1 parts by weight of potassium dihydrogen phosphate, and 0.03 parts by weight of calcium phosphate. It may include weight parts.
또한, 상기 영양배지는 부피는 상기 배양시드 1.5 내지 3.0L를 기준으로 제조되어야 하며, 바람직하게는 상기 영양배지는 부피는 상기 배양시드 2.5L를 기준으로 제조되어야 한다.In addition, the nutrient medium should be manufactured based on a volume of 1.5 to 3.0L of the culture seeds, and preferably, the nutrient medium should be manufactured based on a volume of 2.5L of the culture seeds.
상기 무균기 내에서 상기 배양시드의 부피를 기준으로 1%에 해당하는 상기 배양시드를 상기 영양배지에 접종하고, 진탕배양기(진탕배양기)에서 30 내지 32℃의 온도조건에서 100 내지 150rpm으로 3 내지 5일간, 바람직하게는 4일간 1차 시드배양을 실시한다.In the aseptic chamber, the culture seed corresponding to 1% based on the volume of the culture seed is inoculated into the nutrient medium, and the culture seed is incubated at 100 to 150 rpm for 3 to 3 minutes in a shaking incubator (shaking incubator) at a temperature of 30 to 32°C. Primary seed culture is performed for 5 days, preferably 4 days.
소정의 시간동안 배양을 한 후, 600nm파장으로 흡광도를 측정하며, 측정값이 Lab. scale 실험을 통하여 도출한 배양종료 흡광도 기준치에 도달하면, 배양을 종료하여 1차 시드배양액을 수득한다.After culturing for a predetermined time, the absorbance is measured at a wavelength of 600 nm, and the measured value is reported in Lab. When the culture-ending absorbance standard value derived through scale experiment is reached, the culture is terminated to obtain the first seed culture medium.
이후, 1,500L 발효기를 통해 새로운 영양배지를 준비하고, 120 내지 125℃의 온도조건으로 15 내지 25분간 에어필터와 함께 멸균을 진행하며, 이때, 멸균조건은 121℃의 온도에서 20분간 유지되는 것이 바람직하다.Afterwards, a new nutrient medium is prepared through a 1,500 L fermentor, and sterilization is performed with an air filter for 15 to 25 minutes at a temperature of 120 to 125°C. At this time, the sterilization condition is maintained at a temperature of 121°C for 20 minutes. desirable.
멸균과정 이후, 배양시드의 배양조건인 30 내지 32℃, 50mL/min, 50 내지 80rpm 및 0.5kg/cm²으로 제어하고 접종을 위해 상기 1차 시드배양액을 준비하며, 접종구에 화염링을 설치하고, 발효기 압력을 풀어준 후, 에어공급량을 25 내지 40L/min, 바람직하세는 25mL/min으로 조정하고, 상기 1차 시드배양액을 발효기로 접종하여 3 내지 5일간, 바람직하게는 4일간 2차 시드배양을 실시한다.After the sterilization process, the culture conditions of the culture seeds are controlled to 30 to 32°C, 50 mL/min, 50 to 80 rpm, and 0.5 kg/cm², the primary seed culture medium is prepared for inoculation, and a flame ring is installed at the inoculation port. After releasing the pressure in the fermenter, the air supply amount is adjusted to 25 to 40 L/min, preferably 25 mL/min, and the primary seed culture is inoculated into the fermenter to form secondary seed for 3 to 5 days, preferably 4 days. Carry out culture.
소정의 시간동안 배양을 한 후, 600nm파장으로 흡광도를 측정하며, 측정값이 Lab. scale 실험을 통하여 도출한 배양종료 흡광도 기준치에 도달하면, 배양을 종료하여 2차 시드배양액을 수득한다.After culturing for a predetermined time, the absorbance is measured at a wavelength of 600 nm, and the measured value is reported in Lab. When the culture-ending absorbance standard value derived through scale experiment is reached, the culture is terminated to obtain a second seed culture.
상기 2차 시드배양 종료 이후, 오염 발생 여부를 확인을 위하여 상기 2차 시드배양액을 샘플링을 진행하여 멸균기 내에서 상기 2차 시드배양액 10ul를 고체영양배지에 획선도말을 실시하고, 배양기(배양기)에서 30 내지 32℃으로 배양을 실시하여 시드배양액 이외에 균체가 관찰되는지 확인한다.After the secondary seed culture is completed, the secondary seed culture is sampled to check whether contamination has occurred, and 10 ul of the secondary seed culture is smeared on a solid nutrient medium in a sterilizer, and then placed in an incubator. Cultivate at 30 to 32°C to check whether bacteria other than the seed culture are observed.
오염발생여부 확인 후, 원심분리 및 동결건조과정을 거쳐 시드배양액 내 균체의 수분활성도를 낮춰서 분말화 하고, 수율을 평가한 후, 최종적으로 분말화된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 배양시드로서 수득함으로써 상기 배양 시드제조단계(S20)는 종료된다.After confirming whether contamination has occurred, the water activity of the bacteria in the seed culture medium is lowered and powdered through centrifugation and freeze-drying processes. After evaluating the yield, the powdered Lactobacillus acidophilus cells are finally used as culture seeds. By obtaining the culture seed preparation step (S20), the culture seed preparation step (S20) is completed.
다음으로, 상기 배양시드제조단계(S20)이후에는 상기 대량생산단계(S30)을 통해 상기 배양시드를 발효기로 접종하여 본배양을 통해 락토바실러스 아시도필루스 배양액을 대량으로 제조한다.Next, after the culture seed preparation step (S20), the culture seed is inoculated into a fermenter through the mass production step (S30) to produce a large quantity of Lactobacillus acidophilus culture through main culture.
구체적으로 살펴보면, 우선, 최종배양용량(working volume)을 기준으로 0.5%에 해당하는 상기 배양시드를 준비하고, 1,500L 발효기를 통하여 락토바실러스 아시도필루스를 배양하기 위하여 발효조에 증류수 1,000L와 최적화 영양배지를 넣고 에어필터 멸균을 실시한다.Specifically, first, prepare the culture seed corresponding to 0.5% of the final culture capacity (working volume), and optimize it with 1,000 L of distilled water in the fermenter to cultivate Lactobacillus acidophilus through a 1,500 L fermenter. Add nutrient medium and sterilize the air filter.
이때, 120 내지 125℃의 온도조건으로 15 내지 25분간 멸균을 진행하며, 바람직하게는 멸균조건이 121℃의 온도에서 20분간 유지되어야 한다.At this time, sterilization is performed for 15 to 25 minutes at a temperature of 120 to 125°C, and preferably, the sterilization conditions should be maintained at a temperature of 121°C for 20 minutes.
또한, 에어필터 멸균에 앞서, 상기 발효기의 스팀배관 내에 존재하는 응축수의 배수(Drain)를 10 내지 15분간 진행하며, 에어필터 멸균을 진행 후에는 30분 간 에어필터 건조를 실시한다.In addition, prior to air filter sterilization, condensate present in the steam piping of the fermentor is drained for 10 to 15 minutes, and after air filter sterilization, the air filter is dried for 30 minutes.
여기서, 상기 응축수의 배수(Drain)는 에어필터 과정에서 오염 발생을 방지 하기 위한 것으로, 응축수가 있는 상태로 스팀이 에어필터로 넘어가게 되면 상기 스템배관에 포함된 철 성분을 비롯한 이물질이 필터를 오염 시키는 현상이 나타난다.Here, the drain of the condensate is to prevent contamination during the air filter process. When steam passes through the air filter with condensate present, foreign substances including iron contained in the stem pipe contaminate the filter. A phenomenon appears.
한편, 상기 에어필터 멸균시, 상기 스팀배관으로 들어오는 스팀압력이 너무 높을 경우, 상기 에어필터의 변형을 유발하기 때문에 적정압력으로 조절되어야 한다.Meanwhile, when sterilizing the air filter, if the steam pressure entering the steam pipe is too high, it may cause deformation of the air filter and must be adjusted to an appropriate pressure.
상기 에어필터 멸균을 통해 발효조 및 배지 멸균을 진행한 후, 배양온도인 30 내지 32℃까지 냉각을 실시하고, 배양조건을 24 내지 28℃, 50L/min, 50 내지 80rpm, 0.5 내지 0.8kg/cm²으로 제어하고 접종을 위해 상기 1차 시드배양액을 준비하며, 접종구에 화염링을 설치하고, 발효기 압력을 풀어준 후, 에어공급량을 25 내지 40L/min으로 조정하고, 상기 배양시드를 발효기로 접종하여 상기 락토바실러스 아시도필루스 배양액의 대량생산을 위해 배양을 진행한다.After sterilizing the fermenter and medium through the air filter sterilization, cooling was performed to the culture temperature of 30 to 32 ℃, and the culture conditions were 24 to 28 ℃, 50 L/min, 50 to 80 rpm, 0.5 to 0.8 kg/cm². Control and prepare the primary seed culture for inoculation, install a flame ring in the inoculation port, release the fermenter pressure, adjust the air supply amount to 25 to 40 L/min, and inoculate the culture seed into the fermentor. Cultivation is then carried out for mass production of the Lactobacillus acidophilus culture medium.
상기 대량생산단계(S30)가 완료되면 상기 균체회수단계(S40)를 진행하는데, 상기 균체회수단계(S40)에서는 원심분리기를 이용하여 상기 대량생산단계(S30)에서 수득된 상기 락토바실러스 아시도필루스 배양액에서 락토바실러스 아시도필루스 균체를 회수한다.When the mass production step (S30) is completed, the cell recovery step (S40) is performed. In the cell recovery step (S40), the Lactobacillus acidophilus obtained in the mass production step (S30) is used using a centrifuge. Lactobacillus acidophilus cells are recovered from the loose culture medium.
보다 상세하게는, 튜블러 타입 원심분리기를 이용하여 상기 락토바실러스 아시도필루스 배양액에서 균체를 회수하며, 이때, 원심분리기 RPM, 배양액 이송펌프 속도, 원심분리 필름 교체 횟수 등의 조건 변경을 통하여 균체 회수율을 높일 수 있다.More specifically, the cells are recovered from the Lactobacillus acidophilus culture medium using a tubular-type centrifuge. At this time, the cells are recovered by changing conditions such as centrifuge RPM, culture medium transfer pump speed, and number of centrifugal film replacements. Recovery rate can be increased.
바람직하게는 원심분리기의 속도 11,000 내지 12,500rpm로 설정하고, 배양액 이송 펌프 속도 18 내지 28L/min으로 설정하며, 균체 회수 필름을 1 내지 3회 교체하여 상기 락토바실러스 아시도필루스 배양액에서 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 회수하여야 한다.Preferably, the speed of the centrifuge is set to 11,000 to 12,500 rpm, the culture medium transfer pump speed is set to 18 to 28 L/min, and the cell recovery film is replaced 1 to 3 times to remove the Lactobacillus acidophilus from the Lactobacillus acidophilus culture medium. Acidophilus cells must be recovered.
상기 균체회수단계(S40) 이후, 상기 동결건조단계(S50)를 실시하게 되는데, 이때, 상기 동결건조단계(S50)를 진행하기에 앞서, 상기 균체회수단계(S40)에서 회수된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 초저온냉동고(Deep-freezer)를 이용하여 -65 내지 -75℃의 온도조건에서, 바람직하게는 -70℃에서 24시간 동안 예비동결시키는 예비동결단계(미도시) 추가로 실시하여 후속될 상기 동결건조단계(S50)에서의 동결건조효율을 높일 수 있다.After the cell recovery step (S40), the freeze-drying step (S50) is performed. At this time, before proceeding with the freeze-drying step (S50), the Lactobacillus acii recovered in the cell recovery step (S40) An additional pre-freezing step (not shown) is performed in which the Dophilus cells are pre-frozen using a deep-freezer under temperature conditions of -65 to -75 ℃, preferably at -70 ℃ for 24 hours. The freeze-drying efficiency in the subsequent freeze-drying step (S50) can be increased.
한편, 상기 동결건조단계(S50)는 상기 균체회수단계(S40)에서 회수된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 700mtorr 압력 조건에서 -65 내지 -70℃에 서부터 5 내지 10℃ 간격으로 승온시키며 일정 시간동안 동결건조시킨다.Meanwhile, in the freeze-drying step (S50), the Lactobacillus acidophilus cells recovered in the cell recovery step (S40) are heated at intervals of 5 to 10°C from -65 to -70°C under 700 mtorr pressure conditions and kept at a constant temperature. Freeze-dry for some time.
구체적으로는, 동결건조기용 트레이(Tray)에 원심분리 필름을 제거하여 상기 균체회수단계(S40)에서 회수한 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 놓는다.Specifically, the centrifugal separation film is removed and the Lactobacillus acidophilus cells recovered in the cell recovery step (S40) are placed on a tray for a freeze dryer.
이때, 온도센서를 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체와 상기 트레이 사이에 놓게 되면 트레이별로 온도편차가 크게 나타나기 때문에 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체의 가장 두꺼운 부분에 설치하도록 해야하며, 바람직하게는 상기 예비동결단계(미도시) 이전에 상기 온도센서를 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체의 가장 두꺼운 부분에 설치하도록 해야한다.At this time, when the temperature sensor is placed between the Lactobacillus acidophilus cells and the tray, a large temperature deviation appears for each tray, so it should be installed at the thickest part of the Lactobacillus acidophilus cells, preferably Before the preliminary freezing step (not shown), the temperature sensor must be installed in the thickest part of the Lactobacillus acidophilus cells.
이후, 상기 동결건조기의 선반온도를 -40℃로 설정하고, 설정온도에 도달하면 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체가 놓인 상기 트레이를 챔버(Chamber)내에 넣고 콜드트랩(Cold-trap)을 가동하여 챔버 내 온도가 -65 내지 70℃가 되면, 진공펌프(Vacuum pump)를 가동하여 진공을 걸어준다.Afterwards, the shelf temperature of the freeze dryer is set to -40°C, and when the set temperature is reached, the tray containing the Lactobacillus acidophilus cells is placed in the chamber and the cold trap is operated. When the temperature in the chamber reaches -65 to 70°C, a vacuum pump is activated to create a vacuum.
이후, 동결건조기 패널 상의 압력이 700 mtorr 이상으로 변하지 않는 선에서 선반온도를 5℃ 간격으로 증가시키고, 선반온도가 0℃ 이상으로 증가되면 동결건조기의 압력이 700 mtorr가 변하지 않는 선에서 10℃ 간격으로 온도를 증가시키고, 2시간 간격으로 추가적으로 선반온도를 증가시킨다.Afterwards, the shelf temperature is increased at 5°C intervals as long as the pressure on the freeze dryer panel does not change above 700 mtorr, and when the shelf temperature increases above 0°C, the pressure on the freeze dryer panel increases at 10°C intervals as long as the pressure on the freeze dryer does not change above 700 mtorr. Increase the temperature, and additionally increase the shelf temperature at 2-hour intervals.
상기 동결건조단계(S50)가 시작되고 대략 144시간이 경과한 후, 상기 동결건조단계(S50)를 종료하고 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체의 분말을 거두들이게 되는데, 이때, 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체 분말의 건조 정도에 따라 건조 시간 을 유동적으로 조절할 수 있다.After approximately 144 hours have passed since the freeze-drying step (S50) begins, the freeze-drying step (S50) is completed and the powder of the Lactobacillus acidophilus cells is harvested. At this time, the Lactobacillus acidophilus cells are harvested. The drying time can be flexibly adjusted depending on the degree of drying of the pilus cell powder.
다음으로, 상기 동결원료화단계(S60)에서는 상기 동결건조단계(S50)를 통해 동결건조된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체는 외부와 차단된 청결 구역에서 1 내지 3mm의 입도를 갖도록 분쇄되어 미생물소재로 제조되며, 상기 미생물 소재 95 내지 99 중량%와 EPS 구성 기반 아미노당인 갈락토사민 1 내지 5 중량%가 혼합되어 미생물 제제로 제조된다.Next, in the freeze-drying step (S60), the Lactobacillus acidophilus cells freeze-dried through the freeze-drying step (S50) are pulverized to have a particle size of 1 to 3 mm in a clean area blocked from the outside to kill microorganisms. It is manufactured as a microbial preparation by mixing 95 to 99% by weight of the microbial material and 1 to 5% by weight of galactosamine, an amino sugar based on EPS composition.
공조설비의 악취저감을 위하여 상기 미생물 제제는 0.001 내지 5중량%를 생물막을 견고하는데 도움을 주기 위해 0.1 내지 1.5중량%의 칼슘이 첨가된 멸균증류수 93.5 내지 99.899 중량%와 혼합하여 제조된 희석액을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 희석액을 압력 0.5 내지 1.3 kg/cm², 유속 0.8 내지 1.9 L/min, 분사각도 30 내지 75도 조건으로 공조설비 증발기 표면으로 분사함으로써 공조설비의 악취저감 효과를 높일 수 있다.To reduce odor from air conditioning equipment, a diluted solution prepared by mixing 0.001 to 5% by weight of the microbial preparation with 93.5 to 99.899% by weight of sterilized distilled water with 0.1 to 1.5% by weight of calcium added to help solidify the biofilm is used. It is preferable to spray the diluted solution onto the surface of the evaporator of the air conditioning facility under the conditions of a pressure of 0.5 to 1.3 kg/cm², a flow rate of 0.8 to 1.9 L/min, and a spray angle of 30 to 75 degrees, thereby increasing the odor reduction effect of the air conditioning facility.
도 2는 도 1에 우수균종선별단계를 세부적으로 나타낸 공정순서이다. 도 2에 상기 우수균종선별단계(S10)는 시료채취 및 순수배양단계(S11), 관능평가 우수균종 선별단계(S12), 저영양 생장성 우수균종 선별단계(S13), 생물막 형성능 우수균종 선별단계(S14) 및 생물막 분산도 우수균종 선별단계(S15)를 포함하는 세부단계들로 이루어진다.Figure 2 is a process sequence showing in detail the excellent bacterial strain selection step in Figure 1. In Figure 2, the excellent bacterial species selection step (S10) includes the sample collection and pure culture step (S11), the selection step of excellent bacterial species for sensory evaluation (S12), the selection step of excellent bacterial species with low nutrient growth ability (S13), and the selection step of excellent bacterial species with biofilm-forming ability. It consists of detailed steps including (S14) and a step of selecting excellent bacterial species for biofilm dispersion (S15).
상기 시료채취 및 순수배양단계(S11)는 멸균면봉을 이용하여 상기 공조설비 증발기 표면을 수 회 긁어서 시료를 채취한 후, 무균기 내에서 상기 시료를 채취한 멸균 면봉 튜브의 상단 부분과 PBS 10ml을 50ml 코니컬 튜브(conical tube)로 각각 넣고, 보텍스(Vortex)의 교반속도를 최대치로 하여 3 내지 4분간 탈리 과정 2 내지 3 회 진행하며, 1회 탈리 후에 아이스버켓(ICE bucket) 혹은 냉장고에서 1 내지 2분 간 방치하는 과정을 실시한다.In the sample collection and pure culture step (S11), a sample is collected by scraping the surface of the air conditioning equipment evaporator several times using a sterilized cotton swab, and then the upper part of the sterilized swab tube from which the sample was collected in an aseptic machine is mixed with 10 ml of PBS. Put each into a 50ml conical tube, and perform the desorption process 2 to 3 times for 3 to 4 minutes with the stirring speed of the vortex set to the maximum. After detachment once, place in an ice bucket or refrigerator for 1 time. Carry out the process of leaving it for 2 minutes.
이후, 각각의 탈리 과정을 마친 상기 PBS 용액을 원액으로 하여 고상 배양 진행을 위해 상기 무균기 내에서 원액 10ul를 취하여 고체영양배지에 각각 획선도말을 실시하여 배양기에서 28℃조건으로 3 내지 5일 배양을 실시한다. 더불어 원액 1ml을 취하여 멸균된 R2A, NA 배지 9ml을 넣어 준비한 각각의 테스트 튜브(Test tube)에 접종하여 진탕배양기에서 24 내지 28℃, 100rpm 조건으로 2 내지 5일 배양을 실시한다.Afterwards, using the PBS solution that completed each detachment process as a stock solution, 10 ul of the stock solution was taken from the sterilizer to proceed with solid-state culture, and a stroke line smear was performed on a solid nutrient medium, respectively, and incubated in the incubator at 28°C for 3 to 5 days. Carry out culture. In addition, 1 ml of the stock solution was inoculated into each test tube prepared with 9 ml of sterilized R2A and NA medium, and cultured in a shaking incubator at 24 to 28°C and 100 rpm for 2 to 5 days.
탈리 원액을 접종한 각각의 테스트 튜브 배양이 종료되면 고체영양 배지에 각각 배양액 10ul는 획선도말(Streaking)을 실시하고, 배양희석액(10ul 내지 100ul) 100ul는 평판배양(Spreading)을 실시하여 배양기에서 24 내지 28℃조건으로 2 내지 5일 동안 배양하며, 이러한 과정을 거쳐 고상/액상 배양을 실시하여 얻은 플 레이트(plate)에서 집락(Colony)의 색깔/모양 등이 다른 것을 선별한 후, 단일 균주를 얻기 위하여 백금이로 집락을 취하여 새로운 고체영양배지에 획선도말을 실시하여 순수배양을 수행한다.When the culture of each test tube inoculated with the detached stock solution is completed, 10 ul of the culture solution is streaked on a solid nutrient medium, and 100 ul of the culture dilution solution (10 ul to 100 ul) is plated and cultured in the incubator. Cultivate under conditions of 24 to 28°C for 2 to 5 days, perform solid/liquid culture through this process, select colonies of different colors/shapes from the obtained plates, and select a single strain. To obtain , colonies are collected with platinum teeth and smeared on a new solid nutrient medium to perform pure culture.
순수배양과정을 통하여 획득한 배양액 시료의 단일균주에 대해서는 우수균종을 선별하기 위한 배양액 시료용 액상배지 제조에 활용할 수 있으며, 또한, 순수배양과정을 통하여 획득한 단일 균주에 대해서는 장기보존액 제조를 위한 액상배지 제조에 활용할 수 있다.A single strain from a culture sample obtained through a pure culture process can be used to manufacture a liquid medium for culture sample to select excellent bacterial species, and a single strain obtained through a pure culture process can be used to produce a liquid medium for producing long-term storage solution. It can be used to manufacture badges.
구체적으로는 멸균기를 활용하여 121℃, 15분 간 멸균을 실시하고 순수배양을 진행한 획선도말 플레이트(Streaking plate)에서 집락을 취하여 R2A 배 지(broth)로 접종하여 진탕배양기에서 28℃, 100rpm 조건으로 3 내지 5일 동안 배양을 실시한다. 이때, 상기 장기보존액은 20% 글리세롤(glycerol)을 증류수와 부피비(v/v)로 제조하여 멸균 과정을 거쳐 사용하며, 액상 배양을 위한 R2A 배지는 500ml 삼각 플라스크에 제조되되, 상기 장기보존액 제조를 위해 무균대 내에서 배양이 완료된 삼각 플라스크에서 멸균된 1.5ml 튜브(tube)로 배양액을 1ml씩 분취하여 10,000rpm에서 30초간 원심분리를 실시하며, 무균대 내에서 상등액을 버리고, 20% 글리세롤을 1ml씩 넣고 피펫(pipet)으로 현탁하여 초저온 냉동고(-70℃)에 보관한다.Specifically, sterilization was performed at 121°C for 15 minutes using a sterilizer, colonies were taken from a streaking plate where pure culture was performed, inoculated with R2A broth, and incubated in a shaking incubator at 28°C and 100 rpm. Culture is performed for 3 to 5 days under certain conditions. At this time, the organ preservation solution is prepared with 20% glycerol in a volume ratio (v/v) of distilled water and used through a sterilization process, and the R2A medium for liquid culture is prepared in a 500 ml Erlenmeyer flask. For this purpose, 1 ml of culture fluid is aliquoted from the Erlenmeyer flask in which culture has been completed in the aseptic zone into sterilized 1.5 ml tubes, centrifuged at 10,000 rpm for 30 seconds, the supernatant is discarded in the aseptic zone, and 1 ml of 20% glycerol is added. Add it one by one, suspend it with a pipet, and store it in an ultra-low temperature freezer (-70°C).
다음으로, 상기 관능평가 우수균종 선별단계(S12)는 상기 락토바실러스 아시도필루스의 순수배양과정에서 발생하는 상기 배양액 시료의 냄새 세기를 관능 평가하여 상기 배양액 시료 내에서 우수균종을 선별하는 단계로, 단일 균주로 분리한 미생물의 배양과정에서 나타나는 냄새 세기 정도를 판단하기 위하여 관능 평가를 실시한다.Next, the step of selecting excellent bacterial species for sensory evaluation (S12) is a step of selecting excellent bacterial species within the culture medium sample by sensory evaluation of the odor intensity of the culture medium sample generated during the pure culture process of Lactobacillus acidophilus. , sensory evaluation is conducted to determine the degree of odor intensity that appears during the cultivation process of microorganisms isolated as a single strain.
이때, 액상 배지에서 발생하는 냄새 세기를 최소화하기 위해 저영양 배지의 사용량을 30 내지 75% 줄여서 배지를 제조하여 멸균을 실시하고, 상기 장기 보존액으로 제조된 상기 배양액 시료를 접종하여 진탕배양기에서 28℃의 온도조건에 100rpm으로, 3 내지 5일 동안 배양을 실시한 후, 1 내지 2차에 거쳐 10인 이상으로 구성된 관능평가단을 통하여 선별 미생물 소재가 배양과정에서 발생하는 냄새 세기를 기반으로 5점 평점법을 통하여 선별을 진행한다.At this time, in order to minimize the smell generated from the liquid medium, the medium was prepared by reducing the amount of low-nutrient medium used by 30 to 75% and sterilized, and the culture sample prepared with the long-term storage solution was inoculated and incubated in a shaking incubator at 28°C. After culturing for 3 to 5 days at 100 rpm under temperature conditions, the microbial material is selected through a sensory evaluation panel of 10 or more people in the first to second stages, and a 5-point rating method is based on the intensity of the smell generated during the culture process. Selection is carried out through .
이때, '5점 평점법'을 사용하며, 배점기준은 0점은 냄새 없음, 1점은 아주 약한 냄새(감지하기 어려운 냄새), 2점은 약한 냄새(종류 구분이 어려운 냄새) 3점은 냄새(종류 구분이 가능한 냄새), 4점은 강한 냄새, 5점은 매우 강한 냄새로 하여 진행한다.At this time, the '5-point rating method' is used, and the scoring criteria is 0 points for no odor, 1 point for a very weak odor (an odor that is difficult to detect), 2 points for a weak odor (an odor that is difficult to distinguish between types), and 3 points for an odor. (Smell that can be distinguished by type), 4 points indicate a strong odor, and 5 points indicate a very strong odor.
다음으로, 상기 저영양 생장성 우수균종선별단계(S13)는 상기 관능 평가 우수균종선별단계에서 우수균종으로 선별된 상기 배양액 시료를 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 1차 배양과정에서 이용된 상기 고체영양배지보다 20 내지 75% 감소된 고체영양배지에 1차 배양된 상기 배양액 시료 획선도말하여 1차 배양과정과 동일한 조건으로 2차 배양하며, 2차 배양된 상기 배양액 시료 내에서 가장 크게 형성된 집락(Colony)을 우수균종으로 선별하는 과정이다.Next, in the low-nutrient growth excellent bacterial species selection step (S13), the culture sample selected as an excellent bacterial species in the sensory evaluation excellent bacterial species selection step is spread on a solid nutrient medium and incubated for 2 to 5 days under conditions of 24 to 28 ° C. After primary culture, the culture sample was smeared on a solid nutrient medium reduced by 20 to 75% compared to the solid nutrient medium used in the primary culture, and secondary culture was performed under the same conditions as the primary culture. , This is a process of selecting the largest colony formed in the secondary cultured culture sample as an excellent bacterial species.
구체적으로는 상기 배양액 시료가 배양된 플레이트를 준비하고, 동일시간을 배양하였을 때 집락이 큰 것을 선별하여 새로운 고체영양배지에 집락 1개를 백금이로 취하여 획선도말을 실시하며, 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 1차 배양을 실시한 후, 영양 배지 사용량을 20 내지 75% 감소시켜서 고체영양배지를 제조하고, 상기 배양액 시료가 배양된 플레이트에서 집락을 취하여 획선도말을 실시하여 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 2차 배양을 실시한다.Specifically, a plate on which the culture sample was cultured is prepared, and when cultured for the same time, large colonies are selected, one colony is taken on a new solid nutrient medium, and a stroke line smear is performed. After conducting primary culture at 28°C for 2 to 5 days, solid nutrient medium was prepared by reducing the amount of nutrient medium used by 20 to 75%, and colonies were taken from the plate on which the culture sample was cultured and a stroke line smear was performed. Secondary culture is performed in an incubator at 24 to 28°C for 2 to 5 days.
2차 분리한 플레이트에 대하여 동일 시간 배양하였을 때 칩락이 크게 형성되는 상기 배양액 시료를 우수균종으로 선별한다.When cultured for the same time on the secondary separated plate, the culture sample in which large chip patches are formed is selected as an excellent bacterial species.
이때, 1 내지 2차 배양 과정의 2 내지 3회 반복을 통하여 향후 대량 생산으로 이어졌을 때 필요한 기초데이터를 확보함으로써, 이를 활용하여 생산성 향상을 위한 배양조건 최적화도 진행할 수 있다.At this time, by repeating the first to second culture process 2 to 3 times, basic data required for future mass production can be secured, and this can be used to optimize culture conditions to improve productivity.
다름으로 상기 생물막 형성능 우수균종 선별단계(S14)는 상기 저영양 생장성 우수균종선별단계(S13)에서 우수균종으로 선별된 상기 배양액 시료를 아미노글리코사이드계 항생제 및 베타-락탐계(β-lactam) 항생제를 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 생물막의 형성정도를 관찰하여 생물막의 형성능이 높은 상기 배양액 시료를 우수균종으로 선별하는 단계이다.Differently, in the step of selecting bacterial species with excellent biofilm-forming ability (S14), the culture sample selected as an excellent bacterial species in the step of selecting excellent bacterial species with low-nutrient growth ability (S13) is treated with aminoglycoside antibiotics and beta-lactams. This is the step of plating on a solid nutrient medium with added antibiotics and primary culturing at 24 to 28°C for 2 to 5 days, then observing the degree of biofilm formation and selecting the culture sample with high biofilm forming ability as an excellent bacterial species.
주지된 바와 같이, 상기 항생제란 특정 미생물의 생장을 저해하거나 사멸시키는 제제로 정의되며, 이 중 아미노글리코사이드계(Aminoglycoside)계 항생제의 일종인 스트렙토마이신(Streptomycin), 토브라마이신(Tobramycin), 네오마이신(Neomycin), 젠타마이신(Gentamicin) 중 하나 또는 둘 이상의 일정 농도 조합에서 배양 시, 생물막 형성에 도움을 줄 수 있다. 또한 베타-락탐계(β-lactam) 항생의 일정 농도 조건에서 배양 시, 다당류 기반의 알지네이트(alginate) 생물막이 형성된다.As is well known, the antibiotic is defined as an agent that inhibits the growth or kills specific microorganisms, and among them, Streptomycin, Tobramycin, and Neo, which are types of aminoglycoside antibiotics. When cultured in one or a combination of two or more of neomycin and gentamicin at a certain concentration, it can help form biofilm. Additionally, when cultured under conditions of a certain concentration of beta-lactam antibiotics, a polysaccharide-based alginate biofilm is formed.
따라서, 상기 생물막 형성능 우수균종 선별단계(S14)는 고체영양배지를 제조하는 과정에서 각각 아미노글리코사이드계 항생제 0.01 내지 400ug/ml과 베타-락탐계(β-lactam) 항생제 0.01 내지 400ug/m을 첨가하며, 준비된 각각의 항생제 기반 고체영양배지로 선별된 상기 배양액 시료 100ul를 도말하고, 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 배양을 실시한다.Therefore, in the step (S14) of selecting bacterial species with excellent biofilm-forming ability, 0.01 to 400 ug/ml of aminoglycoside antibiotics and 0.01 to 400 ug/m of beta-lactam antibiotics are added in the process of preparing the solid nutrient medium. Then, 100 ul of the selected culture sample was plated on each prepared antibiotic-based solid nutrient medium, and cultured in an incubator at 24 to 28°C for 2 to 5 days.
이후, CFU counting, 건조 질량(dry mass), 염색(strain)을 활용하여 생물막 형성 정도를 1차적으로 판단하며, 선별된 미생물 소재에 대하여 형광염색을 실시하고, 공초점 레이저 주사현미경(CLSM, confocal laser scanning microscopoe)을 통하여 생물막의 영양 분석을 실시하거나 미세유체채널(microfluidic channel)을 이용한 매립 생물막 모델을 통하여 겔속의 생물막을 일반 현미경으로 관찰을 통하여 생물막 형성 정도를 판별하여 생물막의 형성능이 높은 상기 배양액 시료를 우수균종으로 선별하게 된다.Afterwards, the degree of biofilm formation is primarily determined using CFU counting, dry mass, and staining, fluorescent staining is performed on the selected microbial materials, and confocal laser scanning microscopy (CLSM, confocal Nutrient analysis of the biofilm was performed through a laser scanning microscope, or the degree of biofilm formation was determined by observing the biofilm in the gel under a general microscope through an embedded biofilm model using a microfluidic channel, and the culture medium had a high biofilm formation ability. Samples are selected as excellent bacterial species.
상기 생물막 분산도 우수균종 선별단계(S15)는 상기 생물막 형성능 우수균종선별단계에서 우수균종으로 상기 배양액 시료를 숙신산염, 글루탐산염 및 포도당을 첨가한 고체영양배지에 도말하여 24 내지 28℃ 조건에서 2 내지 5일간 1차 배양한 후, 생물막의 분산정도를 관찰하여 생물막의 분산도가 높은 상기 배양액 시료를 우수균종으로 선별하는 단계이다.In the step (S15) of selecting bacterial species with excellent biofilm-forming ability, the culture sample is plated on a solid nutrient medium containing succinate, glutamate, and glucose as an excellent bacterial species in the biofilm-forming ability selection step, and incubated at 24 to 28° C. After primary culture for to 5 days, the degree of dispersion of the biofilm is observed and the culture sample with a high degree of dispersion of the biofilm is selected as an excellent bacterial species.
숙신산염(succinate), 글루탐산염(glutamate) 및 포도당(glucose)과 같은 탄소기질의 갑작스러운 가용성 증가는 생물막 분산을 유도한다는 점은 주지되어 있으며 해당과정은 이를 활용하여 우수균종을 선별하는 단계인 것이다.It is well known that a sudden increase in the availability of carbon substrates such as succinate, glutamate, and glucose induces biofilm dispersion, and glycolysis is a step in utilizing this to select superior bacterial species. .
구체적으로는 고체영양배지를 제조하는 과정에서 각각 숙신산염, 글루탐산염 및 포도당 1 내지 100mM 첨가하며, 준비된 각각의 항생제 기반 고체영양배지로 선별된 상기 배양액 시료 100ul를 도말하고, 배양기에서 24 내지 28℃, 2 내지 5일 조건으로 배양을 실시한 후, CFU counting, 건조 질량(dry mass), 염색(strain)을 활용하여 생물막 분산 정도를 1차적으로 판단하며, 이에 형광염색을 실시하고, 공초점 레이저 주사현미경(CLSM, confocal laser scanning microscopoe)을 통하여 생물막의 영양 분석을 실시하거나 미세유체채널(microfluidic channel)을 이용한 매립 생물막 모델을 통하여 겔속의 생물막을 일반 현미경으로 관찰하도록 하여 생물막 분산 정도를 판별함으로써 생물막의 분산도가 높은 상기 배양액 시료를 우수균종으로 선별하게 되는 것이다.Specifically, in the process of preparing the solid nutrient medium, 1 to 100mM of succinate, glutamate, and glucose were added, and 100ul of the selected culture sample was plated on each of the prepared antibiotic-based solid nutrient medium, and incubated at 24 to 28°C in an incubator. , After culturing under conditions of 2 to 5 days, the degree of biofilm dispersion is primarily determined using CFU counting, dry mass, and staining, followed by fluorescent staining and confocal laser scanning. Nutrient analysis of the biofilm is performed using a microscope (CLSM, confocal laser scanning microscopoe) or the biofilm in the gel is observed under a general microscope through an embedded biofilm model using a microfluidic channel to determine the degree of biofilm dispersion. The culture sample with a high degree of dispersion is selected as an excellent bacterial species.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 생물막 형성능이 우수한 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법에 따른 제조예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through production examples and experimental examples according to a method for producing a microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus with excellent biofilm forming ability according to a preferred embodiment of the present invention. do.
(제조예)(Manufacturing example)
본 발명에 따라 선별된 상기 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 미생물 제제 희석액을 제조하였다.A dilution of the microbial preparation containing the Lactobacillus acidophilus selected according to the present invention was prepared.
여기서, 상기 미생물 제제 희석액 상기 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 미생물 제제 98%(w/w), 갈락토사민 1%(w/w)와 칼슘 1%(w/w)의 배합비로 제조되었다.Here, the dilution of the microbial preparation was prepared with a mixing ratio of 98% (w/w) of the microbial preparation containing Lactobacillus acidophilus, 1% (w/w) of galactosamine, and 1% (w/w) of calcium. .
(실험예)(Experimental example)
시중에 공조설비 악치제거용 탈취제로 판매되고 있는 에탄올을 주성분으로 하는 제품 20ml과 본 발명에 따른 제조예로 제조된 상기 미생물 제제 희석액와 비교예로 준비된 시중의 악취제거용 탈취제를 공조설비 내 열교환이 일어나는 증발기(Evaporator)로 적용하였다.20 ml of a product containing ethanol as a main ingredient, which is sold commercially as a deodorant for removing bad odor in air conditioning equipment, the diluted solution of the microbial preparation prepared according to the preparation example according to the present invention, and a commercial deodorant for removing bad odor prepared as a comparative example were used to heat exchange in air conditioning equipment. It was applied as an evaporator.
경과시간과 공조설비를 냉방 모드로 설정한 후 발생되는 기체는 펌프(SIBATA, MP-30N)를 활용하여 5L 알루미늄 폴리에스터백으로 기체 시료를 채취하여 휴대용 휘발성 유기화합물검출기(TESTAUCTION, SKT1050)를 이용하여 측정한 후 비교한 결과는 표 1과 같다.After setting the elapsed time and air conditioning equipment to cooling mode, the gas generated is collected using a pump (SIBATA, MP-30N), a gas sample is collected in a 5L aluminum polyester bag, and a portable volatile organic compound detector (TESTAUCTION, SKT1050) is used. The results of the measurement and comparison are shown in Table 1.
표 1과 같이 제조예와 비교예를 비교하였을 때, 처리 후 1개월이 경과함에 따라 제조예의 지속력이 비교예의 지속력보다 월등히 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.When comparing the Preparation Example and the Comparative Example as shown in Table 1, it was confirmed that the durability of the Preparation Example was significantly superior to that of the Comparative Example one month after treatment.
특히 1개월이 지난 시점부터 비교예의 악취 저감 성능이 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며, 그에 반해 제조예예는 미생물 소재의 생물막(Biofilm) 형성을 통한 우점으로 악취 저감 효과를 기대하기에 처리 직후에는 비교예보다 낮은 악취 저감율을 보이나 1개월이 경과되는 시점부터 비교예보다 높은 악취 저감 효과를 보이는 동시에 6개월까지 꾸준히 유지되는 것을 확인하였다.In particular, it was confirmed that the odor reduction performance of the comparative example was significantly lowered after 1 month. In contrast, the manufacturing example was expected to have an odor reduction effect due to the formation of a biofilm of microbial material, so the comparative example was used immediately after treatment. Although it showed a lower odor reduction rate, it was confirmed that after 1 month, it showed a higher odor reduction effect than the comparative example and was consistently maintained for 6 months.
더불어 처리 시기 별로 공조설비 증발기 시편을 샘플링하고, 미생물 군집을 조사한 결과 비교예는 악취 저감율이 감소하는 동시에 미생물 개수 체가 증가하는 양상을 나타내는 반해 제조예는 처리한 미생물 소재 수를 유의미하게 상회하지 않는 선에서 미생물 개체 수가 유지되었으며 악취 저감율은 증가하는 양상을 나타내었다.In addition, as a result of sampling air conditioning equipment evaporator specimens by treatment period and examining the microbial community, the comparative example showed a decrease in the odor reduction rate and an increase in the number of microorganisms, while the manufacturing example did not significantly exceed the number of treated microbial materials. The population of microorganisms was maintained and the odor reduction rate showed an increase.
따라서, 이를 통해 본 발명에 따른 락토바실러스 아시도필루스를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제가 우점을 차지하여 악취를 유발하는 곰팡이나 세균의 증식을 저감시키고 결과적으로 악취를 저감시키는 효과를 가지는 것을 알 수 있다.Therefore, through this, the microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus according to the present invention dominates, reducing the growth of mold or bacteria that cause odor, and consequently having the effect of reducing odor. You can see that
이상과 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.Although embodiments of the present invention have been described with reference to the above and the attached drawings, those skilled in the art will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical idea or essential features. You will understand that it exists. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive.
S10 : 우수균종선별단계
S20 : 배양시드제조단계
S30 : 대량생산단계
S40 : 균체회수단계
S50 : 동결건조단계
S60 : 동결원료화단계S10: Excellent bacterial species selection stage
S20: Culture seed manufacturing step
S30: Mass production stage
S40: Cell recovery step
S50: Freeze drying step
S60: Freezing raw material stage
Claims (2)
락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus, 기탁번호 KCTC11906BP)를 영양배지에서 배양하여 배양시드를 제조하는 배양시드제조단계;
상기 배양시드를 발효기로 접종하여 본배양을 통해 배양액을 대량으로 제조하는 대량생산단계;
원심분리기를 이용하여 상기 대량생산단계에서 수득한 상기 락토바실러스 아시도필루스 배양액에서 락토바실러스 아시도필루스 균체를 회수하는 균체회수단계;
상기 균체회수단계에서 회수된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 700mtorr 압력 조건에서 -65 내지 -70℃에서부터 5 내지 10℃ 간격으로 승온시키며 일정 시간동안 동결건조시키는 동결건조단계; 및
상기 동결건조단계를 통해 동결건조된 상기 락토바실러스 아시도필루스 균체를 1 내지 3mm의 입도를 갖도록 분쇄하여 미생물소재를 형성하며, 상기 미생물소재 95 내지 99 중량%와 갈락토사민 1 내지 5 중량%을 혼합하여 미생물 제제를 제조하는 동결원료화단계;를 포함하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법.In the manufacturing method of a microbial preparation for reducing odor in air conditioning equipment containing Lactobacillus acidophilus with excellent biofilm forming ability,
A culture seed preparation step of producing culture seeds by culturing Lactobacillus acidophilus (Accession No. KCTC11906BP) in a nutrient medium;
A mass production step of inoculating the culture seed into a fermenter and producing a large amount of culture medium through main culture;
A cell recovery step of recovering Lactobacillus acidophilus cells from the Lactobacillus acidophilus culture solution obtained in the mass production step using a centrifuge;
A freeze-drying step of freeze-drying the Lactobacillus acidophilus cells recovered in the cell recovery step for a certain period of time while raising the temperature from -65 to -70°C at intervals of 5 to 10°C under 700 mtorr pressure conditions; and
The Lactobacillus acidophilus cells freeze-dried through the freeze-drying step are pulverized to have a particle size of 1 to 3 mm to form a microbial material, containing 95 to 99% by weight of the microbial material and 1 to 5% by weight of galactosamine. A method for manufacturing a microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment, comprising a frozen raw material mixing step to produce a microbial agent.
상기 락토바실러스 아시도필루스를 영양배지에 순수배양하여 생성한 배양액 시료에 대하여 관능 평가, 저영양 평가, 생물막 형성능 평가 및 생물막 분산도 평가를 통해 우수균종을 선별하는 우수균종 선별 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공조설비 악취저감용 미생물 제제의 제조방법.According to clause 1,
It further includes a selection step of selecting excellent bacterial species through sensory evaluation, low-nutrition evaluation, biofilm-forming ability evaluation, and biofilm dispersion evaluation for the culture sample produced by pure culturing the Lactobacillus acidophilus on a nutrient medium. A method for producing a microbial agent for reducing odor in air conditioning equipment, characterized in that:
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| KR102015472B1 (en) | 2019-04-23 | 2019-08-28 | 장지원 | Manufacturing method for environment-friendly deodorant and environment-friendly deodorant manufactured by the same |
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2022
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