KR20230135577A - 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 미토콘드리아가 풍부화된 세포가 질환 및 장애를 치료하는 데 유용하다는 발견에 기초한다. 본 발명은 외인성 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별 또는 검출하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 또는 검출은 트립타민과 같은 기질의 이용도에 의해 측정된다. 이는 모노아민 산화효소 A(MAO-A), 모노아민 산화효소 B(MAO-B), 글리세롤-3-인산 탈수소효소 또는 이들의 조합의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 또는 검출을 위한 키트를 제공한다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라 2021년 1월 25일에 제출된 미국 임시 출원 제63/141,361호의 이익을 주장한다. 상기 선행 출원의 개시내용은 본 출원의 개시내용의 일부로 간주되며 그 전체가 본 출원의 개시내용에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로, 미토콘드리아가 풍부화된 세포, 보다 구체적으로는, 미토콘드리아-풍부화된 세포를 식별하는 방법에 관한 것이다.
미토콘드리아의 주요 기능은 전자 수송 사슬과 산화-인산화 시스템("호흡 사슬")을 통해 아데노신 삼인산(ATP)으로서의 에너지를 생성하는 것이다. 또한, 미토콘드리아는 진핵 세포에서 피루베이트 산화, 크렙스 회로(Krebs cycle) 및 아미노산, 지방산 및 스테로이드의 대사와 같은 수많은 필수 작업을 수행한다. 미토콘드리아가 관련된 추가적인 과정은 열 생성, 칼슘 이온 저장, 칼슘 신호전달, 세포 예정사(세포자멸사) 및 세포 증식을 포함한다.
세포 내부의 ATP 농도는 일반적으로 1 내지 10 mM이다. ATP는 단당류와 복합 당류(탄수화물) 또는 지질을 에너지원으로 사용하는 산화환원 반응에 의해 생성될 수 있다. 복합 연료가 ATP로 합성되기 위해서는, 이들은 먼저 더 작고 단순한 분자로 분해되어야 한다. 복합 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 단당류로 가수분해된다. 지방(트리글리세리드)은 대사되어 지방산과 글리세롤을 생성한다.
포도당을 이산화탄소로 산화시키는 전체 과정은 세포 호흡으로 알려져 있으며 단일 포도당 분자에서 약 30 분자의 ATP를 생성할 수 있다. ATP는 다양한 별개의 세포 과정에 의해 생성될 수 있다. 진핵 유기체에서 에너지를 생성하는 데 사용되는 세 가지 주요 경로는 세포 호흡의 두 구성 요소인 해당 작용 및 구연산 회로/산화적 인산화, 및 베타 산화이다. 비광합성 진핵생물에 의한 이 ATP 생성의 대부분은 미토콘드리아에서 일어나며, 미토콘드리아는 전형적인 세포의 총 부피의 거의 25%를 차지할 수 있다.
숙주 세포 또는 조직으로의 미토콘드리아의 전달을 유도하려는 시도가 보고되어 왔다. 대부분의 방법은 주입에 의한 미토콘드리아의 능동적 전달이 필요하다. 리포솜과 같은 비히클로 둘러싸인 미토콘드리아의 전달 또한 알려져 있다. mtDNA 전달은 시험관 내에서 세포 간에 자발적으로 발생할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 미토콘드리아 전달은 세포내이입 또는 내재화에 의해 시험관 내에서 입증되었다.
미토콘드리아-풍부화된 세포는 질환 및 장애, 특히 미토콘드리아 관련 장애를 치료하는 데 유용한 것으로 나타났다. 따라서, 외인성 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별 또는 검출하는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 외인성 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별 또는 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 또는 검출을 위한 키트를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은, 세포를 대사 기질과 접촉시키고 상기 대사 기질과의 접촉 후에 상기 세포 내의 전자 전달을 측정함으로써, 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아로 풍부화된다. 특정 양태에서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 다양한 양태에서, 상기 세포는 CD34+ 세포이다. 일 양태에서, 상기 대사 기질은 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4, 숙시네이트, 또는 이들의 조합이다. 추가적인 양태에서, 트립타민을 이용하는 효소는 미토콘드리아 내에 위치하거나 미토콘드리아 막에 결합된다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 상기 세포를 외인성 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화된다. 일 양태에서, 비색 분석은 흡광도에 의해 측정되며, 증가된 흡광도는 세포가 풍부화되었음을 나타낸다. 추가적인 양태에서, 상기 세포를 상기 대사 기질과 접촉시키는 단계는 NADH 및/또는 FADH2를 생성한다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은, 세포 내의 모노아민 산화효소 A(MAO-A: monoamine oxidase A) 및/또는 모노아민 산화효소 B(MAO-B)의 수준을 측정함으로써 세포의 태반 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 태반 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 MAO-A 및/또는 MAO-B를 갖는다. 일 양태에서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 양태에서, 상기 세포는 CD34+ 세포이다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 상기 세포를 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화된다. 추가적인 양태에서, 상기 MAO-A 및/또는 MAO-B 수준은 질량 분광법에 의해 측정된다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은, 미토콘드리아 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준을 측정함으로써 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 미토콘드리아 글리세롤-3-인산 탈수소효소를 갖는다. 일 양태에서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 다양한 양태에서, 상기 세포는 CD34+ 세포이다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 상기 세포를 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화된다. 다양한 양태에서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아로 풍부화된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 대사 기질 및 사용 지침을 갖는, 외인성 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별하기 위한 키트를 제공한다. 일 양태에서, 상기 기질은 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4 또는 이들의 조합이다. 추가적인 양태에서, 미토콘드리아는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아이다.
일 실시형태에서, 본 발명은, 비색 분석에 의해, 세포를 대사 기질과 접촉시킨 후의 미토콘드리아 풍부화를 측정하고/거나, 세포 내의 모노아민 산화효소 A(MAO-A) 및/또는 모노아민 산화효소 B(MAO-B)의 수준을 측정하고/거나, 세포 내의 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준을 측정함으로써 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 모노아민 산화효소 A(MAO-A), 모노아민 산화효소 B(MAO-B) 및/또는 글리세롤-3-인산 탈수소효소 각각을 갖고, 상기 비색 분석은 흡광도에 의해 측정되고, 흡광도의 증가는 미토콘드리아 풍부화를 나타낸다.
도 1은 트립타민 산화 반응의 개략도이다.
도 2는 인돌-3-아세트알데히드의 형성을 위한 반응의 개략도이다.
도 3a 내지 도 3f는 단리된 미토콘드리아에 의한 기질 이용도를 나타낸다. Y축은 흡광도 값에서 배경 값을 차감함으로써 계산된 델타 OD이다. 도 3a: 구연산. 도 3b: D,L-이소구연산. 도 3c: 시스-아코니트산. 도 3d: 숙신산. 도 3e: 트립타민. 도 3f: D,L-a-글리세롤-PO4.
도 4a 내지 도 4e는 미토콘드리아가 풍부화된 세포에 의한 기질 이용도를 나타낸다. Y축은 흡광도 값에서 배경 값을 차감함으로써 계산된 델타 OD이다. 도 4a: 트립타민. 도 4b: D,L-a-글리세롤-PO4. 도 4c: 구연산. 도 4d: D,L-이소구연산. 도 4e: 시스-아코니트산.
도 5는 트립타민 이용도를 나타낸다. Y축은 흡광도 값에서 배경 값을 차감함으로써 계산된 델타 OD이다.
도 6a 내지 도 6c는 태반 미토콘드리아가 증강된 KG1a, LCL 및 CD34+ 세포의 산소 소비율(OCR: oxygen consumption rate)을 나타내는 그래프이다. 도 6a: 복합체 I 및 복합체 II의 기질을 사용하여 측정된 태반 미토콘드리아가 증강된 KG1a 세포의 OCR을 나타내는 그래프이다. 도 6b: 복합체 I 및 복합체 II의 기질을 사용하여 측정된 태반 미토콘드리아가 증강된 LCL 세포의 OCR을 나타내는 그래프이다. 도 6c: 복합체 I의 기질을 사용하여 측정된 태반 미토콘드리아가 증강된 CD34+ 세포의 OCR을 나타내는 그래프이다.
도 7은 단리된 미토콘드리아에 의한 트립타민 이용도를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 숙시네이트 이용도를 나타낸다. 도 8a: MitoPlate(Biolog)에 의해 분석된, 태반 유래 미토콘드리아-숙시네이트 이용 활성 및 혈액 유래 미토콘드리아-숙시네이트 이용 활성을 나타낸다. 도 8b: 50M개의 혈액 유래 미토콘드리아 입자의 배경에 첨가된 증가하는 양의 태반 유래 미토콘드리아 입자(750k개 내지 35M개)에서의 숙시네이트 이용 활성을 나타낸다.
도 2는 인돌-3-아세트알데히드의 형성을 위한 반응의 개략도이다.
도 3a 내지 도 3f는 단리된 미토콘드리아에 의한 기질 이용도를 나타낸다. Y축은 흡광도 값에서 배경 값을 차감함으로써 계산된 델타 OD이다. 도 3a: 구연산. 도 3b: D,L-이소구연산. 도 3c: 시스-아코니트산. 도 3d: 숙신산. 도 3e: 트립타민. 도 3f: D,L-a-글리세롤-PO4.
도 4a 내지 도 4e는 미토콘드리아가 풍부화된 세포에 의한 기질 이용도를 나타낸다. Y축은 흡광도 값에서 배경 값을 차감함으로써 계산된 델타 OD이다. 도 4a: 트립타민. 도 4b: D,L-a-글리세롤-PO4. 도 4c: 구연산. 도 4d: D,L-이소구연산. 도 4e: 시스-아코니트산.
도 5는 트립타민 이용도를 나타낸다. Y축은 흡광도 값에서 배경 값을 차감함으로써 계산된 델타 OD이다.
도 6a 내지 도 6c는 태반 미토콘드리아가 증강된 KG1a, LCL 및 CD34+ 세포의 산소 소비율(OCR: oxygen consumption rate)을 나타내는 그래프이다. 도 6a: 복합체 I 및 복합체 II의 기질을 사용하여 측정된 태반 미토콘드리아가 증강된 KG1a 세포의 OCR을 나타내는 그래프이다. 도 6b: 복합체 I 및 복합체 II의 기질을 사용하여 측정된 태반 미토콘드리아가 증강된 LCL 세포의 OCR을 나타내는 그래프이다. 도 6c: 복합체 I의 기질을 사용하여 측정된 태반 미토콘드리아가 증강된 CD34+ 세포의 OCR을 나타내는 그래프이다.
도 7은 단리된 미토콘드리아에 의한 트립타민 이용도를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 숙시네이트 이용도를 나타낸다. 도 8a: MitoPlate(Biolog)에 의해 분석된, 태반 유래 미토콘드리아-숙시네이트 이용 활성 및 혈액 유래 미토콘드리아-숙시네이트 이용 활성을 나타낸다. 도 8b: 50M개의 혈액 유래 미토콘드리아 입자의 배경에 첨가된 증가하는 양의 태반 유래 미토콘드리아 입자(750k개 내지 35M개)에서의 숙시네이트 이용 활성을 나타낸다.
본 발명은 외인성 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별 또는 검출하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 또는 검출은 기질의 이용도를 측정함에 의한 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 또는 검출은 효소의 수준을 측정함에 의한 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 상기 기질은 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4, 숙시네이트, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에 따르면, 모노아민 산화효소 A(MAO-A), 모노아민 산화효소-B(MAO-B) 또는 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준이 측정된다. 본 발명은 또한 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 또는 검출을 위한 키트를 제공한다.
본 조성물 및 방법을 설명하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 조성물, 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 이러한 조성물, 방법 및 조건은 변화할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위로만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시형태를 기술하기 위한 목적일 뿐이며 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용될 때, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "상기 방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법 및/또는 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백해질 본원에 기술된 유형의 단계 등을 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 수정 및 변형이 본 개시내용의 사상 및 범위 내에 포함됨이 이해될 것이다. 이제 바람직한 방법 및 물질에 대해 기술할 것이다.
본 발명은, 줄기 세포 및 골수 세포는 온전한 외인성 미토콘드리아로 풍부화되는 것에 대해 수용적이며, 인간 골수 세포는, 예를 들어 국제공개 WO 2016/135723호에 개시된 바와 같이, 미토콘드리아로 풍부화되는 것에 대해 특히 수용적이라는 발견에 부분적으로 기초한다. 임의의 이론 또는 메카니즘에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 외인성 미토콘드리아와 세포의 공동 인큐베이션은 세포로의 미토콘드리아의 전이를 촉진한다고 가정된다. 구체적으로, 외인성 미토콘드리아와 줄기 세포 또는 골수 세포의 공동 인큐베이션은 줄기 세포 또는 골수 세포로의 미토콘드리아의 전이를 촉진한다.
본 발명은 미토콘드리아-풍부화된 세포의 식별 또는 검출을 위한 방법 및 키트를 제공한다.
미토콘드리아는 세포의 에너지 생성에 중요한 역할을 한다. 세포 내의 미토콘드리아의 양과 구조가 변할 수 있기 때문에, 이들 세포 기관이 역동적이라는 것은 분명하다. 미토콘드리아는 1,000개 이상의 단백질로 구성되어 복잡하며, 이의 대부분은 미토콘드리아 DNA가 아닌 핵에 의해 암호화된다. 단백질 외에도, 미토콘드리아는 특수한 막들을 가지며, 이들은 서로 상호 작용할 수 있고 소포체와 같은 다른 세포 기관과도 상호 작용할 수 있다.
세포 내의 미토콘드리아 함량이 증가하면 구연산 합성효소(CS: 구연산 합성효소) 활성 수준 또는 CoxI 양이 증가하기 때문에, 미토콘드리아 증강을 확인하기 위한 현재의 솔루션은 이들 매개변수의 수준의 상대적 증가를 정량화하는 데 기반한다.
이들 방법을 사용할 때의 단점 중 하나는, 이들은, 세포 내의 미토콘드리아 발현 증가가 외인성 미토콘드리아가 세포에 유입되었기 때문인지 또는 (예를 들어 증강 동안 세포가 받는 스트레스로 인한) 내인성 미토콘드리아 발현 증가와 같은 다른 이유 때문인지를 결정하기 위해 다른 방법과 독립적으로 사용될 수 없다는 것이다.
또한, 현재 이용 가능한 방법은 발현의 상대적인 변화를 기반으로 하므로, 처리된 세포에서의 CS 활성 수준 또는 CoxI 양의 증가가 있었는지를 측정하기 위해 처리되지 않은 세포를 대조군으로 가져야 한다.
본 발명은 트립타민 이용도를 검출하기 위한 분석이 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별하는 데 사용될 수 있음을 입증한다. 특정 양태에서, MAO의 존재 및/또는 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준이 측정된다. 이들 반응의 구성 요소를 측정하는 것은, 세포가 외인성 미토콘드리아로 풍부화되었는지 여부를 측정하는 신규한 방법을 제공한다.
트립타민은 인돌 고리 구조를 갖는 모노아민 알칼로이드이다. 트립타민을 수반하는 몇 가지 반응이 존재한다. 트립타민 생합성은 일반적으로 전구체 아미노산 트립토판에서 시작된다. 트립타민 산화는 도 1에 도시되어 있다. 이 반응은 두 가지 다른 효소, 즉 모노아민 산화효소(MAO) 또는 아밀로라이드 민감성 아민 산화효소(AOC1: amiloride-sensitive amine oxidase)에 의해 촉매될 수 있다. MAO에는 두 가지 형태, 즉, MAO-A 및 MAO-B가 존재한다. MAO-A는 도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌과 같은 아민의 산화적 탈아미노화를 촉매하는 효소이다. MAO-A는 주로 미토콘드리아의 외막에 위치하지만 시토졸에서도 발견된다. MAO-B는 생체 및 생체이물 아민의 산화적 탈아미노화를 촉매하고 중추 신경계 및 말초 조직(예를 들어 도파민)에서의 신경활성 및 혈관활성 아민의 이화작용에서 중요한 역할을 하며, 벤질아민 및 페네틸아민을 우선적으로 분해한다. MAO-B는 미토콘드리아의 외막에 위치한다. MAO-A와 MAO-B는 둘 모두 다양한 조직에 위치하며, 태반에 높은 수준으로 위치한다. AOC1은 푸트레신, 히스타민, 스페르민, 스페르미딘과 같은 화합물, 알러지 및 면역 반응, 세포 증식, 조직 분화, 종양 형성 및 아마도 세포자멸사에 관여하는 물질의 분해를 촉매한다. AOC1은 퍼옥시좀, 원형질 막, 세포외 영역에 위치하거나 또는 분비된다. AOC1은 다양한 조직에 위치하며, 태반에서는 상대적으로 중간 수준의 발현 수준을 갖는다.
또 다른 반응에서, 트립타민 산화 반응(반응 I)의 일부로서 형성된 인돌-3-아세트알데히드는 알데히드 탈수소효소(NAD+) 계열의 효소(ALDH2(미토콘드리아 효소), ALDH1B1(미토콘드리아 효소), ALDH9A1, ALDH3A2, ALDH7A1)에 의해 추가로 촉매되어 NADH를 형성한다(도 2). NAD+ 계열의 효소 중 일부는 미토콘드리아 기질 효소이고 일부는 세포질 효소이다.
트립타민을 수반하는 다른 반응은 메틸화 및 아세틸화이다. 메틸화는 인돌에틸아민 N-메틸전달효소(INMT: indolethylamine N-methyltrnasferase)에 의해 촉매된다. 아세틸화는 아르알킬아민 N-아세틸전달효소(AANAT: aralkylamine N-acetyltransferase)에 의해 촉매된다. 이들 반응 및 이들 반응의 생성물을 수반하는 직접적인 다운스트림 반응은 NAD+ 또는 FAD+를 생성하지 않는다.
미토콘드리아 글리세롤-3-인산 탈수소효소는, FAD+를 환원시켜 FADH2를 형성하는 것과 함께 글리세롤 3-인산(일명 D,L-글리세롤-PO4)을 디히드록시아세톤 인산(일명 글리세론 인산(구식 표기))으로 전환하는 것을 촉매하는 효소이다.
일 실시형태에서, 본 발명은, 세포를 대사 기질과 접촉시키고 상기 대사 기질과의 접촉 후에 상기 세포 내의 전자 전달을 측정함으로써, 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 전자 전달을 측정하는 단계는 비색 분석, 형광 분석, 발광 분석 또는 산소 소비에 의한 것이다. 일 양태에서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아로 풍부화된다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아로 풍부화된다. 특정 양태에서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 다양한 양태에서, 상기 세포는 CD34+ 세포이다. 일 양태에서, 상기 대사 기질은 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4, 숙시네이트, 또는 이들의 조합이다. 특정 양태에서, 상기 대사 기질은 트립타민이다. 특정 양태에서, 상기 대사 기질은 숙시네이트이다. 추가적인 양태에서, 트립타민을 이용하는 효소는 미토콘드리아 내에 위치하거나 미토콘드리아 막에 결합된다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 상기 세포를 외인성 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화되었다. 일 양태에서, 비색 분석은 흡광도에 의해 측정되며, 증가된 흡광도는 세포가 풍부화되었음을 나타낸다. 추가적인 양태에서, 상기 세포를 상기 대사 기질과 접촉시키는 단계는 NADH 및/또는 FADH2를 생성한다.
일 양태에서, 단리된 표적 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 추가적인 양태에서, 상기 단리된 세포는 CD34+이다.
본원에서 사용되는, 용어 "풍부화" 또는 "증강"은 상호 교환적으로 사용되며, 미토콘드리아 함량, 예를 들어 온전한 미토콘드리아의 수 또는 포유동물 세포의 미토콘드리아의 기능을 증가시키도록 고안된 임의의 작용을 지칭한다. 특정 양태에서, 외인성 미토콘드리아가 풍부한 표적 세포는 풍부화 전의 동일한 표적 세포와 비교하여 향상된 기능을 나타낼 것이다.
본원에서 사용되는, 용어 "표적 세포"는 외인성 미토콘드리아로 풍부화되었거나 풍부화될 세포이다. 다양한 양태에서, 상기 표적 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포이다. 구체적으로, 표적 세포는 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 공통 골수 전구 세포, 공통 림프 전구 세포, CD34+ 세포 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "줄기 세포"는 일반적으로, 임의의 포유동물 줄기 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 다른 유형의 세포로 분화할 수 있고 동일한 유형의 줄기 세포를 더 많이 생성하기 위해 분열할 수 있는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 전능성 또는 만능성일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "인간 줄기 세포"는 일반적으로, 인간에서 자연적으로 발견되는 모든 줄기 세포, 및 생체 외에서 생성되거나 유래되고 인간과 상용성인 모든 줄기 세포를 지칭한다. 일부 양태에서, 상기 인간 줄기 세포는 자가 세포이다. 일부 양태에서, 상기 인간 줄기 세포는 동종이계 세포이다. "전구 세포"는 줄기 세포와 마찬가지로 특정 유형의 세포로 분화하는 경향이 있지만, 줄기 세포보다 더 특이적이며, "표적" 세포로 분화하도록 강요된다. 줄기 세포와 전구 세포의 가장 중요한 차이점은 줄기 세포는 무한히 복제될 수 있는 반면 전구 세포는 제한된 횟수로만 분열할 수 있다는 것이다. 본원에서 사용되는, 용어 "인간 줄기 세포"는 "전구 세포" 및 "완전히 분화되지 않은 줄기 세포"를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 만능 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)이다. 일부 양태에서, 상기 줄기 세포는 유도 PSC(iPSC: induced PSC)이다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 골수 세포로부터 유래된다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34+ 세포이다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 다른 양태에서, 상기 줄기 세포는 지방 조직으로부터 유래된다. 다른 양태에서, 상기 줄기 세포는 혈액으로부터 유래된다. 추가적인 양태에서, 상기 줄기 세포는 제대혈로부터 유래된다. 추가적인 양태에서, 상기 줄기 세포는 구강 점막으로부터 유래된다. 특정 양태에서, 질환이나 장애를 앓고 있는 환자 또는 건강한 대상체로부터 획득된 줄기 세포는 골수 세포 또는 골수 유래 줄기 세포이다.
본원에서 사용되는, 용어 "만능 줄기 세포(PSC)"는 무한히 증식할 수 있을 뿐만 아니라 체내에서 복수의 세포 유형을 생성할 수 있는 세포를 지칭한다. 전능 줄기 세포는 체내에서 다른 모든 세포 유형을 생성할 수 있는 세포이다. 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell)는 전능 줄기세포이고 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 만능 줄기 세포이다.
본원에서 사용되는, 용어 "유도 만능 줄기 세포(iPSC)"는 인간 성체 체세포로부터 생성될 수 있는 일종의 만능 줄기 세포를 지칭한다. 본원에서 iPSC가 생성될 수 있는 체세포의 일부 비제한적인 예는 섬유모세포, 내피 세포, 모세혈액 세포, 각질형성세포, 골수 세포 상피 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell)"는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 일종의 전능 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "골수 세포"는 일반적으로, 인간의 골수에서 자연적으로 발견되는 모든 인간 세포 및 인간의 골수에서 자연적으로 발견되는 모든 세포 집단을 지칭한다. 용어 "골수 줄기 세포" 및 "골수 유래 줄기 세포"는 골수로부터 유래된 줄기 세포 집단을 지칭한다.
일부 양태에서, 상기 표적 세포는 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 공통 골수 전구 세포, 공통 림프 전구 세포, CD34+ 세포 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 자가 또는 동종이계 인간 줄기 세포는 만능 줄기 세포(PSC) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 추가적인 양태에서, 상기 자가 또는 동종이계 인간 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다.
여러 양태에 따르면, 상기 인간 줄기 세포는 지방 조직, 구강 점막, 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래된다. 특정 양태에서, 상기 인간 줄기 세포는 골수로부터 유래된다.
특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 골수 조혈 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "골수 조혈 세포"는 골수 형성에 관여하는, 예를 들어 골수 및 골수로부터 발생하는 모든 세포, 즉 모든 혈액 세포의 생성에 관여하는 세포를 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 적혈구 생성 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "적혈구 생성 세포"는 적혈구 생성에 관여하는, 예를 들어 적혈구(적혈구)의 생성에 관여하는 세포를 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 다능성 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "다능성 조혈 줄기 세포" 또는 "혈구모세포"는 조혈 과정을 통해 다른 모든 혈액 세포를 발생시키는 줄기 세포를 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 공통 골수 전구 세포, 공통 림프 전구 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "공통 골수 전구체"는 골수 세포를 생성하는 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "공통 림프 전구체"는 림프구를 생성하는 세포를 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는, 용어 "중간엽 줄기세포"는 골모세포, 연골세포, 근육세포 및 지방세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 간질 세포를 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 골수 조혈 세포를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 적혈구 생성 세포로 구성된다. 특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 다능성 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 공통 골수 전구 세포, 공통 림프 전구 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포로 구성된다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 말초 혈액으로부터 획득된 복수의 인간 골수 줄기 세포를 포함한다.
CD34 항원으로도 알려진 조혈 전구 세포 항원 CD34는 인간에서 CD34 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. CD34는 세포 표면 당단백질의 분화 클러스터이며 세포-세포 접착 인자로 기능한다. 특정 양태에서, 상기 골수 줄기 세포는 골수 전구 세포 항원 CD34를 발현한다(CD34+임). 특정 양태에서, 상기 골수 줄기 세포는 골수 전구 세포 항원 CD34를 이들의 외막에 제시한다. 특정 양태에서, 상기 CD34+ 세포는 제대혈로부터 유래한다.
본원에서 사용되는, 용어 "CD34+ 세포"는, 그 기원에 관계없이, CD34 양성인 것으로 특성화되는 조혈 줄기 세포를 지칭한다. 특정 양태에서, 상기 CD34+ 세포는 골수로부터, 혈액으로 동원된 골수 세포로부터, 또는 제대혈로부터 획득된다.
본원에서 사용되는, 어구 "장애를 앓고 있는 대상체로부터 또는 장애를 앓고 있지 않는 공여자로부터 획득된 줄기 세포"는 상기 대상체로부터의 단리 시점에 상기 대상체/공여자에서 줄기 세포였던 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 문구 "장애를 앓고 있는 대상체로부터 유래된 줄기 세포" 또는 "장애를 앓고 있지 않는 공여자로부터"는, 상기 대상체/공여자에서 줄기 세포가 아니었으며 줄기 세포가 되도록 조작된 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "조작된"은 체세포를 미분화 상태 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)가 되도록 재프로그래밍하고, 선택적으로 상기 iPSC를 원하는 계통 또는 집단의 세포, 예를 들어 골수 세포(문헌[Xu Y. et al., PLoS ONE, 2012, Vol. 7(4), page e3432l])가 되도록 추가로 재프로그래밍하기 위한(문헌[Chen M. et al., IOVS, 2010, Vol. 51(11), pages 5970-5978]) 해당 분야에 알려진 방법(문헌[Yu J. et al., Science, 2007, Vol. 318(5858), pages 1917-1920]) 중 어느 하나를 사용하는 것을 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체로부터 직접 유래된다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 공여자로부터 직접 유래된다. 본원에서 사용되는, 용어 "직접 유래된"은 다른 세포로부터 직접 유래된 줄기 세포를 지칭한다. 특정 양태에서, 상기 조혈 줄기 세포(HSC)는 골수 세포로부터 유래되었다. 특정 양태에서, 상기 조혈 줄기 세포(HSC)는 말초 혈액으로부터 유래되었다.
특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체로부터 간접적으로 유래된다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 공여자로부터 간접적으로 유래된다. 본원에서 사용되는, 용어 "간접적으로 유래된"은 비-줄기 세포로부터 유래된 줄기 세포를 지칭한다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)가 되도록 조작된 체세포로부터 유래되었다.
일부 양태에서, 상기 표적 세포는 전혈, 혈액 분획, 말초 혈액, PBMC, 혈청, 혈장, 지방 조직, 구강 점막, 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 획득된다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 골수로부터 직접 획득된다. 특정 양태에서, 상기 줄기 세포는 공여자의 골수로부터 직접 획득된다. 본원에서 사용되는, 용어 "직접 획득된"은 골수 자체로부터, 예를 들어 수술 또는 주사기에 의한 바늘을 통한 흡인과 같은 수단에 의해, 획득된 줄기 세포를 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 표적 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자의 골수로부터 간접적으로 획득된다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포는 공여자의 골수로부터 간접적으로 획득된다. 본원에서 사용되는, 용어 "간접적으로 획득된"은 골수 자체 이외의 위치로부터 획득된 골수 세포를 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 표적 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 말초 혈액으로부터 획득된다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포는 건강한 공여자 또는 대상체의 말초 혈액으로부터 획득된다. 본원에서 사용되는, 용어 "말초 혈액"은 혈관계에서 순환하는 혈액을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "자가 세포" 또는 "자가인 세포"는 상호 교환적으로 사용되며 환자 자신의 세포를 지칭한다.
추가적인 양태에서, 상기 단리된 표적 세포는 유전적으로 변형된 세포이다. 특정 양태에서, 상기 유전적으로 변형된 세포는 T-세포이다. 특정 양태에서, 상기 유전적으로 변형된 세포는 T-세포 수용체(TCR: T-cell receptor) 또는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)-형질도입된 T 세포이다.
본원에서 사용되는, 용어 "림프구"는 질환으로부터 신체를 방어하는 데 중요한 역할을 하는 백혈구를 지칭하며, T-세포, 자연 살해 세포(NK 세포), B-세포 및 이들의 혼합물을 포함한다. 상기에 나열된 면역 세포 유형은 추가적인 하위 집합으로 나뉠 수 있다. 일부 양태에서, 상기 림프구는 성숙한 림프구이다. 일부 양태에서, 상기 림프구는 유전적으로 변형되지 않은 림프구이다. 다른 양태에서, 상기 림프구는 유전적으로 변형된 림프구이다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. T 세포는 다양한 면역 관련 기능을 제공함으로써 면역 반응을 조절하고 형성하는 데 중요한 역할을 하는 특정 유형의 림프구이다. T 세포는 세포 표면 상의 T-세포 수용체 (TCR)의 존재에 의해 다른 림프구와 구별될 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "T 세포"는 세포독성 T 세포, 보조 T 세포, 조절 T 세포 및 자연 살해 T 세포(NKT)를 포함한다. 일부 양태에 따르면, 상기 T 세포는 T 세포 전구체이다. 다른 양태에 따르면, 상기 T 세포는 성숙한 T 세포이다. 일부 양태에 따르면, 상기 T 세포는 완전히 분화된 T 세포이다.
일부 양태에 따르면, 상기 표적 세포는 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간 대상체로부터 유래된다.
본원에서 사용되는, 용어 "미토콘드리아-풍부화된 세포" 또는 "미토콘드리아-풍부화된 표적 세포"는 상호 교환적으로 사용되며, 외인성 미토콘드리아가 삽입된 임의의 세포를 지칭한다. 상기 세포는 표적 세포일 수 있다. 상기 세포는 줄기 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "미토콘드리아-풍부화된 T 세포"는 외인성 미토콘드리아가 삽입된 T 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "미토콘드리아-풍부화된 조혈 줄기 세포"는 외인성 미토콘드리아가 삽입된 조혈 줄기 세포이다.
용어 "동종이계 세포"는 상기 대상체 이외의 공급원, 예를 들어 다른 공여자 개체로부터 유래한 세포를 지칭한다.
본원 및 청구범위에서 사용되는, 용어 "동계"는 거부 없이 개체 간의 이식을 허용하기에 충분한 유전적 동일성 또는 유전적 유사-동일성(near-identity)을 지칭한다. 본원에서, 미토콘드리아와 관련하여, 동계라는 용어는 동일한 모계 혈통을 의미하는 자가 미토콘드리아라는 용어와 상호 교환적으로 사용된다.
특정 양태에서, 줄기 세포일 수 있는 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 하기 중 적어도 하나를 갖는다: (i) 미토콘드리아 풍부화 이전의 표적 세포 내의 미토콘드리아 DNA 함량과 비교하여 증가된 미토콘드리아 DNA 함량; (ii) 미토콘드리아 풍부화 이전의 표적 세포의 산소(O2) 소비율과 비교하여 증가된 산소(O2) 소비율; (iii) 미토콘드리아 풍부화 이전의 표적 세포 내의 구연산 합성효소의 함량 또는 활성 수준과 비교하여 증가된 구연산 합성효소의 함량 또는 활성 수준; (iv) 미토콘드리아 풍부화 이전의 표적 세포에서의 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도와 비교하여 증가된 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도; (v) 더 낮은 헤테로플라스미 (heteroplasmy) 수준; 또는 (i), (ii), (iii) (iv) 및 (v)의 임의의 조합.
특정 양태에서, 상기 표적 세포는 장애를 앓고 있는 대상체에 대해 동종이계이다. 용어 "대상체에 대해 동종이계"는 줄기 세포 또는 미토콘드리아가 환자의 세포와 HLA 매칭되거나 적어도 부분적으로 HLA 매칭되는 것을 지칭한다. 특정 양태에 따르면, 상기 공여자는 특정 미토콘드리아 DNA 하플로그룹의 식별에 따라 상기 대상체와 매칭된다. 특정 양태에서, 상기 대상체는 줄기 세포 및/또는 미토콘드리아의 공급원이다.
본원에서 사용되는, 용어 "HLA-매칭된"은, 적어도 대상체가 공여자의 표적 세포에 대해 급성 면역 반응을 발생시키지 않는 정도로, 표적 세포의 대상체 및 공여자가 가능한 한 밀접하게 HLA-매칭되는 것을 지칭한다. 이러한 면역 반응의 예방 및/또는 치료는 면역 억제제의 급성 또는 만성 사용 여부에 관계없이 달성될 수 있다. 특정 양태에서, 공여자로부터의 표적 세포는 환자가 표적 세포를 거부하지 않는 정도로 환자에게 HLA-매칭된다.
본원에서 사용되는, 용어 "하플로그룹"은 모계 상에서 공통 조상을 공유하는 사람들의 유전적 집단 그룹을 지칭한다. 미토콘드리아 하플로그룹은 시퀀싱에 의해 측정된다.
특정 양태에서, 상기 미토콘드리아는 동일한 하플로그룹으로부터 유래한다. 다른 양태에서, 상기 미토콘드리아는 상이한 하플로그룹으로부터 유래한다.
일부 양태에서, 상기 표적 세포는 시험관 내에서 배양 및 증식된다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포는 미토콘드리아 풍부화 이전 또는 이후에 적어도 하나의 동결-해동 주기를 거친다.
다양한 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 대상체로부터 또는 공여자로부터 단리된다. 특정 양태에 따르면, 상기 외인성 미토콘드리아는 상기 대상체의 장애에 따라 특정 미토콘드리아 하플로그룹으로부터 선택된 공여자로부터 단리된다.
다양한 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 신선하거나, 동결되거나, 동결-해동된다.
본원에서 사용되는, 용어 "공여자"는 상기 외인성 미토콘드리아를 제공하는 공여자를 지칭한다. 일부 양태에서, 상기 공여자는 질환 또는 장애를 앓고 있지 않거나, 상기 대상체가 앓고 있는 것과 동일한 질환 또는 장애를 앓고 있지 않다.
미토콘드리아와 관련하여, 용어 "외인성" 또는 "단리된 외인성"은 세포 외부의 공급원으로부터 표적 세포(예를 들어, 줄기 세포)에 도입된 미토콘드리아를 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 외인성 미토콘드리아는 일반적으로, 상기 표적 세포와 다른 공여자 세포로부터 유래되거나 단리된다. 예를 들어, 외인성 미토콘드리아는 공여자 세포에서 생성되거나 제조되고, 상기 공여자 세포로부터 정제, 단리, 또는 획득되며, 이후 상기 표적 세포에 도입될 수 있다. 외인성 미토콘드리아는 공여자로부터 획득된 것과 같이 동종이계이거나 대상체로부터 획득된 것과 같이 자가일 수 있다. 단리된 미토콘드리아는 기능성 미토콘드리아를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 전체 미토콘드리아이다.
본원에서 사용되는, 미토콘드리아와 관련하여, 용어 "단리된" 및 "부분적으로 정제된"은 다른 세포 구성 요소로부터, 적어도 부분적으로, 정제된 외인성 미토콘드리아를 포함한다. 외인성 단리된 또는 부분적으로 정제된 미토콘드리아 내의 미토콘드리아 단백질의 총량은 샘플 내의 세포 단백질의 총량의 10% 내지 90%이다.
본원에서 사용되는, 용어 "기능성 미토콘드리아"는 정상적인 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 나타내는 매개변수 및 정상적인 비병리학적 활성 수준을 나타내는 미토콘드리아를 지칭한다. 미토콘드리아의 활성은 막 전위, O2 소비, ATP 생성, 구연산 합성효소(CS) 활성 수준과 같은 당업계에 널리 알려진 다양한 방법으로 측정될 수 있다.
특정 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 상기 미토콘드리아-풍부화된 세포 내의 총 미토콘드리아 함량의 적어도 1%를 구성한다. 특정 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포 내의 총 미토콘드리아 함량의 적어도 10%를 구성한다. 일부 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포 내의 총 미토콘드리아 함량의 적어도 약 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% 또는 50%를 구성한다. 특정 양태에서, 상기 단리된 미토콘드리아 내의 미토콘드리아 단백질의 총량은 세포 단백질의 총량의 10 내지 90%, 20 내지 80%, 20 내지 70%, 40 내지 70%, 20 내지 40%, 또는 20 내지 30%이다. 특정 양태에서, 상기 단리된 미토콘드리아 내의 미토콘드리아 단백질의 총량은 샘플 내의 세포 단백질의 총량의 20% 내지 80%이다. 특정 양태에서, 상기 단리된 미토콘드리아 내의 미토콘드리아 단백질의 총량은 상기 미토콘드리아와 기타 준세포 분획의 합계 중량의 20% 내지 80%이다. 다른 양태에서, 상기 단리된 미토콘드리아 내의 미토콘드리아 단백질의 총량은 상기 미토콘드리아와 기타 준세포 분획의 합계 중량의 80% 초과이다.
특정 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 인간 세포 또는 인간 조직으로부터 획득된다. 일부 양태에서, 상기 인간 세포 또는 인간 조직은 태반 세포, 배양물에서 성장한 태반 세포 및 혈액 세포로부터 선택된다. 일부 양태에서, 상기 인간 세포는 인간 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 인간 세포는 인간 체세포이다. 일부 양태에서, 세포는 배양물 내의 세포이다. 체세포의 일부 비제한적인 예는 섬유모세포, 내피 세포, 모세혈액 세포, 각질형성세포, 골수 세포, 및 상피 세포를 포함한다.
미토콘드리아와 관련하여, 용어 "자가"는 해당 세포와 동일한 공급원으로부터 표적 세포(예를 들어 줄기 세포)에 도입된 미토콘드리아를 지칭한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 자가 미토콘드리아는 상기 표적 세포의 공급원인 대상체로부터 유래되거나 단리된다. 예를 들어, 자가 미토콘드리아는 상기 대상체의 세포로부터 정제/단리/획득된 후 상기 대상체의 표적 세포에 도입될 수 있다. 용어 "자가 미토콘드리아"는 환자 자신의 세포 또는 모계 관련 세포로부터 획득된 미토콘드리아를 지칭한다. 용어 "동종이계 미토콘드리아"는 다른 공여자 개체로부터 유래한 미토콘드리아를 지칭한다.
미토콘드리아와 관련하여, 용어 "내인성"은 세포에 의해 제조/발현/생성되며, 외부 공급원으로부터 세포로 도입된 것이 아닌 미토콘드리아를 지칭한다. 일부 양태에서, 내인성 미토콘드리아는 세포의 게놈에 의해 암호화되는 단백질 및/또는 다른 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 용어 "내인성 미토콘드리아"는 "숙주 미토콘드리아"라는 용어와 동일하다.
특정 양태에서, 외인성 인간 미토콘드리아는 인간 줄기 세포일 수 있는 표적 세포에 도입되어, 이들 세포를 외인성 미토콘드리아로 풍부화시킨다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포는, 상기 표적 세포를 상기 외인성 미토콘드리아와 접촉시키거나 이와 함께 인큐베이션함으로써, 외인성 미토콘드리아로 풍부화된다. 상기 접촉 또는 인큐베이션은 상기 외인성 또는 단리된 미토콘드리아가 상기 표적 세포에 진입하도록 허용하는 조건 하에서 수행된다.
이러한 풍부화는 상기 표적 세포의 미토콘드리아 함량을 변화시킨다는 것이 이해되어야 하며, 즉, 나이브(naive) 인간 표적 세포는 실질적으로 하나의 집단의 숙주/자가 미토콘드리아를 갖는 반면, 외인성 미토콘드리아로 풍부화된 표적 세포는 실질적으로 두 집단의 미토콘드리아, 즉 제1 집단의 숙주/내인성 미토콘드리아 및 또 다른 집단의 도입된 미토콘드리아(즉, 상기 외인성 미토콘드리아)를 갖는다. 따라서, 용어 "풍부화된"은 외인성 미토콘드리아를 수용/통합한 후의 세포의 상태에 관한 것이다. 두 집단 사이의 미토콘드리아의 비율 및/또는 수를 측정하는 것은 간단한데, 그 이유는 상기 두 집단이 미토콘드리아 DNA와 같은 여러 양태에서 상이할 수 있기 때문이다. 따라서, 문구 "외인성 인간 미토콘드리아가 풍부화된 인간 세포"는 "내인성 미토콘드리아 및 외인성 단리된 미토콘드리아를 포함하는 인간 세포"라는 문구와 동일하다. 예를 들어, 총 미토콘드리아 함량의 적어도 1%의 외인성 단리된 미토콘드리아를 포함하는 인간 표적 세포는 숙주 내인성 미토콘드리아와 외인성 단리된 미토콘드리아를 99:1의 비율로 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들어, "총 미토콘드리아의 3%"는, 풍부화 후에, 원래의(내인성) 미토콘드리아 함량이 총 미토콘드리아의 97%이고 도입된(외인성) 미토콘드리아가 총 미토콘드리아의 3%임을 의미하며, 이것은 (3/97=) 3.1% 풍부화에 해당한다. 또 다른 예에서, "총 미토콘드리아의 33%"는, 풍부화 후에, 원래의(내인성) 미토콘드리아 함량이 총 미토콘드리아의 67%이고 도입된(외인성) 미토콘드리아가 총 미토콘드리아의 33%임을 의미하며, 이것은 (33/67=) 49.2% 풍부화에 해당한다.
일부 양태에서, 외인성 미토콘드리아가 상기 표적 세포 내로 도입된 후의 외인성 미토콘드리아로부터의 내인성 미토콘드리아의 식별/판별은, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 하기를 포함하는 다양한 수단에 의해 수행될 수 있다: 내인성 미토콘드리아와 외인성 미토콘드리아 간의 mtDNA 서열의 차이, 예를 들어 상이한 일배체형을 식별하는 것, 외인성 미토콘드리아의 공급원 조직으로부터 유래한 특정 미토콘드리아 단백질, 예를 들어 태반의 시토크롬 p450 콜레스테롤 측쇄 절단(P450SCC: p450 cholesterol side chain cleavage), 갈색 지방 조직의 UCP1 등을 식별하는 것, 또는 이들의 임의의 조합.
헤테로플라스미는 세포 또는 개체 내에 한 가지 유형 초과의 미토콘드리아 DNA가 존재하는 것이다. 헤테로플라스미 수준은 돌연변이 mtDNA 분자 대 야생형/기능성 mtDNA 분자의 비율이며, 미토콘드리아 질환의 중증도를 고려하는 데 있어 중요한 인자이다. 더 낮은 헤테로플라스미 수준(충분한 양의 미토콘드리아가 기능성임)은 건강한 표현형과 관련이 있는 반면, 더 높은 헤테로플라스미 수준(불충분한 양의 미토콘드리아가 기능성임)은 병리와 관련이 있다. 특정 양태에서, 풍부화된 줄기 세포의 헤테로플라스미 수준은 상기 대상체 또는 공여자로부터 획득되거나 유래된 줄기 세포의 헤테로플라스미 수준보다 적어도 1%, 3%, 5%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 더 낮다.
본원에서 사용되는, 용어 "미토콘드리아-풍부화된 표적 세포" 또는 "미토콘드리아-풍부화된 세포"는 상호 교환적으로 사용되며 외인성 미토콘드리아가 삽입된 표적 세포를 지칭한다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 CD45, CD3, CD33, CD14, CD19, CD11, CD15, CD16 등을 발현하는 세포로 분화된다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 CD45, CD3, CD33, CD14 또는 CD19를 발현한다. CD45는 적혈구 및 형질 세포를 제외한 조혈 계통의 모든 세포에 존재하는 수용체 연결 단백질 티로신 포스파타제이다. CD3은 면역 반응 효율의 마커이다. 구체적으로, CD3은 전흉선세포에서 발현된다. 세포 상의 CD45 및 CD3의 발현은 유동 세포 분석법을 포함한 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다.
일부 양태에서, 전술된 방법은 상기 표적 세포를 증식시킬 수 있는 증식 배지에서 상기 줄기 세포를 배양함으로써 상기 표적 세포를 증식시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 표적 세포를 증식시킬 수 있는 배양 또는 증식 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포를 증식시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어 "배양 또는 증식 배지"는 세포 배양 배지, 세포 성장 배지, 세포에 자양물을 제공하는 완충액과 같은 유체 배지이다.
본원에서 사용되는, 용어 "접촉"은 상기 미토콘드리아와 세포를 충분히 근접하게 만들어 상기 세포로의 상기 미토콘드리아의 진입을 촉진하는 것을 지칭한다. 표적 세포에 미토콘드리아를 도입 또는 삽입하는 것이라는 용어는 접촉이라는 용어와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는, 어구 "단리된 미토콘드리아가 표적 세포에 진입하도록 허용하는 조건"은 일반적으로, 시간, 온도, 배양 배지 및 미토콘드리아와 줄기 세포 사이의 근접성과 같은 매개변수를 지칭한다. 예를 들어, 인간 세포 및 인간 세포주는 액체 배지에서 일상적으로 인큐베이션되고, 조직 배양물 인큐베이터와 같은 멸균 환경에서 37℃ 및 5% CO2 분위기에서 유지된다. 본원에 개시되고 예시된 대안적인 양태에 따르면, 상기 세포는 인간 혈청 알부민이 보충된 식염수에서 실온에서 인큐베이션될 수 있다.
특정 양태에서, 상기 인간 표적 세포는 약 16 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 0.5 내지 30시간 범위의 시간 동안 상기 단리된 미토콘드리아와 함께 인큐베이션된다. 특정 양태에서, 상기 인간 표적 세포는 1 내지 30시간 또는 5 내지 25시간 범위의 시간 동안 상기 단리된 미토콘드리아와 함께 인큐베이션된다. 특정 양태에서, 인큐베이션은 20 내지 30시간 동안 수행된다. 일부 양태에서, 인큐베이션은 적어도 1, 3, 5, 8, 10, 13, 15, 18, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 동안 수행된다. 다른 양태에서, 인큐베이션은 최대 5, 10, 15, 20 또는 30시간 수행된다. 특정 양태에서, 인큐베이션은 24시간 동안 수행된다. 특정 양태에서, 인큐베이션은 상기 표적 세포 내의 미토콘드리아 함량이 초기 미토콘드리아 함량에 비해 평균 1% 내지 45% 증가될 때까지 수행된다.
일부 양태에서, 인큐베이션은 실온(16℃ 내지 30℃)에서 수행된다. 다른 양태에서, 인큐베이션은 37℃에서 수행된다. 일부 양태에서, 인큐베이션은 5% CO2 분위기에서 수행된다. 다른 양태에서, 인큐베이션은 공기에서 발견되는 수준을 초과하는 추가된 CO2를 포함하지 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 인큐베이션은 인간 혈청 알부민(HSA: human serum albumin)이 보충된 배양 배지에서 수행된다. 추가적인 양태에서, 상기 인큐베이션은 HSA가 보충된 식염수에서 수행된다. 특정한 예시적인 양태에 따르면, 단리된 외인성 미토콘드리아가 상기 인간 줄기 세포에 진입하도록 허용하여 상기 인간 표적 세포를 상기 인간 외인성 미토콘드리아로 풍부화시키는 조건은, 4.5% 인간 혈청 알부민이 보충된 식염수에서 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 상기 미토콘드리아는 공여자로부터 획득된다. 또 다른 양태에서, 상기 외인성 미토콘드리아는 상기 표적 세포에 대해 자가 또는 동종이계이다.
특정 양태에서, 상기 인큐베이션은 실온에서 수행된다. 특정 양태에서, 상기 인큐베이션은 적어도 6시간 동안 수행된다. 특정 양태에서, 상기 인큐베이션은 적어도 12시간 동안 수행된다. 특정 양태에서, 상기 인큐베이션은 12 내지 24시간 동안 수행된다. 특정 양태에서, 상기 조건은 나이브 표적 세포의 미토콘드리아 함량을 CS 활성에 의해 측정될 때 적어도 약 1%, 3%, 5% 또는 10% 증가시키기에 충분하다.
구연산 합성효소(CS)는 미토콘드리아 기질에 국한되지만 핵 DNA에 의해 암호화된다. 구연산 합성효소는 크렙스 회로의 제1 단계에 관여하며 온전한 미토콘드리아의 존재에 대한 정량적 효소 마커로서 일반적으로 사용된다(문헌[Larsen S. et al., J. Physiol., 2012, Vol. 590(14), pages 3349-3360]; 문헌[Cook G.A. et al., Biochim. Biophys. Acta., 1983, Vol. 763(4), pages 356-367]).
미토콘드리아 투여량은 CS 활성 단위, mtDNA 카피 수, 또는 본원에 설명된 바와 같은 외인성 미토콘드리아 양의 다른 정량화 가능한 측정치로 표현될 수 있다. "CS 활성 단위"는 1 mL 반응 부피에서 1분에 1 마이크로몰 기질의 전환을 가능하게 하는 양으로 정의된다.
일부 양태에서, 상기 표적 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화는 상기 표적 세포에 백만 개의 세포 당 적어도 0.044 내지 최대 176 밀리유닛(mU)의 구연산 합성효소(CS) 활성의; 백만 개의 세포 당 적어도 0.088 내지 최대 176 mU의 CS 활성의; 백만 개의 세포 당 적어도 0.2 내지 최대 150 mU의 CS 활성의; 백만 개의 세포 당 적어도 0.4 내지 최대 100 mU의 CS 활성의; 백만 개의 세포 당 적어도 0.6 내지 최대 80 mU의 CS 활성의; 백만 개의 세포 당 적어도 0.7 내지 최대 50 mU의 CS 활성의; 백만 개의 세포 당 적어도 0.8 내지 최대 20 mU의 CS 활성의; 백만 개의 세포 당 적어도 0.88 내지 최대 17.6 mU의 CS 활성의; 또는 백만 개의 세포 당 적어도 0.44 내지 최대 17.6 밀리유닛의 CS 활성의 미토콘드리아 투여량을 도입하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "미토콘드리아 함량"은 세포 내의 미토콘드리아의 양, 또는 복수의 세포 내의 미토콘드리아의 평균 양을 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "증가된 미토콘드리아 함량"은 미토콘드리아 풍부화 이전의 표적 세포의 미토콘드리아 함량보다 검출 가능하게 더 높은 미토콘드리아 함량을 지칭한다.
특정 양태에서, 외인성 미토콘드리아가 풍부화된 인간 표적 세포의 미토콘드리아 함량은 풍부화 이전의 표적 세포의 미토콘드리아 함량보다 검출 가능하게 더 높다. 다양한 양태에 따르면, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포의 미토콘드리아 함량은 상기 표적 세포의 미토콘드리아 함량보다 적어도 1%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200% 또는 그 초과로 더 높다.
특정 양태에서, 상기 표적 세포 또는 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포의 미토콘드리아 함량은 구연산 합성효소의 함량을 측정함으로써 측정된다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포 또는 풍부화된 줄기 세포의 미토콘드리아 함량은 구연산 합성효소의 활성 수준을 측정함으로써 측정된다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포 또는 풍부화된 표적 세포의 미토콘드리아 함량은 구연산 합성효소의 함량과 상관 관계가 있다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포 또는 풍부화된 표적 세포의 미토콘드리아 함량은 구연산 합성효소의 활성 수준과 상관 관계가 있다. CS 활성은, 예를 들어 CS 활성 키트 CS0720(Sigma)을 사용하여, 상업적으로 입수 가능한 키트에 의해 측정될 수 있다.
미토콘드리아 DNA 함량은, 핵 유전자로 정규화된, 미토콘드리아 풍부화 이전 및 이후의 미토콘드리아 유전자의 정량적 PCR을 수행함으로써 측정될 수 있다.
특정 상황에서, 미토콘드리아 풍부화 이전 및 이후의 동일한 세포는 CS 및 ATP 활성과 같은 추가적인 매개변수를 측정하고 풍부화 수준을 측정하기 위한 대조군 역할을 한다.
특정 양태에서, 본원에서 사용되는, 용어 "검출 가능하게 더 높은"은 정상 값과 증가된 값 사이의 통계적으로 유의미한 증가를 지칭한다. 특정 양태에서, 본원에서 사용되는, 용어 "검출 가능하게 더 높은"은 비병리학적 증가, 즉 실질적으로 더 높은 값과 관련된 병리학적 증상이 명백해지지 않는 수준을 지칭한다. 특정 양태에서, 본원에서 사용되는, 용어 "증가된"은 건강한 대상체 또는 복수의 건강한 대상체의 상응하는 세포 또는 상응하는 미토콘드리아에서 또는 미토콘드리아 풍부화 이전의 표적 세포에서 발견되는 상응하는 값보다 1.05배, 1.1배, 1.25배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배 또는 그 초과인 값을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "증가된 미토콘드리아 DNA 함량"은 미토콘드리아 풍부화 이전의 표적 세포 내의 미토콘드리아 DNA 함량보다 검출 가능하게 더 높은 미토콘드리아 DNA 함량을 지칭한다. 미토콘드리아 함량은 SDHA 또는 COX1 함량을 측정함으로써 측정될 수 있다. 본 명세서 및 청구범위의 맥락에서, "정상 미토콘드리아 DNA"는 미토콘드리아 질환과 관련이 있는 것으로 알려진 돌연변이 또는 결실을 보유하지/갖지 않는 미토콘드리아 DNA를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "정상 산소(O2) 소비율"은 건강한 개체로부터의 세포의 평균 O2소비를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "구연산 합성효소의 정상 활성 수준"은 건강한 개체로부터의 세포 내의 구연산 합성효소의 평균 활성 수준을 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "정상 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도"는 건강한 개체로부터의 세포에서의 평균 ATP 생성 속도를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화의 정도는 기능 및/또는 효소 분석에 의해 추가로 측정될 수 있으며, 이는 산소(O2) 소비율, 구연산 합성효소의 함량 또는 활성 수준, 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 상기 표적 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화는 상기 공여자의 미토콘드리아 DNA의 검출에 의해 확인될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 상기 표적 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화의 정도는 헤테로플라스미의 변화 수준 및/또는 세포 당 mtDNA의 카피 수에 의해 측정될 수 있다.
TMRM(테트라메틸로다민 메틸 에스테르) 또는 관련 TMRE(테트라메틸로다민 에틸 에스테르)는 미토콘드리아 막 전위의 변화를 식별함으로써 살아있는 세포에서의 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 세포 투과성 플루오로제닉(fluorogenic) 염료이다. 일부 양태에 따르면, 풍부화 수준은 TMRE 또는 TMRM으로 염색함으로써 측정될 수 있다.
일부 양태에 따르면, 미토콘드리아 막의 온전성은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 비제한적인 예에서, 미토콘드리아 막의 온전성은 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM) 또는 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE) 형광 프로브를 사용하여 측정된다. 현미경으로 관찰되어 TMRM 또는 TMRE 염색을 보이는 미토콘드리아는 온전한 미토콘드리아 외막을 가지고 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "미토콘드리아 막"은 미토콘드리아 내막, 미토콘드리아 외막 및 이들 모두로 구성된 군으로부터 선택된 미토콘드리아 막을 지칭한다.
특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 인간 표적 세포에서의 미토콘드리아 풍부화 수준은 상기 세포 내의 전체 미토콘드리아 DNA 중 적어도 통계적으로 대표적인 부분을 시퀀싱하고 숙주/내인성 미토콘드리아 DNA 및 외인성 미토콘드리아 DNA의 상대적인 수준을 측정함으로써 측정된다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 인간 표적 세포에서의 미토콘드리아 풍부화 수준은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP: single nucleotide polymorphism) 분석에 의해 측정된다. 특정 양태에서, 가장 큰 미토콘드리아 집단 및/또는 가장 큰 미토콘드리아 DNA 집단은 숙주/내인성 미토콘드리아 집단 및/또는 숙주/내인성 미토콘드리아 DNA 집단이고/거나; 두 번째로 큰 미토콘드리아 집단 및/또는 두 번째로 큰 미토콘드리아 DNA 집단은 외인성 미토콘드리아 집단 및/또는 외인성 미토콘드리아 DNA 집단이다.
특정 양태에 따르면, 상기 표적 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화는 당업계에서 인정되는 통상적인 분석에 의해 측정될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 인간 표적 세포에서의 미토콘드리아 풍부화 수준은 (i) 숙주/내인성 미토콘드리아 DNA 및 외인성 미토콘드리아 DNA의 수준; (ii) 구연산 합성효소(CS), 시토크롬 C 산화효소(COX1), 숙시네이트 탈수소효소 복합 플라보단백질 서브유닛 A(SDHA) 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 미토콘드리아 단백질의 수준; (iii) CS 활성 수준; 또는 (iv) (i), (ii) 및 (iii)의 임의의 조합에 의해 측정된다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 인간 표적 세포의 풍부화 수준은 NADH, FADH2, MAO-A, MAO-B, 글리세롤-3-인산 탈수소효소 또는 이들의 임의의 조합을 측정함으로써 트립타민과 같은 기질의 이용도를 측정함으로써 측정된다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 인간 표적 세포의 풍부화 수준은, 예를 들어 탈수소효소 복합 플라보단백질 서브유닛 A의 수준을, 측정함으로써 숙시네이트와 같은 기질의 이용도를 측정함으로써 측정된다.
특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 인간 줄기 세포에서의 미토콘드리아 풍부화 수준은 하기 중 적어도 하나에 의해 측정된다: (i) 동종이계 미토콘드리아의 경우 숙주 미토콘드리아 DNA 및 외인성 미토콘드리아 DNA의 수준; (ii) 구연산 합성효소 활성 수준; (iii) 숙시네이트 탈수소효소 복합 플라보단백질 서브유닛 A(SDHA) 또는 시토크롬 C 산화효소(COX1)의 수준; (iv) 산소(O2) 소비율; (v) 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도; (vi) 트립타민 이용도 측정 (vii) 숙시네이트 이용도 측정 (viii) NADH 또는 FADH2, MAO-A, MAO-B 또는 글리세롤-3-인산 탈수소효소를 생성하는 대사 기질로부터 전자 수송 사슬(ETC)로의 전자 흐름의 속도 및 ETC를 통한 전자 흐름의 속도 측정, 또는 (ix) 이들의 임의의 조합. 이들 다양한 매개변수를 측정하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 본원에 기술된 방법은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 양태에서, 상기 표적 세포의 외인성 인간 미토콘드리아 풍부화는 상기 인간 표적 세포를 상기 단리된 외인성 인간 미토콘드리아와 함께 인큐베이션한 후 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포를 세척하는 것을 포함한다. 이 단계는 세포 파편 또는 미토콘드리아 막 잔류물 및 표적 세포에 진입하지 않은 미토콘드리아가 실질적으로 없는 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 세척은 상기 인간 표적 세포를 상기 단리된 외인성 인간 미토콘드리아와 함께 인큐베이션한 후 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포를 원심분리하는 것을 포함한다. 일부 양태에 따르면, 상기 미토콘드리아-풍부화된 인간 세포는 자유 미토콘드리아, 즉 줄기 세포에 진입하지 않은 미토콘드리아, 또는 다른 세포 파편으로부터 분리된다.
상기 미토콘드리아-풍부화된 세포를 포함하는 조성물로부터 잔류물을 제거하는 것은 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 양태에 따르면 잔류물 제거는 원심분리에 의해 수행된다.
특정 양태에서, 상기 표적 세포 및/또는 상기 단리된 외인성 미토콘드리아는 인큐베이션 및/또는 접촉 이전에 또는 그 동안 농축된다. 특정 양태에서, 상기 표적 세포 및/또는 단리된 외인성 미토콘드리아는 인큐베이션 또는 접촉 이전, 동안 또는 이후에 원심분리를 거친다. 일부 양태에서, 상기 단리된 미토콘드리아와 상기 표적 세포의 인큐베이션 이전, 동안, 또는 이후에, 단일 또는 그 초과의 원심분리 단계가 존재한다.
특정 양태에서, 원심분리 속도는 7,000g 또는 8,000g이다. 추가적인 양태에 따르면, 상기 원심분리는 300g 내지 8000g; 500g 내지 8000g; 1000g 내지 8000g; 300g 내지 5000g; 2000g 내지 4000g; 2500g 내지 8500g; 3000g 내지 8000g; 4000g 내지 8000g; 5,000g 내지 10,000g; 7000g 내지 8000g 또는 2500g 초과의 속도에서 수행된다. 일부 양태에서, 원심분리는 2분 내지 30분; 3분 내지 25분; 5분 내지 20분; 또는 8분 내지 15분 범위의 시간 동안 수행된다.
일부 양태에서, 원심분리는 2 내지 6℃; 4 내지 37℃; 4 내지 10℃ 또는 16 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행된다. 특정 양태에서 원심분리는 4℃에서 수행된다. 일부 양태에서, 상기 단리된 외인성 미토콘드리아와 상기 표적 세포의 인큐베이션 이전, 동안, 또는 이후에 원심분리 단계가 존재하며, 이어서 세포를 30℃ 미만의 온도에서 휴지시킨다. 일부 양태에서, 상기 단리된 외인성 미토콘드리아가 인간 표적 세포에 진입하도록 허용하는 조건은, 상기 단리된 미토콘드리아와 상기 표적 세포의 인큐베이션 이전, 동안 또는 이후의 단일 원심분리에 이어 16 내지 28℃ 범위의 온도에서 세포를 휴지시키는 것을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 표적 세포는 신선하게 사용된다. 일부 양태에서, 상기 표적 세포는 미토콘드리아 풍부화 이전 또는 이후에 동결 및 해동된다.
특정 양태에서, 상기 표적 세포는 신선하다. 특정 양태에서, 표적 세포는 동결 및 해동된 다음, 인큐베이션된다. 특정 양태에서, 상기 단리된 외인성 미토콘드리아는 신선하다. 특정 양태에서, 상기 단리된 외인성 미토콘드리아는 동결 및 해동된 다음, 인큐베이션된다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 신선하다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 동결된다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 동결된 다음 해동된다.
특정 양태에서, 상기 미토콘드리아는 동결되지 않는다. 추가적인 양태에서, 상기 단리된 미토콘드리아는 동결된 후 저장되고 해동된 다음, 사용된다. 추가적인 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 동결 및 저장 없이 사용된다. 추가적인 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 동결, 저장 및 해동 후에 사용된다. 생존력을 보존하기 위한 세포 제제의 동결 및 해동에 적합한 방법은 당업계에 널리 알려져 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "동결-해동 주기"는 상기 단리된 외인성 미토콘드리아를 0℃ 미만의 온도로 동결시키고, 상기 미토콘드리아를 일정 기간 동안 0℃ 미만의 온도로 유지하고, 상기 단리된 미토콘드리아를 실온 또는 체온 또는 상기 표적 세포를 상기 단리된 미토콘드리아와 접촉시킬 수 있는 0℃ 초과의 임의의 온도로 해동하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "실온"은 전형적으로, 18℃ 내지 25℃의 온도를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 용어 "체온"은 35.5℃ 내지 37.5℃, 바람직하게는 37℃의 온도를 지칭한다.
또 다른 양태에서, 동결-해동 주기를 거친 미토콘드리아는 -20℃ 이하; -4℃ 이하 또는 -70℃ 이하의 온도에서 동결되었다. 또 다른 양태에 따르면, 상기 미토콘드리아의 동결은 점진적이다. 일부 양태에 따르면, 미토콘드리아의 동결은 급속 동결을 통해 이루어진다. 본원에서 사용되는, 용어 "급속 동결"은 상기 미토콘드리아를 극저온에 노출시킴으로써 이를 신속히 동결시키는 것을 의미한다.
또 다른 양태에서, 동결-해동 주기를 거친 미토콘드리아는 해동 전에 적어도 30분 동안 동결되었다. 또 다른 양태에 따르면, 상기 동결-해동 주기는 상기 단리된 외인성 미토콘드리아를, 해동 전에 적어도 30, 60, 90, 120, 180, 210분 동안 동결시키는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 동결-해동 주기를 거친 단리된 외인성 미토콘드리아는 해동 전에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 48, 72, 96, 또는 120시간 동안 동결되었다. 또 다른 양태에서, 동결-해동 주기를 거친 단리된 외인성 미토콘드리아는 해동 전에 적어도 4, 5, 6, 7, 30, 60, 120, 365일 동안 동결되었다. 또 다른 양태에 따르면, 상기 동결-해동 주기는 상기 단리된 외인성 미토콘드리아를, 해동 전에 적어도 1, 2, 3주 동안 동결시키는 것을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 상기 동결-해동 주기는 상기 단리된 외인성 미토콘드리아를, 해동 전에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 동안 동결시키는 것을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 상기 동결-해동 주기 후의 상기 단리된 외인성 미토콘드리아의 산소 소비량은 상기 동결-해동 주기 전의 상기 외인성 미토콘드리아의 산소 소비량과 같거나 더 높다.
특정 양태에 따르면, 해동은 실온에서 수행된다. 또 다른 양태에서, 해동은 체온에서 수행된다. 또 다른 양태에 따르면, 해동은 상기 외인성 미토콘드리아를 상기 표적 세포와 접촉시키거나 이와 함께 인큐베이션할 수 있는 온도에서 수행된다. 또 다른 양태에 따르면, 해동은 점진적으로 수행된다.
본원에서 사용되는, "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은, 대상체로부터 수집되며, 전체적으로 고려하였을 때, 샘플의 공급원의 내용물 또는 구성을 대표하는 임의의 "생물학적 샘플"을 지칭하도록 의도된다. 샘플은 분석을 위해 수집되고 곧장 처리될 수 있거나, 또는 분석이 완료될 때까지 샘플 품질을 유지하기 위해 적절한 저장 조건에서 저장될 수 있다. 이상적으로는, 저장된 샘플은 신선하게 수집된 표본과 동등하게 유지된다. 샘플의 공급원은 내부 장기, 정맥, 동맥 또는 심지어 체액일 수 있다. 샘플의 비제한적인 예는 혈액, 혈장, 소변, 타액, 땀, 장기 생검, 뇌척수액(CSF: cerebrospinal fluid), 눈물, 정액, 질액, 대변, 피부 및 모발을 포함한다.
특정 양태에서, 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체 또는 상기 공여자는 말초 혈액으로의 골수 세포 동원을 유도하는 제제를 투여받는다.
추가적인 양태에서, 상기 대상체 또는 공여자는, 샘플 수집 전에, 과립구 집락 자극 인자(G-CSF: granulocyte-colony stimulating factor), 과립구-대식 세포 집락 자극 인자(GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 1,1'-[1,4-페닐렌비스(메틸렌)]-비스[1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸](플레릭사포르(Plerixafor)), 이의 염, 및 이들의 임의의 조합을 투여받는다.
일부 양태에서, 상기 표적 세포는 상기 표적 세포를 증식시킬 수 있는 증식 배지에서 상기 표적 세포를 배양함으로써 증식된다. 다른 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 미토콘드리아-풍부화된 세포를 증식시킬 수 있는 배양 또는 증식 배지에서 상기 미토콘드리아-풍부화된 세포를 배양함으로써 증식된다. 본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어 "배양 또는 증식 배지"는 세포 배양 배지, 세포 성장 배지, 세포에 자양물을 제공하는 완충액과 같은 유체 배지이다.
용어 "질환" 및 "장애"는 정상적인 것으로 간주되지 않거나 생리학적 상태와 다른 임의의 고통을 지칭하도록 의도된다. 질환과 장애는 신체의 거의 모든 기관, 조직 또는 기능에 영향을 미칠 수 있다. 질환 및 병태의 비제한적인 예는 암, 근육 질환 및 장애, 당원 축적 질환 및 장애, 혈관 내피 장애 또는 질환, 뇌 장애 또는 뇌 질환, 태반 장애 또는 태반 질환, 흉선 장애 또는 흉선 질환, 자가면역 질환, 신장 질환 또는 장애, 췌장 장애 또는 췌장 질환, 전립선 장애 또는 전립선 질환, 신장 장애 또는 신장 질환, 혈액 장애 또는 혈액 질환, 심장 질환 또는 심장 장애, 피부 장애 또는 피부 질환, 면역 및 염증성 질환 및 장애, 골 질환 또는 골 장애, 위장 질환 또는 위장 장애, 및 안구 질환 또는 안구 장애를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 미토콘드리아 질환 또는 장애이다.
본원에서 사용되는, 용어 "질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체" 또는 "질환 또는 장애를 갖는 대상체"는 특정 병태에 의해 야기되는 쇠약 효과를 경험하는 인간 대상체를 지칭한다. 상기 장애는 암, 연령 관련 장애, 신장 질환, 췌장 질환, 간 질환, 근육 장애, 뇌 질환 또는 1차 미토콘드리아 질환, 2차 미토콘드리아 기능장애뿐만 아니라 다른 질환 또는 장애도 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "생체외 방법"은 그 단계가 전적으로 인체 외부에서 수행되는 방법을 지칭한다.
특정 양태에서, 줄기 세포일 수 있는 상기 표적 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있지 않는 대상체 또는 공여자로부터 획득되며, 상기 표적 세포는 (i) 정상적인 산소(O2) 소비율; (ii) 정상적인 구연산 합성효소 함량 또는 활성 수준; (iii) 정상적인 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도; 또는 (iv) (i), (ii) 및 (iii)의 조합을 갖는다.
특정 양태에서, 줄기 세포일 수 있는 상기 표적 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체 또는 공여자로부터 획득되며, 상기 표적 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있지 않는 대상체와 비교하여 (i) 감소된 산소(O2) 소비율; (ii) 감소된 구연산 합성효소 함량 또는 활성 수준; (iii) 감소된 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도; 또는 (iv) (i), (ii) 및 (iii)의 조합을 갖는다.
특정 양태에서, 상기 미토콘드리아-풍부화된 표적 세포는 상기 표적 세포와 비교하여 (i) 증가된 산소(O2) 소비율; (ii) 증가된 구연산 합성효소 함량 또는 활성 수준; (iii) 증가된 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도; (iv) 증가된 미토콘드리아 DNA 함량; (v) 더 낮은 헤테로플라스미 수준 또는 (vi) (i), (ii), (iii) (iv) 및 (v)의 조합을 갖는다.
본원에서 사용되는, 용어 "증가된 산소(O2) 소비율"은 미토콘드리아 풍부화 이전의 산소(O2) 소비율보다 검출 가능하게 더 높은 산소(O2) 소비율을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "증가된 구연산 합성효소 함량 또는 활성 수준"은 미토콘드리아 풍부화 이전의 구연산 합성효소의 함량 값 또는 활성 수준보다 검출 가능하게 더 높은 구연산 합성효소의 함량 또는 활성 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "증가된 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도"는 미토콘드리아 풍부화 이전의 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도보다 검출 가능하게 더 높은 아데노신 삼인산(ATP) 생성 속도를 지칭한다.
MAO에는 두 가지 형태, 즉, MAO-A 및 MAO-B가 존재한다. MAO-A는 도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌과 같은 아민의 산화적 탈아미노화를 촉매하는 효소이다. MAO-A는 주로 미토콘드리아의 외막에 위치하지만 시토졸에서도 발견된다. MAO-B는 생체 및 생체이물 아민의 산화적 탈아미노화를 촉매하고 중추 신경계 및 말초 조직(예를 들어 도파민)에서의 신경활성 및 혈관활성 아민의 이화작용에서 중요한 역할을 하며, 벤질아민 및 페네틸아민을 우선적으로 분해한다. MAO-B는 미토콘드리아의 외막에 위치한다. MAO-A와 MAO-B는 둘 모두 다양한 조직에 위치하며, 태반에 높은 수준으로 위치한다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은, 세포 내의 모노아민 산화효소 A(MAO-A) 및/또는 모노아민 산화효소 B(MAO-B)의 수준을 측정함으로써 세포의 태반 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 태반 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 MAO-A 및/또는 MAO-B를 갖는다. 일 양태에서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 양태에서, 상기 세포는 CD34+ 세포이다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 상기 세포를 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화되었다. 특정 양태에서, 상기 태반 미토콘드리아는 신선한, 동결된 또는 동결-해동된 미토콘드리아이다. 추가적인 양태에서, 상기 MAO-A 및/또는 MAO-B 수준은 질량 분광법에 의해 측정된다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은, 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준을 측정함으로써 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 글리세롤-3-인산 탈수소효소를 갖는다. 일 양태에서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 또는 이들의 임의의 조합이다. 다양한 양태에서, 상기 세포는 CD34+ 세포이다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 상기 세포를 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화되었다. 특정 양태에서, 상기 미토콘드리아는 신선한, 동결된 또는 동결-해동된 미토콘드리아이다. 다양한 양태에서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아로 풍부화된다. 추가적인 양태에서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아로 풍부화된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 대사 기질; 및 사용 지침을 갖는, 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별하기 위한 키트를 제공한다. 일 양태에서, 상기 기질은 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4, 숙시네이트, 또는 이들의 조합이다. 추가적인 양태에서, 상기 미토콘드리아는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아이다.
일 실시형태에서, 본 발명은, 비색 분석에 의해, 세포를 대사 기질과 접촉시킨 후의 미토콘드리아 풍부화를 측정하고/거나, 세포 내의 모노아민 산화효소 A(MAO-A) 및/또는 모노아민 산화효소 B(MAO-B)의 수준을 측정하고/거나, 세포 내의 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준을 측정함으로써 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법을 제공하고, 여기서 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 모노아민 산화효소 A(MAO-A), 모노아민 산화효소 B(MAO-B) 및/또는 글리세롤-3-인산 탈수소효소 각각을 갖고, 상기 비색 분석은 흡광도에 의해 측정되고, 흡광도의 증가는 미토콘드리아 풍부화를 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명의 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 이들은 사용될 수 있는 것들을 대표하지만, 당업자에게 알려진 다른 절차, 방법론 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1
태반 미토콘드리아의 기질 이용도
단리된 태반 미토콘드리아가 상이한 기질들을 이용하는 능력을 평가하였다. 미토콘드리아는 신선한 태반으로부터 단리되었다. 단리된 미토콘드리아를 31개의 기질과 함께 인큐베이션하고, 상이한 기질들을 이용하는 이의 능력을 MitoPlate(Biolog)로 분석하였다. 약술하면, MitoPlate는 NADH 또는 FADH2를 생성하는 대사 기질로부터 전자 수송 사슬로의 전자 흐름의 속도 및 전자 수송 사슬을 통한 전자 흐름의 속도를 측정함으로써 미토콘드리아 기능을 평가한다. 각각의 기질은 상이한 경로를 따르며, 미토콘드리아로 진입하기 위해 상이한 수송체를 사용하고 NADH 또는 FADH2를 생성하기 위해 상이한 탈수소효소를 사용한다. 전자는 NADH 또는 FADH2로부터 호흡 복합체 1 또는 2로 이동한 다음 전자 수송 사슬의 말단 부분으로 이동하며, 이 곳에서 테트라졸륨 산화환원 염료(MC)는 환원 시 보라색으로 변하는 말단 전자 수용체로서 작용한다.
두 개의 대조군이 사용되었다. 대조군 1은 카르보닐 시안화물-4(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP)으로 처리된 미토콘드리아였다. FCCP는 양성자 구배를 무너뜨리고 미토콘드리아 막 전위를 방해하는 커플링 해제제이다. 대조군 2는 물에 현탁되고 와류되어 막 완전성이 손상된 단리된 미토콘드리아였다.
결과는 단리된 기능성 태반 미토콘드리아가 구연산, D,L-이소구연산, 시스-아코니트산, 숙신산, 트립타민 및 D,L-a-글리세롤 PO4를 이용할 수 있음을 나타낸다(도 3).
또한, 대조군 1은 구연산, D,L-이소구연산, 시스-아코니트산, 트립타민 및 D,L-a-글리세롤 PO4를 이용할 수 있었지만 숙신산은 이용하지 못했다.
실시예 2
미토콘드리아-풍부화된 세포의 기질 이용도
풍부화된 세포에 대해, 실시예 1에 기술된 기질을 이용하는 능력을 시험하였다. 미토콘드리아 질환을 앓고 있지 않는 건강한 대상체에게 G-CSF + 플레릭사포르를 투여하여 말초 혈액(PB: peripheral blood)으로의 골수 세포 동원을 유도하였다. 환자의 혈액 줄기 세포를 성분채집술로 수집하고 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSPC: hematopoietic stem cell)를 단리하였다. CD34+는 처리되지 않았거나(NT), 또는 건강한 공여자의 혈액 또는 태반으로부터 단리된 동결 및 해동된 건강한 미토콘드리아로 증강되었다. 약술하면, 세포를 백만 개의 세포 당 4.4 mU CS 활성(각각 BLD 4.4 및 PLC 4.4)의 투여량의 혈액 또는 태반 유래 미토콘드리아와 혼합하고, 7000g에서 원심분리하고 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, PBS로 2회 세척하였다. 풍부화는 COX-1 단백질의 증가에 의해 확인되었다(미처리 세포 대 증강 세포).
Mitoplate(BIOLOG)를 사용하여 NADH 또는 FADH2를 생성하는 대사 기질로부터 전자 수송 사슬로의 전자 흐름의 속도 및 전자 수송 사슬을 통한 전자 흐름의 속도를 측정함으로써, 미토콘드리아 기능을 분석하였다.
NT 세포를 대조군으로 사용하였다. NT 세포와 풍부화된 세포(BLD 4.4 및 PLC 4.4)를 사포닌(Sigma SAE0073)으로 투과화하고 MitoPlate에 로딩한 다음 기질을 이용하는 능력을 분석하였다(도 4). 결과는 태반 유래 미토콘드리아(PLC 4.4)가 풍부한 CD34+ 세포가 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4(도 4) 및 숙신산(데이터 미도시)을 기질로 이용할 수 있음을 나타낸다. 가장 중요한 결과는 PLC-풍부화된 세포는 트립타민을 이용할 수 있는 반면 NT 세포와 BLD-풍부화된 세포는 그렇지 않다는 것이다.
또한, 혈액 미토콘드리아 및 태반 미토콘드리아 풍부화는 둘 모두, NT 세포와 비교하여, 세포가 D,L-a-글리세롤 PO4를 이용하는 능력을 향상시켰지만, BLD-풍부화된 세포는 PLC-풍부화된 세포만큼 D,L-a-글리세롤 PO4를 효율적으로 이용하지 못하였다.
또한, 단리된 기능성 태반 미토콘드리아가 트립타민, L-a-글리세롤 PO4, 구연산, 이소구연산, 시스-아코니트산 및 숙신산을 이용할 수 있음이 실시예 1에서 나타났다. 그러나, 이 실험에서, 세포의 태반 또는 혈액 유래 미토콘드리아 풍부화는, 구연산, 이소구연산 및 시스-아코니트산을 이용하는 세포의 능력의 증가를 나타내지 않았다.
실시예 3
미토콘드리아 분석
실시예 2의 혈액 및 태반으로부터 단리된 미토콘드리아에서의 효소를 이용하는 트립타민의 존재를 측정하기 위해 질량 분광법(MS: mass spectrometry)을 수행하였다. 10 마이크로그램의 각각의 미토콘드리아 샘플(3개의 BLD-미토콘드리아 샘플, 3개의 PLC-미토콘드리아 샘플)을 8 M 우레아에서 추출한 후 초음파 처리하였다. 추출된 단백질을 카르바미도메틸화에 의해 환원시키고 트립신으로 분해하였다. 생성된 펩티드를 Q-Exactive HF(Thermo)에서 LC-MS/MS로 분석하고, 검색 알고리즘, 즉 인간 uniprot 데이터베이스에 대한 Sequest(Thermo) 검색 엔진을 사용하여 Discoverer 1.4로 식별하였다. 식별된 모든 펩티드는 높은 신뢰도로 필터링되었다. 추출된 이온 전류(XIC: extracted ion current)를 기반으로 각각의 펩티드의 피크 면적을 계산함으로써 반정량화(semi quantitation)를 수행하였다. 3개 초과의 펩티드로 표시되는 단백질의 경우, 단백질의 발현 강도는 가장 강한 3개의 펩티드의 평균이다. 표 1의 단백질 발현 강도는 배경 노이즈 감소와 함께 log2로 표시되었다. 각각의 단백질을 나타내는 펩티드의 수는 괄호 안에 표시되었다.
결과는 혈액으로부터 단리된 미토콘드리아에 비해 태반으로부터 단리된 미토콘드리아에서 더 높은 수준의 MAOA, MAOB 및 ALDH1B1이 발견되었음을 확증하였다.
실시예 4
트립타민 이용도
트립타민을 이용하는 효소의 위치를 시험하기 위해 MitoPlate 분석을 수행하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)는 백만 개의 세포 당 4.4 mU CS 활성의 투여량의 태반 유래 미토콘드리아(PLC)로 풍부화되거나, 백만 개의 세포 당 4.4 mU CS 활성의 투여량의, 증강 이전에 여과된 태반 유래 미토콘드리아(여과됨)로 풍부화되었다. 미토콘드리아(전형적으로, 크기가 0.5 마이크로미터 내지 1마이크로미터 범위임)를 배제하기 위해 샘플을 0.22 um 필터에 통과시킴으로써, 여과된 샘플을 제조하였다. 미처리 PBMC를 대조군(NT)으로 사용하였다.
도 5에 표시된 결과는 트립타민을 이용하는 효소는 미토콘드리아에 위치하거나 미토콘드리아 막에 결합되어 있을 가능성이 있어서, 필터를 통과하는 분획(예를 들어 세포질 효소)에는 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 5
신선한 미토콘드리아 및 동결-해동된 미토콘드리아는 트립타민을 이용할 수 있다
신선한 단리된 미토콘드리아가 트립타민을 이용하는 능력을 동결-해동된(동결되고 해동된)(F&T: frozen and thawed) 미토콘드리아가 트립타민을 이용하는 능력과 비교하였다.
신선한 미토콘드리아 및 F&T 미토콘드리아 둘 모두 인간 태반으로부터 단리되었다. F&T 미토콘드리아를 -196℃의 온도에서 10분 동안 동결하고 실온에서 해동하였다. 단리된 미토콘드리아는 MitoPlate에서 트립타민과 함께 인큐베이션되었다.
도 7에 표시된 결과는 신선한 미토콘드리아와 F&T 미토콘드리아 둘 모두 트립타민을 이용함을 나타낸다.
실시예 6
미토콘드리아-풍부화된 세포에 의한 트립타민 이용도
Seahorse XFe96 Analyzer를 사용하여, 태반 미토콘드리아를 사용한 세포 증강을 추가로 확인하였다. 이 분석에서, 산소 소비율(OCR)은 세포주 KG1a, LCL(Coreille의 GM18456, 피어슨(Pearson) 환자) 및 CD34+(Hemacare 로트: 18049698)에서 복합체 I(CI: complex I) 및 복합체 II(CII)의 특정 기질을 사용하여 측정되었다. LCL, KG1a 또는 CD34+의 10X106개의 세포가 백만 개의 세포 당 0.88 mU 또는 4.4 mU CS 활성의 투여량의 태반 미토콘드리아로 증강되었다. 증강된 세포를 비증강 세포와 비교하였다. 세포를 투과화제(사포닌)로 처리하고 포도당(10 mM), 피루베이트(1 mM) 및 글루타메이트(2 mM)가 보충된 RPMI 배지 또는 MAS 완충액(70 mM 수크로스, 220 mM 만니톨, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM HEPES pH 7.4)에서 유지하였다. 사전 코팅된 Seahorse XF96 마이크로플레이트에, 웰 당 300k개의 세포의 KG1a, 웰 당 300k개의 세포의 CD34+, 또는 웰 당 150k개의 세포의 LCL을 포함하는 50 μl 배지를 로딩하였다. 플레이트를 200g에서 1분 동안 원심분리하고. 추가적인 130 μl의 RPMI 배지 또는 MAS + 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 트립타민이 CI 특이적 기질로 사용되었고 숙시네이트가 CII 특이적 기질로 사용되었다. LCL 세포 및 KG1a 세포의 경우, 포트 A에 ADP(5 mM 최종 농도)를, 포트 B에 트립타민(60 mM)을, 포트 C에 숙시네이트(10 mmM)를 주입하였다. CD34+ 세포의 경우 ADP(5 mM 최종 농도)를 포트 A에 트립타민(60 mM)과 함께 주입하였다. 혼합 및 측정 시간은 각각 3분 및 3분이었다. Wave 소프트웨어(Agilent)를 사용하여 OCR 비율을 분석하였다. OCR 측정치는 배경(세포를 포함하지 않는 배지 및 기질)으로 정규화되었다.
결과는 트립타민을 CI 기질로 첨가했을 때, 백만 개의 세포 당 0.88 mU 또는 4.4 mU CS 활성의 미토콘드리아 투여량으로 증강된 KG1a 세포가 NT 대조군 세포에 비해 OCR 수준이 각각 29% 및 74% 증가했음을 보여준다. 더욱이, 트립타민과 숙시네이트 둘 모두를 첨가했을 때, CI과 CII의 합계 호흡수(OCR)는, 대조군 비증강 세포(NT)에 비해, 0.88 mU 및 4.4 mU 증강된 세포에서 각각 12% 및 41% 증가하였다(도 6a).
CI 기질로서 트립타민을 첨가하였을 때, 백만 개의 세포 당 0.88 mU 또는 4.4 mU CS 활성의 미토콘드리아 투여량으로 증강된 LCL 세포는 NT 대조군 세포에 비해 OCR 수준이 각각 43% 및 182% 증가하였다. 트립타민과 숙시네이트 둘 모두를 첨가했을 때, CI과 CII의 합계 OCR은, 대조군 비증강 세포(NT)에 비해, 0.88 mU 및 4.4 mU 증강된 세포에서 각각 43% 및 57% 증가하였다(도 6b).
CD34+ 세포의 경우, 결과는, 트립타민의 첨가 시 백만 개의 세포 당 0.88 mU 또는 4.4 mU CS 활성의 미토콘드리아 투여량으로 증강된 CD34+ 세포가 OCR 수준이 각각 39% 및 271% 증가했음을 보여준다(도 6c).
실시예 7
미토콘드리아 풍부화를 평가하기 위한 효소 발현의 검출
세포에서의 태반 미토콘드리아 풍부화를 검출하기 위해 MAO 효소의 존재가 측정된다. 약술하면, 증강된 세포 및 비증강 세포는 MAO 분석 완충액을 사용하여 균질화된다. 균질액을 원심분리하고(4C에서 4분 동안 10,000 x g) 상청액을 수집한다. 대조군, 표준물(H2O2), 반응 완충액(분석 완충액, MAO 기질, 현상액 및 프로브) 및 배경 반응 혼합물(분석 완충액, 현상액 및 프로브)을 제조한다. 샘플 상청액(40 μl)을 반응 플레이트의 웰에 첨가한다. 전체 MAO 활성을 측정하기 위해, 10 μl의 분석 완충액을 지정된 웰에 첨가한다. MAO-A 활성을 측정하기 위해, 10 μl의 10 μM 셀레길린을 지정된 웰에 첨가한다. MAO-B 활성을 측정하기 위해, 10 μL의 10 μM 클로르길린을 지정된 웰에 첨가한다. 반응 혼합물(50 μl)을 각각의 웰에 첨가하고 배경 반응 혼합물(50 μl)을 배경 대조 샘플 웰에 첨가한다. 형광(Ex/Em = 535/587 nm)은 25℃에서 60분 동안 동적 모드에서 측정된다. 증강된 세포에서의 전체 MAO, MAO-A 및/또는 MAO-B 활성의 증가는 세포 미토콘드리아 풍부화를 나타낸다.
실시예 8
PLC-미토콘드리아 검출을 위한 MAOA 염색 기술
MAO-A는 CD34+ 세포가 아닌 태반 세포에서 검출되는 미토콘드리아 단백질이기 때문에, 조혈 줄기 세포의 배경에 대비해 태반 미토콘드리아의 검출에 특이적인 형광 표지 방법(면역형광 기반 분석)이 개발되었다. 이 방법을 사용하면, 이미징 기반 분석을 통해 단일 세포 해상도에서 정량적으로 증강을 측정할 수 있다.
MAO-A 항체(Abcam 카탈로그 #ab200752) 및 TOMM20 항체(Abcam 카탈로그 #ab210047)를 사용하였다. TOMM20은 보편적인 미토콘드리아 항체이며, 분석의 내부 양성 대조군으로 사용되었다. TOMM20은 살아있는 세포에서 미토콘드리아를 염색하는 적색 형광 염료인 MitoTracker(Invitrogen, 카탈로그 # M22426)와 완전히 공동-국지화(colocalize)되는 것으로 밝혀졌다.
건강한 CD34+ 세포를 단리된 태반 미토콘드리아와 함께, 백만 개의 세포 당 4.4 mU(CS 활성 기준)의 미토콘드리아 대 세포 비율로 인큐베이션하였다. 24시간 인큐베이션 후, CD34+ 세포를 3회 세척하였다. NT 세포를 대조군으로 사용하였다(예를 들어, 미토콘드리아를 첨가하지 않은 세포). 세포를 1% BSA 중의 항체, 즉, TOMM20-AF405(최종 희석률 1:5000) 및 Ab MAOA(최종 희석률 1:50)의 항체를 사용하여 얼음 위에서(부드럽게 진탕) 30분 동안 면역염색하였다.
Amnis IMAGESTREAM X MARKII로 세포를 이미징하였다. IDEAS® 분석 소프트웨어로 데이터를 분석하였다.
MAO-A를 사용한 면역형광법은 매우 민감하고 특이성이 높았기 때문에, 태반 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 염색된 반면, 미처리된 세포는 염색되지 않았다.
실시예 9
숙시네이트 이용도
인간 태반과 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 미토콘드리아를 단리하였다. 미토콘드리아가 숙시네이트 기질을 이용하는 능력을 MitoPlate(Biolog)로 분석하였다.
도 8a에 표시된 결과는 태반으로부터 단리된 미토콘드리아가 혈액으로부터 단리된 미토콘드리아에 비해 더 높은 숙시네이트 이용 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
혈액 유래 미토콘드리아와 태반 유래 미토콘드리아 둘 모두 숙시네이트를 이용할 수 있기 때문에(도 8a), 증강된 세포에서의 외인성 미토콘드리아의 상이한 비율에 대한 방법의 민감도 수준을 시험하였다.
태반 유래 미토콘드리아가 숙시네이트를 이용하는 능력은 PBMC로부터 단리된 미토콘드리아의 배경에 대해 시험되었다. 사용된 배경 대조군은 PBMC로부터 단리된 미토콘드리아였다. 50M개의 혈액 유래 미토콘드리아 입자가 1M개의 CD34 세포로부터 단리된 미토콘드리아의 등가물로 사용되었다. 증가하는 양의 태반 유래 미토콘드리아 입자(750k개 내지 35M개)를 50M개의 혈액 유래 미토콘드리아 입자의 배경에 첨가하여, 전체 숙시네이트 이용 활성을 평가하였다.
도 8b에서 알 수 있는 바와 같이, 50M개의 혈액 유래 미토콘드리아 입자의 배경 활성에 대비해 숙시네이트를 사용하는 태반 유래 미토콘드리아의 능력은 고농도 및 저농도의 태반 유래 미토콘드리아에서 명백하였다.
본 발명이 상기 실시예를 참조하여 설명되었지만, 수정 및 변경이 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.
Claims (29)
- 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법으로서,
a) 상기 세포를 대사 기질과 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 대사 기질과의 접촉 후 상기 세포 내의 전자 전달을 측정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 전자 전달을 측정하는 단계는 비색 분석, 형광 분석, 발광 분석 또는 산소 소비에 의한 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아로 풍부화된 것인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아로 풍부화된 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 세포는 CD34+ 세포인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대사 기질은 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4, 숙시네이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 대사 기질은 트립타민인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 대사 기질은 숙시네이트인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포를 외인성 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화된 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비색 분석은 흡광도에 의해 측정되는 것인, 방법.
- 제11항에 있어서, 증가된 흡광도는 상기 세포가 풍부화되었음을 나타내는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포를 상기 대사 기질과 접촉시키는 단계는 NADH 및/또는 FADH2를 생성하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미토콘드리아는 신선한 것, 동결-해동된 것, 또는 이들의 조합인, 방법.
- 세포의 태반 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법으로서, 상기 세포 내의 모노아민 산화효소 A(MAO-A) 및/또는 모노아민 산화효소 B(MAO-B)의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 태반 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 MAO-A 및/또는 MAO-B를 갖는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 세포는 CD34+ 세포인, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포를 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화된 것인, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 MAO-A 및/또는 MAO-B 수준은 질량 분광법에 의해 측정되는, 방법.
- 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법으로서, 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 글리세롤-3-인산 탈수소효소를 갖는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포, 전구 세포 또는 골수 유래 줄기 세포, 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, 거핵구, 적혈구, 비만 세포, 근육모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식 세포, 자연 살해(NK) 세포, 소림프구, T 림프구, B 림프구, 형질 세포, 망상 세포, 골수 조혈 세포, 적혈구 생성 세포 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 세포는 CD34+ 세포인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포를 미토콘드리아와 접촉시킴으로써 풍부화된 것인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아로 풍부화된 것인, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 세포는 태반 미토콘드리아로 풍부화된 것인, 방법.
- 외인성 미토콘드리아가 풍부화된 세포를 식별하기 위한 키트로서,
a) 대사 기질; 및
b) 사용 지침을 포함하는, 키트. - 제26항에 있어서, 상기 대사 기질은 트립타민, D,L-a-글리세롤 PO4, 숙시네이트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트.
- 제27항에 있어서, 상기 미토콘드리아는 태반 미토콘드리아 또는 혈액 유래 미토콘드리아인, 키트.
- 세포의 외인성 미토콘드리아 풍부화를 측정하는 방법으로서,
상기 세포를 대사 기질과 접촉시킨 후 전자 전달을 측정하는 단계, 상기 세포 내의 모노아민 산화효소 A(MAO-A) 및/또는 모노아민 산화효소 B(MAO-B)의 수준을 측정하는 단계, 및/또는 상기 세포 내의 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 세포를 대사 기질과 접촉시킨 후, 미토콘드리아가 풍부화된 세포는 미토콘드리아가 풍부화되지 않은 세포와 비교하여 증가된 수준의 전자 전달, 모노아민 산화효소 A(MAO-A), 모노아민 산화효소 B(MAO-B) 및/또는 글리세롤-3-인산 탈수소효소를 갖고; 비색 분석은 흡광도에 의해 측정되고 흡광도의 증가는 미토콘드리아 풍부화를 나타내는, 방법.
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