KR20230134530A - 펩티드 샘플 제조를 위한 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용의 측면은 샘플 중의 하나 이상의 표적 분자의 제조 및/또는 연구를 위한 방법, 물품, 키트, 및/또는 시스템에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 펩티드, 단백질, 또는 그의 단편 또는 유도체이다. 본 개시내용의 방법, 물품, 키트, 및/또는 시스템의 사용을 통해, 표적 분자는 일부 실시양태에서 보다 용이하게 시퀀싱되거나 시퀀싱을 위해 제조될 수 있다.
Description
관련 출원
본 출원은 발명의 명칭이 "펩티드 샘플 제조를 위한 장치 및 방법"인 2021년 1월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/139,332에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
생체분자, 예컨대 펩티드의 조작 및/또는 제조에 관한 방법, 물품, 시스템, 및 키트가 일반적으로 기재된다.
프로테오믹스는 생물학적 시스템의 연구에서 중요한 것으로서 부상하였다. 개별적 유기체 또는 샘플 유형의 이러한 분석은 개선된 진단 및 치료 전략을 초래하는 세포적 프로세스 및 반응 패턴에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 단백질 조성물 및 변형을 둘러싼 복잡성은 생물학적 샘플에 대한 대규모 시퀀싱 정보를 결정하는데 있어서 과제를 제공한다.
단백질 조성물을 조작하기 (예를 들어, 제조하기) 위한 개선되고 보다 편리한 기술 및 시스템이 요망된다.
요약
본 개시내용의 측면은 샘플 중의 하나 이상의 표적 분자의 제조 및/또는 연구를 위한 방법, 물품, 키트, 및/또는 시스템에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 펩티드, 단백질, 또는 그의 단편 또는 유도체이다. 본 개시내용의 방법, 물품, 키트, 및/또는 시스템의 사용을 통해, 표적 분자는 일부 실시양태에서 보다 용이하게 시퀀싱되거나 시퀀싱을 위해 제조될 수 있다. 본 발명의 요지는 일부 경우에 상호관련된 생성물, 특정 문제에 대한 대안적 해법, 및/또는 하나 이상의 시스템 및/또는 물품의 복수의 상이한 용도를 수반한다.
한 측면에서, 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치가 기재된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치는 아미노산 측쇄를 유도체화할 수 있는 유도체화제를 수용하도록 구성된 유도체화제 저장소; 및 하나 이상의 마이크로채널을 통해 유도체화제 저장소에 유동적으로 연결된 켄칭 영역으로서, 여기서 켄칭 영역은 유도체화제와 반응할 수 있는 관능기를 포함하는 표면을 갖는 고체 기재를 포함하는 것인 켄칭 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치는 샘플의 가열을 용이하게 하도록 구성된 인큐베이션 영역으로서, 여기서 인큐베이션 영역은 인큐베이션 채널을 포함하고, 여기서 인큐베이션 채널은 마이크로채널인 인큐베이션 영역; 유도체화 영역; 및 아미노산 측쇄를 유도체화할 수 있는 유도체화제를 수용하도록 구성된 유도체화제 저장소로서, 여기서 유도체화제 저장소는 유체가 인큐베이션 채널로부터, 유도체화제 저장소를 통해, 및 유도체화 영역으로 수송될 수 있도록 인큐베이션 채널 및 유도체화 영역에 유동적으로 연결되는 것인 유도체화제 저장소를 포함한다.
또 다른 측면에서, 펩티드 샘플을 제조하기 위한 키트가 기재된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플을 제조하기 위한 키트는 인큐베이션 채널을 포함하는 인큐베이션 영역을 포함하는 유체 장치로서, 여기서 인큐베이션 채널은 마이크로채널인 유체 장치; 및 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제로부터 선택되는 하나 이상의 시약을 포함하고; 여기서 인큐베이션 영역은 하나 이상의 시약을 수용하도록 구성된다.
또 다른 측면에서, 펩티드 샘플을 제조하는 방법이 기재된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플을 제조하는 방법은 적어도 하나의 마이크로채널을 포함하는 유체 장치의 인큐베이션 영역에서 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제를 포함하는 혼합물을 포함하는 펩티드 샘플을 인큐베이션하여 소화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계를 포함하고; 여기서 인큐베이션 동안: 환원제는 단백질의 아미노산 측쇄를 환원시켜 환원된 아미노산 측쇄를 형성하고, 아미노산 측쇄 캡핑제는 환원된 아미노산 측쇄와 공유 결합을 형성하여 캡핑된 아미노산 측쇄를 형성하고, 단백질 소화제는 캡핑된 아미노산 측쇄를 포함하는 단백질의 단백질분해를 유도하여 하나 이상의 캡핑된 펩티드를 형성하고, 그에 의해 소화된 펩티드 샘플을 형성한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플을 제조하는 방법은 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 제1 유체 장치 부분의 인큐베이션 영역에서 펩티드 샘플을 인큐베이션하여 소화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계; 및 소화된 펩티드 샘플의 하나 이상의 펩티드를 관능화하여 관능화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 관능화 단계는 제2 유체 장치 부분의 유도체화 영역에서 유도체화제를 사용하여 하나 이상의 펩티드의 아미노산 측쇄를 유도체화하여 하나 이상의 유도체화된 펩티드 및 과량의 유도체화제를 포함하는 비켄칭된 혼합물을 형성하고, 제3 유체 장치 부분의 켄칭 영역에서 과량의 유도체화제의 적어도 일부를 제거함으로써 비켄칭된 혼합물을 켄칭하여 켄칭된 혼합물을 형성하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 이점 및 신규한 특색은 첨부된 도면과 함께 고려되는 경우 본 발명의 다양한 비-제한적 실시양태의 하기 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 본 명세서 및 참조로 포함되는 문서가 상충되고/거나 불일치하는 개시내용을 포함하는 경우, 본 명세서가 지배할 것이다.
본 발명의 비-제한적 실시양태는 개략적이고, 달리 지시되지 않는 한, 일정한 비율로 그려지는 것으로 의도되지 않는 첨부된 도면을 참조하여 예로서 기재된다. 도면의 일부 실시양태에서, 예시된 각각의 동일한 또는 거의 동일한 성분은 전형적으로 단일 수치에 의해 나타내어진다. 명확성의 목적을 위해, 모든 성분이 모든 도면에 표지되지는 않으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 이해하는 것을 허용하기 위해 예시가 필요하지 않은 경우 본 발명의 각각의 실시양태의 모든 성분이 나타내어지지는 않는다.
도 1a 내지 1d는 특정 실시양태에 따른 인큐베이션 영역, 인큐베이션 채널, 유도체화 영역, 유도체화제 저장소, 및 유도체화 시약 저장소를 포함하는 유체 장치의 개략적 예시를 나타내고;
도 2a 내지 2b는 특정 실시양태에 따른 유도체화제 저장소 및 켄칭 영역을 포함하는 유체 장치의 개략적 예시를 나타내고;
도 3a 내지 3b는 특정 실시양태에 따른 펩티드 샘플의 소화를 위한 예시적인 작업흐름을 나타내고;
도 4는 특정 실시양태에 따른 고정화 복합체에 연결된 펩티드를 나타내고;
도 5는 특정 실시양태에 따른 고정화 복합체의 제조를 위한 반응 스킴을 나타내고;
도 6은 특정 실시양태에 따른 시퀀싱을 위한 펩티드를 고정화하는 프로세스를 나타내고;
도 7은 특정 실시양태에 따른 유도체화 반응 스킴을 나타내고;
도 8은 특정 실시양태에 따른 펩티드 고정화의 스킴을 나타내고;
도 9는 특정 실시양태에 따른 샘플 제조 모듈 및 검출 모듈을 포함하는 시스템의 개략적 예시를 나타내고;
도 10a 내지 10b는 특정 실시양태에 따른 유체 장치 부분의 배열의 개략적 예시를 나타내고;
도 11은 특정 실시양태에 따른 유체 장치의 채널의 횡단면 개략적 예시를 나타내고;
도 12a 내지 12b는 특정 실시양태에 따른 다수의 유체 장치를 포함하는 샘플 제조 장치를 나타내고;
도 13a 내지 13b는 특정 실시양태에 따른 단백질을 소화시키고 제조하는 프로세스를 나타내고;
도 14a 내지 14i는 특정 실시양태에 따른 인큐베이션 영역, 유도체화 영역, 및 켄칭 영역을 포함하는 유체 장치의 개략적 예시를 나타내고;
도 15a 내지 15d는 특정 실시양태에 따른 예시적인 유체 장치에서 제조된 펩티드 샘플을 시퀀싱하는 것의 결과를 나타내고;
도 16a 내지 16b는 특정 실시양태에 따른 인큐베이션 영역을 포함하는 유체 장치 부분의 개략적 예시를 나타내고;
도 17a 내지 17b는 특정 실시양태에 따른 유도체화 영역을 포함하는 유체 장치 부분의 개략적 예시를 나타낸다.
도 1a 내지 1d는 특정 실시양태에 따른 인큐베이션 영역, 인큐베이션 채널, 유도체화 영역, 유도체화제 저장소, 및 유도체화 시약 저장소를 포함하는 유체 장치의 개략적 예시를 나타내고;
도 2a 내지 2b는 특정 실시양태에 따른 유도체화제 저장소 및 켄칭 영역을 포함하는 유체 장치의 개략적 예시를 나타내고;
도 3a 내지 3b는 특정 실시양태에 따른 펩티드 샘플의 소화를 위한 예시적인 작업흐름을 나타내고;
도 4는 특정 실시양태에 따른 고정화 복합체에 연결된 펩티드를 나타내고;
도 5는 특정 실시양태에 따른 고정화 복합체의 제조를 위한 반응 스킴을 나타내고;
도 6은 특정 실시양태에 따른 시퀀싱을 위한 펩티드를 고정화하는 프로세스를 나타내고;
도 7은 특정 실시양태에 따른 유도체화 반응 스킴을 나타내고;
도 8은 특정 실시양태에 따른 펩티드 고정화의 스킴을 나타내고;
도 9는 특정 실시양태에 따른 샘플 제조 모듈 및 검출 모듈을 포함하는 시스템의 개략적 예시를 나타내고;
도 10a 내지 10b는 특정 실시양태에 따른 유체 장치 부분의 배열의 개략적 예시를 나타내고;
도 11은 특정 실시양태에 따른 유체 장치의 채널의 횡단면 개략적 예시를 나타내고;
도 12a 내지 12b는 특정 실시양태에 따른 다수의 유체 장치를 포함하는 샘플 제조 장치를 나타내고;
도 13a 내지 13b는 특정 실시양태에 따른 단백질을 소화시키고 제조하는 프로세스를 나타내고;
도 14a 내지 14i는 특정 실시양태에 따른 인큐베이션 영역, 유도체화 영역, 및 켄칭 영역을 포함하는 유체 장치의 개략적 예시를 나타내고;
도 15a 내지 15d는 특정 실시양태에 따른 예시적인 유체 장치에서 제조된 펩티드 샘플을 시퀀싱하는 것의 결과를 나타내고;
도 16a 내지 16b는 특정 실시양태에 따른 인큐베이션 영역을 포함하는 유체 장치 부분의 개략적 예시를 나타내고;
도 17a 내지 17b는 특정 실시양태에 따른 유도체화 영역을 포함하는 유체 장치 부분의 개략적 예시를 나타낸다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 (예를 들어, 유체 장치를 사용한) 펩티드 샘플 (예를 들어 펩티드 라이브러리)의 제조 및 분석을 위한 방법, 물품, 시스템, 및 키트를 제공한다. 일부 이러한 실시양태는 (예를 들어, 펩티드/단백질 시퀀싱을 위한) 펩티드 샘플의 제조 및 분석을 가속화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 물품, 및 키트는 유체 장치의 부분 내의 펩티드 샘플의 인큐베이션, 소화, 관능화 (예를 들어 유도체화를 통해), 켄칭 (예를 들어, 관능화된 고체 기재와의 접촉을 통해), 및/또는 정제를 용이하게 한다. 일부 경우에, 유체 장치의 부분은 서로에 연결될 수 있다 (예를 들어, 동일한 카트리지의 일부로서). 이들 실시양태는 펩티드 샘플의 제조 및 분석을 위한 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이들 실시양태는 그렇지 않다면 직접적 인간 관여를 요구하였을 것인 개재하는 작용, 예컨대 혼합된 화합물의 청소 및 분리에 대한 필요 없이, 펩티드 샘플의 제조 및 분석의 2개 이상의 단계가 자동으로 및 순차적으로 (및 일부 경우에 동시에) 수행되는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 단백질 또는 펩티드를 포함하고, 펩티드 샘플의 분석은 단백질 또는 펩티드의 시퀀싱을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 제조를 위해 구성된 유체 장치 (예를 들어, 카트리지)가 제공된다. 일부 이러한 구성은 예를 들어, 펩티드를 화학적으로 변형시키기 위한 (예를 들어, 소화/단편화, 유도체화, 또는 이들의 조합을 위한) 시약을 위해 적응된, 및 일부 경우에 이를 포함하는 영역 (예를 들어, 저장소 및/또는 채널)을 포함할 수 있다. 유체 장치는 하나 이상의 마이크로채널을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 장치는 펩티드의 소화 및/또는 다른 변형, 예컨대 접합을 용이하게 하도록 구성된 인큐베이션 영역을 포함한다 (예를 들어, 구불구불한 마이크로채널 및/또는 열적으로 전도성 고체 물질을 포함함으로써). 펩티드의 소화를 위한 다수의 화학적 변형은 유체 장치에서 자동으로 일어날 수 있다 (예를 들어, 다수의 시약, 예컨대 환원제, 캡핑제, 및/또는 소화제의 혼합물을 인큐베이션 채널로 보냄으로써). 유체 장치 (예를 들어, 카트리지)는 유도체화 영역 및 유도체화제 또는 시약 저장소 (예를 들어, 관능화 프로세스의 일부로서)를 포함할 수 있고, 또한 과량의 시약의 제거 및/또는 불활성화를 용이하게 하는 켄칭 영역을 포함할 수 있다. 유체 장치 (예를 들어, 미세유체 카트리지)는 샘플 제조 모듈 (예를 들어, 연동 펌프를 포함함) 및 검출 모듈 (예를 들어, 펩티드 시퀀싱 모듈)을 포함하는 시스템에 작동적으로 커플링되도록 구성될 수 있다.
단백질 샘플의 제조 (및 일부 경우에, 분석)를 위한 작업흐름은 대개 몇몇 단계를 요구한다. 각각의 단계는 통상적으로 물질 소실, 비효율성, 및 시간 비용의 정도와 연관될 수 있기 때문에, 작업흐름의 단계의 일부 또는 전부를 제거하거나 자동화하는 접근법은 다수의 유익을 제공한다. 그러나, 이들 단계를 제거하거나 자동화하는 것은, 화학적 불순물 또는 결함의 존재가 또한 예상치 않고 해로운 효과를 생성할 수 있기 때문에, 간단한 프로세스가 아니다.
펩티드 샘플의 제조 (및 일부 경우에, 분석)를 위한 작업흐름을 단순화하기 위한 한 접근법은 유체 장치 (예를 들어, 미세유체 장치)를 사용한 하나 이상의 단계의 수행이다. 이러한 장치는 펩티드 샘플의 제조를 위한 화학적 프로세스의 이례적인 제어를 제공하여 신뢰성 및 수율을 증가시킬 수 있다. 그러나, 특정 기존의 유체 장치를 사용하는 경우, 일부 단계를 수동으로 수행하는 것이 여전히 종종 필요하다. 본 개시내용의 맥락에서, 본 발명자들은 펩티드 샘플의 제조 및 분석의 단계를 자동화할 필요를 인식하였고, 이 필요를 충족시키는 발명적 해법을 제공하였다.
한 측면에서, 펩티드 샘플을 제조하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 방법은 유체 장치의 인큐베이션 영역에서 펩티드 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 영역은 제1 유체 장치 부분의 일부이다. 인큐베이션 영역은 샘플의 가열을 용이하게 하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 영역은 인큐베이션 채널을 포함한다. 펩티드 샘플은 인큐베이션 영역의 인큐베이션 채널에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플을 인큐베이션하는 것은 소화된 펩티드 샘플을 형성한다. 예를 들어, 도 1a 내지 1d는 인큐베이션 영역 (110)을 포함하는 유체 장치 (100)의 개략적 예시를 제시한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 인큐베이션 영역 (110)의 인큐베이션 채널 (112)에서 인큐베이션된다. 잠재적으로 적합한 인큐베이션 조건의 상세사항은 하기에 보다 상세하게 기재된다.
또 다른 측면에서, 방법은 소화된 펩티드 샘플의 하나 이상의 펩티드를 관능화하는 것을 포함한다. 소화된 펩티드 샘플의 펩티드를 관능화하는 것은 관능화된 펩티드 샘플을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 관능화는 유도체화제를 사용하여 하나 이상의 펩티드의 아미노산 측쇄를 유도체화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 소화된 펩티드는 유도체화제에 노출될 수 있다 (예를 들어, 유도체화제를 펩티드를 포함하는 용액에 용해시키고, 펩티드를 포함하는 용액 및 유도체화제를 포함하는 용액을 혼합함으로써 등). 일부 실시양태에서, 유도체화제는 아미노산 측쇄를 유도체화할 수 있다. 아미노산 측쇄는 제2 유체 장치 부분의 유도체화 영역에서 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 도 1a에서, 하나 이상의 펩티드의 아미노산 측쇄는 유도체화 영역 (120)에서 유도체화될 수 있다. 아미노산을 유도체화하는 것은 비켄칭된 혼합물을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 비켄칭된 혼합물은 하나 이상의 유도체화된 펩티드 및 과량의 유도체화제를 포함한다. 일부 실시양태는 비켄칭된 혼합물의 적어도 일부를 유도체화 영역으로부터 켄칭 영역으로 자동으로 수송하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 이 맥락에서, 프로세스는 일반적으로 그것이 프로세스의 단계 동안 또는 사이에 직접적 인간 개입 없이 수행되는 경우 자동화된 것으로 간주된다. 대개, 자동화된 프로세스는 미리 프로그래밍된 명령에 따름으로써 프로세스의 단계를 수행할 수 있는 컴퓨터-실행된 컨트롤러에 의해 수행된다. 명령은 미리 프로그래밍되거나 (예를 들어, 제조자 또는 사용자에 의해), 프로세스 동안 사용자에 의해 수동으로 제출되거나, 또는 2가지의 조합일 수 있다. 컴퓨터-실행된 컨트롤러와 접속하는 인간 사용자는 이 맥락에서 직접적 인간 개입으로 간주되지 않는다. 시약 및/또는 샘플 성분을 수동으로 도입하거나, 제거하거나, 혼합하거나, 수송하는 사용자 (예를 들어, 피펫팅/시린징, 붓기 등에 의해)는 직접적 인간 개입의 예이다.
일부 실시양태에서, 방법은 비켄칭된 혼합물을 켄칭하여 켄칭된 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 비켄칭된 혼합물을 켄칭하는 것은 켄칭 영역에서 과량의 유도체화제의 적어도 일부 (예를 들어, 적어도 10 wt%, 적어도 25 wt%, 적어도 50 wt%, 적어도 75 wt%, 적어도 90 wt%, 적어도 95 wt%, 적어도 99 wt%, 또는 그 초과)를 제거할 수 있다. 켄칭 영역은 예를 들어, 제3 유체 장치 부분의 일부일 수 있다. 켄칭 영역은 고체 기재를 포함할 수 있다. 고체 기재는 관능기를 포함하는 표면을 가질 수 있다. 관능기는 유도체화제와 반응할 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 2b는 일부 실시양태에 따른 켄칭 영역 (130)을 포함하는 유체 장치 부분을 예시한다. 켄칭 영역 (130)의 고체 기재 표면 (132)은 유도체화제와 반응할 수 있는 관능기 (예를 들어, 아민) (134)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 영역으로부터의 소화된 펩티드 샘플의 적어도 일부는 인큐베이션 영역으로부터 유도체화 영역으로 자동으로 수송된다. 일부 실시양태에서, 관능기는 예를 들어 반응에 의해 (예를 들어, 하나 이상의 공유 결합, 정전기적 상호작용, 및/또는 수소 결합을 형성함으로써) 유도체화제를 고정화할 수 있다.
또 다른 측면에서, 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치가 기재된다. 일부 실시양태에서, 유체 장치는 유도체화제 저장소를 포함한다. 유도체화제 저장소는 유도체화제를 수용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 장치는 켄칭 영역을 추가로 포함한다. 켄칭 영역은 유도체화제 저장소에 유동적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 하나 이상의 채널을 통해 유도체화제 저장소에 연결된다. 이들 채널의 일부 또는 전부는 마이크로채널일 수 있다. 예를 들어, 도 2a는 유도체화제 저장소 (122) 및 켄칭 영역 (130)을 포함하는 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치를 예시하고, 여기서 켄칭 영역 (130)은 채널 (예를 들어, 마이크로채널) (180)에 의해 유도체화제 저장소 (122)에 연결된다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 유도체화 영역 및 유도체화제 저장소를 포함하는 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치이다. 일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 유도체화제를 수용하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 유도체화제를 포함한다 (예를 들어, 유도체화제의 적어도 일부는 유도체화 영역 내에 함유됨). 예를 들어, 도 1a에서, 유체 장치 (100)는 유도체화 영역 (120) 및 유도체화제 저장소 (122)를 포함하고, 인큐베이션 채널 (112)을 포함하는 인큐베이션 영역 (110)을 추가로 포함한다. 이 실시양태에서, 유도체화제 저장소 (122)는 유도체화제 (123)를 수용하도록 구성된다 (예를 들어, 펩티드 제조 프로세스 전에 및/또는 동안). 일부 실시양태에서, 유체 장치는 인큐베이션 채널을 포함하는 인큐베이션 영역을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 유도체화제 저장소는 유체 (예를 들어, 펩티드 샘플을 포함함)가 인큐베이션 채널로부터, 유도체화제 저장소를 통해, 및 유도체화 영역으로 수송될 수 있도록 인큐베이션 채널 및 유도체화 영역에 유동적으로 연결된다. 예를 들어, 도 1a에서, 유도체화제 저장소 (122)는 유체가 인큐베이션 채널 (112)로부터, 유도체화제 저장소 (122)를 통해, 및 유도체화 영역 (120)으로 수송될 수 있도록 인큐베이션 채널 (112) 및 유도체화 영역 (120)에 유동적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 유도체화 시약 저장소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도체화 시약 저장소는 유도체화 시약을 수용하도록 구성된다. 예를 들어, 도 1b는 유도체화 시약 (125)을 수용하도록 구성된 유도체화 시약 저장소 (124)를 포함하는 유체 장치 (100)의 개략적 예시를 제시한다. 일부 실시양태에서, 유도체화 시약은 유도체화제 및 아미노산 측쇄 사이의 반응을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 유도체화 시약은 유도체화 반응을 위한 촉매일 수 있다. 구체적인 예로서, 유도체화제는 아지드 전달 시약, 예컨대 이미다졸-1-술포닐 아지드를 포함할 수 있고, 유도체화 시약은 Cu2+의 공급원, 예컨대 황산구리일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도체화제 저장소 및 유도체화 시약 저장소는 유체가 인큐베이션 영역 (예를 들어 인큐베이션 채널)으로부터, 유도체화제 저장소 및 유도체화 시약 저장소를 통해, 및 유도체화 영역으로 수송될 수 있도록 유동적으로 연결된다. 예를 들어, 도 1b에서, 유체는 인큐베이션 영역 (110)으로부터, 유도체화제 저장소 (122)를 통해, 유도체화 시약 저장소 (124)를 통해, 및 유도체화 영역 (120)으로 수송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체는 순서대로 인큐베이션 영역 (예를 들어 인큐베이션 채널)으로부터, 유도체화제 저장소 및 유도체화 시약 저장소를 통해, 및 유도체화 영역으로 수송될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유도체화 시약 저장소는 제1 유도체화 시약 저장소이고, 유체 장치는 제2 유도체화 시약 저장소를 추가로 포함한다. 예를 들어, 도 1c는 제1 유도체화 시약 저장소 (124) 및 제2 유도체화 시약 저장소 (126)를 포함하는 유체 장치 (100)의 개략적 예시를 제시한다. 일부 실시양태에서, 제2 유도체화 시약 저장소는 제2 유도체화 시약을 수용하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 유도체화 시약은 유도체화제 및 아미노산 측쇄 사이의 반응을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 제2 유도체화 시약은 pH 조정 시약, 예컨대 탄산칼륨 (K2CO3)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도체화제 저장소, 제1 유도체화 시약 저장소, 및 제2 유도체화 시약 저장소는 유체가 순서대로 인큐베이션 영역 (예를 들어 인큐베이션 채널)으로부터, 제2 유도체화 시약 저장소를 통해, 유도체화제 저장소를 통해, 제1 유도체화 시약 저장소를 통해, 및 유도체화 영역으로 수송될 수 있도록 유동적으로 연결된다. 예를 들어, 도 1c에서, 유체는 인큐베이션 영역 (110)으로부터, 제2 유도체화 시약 저장소 (126) (제2 유도체화 시약 (127)을 수용하도록 구성됨)를 통해, 유도체화제 저장소 (122) (유도체화제 (123)를 수용하도록 구성됨)를 통해, 제1 유도체화 시약 저장소 (124) (제1 유도체화 시약 (125)을 수용하도록 구성됨)를 통해, 및 유도체화 영역 (120)으로 수송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 유도체화 시약 (예를 들어, Cu2+의 공급원, 예컨대 황산구리)은 제1 유도체화 시약 및 제2 유도체화 시약이 소화된 펩티드 샘플과 합해질 (예를 들어, 혼합될) 때까지 제2 유도체화 시약 (예를 들어, pH 조정 시약, 예컨대 염기성 완충제를 포함하는 염, 예컨대 K2CO3)과 노출되지 (예를 들어, 혼합되지) 않는다. 제1 유도체화 시약 및 제2 유도체화 시약의 사전-혼합물을 회피하는 것은 제1 유도체화 시약 및 제2 유도체화가 효율적인 유도체화에 유해하게 영향을 미치는 방식으로 반응할 수 있는 일부 경우에 유익할 수 있다.
또 다른 측면에서, 펩티드 샘플을 제조하기 위한 키트가 기재된다. 일부 실시양태에서, 키트는 유체 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 시약을 포함한다. 시약은 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및/또는 단백질 소화제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제로부터 선택되는 2개 이상의 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제의 각각을 포함한다. 일부 경우에, 유체 장치는 시약 중 하나 이상을 수용하도록 구성된 인큐베이션 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 및 시약은 개별적으로 패키징된다. 일부 실시양태에서, 키트의 2개 이상의 부분 (예를 들어 유체 장치, 시약)은 함께 패키징된다. 일부 실시양태에서, 모든 키트 성분은 함께 패키징된다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 펩티드 샘플에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 하나 이상의 펩티드 (예를 들어, 단백질)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 액체 용액 (예를 들어, 수성 완충제)에 적어도 부분적으로 (또는 완전히) 용해된다. 반드시 모든 실시양태에서는 아니지만 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및/또는 단백질 소화제를 포함하는 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제를 포함하는 혼합물을 포함한다.
임의의 적합한 환원제는 펩티드 샘플 내의 단백질을 환원시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디술피드-결합을 환원시키는데 적합하다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디술피드 결합을 가역적으로 환원시킬 수 있다. 적합한 가역적 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), β-메르캅토에탄올 (BME), 및/또는 글루타티온 (GSH)과 같은 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디술피드 결합을 비가역적으로 환원시킬 수 있다. 적합한 비가역적 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)과 같은 화합물을 포함할 수 있다. 일부 구체적인 실시양태에서, 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 포함한다.
임의의 적합한 아미노산 측쇄 캡핑제는 펩티드 샘플 내의 단백질의 아미노산 측쇄를 캡핑하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 캡핑제는 디술피드 결합의 형성을 방지한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 캡핑제는 아미노산 측쇄가 추가의 반응성, 예컨대 친핵체/친전자체 또는 산화환원 반응성을 겪는 것을 방지한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 캡핑제는 시스테인 캡핑제이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 캡핑제는 술프히드릴-반응성 알킬화 시약 (예를 들어 시스테인 알킬화제)이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 캡핑제는 할로아세트아미드 (예를 들어 클로로아세트아미드, 아이오도아세트아미드) 또는 할로아세테이트/할로아세트산 (예를 들어, 클로로아세테이트/클로로아세트산, 아이오도아세테이트/아이오도아세트산)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 캡핑제는 방향족 벤질 할라이드이다. 예를 들어, 아미노산 측쇄 캡핑제는 벤젠 방향족 기, 피리딘 방향족 기, 피라진 방향족 기 등에 기반한 방향족 벤질 할라이드 유도체일 수 있다. 적합한 시스테인 알킬화제의 다른 예는 4-비닐피리딘, 아크릴아미드, 및 메탄티오술포네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 캡핑제는 아이오도아세트아미드를 포함한다.
임의의 적합한 단백질 소화 방법이 사용될 수 있으며, 몇몇은 하기에 상세하게 기재된다. 일부 구체적인 실시양태에서, 단백질 소화 시약은 효소적 단백질 소화 시약이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질 소화제는 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 트립신, Lys-C, Asp-N, 및/또는 Glu-C를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 트립신이다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 특정 범위 내의 pH를 유지하도록 완충된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 실온에서 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 및/또는 그 초과의 pH를 유지하도록 완충된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 실온에서 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 및/또는 그 미만의 pH를 유지하도록 완충된다. 이들 범위의 조합은 가능하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 6 내지 9의 pH를 유지하도록 완충된다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 제1 단계를 위해 제1 pH 범위로 완충되고, 제2 단계를 위해 제2 pH 범위로 완충될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 인큐베이션 동안 6 내지 9의 pH로 완충되고, 이어서 유도체화 단계를 위해 10 내지 11의 pH로 완충된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 및/또는 10개 또는 그 초과의 단계를 위해 요망되는 pH 범위로 완충된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 인큐베이션 동안 6 내지 9의 pH로 완충되고, 이어서 유도체화 단계를 위해 10 내지 11의 pH로 완충된 후, 고정화 복합체 형성 단계 및 정제 단계를 위해 7 내지 8의 pH로 완충된다.
펩티드 샘플은 펩티드 샘플의 목적하는 pH 범위에 적합한 임의의 완충제로 완충될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 펩티드 샘플에 대해 6 내지 9의 pH를 유지하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 pH 범위에 대해 적절한 예시적인 완충제는 개별적으로 또는 조합으로 사용되어 목적하는 범위 내의 pH를 안정화할 수 있는 HEPES 완충제, 포스페이트 완충제 (예를 들어 PBS), 트리스(Tris), 비스-트리스(Bis-Tris), 카르보네이트 완충제 (예를 들어 카르보네이트, 예컨대 탄산나트륨 또는 탄산칼륨; 및/또는 비카르보네이트, 예컨대 중탄산나트륨을 포함하는 완충제)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 pH 범위에 대해 적절한 완충제는 HEPES 완충제, 포스페이트 완충제 (예를 들어 PBS), 및/또는 카르보네이트 완충제 (예를 들어 카르보네이트, 예컨대 탄산나트륨 또는 탄산칼륨; 및/또는 비카르보네이트, 예컨대 중탄산나트륨을 포함하는 완충제)를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 및 많은 다른 완충제 시스템에 익숙할 것이며, 비-열거된 완충제 시스템의 사용이 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 생물학적 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 혈액, 타액, 가래, 대변, 소변 또는 협측 스왑 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 또는 임의의 다른 포유동물로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 박테리아 세포 배양물 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 박테리아 세포 배양물)로부터의 것이다. 박테리아 세포 배양물은 그람 양성 박테리아 세포 및/또는 그람 음성 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 이전에 추출된 정제된 샘플 단백질이다. 혈액 샘플은 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)로부터의 신선하게 채혈된 혈액 샘플 또는 건조된 혈액 샘플 (예를 들어, 고체 매체 (예를 들어, 구트리에(Guthrie) 카드) 상에서 보존됨)일 수 있다. 혈액 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 적혈구, 및/또는 백혈구를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플 (예를 들어, 세포 또는 조직을 포함하는 샘플)은 본 개시내용에 따른 프로세스에서 제조될, 예를 들어, 용해될 (예를 들어, 파괴될, 분해될 및/또는 다르게는 소화될) 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조되는, 예를 들어, 용해되는 펩티드 샘플은 배양된 세포, 생검 (예를 들어, 암 환자, 예를 들어, 인간 암 환자로부터의 종양 생검)으로부터의 조직 샘플, 또는 임의의 다른 임상적 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 조직을 포함하는 펩티드 샘플은 상기 세포 또는 조직으로부터 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질)를 방출하는 공지된 물리적 또는 화학적 방법론 중 임의의 하나를 사용하여 용해된다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 전해질적 방법, 효소적 방법, 세정제-기반 방법, 및/또는 기계적 균질화를 사용하여 용해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플 (예를 들어, 복합체 조직, 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아)은 일련으로 수행되는 다수의 용해 방법을 요구할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플이 세포 또는 조직을 포함하지 않는 경우 (예를 들어, 정제된 단백질을 포함하는 펩티드 샘플), 용해 단계는 생략될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플의 용해는 표적 단백질(들)을 단리하기 위해 수행된다. 일부 실시양태에서, 용해 방법은 펩티드 샘플을 분쇄하는 분쇄기의 사용, 초음파처리, 표면 음파 (SAW), 동결-해동 사이클, 가열, 세정제의 첨가, 단백질 분해제 (예를 들어, 효소, 예컨대 히드롤라제 또는 프로테아제)의 첨가, 및/또는 세포벽 소화 효소 (예를 들어, 리소자임 또는 지몰라제)의 첨가를 추가로 포함한다. 용해를 위한 예시적인 세정제 (예를 들어, 비-이온성 세정제)는 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴리소르베이트 및 알킬페놀 에톡실레이트, 바람직하게는 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬글루코시드 및/또는 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 방법은 목적하는 온도 (예를 들어, 적어도 60℃, 적어도 70℃, 적어도 80℃, 적어도 90℃, 또는 적어도 95℃)에서 적어도 1 내지 30분, 1 내지 25분, 5 내지 25분, 5 내지 20분, 10 내지 30분, 5 내지 10분, 10 내지 20분, 또는 적어도 5분 동안의 펩티드 샘플의 가열을 수반한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 완충제 시스템의 존재 하에서 제조, 예를 들어 용해된다. 이 완충제 시스템은 본원에 기재된 그러한 방법을 포함하는 임의의 공지된 용해 방법론 동안 펩티드 샘플의 슬러리를 제조하고/거나, 펩티드 샘플을 현탁시키고/거나, 펩티드 샘플을 안정화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 RIPA 완충제, 구아니딘-HCl 완충제를 포함하는 GCI 완충제, Gly-NP40 완충제, TRIS 완충제, HEPES 완충제, 또는 임의의 다른 공지된 완충 용액의 존재 하에서 제조, 예를 들어, 용해된다.
본원에 기재된 많은 용해 방법은 펩티드 샘플의 세포벽이 파괴되도록 펩티드 샘플을 기계적으로 균질화함으로써 펩티드 샘플이 용해되는 것을 허용한다. 예를 들어, 기계적 균질화에 의한 용해를 유발하는 방법은 비드-비팅, 가열 (예를 들어, 세포벽을 파괴하는데 충분히 높은 온도, 예를 들어, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 또는 95℃ 초과로), 시린지/니들/마이크로채널 통과 (전단을 유발하기 위해), 초음파처리, 또는 그라인더로의 침연을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 임의의 용해 방법론은 임의의 다른 용해 방법론과 조합될 수 있다. 예를 들어, 임의의 용해 방법론은 용해의 속도를 빨리 하기 위해 가열 및/또는 초음파처리 및/또는 시린지/니들/마이크로채널 통과와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플 제조는 세포 파괴 (즉, 용해 후 원하지 않는 세포 및 조직 요소의 후속 제거)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 파괴는 단백질 침전을 수반한다. 일부 실시양태에서, 침전 후, 용해되고 파괴된 펩티드 샘플은 원심분리로 처리된다. 일부 실시양태에서, 원심분리 후, 상청액은 버려진다. 침전은 문헌 [Winter, D. and H. Steen (2011). "Optimization of cell lysis and protein digestion protocols for the analysis of HeLa S3 cells by LC-MS/MS." PROTEOMICS 11(24): 4726-4730]에 기재된 그러한 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 프로세스를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드는 면역침전된다. 일부 실시양태에서, 침전된 단백질의 원심분리에 이어서 상청액을 버리고, 펠릿 분획을 후속 세척 (예를 들어, 클로로포름/메탄올 또는 트리클로로아세트산을 사용한 세척)한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플 (예를 들어, 표적 단백질을 포함하는 펩티드 샘플)은 본 개시내용에 따른 프로세스에서 예를 들어, 용해 후에 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 크로마토그래피 (예를 들어, 펩티드 샘플에 선택적으로 결합하는 친화성 크로마토그래피) 또는 전기영동을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 침전제의 존재 하에서 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제 단계 또는 방법 후, 펩티드 샘플은 용리 완충제를 사용하여 정제 매트릭스 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 매트릭스)로부터 세척되고/거나 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제 단계 또는 방법은 가역적으로 전환가능한 중합체, 예컨대 전기활성 중합체의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 다공성 매트릭스 (예를 들어, 셀룰로스 아세테이트, 아가로스, 아크릴아미드)를 통한 펩티드 샘플의 전기영동적 통과에 의해 초기에 정제될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 분자(들)는 풍부화 전에 단편화/소화된다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 풍부화 후에 단편화/소화된다. 일부 실시양태에서, 표적 분자(들)는 표적 분자(들)의 임의의 풍부화 없이 단편화/소화된다.
일부 실시양태에서, 펩티드 샘플을 제조하는 것은 인큐베이션 (예를 들어, 인큐베이션 단계의 일부로서)을 포함한다. 인큐베이션 단계는 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제의 각각을 포함하는 혼합물을 포함하는 펩티드 샘플 상에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 동안, 환원제는 단백질의 아미노산 측쇄를 환원시켜 환원된 아미노산 측쇄를 형성한다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 동일한 인큐베이션 단계 동안), 아미노산 측쇄 캡핑제는 환원된 아미노산 측쇄와 공유 결합을 형성하여 캡핑된 아미노산 측쇄를 형성한다. 일부 실시양태에서 (예를 들어, 동일한 인큐베이션 단계 동안), 단백질 소화제는 단백질의 단백질분해를 유도하여 하나 이상의 펩티드를 형성하고, 그에 의해 소화된 펩티드 샘플을 형성한다. 단백질 소화제는 캡핑된 아미노산 측쇄를 포함하는 단백질의 단백질분해를 유도하여 하나 이상의 캡핑된 펩티드를 형성하고, 그에 의해 소화된 펩티드 샘플을 형성할 수 있다. 특정 기존의 펩티드 소화 기술은 상기-언급된 프로세스 (예를 들어, 환원, 캡핑, 단백질분해)의 일부 또는 전부를 별개의 단계로서 (예를 들어, 각각의 시약을 단계적 방식으로 도입함으로써) 수행하는 것을 수반할 수 있음이 본 개시내용의 맥락에서 실현되었다. 놀랍게도, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제의 일부 또는 전부를 펩티드와 합한 혼합물을 사용하여 만족스러운 소화가 달성될 수 있음이 실현되었다. 단계 및 시약의 이러한 조합은 저장소 및 시약 입구의 구성을 단순화하고/거나 그의 수를 감소시킴으로써 유체 장치 (예를 들어, 하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 카트리지) 상의 펩티드의 소화를 용이하게 할 수 있다. 상기-언급된 프로세스 (예를 들어, 환원, 캡핑, 단백질분해)의 일부 또는 전부는 직접적 인간 개입 없이 (예를 들어, 개재하는 정제/후처리 단계 없이, 시약의 수동 전달 없이, 중간체 생성물의 수동 전달 없이) 인큐베이션 영역에서 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계의 일부 또는 전부는 자동으로 수행된다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계 (예를 들어, 유체 장치의 인큐베이션 영역에서)는 펩티드 샘플을 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 또는 37℃ 이상, 또는 그 초과의 온도에서 유지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계는 펩티드 샘플을 70℃ 이하, 50℃ 이하, 37℃ 이하, 35℃ 이하, 또는 30℃ 이하의 온도에서 유지하는 것을 포함한다. 이들 범위의 조합은 가능하다. 예를 들어, 인큐베이션 단계는 펩티드 샘플을 20℃ 이상 및 70℃ 이하의 온도에서 유지하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계는 펩티드 샘플을 상기-언급된 범위 내의 온도 (예를 들어, 37℃)에서 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 적어도 20분, 적어도 25분, 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 또는 그 초과 동안 유지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계는 펩티드 샘플을 상기-언급된 범위 내의 온도 (예를 들어, 37℃)에서 20시간 이하, 15시간 이하, 10시간 이하, 또는 그 미만 동안 유지하는 것을 포함한다. 조합 (예를 들어, 상기-언급된 온도를 적어도 1분 및 20시간 이하, 적어도 6시간 및 10시간 이하 동안 유지하는 것)은 가능하다.
인큐베이션은 펩티드 샘플의 소화를 발생시킬 수 있다. 일반적으로, 펩티드 샘플의 소화는 임의의 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있지만, 전형적으로 비-효소적 또는 효소적 방법을 수반할 것이다. 비효소적 소화를 위한 접근법은 소화제, 예컨대 시아노겐 브로마이드, 히드록실아민, 아이오도소벤조산, 디메틸 술폭시드-염산, BNPS-스카톨 [2-(2-니트로페닐술페닐)-3-메틸인돌], 또는 2-니트로-5-티오시아노벤조산을 사용한 산 가수분해 및/또는 절단을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 전기화학적 산화 및/또는 마이크로웨이브와 함께의 소화를 포함하는 전기-물리적 소화 방법은 또한 채용될 수 있다.
소화의 효소적 방법은 전형적으로 단백질을 성분 펩티드로 단편화하는 소화제, 예컨대 프로테아제를 이용한다. 이들 효소는 트립신 (전형적으로 생성된 펩티드의 크기 및 펩티드의 카르복실 말단에서의 염기성 잔기의 생성에 대해 바람직함), 키모트립신, LysC, LysN, AspN, GluC 및/또는 ArgC를 포함한다. 효소적 단편화/소화 방법은 사용의 용이성, 속도, 자동화 및/또는 유효성을 위해 선택되고 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소적 방법은 고체 기재 상의 효소 고정화를 포함한다. 효소적 방법은 유동에서 (예를 들어, 미세유체 채널에서) 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소적 방법은 인큐베이션 영역에서 수행된다. 소화 방법은 자동으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 소화 방법은 수동으로 수행될 수 있다. 효소적 소화는 임의의 수 또는 조합의 효소를 이용할 수 있고, 임의의 공지된 비-효소적 방법을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단편화/소화 프로세스는 도 3a에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질(들)을 포함하는 샘플은 먼저 변성되고 환원된다 (예를 들어, 아세토니트릴 및 TCEP를 사용하여). 일부 실시양태에서, 단편화되는 표적 단백질(들)은 시스테인 블록으로 처리된다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질(들)은 트립신 및 LysC의 혼합물을 사용하여 단편화된다 (예를 들어, 120분 동안). 효소적 반응은 켄칭될 수 있다 (예를 들어, 유체 장치의 켄칭 영역을 사용하여). 대조적으로, 일부 실시양태에서, 단편화/소화 프로세스는 단일 단계로 수행될 수 있고, 여기서 TCEP, 아이오도아세트아미드, 및 트립신을 포함하는 펩티드 혼합물은 상기 기재된 바와 같이 인큐베이션 영역에서 인큐베이션된다. 이러한 프로세스의 예시적인 실시양태는 도 3b에 기재된다.
일부 실시양태는 유체 장치에서 소화된 펩티드 샘플의 펩티드의 하나 이상을 관능화하여 관능화된 펩티드 샘플을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관능화는 하나 이상의 펩티드의 아미노산 측쇄를 유도체화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관능화는 하나 이상의 펩티드를 말단으로 관능화하는 것 (예를 들어, 하기 기재된 방법 중 하나 이상에 의해)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소화된 펩티드 샘플의 하나 이상의 펩티드를 관능화하는 것은 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 포함하는 비켄칭된 혼합물을 형성한다. 일부 실시양태에서, 유도체화제는 아미노산 측쇄를 유도체화하는데 사용된다 (예를 들어 하기 기재된 방법 중 하나 이상에 의해). 유도체화제는 아지드 전달제 (예를 들어 이미다졸-1-술포닐 아지드, 트리플루오로메탄술포닐 아지드)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아지드 전달제는 이미다졸-1-술포닐 아지드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아지드 전달제는 벤젠술포닐-아지드를 포함한다. 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 포함하는 비켄칭된 혼합물은 또한 과량의 유도체화제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관능화는 과량의 유도체화제의 적어도 일부를 제거함으로써 비켄칭된 혼합물을 켄칭하여 켄칭된 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 비켄칭된 혼합물을 켄칭하는 방법은 하기에 보다 상세하게 기재된다.
관능화는 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 고정화 복합체에 접합시켜 하나 이상의 고정화 복합체-접합된 펩티드를 형성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 고정화 복합체에의 접합은 하기에 상세하게 기재된다. 그러나, 일부 구체적인 실시양태에서, 고정화 복합체는 DBCO, 단일-가닥 DNA, 및 스트렙타비딘 (SV)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고정화 복합체는 DBCO-Q24-SV일 수 있다. 접합의 적어도 일부는 유체 장치의 인큐베이션 영역에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 고정화 복합체에 접합시키는 것은 제4 유체 장치 부분의 고정화 복합체 형성 영역에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태는 켄칭된 혼합물의 적어도 일부를 켄칭 영역으로부터 고정화 복합체-형성 영역으로 자동으로 수송하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태는 켄칭된 혼합물의 적어도 일부를 켄칭 영역으로부터 인큐베이션 영역으로 자동으로 수송하는 것을 포함할 수 있다.
표적 분자는 말단 단부 또는 위치에서 관능화될 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질은 그의 N-말단 단부 또는 그의 C-말단 단부에서 관능화될 수 있다.
C-말단 카르복실레이트 관능화
한 측면에서, 본 개시내용은
a. 복수의 화학식 (I)의 펩티드 또는 그의 염을 화학식 (II)의 화합물과 반응시켜 복수의 화학식 (III)의 화합물 또는 그의 염을 수득하는 단계; 및
b. 복수의 화학식 (III)의 화합물, 또는 그의 염을 화학식 (IV)의 화합물과 반응시켜 복수의 화학식 (V)의 화합물 또는 그의 염을 수득하는 단계
를 포함하는 펩티드의 선택적 C-말단 관능화의 방법을 제공하고; 여기서 m, n, P, R(CO2H)n, HX, X, L1, L2, R1, R2, Y 및 Z는 하기와 같이 정의된다.
m은 1 내지 25의 정수이다 (포함적). 특정 실시양태에서, m은 1 내지 10이다 (포함적). 특정 실시양태에서, m은 5 내지 10이다 (포함적). 특정 실시양태에서, m은 1 내지 5이다 (포함적). 특정 실시양태에서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다.
n은 1 또는 2이다. 특정 실시양태에서, n은 1이다. 특정 실시양태에서, n은 2이다.
각각의 P는 독립적으로 펩티드이다. 특정 실시양태에서, P는 2 내지 100개의 아미노산 잔기를 갖는다. 특정 실시양태에서, P는 2 내지 30개의 아미노산 잔기를 갖는다.
각각의 R(CO2H)n은 독립적으로 n개의 카르복실레이트 모이어티를 갖는 아미노산 잔기이다. n은 1 또는 2이다. 특정 실시양태에서, n은 1이다. n이 1인 경우, R(CO2H)n은 리신 또는 아르기닌이다. 특정 실시양태에서, R(CO2H)n은 리신이다. 또 다른 특정 실시양태에서, R(CO2H)n은 아르기닌이다. 특정 실시양태에서, n은 2이다. n이 2인 경우, R(CO2H)n은 글루탐산 또는 아스파르트산이다. 특정 실시양태에서, R(CO2H)n은 글루탐산이다. 또 다른 특정 실시양태에서, R(CO2H)n은 아스파르트산이다.
HX는 아실화될 수 있는 친핵성 모이어티이고, 여기서 H는 양성자이다. X는 하나 이상의 헤테로원자이다. 특정 실시양태에서, X는 O, S, 또는 NH, 또는 NO이다.
L1은 링커이다. 특정 실시양태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 지방족 쇄이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로, 독립적으로 헤테로원자, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클릴 모이어티에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, L1은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 다른 실시양태에서, L1은 펩티드, 또는 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, L1은 5 nm 미만이다. 특정 실시양태에서 L1은 1 nm 미만이다.
L2는 링커이거나, 또는 부재한다. 특정 실시양태에서, L2는 부재한다. 특정 실시양태에서, L2는 치환된 또는 비치환된 지방족 쇄이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로, 독립적으로 헤테로원자, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클릴 모이어티에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, L2는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 다른 실시양태에서, L2는 펩티드, 또는 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서 L2는 5 내지 20 nm이다 (포함적).
R1은 클릭 화학 핸들을 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, R1은 아지드, 테트라진, 니트릴 옥시드, 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 1차 알킨이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 시클릭 (예를 들어, 모노- 또는 폴리시클릭) 알킨 (예를 들어, 디아릴시클로옥틴, 또는 비사이클[6.1.0]노닌)이다. 특정 실시양태에서, R1은 아지드를 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 스트레인드 알켄은 트랜스-시클로옥텐이다. 특정 실시양태에서, 테트라진은 하기 구조를 포함한다:
R2는 R1에 상보적인 클릭 화학 핸들을 포함하는 모이어티이다. R2의 클릭 화학 핸들은 R1과 클릭 반응 (즉, 5-원 헤테로시클릭 고리를 형성하는 전자고리화 반응)을 겪을 수 있다. 예를 들어, R1이 아지드, 니트릴 옥시드, 또는 테트라진을 포함하는 경우, R2는 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함할 수 있다. 반대로, R1이 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함하는 경우, R2는 아지드, 니트릴 옥시드, 또는 테트라진을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, R2는 아지드, 테트라진, 니트릴 옥시드, 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 1차 알킨이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 시클릭 (예를 들어, 모노- 또는 폴리시클릭) 알킨 (예를 들어, 디아릴시클로옥틴, 또는 비사이클[6.1.0]노닌)이다. 특정 특정 실시양태에서, R2는 BCN을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, R2는 DBCO를 포함한다. 특정 실시양태에서, 스트레인드 알켄은 트랜스-시클로옥텐이다. 특정 실시양태에서, 테트라진은 하기 구조를 포함한다:
Y는 R1 및 R2의 클릭 반응으로부터 초래되는 모이어티이다. Y는 R1 및 R2의 반응성 클릭 화학 핸들 사이의 전자고리화 반응 (예를 들어, 3+2 고리화첨가, 또는 4+2 고리화첨가)로부터 초래되는 5-원 헤테로시클릭 고리이다. 특정 실시양태에서, Y는 1,2,3-트리아졸릴, 4,5-디히드로-1,2,3-트리아졸릴, 이속사졸릴, 4,5-디히드로이속사졸릴, 또는 1,4-디히드로피리다질 모이어티를 포함하는 디라디칼이다.
Z는 수용성 모이어티이다. 특정 실시양태에서, Z는 그것이 부착되는 화합물에 수-가용성을 부여한다. 특정 실시양태에서, Z는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Z는 단일-가닥 DNA를 포함한다. 특정 실시양태 (예를 들어, 화학식 (V)의 화합물)에서, Z는 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 추가로 포함한다. Z가 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함하는 경우, Z는 스트렙타비딘을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, Z는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, Z의 모이어티는 또 다른 분자 또는 표면에 분자간으로 결합하여, 예를 들어, Z를 포함하는 화합물을 분자 또는 표면에 고착시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 (II)의 화합물은 화학식 (IIa)의 것이다:
특정 실시양태에서, 화학식 (III)은 화학식 (IIIa)의 것이다:
특정 실시양태에서, n은 1이다. 특정 실시양태에서, n은 2이다. 특정 실시양태에서, m은 1이다. 특정 실시양태에서, m은 5이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (IV)는 TCO, 및 단일-가닥 DNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IV)는 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IV)는 Q24-BisBt-BCN이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IV)는 Q24- BisBt-DBCO이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IV)는 Q24- BisBt-TCO이다. 일반적으로, 화학식 (IV)는 분지화 모이어티 (예를 들어, 1, 3, 5-트리카르복실레이트 모이어티)를 포함할 수있고, 여기서 2개의 분지는 비오틴 모이어티에의 직접적 또는 간접적 부착이고, 제3 분지는 수용성 모이어티 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 Q24)에의 부착이다. 도 4는 스트렙타비딘에 결합된 Q24-BisBt-BCN의 예시를 제시한다. 도 5는 특정 실시양태에 따른 Q24-BisBt-BCN 및/또는 Q24-BisBt-DBCO의 제조를 위한 반응 스킴을 제시한다. 도 4 및 도 5에 나타내어진 바와 같이, 특정 실시양태에서 화학식 (IV)는 (i) 비스비오틴-아지드 관능화된 링커 및 (ii) 알킨 (예를 들어, BCN)-관능화된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 Q24)를 포함하는 단편의 클릭-커플링으로부터 유래된 트리아졸 모이어티를 포함한다. 클릭-커플링된 생성물은 추가의 클릭 핸들 R2, 예컨대 BCN 또는 DBCO를 도입하도록 유도체화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 (V)는 화학식 (Va)의 것이다:
여기서 m, n은 1 또는 2이고; L2, Y, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다. 특정 특정 실시양태에서, n은 1이다. 특정 특정 실시양태에서, n은 2이다. 특정 특정 실시양태에서, m은 1이다. 특정 특정 실시양태에서, m은 5이다. 특정 특정 실시양태에서, L2는 부재한다. 특정 실시양태에서, Y는 1,2,3-트리아졸릴, 4,5-디히드로-1,2,3-트리아졸릴, 이속사졸릴, 4,5-디히드로이속사졸릴, 및 1,4-디히드로피리다질로부터 선택되는 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z는 단일-가닥 DNA를 포함한다. 특정 특정 실시양태에서, Z는 Q24를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z는 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Z는 스트렙타비딘을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 단계 (a)의 반응은 카르보디이미드 시약의 존재 하에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 카르보디이미드 시약은 수용성이다. 특정 실시양태에서, 카르보디이미드 시약은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)이다. 특정 실시양태에서, 단계 (a)의 반응은 3 내지 5의 범위의 pH에서 수행된다. 특정 실시양태에서 (예를 들어, 1 mM 미만의 총 펩티드 농도에 대한 경우), EDC의 농도는 약 10 mM이고, 화학식 (II)의 화합물의 농도는 약 20 mM이다. 특정 실시양태에서 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같이, 트립신/LysC 소화와 관련하여) 화학식 (II)의 화합물의 농도는 약 50 mM일 수 있고, EDC의 농도는 C-말단 분자내 고리화를 억제하기 위해 약 25 mM일 수 있다.
단계 (a)의 특정 실시양태에서, 복수의 화학식 (III)의 화합물은 단계 (b) 전에, 예를 들어, 화합물을 G10 세파덱스 칼럼을 통해 통과시키고/거나 화합물을 C18 수지 칼럼을 통해 통과시킴으로써 풍부화된다. C18 수지-기반 풍부화의 사용은 화학식 (II)의 화합물이 약 200 g/mol 초과인 경우 특히 유용하다. G-10 세파덱스가 풍부화에 사용되는 경우, 용리 완충제는 0.5x PBS (pH 7.0)일 수 있다. C18 수지가 풍부화에 사용되는 경우, 용리 완충제는 물 중 80% 아세토니트릴을 갖는 0.1% 포름산일 수 있다. C18 용리액은 건조되고, 잔류물은 단계 (b) 전에 0.5x PBS에 재현탁될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단계 (a)의 반응은 고정화된 카르보디이미드 시약의 존재 하에서 수행된다. 예를 들어, 카르보디이미드 시약은 고정적인 및/또는 반응 용매에서 불용성인 모이어티에 공유 부착되고, 그에 의해 과량의 시약 및/또는 반응 부산물 및/또는 비반응된 펩티드의 분리를 용이하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 고정화된 카르보디이미드 시약은 수지, 예컨대 폴리스티렌 (PS)에 공유 부착된 카르보디이미드 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, PS-고정화된 카르보디이미드 시약은 하기 화학식의 것이다:
특정 실시양태에서, 단계 (a)의 반응이 고정화된 카르보디이미드 시약, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 PS-고정화된 시약의 존재 하에서 수행되는 경우, 반응은 4 내지 5의 범위의 pH에서 및/또는 주위 온도에서 및 또는 약 20분 동안 수행된다.
특정 실시양태에서, 고정화된 카르보디이미드 시약, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 PS-고정화된 시약의 존재 하에서 단계 (a)의 반응을 수행하는 것은 모든 비반응된 (즉, 비-아실화된) 펩티드의 제거를 용이하게 하는데, 이는 비반응된 펩티드가 고정화된 카르보디이미드 시약에 공유 결합되어 잔류하기 때문이다.
고정화된 카르보디이미드 시약을 사용한 예시적인 프로세스는 도 6에 나타내어진다. 자동화 적합성 프로세스에 대한 예시적인 흐름도는 도 7에 나타내어진다. 단계 (b)의 특정 실시양태에서, 복수의 화학식 (III)의 화합물 및 화학식 (IV)의 화합물 사이의 클릭 반응은 비촉매된다. 특정 실시양태에서, 클릭 반응은 예를 들어, 구리 염 (예를 들어, Cu+ 염, 또는 계내에서 Cu+ 염으로 환원되는 Cu2+ 염)을 사용하여 촉매된다. 적합한 Cu2+ 염은 CuSO4를 포함한다. 특정 실시양태에서, 단계 (b)의 반응은 반응 혼합물을 가열하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (IV)의 화합물은 복수의 화학식 (III)의 화합물에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IV)의 화합물 및 복수의 화학식 (III)의 화합물의 총 농도는 10 μM 내지 1 mM의 범위에서 유지된다.
단계 (b)의 특정 실시양태에서, Z가 단일-가닥 DNA를 포함하는 경우, 방법은 상보적 DNA 가닥을 단일-가닥 DNA에 혼성화하여 Z가 이중-가닥 DNA를 포함하는 화합물을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단일-가닥 DNA는 Q24이고, 상보적 DNA 가닥은 Cy3B-표지된 Q24 상보적 가닥이다.
단계 (b)의 특정 실시양태에서, Z가 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함하는 경우, 방법은 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 스트렙타비딘과 접촉시켜 Z가 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴) 및 스트렙타비딘을 포함하는 화합물을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 복수의 화학식 (I)의 펩티드, 또는 그의 염은 단백질을 효소적 소화로 처리하여 복수의 화학식 (I)의 펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 소화적 혼합물을 수득함으로써 수득된다. 특정 실시양태에서, 효소적 소화는 단백질의 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기의 C-말단 결합을 절단하는 것을 포함한다. 특정 구체적인 실시양태에서, 효소적 소화는 Glu-C 소화이다.
특정 실시양태에서, 20 μg 단백질의 소화 후, 복수의 화학식 (I)의 펩티드, 또는 그의 염의 총 농도는 100 μM 미만이다.
특정 실시양태에서, 효소적 소화는 포스페이트 완충제 (pH 7.8) 또는 중탄산암모늄 완충제 (pH 4.0)에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 효소적 소화는 단백질의 리신 및/또는 아르기닌 잔기의 C-말단 결합을 절단하는 것을 포함한다. 특정 구체적인 실시양태에서, 효소적 소화는 트립신+Lys-C 소화이다.
특정 실시양태에서, 단백질의 카르복실산 모이어티는, 존재하는 경우, 효소적 소화 전에 보호된다. 예를 들어, 단백질의 카르복실산 모이어티는, 존재하는 경우, 효소적 소화 전에 에스테르화될 수 있다. 특정 구체적인 실시양태에서, 에스테르화된 카르복실산은 메틸 에스테르이다.
특정 실시양태에서, 단백질의 술피드 모이어티는 효소적 소화 전에 보호된다. 특정 구체적인 실시양태에서, 술피드 모이어티는 단백질을 트리스(카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 및 아이오도아세트아미드(ICM), 또는 말레이미드에 노출시킴으로써 보호된다.
특정 특정 실시양태에서, TCEP는 히드로클로라이드 염, 즉, TCEP·HCl의 형태로 존재한다.
특정 실시양태에서, 방법은 단계 (a) 전에 소화적 혼합물을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
C-말단 아민 관능화
또 다른 측면에서, 본 개시내용은
a. 복수의 화학식 (VI)의 펩티드 또는 그의 염을 화학식 (VII)의 화합물과 반응시켜 복수의 화학식 (VIII)의 화합물, 또는 그의 염을 수득하는 단계; 및
b. 복수의 화학식 (VIII)의 화합물, 또는 그의 염을 화학식 (IX)의 화합물과 반응시켜 복수의 화학식 (X)의 화합물 또는 그의 염을 수득하는 단계
를 포함하는 펩티드의 선택적 C-말단 아민 관능화의 방법을 제공하고; 여기서 P, L3, L4, R3, R4, Y1, 및 Z1은 하기 정의되는 바와 같다:
각각의 P는 독립적으로 펩티드이다. 특정 실시양태에서, P는 2 내지 100개의 아미노산 잔기를 갖는다. 특정 실시양태에서, P는 2 내지 30개의 아미노산 잔기를 갖는다.
L3은 링커이다. 특정 실시양태에서, L3은 치환된 또는 비치환된 지방족 쇄이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로, 독립적으로 헤테로원자, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클릴 모이어티에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, L3은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 다른 실시양태에서, L3은 펩티드, 또는 올리고뉴클레오티드이다.
L4는 링커이거나, 또는 부재한다. 특정 실시양태에서, L4는 부재한다. 특정 실시양태에서, L4는 치환된 또는 비치환된 지방족 쇄이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로, 독립적으로 헤테로원자, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클릴 모이어티에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, L4는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 다른 실시양태에서, L4는 펩티드, 또는 올리고뉴클레오티드이다.
R3은 클릭 화학 핸들을 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, R3은 아지드, 테트라진, 니트릴 옥시드, 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 1차 알킨이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 시클릭 (예를 들어, 모노- 또는 폴리시클릭) 알킨 (예를 들어, 디아릴시클로옥틴, 또는 비사이클[6.1.0]노닌)이다. 특정 실시양태에서, 스트레인드 알켄은 트랜스-시클로옥텐이다. 특정 실시양태에서, R1은 아지드를 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 테트라진은 하기 구조를 포함한다:
R4는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 특정 실시양태에서, R4는 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 특정 특정 실시양태에서, R4는 페닐이다. 특정 특정 실시양태에서, R4는 4-니트로페닐이다.
R5는 R3에 상보적인 클릭 화학 핸들을 포함하는 모이어티이다. R5의 클릭 화학 핸들은 R3과 클릭 반응 (즉, 5-원 헤테로시클릭 고리를 형성하는 전자고리화 반응)을 겪을 수 있다. 예를 들어, R3이 아지드, 니트릴 옥시드, 또는 테트라진을 포함하는 경우, R5는 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함할 수 있다. 반대로, R3이 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함하는 경우, R5는 아지드, 니트릴 옥시드, 또는 테트라진을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, R5는 아지드, 테트라진, 니트릴 옥시드, 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함하는 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 1차 알킨이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 시클릭 (예를 들어, 모노- 또는 폴리시클릭) 알킨 (예를 들어, 디아릴시클로옥틴, 또는 비사이클[6.1.0]노닌)이다. 특정 특정 실시양태에서, R5는 BCN을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, R5는 DBCO를 포함한다. 특정 실시양태에서, 스트레인드 알켄은 트랜스-시클로옥텐이다. 특정 실시양태에서, 테트라진은 하기 구조를 포함한다:
Y1은 R3 및 R5의 클릭 반응으로부터 초래되는 모이어티이다. Y1은 R3 및 R5의 반응성 클릭 화학 핸들 사이의 전자고리화 반응 (예를 들어, 3+2 고리화첨가, 또는 4+2 고리화첨가)으로부터 초래되는 5-원 헤테로시클릭 고리이다. 특정 실시양태에서, Y1은 1,2,3-트리아졸릴, 4,5-디히드로-1,2,3-트리아졸릴, 이속사졸릴, 4,5-디히드로이속사졸릴, 또는 1,4-디히드로피리다질 모이어티를 포함하는 디라디칼이다.
Z1은 수용성 모이어티이다. 특정 실시양태에서, Z1은 그것이 부착되는 화합물에 수-가용성을 부여한다. 특정 실시양태에서, Z1은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Z1은 단일-가닥 DNA를 포함한다. 특정 특정 실시양태에서, Z1은 Q24를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z1은 단일-가닥 DNA를 포함한다. 특정 실시양태 (예를 들어, 화학식 (V)의 화합물)에서, Z1은 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 추가로 포함한다. Z1이 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함하는 경우, Z1은 스트렙타비딘을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, Z1은 이중-가닥 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, Z1의 모이어티는 또 다른 분자 또는 표면에 분자간으로 결합하여, 예를 들어 Z1을 포함하는 화합물을 분자 또는 표면에 고착시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 (VII)의 화합물은
로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 (VIII)은 화학식 (VIIIa) 또는 화학식 (VIIIb)의 것이다:
.
특정 실시양태에서, 화학식 (IX)는 TCO, 단일-가닥 DNA, 및 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IX)는 Q24-BisBt-BCN이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IX)는 Q24- BisBt-DBCO이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (IX)는 Q24- BisBt-TCO이다. 일반적으로, 화학식 (IX)는 분지화 모이어티 (예를 들어, 1, 3, 5-트리카르복실레이트 모이어티)를 포함할 수 있고, 여기서 2개의 분지는 비오틴 모이어티에의 직접적 또는 간접적 부착이고, 제3 분지는 수용성 모이어티 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 Q24)에의 부착이다. 도 4 및 도 5에 나타내어진 바와 같이, 특정 실시양태에서 화학식 (IX)는 (i) 비스비오틴-아지드 관능화된 링커 및 (ii) 알킨 (예를 들어, BCN)-관능화된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 Q24)를 포함하는 단편의 클릭-커플링으로부터 유래된 트리아졸 모이어티를 포함한다. 클릭-커플링된 생성물은 추가의 클릭 핸들 R5, 예컨대 BCN 또는 DBCO를 도입하도록 유도체화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단계 (a)의 반응은 약 20 mM 내지 500 mM의 범위의 농도 및 약 9 내지 11의 범위의 pH를 갖는 완충제, 및 총 부피의 약 20 내지 70%의 범위의 아세토니트릴의 존재 하에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (a)의 반응은 pH 9.5 완충제/아세토니트릴 (1:3 v/v)에서 대략 37 ℃에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (a)의 반응은 약 500 μM 내지 50 mM의 화학식 (VII)의 화합물의 농도를 사용하여 수행된다.
특정 실시양태에서, 복수의 화학식 (VIII)의 화합물은 단계 (b) 전에 풍부화된다. 특정 실시양태에서, 풍부화는 에틸 아세테이트/헥산 추출을 포함한다. 에틸 아세테이트/헥산에 대한 적합한 범위는 헥산 중 20 내지 100 부피 % 에틸 아세테이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 추출에 사용되는 유기 용매의 부피는 수성 층의 부피의 약 10x이다. 다른 수 비혼화성 유기 용매, 예를 들어, 디에틸 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 벤젠, 톨루엔, 및 n-1-부탄올은 추출에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단계 (b)의 반응은 화학식 (VIII)의 화합물을 약 1 당량의 화학식 (IX)의 화합물과 반응시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단계 (b)의 반응은 반응 혼합물을 가열하는 것을 포함한다.
단계 (b)의 특정 실시양태에서, Z1이 단일-가닥 DNA를 포함하는 경우, 방법은 상보적 DNA 가닥을 단일-가닥 DNA에 혼성화하여 Z1이 이중-가닥 DNA를 포함하는 화합물을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단일-가닥 DNA는 Q24이고, 상보적 DNA 가닥은 Cy3B-표지된 Q24 상보적 가닥이다.
단계 (b)의 특정 실시양태에서, Z1이 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함하는 경우, 방법은 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 스트렙타비딘과 접촉시켜 Z1이 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴) 및 스트렙타비딘을 포함하는 화합물을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 복수의 화학식 (VI)의 펩티드, 또는 그의 염은 단백질을 효소적 소화로 처리하여 복수의 화학식 (VI)의 펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 소화적 혼합물을 수득함으로써 수득된다. 효소적 소화는 단백질의 리신 및/또는 아르기닌 잔기의 C-말단 결합을 절단하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 효소적 소화는 트립신, Lys-C, 또는 이들의 조합을 사용하여 수행된다. 특정 실시양태에서, 효소적 소화는 단백질을 트리스-HCl 완충제 (pH 8.5)에서 트립신 및 Lys-C와 반응시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 20 μg 단백질의 소화 후, 복수의 화학식 (VI)의 펩티드, 또는 그의 염의 총 농도는 100 μM 미만이다. 특정 실시양태에서, 효소적 소화는 단백질을 트립신과 반응시키는 것을 포함하고, 여기서 트립신:단백질의 몰비는 1:50 내지 1:200의 범위 내이다 (포함적).
특정 실시양태에서, 단백질의 술피드 모이어티는 효소적 소화 전에 보호된다. 특정 구체적인 실시양태에서, 술피드 모이어티는 단백질을 트리스(카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 및 아이오도아세트아미드(ICM), 또는 말레이미드에 노출시킴으로써 보호된다.
특정 실시양태에서, 방법은 단계 (a) 전에 소화적 혼합물을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 소화적 혼합물은 풍부화 또는 정제 없이 펩티드의 선택적 C-말단 아민 관능화의 방법에 사용된다.
디아조 전달을 통한 아미노산 측쇄 유도체화
시퀀싱 전에, 소화된 펩티드는 펩티드를 시퀀싱 기재 상에 고정화할 수 있는 모이어티로 관능화되어야 한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 유도체화에 의해 달성된다. 따라서, 본 개시내용은 복수의 화학식 (XI)의 펩티드 또는 그의 염을 유도체화제, 예컨대 화학식 (XII)의 화합물과, Cu2+, 또는 그의 전구체, 및 약 7 내지 8.5의 pH를 갖는 완충제를 포함하는 조건 (a) 하에서 반응시켜 복수의 화학식 (XIIIa)의 N-말단 아지도 화합물, 또는 그의 염을 수득하거나; 또는
Cu2+, 또는 그의 전구체, 및 약 10 내지 11의 pH를 갖는 완충제를 포함하는 조건 (b) 하에서 반응시켜 복수의 화학식 (XIII)의 ε-아지도 화합물 또는 그의 염을 수득하는 것을 포함하는 펩티드의 아미노산 측쇄의 선택적 N-관능화의 방법을 제공한다:
여기서 각각의 P는 독립적으로 N-말단 아민을 갖는 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (XII)의 유도체화제는 염의 형태로 존재한다. 특정 특정 실시양태에서, 화학식 (XII)의 화합물은 이미다졸-1-술포닐 아지드 테트라플루오로보레이트이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (XII)의 화합물, 또는 그의 염은 시약 용액의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 시약 용액은 pH 조정 시약 (예를 들어, 수산화칼륨)을 포함한다.
본 개시내용의 맥락에서, pH 조정 시약은 용액의 pH를 화학 반응을 위한 목적하는 값으로 조정하는데 적합한 임의의 화학물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, pH 조정 시약은 염기 (예를 들어 강염기, 약염기)를 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 조정 시약은 산 (예를 들어 강산, 약산)을 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 조정 시약은 완충제를 포함한다.
각각의 P는 독립적으로 N-말단 아민을 갖는 펩티드이다. 특정 실시양태에서, P는 2 내지 100개의 아미노산 잔기를 갖는다. 특정 실시양태에서, P는 2 내지 30개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 반응에서 펩티드의 농도는 필요한 임의의 생각할 수 있는 농도이다.
특정 실시양태에서, 조건 (a)는 촉매 시약, 예컨대 적합한 Cu2+ 염, 예를 들어 CuSO4를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조건 (a)는 약 25 ℃에서 약 30 내지 60분 동안의 반응을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조건 (a)는 주위 온도 (예를 들어, 약 25 ℃)에서 약 60분 동안의 반응을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 (XII)의 화합물은 500 Da 이하인 아릴/헤테로아릴 술포닐 아지드 화합물에 의해 대체된다. 예를 들어, 화학식 (XII)의 화합물은 화학식 (XIIa)의 화합물로 대체될 수 있다:
여기서 RA는 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
특정 실시양태에서, 조건 (b)는 pH 10.5의 포스페이트 또는 비카르보네이트 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조건 (b)는 적합한 pH 조정 시약 (예를 들어, 탄산칼륨)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조건 (b)는 적합한 촉매 시약, 예컨대 Cu2+ 염, 예를 들어 CuCl2, CuBr2, Cu(OH)2, 또는 CuSO4를 포함한다. 특정 실시양태에서, Cu2+ 염은 CuSO4이다. 특정 실시양태에서, Cu2+ 염의 몰량은 화학식 (XI)의 화합물의 몰량의 약 2.5배이다. 특정 특정 실시양태에서, 조건 (b)는 Cu2+ 염의 농도가 약 250 μM인 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조건 (b)는 Cu2+ 염의 농도가 1 내지 5 mM 또는 100 내지 1000 μM인 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 조건 (b)는 약 20 내지 30℃, 예를 들어, 20 내지 25℃, 22 내지 27℃, 25 내지 30℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 또는 30℃에서의 반응을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 조건 (b)는 약 30 내지 60분, 예를 들어, 30 내지 35분, 35 내지 40분, 40 내지 45분, 45 내지 50분, 50 내지 55분, 또는 55 내지 60분 동안의 반응을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 조건 (b)는 주위 온도 (예를 들어, 약 25 ℃)에서 약 60분 동안의 반응을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 (XIIa)의 화합물은 용액의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 용액은 염기 (예를 들어, 수산화칼륨)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조건 (b) 하의 디아조 전달 반응의 N-말단:ε 선택도는 적어도 약 90%이다.
디아조 전달 반응의 켄칭
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 디아조 전달 화학을 이용하는 방법은 술포닐 아지드 작용제를 중화시키는 물질의 첨가에 의해 비반응된 술포닐 아지드 작용제를 켄칭하는 (즉, 중화시키는) 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 물질은 수지 또는 비드, 예를 들어, 폴리스티렌 비드이다. 특정 실시양태에서, 물질은 관능기, 예를 들어 폴리스티렌 폴리아민 비드를 포함한다. 유리하게는, 수지 또는 비드는 여과에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 화학식 (XI)의 펩티드, 또는 그의 염은 단백질을 효소적 소화로 처리하여 복수의 화학식 (XI)의 펩티드, 또는 그의 염을 포함하는 소화적 혼합물을 수득함으로써 수득된다. 효소적 소화는 단백질의 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기의 C-말단 결합을 절단하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소적 소화는 트립신+Lys-C 소화이다. 일부 실시양태에서, 트립신+Lys-C 소화는 단백질을 pH 9.5 완충제에서 실온에서 트립신 및 Lys-C와 반응시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 화학식 (XIIIb)의 화합물, 또는 그의 염을 풍부화하는 것을 추가로 포함한다.
고정화 복합체 형성
일부 실시양태에서, 방법은 복수의 화학식 (XIIIb)의 화합물 또는 그의 염을 고정화 복합체, 예컨대 화학식 (XIV)의 화합물과 반응시켜 복수의 화학식 (XV)의 화합물, 또는 그의 염을 수득하는 것을 추가로 포함한다:
여기서 R6은 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함하는 모이어티이고; L5는 링커이거나, 또는 부재하고; Z2는 수용성 모이어티이다.
여기서 Y2는 화학식 (XIIIb)의 아지드 모이어티 및 R6과의 클릭 반응으로부터 초래되는 모이어티이다.
R6은 화학식 (XIIIb)의 아지드 모이어티에 상보적인 클릭 화학 핸들을 포함하는 모이어티이다. R6의 클릭 화학 핸들은 화학식 (XIIIb)의 아지드 모이어티와 클릭 반응 (즉, 5-원 헤테로시클릭 고리를 형성하는 전자고리화 반응)을 겪을 수 있다. 특정 실시양태에서, R6은 알킨 또는 스트레인드 알켄을 포함한다. 특정 실시양태에서, 알킨은 1차 알킨이다. 특정 실시양태에서, 알킨은 시클릭 (예를 들어, 모노- 또는 폴리시클릭) 알킨 (예를 들어, 디아릴시클로옥틴, 또는 비사이클[6.1.0]노닌)이다. 특정 특정 실시양태에서, R6은 BCN을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, R6은 DBCO를 포함한다. 특정 실시양태에서, 스트레인드 알켄은 트랜스-시클로옥텐이다.
특정 실시양태에서, L5는 부재한다. 특정 실시양태에서, L5는 치환된 또는 비치환된 지방족 쇄이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 임의로 헤테로원자, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클릴 모이어티에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, L5는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 다른 실시양태에서, L5는 펩티드, 또는 올리고뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, Z2는 PEG를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z2는 단일-가닥 DNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z2는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, Z2는 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, Z2가 단일-가닥 DNA를 포함하는 경우, 방법은 상보적 DNA 가닥을 단일-가닥 DNA에 혼성화하여 Z2가 이중-가닥 DNA를 포함하는 화합물을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단일-가닥 DNA는 Q24이고, 상보적 DNA 가닥은 Cy3B이다.
특정 실시양태에서, 화학식 (XIV)의 화합물은 고정화 복합체이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (XIV)의 화합물은 TCO, 단일-가닥 DNA, 및 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 (XIV)는 Q24-BisBt-BCN이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (XIV)는 Q24- BisBt-DBCO이다. 특정 실시양태에서, 화학식 (XIV)는 Q24- BisBt-TCO이다. 일반적으로, 화학식 (XIV)는 분지화 모이어티 (예를 들어, 1, 3, 5-트리카르복실레이트 모이어티)를 포함할 수 있고, 여기서 2개의 분지는 비오틴 모이어티에의 직접적 또는 간접적 부착이고, 제3 분지는 수용성 모이어티 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 Q24)에의 부착이다. 도 4 및 도 5에 나타내어진 바와 같이, 특정 실시양태에서 화학식 (XIV)는 (i) 비스비오틴-아지드 관능화된 링커 및 (ii) 알킨 (예를 들어, BCN)-관능화된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 Q24)를 포함하는 단편의 클릭-커플링으로부터 유래된 트리아졸 모이어티를 포함한다. 클릭-커플링된 생성물은 추가의 클릭 핸들 R6, 예컨대 BCN 또는 DBCO를 도입하도록 유도체화될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 화학식 (XIV)의 고정화 복합체는 DBCO, 단일-가닥 DNA, 및 스트렙타비딘 (SV)을 포함한다. 특정 특정 실시양태에서, 화학식 (XIV)의 화합물은 DBCO-Q24-SV이다.
특정 실시양태에서, Z2가 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함하는 경우, 방법은 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 스트렙타비딘과 접촉시켜 Z2가 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴) 및 스트렙타비딘을 포함하는 화합물을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, Z2가 스트렙타비딘을 포함하는 경우, 방법은 스트렙타비딘을 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)과 접촉시켜 Z2가 스트렙타비딘 및 비오틴 (예를 들어, 비스비오틴)을 포함하는 화합물을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
클릭 화학
특정 실시양태에서, 호스트를 태그에 접합시키는데 사용되는 반응은 "클릭 화학" 반응 (예를 들어, 휘스겐(Huisgen) 알킨-아지드 고리화첨가)이다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 "클릭 화학" 반응은 이 목적을 위해 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 클릭 화학은 2001년에 샤프리스(Sharpless)에 의해 도입된 화학적 접근법이며, 작은 단위를 함께 연결함으로써 물질을 빠르게 및 신뢰성 있게 생성하도록 적합화된 화학을 기재한다. 예를 들어, 문헌 [Kolb, Finn and Sharpless, Angewandte Chemie International Edition (2001) 40: 2004-2021]; [Evans, Australian Journal of Chemistry (2007) 60: 384-395)]을 참조한다. 예시적인 커플링 반응 (이의 일부는 "클릭 화학"으로서 분류될 수 있음)은 활성화된 산 또는 아실 할라이드로부터의 에스테르, 티오에스테르, 아미드의 형성 (예를 들어, 예컨대 펩티드 커플링); 친핵성 이동 반응 (예를 들어, 예컨대 할라이드의 친핵성 이동 또는 스트레인드 고리 시스템의 개환); 아지드-알킨 휘스겐 고리화첨가; 티올-인 첨가; 이민 형성; 마이클(Michael) 첨가 (예를 들어, 말레이미드 첨가); 및 딜스-알더(Diels-Alder) 반응 (예를 들어, 테트라진 [4 + 2] 고리화첨가)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "클릭 화학"은 반응성 기를 포함하는 작은 단위를 함께 연결함으로써 공유 결합을 빠르게 및 신뢰성 있게 생성하도록 적합화된 화학을 기재하는, 더 스크립스 리서치 인스티튜트(The Scripps Research Institute)의 케이. 배리 샤프리스(K. Barry Sharpless)에 의해 도입된 화학적 합성 기술을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Kolb, Finn and Sharpless Angewandte Chemie International Edition (2001) 40: 2004-2021]; [Evans, Australian Journal of Chemistry (2007) 60: 384-395)]을 참조한다. 예시적인 반응은 아지드-알킨 휘스겐 고리화첨가; 및 딜스-알더 반응 (예를 들어, 테트라진 [4 + 2] 고리화첨가)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 클릭 화학 반응은 모듈식이고/거나, 범위에 있어서 광범위하고/거나, 높은 화학적 수율을 제공하고/거나, 해롭지 않은 부산물을 생성하고/거나, 입체특이적이고/거나, 단일 반응 생성물과의 반응에 바람직한 > 84 kJ/mol의 큰 열역학적 구동력을 나타내고/거나, 생리학적 조건 하에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 클릭 화학 반응은 높은 원자 경제학을 나타내고/거나, 간단한 반응 조건 하에서 수행될 수 있고/거나, 용이하게 입수가능한 출발 물질 및 시약을 사용하고/거나, 독성 용매를 사용하지 않거나 양성 또는 용이하게 제거되는 용매 (바람직하게는 물)를 사용하고/거나, 비-크로마토그래피적 방법 (결정화 또는 증류)에 의한 간단한 생성물 단리를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "클릭 화학 핸들"은 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 반응물, 또는 반응성 기를 지칭한다. 예를 들어, 스트레인드 알킨, 예를 들어, 시클로옥틴은 클릭 화학 핸들인데, 이는 그것이 스트레인-촉진된 고리화첨가에 참여할 수 있기 때문이다 (예를 들어, 표 1 참조). 일반적으로, 클릭 화학 반응은 서로와 반응할 수 있는 클릭 화학 핸들을 포함하는 적어도 2개의 분자를 요구한다. 서로와 반응성인 이러한 클릭 화학 핸들 쌍은 때때로 본원에서 파트너 클릭 화학 핸들로 지칭된다. 예를 들어, 아지드는 시클로옥틴 또는 임의의 다른 알킨에 대한 파트너 클릭 화학 핸들이다. 본 발명의 일부 측면에 따라 사용하는데 적합한 예시적인 클릭 화학 핸들은 본원에, 예를 들어 표 1 및 2에 기재되어 있다. 다른 적합한 클릭 화학 핸들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
표 1: 예시적인 클릭 화학 핸들 및 반응.
일부 실시양태에서, 금속 촉매, 예를 들어, 구리 (II)의 존재 하에서 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 클릭 화학 핸들이 사용된다. 일부 실시양태에서, 금속 촉매의 부재 하에서 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 클릭 화학 핸들이 사용된다. 이러한 클릭 화학 핸들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 문헌 [Becer, Hoogenboom, and Schubert, Click Chemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition, Angewandte Chemie International Edition (2009) 48: 4900 - 4908]에 기재된 클릭 화학 핸들을 포함한다.
표 2: 예시적인 클릭 화학 핸들 및 반응.
부분적으로 문헌 [Becer, Hoogenboom, and Schubert, Click Chemistry Beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition, Angewandte Chemie International Edition (2009) 48: 4900 - 4908]으로부터 재현됨.
본원에 기재된 접합의 방법에 사용하는데 적합한 추가의 클릭 화학 핸들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 이러한 클릭 화학 핸들은 PCT/US2012/044584 및 그 안의 참고문헌에 기재된 클릭 화학 반응 파트너, 기, 및 핸들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이 참고문헌은 클릭 화학 핸들 및 방법론에 대해 본원에 참조로 포함된다.
화합물
특정 측면에서, 본 개시내용은 다양한 실시양태에서 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II), (IIa), (III), (IIIa), (IV), (V), (Va), (VII), (VIII), (VIIIa), (VIIIb), (XIV), (X), (XI), (XII), (XIIIa), (XIIIb), (XV)의 화합물, 및 그의 염을 제공한다.
특정 실시양태에서, 화합물은 수용성이다.
펩티드 표면 고정화
특정 실시양태에서, 화합물은 단백질 및 펩티드의 분석, 예컨대 펩티드 시퀀싱에 관한 적용에 유용하다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 화학식 (V), (X), (XV)의 화합물, 및 그의 염은 표면에 공유 또는 비-공유 부착될 수 있다.
특정 분석 방법 (예를 들어, 단일 분자 분석 방법)에서, 분석되는 분자는 분자가 용액 중의 다른 반응 성분으로부터 간섭 없이 모니터링될 수 있도록 표면 상으로 고정화된다. 일부 실시양태에서, 분자의 표면 고정화는 분자가 분자를 수반하는 반응의 실시간 모니터링을 위해 표면의 목적하는 영역에 국한되는 것을 허용한다.
따라서, 일부 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 화합물 중 임의의 하나를 고체 지지체의 표면에 부착시킴으로써 펩티드를 표면에 고정화하는 방법을 제공한다. 고체 지지체는 본원에 기재된 샘플 제조를 위한 유체 장치의 하류의 검출 모듈 (예를 들어, 시퀀싱 모듈)에의 본 발명자들의 커플링가능하도록 커플링된 물품의 일부일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 화학식 (V), (X), (XV)의 화합물, 또는 그의 염을 고체 지지체의 표면에 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면은 펩티드의 관능화된 말단 단부에의 부착 (예를 들어, 공유 또는 비-공유 부착)을 위해 구성된 상보적 관능성 모이어티로 관능화된다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 고체 지지체의 표면에서 형성된 복수의 샘플 웰을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 단일 펩티드를 복수의 샘플 웰의 각각의 표면에 고정화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰당 단일 펩티드를 국한시키는 것은 단일 분자 검출 방법, 예를 들어, 단일 분자 펩티드 시퀀싱을 위해 유리하다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 표면은 기재 또는 고체 지지체의 표면을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 침착된 물질, 예컨대 본원에 기재된 관능화된 펩티드를 지지할 수 있는 표면, 예컨대 수용 표면을 갖는 물질, 층, 또는 다른 구조를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기재의 수용 표면은 임의로 나노스케일 또는 마이크로스케일 함입 특색, 예컨대 샘플 웰의 어레이를 포함하는 하나 이상의 특색을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 어레이는 요소, 예컨대 센서 또는 샘플 웰의 평면 배열이다. 어레이는 1 또는 2차원일 수 있다. 1차원 어레이는 제1 치수에서 요소의 하나의 행 또는 열 및 제2 치수에서 복수의 행 또는 열을 갖는 어레이이다. 제1 및 제2 치수에서 행 또는 열의 수는 동일할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 어레이는 예를 들어, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107개의 샘플 웰을 포함할 수 있다.
펩티드 표면 고정화의 예시 스킴은 도 8에 도시된다. 나타내어진 바와 같이, 패널 (I) 내지 (II)는 관능화된 말단 단부 (902)를 포함하는 펩티드 (900)를 고정화하는 프로세스를 도시한다. 패널 (I)에서, 샘플 웰을 포함하는 고체 지지체가 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 비-금속성 층 (910)을 포함하는 바닥 표면 및 금속성 층 (912)을 포함하는 측벽 표면에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 비-금속성 층 (910)은 투명한 층 (예를 들어, 유리, 실리카)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속성 층 (912)은 금속 옥시드 표면 (예를 들어, 이산화티타늄)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속성 층 (912)은 부동화 코팅 (914) (예를 들어, 인-함유 층, 예컨대 오르가노포스포네이트 층)을 포함한다. 나타내어진 바와 같이, 비-금속성 층 (910)을 포함하는 바닥 표면은 상보적 관능성 모이어티 (904)를 포함한다. 선택적 표면 변형 및 관능화의 방법은 미국 특허 공개 번호 2018/0326412, 미국 가출원 번호 62/914,356 및 미국 특허 공개 번호 2021-0129179에 추가로 상세하게 기재되어 있으며, 이들의 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 관능화된 말단 단부 (902)를 포함하는 펩티드 (900)는 고체 지지체의 상보적 관능성 모이어티 (904)와 접촉되어 공유 또는 비-공유 연결 기를 형성한다. 일부 실시양태에서, 관능화된 말단 단부 (902) 및 상보적 관능성 모이어티 (904)는 예를 들어, 펩티드 (900) 및 고체 지지체 사이에 공유 연결 기를 형성하는 파트너 클릭 화학 핸들을 포함한다. 적합한 클릭 화학 핸들은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 관능화된 말단 단부 (902) 및 상보적 관능성 모이어티 (904)는 예를 들어, 펩티드 (900) 및 고체 지지체 사이에 비-공유 연결 기를 형성하는 비-공유 결합 파트너를 포함한다. 비-공유 결합 파트너의 예는 상보적 올리고뉴클레오티드 가닥 (예를 들어, DNA, RNA, 및 그의 변이체를 포함하는 상보적 핵산 가닥), 단백질-단백질 결합 파트너 (예를 들어, 바르나제 및 바르스타), 및 단백질-리간드 결합 파트너 (예를 들어, 비오틴 및 스트렙타비딘)를 포함한다.
패널 (II)에서, 펩티드 (900)는 관능화된 말단 단부 (902) 및 상보적 관능성 모이어티 (904)를 접촉시킴으로써 형성된 연결 기를 통해 바닥 표면에 고정화되어 나타내어진다. 이 예에서, 펩티드 (900)는 패널 (III)의 확대된 영역에 도시된 비-공유 연결 기를 통해 부착된다. 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 비-공유 연결 기는 아비딘 단백질 (920)을 포함한다. 아비딘 단백질은 일반적으로 아비딘 단백질의 4개의 서브유닛의 각각에 비오틴 결합 부위를 갖는 비오틴-결합 단백질이다. 아비딘 단백질은 예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 트랍타비딘, 타마비딘, 브라다비딘, 크세나비딘, 및 그의 동족체 및 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아비딘 단백질 (920)은 스트렙타비딘이다. 아비딘 단백질 (920)의 다가성은 다양한 연결 배치를 허용할 수 있는데, 이는 4개의 결합 부위의 각각이 독립적으로 비오틴 분자에 결합할 수 있기 때문이다 (백색 원으로서 나타내어짐).
패널 (III)에 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 비-공유 연결은 제1 비스-비오틴 모이어티 (922) 및 제2 비스-비오틴 모이어티 (924)에 결합된 아비딘 단백질 (920)에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 관능화된 말단 단부 (902)는 제1 비스-비오틴 모이어티 (922)를 포함하고, 상보적 관능성 모이어티 (904)는 제2 비스-비오틴 모이어티 (924)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관능화된 말단 단부 (902)는 상보적 관능성 모이어티 (904)와 접촉되기 전에 아비딘 단백질 (920)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상보적 관능성 모이어티 (904)는 관능화된 말단 단부 (902)와 접촉되기 전에 아비딘 단백질 (920)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 관능화된 말단 단부 (902)는 제1 비스-비오틴 모이어티 (922) 및 수용성 모이어티를 포함하고, 여기서 수용성 모이어티는 제1 비스-비오틴 모이어티 (922) 및 펩티드 (900)의 아미노산 (예를 들어, 말단 아미노산) 사이에 연결을 형성한다. 수용성 모이어티는 본원의 다른 곳에 상세하게 기재되어 있다.
일부 실시양태는 관능화된 펩티드 샘플을 정제하여 정제된 관능화된 펩티드 샘플을 형성하는 것을 포함한다. 관능화된 펩티드 샘플을 정제하는 것은 제5 유체 장치 부분의 정제 영역에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태는 관능화된 펩티드 샘플의 적어도 일부를 고정화 복합체 형성 영역으로부터 정제 영역으로 자동으로 수송하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관능화된 펩티드 샘플을 정제하는 것은 관능화된 펩티드 샘플의 임의의 나머지 비-관능화된 펩티드의 적어도 일부를 제거함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제는 관능화된 펩티드 샘플을 크기 배제 매체를 통해 통과시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 크기 배제 매체는 칼럼일 수 있다. 칼럼은 탈염 칼럼일 수 있다. 일부 실시양태에서, 칼럼은 제바(Zeba) 칼럼 (예를 들어 제바 7 kDa 또는 제바 40 kDa 칼럼)이다. 일부 실시양태에서, 크기 배제 매체는 유체 장치의 일부이다. 일부 실시양태에서, 크기 배제 매체는 시스템의 일부이지만, 그 시스템의 유체 장치의 일부는 아니다.
일부 실시양태에서, 단백질을 정제하는 것은 면역침전을 통한 정제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역침전은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 샘플 (예를 들어, 관능화 전 또는 후의 샘플)로부터 표적 단백질을 침전시키는 것을 포함한다.
본 개시내용의 특정 측면은 유체 장치에 관한 것이다. 유체 장치는 시스템 (예를 들어, 샘플 제조 모듈)과 작동가능하게 커플링될 수 있는 모듈식 장치일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 장치는 카트리지이거나 이를 포함한다. 유체 장치 (및/또는 샘플 제조 모듈)는 본원에 기재된 바와 같은 유체 장치 성분 (예를 들어, 카트리지)을 작동하는데 사용될 수 있는 기계적 및 전자 및/또는 광학 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 장치는 유체 장치 부분 (예를 들어, 인큐베이션 영역) 상의 특이적 온도를 달성하고 유지하도록 작동한다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 성분은 유체 장치의 전극에 특이적 시간 지속기간 동안 특이적 전압을 인가하도록 작동한다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 적어도 하나의 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 장치는 마이크로채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 채널의 일부의 적어도 부분은 채널의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성된 엘라스토머를 포함하는 표면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 성분은 액체를 유체 장치의 저장소 및/또는 채널 (예를 들어, 인큐베이션 채널)에, 그로부터, 또는 그 사이에 이동시키도록 작동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 성분은 액체를 유체 장치의 채널(들)을 통해, 예를 들어, 유체 장치의 저장소 및/또는 다른 채널 (예를 들어 인큐베이션 채널)에, 그로부터, 또는 그 사이에 이동시키도록 작동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 성분은 채널을 통해 유체를 펌핑하는 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 채널과 회합된 엘라스토머 성분 (예를 들어, 엘라스토머를 포함하는 표면 층)과 상호작용하도록 구성된 연동 펌핑 메커니즘 (예를 들어, 기구)을 통해 액체를 이동시킨다.
일부 실시양태에서, 시스템은 샘플 제조 모듈을 포함하고, 샘플 제조 모듈은 롤러 및 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 포함하는 기구를 포함하는 연동 펌프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈은 롤러 및 롤러에 연결된 크랭크-및-로커 메커니즘을 포함하는 기구를 포함하는 연동 펌프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 샘플 제조 모듈을 포함하고, 샘플 제조 모듈은 채널을 포함하는 표면을 갖는 베이스 층을 포함하는 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 포함하는 연동 펌프를 포함하고, 여기서 채널의 적어도 일부의 적어도 부분은 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다. 시스템은 샘플 제조 모듈의 하류에 검출 모듈을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 영역은 하나 초과의 유체 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 시스템의 샘플 제조 영역으로부터 하류에 검출 모듈을 포함한다.
예를 들어, 도 9는 일부 실시양태에 따른 본원에 기재된 장치 (예를 들어, 기구, 유체 장치, 연동 펌프)를 혼입하는 예시적인 시스템 (2000)의 개략적 예시이다. 예시적인 시스템 (2000)은 일부 실시양태에 따라, 샘플의 하나 이상의 성분을 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템 (2000)은 샘플 제조 모듈 (1700)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템 (2000)은 샘플 제조 모듈 (1700) 및 샘플 제조 모듈 (1700)의 하류에 검출 모듈 (1800) 둘 다를 포함한다. 샘플 제조 모듈 및 검출 모듈의 예시적인 특색 및 연관된 방법은 하기에 보다 상세하게 기재된다. 샘플 제조 모듈 (1700) 및 검출 모듈 (1800)은 특정 실시양태에 따라, 샘플의 적어도 부분이, 제조된 후, 샘플 제조 모듈 (1700)로부터 샘플이 검출되는 (예를 들어, 분석되는, 시퀀싱되는, 확인되는 등) 검출 모듈 (1800)로 (직접적으로 또는 간접적으로) 수송될 (예를 들어, 유동될) 수 있도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 2개 이상의 유체 장치 부분 (예를 들어 제1 유체 장치 부분, 제2 유체 장치 부분, 제3 유체 장치 부분, 제4 유체 장치 부분, 제5 유체 장치 부분)은 동일한 유체 장치의 일부이다. 예를 들어: 일부 실시양태에서, 제1 유체 장치 부분 및 제2 유체 장치 부분은 동일한 유체 장치의 일부이다. 일부 실시양태에서, 제1 유체 장치 부분 및 제3 유체 장치 부분은 동일한 유체 장치의 일부이다. 일부 실시양태에서, 제2 유체 장치 부분 및 제3 유체 장치 부분은 동일한 유체 장치의 일부이다. 일부 실시양태에서, 제1 유체 장치 부분, 제2 유체 장치 부분, 제3 유체 장치 부분, 및 제4 유체 장치 부분은 동일한 유체 장치의 일부이다. 예를 들어, 도 10a는 유체 장치 (100)의 일부인 제1 유체 장치 부분 (102), 제2 유체 장치 부분 (104), 및 제3 유체 장치 부분 (106)의 개략적 예시를 제시한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 2개 이상의 유체 장치 부분 (예를 들어 제1 유체 장치 부분, 제2 유체 장치 부분, 제3 유체 장치 부분, 제4 유체 장치 부분, 제5 유체 장치 부분)은 별개의 상이한 유체 장치 (예를 들어 별개의 카트리지)의 일부이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 제1 유체 장치 부분 및 제2 유체 장치 부분은 상이한 유체 장치의 일부이다. 예를 들어, 도 10b는 별개의 유체 장치의 일부인 제1 유체 장치 부분 (102), 제2 유체 장치 부분 (104), 및 제3 유체 장치 부분 (106)의 개략적 예시를 제시한다. 일부 실시양태에서, 동일한 유체 장치의 일부가 아닌 유체 장치 부분은 동일한 시스템의 일부이다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 부분은 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 부분은 하나 이상의 마이크로채널을 포함한다.
시스템 성분은 예를 들어, 샘플 정보가 입력될 수 있고, 특이적 프로세스가 선택될 수 있고, 실행 결과가 보고될 수 있는 사용자 인터페이스를 유도하는 컴퓨터 자원을 포함할 수 있다. 유체 장치 및 시스템의 다양한 측면 및 실시양태는 하기에 상세하게 기재된다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 카트리지이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 하나 이상의 저장된 시약 (예를 들어, 액체 또는 액체 형태로의 재구성을 위해 적합한 동결건조된 형태의)을 포함한다. 카트리지의 저장된 시약은 목적하는 프로세스를 수행하는데 적합한 시약 및/또는 목적하는 샘플 유형 (예를 들어 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 단백질 소화제)을 프로세싱하는데 적합한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 단일-사용 카트리지 (예를 들어, 일회용 카트리지) 또는 다중-사용 카트리지 (예를 들어, 재사용가능한 카트리지)이다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 사용자-공급된 샘플 (예를 들어 단백질의)을 수용하도록 구성된다. 사용자-공급된 샘플은 카트리지가 예를 들어, 사용자에 의해 수동으로 또는 자동화된 프로세스에서 유체 장치에 의해 수용되기 전 또는 후에 카트리지에 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)는 채널을 포함하는 표면을 갖는 베이스 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널의 적어도 일부의 적어도 부분은 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 채널의 적어도 일부의 적어도 부분은 표면 층을 갖는다. 표면 층은 엘라스토머를 포함할 수 있다. 표면 층은 채널의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성될 수 있다. 카트리지의 실시양태는 본원의 다른 곳에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)는 샘플 제조 프로세스에 사용되는 유체 (예를 들어, 하나 이상의 시약을 포함하는 유체)를 함유하고/거나 수송하도록 구성된 하나 이상의 채널 (예를 들어, 미세유체 채널)을 포함한다. 시약은 완충제, 효소적 시약, 중합체 매트릭스, 포획 시약, 크기-특이적 선택 시약, 서열-특이적 선택 시약, 및/또는 정제 시약을 포함한다. 샘플 제조 프로세스에 사용하기 위한 추가의 시약은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 예를 들어, 샘플 제조 단계에 대해 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질 분석, 시퀀싱, 또는 확인에 대해) 상기 기재된 임의의 시약 (또는 이들의 조합)은 카트리지 (예를 들어, 카트리지의 채널, 저장소, 및/또는 반응 용기)에 사용되고/거나 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)는 하나 이상의 저장된 시약 (예를 들어, 액체 또는 액체 형태로의 재구성을 위해 적합한 동결건조된 형태의)을 포함한다. 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 저장된 시약은 목적하는 프로세스를 수행하는데 적합한 시약 및/또는 목적하는 샘플 유형을 프로세싱하는데 적합한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 장치는 단일-사용 유체 장치 (예를 들어, 일회용 카트리지) 또는 다중-사용 유체 장치 (예를 들어, 재사용가능한 카트리지)이다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)는 사용자-공급된 샘플을 수용하도록 구성된다. 사용자-공급된 샘플은 유체 장치가 예를 들어, 사용자에 의해 수동으로 또는 자동화된 프로세스에서 장치에 의해 수용되기 전 또는 후에 유체 장치에 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)는 베이스 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 베이스 층은 하나 이상의 채널을 포함하는 표면을 갖는다. 예를 들어, 도 11은 일부 실시양태에 따른 채널 (202)의 폭을 따른 유체 장치 (200)의 횡단면도의 개략적 도해이다. 도시된 유체 장치 (200)는 채널 (202)을 포함하는 표면 (211)을 갖는 베이스 층 (204)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 채널의 적어도 일부는 마이크로채널이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 채널 (202)의 적어도 일부는 마이크로채널이다. 특정 실시양태에서, 모든 채널은 마이크로채널이다. 예를 들어, 도 11을 다시 언급하면, 특정 실시양태에서, 모든 채널 (202)은 마이크로채널이다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 작은-부피 유체 (예를 들어, 1 내지 10 μL, 2 내지 10 μL, 4 내지 10 μL, 5 내지 10 μL, 1 내지 8 μL, 또는 1 내지 6 μL 유체)를 취급할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 카트리지는 유체 장치의 샘플 제조 장치 또는 모듈에 물리적으로 포매되거나 그와 회합된다 (예를 들어, 제조된 샘플이 시퀀싱을 위해 반응 혼합물에 전달되는 것을 허용하기 위해). 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈에 물리적으로 포매되거나 그와 회합된 시퀀싱 카트리지는 페이스 밀봉 가스켓 또는 원뿔형 프레스 핏 (예를 들어, 루어(Luer) 피팅)의 형태의 유체 계면을 갖는 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 계면은 이어서 샘플 제조 장치 또는 모듈로부터 시퀀싱 카트리지를 물리적으로 분리하기 위해 제조된 샘플의 전달 후에 파괴될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)는 샘플 제조 프로세스에 사용되는 유체를 수용하고/거나 하나 이상의 시약을 함유하도록 구성된 하나 이상의 저장소 또는 반응 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)은 저장소에 연결된다. 저장소는 샘플이 관여하는 화학 반응에 사용될 수 있다. 한 비-제한적 예로서, 저장소는 샘플이 관여하는 효소적 반응 (예를 들어, 추가의 분석, 시퀀싱, 또는 진단 프로세스 전의 상류 프로세스로서)에 사용될 수 있다.
저장소는 저장소의 둘레 상에 교차함으로써 채널(들)의 바닥 표면에서 적어도 일부 채널(들)에 연결될 수 있다. 일부 이러한 경우에, 이어서, 저장소 및 그것이 연결된 채널은 각각 유체 장치의 표면 층 (예를 들어, 막, 예컨대 실리콘 막)과 접속한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 저장소는 저장소 또는 유체 장치의 상부 표면을 통해 적어도 일부 채널(들)에 연결된다. 일부 실시양태에서, 저장소는 비어 있다 (예를 들어, 본원의 프로세스 중 하나 이상 전에 초기에 비어 있음). 예를 들어, 저장소는 시퀀싱 (또는 분석 또는 진단) 적용의 시작에서 초기에 비어 있을 수 있지만, 적용 동안, 샘플 및/또는 시약 (예를 들어, 효소적 반응 시약)이 첨가된다. 일부 실시양태에서, 저장소는 시약 (예를 들어, 작은 부피, 예컨대 수 마이크로리터의 효소적 반응 시약)을 함유한다. 일부 이러한 실시양태에서, 샘플은 저장소 내로의 샘플의 수송시 시약 및 샘플 및 시약 믹스를 함유하는 저장소 내로 수송된다.
일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)은 온도 구역에서 저장소에 연결된다. 저장소는 그것이 저장소에서의 유체의 온도를 조절할 수 있는 열조에 의해 접촉되거나 적어도 부분적으로 (또는 완전히) 둘러싸이는 경우 온도 구역에 있을 수 있다. 상기 및 하기 기재된 인큐베이션 영역은 온도 구역일 수 있다. 예를 들어, 저장소는 저장소에서의 유체의 온도를 조절할 수 있는 금속 공동 (예를 들어, 기기 내로 통합된 금속 공동)에 의해 둘러싸일 수있다. 저장소의 온도 조절 (예를 들어, 온도 구역을 통해)은 상대적으로 정확한 온도 제어를 허용할 수 있다. 상대적으로 정확한 온도는 목적하는 반응 (예를 들어, 효소적 반응)이 특이적 온도 범위에서 보다 효율적으로 진행하는 특정 실시양태에서 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 인큐베이션 영역을 포함한다. 인큐베이션 영역은 일부 실시양태에서, 인큐베이션 채널을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a를 언급하면, 유체 장치 (100)는 인큐베이션 영역 (110)을 포함하며, 이는 인큐베이션 채널 (112)을 포함한다. 인큐베이션 영역은 하나 이상의 시약을 수용하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인큐베이션 채널은 하나 이상의 시약을 수용하도록 구성된다. 일부 실시양태는 인큐베이션 단계 전에 펩티드 샘플을 유체 장치의 채널로부터 인큐베이션 영역으로 수송하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계는 샘플의 적어도 일부가 인큐베이션 영역의 인큐베이션 채널의 적어도 부분에 있는 동안 수행된다.
인큐베이션 채널은 마이크로채널일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 채널은 제1 채널 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 채널은 제2 채널 부분을 포함한다. 제2 채널 부분은 제1 채널 부분에 평행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 채널 부분 및 제2 채널 부분은 제1 채널 부분의 평균 방향 및 제2 채널 부분의 평균 방향 사이의 각도 θ가 20° 이하, 15° 이하, 10° 이하, 5° 이하, 또는 그 미만인 경우 평행한 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 채널 부분 및 제2 채널 부분은 이들이 완전히 평행한 경우 (즉, 제1 채널 부분의 평균 방향 및 제2 채널 부분의 평균 방향 사이의 각도 θ가 0인 경우) 평행한 것으로 간주된다. 예를 들어, 도 1b에서 인큐베이션 채널 (112)은 제1 채널 부분 (116), 뿐만 아니라 제1 채널 부분 (116)에 평행한 제2 채널 부분 (118)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 턴 부분은 제2 채널 부분의 제1 채널 부분을 연결한다. 예를 들어, 도 1b를 다시 언급하면, 턴 부분 (117)은 제1 채널 부분 (116)을 제2 채널 부분 (118)에 연결한다. 일부 경우에, 인큐베이션 채널의 적어도 부분은 구불구불한 구성을 갖는다. 예를 들어, 도 1b에서, 인큐베이션 채널 (112)은 구불구불한 구성을 갖는다. 제1 채널 부분 및 턴 부분을 통해 연결된 평행한 제2 채널 부분을 갖는 것 (예를 들어, 구불구불한 구성의 경우에서와 같이)은 효율적인 인큐베이션을 촉진시킬 수 있음 (예를 들어, 효율적인 가열에 의해)이 본 개시내용의 맥락에서 실현되었다. 예를 들어, 이러한 구성은 인큐베이션 채널 내의 유체의 보다 효율적인 가열을 촉진시킬 수 있는 상대적으로 작은 공간에서 상대적으로 큰 인큐베이션 채널 부피를 제공할 수 있다. 부피를 증가시키기 위한 다른 기술이 가능하지만, 여기에 기재된 구성은 인큐베이션 채널 내의 상대적으로 긴 통로 길이를 제공함으로써 상대적으로 작은 채널 횡단면 치수 (예를 들어, 마이크로채널)의 사용을 허용한다.
본 개시내용의 맥락에서, 채널은 그것이 턴 부분에 의해 분리된 2개 이상의 평행한 채널 부분을 포함하는 경우 구불구불한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에 따르면, 구불구불한 채널은 n개의 평행한 채널 부분, 및 턴 부분이 평행한 채널 부분의 각각의 연속적 쌍을 연결하도록 구성된 n-1개의 턴 부분을 포함할 수 있고, 여기서 n은 1보다 큰 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 8 이상, 10 이상, 또는 그 초과이다. 예를 들어, U-형상 채널 또는 S-형상 채널은 구불구불한 것일 수 있다.
인큐베이션 채널은 혼합물의 공급원에 유동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 도 1d에서, 유체 장치 (100)는 혼합물 (114)의 공급원에 연결된다. 혼합물은 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및/또는 단백질 소화제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 혼합물은 이들 모두를 포함할 수 있다 (예를 들어 혼합물은 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제를 포함할 수 있음).
본원에 사용된 용어 "채널"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 유체를 함유하고/거나 수송하도록 구성된 구조를 지칭할 수 있다. 채널은 일반적으로 벽; 베이스 (예를 들어, 벽에 연결되고/거나 벽으로부터 형성된 베이스); 및 채널의 하나 이상의 부분에서 개방되고/거나, 커버되고/거나, 밀봉될 수 있는 표면 개구를 포함한다. 일부 실시양태에서, 밀봉되는 표면 부분은 완전히 밀봉된다. 일부 실시양태에서, 밀봉되는 표면 부분은 실질적으로 밀봉된다. 표면 개구는 표면 개구의 50% 초과, 60% 초과, 75% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과가 밀봉되는 경우 실질적으로 밀봉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면 개구는 엘라스토머에 의해 밀봉될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "마이크로채널"은 1000 마이크로미터 이하의 크기의 적어도 하나의 치수를 포함하는 채널을 지칭한다. 예를 들어, 마이크로채널은 1000 마이크로미터 이하 (예를 들어, 100 마이크로미터 이하, 10 마이크로미터 이하, 5 마이크로미터 이하)의 크기의 적어도 하나의 치수 (예를 들어, 폭, 높이)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이크로채널은 1 마이크로미터 이상 (예를 들어, 2 마이크로미터 이상, 10 마이크로미터 이상)의 적어도 하나의 치수를 포함한다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 1 마이크로미터 이상 및 1000 마이크로미터 이하, 10 마이크로미터 이상 및 100 마이크로미터 이하). 다른 범위는 또한 가능하다. 일부 실시양태에서, 마이크로채널은 1000 마이크로미터 이하의 수력학적 직경을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "수력학적 직경" (DH)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, DH = 4A/P로서 결정될 수 있고, 여기서 A는 채널을 통한 유체의 유동의 횡단면적이고, P는 횡단면의 윤변 (유체에 의해 접촉된 채널의 횡단면의 둘레)이다.
일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다. 도 11을 다시 언급하면, 일부 실시양태에서, 채널 (202)의 적어도 일부의 적어도 부분은 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "삼각형"은 삼각형이 실제 형상에 근사하거나 동등하도록 내접되거나 외접될 수 있는 형상을 지칭하는데 사용되며, 순수하게 삼각형에 국한되지는 않는다. 예를 들어, 삼각형 횡단면은 하나 이상의 부분에서 비-제로 곡률을 포함할 수 있다.
삼각형 횡단면은 쐐기 형상을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "쐐기 형상"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되어 있을 것이며, 두꺼운 단부를 갖고 얇은 단부로 가늘어지는 형상을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 쐐기 형상은 두꺼운 단부로부터 얇은 단부로 대칭의 축을 갖는다. 예를 들어, 쐐기 형상은 두꺼운 단부 (예를 들어, 채널의 표면 개구)를 갖고, 얇은 단부 (예를 들어, 채널의 베이스)로 가늘어질 수 있으며, 두꺼운 단부로부터 얇은 단부로 대칭의 축을 가질 수 있다.
추가적으로, 특정 실시양태에서, 실질적으로 삼각형 횡단면 (즉, "v-홈(들)")은 다양한 종횡비를 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 v-홈에 대한 "종횡비"는 높이-대-폭 비를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, v-홈(들)은 2 이하, 1 이하, 또는 0.5 이하, 및/또는 0.1 이상, 0.2 이상, 또는 0.3 이상의 종횡비를 가질 수 있다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 0.1 내지 2, 0.2 내지 1). 다른 범위는 또한 가능하다.
일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 실질적으로 삼각형 부분 및 실질적으로 삼각형 부분 내로 개방된 제2 부분을 포함하고, 채널의 표면에 비해 실질적으로 삼각형 부분 밑으로 연장하는 횡단면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 부분은 실질적으로 삼각형 부분의 평균 직경보다 유의하게 더 작은 직경 (예를 들어, 평균 직경)을 갖는다. 도 11을 다시 언급하면, 일부 실시양태에서, 채널 (202)의 적어도 일부의 적어도 부분은 실질적으로 삼각형 부분 (201) 및 실질적으로 삼각형 부분 (201) 내로 개방된 제2 부분 (203)을 포함하고, 채널의 표면 (205)에 비해 실질적으로 삼각형 부분 (201) 밑으로 연장하는 횡단면을 갖고, 여기서 제2 부분 (203)은 실질적으로 삼각형 부분 (201)의 평균 직경 (209)보다 유의하게 더 작은 직경 (207)을 갖는다. 일부 실시양태에서 제2 부분의 직경 대 실질적으로 삼각형 부분의 평균 직경의 비는 0.8 이하, 0.6 이하, 0.5 이하, 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하, 및/또는 0.1만큼 작거나 그 미만이다. 일부 이러한 경우에, 채널의 실질적으로 삼각형 부분의 평균 직경의 그것보다 유의하게 더 작은 직경을 갖는 채널의 제2 부분은 기구의 롤러에 접근가능한 실질적으로 삼각형 부분 및 표면 층의 변형된 부분, 그러나 롤러에 접근불가능한 제2 부분 및 표면 층의 변형된 부분을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 도 11을 다시 언급하면, 특정 실시양태에 따르면, 채널 (202)의 실질적으로 삼각형 부분 (201)은 롤러 (도시되지 않음) 및 표면 층 (206)의 변형된 부분에 접근가능한 반면, 제2 부분 (203)은 롤러 및 표면 층 (206)의 변형된 부분에 접근불가능하다. 일부 이러한 경우에, 표면 층 (206)을 갖는 밀봉부는 제2 부분 (203)을 갖는 채널 (202)의 부분에서 달성될 수 없는데, 이는 표면 층 (206)이 그것이 실질적으로 삼각형 부분 (201)을 채우지만, 제2 부분 (203)은 그렇지 않도록 롤러에 의해 변형되는 경우에도, 유체가 제2 부분 (203)에서 여전히 자유롭게 이동할 수 있기 때문이다. 일부 실시양태에서, 채널의 길이를 따른 부분은 실질적으로 삼각형 부분 및 제2 부분 ("딥 섹션") 둘 다를 가질 수 있는 반면, 채널의 길이를 따른 상이한 부분은 단지 실질적으로 삼각형 부분만을 갖는다. 일부 이러한 실시양태에서, 기구 (예를 들어, 롤러)가 실질적으로 삼각형 부분 및 제2 부분 (딥 섹션) 둘 다를 갖는 부분과 결속하는 경우, 펌프 작용은 시작되지 않는데, 이는 표면 층을 갖는 밀봉부가 달성되지 않기 때문이다. 그러나, 기구가 채널의 길이 방향을 따라 결속함에 따라, 기구가 단지 실질적으로 삼각형 섹션만을 갖는 채널의 부분에서 표면 층을 변형시키는 경우, 펌프 작용은 시작하는데, 이는 그 부분에서 제2 부분 (딥 섹션)의 결여가 밀봉부 (및 결과적으로 차등적 압력)가 생성되는 것을 허용하기 때문이다. 따라서, 일부 경우에, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 채널의 길이를 따른 딥 섹션의 존재 및 부재는 채널의 부분의 제어가 기구와의 결속시 펌프 작용을 겪을 수 있음을 허용할 수 있다.
유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 채널의 적어도 일부의 제2 부분으로서 이러한 "딥 섹션"의 포함은 임의의 다양한 잠재적 유익에 기여할 수 있다. 예를 들어, 이러한 딥 섹션 (예를 들어, 제2 부분 (203))은 일부 경우에, 연동 펌핑 프로세스에서 펌프 부피의 감소에 기여한다. 일부 이러한 경우에, 펌프 부피는 보다 높은 부피 분해능에 대해 2배 이상 감소될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 딥 섹션은 또한 어디에서 롤러가 채널 상에 착륙하는지에 의해 결정되지 않는 펌프 부피에 대한 잘 정의된 시작점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 삼각형 부분 및 제2 부분 (딥 섹션) 둘 다를 갖는 채널의 부분 및 단지 실질적으로 삼각형 부분만을 갖는 채널의 부분 사이의 계면은 일부 경우에, 펌프 부피에 대한 잘 정의된 시작점으로서 사용될 수 있는데, 이는 단지 후자의 채널 부분의 부피를 점유하는 유체만이 펌핑될 수 있기 때문이다. 일부 경우에, 어디에서 롤러가 채널 상에 착륙하는지는 임의의 다양한 인자, 예컨대 카트리지 등록에 따라 연관된 일부 오류를 가질 수 있다. 딥 섹션의 포함은 일부 경우에, 이러한 오류와 연관된 펌프 부피의 변동을 감소시키거나 제거할 수 있다.
본원에 사용된 채널의 실질적으로 삼각형 부분의 평균 직경은 실질적으로 삼각형 부분의 정점으로부터 채널의 표면까지의 z-축에 걸친 평균으로서 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 적어도 일부 채널 (또한 본원에서 펌핑 레인으로 지칭됨) (예를 들어, 모든 채널)은 각각 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 포함하는 밸브를 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 밸브는 채널의 단부의 기하학에 의해 형성된 연관된 채널에 폐색물을 포함한다. 예를 들어, 채널의 단부의 기하학은 채널의 바닥으로부터 채널의 상부 표면에 걸치는 벽일 수 있고, 여기서 채널은 표면 층과 접속한다. 일부 이러한 실시양태에서, 채널은 밸브가 개방되도록 충분한 압력이 적용될 때까지 그의 연관된 밸브에 의해 폐쇄되어 잔류한다. 특정 실시양태에서, 밸브는 밖으로 부푸는 표면 층에 의해 개방된다. 특정 실시양태에서, 각각의 밸브는 롤러에 의해 효과적으로 작동된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 롤러가 밸브에 상대적으로 가까울 때 롤러에 의해 표면 층 상에 가해지는 압력은 작은 폐색물 및 표면 층 사이의 밀봉부가 가역적으로 파괴되고, 그에 의해 유체가 밸브를 통해 통과하는 것을 허용하도록, 표면 층이 밖으로 부풀게 한다 (예를 들어, 격막과 같이). 일부 경우에, 이러한 "수동" 밸브의 사용은 임의의 다양한 이점에 기여할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 기재된 이러한 통합된 밸브의 사용은 펌핑되지 않는 레인 (예를 들어, 기구의 롤러와의 결속을 통해)이 폐쇄되어 잔류하는 것을 보장할 수 있다. 일부 이러한 경우에, 단지 기구 (예를 들어, 펌프)에 의해 결속된 채널로부터의 유체만이 유체 장치 (예를 들어 카트리지)로부터 유도되며, 이는 감소된 오염으로 또는 오염 없이 다중-채널 펌프로부터 유체를 선택적으로 유도하는 편리하고, 간단하고, 저렴한 방법을 허용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 채널은 일반적으로 1 이하의 깊이/폭의 종횡비를 갖는 특정 상대적으로 작은 폭 및 깊이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 채널 폭은 1 mm 이상, 1.2 mm 이상, 1.5 mm 이상, 2 mm 이하, 1.8 mm 이하, 및/또는 1.6 mm 이하이다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 1 mm 내지 2 mm). 다른 범위는 또한 가능하다. 일부 실시양태에서, 채널 깊이는 0.6 mm 이상, 0.75 mm 이상, 0.9 mm 이상, 1.5 mm 이하, 1.2 mm 이하, 및/또는 1.0 mm 이하이다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 0.6 mm 내지 1.5 mm). 다른 범위는 또한 가능하다. 일부 실시양태에서, 채널 종횡비는 1 이하, 0.8 이하, 0.6 이하, 0.5 이하, 0.2 이상, 및/또는 0.4 이상이다. 상기-언급된 범위의 조합은 또한 가능하다 (예를 들어, 0.2 내지 1). 다른 범위는 또한 가능하다. 특정 실시양태에서, 성형 프로세스의 내성 및 역량을 고려하여, 1.5 mm 정도의 폭 및 0.75 mm 정도의 깊이의 채널이 적절할 수 있다. 특정 실시양태에서, 채널 횡단면은 채널 내로의 롤러 접근의 용이성 (예를 들어, 보다 얕은 v-홈이 보다 좋을 수 있음) 및 보다 높은 부피 정확성 (예를 들어, 적어도 부피는 엘라스토머를 포함하는 표면 층의 정확한 평면성을 달성하는 것에 덜 의존적이 되기 때문에, 보다 깊은 v-홈이 보다 좋을 수 있음) 둘 다를 제공하는 90도 v-홈을 갖는 1/2의 종횡비를 갖는다. 특정 실시양태에서, 채널 깊이는 표면 층이 채널 치수의 일부 유의한 분율일 가능성이 있는 채널에서의 결함을 일시적으로 채우고 그에 대해 밀봉할 수 있도록, 엘라스토머를 포함하는 표면 층의 두께의 정도이다.
일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 표면 층을 갖는다.
일부 실시양태에서, 표면 층은 엘라스토머를 포함한다. 도 11을 다시 언급하면, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 채널 (202)의 적어도 일부의 적어도 부분은 채널 (202)의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성된 엘라스토머를 포함하는 표면 층 (206)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 채널 (202)의 적어도 일부의 적어도 부분은 채널의 베이스에 단일 정점을 갖고 베이스 층의 표면에 2개의 다른 정점을 갖는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖고; 채널 (202)의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성된 엘라스토머를 포함하는 표면 층 (206)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 엘라스토머는 실리콘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엘라스토머는 실리콘 및/또는 열가소성 엘라스토머를 포함하고/거나 엘라스토머로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 표면 층은 채널의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 표면 층은 유체 (예를 들어, 액체)가 채널의 입구 또는 출구를 통해서를 제외하고는 채널을 떠날 수 없도록 채널의 표면 개구를 완전히 밀봉하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 표면 층은 베이스 층의 표면의 부분에 결합된다 (예를 들어, 접착제에 의해, 열 적층, 또는 임의의 다른 적합한 결합 수단에 의해). 일부 실시양태에서, 표면 층은 접착제에 의해 베이스 층의 표면의 부분에 결합된다. 일부 실시양태에서, 표면 층은 열 적층에 의해 베이스 층의 표면의 부분에 결합된다.
본원에 사용된 용어 "밀봉하다"는 개구가 밀봉되도록 개구의 연부에서의 또는 부근에서의 접촉을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "표면 개구"는 표면 층에 의해 커버되지 않는 경우 채널을 주위 대기에 개방할 채널의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 마이크로채널은 표면 개구를 가질 수 있다.
본원에 사용된 표면 층은 임의의 적합한 결합 수단에 의해 베이스 층의 표면의 부분에 결합될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표면 층은 베이스 층의 표면의 부분에 공유적으로, 이온적으로, 반 데르 발스 상호작용에 의해, 쌍극자-쌍극자 상호작용에 의해, 수소 결합에 의해, 파이-파이 스태킹 상호작용에 의해, 또는 또 다른 적합한 결합 수단에 의해 결합된다.
일부 실시양태에서, 표면 층은 베이스 층의 표면의 부분과 직접적으로 접촉하여 장력에서 보유된다.
본원에 사용된 채널의 표면 (예를 들어, 천장)은 표면 층의 내표면에 상응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표면 층의 적어도 부분은 적용된 압력의 적어도 하나의 규모의 부재 하에서 평평하다. 일부 실시양태에서, 표면 층의 전체는 적용된 압력의 적어도 하나의 규모의 부재 하에서 평평하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표면 층의 적어도 부분 (또는 전체)은 기구의 롤러에 의한 결속의 부재 하에서 평평하다 (이는 압력의 적용을 통해 표면 층의 변형을 유발할 수 있음).
일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 생물학적 물질과 혼화성인 물질 (예를 들어, 실질적으로 단단한 물질)을 포함하는 벽 및 베이스를 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 일부 채널(들)의 적어도 부분은 실질적으로 단단한 물질을 포함하는 벽 및 베이스를 갖는다. 예를 들어, 도 11을 다시 언급하면, 일부 실시양태에서, 채널 (202)의 적어도 일부의 적어도 부분은 실질적으로 단단한 물질을 포함하는 벽 및 베이스를 갖는다. 특정 실시양태에서, 베이스는 베이스 층 (204)의 물질과 동일한 물질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 베이스는 베이스 층 (204)의 물질과는 상이한 물질을 포함한다. 예를 들어, 베이스는 채널의 벽 및 베이스가 단단한 물질로 코팅되는 경우에 베이스 층 (204)의 물질과는 상이한 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 단단한 물질은 생물학적 물질과 혼화성이다. 일부 실시양태에서, 베이스 층은 사출-성형된 부분이다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 유도체화 영역을 포함한다. 유도체화 영역은 임의의 적합한 기하학을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 컨테이너를 포함한다. 예를 들어, 유도체화 영역은 실린더, 프리즘, 평행육면체, 채널, 또는 적합한 부피의 임의의 다른 컨테이너를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 가열되거나 냉각되도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 채널 (예를 들어 구불구불한 채널)을 포함하는 것이 유리한데, 이는 이 구성이 효율적인 열 접촉을 촉진시킬 수 있기 때문이다 (예를 들어, 효율적인 가열에 의해). 예를 들어, 이러한 구성은 상대적으로 작은 공간에서 상대적으로 큰 채널 부피를 제공할 수 있으며, 이는 채널 내의 유체의 보다 효율적인 가열을 촉진시킬 수 있다. 부피를 증가시키기 위한 다른 기술이 가능하지만, 여기에 기재된 구성은 유도체화 영역 내의 상대적으로 긴 통로 길이를 제공함으로써 상대적으로 작은 채널 횡단면 치수 (예를 들어, 마이크로채널)의 사용을 허용한다.
일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 10 μL 이상, 100 μL 이상, 1 mL 이상, 또는 그 초과의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 5 mL 이하의, 1 mL 이하의, 100 μL 이하의, 50 μL 이하의, 또는 그 미만의 부피를 갖는다. 이들 범위의 조합은 가능하다. 예를 들어, 유도체화 영역은 100 μL 이상 5 mL 이하의 부피를 가질 수 있다. 이들 범위 밖의 부피를 갖는 유체 장치는 또한 고려된다.
일부 실시양태에서, 유도체화 영역은 유체가 유도체화제 저장소를 통해 통과하지 않고 인큐베이션 영역으로부터 유도체화 영역으로 자동으로 수송될 수 있도록 인큐베이션 영역에 유동적으로 연결된다. 일부 경우에, 유도체화 영역은 유도체화제 저장소로부터의 유체가 먼저 유도체화 영역에서의 인큐베이션 영역으로부터의 유체에 노출될 수 있도록 (예를 들어 혼합을 통해) 구성된다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 켄칭 영역을 포함한다. 켄칭 영역은 임의의 적합한 기하학을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 컨테이너를 포함한다. 예를 들어, 켄칭 영역은 실린더, 프리즘, 평행육면체, 채널, 또는 적합한 부피의 임의의 다른 컨테이너를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 가열되거나 냉각되도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 혼합 채널 (예를 들어 구불구불한 채널)을 포함하는 것이 유리한데, 이는 이 구성이 펌프-유도된 혼합에 도움이 될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 이러한 구성은 혼합물의 교반을 용이하게 할 수 있거나, 켄칭 영역의 출구로부터 켄칭 영역의 입구로 비켄칭된 혼합물의 재순환을 단순화할 수 있다. 부피를 증가시키기 위한 다른 기술이 가능하지만, 여기에 기재된 구성은 켄칭 영역 내의 상대적으로 긴 통로 길이를 제공함으로써 상대적으로 작은 채널 횡단면 치수 (예를 들어, 마이크로채널)의 사용을 허용한다.
일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 10 μL 이상, 100 μL 이상, 1 mL 이상, 또는 그 초과의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 5 mL 이하의, 1 mL 이하의, 100 μL 이하의, 50 μL 이하의, 또는 그 미만의 부피를 갖는다. 이들 범위의 조합은 가능하다. 예를 들어, 켄칭 영역은 100 μL 이상 5 mL 이하의 부피를 가질 수 있다. 이들 범위 밖의 부피를 갖는 유체 장치는 또한 고려된다.
일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 유도체화 영역에 유동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 켄칭 영역은 유도체화제 저장소 및/또는 유도체화 시약 저장소에 유동적으로 연결된다.
일부 실시양태는 고체 기재를 포함할 수 있는 켄칭 영역에서 (예를 들어, 유체 장치의 켄칭 영역에서) 비켄칭된 혼합물을 켄칭하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 기재는 비드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 기재 (예를 들어, 비드)는 켄칭 영역 내로 패킹된다. 일부 실시양태에서, 고체 기재는 켄칭 영역 내의 필터와 회합된다 (예를 들어, 그에 부착된다, 그에 포매된다, 그에 인접한다 등). 고체 기재는 관능기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 고체 기재는 복수의 비드를 포함하며, 이들의 일부 또는 전부는 이러한 관능기를 포함하는 표면을 갖는다. 일부 실시양태에서, 고체 기재의 관능기는 아민 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 기재는 폴리아민 비드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 기재는 복수의 폴리아민 비드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 기재는 중합체성 물질 (예를 들어, 중합체성 물질을 포함하는 비드)이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체 기재는 폴리스티렌을 포함한다. 예를 들어, 고체 기재는 복수의 폴리스티렌 비드 (예를 들어, 관능기, 예컨대 아민 기를 포함함)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 켄칭은 비켄칭된 혼합물의 과량의 유도체화제의 적어도 일부를 반응시키는 것을 포함한다. 과량의 유도체화제는 고체 기재의 관능기 (예를 들어, 켄칭 영역 내의 비드의 아민 기)와 반응될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 켄칭 영역의 적어도 부분을 통해 비켄칭된 혼합물을 재순환시키도록 구성된다. 켄칭 영역의 적어도 부분을 통해 비켄칭된 혼합물을 재순환시키는 것은 몇몇 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 켄칭 영역의 적어도 부분을 통해 비켄칭된 혼합물을 재순환시키는 것은 일부 실시양태에서 켄칭의 속도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 비켄칭된 영역은 입구 및 출구를 포함한다. 예를 들어, 도 2b에서의 예시적인 실시양태는 입구 (136) 및 출구 (138)를 포함한다. 일부 경우에, 유체 장치는 유체가 켄칭 영역의 출구로부터 켄칭 영역의 입구로 수송될 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 도 2b에서, 유체 장치 (100)는 유체가 켄칭 영역 (130)의 출구 (138)로부터 켄칭 영역 (130)의 입구 (136)로 수송될 수 있도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 켄칭 영역의 출구로부터 켄칭 영역의 입구로 수송된 유체는 비켄칭된 혼합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 켄칭은 비켄칭된 혼합물을 고체 기재 (예를 들어 복수의 비드)의 존재 하에서 고정적으로 유지하는 것을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이 맥락에서 혼합물이 고정적이라는 사실은 혼합물의 순 유속이 0임을 의미함을 이해할 것이다. 고정적 혼합물은 혼합물의 그 유동과 연관되지 않는 대류적 또는 난류적 유동을 여전히 경험할 수 있다. 일부 실시양태에서, 켄칭은 예를 들어 혼합물의 비제로 유동을 생성함으로써 비켄칭된 혼합물을 고체 기재와 능동적으로 혼합하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 켄칭은 다수의 단계를 포함하고, 여기서 일부 단계 동안 비켄칭된 혼합물은 고체 기재의 존재 하에서 고정적이고, 다른 단계 동안 비켄칭된 혼합물은 고체 기재와 능동적으로 혼합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 켄칭은 1개 초과의 단계, 2개 초과의 단계, 3개 초과의 단계, 4개 초과의 단계, 5개 초과의 단계, 7개 초과의 단계, 10개 초과의 단계, 15개 초과의 단계, 20개 초과의 단계, 또는 그 초과의 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 켄칭은 고정적 혼합 및 능동적 혼합의 단계를 교대시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유체 장치는 밀봉 플레이트를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 밀봉 플레이트는 경질 플라스틱을 포함하고/거나, 사출-성형된 부분이다. 특정 실시양태에서, 밀봉 플레이트는 하나 이상의 관통-구멍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 관통-구멍은 베이스 층에서의 하나 이상의 연관된 채널과 실질적으로 유사한 형상을 갖는다. 이 맥락에서, "관통-구멍"은 예를 들어, 기구의 하나 이상의 기계적 성분이 유체 장치의 표면 층과 결속하고/거나 이탈하도록 활주할 수 있는 밀봉 플레이트 내의 갭/구멍/공극을 지칭함이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 롤러 및 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 포함하는 연동 펌프는 그 표면과 결속하고/거나 이탈하는 경우 롤러가 밀봉 플레이트의 관통 구멍의 적어도 부분을 통해 활주하여 유체 장치의 표면 층에 도달하도록 구성될 수 있다. 관통-구멍은 임의의 다양한 형상 및 종횡비를 가질 수 있다 (직사각형, 정사각형, 원형, 길쭉함 등).
특정 실시양태에서, 밀봉 플레이트의 하나 이상의 관통-구멍의 적어도 일부는 베이스 층에서의 하나 이상의 연관된 채널과 일직선상으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어, 카트리지)는 밀봉 플레이트 및 베이스 층 사이에 배치된 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면 층은 베이스 층에서의 밀봉 플레이트 사이에 직접적으로 배치된다. 특정 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어, 카트리지)는 밀봉 플레이트 및 베이스 층 사이에 배치된 표면 층의 하나 이상의 노출된 영역을 포함하고, 여기서 하나 이상의 노출된 영역의 각각은 밀봉 플레이트의 연관된 관통-구멍 및 베이스 층의 정렬된 채널에 의해 정의된다. 특정 실시양태에서, 표면 층의 하나 이상의 노출된 영역의 하나 이상의 노출된 부분은 벽의 하나 이상의 연관된 부분 및/또는 베이스 층의 연관된 채널의 베이스와 접촉하는 롤러에 의해 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈을 포함하는 본원의 시스템은 시퀀싱 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 시퀀싱 모듈을 포함하는 시스템은 2개의 카트리지가 단일, 분리불가능한 소모품을 포함하도록, 샘플 제조 카트리지 내로 포매된 시퀀싱 칩 또는 카트리지를 수반한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 칩 또는 카트리지는 소모품 지지 전자장치 (예를 들어, 와이어본드, 전기적 접촉을 갖는 PCB 기재)를 요구한다. 소모품 지지 전자장치는 시퀀싱 칩 또는 카트리지와 직접적으로 물리적 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 칩 또는 카트리지는 연동 펌프, 온도 제어 및/또는 전기영동 접촉을 위한 인터페이스를 요구한다. 이들 인터페이스는 많은 전기적 접촉 및 레이저 정렬을 위한 정확한 기하학적 등록을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 칩 또는 카트리지의 상이한 섹션은 상이한 온도, 물리적 힘, 가변하는 전압 및 전류의 전기적 인터페이스, 진동, 및/또는 경쟁 정렬 요건을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 또는 시퀀싱 모듈과 연관된 이질적인 기기 하위-시스템은 자원을 공유하기 위해 가깝게 근접해야 한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈 및 시퀀싱 모듈을 포함하는 시스템은 핸즈-프리이다 (즉, 손을 사용하지 않고 사용될 수 있음).
일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈은 진단 목적을 위한 샘플을 제조하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 진단 목적을 위한 샘플을 제조하는데 사용되는 샘플 제조 장치는 진단 모듈 또는 진단 장치에 표적 분자 또는 복수의 분자 (예를 들어, 표적 단백질)를 전달하거나 전달하도록 위치된다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 장치 또는 모듈은 진단 장치에 직접적으로 (예를 들어, 그에 물리적으로 부착됨) 또는 간접적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 시스템은 하나 이상의 유체 장치를 수용하도록 구성된 (예를 들어, 한 번에 하나의 카트리지를 수용하도록 구성된) 유체 장치 하우징을 포함한다. 도 12a는 일부 실시양태에 따른 샘플 제조 장치 (300)의 개략적 도해를 나타낸다. 장치 (예를 들어, 카트리지 하우징을 포함하는 샘플 제조 장치)는 하나 이상의 카트리지 (또는 2개 이상, 또는 3개 이상 등)를 순차적으로 또는 동시에 수용하도록 구성될 수 있다. 샘플 제조 장치 (300)는 예를 들어, 용해 카트리지 (301), 풍부화 카트리지 (302), 단편화 카트리지 (303), 및/또는 관능화 카트리지 (304) 중 하나 이상을 동시에 또는 순차적으로 수용하도록 구성될 수 있다.
샘플 및 시약은 임의의 다양한 기술을 통해 유체 장치 (예를 들어 카트리지)에서 유동하도록 만들어질 수 있다 (예를 들어, 채널을 통해). 한 이러한 기술은 연동 펌핑을 통해 유동을 유발하는 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조 모듈은 펌프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펌프는 연동 펌프이다. 일부 이러한 펌프는 본원에 기재된 유체 취급을 위한 발명적 성분 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 펌프는 기구 및/또는 유체 장치 (예를 들어, 카트리지)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펌프의 기구는 롤러, 크랭크, 및 로커를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 크랭크 및 로커는 롤러에 연결된 크랭크-및-로커 메커니즘으로서 구성된다. 기구의 롤러와의 크랭크-및-로커 메커니즘의 커플링은 일부 경우에, 본원에 기재된 특정 이점이 달성되는 것을 허용할 수 있다 (예를 들어, 유체 장치로부터의 기구의 손쉬운 이탈, 잘-계량된 스트로크 부피). 특정 실시양태에서, 펌프의 유체 장치는 채널 (예를 들어, 미세유체 채널)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체 장치의 채널의 적어도 부분은 본원에 기재된 임의의 다수의 이점에 기여할 수 있는 특정 횡단면 형상 및/또는 표면 층을 갖는다.
일부 경우에 특정 유익을 제공할 수 있는 일부 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 한 비-제한적 측면은 유체 장치에서의 특정 횡단면 형상을 갖는 채널의 포함이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유체 장치는 v-형상 채널을 포함한다. 이러한 v-형상 채널을 형성하는 한 잠재적으로 편리한 그러나 비-제한적 방법은 유체 장치 내로 v-형상 홈을 성형하거나 기계가공함으로써이다. v-형상 채널 (또한 본원에서 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는 v-홈 또는 채널로 지칭됨)을 포함시키는 것의 인식된 이점은 특정 실시양태에서 기구의 롤러가 유체 장치와 결속하여 채널을 통해 유체 유동을 유발하는 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, v-형상 채널은 롤러에 대해 치수적으로 비민감하다. 다시 말해서, 일부 경우에, 기구의 롤러 (예를 들어, 쐐기 형상 롤러)가 v-형상 채널과 적합하게 결속하기 위해 부착해야 할 단일 치수는 없다. 대조적으로, 채널의 특정 통상적인 횡단면 형상, 예컨대 반원형은 롤러가 채널과 적합하게 결속하기 위해 (예를 들어, 연동 펌핑 프로세스에서 차등적인 압력을 유발하는 유체 밀봉부를 생성하기 위해) 특정 치수 (예를 들어, 반경)를 가질 것을 요구할 수 있다. 일부 실시양태에서, 롤러에 대해 치수적으로 비민감한 채널의 포함은 하드웨어 성분의 보다 간단하고 덜 비싼 제작 및 증가된 구성성/유연성을 발생시킬 수 있다.
샘플 제조 장치는 수용된 유체 장치에서 (예를 들어, 유체 장치의 채널/저장소 내에 또는 유체 장치 내로 및/또는 그로부터) 성분 (예를 들어, 시약, 샘플)을 수송하도록 구성된 펌프를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 12b를 언급하면, 샘플 제조 장치 (300)는 용해 카트리지 (301), 풍부화 카트리지 (302), 단편화 카트리지 (303), 및/또는 관능화 카트리지 (304) 중 하나 이상에서 성분을 수송하도록 구성된 펌프 (305)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펌프는 기구 및 수용된 카트리지를 포함하고, 펌프의 기구 및 카트리지 사이의 상호작용은 유체 유동을 유발한다. 예를 들어, 펌프 (305)는 연동 펌프일 수 있고, 기구 (306)는 카트리지에서 유체 운동을 유발하도록 카트리지 (예를 들어, 카트리지 (301))에 작동적으로 커플링될 수 있다 (예를 들어, 기구 (306)가 롤러를 포함하고, 카트리지 (301)가 롤러에 의해 변형가능한 가요성 표면 (예를 들어, 엘라스토머 표면)을 포함하는 경우).
특정 측면에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)는 표면 층 (예를 들어, 평평한 표면 층)을 포함한다. 한 예시적인 측면은 v-홈 위에 엘라스토머 (예를 들어, 실리콘)를 포함하는 (예를 들어, 이로 본질적으로 이루어진) 막 (또한 본원에서 표면 층으로 지칭됨)을 층상화하여, 사실상, 가요성 튜브의 절반을 생성하는 것을 수반하는 잠재적으로 유리한 실시양태에 관한 것이다. 이어서, 일부 실시양태에서, 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 채널로 변형시켜 핀치를 형성함으로써, 및 이어서 핀치를 변환함으로써, 음성 압력은 석션을 생성하는 핀치의 트레일링 연부 상에 생성될 수 있고, 양성 압력은 핀치의 리딩 연부 상에 생성되어, 핀치의 리딩 연부의 방향으로 유체를 펌핑할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이는 유체 장치, 예컨대 카트리지 (표면 층을 갖는 채널을 포함함)를 롤러를 포함하는 기구와 접속함으로써 펌핑하며, 기구는 롤러를 표면 층의 부분과 결속시켜 표면 층의 부분을 연관된 채널의 벽 및/또는 베이스와 핀칭하고/거나, 롤링 운동에서 롤러를 연관된 채널의 벽 및/또는 베이스를 따라 변환하여 표면 층의 핀치를 벽 및/또는 베이스에 대해 변환하고/거나, 롤러를 표면 층의 제2 부분과 이탈시키는 것을 포함하는 롤러의 운동을 수행하도록 구성된다. 특정 실시양태에서, 크랭크-및-로커 메커니즘은 롤러의 이 운동을 수행하는 기구 내로 혼입된다.
통상적인 연동 펌프는 일반적으로 배관이 펌프가 기능할 때 기구의 나머지와 항상 결속되도록, 회전 캐리지 상의 롤러를 포함하는 기구 내로 삽입된 배관을 수반한다. 대조적으로, 특정 실시양태에서, 본원에서 유체 장치 (예를 들어 카트리지)에서의 채널은 롤러가 수평 표면과 결속하도록 선형이거나 적어도 하나의 선형 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 롤러는 롤러가 표면 층의 부분을 연속적으로 핀칭하면서 수평 표면을 추적할 수 있도록 스프링-로딩된 작은 롤러 아암에 연결된다. 기구 (예를 들어, 기구의 롤러 아암)를 스프링 로딩하는 것은 일부 경우에 기구 (예를 들어, 롤러)에 의해 표면 층 및 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 채널에 적용되는 힘을 조절하는 것을 도울 수 있다.
특정 실시양태에서, 롤러에 연결된 크랭크-및-로커 메커니즘에서 크랭크의 각각의 회전은 별개의 펌핑 부피를 제공한다. 특정 실시양태에서, 기구를 이탈된 위치에 파킹하는 것은 간단하며, 여기서 롤러는 임의의 유체 장치 (예를 들어 카트리지)로부터 이탈된다. 특정 실시양태에서, 전방 및 후방 펌핑 운동은 유사한 양의 힘 (토크) (예를 들어, 10% 내)이 전방 및 후방 펌핑 운동에 요구되도록, 본원에 기재된 기구에 의해 제공된 바와 같이 상당히 대칭적이다.
특정 실시양태에서, 기구의 특정 크기에 대해, 상대적으로 높은 크랭크 반경 (예를 들어, 2 mm 이상, 임의로 연관된 연결을 포함함)을 갖는 것이 유리할 수 있다. 결과적으로, 특정 실시양태에서, 연관된 유체 장치 (예를 들어 카트리지)와 결속하는 상대적으로 높은 스트로크 길이 (예를 들어, 10 mm 이상)를 갖는 것이 또한 유리할 수 있다. 상대적으로 높은 크랭크 반경 및 스트로크 길이를 갖는 것은 특정 실시양태에서, 유체 장치에 대해 기구의 성분을 이동시키는 경우, 기구 및 유체 장치 사이의 기계적 간섭이 없는 것을 보장한다.
특정 실시양태에서, v-형상 홈을 갖는 것은 유리하게는 쐐기-형상 연부를 갖는 다양한 크기의 롤러로의 이용을 허용한다. 대조적으로, 예를 들어, v-홈이라기 보다는 직사각형 채널을 갖는 것은 직사각형 채널과 연관된 롤러의 폭이 직사각형 채널의 폭에 관하여 보다 제어되고 정확할 것을 필요로 하게 하고, 직사각형 채널에 적용되는 힘이 보다 정확할 필요가 있게 한다. 유사하게, 반원형 횡단면을 갖는 채널(들)은 또한 연관된 롤러의 폭에 대한 보다 제어되고 정확한 치수를 요구할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 기구는 기구의 적어도 부분을 복수의 차원 (예를 들어, 2차원, 3차원)으로 이동시키도록 구성된 다중-축 시스템 (예를 들어, 로봇)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다중-축 시스템은 기구의 적어도 부분을 연관된 유체 장치(들) 중에서 임의의 펌핑 레인 위치로 이동시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원의 캐리지는 다중-축 시스템에 기능적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 롤러는 다중-축 시스템에 간접적으로 기능적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 롤러에 연결된 크랭크-및-로커 메커니즘을 포함하는 기구 부분은 다중-축 시스템에 기능적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 펌핑 레인은 위치에 의해 어드레스되고, 다중-축 시스템을 사용하여 본원에 기재된 기구에 의해 접근될 수 있다.
특정 실시양태에서, 샘플 제조를 위한 본원에 기재된 시스템은 시스템에 의해 제조된 샘플의 적어도 일부 (예를 들어, 그의 전부)를 분석하기 위한 진단 기기와 유동적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플 (예를 들어 정제된 펩티드 샘플)은 샘플 제조 모듈로부터 진단 기기로 자동으로 수송될 수 있다. 특정 실시양태에서, 진단 기기는 샘플의 기저의 서열에 기반한 밴드 또는 색상의 존재 또는 부재에 기반하여 출력을 생성한다. 성분 (예를 들어, 모듈, 장치)이 연결되는 (예를 들어, 기능적으로 연결되는) 것으로 기재되는 경우, 연결은 영구적으로 연결될 수 있거나, 연결은 가역적으로 연결될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 경우에, 연결되는 것으로 기재된 성분은 이들이 제1 기간 동안 연결될 수 있지만 (예를 들어, 채널, 튜브, 도관을 통해, 예를 들어, 유체 연결로), 이어서 제2 기간 동안, 이들은 연결되지 않을 수 있다는 (예를 들어, 유체 연결을 디커플링함으로써) 점에서, 디커플링가능하게 연결된다. 일부 이러한 실시양태에서, 가역적/디커플링가능한 연결은 수행되는 샘플 제조/ 분석/ 시퀀싱/ 확인의 유형에 따라, 특정 성분이 대체되거나 재구성될 수 있는 모듈식 시스템을 제공할 수 있다.
본 개시내용의 측면은 또한 단백질 시퀀싱 및 확인의 방법, 단백질 시퀀싱 및 확인의 방법, 아미노산 확인의 방법, 및 이러한 방법을 수행하기 위한 조성물, 시스템, 및 장치를 수반한다. 일부 측면에서, 표적 단백질의 서열을 결정하는 방법이 기재된다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 표적 단백질의 서열을 결정하기 전에 풍부화된다 (예를 들어, 전기영동적 방법, 예를 들어, 친화성 SCODA를 사용하여 풍부화됨). 일부 측면에서, 샘플 (예를 들어, 정제된 샘플, 세포 용해물, 단일-세포, 세포의 집단, 또는 조직)에 존재하는 복수의 단백질 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 50개, 또는 그 초과)의 서열을 결정하는 방법이 기재된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 샘플에 존재하는 표적 단백질 또는 복수의 단백질의 서열을 결정하기 전에 본원에 기재된 바와 같이 제조된다 (예를 들어, 소화되고/거나, 용해되고/거나, 정제되고/거나, 단편화되고/거나 표적 단백질에 대해 풍부화됨). 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 풍부화된 표적 단백질이다 (예를 들어, 전기영동적 방법, 예를 들어, 친화성 SCODA를 사용하여 풍부화됨).
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 혼합물로부터 단백질의 아미노산의 하나 이상의 유형을 확인함으로써 복수의 단백질을 포함하는 샘플에서 개별적 단백질을 시퀀싱하고/거나 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단백질의 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 말단 아미노산)은 표지되고 (예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어 결합제를 사용하여), 단백질에서의 표지된 아미노산의 상대 위치가 결정된다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 아미노산의 상대 위치는 일련의 아미노산 표지화 및 절단 단계를 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 단백질에서의 표지된 아미노산의 상대 위치는 표지된 단백질을 공극 (예를 들어, 단백질 채널)을 통해 전위시키고, 단백질 분자에서의 표지된 아미노산의 상대 위치를 결정하기 위해 공극을 통한 전위 동안 표지된 아미노산(들)으로부터 신호 (예를 들어, 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달 (FRET) 신호)를 검출함으로써 단백질로부터 아미노산을 제거하지 않고 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 아미노산)의 신원은 말단 아미노산이 제거되고, 말단 단부에서의 다음 아미노산의 신원이 평가되기 전에 결정되며; 이 프로세스는 단백질에서의 복수의 연속적 아미노산이 평가될 때까지 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 신원을 평가하는 것은 존재하는 아미노산의 유형을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 실제 아미노산 신원을 결정하는 것 (예를 들어, 예를 들어 개별적 말단 아미노산에 대해 특이적인 결합제를 사용하여 천연-발생 20종의 아미노산 중, 어느 아미노산인지를 결정하는 것)을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 신원을 평가하는 것은 단백질의 말단에 존재할 수 있는 잠재적 아미노산의 하위세트를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산이 하나 이상의 특이적 아미노산이 아님 (즉, 및 따라서 임의의 다른 아미노산일 수 있음)을 결정함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산의 특정된 하위세트 중 어느 것이 (예를 들어, 크기, 전하, 소수성, 결합 특성에 기반하여) 단백질의 말단에 있을 수 있는지 (예를 들어, 2개 이상의 말단 아미노산의 특정된 하위세트에 결합하는 결합제를 사용하여) 결정함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단백질은 복수의 보다 작은 단백질로 소화될 수 있고, 서열 정보는 상기 기재된 바와 같이 이들 보다 작은 단백질 중 하나 이상으로부터 얻어질 수 있다 (예를 들어, 단백질의 말단 아미노산을 순차적으로 평가하고, 그 아미노산을 제거하여 다음 아미노산을 말단에 노출시키는 것을 수반하는 방법을 사용하여).
일부 실시양태에서, 단백질은 그의 아미노 (N) 말단으로부터 시퀀싱된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 그의 카르복시 (C) 말단으로부터 시퀀싱된다. 일부 실시양태에서, 단백질의 제1 말단 (예를 들어, N 또는 C 말단)은 고정화되고, 다른 말단 (예를 들어, C 또는 N 말단)은 본원에 기재된 바와 같이 시퀀싱된다.
본원에 사용된 단백질을 시퀀싱하는 것은 단백질에 대한 서열 정보를 결정하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이는 단백질의 부분 (또는 전부)에 대한 각각의 순차적 아미노산의 신원을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 단편 (예를 들어, 표적 단백질의 단편 또는 복수의 단백질을 포함하는 샘플의 단편)의 신원을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 단백질 내의 아미노산의 하위세트의 신원을 평가하는 것 및 단백질에서의 각각의 아미노산의 신원을 결정하지 않으면서 하나 이상의 아미노산 유형의 상대 위치를 결정하는 것)을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서 아미노산 함량 정보는 단백질에서의 아미노산의 상이한 유형의 상대 위치를 직접적으로 결정하지 않으면서 단백질로부터 얻어질 수 있다. 아미노산 함량 단독은 존재하는 단백질의 신원을 추론하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 아미노산 함량을 단백질 정보의 데이터베이스와 비교하고, 어느 단백질(들)이 동일한 아미노산 함량을 갖는지를 결정함으로써).
일부 실시양태에서, (예를 들어, 효소적 및/또는 화학적 절단을 통해) 표적 단백질 또는 복수의 단백질을 포함하는 샘플로부터 수득된 복수의 단백질 단편에 대한 서열 정보는 샘플에 존재하는 표적 단백질 또는 복수의 단백질의 서열을 재구축하거나 추론하기 위해 분석될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 아미노산의 하나 이상의 유형은 아미노산의 하나 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 표지된 친화성 시약의 발광을 검출함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 하나 이상의 유형은 표지된 단백질의 발광을 검출함으로써 확인된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질의 말단에 존재하는 일련의 아미노산을 시간 경과에 따라 확인함으로써 (예를 들어, 말단에서의 아미노산의 반복적 검출 및 절단에 의해) 단백질을 시퀀싱하기 위한 조성물, 장치, 및 방법을 제공한다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질의 표지된 아미노 함량을 확인하고, 참조 서열 데이터베이스와 비교함으로써 단백질을 시퀀싱하기 위한 조성물, 장치, 및 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질의 복수의 단편을 시퀀싱함으로써 단백질을 시퀀싱하기 위한 조성물, 장치, 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단백질을 시퀀싱하는 것은 복수의 단백질 단편에 대한 서열 정보를 조합하여 단백질에 대한 서열을 확인하고/거나 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 정보를 조합하는 것은 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 관련된 단백질의 세트, 예컨대 유기체의 전체 프로테옴이 시퀀싱되는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 시퀀싱 반응은 본 개시내용의 측면에 따라 병렬로 (예를 들어, 단일 칩 또는 카트리지 상에서) 수행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 시퀀싱 반응은 단일 칩 또는 카트리지 상의 별개의 샘플 웰에서 각각 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 복수의 단백질을 포함하는 샘플에서 개별적 단백질의 시퀀싱 및 확인에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 복수의 단백질을 포함하는 샘플에서 개별적 단백질을 고유하게 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개별적 단백질은 단백질의 부분적 아미노산 서열을 결정함으로써 혼합된 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 단백질의 부분적 아미노산 서열은 대략 5 내지 50, 10 내지 50, 25 내지 50, 25 내지 100, 또는 50 내지 100개의 아미노산의 인접한 스트레치 내이다.
임의의 특정 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 대부분의 인간 단백질은 프로테오믹 데이터베이스를 참고로 불완전한 서열 정보를 사용하여 확인될 수 있는 것으로 예상된다. 예를 들어, 인간 프로테옴의 간단한 모델링은 단백질의 대략 98%가 6 내지 40개의 아미노산의 스트레치 내에서 아미노산의 단지 4개의 유형을 검출함으로써 고유하게 확인될 수 있음을 보였다 (예를 들어, 문헌 [Swaminathan, et al. PLoS Comput Biol. 2015, 11(2):e1004080]; 및 [Yao, et al. Phys. Biol. 2015, 12(5):055003] 참조). 따라서, 복수의 단백질을 포함하는 샘플은 대략 6 내지 40개의 아미노산의 짧은 단백질 단편으로 단편화될 (예를 들어, 화학적으로 분해될, 효소적으로 분해될) 수 있고, 이 단백질-기반 라이브러리의 시퀀싱은 원래 샘플에 존재하는 단백질의 각각의 신원 및 풍부도를 밝힐 것이다. 선택적 아미노산 표지화 및 부분적 서열 정보를 결정함으로써 단백질을 확인하기 위한 조성물 및 방법은 발명의 명칭이 "단일 분자 펩티드 시퀀싱"인 2015년 9월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/510,962에 상세하게 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용에 따른 시퀀싱은 일부 측면에서, 기재의 (예를 들어, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 시퀀싱 장치 또는 모듈에서 고체 지지체, 예를 들어 칩 또는 카트리지의) 표면 상에 단백질 (예를 들어, 표적 단백질)을 고정화하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 기재 상의 샘플 웰의 표면 상에 (예를 들어, 샘플 웰의 바닥 표면 상에) 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질의 N-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착됨). 일부 실시양태에서, 단백질의 C-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착됨). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착됨). 고정화된 아미노산(들)은 예를 들어 본 개시내용에 기재된 바와 같이 임의의 적합한 공유 또는 비-공유 연결을 사용하여 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 단백질은 예를 들어 기재 상의 샘플 웰의 어레이에서 복수의 샘플 웰 (예를 들어, 각각의 샘플 웰의 표면, 예를 들어 바닥 표면에 부착된 하나의 단백질을 가짐)에 부착된다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 아미노산)의 신원이 결정되고, 이어서 말단 아미노산이 제거되고, 말단 단부에서의 다음 아미노산의 신원이 결정된다. 이 프로세스는 단백질에서 복수의 연속적 아미노산이 결정될 때까지 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 신원을 결정하는 것은 존재하는 아미노산의 유형을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 예를 들어 천연-발생 20종의 아미노산 중 어느 것이 말단 아미노산인지 (예를 들어, 개별적 말단 아미노산에 대해 특이적인 결합제를 사용하여) 결정함으로써 실제 아미노산 신원을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 신원을 결정하는 것은 단백질의 말단에 존재할 수 있는 잠재적 아미노산의 하위세트를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산이 하나 이상의 특이적 아미노산이 아님 (및 따라서 임의의 다른 아미노산일 수 있음)을 결정함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산의 특정된 하위세트 중 어느 것이 (예를 들어, 크기, 전하, 소수성, 번역후 변형, 결합 특성에 기반하여) 단백질의 말단에 있을 수 있는지 (예를 들어, 2개 이상의 말단 아미노산의 특정된 하위세트에 결합하는 결합제를 사용하여) 결정함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 신원을 평가하는 것은 아미노산이 번역후 변형을 포함하는 것을 결정하는 것을 포함한다. 번역후 변형의 비-제한적 예는 아세틸화, ADP-리보실화, 카스파제 절단, 시트룰린화, 포르밀화, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 네딜화, 질화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 프레닐화, S-니트로실화, 황산화, 수모일화, 및 유비퀴틴화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 단백질은 복수의 보다 작은 단백질로 소화될 수 있고, 서열 정보는 이들 보다 작은 단백질 중 하나 이상으로부터 얻어질 수 있다 (예를 들어, 단백질의 말단 아미노산을 순차적으로 평가하고, 그 아미노산을 제거하여 다음 아미노산을 말단에 노출시키는 것을 수반하는 방법을 사용하여).
일부 실시양태에서, 단백질 분자의 시퀀싱은 단백질 분자에서 적어도 2개의 (예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100개, 또는 그 초과의) 아미노산을 확인하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산은 인접한 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산은 비-인접한 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 단백질 분자의 시퀀싱은 단백질 분자에서 모든 아미노산의 100% 미만 (예를 들어, 99% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 그 미만)의 확인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질 분자의 시퀀싱은 단백질 분자에서 아미노산의 하나의 유형의 100% 미만의 확인 (예를 들어, 단백질 분자에서 하나의 유형의 모든 아미노산의 부분의 확인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 분자의 시퀀싱은 단백질 분자에서 아미노산의 각각의 유형의 100% 미만의 확인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 분자의 시퀀싱은 단백질에서 아미노산의 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100개 또는 그 초과의 유형의 확인을 포함한다.
반복적 말단 아미노산 검출 및 절단에 의한 단백질 시퀀싱의 비-제한적 예는 도 13a에 도시된다. 일부 실시양태에서, 단백질 시퀀싱은 연결 기 (1002)를 통해 고체 지지체의 표면 (1004)에 고정화된 (예를 들어, 샘플 웰의 바닥 또는 측벽 표면에 부착된) 단백질 (1000)을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결 기 (1002)는 단백질 (1000)의 관능화된 말단 단부 및 표면 (1004)의 상보적 관능성 모이어티 사이의 공유 또는 비-공유 연결에 의해 형성된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 연결 기 (1002)는 단백질 (1000)의 비오틴 모이어티 (예를 들어, 본 개시내용에 따라 관능화됨) 및 표면 (1004)의 아비딘 단백질 사이의 비-공유 연결에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 연결 기 (1002)는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 (1000)은 다른 말단 단부가 시퀀싱 반응에서 말단 아미노산의 검출 및 절단을 위해 자유롭도록 하나의 말단 단부에서 관능화 모이어티를 통해 표면 (1004)에 고정화된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 특정 단백질 시퀀싱 반응에 사용되는 시약은 단백질 (1000)의 비-고정화된 (예를 들어, 유리) 말단에서 말단 아미노산과 우선적으로 상호작용한다. 이러한 방식으로, 단백질 (1000)은 검출 및 절단의 반복된 사이클에 걸쳐 고정화되어 잔류한다. 이를 위해, 일부 실시양태에서, 링커 (1002)는 예를 들어, 표면 (1004)으로부터의 단백질 (1000)의 탈착을 제한하기 위해, 검출 및 절단에 사용되는 조건의 목적하는 세트에 따라 디자인될 수 있다. 적합한 링커 조성 및 단백질을 관능화하기 위한 기술 (예를 들어, 단백질을 표면에 고정화하는데 사용될 수 있는)은 본원의 다른 곳에 상세하게 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 도 13a에 나타내어진 바와 같이, 단백질 시퀀싱은 (1) 단백질 (1000)을 말단 아미노산의 하나 이상의 유형과 회합하는 하나 이상의 아미노산 인식 분자와 접촉시킴으로써 진행될 수 있다. 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)는 말단 아미노산과 회합함으로써 단백질 (1000)과 상호작용한다.
일부 실시양태에서, 방법은 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)를 검출함으로써 단백질 (1000)의 아미노산 (말단 아미노산)을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출은 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)로부터의 발광을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발광은 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)와 고유하게 연관되고, 발광은 그에 의해 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)가 선택적으로 결합하는 아미노산의 유형과 연관된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)의 하나 이상의 발광 특성을 결정함으로써 확인된다.
일부 실시양태에서, 단백질 시퀀싱은 (2) 단백질 (1000)을 단백질 (1000)의 말단 아미노산에 결합하고 이를 절단하는 엑소펩티다제 (1008)와 접촉시킴으로써 말단 아미노산을 제거함으로써 진행된다. 엑소펩티다제 (1008)에 의한 말단 아미노산의 제거시, 단백질 시퀀싱은 (3) 단백질 (1000) (n-1개의 아미노산을 가짐)을 말단 아미노산 인식 및 절단의 추가의 사이클로 처리함으로써 진행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (1) 내지 (3)은 예를 들어, 동적 펩티드 시퀀싱 반응에서와 같이 동일한 반응 혼합물에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 단계 (1) 내지 (3)은 관련 기술분야에 공지된 다른 방법, 예컨대 에드만 분해에 의한 펩티드 시퀀싱을 사용하여 수행될 수 있다.
에드만 분해는 단백질의 말단 아미노산을 변형시키고 절단하는 반복된 사이클을 수반하고, 여기서 각각의 연속적으로 절단된 아미노산을 확인하여 단백질의 아미노산 서열을 결정한다. 도 13a를 언급하면, 통상적인 에드만 분해에 의한 펩티드 시퀀싱은 (1) 단백질 (1000)을 말단 아미노산의 하나 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 아미노산 인식 분자와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (1)은 단백질 (1000)에 선택적으로 결합하지 않는 임의의 하나 이상의 표지된 아미노산 인식 분자를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (2)는 말단 아미노산을 이소티오시아네이트 (예를 들어, PITC)와 접촉시켜 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산을 형성함으로써 단백질 (1000)의 말단 아미노산 (예를 들어, 유리 말단 아미노산)을 변형시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산은 비변형된 말단 아미노산보다 절단 시약 (예를 들어, 화학적 또는 효소적 절단 시약)에 의한 제거에 더 감수성이다.
일부 실시양태에서, 에드만 분해는 (2) 단백질 (1000)을 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는 엑소펩티다제 (1008)와 접촉시킴으로써 말단 아미노산을 제거함으로써 진행된다. 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제 (1008)는 변형된 시스테인 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제 (1008)는 변형된 시스테인 프로테아제, 예컨대 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터의 시스테인 프로테아제를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Borgo, et al. (2015) Protein Science 24:571-579] 참조). 추가의 다른 실시양태에서, 단계 (2)는 단백질 (1000)을 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산을 절단하는데 충분한 화학적 (예를 들어, 산성, 염기성) 조건으로 처리함으로써 말단 아미노산을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에드만 분해는 (3) 말단 아미노산 절단 후 단백질 (1000)을 세척함으로써 진행된다. 일부 실시양태에서, 세척은 엑소펩티다제 (1008)를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척은 단백질 (1000)을 중성 pH 조건으로 복원하는 것을 포함한다 (예를 들어, 산성 또는 염기성 조건에 의한 화학적 절단 후). 일부 실시양태에서, 에드만 분해에 의한 시퀀싱은 단계 (1) 내지 (3)을 복수의 사이클 동안 반복하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩티드 시퀀싱은 동적 펩티드 시퀀싱 반응에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 13a를 다시 언급하면, 단계 (1) 및 단계 (2)를 수행하는데 필요한 시약은 단일 반응 혼합물 내에서 배합된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단계 (1) 및 (2)는 하나의 반응 혼합물을 또 다른 것에 대해 교환하지 않고 및 통상적인 에드만 분해에서와 같은 세척 단계 없이 일어날 수 있다. 따라서, 이 실시양태에서, 단일 반응 혼합물은 표지된 아미노산 인식 분자 (1006) 및 엑소펩티다제 (1008)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제 (1008)는 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)의 그것 미만인 농도로 혼합물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제 (1008)는 표지된 아미노산 인식 분자 (1006)의 그것 미만인 결합 친화도로 단백질 (1000)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 동적 단백질 시퀀싱은 말단 아미노산과 표지된 아미노산 인식 분자 및 절단 시약 (예를 들어, 엑소펩티다제)의 결합 상호작용을 평가함으로써 실시간으로 수행된다. 도 13b는 별개의 결합 사건이 신호 출력의 신호 펄스를 발생시키는 시퀀싱의 방법의 예를 나타낸다. 도 13b의 삽도 패널 (좌측)은 이 접근법에 의한 실시간 시퀀싱의 일반적 스킴을 예시한다. 나타내어진 바와 같이, 표지된 아미노산 인식 분자는 말단 아미노산 (여기서 페닐알라닌으로 나타내어짐)과 회합하고 (예를 들어, 그에 결합하고), 그로부터 해리하며, 이는 말단 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 신호 출력의 일련의 펄스를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 일련의 펄스는 상응하는 말단 아미노산의 신원을 진단할 수 있는 펄싱 패턴 (예를 들어, 특징적 패턴)을 제공한다.
도 13b의 삽도 패널 (좌측)에 추가로 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 엑소펩티다제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제는 표지된 아미노산 인식 분자의 그것 미만인 농도로 혼합물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제는 그것이 말단 아미노산의 대부분의 또는 모든 유형을 절단하도록 폭넓은 특이성을 나타낸다. 따라서, 동적 시퀀싱 접근법은 엑소펩티다제 절단 활성에 의해 촉매되는 분해 반응의 과정에 걸쳐 단백질의 말단에서 인식 분자 결합을 모니터링하는 것을 수반할 수 있다.
도 13b는 시간 경과에 따른 신호 출력 강도의 진행을 추가로 나타낸다 (우측 패널). 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제(들)에 의한 말단 아미노산 절단은 표지된 아미노산 인식 분자의 결합 펄스보다 더 낮은 빈도로 일어난다. 이러한 방식으로, 단백질의 아미노산은 실시간 시퀀싱 프로세스에서 카운팅되고/거나 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자의 하나의 유형은 아미노산의 하나 초과의 유형과 회합될 수 있고, 여기서 상이한 특징적 패턴은 표지된 아미노산 인식 분자의 하나의 유형과 말단 아미노산의 상이한 유형의 회합에 상응한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상이한 특징적 패턴 (페닐알라닌 (F, Phe), 트립토판 (W, Trp), 및 티로신 (Y, Tyr)의 각각에 의해 예시된 바와 같음)은 분해의 과정에 걸친 표지된 아미노산 인식 분자 (예를 들어, ClpS 단백질)의 하나의 유형과 말단 아미노산의 상이한 유형의 회합에 상응한다. 일부 실시양태에서, 각각 아미노산의 상이한 하위세트와 회합할 수 있는 복수의 표지된 아미노산 인식 분자가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 동적 펩티드 시퀀싱은 상이한 회합 사건, 예를 들어, 아미노산 인식 분자 및 펩티드의 말단 단부에서의 아미노산 사이의 회합 사건을 관찰함으로써 수행되고, 여기서 각각의 회합 사건은 시간의 지속기간 동안 존속하는 신호, 예를 들어, 발광 신호의 규모의 변화를 생성한다. 일부 실시양태에서, 상이한 회합 사건, 예를 들어, 아미노산 인식 분자 및 펩티드의 말단 단부에서의 아미노산 사이의 회합 사건을 관찰하는 것은 펩티드 분해 프로세스 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 특징적 신호 패턴으로부터 또 다른 것으로의 전이는 아미노산 절단 (예를 들어, 펩티드 분해로부터 초래된 아미노산 절단)을 지시한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 단백질의 말단으로부터의 적어도 하나의 아미노산의 제거 (예를 들어, 단백질로부터의 적어도 하나의 말단 아미노산의 제거)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 특징적 신호 패턴 사이의 시간 지속기간에 기반한 추론에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 표지된 절단 시약과 단백질의 말단에서의 아미노산의 회합에 의해 생성된 신호의 변화를 검출함으로써 결정된다. 아미노산은 분해 동안 단백질의 말단으로부터 순차적으로 절단되기 때문에, 일련의 규모의 변화, 또는 일련의 신호 펄스가 검출된다.
일부 실시양태에서, 신호 펄스 정보는 일련의 신호 펄스에서의 특징적 패턴에 기반하여 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특징적 패턴은 복수의 신호 펄스를 포함하며, 각각의 신호 펄스는 펄스 지속기간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 신호 펄스는 특징적 패턴에서의 펄스 지속기간의 분포의 요약 통계 (예를 들어, 평균, 중위, 시간 분해 상수)를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특징적 패턴의 평균 펄스 지속기간은 약 1 밀리초 내지 약 10초 (예를 들어, 약 1 ms 내지 약 1 s, 약 1 ms 내지 약 100 ms, 약 1 ms 내지 약 10 ms, 약 10 ms 내지 약 10 s, 약 100 ms 내지 약 10 s, 약 1 s 내지 약 10 s, 약 10 ms 내지 약 100 ms, 또는 약 100 ms 내지 약 500 ms)이다. 일부 실시양태에서, 단일 단백질에서의 아미노산의 상이한 유형에 상응하는 상이한 특징적 패턴은 요약 통계의 통계적으로 유의한 차이에 기반하여 서로로부터 구별될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 하나의 특징적 패턴은 적어도 10 밀리초 (예를 들어, 약 10 ms 내지 약 10 s, 약 10 ms 내지 약 1 s, 약 10 ms 내지 약 100 ms, 약 100 ms 내지 약 10 s, 약 1 s 내지 약 10 s, 또는 약 100 ms 내지 약 1 s)의 평균 펄스 지속기간의 차이에 기반하여 또 다른 특징적 패턴으로부터 구별가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 특징적 패턴 사이의 평균 펄스 지속기간의 보다 작은 차이는 통계적 신뢰성으로 하나를 또 다른 것으로부터 구별하기 위해 각각의 특징적 패턴 내에서 펄스 지속기간의 보다 큰 수를 요구할 수 있음이 인정되어야 한다.
본 개시내용에 따른 단백질의 시퀀싱은 일부 측면에서, 단일 분자 분석을 수행하는 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 시스템은 시퀀싱 모듈 또는 장치 및 시퀀싱 장치와 접속하도록 구성된 기기를 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 검출 모듈 (1800)은 이러한 시퀀싱 모듈 또는 장치를 포함한다. 시퀀싱 모듈 또는 장치는 픽셀의 어레이를 포함할 수 있고, 여기서 개별적 픽셀은 샘플 웰 및 적어도 하나의 광검출기를 포함한다. 시퀀싱 장치의 샘플 웰은 시퀀싱 장치의 표면 상에 또는 이를 통해 형성되고, 시퀀싱 장치의 표면 상에 정치된 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 장치 내로 삽입될 수 있는 카트리지 (예를 들어, 일회용 또는 단일-사용 카트리지)의 성분이다. 집합적으로, 샘플 웰은 샘플 웰의 어레이로 간주될 수 있다. 복수의 샘플 웰은 샘플 웰의 적어도 부분이 단일 표적 분자 또는 복수의 분자 (예를 들어, 표적 단백질)를 포함하는 샘플을 수용하도록 적합한 크기 및 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 내의 분자의 수는 일부 샘플 웰은 1개의 분자 (예를 들어, 표적 단백질)를 함유하는 반면, 다른 것들은 0, 2개, 또는 복수의 분자를 함유하도록 시퀀싱 장치의 샘플 웰 중에서 분포될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱 모듈 또는 장치는 샘플 제조 장치로부터 표적 분자 또는 복수의 분자 (예를 들어, 표적 단백질)를 포함하는 샘플을 수용하도록 위치된다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 장치는 샘플 제조 장치에 직접적으로 (예를 들어, 그에 물리적으로 부착됨) 또는 간접적으로 연결된다. 그러나, 샘플 제조 장치 및 시퀀싱 장치 또는 모듈 (또는 임의의 다른 유형의 검출 모듈) 사이의 연결은 모든 실시양태에 대해 필수적이지는 않다. 일부 실시양태에서, 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질) 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플은 샘플 제조 장치 (예를 들어, 샘플 제조 모듈)로부터 시퀀싱 모듈 또는 장치로 직접적으로 (예를 들어, 표적 분자 또는 샘플의 조성을 변화시키는 임의의 개재하는 단계 없이) 또는 간접적으로 (예를 들어, 표적 분자 또는 샘플의 조성을 변화시킬 수 있는 하나 이상의 추가의 프로세싱 단계를 수반함) 수동으로 수송된다. 수동 수송은 예를 들어, 수동 피펫팅 또는 관련 기술분야에 공지된 적합한 수동 기술을 통한 수송을 수반할 수 있다.
여기 광은 시퀀싱 장치의 외부의 하나 이상의 광원으로부터 시퀀싱 장치에 제공된다. 시퀀싱 장치의 광학 성분은 광원으로부터 여기 광을 수용하고, 시퀀싱 장치의 샘플 웰의 어레이를 향해 광을 지향시키고, 샘플 웰 내의 조명 영역을 조명할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플이 샘플 웰의 표면에 근접하여 보유되는 것을 허용하는 구성을 가질 수 있으며, 이는 샘플 웰로의 여기 광의 전달 및 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플로부터의 방출 광의 검출을 용이하게 할 수 있다. 조명 영역 내에 위치된 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플은 여기 광에 의해 조명되는 것에 반응하여 방출 광을 방출할 수 있다. 예를 들어, 단백질 (또는 그의 복수)은 여기 광의 조명을 통해 여기된 상태를 달성하는 것에 반응하여 광을 방출하는 형광 마커로 표지될 수 있다. 이어서 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플에 의해 방출된 방출 광은 분석되는 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플을 갖는 샘플 웰에 상응하는 픽셀 내의 하나 이상의 광검출기에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면 수에 있어서 대략 10,000개의 픽셀 내지 1,000,000개의 픽셀의 범위일 수 있는 샘플 웰의 어레이에 걸쳐 수행되는 경우, 다수의 샘플 웰은 병렬로 분석될 수 있다.
시퀀싱 모듈 또는 장치는 여기 광을 수용하고, 여기 광을 샘플 웰 어레이 중에 지향시키기 위한 광학 시스템을 포함할 수 있다. 광학 시스템은 여기 광을 시퀀싱 장치에 커플링시키고, 여기 광을 다른 광학 성분에 지향시키도록 구성된 하나 이상의 격자 커플러를 포함할 수 있다. 광학 시스템은 격자 커플러로부터의 여기 광을 샘플 웰 어레이를 향해 지향시키는 광학 성분을 포함할 수 있다. 이러한 광학 성분은 광학 스플리터, 광학 컴바이너, 및 도파관을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 광학 스플리터는 격자 커플러로부터의 여기 광을 커플링시키고, 여기 광을 도파관 중 적어도 하나에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 광학 스플리터는 도파관의 각각이 실질적으로 유사한 양의 여기 광을 수용하도록 여기 광의 전달이 모든 도파관에 걸쳐 실질적으로 균일한 것을 허용하는 구성을 가질 수 있다. 이러한 실시양태는 시퀀싱 장치의 샘플 웰에 의해 수용되는 여기 광의 균일성을 개선시킴으로써 시퀀싱 장치의 성능을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱 장치에 포함되는, 여기 광을 샘플 웰에 커플링시키고/거나 방출 광을 광검출기에 지향시키기 위한 적합한 성분의 예는 발명의 명칭이 "분자를 탐색, 검출 및 분석하기 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,688, 및 발명의 명칭이 "분자를 탐색, 검출 및 분석하기 위한 외부 광원을 갖는 통합 장치"인 2014년 11월 17일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/543,865에 기재되어 있으며, 이의 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 시퀀싱 장치에서 실행될 수 있는 적합한 격자 커플러 및 도파관의 예는 발명의 명칭이 "광학 커플러 및 도파관 시스템"인 2017년 12월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/844,403에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가의 광자 구조는 샘플 웰 및 광검출기 사이에 위치되고, 여기 광이 광검출기에 도달하는 것을 감소시키거나 방지하도록 구성될 수 있으며, 이는 그렇지 않다면 방출 광을 검출하는데 있어서 신호 잡음에 기여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 장치에 대한 회로로서 작용할 수 있는 금속 층은 또한 공간 필터로서 작용할 수 있다. 적합한 광자 구조의 예는 스펙트럼 필터, 편광 필터, 및 공간 필터를 포함할 수 있고, 발명의 명칭이 "광학 거부 광자 구조"인 2018년 7월 23일에 출원된 미국 특허 출원 번호 16/042,968에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
시퀀싱 모듈 또는 장치로부터 위치한 성분은 여기원을 시퀀싱 장치에 위치시키고 정렬하는데 사용될 수 있다. 이러한 성분은 렌즈, 거울, 프리즘, 윈도우, 조리개, 감쇠기, 및/또는 광학 섬유를 포함하는 광학 성분을 포함할 수 있다. 하나 이상의 정렬 성분의 제어를 허용하는 추가의 기계적 성분은 기기에 포함될 수 있다. 이러한 기계적 성분은 작동기, 스텝퍼 모터, 및/또는 손잡이를 포함할 수 있다. 적합한 여기원 및 정렬 메커니즘의 예는 발명의 명칭이 "펄스화된 레이저 및 시스템"인 2016년 5월 20일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/161,088에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 빔-스티어링 모듈의 또 다른 예는 발명의 명칭이 "콤팩트 빔 쉐이핑 및 스티어링 어셈블리"인 2017년 12월 14일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/842,720에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 적합한 여기원의 추가의 예는 발명의 명칭이 "분자를 탐색, 검출 및 분석하기 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,688에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
시퀀싱 모듈 또는 장치의 개별적 픽셀과 함께 위치된 광검출기(들)는 픽셀의 상응하는 샘플 웰로부터 방출 광을 검출하도록 구성되고 위치될 수 있다. 적합한 광검출기의 예는 발명의 명칭이 "수용된 광자의 시간적 비닝을 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,656에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 및 그의 각각의 광검출기(들)는 공통 축을 따라 정렬될 수 있다. 이 방식으로, 광검출기(들)는 픽셀 내에서 샘플 웰과 중첩될 수 있다.
검출된 방출 광의 특징은 방출 광과 연관된 마커를 확인하기 위한 지시를 제공할 수 있다. 이러한 특징은 광검출기에 의해 검출된 광자의 도착 시간, 광검출기에 의해 시간 경과에 따라 축적된 광자의 양, 및/또는 2개 이상의 광검출기에 걸친 광자의 분포를 포함하는 임의의 적합한 유형의 특징을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광검출기는 샘플의 방출 광과 연관된 하나 이상의 타이밍 특징 (예를 들어, 발광 수명)의 검출을 허용하는 구성을 가질 수 있다. 광검출기는 여기 광의 펄스가 시퀀싱 장치를 통해 전파된 후에 광자 도착 시간의 분포를 검출할 수 있고, 도착 시간의 분포는 샘플의 방출 광의 타이밍 특징 (예를 들어, 발광 수명에 대한 프록시)의 지시를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 광검출기는 마커에 의해 방출된 방출 광의 확률 (예를 들어, 발광 강도)의 지시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 광검출기는 방출 광의 공간적 분포를 포획하도록 사이징되고 배열될 수 있다. 이어서 하나 이상의 광검출기로부터의 출력 신호는 복수의 마커 중에서로부터 마커를 구별하는데 사용될 수 있고, 여기서 복수의 마커는 샘플 내에서 샘플을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 다수의 여기 에너지에 의해 여기될 수 있고, 다수의 여기 에너지에 반응하여 샘플에 의해 방출된 방출 광 및/또는 방출 광의 타이밍 특징은 복수의 마커로부터 마커를 구별할 수 있다.
작동에 있어서, 샘플 웰 내의 샘플의 병렬 분석은 여기 광을 사용하여 웰 내의 샘플의 일부 또는 전부를 여기시키고, 샘플 방출로부터의 신호를 광검출기로 검출함으로써 수행된다. 샘플로부터의 방출 광은 상응하는 광검출기에 의해 검출되고, 적어도 하나의 전기적 신호로 전환될 수 있다. 전기적 신호는 시퀀싱 장치와 접속된 기기에 연결될 수 있는 시퀀싱 장치의 회로에서의 전도선을 따라 전송될 수 있다. 전기적 신호는 이어서 프로세싱되고/거나 분석될 수 있다. 전기적 신호의 프로세싱 및/또는 분석은 기기 상에 또는 그 외부에 위치한 적합한 컴퓨팅 장치 상에서 일어날 수 있다.
기기는 기기 및/또는 시퀀싱 장치의 작동을 제어하기 위한 사용자 인터페이스를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 기기 내로 정보, 예컨대 기기의 기능을 제어하는데 사용되는 명령 및/또는 설정을 입력하는 것을 허용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 버튼, 스위치, 다이알, 및/또는 음성 명령을 위한 마이크를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 기기 및/또는 시퀀싱 장치의 성능에 대한 피드백, 예컨대 시퀀싱 장치 상의 광검출기로부터의 판독 신호에 의해 얻어진 적절한 정렬 및/또는 정보를 수신하는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 음향 피드백을 제공하는 스피커를 사용하여 피드백을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 사용자에게 시각적 피드백을 제공하기 위한 인디케이터 라이트 및/또는 디스플레이 스크린을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기기 또는 장치는 컴퓨팅 장치와 연결하도록 구성된 컴퓨터 인터페이스를 포함할 수 있다. 컴퓨터 인터페이스는 USB 인터페이스, 파이어와이어(FireWire) 인터페이스, 또는 임의의 다른 적합한 컴퓨터 인터페이스일 수 있다. 컴퓨팅 장치는 임의의 일반용 컴퓨터, 예컨대 랩탑 또는 데스크탑 컴퓨터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 적합한 컴퓨터 인터페이스를 통해 무선 네트워크 상에서 접근가능한 서버 (예를 들어, 클라우드-기반 서버)일 수 있다. 컴퓨터 인터페이스는 기기 및 컴퓨팅 장치 사이의 정보의 통신을 용이하게 할 수 있다. 기기를 제어하고/거나 설정하기 위한 입력 정보는 컴퓨팅 장치에 제공되고, 컴퓨터 인터페이스를 통해 기기에 전송될 수 있다. 기기에 의해 생성된 출력 정보는 컴퓨터 인터페이스를 통해 컴퓨팅 장치에 의해 수신될 수 있다. 출력 정보는 기기의 성능, 시퀀싱 장치의 성능, 및/또는 광검출기의 판독 신호로부터 생성된 데이터에 관한 피드백을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기기는 시퀀싱 장치의 하나 이상의 광검출기로부터 수신된 데이터를 분석하고/거나 제어 신호를 여기원(들)에 전송하도록 구성된 프로세싱 장치를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱 장치는 일반용 프로세서, 및/또는 특수-적응된 프로세서 (예를 들어, 중앙 처리 장치 (CPU), 예컨대 하나 이상의 마이크로프로세서 또는 마이크로컨트롤러 코어, 필드-프로그래밍가능 게이트 어레이 (FPGA), 어플리케이션-특이적 집적 회로 (ASIC), 커스텀 집적 회로, 디지털 신호 프로세서 (DSP), 또는 이들의 조합)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 광검출기로부터의 데이터의 프로세싱은 기기의 프로세싱 장치 및 외부 컴퓨팅 장치 둘 다에 의해 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 외부 컴퓨팅 장치는 생략될 수 있고, 하나 이상의 광검출기로부터의 데이터의 프로세싱은 단지 시퀀싱 장치의 프로세싱 장치에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 발광 방출 특징에 기반하여 표적 분자 또는 복수의 분자를 포함하는 샘플을 분석하도록 구성된 기기는 상이한 발광 분자 사이의 발광 수명 및/또는 강도의 차이, 및/또는 상이한 환경에서의 동일한 발광 분자의 수명 및/또는 강도 사이의 차이를 검출할 수 있다. 본 발명자들은 발광 방출 수명의 차이가 상이한 발광 분자의 존재 또는 부재 사이를 식별하고/거나 발광 분자가 처리되는 상이한 환경 또는 조건 사이를 식별하는데 사용될 수 있음을 인식하고 인정하였다. 일부 경우에, 수명 (예를 들어, 방출 파장이라기 보다는)에 기반하여 발광 분자를 식별하는 것은 시스템의 측면을 단순화할 수 있다. 예로서, 파장-식별 광학장치 (예컨대 파장 필터, 각각의 파장에 대한 전용 검출기, 상이한 파장에서 전용 펄스화된 광원, 및/또는 회절 광학장치)는 수명에 기반하여 발광 분자를 식별하는 경우 수에 있어서 감소되거나 제거될 수 있다. 일부 경우에, 단일 특징적 파장에서 작동하는 단일 펄스화된 광원은 광학 스펙트럼의 동일한 파장 영역 내에서 방출하지만 측정가능하게 상이한 수명을 갖는 상이한 발광 분자를 여기시키는데 사용될 수 있다. 동일한 파장 영역에서 방출하는 상이한 발광 분자를 여기시키고 식별하기 위한, 상이한 파장에서 작동하는 다수의 광원이라기 보다는 단일 펄스화된 광원을 사용하는 분석 시스템은 작동 및 유지가 덜 복잡할 수 있고, 보다 컴팩트할 수 있으며, 보다 낮은 비용으로 제조될 수 있다.
발광 수명 분석에 기반한 분석 시스템은 특정 유익을 가질 수 있지만, 분석 시스템에 의해 얻어지는 정보의 양 및/또는 검출 정확도는 추가의 검출 기술을 허용함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 시스템의 일부 실시양태는 추가적으로 발광 파장 및/또는 발광 강도에 기반하여 샘플의 하나 이상의 특성을 식별하도록 구성될 수 있다. 일부 실행에서, 발광 강도는 추가적으로 또는 대안적으로 상이한 발광 표지 사이에 구별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 발광 표지는 그들의 붕괴 속도가 유사할 수 있다고 하더라도, 유의하게 상이한 강도에서 방출하거나 그들의 여기의 확률의 유의한 차이 (예를 들어, 적어도 약 35%의 차이)를 가질 수 있다. 측정된 여기 광에 대한 비닝된 신호를 참고함으로써, 상이한 발광 표지를 강도 수준에 기반하여 구별하는 것이 가능할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 상이한 발광 수명은 발광 표지의 여기 후 발광 방출 사건을 시간-비닝하도록 구성된 광검출기로 구별될 수 있다. 시간 비닝은 광검출기에 대한 단일 전하-축적 사이클 동안 일어날 수 있다. 전하-축적 사이클은 광-생성된 운반체가 시간-비닝 광검출기의 빈에서 축적되는 판독 사건 사이의 간격이다. 시간-비닝 광검출기의 예는 발명의 명칭이 "수용된 광자의 시간적 비닝을 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,656에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 시간-비닝 광검출기는 광자 흡수/운반체 생성 영역에서 전하 운반체를 생성하고, 전하 운반체를 전하 운반체 저장 영역에서의 전하 운반체 저장 빈에 직접적으로 전달할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 시간-비닝 광검출기는 운반체 활주/포획 영역을 포함하지 않을 수 있다. 이러한 시간-비닝 광검출기는 "직접적 비닝 픽셀"로 지칭될 수 있다. 직접적 비닝 픽셀을 포함하는 시간-비닝 광검출기의 예는 발명의 명칭이 "직접적 비닝 픽셀을 갖는 통합 광검출기"인 2017년 12월 22일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/852,571에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 동일한 유형의 상이한 수의 형광단은 각각의 개별적 분자가 발광 강도에 기반하여 확인될 수 있도록, 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질) 또는 샘플에 존재하는 복수의 분자 (예를 들어, 복수의 단백질)의 상이한 성분에 연결될 수 있다. 예를 들어, 2개의 형광단은 제1 표지된 분자에 연결될 수 있고, 4개 이상의 형광단은 제2 표지된 분자에 연결될 수 있다. 상이한 수의 형광단 때문에, 상이한 분자와 연관된 상이한 여기 및 형광단 방출 확률이 있을 수 있다. 예를 들어, 빈의 겉보기 강도가 제1 표지된 분자에 대해 유의하게 더 높도록, 신호 축적 간격 동안 제2 표지된 분자에 대한 보다 많은 방출 사건이 있을 수 있다.
본 발명자들은 형광단 붕괴 속도 및/또는 형광단 강도에 기반하여 단백질을 구별하는 것이 광학 여기 및 검출 시스템의 단순화를 용이하게 할 수 있음을 인식하고 인정하였다. 예를 들어, 광학 여기는 단일-파장 공급원 (예를 들어, 다수의 공급원 또는 다수의 상이한 특징적 파장에서 작동하는 공급원이라기 보다는 하나의 특징적 파장을 생성하는 공급원)으로 수행될 수 있다. 추가적으로, 파장 식별 광학장치 및 필터는 검출 시스템에 필요하지 않을 수 있다. 또한, 단일 광검출기는 각각의 샘플 웰이 상이한 형광단으로부터 방출을 검출하는데 사용될 수 있다. 어구 "특징적 파장" 또는 "파장"은 방사선의 제한된 밴드폭을 갖는 중심 또는 우세한 파장을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 방사선의 제한된 밴드폭은 펄스화된 광원에 의한 20 nm 밴드폭 출력 내의 중심 또는 피크 파장을 포함할 수 있다. 일부 경우에, "특징적 파장" 또는 "파장"은 공급원에 의한 방사선 출력의 총 밴드폭 내의 피크 파장을 지칭하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 검출 모듈을 포함한다. 검출 모듈 (예를 들어, 도 9에서의 검출 모듈 (1800))은 임의의 다양한 상기 언급된 적용 (예를 들어, 생물분석적 적용, 예컨대 분석, 단백질 시퀀싱, 펩티드 시퀀싱, 분석물 확인, 진단)을 수행하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 검출 모듈은 분석 모듈을 포함한다. 분석 모듈은 샘플 제조 모듈에 의해 제조된 샘플을 분석하도록 구성될 수 있다. 분석 모듈은 예를 들어, 유체 샘플에서의 하나 이상의 성분의 농도를 결정하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 모듈은 시퀀싱 모듈을 포함한다. 예로서, 도 9를 다시 언급하면, 검출 모듈 (1800)은 일부 실시양태에 따른 시퀀싱 모듈을 포함한다. 시퀀싱 모듈은 샘플 제조 모듈에 의해 제조된 샘플의 하나 이상의 성분의 시퀀싱을 수행하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 확인 모듈은 펩티드 분자 (예를 들어, 단백질 분자)를 확인하도록 구성된다.
도 9는 별개의 샘플 제조 모듈 (1700) 및 검출 모듈 (1800) (예를 들어, 분석 모듈, 시퀀싱 모듈, 확인 모듈)을 도시하지만, 샘플 제조 모듈 자체 (예를 들어, 연동 펌프, 기구, 카트리지를 포함함)는 일부 경우에, 분석, 시퀀싱, 또는 확인 프로세스를 수행할 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, 샘플 모듈은 분석, 시퀀싱, 및/또는 확인 프로세스의 조합을 수행할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펌프 (예를 들어, 기구 (1200) 및 유체 장치 (1300)를 포함하는 펌프 (1400))는 샘플의 특정 부피 (예를 들어, 상대적으로 작은 부피, 예컨대 펌프 사이클당 10 μL 이하)를 (예를 들어, 차례대로 및/또는 특정 유속으로) 직접적으로 또는 간접적으로 통합 검출기 (예를 들어, 광학 또는 전기적 검출기)에 전달하도록 구성되고/거나 사용될 수 있다. 통합 검출기는 임의의 다양한 적용 (예를 들어, 분석, 시퀀싱, 확인, 진단)을 수행하기 위한 측정을 하는데 사용될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템에 의해 제조된 샘플 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 신체 조직, 신체 분비물을 포함함)은 임의의 적합한 기계 (예를 들어, 상이한 모듈, 또는 동일한 모듈)를 사용하여 시퀀싱될/분석될 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 기계가 샘플을 검출하기 (예를 들어, 시퀀싱하기) 위한 최소 비작동 시간으로 (예를 들어, 계속적으로) 사용될 수 있도록, 샘플 제조를 위한 본원에 기재된 모듈 및 시스템에 의해 제조된 샘플의 적어도 일부 (예를 들어, 그의 전부)를 검출하기 (예를 들어, 시퀀싱하기) 위한 별개의 기계를 갖는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조를 위한 모듈 (예를 들어, 샘플 제조 모듈 (1700))은 시스템에 의해 제조된 샘플의 적어도 일부 (예를 들어, 그의 전부)를 검출하기 (예를 들어, 시퀀싱하기) 위한 기계 (예를 들어, 검출 모듈 (1800))에 유동적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플 제조를 위한 본원에 기재된 시스템은 시스템에 의해 제조된 샘플의 적어도 일부 (예를 들어, 그의 전부)를 분석하기 위한 진단 기기와 유동적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 진단 기기는 샘플의 기저의 서열에 기반한 밴드 또는 색상의 존재 또는 부재에 기반하여 출력을 생성한다. 성분 (예를 들어, 모듈, 장치)이 연결되는 (예를 들어, 기능적으로 연결되는) 것으로 기재되는 경우, 연결은 영구적으로 연결될 수 있거나, 연결은 가역적으로 연결될 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 경우에, 연결되는 것으로 기재된 성분은 이들이 제1 기간 동안 연결될 수 있지만 (예를 들어, 채널, 튜브, 도관을 통해, 예를 들어, 유체 연결로), 이어서 제2 기간 동안, 이들은 연결되지 않을 수 있다는 (예를 들어, 유체 연결을 디커플링함으로써) 점에서, 디커플링가능하게 연결된다. 일부 이러한 실시양태에서, 가역적/디커플링가능한 연결은 수행되는 샘플 제조/분석/시퀀싱/확인의 유형에 따라, 특정 성분이 대체되거나 재구성될 수 있는 모듈식 시스템을 제공할 수 있다.
또 다른 측면에서, 유체 장치 (예를 들어, 카트리지)를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 제조하는 방법은 표면 층을 포함하는 표면 물품을 베이스 층과 어셈블리하여 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 형성하는 것을 포함하고, 여기서 (1) 표면 층은 엘라스토머를 포함하고, (2) 베이스 층은 하나 이상의 채널을 포함하고, (3) 하나 이상의 채널의 적어도 일부는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다. 유체 장치를 제조하는 방법의 실시양태는 본원의 다른 곳에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 제조하는 방법은 표면 층을 포함하는 표면 물품을 베이스 층과 어셈블리하여 유체 장치를 형성하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면 층은 엘라스토머를 포함한다. 특정 실시양태에서, 베이스 층은 하나 이상의 채널을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 채널의 적어도 일부는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다.
특정 실시양태에서, 방법은 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 하나 이상의 기계적 성분을 제조하는 것을 포함하고, 예를 들어, 여기서 제조는 사출 성형 (예를 들어, 정확성 사출 성형)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 경강 툴링으로의 사출 성형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 평활한 무결함 표면 및 긴밀한 내성 (예를 들어, 수 십 마이크로미터 정도)은 경강 툴링으로의 사출 성형에 의해 제조된 하나 이상의 기계적 성분에 대해 달성되며, 이는 높은 처리량으로 의료 장치 소모품을 제조하는데 유리할 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 유체 장치의 하나 이상의 성분, 예컨대 인큐베이션 채널, 켄칭 영역, 저장소 (예를 들어 유도체화제 저장소, 유도체화 시약 저장소) 및 영역 (예를 들어 인큐베이션 영역, 켄칭 영역, 유도체화 영역, 고정화 형성 복합체 영역)을 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제조는 사출 성형 (예를 들어, 정확성 사출 성형)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 경강 툴링으로의 사출 성형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 평활한 무결함 표면 및 긴밀한 내성 (예를 들어, 수 십 마이크로미터 정도)은 경강 툴링으로의 사출 성형에 의해 제조된 하나 이상의 기계적 성분에 대해 달성되며, 이는 높은 처리량으로 의료 장치 소모품을 제조하는데 유리할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 엘라스토머 (예를 들어, 실리콘, 열가소성 엘라스토머)를 포함하는 표면 층을 하나 이상의 관통-구멍을 포함하는 밀봉 플레이트 (예를 들어, 경질 플라스틱 사출-성형된 부분) 상으로 오버-몰딩하여 표면 층 및 밀봉 플레이트를 포함하는 표면 물품을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표면 물품을 베이스 층과 어셈블리하여 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 형성하는 것을 포함하고, 여기서 어셈블리는 예를 들어, 레이저 용접, 음파 용접, 접착 (예를 들어, 접착제를 사용하여), 및/또는 소모품에 대한 또 다른 적합한 부착 프로세스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 밀봉 플레이트에서의 하나 이상의 관통-구멍을 베이스 층에서의 상응하는 하나 이상의 채널과 정렬하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 미리-제조된 쉬트 스톡으로부터 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 다이-커팅하는 (예를 들어, 오버-몰딩에 대한 대안으로서) 것을 포함하며, 이는 유리하게는 경도계 및/또는 두께에 있어서 높은 정확성을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 예를 들어 레이저 용접, 음파 용접, 접착, 및/또는 소모품에 대한 또 다른 적합한 부착 프로세스를 사용하여, 베이스 층 (예를 들어, 경질 플라스틱을 포함하고/거나 이로 본질적으로 이루어짐) 및 밀봉 플레이트 (예를 들어, 경질 플라스틱을 포함하고/거나 이로 본질적으로 이루어짐) 사이에 엘라스토머를 포함하는 표면 층 (예를 들어, 다이-커팅된 엘라스토머 층)을 어셈블리하여 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 형성하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 베이스 층은 하나 이상의 채널을 포함하고, 밀봉 플레이트는 하나 이상의 관통-구멍을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 밀봉 플레이트에서의 하나 이상의 관통-구멍을 베이스 층에서의 상응하는 하나 이상의 채널과 정렬하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표면 층은 연동 층, 밸브 격막, 및 시스템을 위한 페이스-밀봉 가스켓으로서 기능한다.
일부 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 제조하는 방법은 표면 층을 포함하는 표면 물품을 베이스 층과 어셈블리하여 유체 장치를 형성하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표면 층은 엘라스토머를 포함한다. 특정 실시양태에서, 베이스 층은 하나 이상의 채널을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 채널의 적어도 일부는 실질적으로 삼각형-형상 횡단면을 갖는다.
일부 실시양태에서, 표면 층을 포함하는 표면 물품을 베이스 층과 어셈블리하여 유체 장치를 형성하는 것은 레이저 용접, 음파 용접, 및/또는 표면 층을 베이스 층에 접착시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 접착제를 사용하여 표면 층을 베이스 층에 접착시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 미리-제조된 쉬트 스톡으로부터 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 다이-커팅하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면 물품은 표면 층으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 표면 층을 포함하는 표면 물품을 베이스 층과 어셈블리하여 유체 장치 (예를 들어 카트리지)를 형성하는 것은 베이스 층 및 밀봉 플레이트 사이에 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 어셈블리하여 유체 장치를 형성하는 것을 포함하고, 여기서 밀봉 플레이트는 하나 이상의 관통-구멍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 베이스 층 및 밀봉 플레이트 사이에 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 어셈블리하는 것은 레이저 용접, 음파 용접, 및/또는 표면 층을 표면 층의 한 페이스 상의 베이스 층에 및 표면 층의 다른 페이스 상의 밀봉 플레이트에 접착시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 엘라스토머를 포함하는 표면 층을 하나 이상의 관통-구멍을 포함하는 밀봉 플레이트 상으로 오버-몰딩하여 표면 물품을 형성하는 것을 포함하고, 여기서 표면 물품은 밀봉 플레이트를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 밀봉 플레이트의 하나 이상의 관통-구멍의 적어도 일부는 베이스 층의 하나 이상의 채널의 적어도 일부의 형상과 실질적으로 유사한 형상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 방법은 밀봉 플레이트에서의 하나 이상의 관통-구멍을 베이스 층의 상응하는 하나 이상의 채널과 정렬하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 하나 이상의 관통-구멍을 하나 이상의 채널과 정렬하는 것은, 롤러 (예를 들어, 본원에 기재된 기구의 롤러)가 표면 층의 노출된 영역의 노출된 부분을 변형시켜 베이스 층에서의 연관된 채널의 벽 및/또는 베이스의 부분을 접촉할 수 있도록, 베이스 층에서의 하나 이상의 연관된 채널 위의 표면 층의 하나 이상의 노출된 영역에 상응하는 표면 층의 하나 이상의 노출된 영역을 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 하나 이상의 기계적 성분을 사출 성형하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 유체 장치의 하나 이상의 기계적 성분을 사출 성형하는 것은 밀봉 플레이트를 형성하기 위한 사출 성형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유체 장치 (예를 들어 카트리지)의 하나 이상의 기계적 성분을 사출 성형하는 것은 베이스 층을 형성하기 위한 사출 성형을 포함한다. 사출 성형은 예를 들어, 정확성 사출 성형 및/또는 경강 툴링으로의 사출 성형을 포함할 수 있다.
도 14a 내지 14i는 일부 실시양태에 따른 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치의 개략적 예시의 다양한 모습을 나타낸다. 도 14a는 일부 실시양태에 따른 유체 장치 (400)의 하향식 개략적 예시를 나타내는 반면, 도 14b는 유체 장치 (400)의 하향식 투영도를 나타낸다. 도 14c는 유사하게, 일부 실시양태에 따른 유체 장치 (400)의 투시적 개략적 예시를 나타내는 반면, 도 14d는 유체 장치 (400)의 투시적 투영도를 나타낸다. 카트리지의 형태로 나타내어진 유체 장치 (400)는 (예를 들어, 하나 이상의 마이크로채널을 통해) 인큐베이션 채널 (412)을 포함하는 인큐베이션 영역 (410)에 유동적으로 연결된 샘플 로딩 영역 (414)을 포함한다. 인큐베이션 채널 (412)은 구불구불한 구성을 가질 수 있다. 샘플 로딩 영역 (414)은 (예를 들어, 외부 공급원, 예컨대 피펫, 시린지, 또는 상이한 유체 장치에의 유체 연결을 통해) 펩티드 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 유체 장치 (400)는 마이크로채널을 통해 제2 유도체화 시약 저장소 (426), 유도체화제 저장소 (422), 및 제1 유도체화 시약 저장소 (424)를 통해 인큐베이션 채널 (412)에 유동적으로 연결된 유도체화 영역 (420)을 추가로 포함한다. 유체 장치 (400)는 (예를 들어, 하나 이상의 마이크로채널을 통해) 유도체화 영역 (420)에 유동적으로 연결된 켄칭 영역 (430)을 추가로 포함한다. 켄칭 영역 (430)은 관능기를 포함하는 고체 기재 (예를 들어, 복수의 폴리아민 비드의 형태로)를 포함할 수 있다. 켄칭 영역 (430)은 유체 (예를 들어, 펩티드 샘플)가 켄칭 영역을 통해 임의의 수의 목적하는 횟수 (예를 들어, 2회, 3회, 5회, 10회, 20회 등)로 재순환될 수 있도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 켄칭 영역 (430)은 입구 및 입구에 유동적으로 연결된 출구를 포함할 수 있다. 유체 장치 (400)는 켄칭 영역 (430) (및, 일부 경우에, 인큐베이션 영역 (410))에 유동적으로 연결된 고정화 복합체-형성 영역 (440)을 추가로 포함할 수 있다. 고정화 복합체-형성 영역 (440)은 고정화 복합체 (예를 들어, 스트렙타비딘-보유 고정화 복합체)를 포함하거나 이를 수용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 장치 (400)는 인큐베이션 영역 (410)에 유동적으로 연결된 정제 영역 (450) (예를 들어, 크기 배제 매체, 예컨대 탈염 칼럼을 포함함)을 포함한다. 마지막으로, 유체 장치는 완충제 저장소 (490), 수집물 저장소 (492) (정제된 펩티드가 예를 들어, 하류 분석, 예컨대 시퀀싱을 위해 유체 장치로부터 제거될 수 있음), 및 폐기물 저장소 (494)를 추가로 포함할 수 있다.
유체 장치 (400) 내의 유체 및/또는 시약의 수송은 연동 펌핑에 의해 유도될 수 있다. 유체 장치 (400)는 상기 언급된 영역의 일부 또는 전부 및 유체 장치 (400)의 저장소에 유동적으로 수집된 펌핑 레인 (470)을 포함함으로써 이러한 연동 펌핑을 위해 구성될 수 있다. 펌핑 레인 (470)은 베이스 층 및 엘라스토머 표면을 갖는 채널일 수 있다. 예를 들어, 도 14c 내지 14d에서, 유체 장치 (400)는 펌핑 레인 (470)에 커플링된 엘라스토머 표면 (462) (예를 들어, 실리콘 층)을 포함한다. 펌핑 기구 (예를 들어, 기구의 롤러)와의 상호작용은 펌핑 레인에서 연동 작용을 개시할 수 있으며, 이는 유체 수송을 작동시킬 수 있다. 엘라스토머 표면 (462)은 밀봉 플레이트 (460)를 통해 유체 장치 (400)에 고정될 수 있다. 도 14e 내지 14g는 엘라스토머 표면 (462) 및 밀봉 플레이트 (460)의 다양한 모습을 나타내는 유체 장치 (400)의 측면도 (도 14e), 측면도 분해조립도 (도 14f), 및 저면도 투영도 (도 14g) 개략적 예시를 나타낸다. 도 14e 및 14f는 또한 베이스 층 (464)을 나타낸다. 도 14h는 일부 실시양태에 따른 엘라스토머 표면 (462) 및 밀봉 플레이트 (460)의 투시적 개략적 예시를 나타낸다. 도 14i는 일부 실시양태에 따른 밀봉 플레이트 (460)의 투시적 개략적 예시를 나타낸다.
펩티드 샘플의 제조는 일부 실시양태에서, 먼저 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플)을 펩티드 (예를 들어, 단백질)에 관하여 용해시키고/거나 풍부화하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 샘플은 펩티드 (예를 들어, 단백질), 환원제 (예를 들어, TCEP-HCl), 아미노산 측쇄 캡핑제 (예를 들어, 시스테인 알킬화, 예컨대 아이오도아세트아미드), 및 단백질 소화제 (예를 들어, 프로테아제, 예컨대 트립신)의 혼합물을 수성 완충제에서 (예를 들어, 10 내지 20% 아세토니트릴을 갖는 100 mM HEPES 또는 pH 8의 인산나트륨에서) 제조함으로써 형성된다. 펩티드 샘플은 샘플 로딩 영역 (414) 내로 도입되고, 인큐베이션 영역 (410)의 인큐베이션 채널 (410)로 수송될 수 있다. 이어서 펩티드 샘플은 인큐베이션 영역 (410)에서 인큐베이션될 수 있다 (예를 들어, 37°의 온도를 유지함으로써). 인큐베이션 동안, 환원제는 아미노산 측쇄를 환원시켜 (예를 들어, 2개의 시스테인 측쇄 사이의 디술피드 결합을 환원시킴으로써) 단백질을 변성시킬 수 있다. 또한 인큐베이션 동안, 아미노산 측쇄 캡핑제는 환원된 아미노산 측쇄와 공유 결합을 형성할 수 있다 (예를 들어, 생성된 시스테인 측쇄를 알킬화함으로써). 또한 인큐베이션 동안, 단백질 소화제 (예를 들어, 프로테아제)는 단백질의 단백질분해를 유도하여 하나 이상의 캡핑된 펩티드를 형성하고, 그에 의해 소화된 단백질 샘플을 형성할 수 있다.
이어서 소화된 단백질 샘플은 제2 유도체화 시약 저장소 (426) (여기서 이는 샘플의 pH가 10 내지 11이도록 pH 조정 시약, 예컨대 염기 (예를 들어, K2CO3)와 혼합됨), 유도체화제 저장소 (422) (여기서 이는 유도체화제, 예컨대 아지드 전달제와 혼합됨), 및 제1 유도체화 시약 저장소 (424) (여기서 이는 촉매, 예컨대 Cu2+의 공급원과 혼합됨)를 통해 수송될 수 있다. 이어서 생성된 혼합물은 유도체화 영역 (420)으로 수송될 수 있고, 여기서 유도체화 반응이 일어나 (예를 들어, 하나 이상의 측쇄, 예컨대 리신을 유도체화하기 위해) 하나 이상의 유도체화된 펩티드 및 과량의 유도체화제를 포함하는 비켄칭된 혼합물을 형성할 수 있다.
이어서 생성된 혼합물은 과량의 유도체화제와 반응하는 고체 기재 (예를 들어, 폴리아민 비드)를 포함할 수 있는 켄칭 영역 (430)으로 수송될 수 있다. 샘플의 재순환이 일어날 수 있고, 켄칭 영역에서의 혼합물은 혼합을 촉진시키기 위해 교반될 수 있다 (예를 들어, 유체 장치의 연동 펌핑 성분으로부터의 작용을 통해). 유도체화된 펩티드를 포함하는 생성된 켄칭된 혼합물은 예컨대 산 (예를 들어, 아세트산)에의 노출을 통해 pH 조정 (예를 들어, 보다 낮은 pH, 예컨대 pH 7 내지 8로)을 겪을 수 있다. 이어서 pH-조정된 유도체화된 펩티드는 고정화 복합체-형성 영역 (440)으로 수송될 수 있고, 여기서 유도체화된 펩티드는 고정화 복합체, 예컨대 스트렙타비딘-보유 고정화 복합체 (예를 들어, DBCO-Q24-SV)와 혼합될 수 있다. 유도체화된 펩티드 및 고정화 복합체의 혼합물은 인큐베이션 영역 (410)으로 수송될 수 있고, 여기서 펩티드를 고정화 복합체에 접합시키는 고정화 복합체-형성 반응이 수행될 수 있다 (예를 들어, 37℃의 온도를 유지함으로써). 이어서 관능화된 펩티드 샘플은 정제 영역 (450)으로 수송될 수 있고, 여기서 임의의 나머지 비-관능화된 펩티드가 제거될 수 있다 (예를 들어, 크기 배제 매체, 예컨대 유체 장치 (400) 내로 통합된 탈염 칼럼을 통해 통과시킴으로써). 이어서 정제된 펩티드 샘플은 수집물 저장소 (492)로부터 수집될 수 있고, 폐기물 (예를 들어, 크기 배제 매체로부터의)은 폐기물 저장소 (494)로 보내질 수 있다.
도 14a 내지 14i의 맥락에서 상기 기재된 단계의 일부 또는 전부는 자동으로 수행될 수 있다.
표면 층에 관하여 본원에 사용된 용어 "내표면"은 채널 내로 면한 표면을 지칭하는데 사용되는 반면, 표면 층의 "외표면"은 채널의 외부의 환경에 면한다. 예를 들어, 마이크로채널은 내표면 및 외표면을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "제1 부분" 및 "제2 부분"은 적어도 부분적으로 중첩하는 부분 또는 중첩을 갖지 않는 부분을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 제1 부분 및 제2 부분은 실질적으로 중첩할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "변환"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 위치를 변화시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 변환은 변형 (예를 들어, 탄성 변형)의 위치를 변화시키는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "변형"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 적용된 힘에 반응한 물품에 대한 형상의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 변형은 적용된 힘에 반응한 표면 층에 대한 형상의 변화를 지칭할 수 있다. 변형은 탄성적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "탄성 변형"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 적용된 힘의 제거시 자발적으로 반전되는 적용된 힘에 반응한 물품에 대한 형상의 일시적 변화를 지칭한다. 예를 들어, 탄성 변형은 적용된 힘의 제거시 자발적으로 반전되는 적용된 힘에 반응한 표면 층에 대한 형상의 일시적 변화를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유체 장치, 물품, 및 시스템의 성분은 유동적으로 연결된다. 2개의 성분은 실시양태의 일부 구성 하에서, 유체가 그들 사이에 통과할 수 있는 경우 유동적으로 연결된다. 예를 들어, 제1 유체 장치 성분 및 제2 유체 장치 성분은 이들이 채널, 마이크로채널, 또는 튜브에 의해 연결되는 경우 유체 통신될 수 있다. 또 다른 예로서, 밸브에 의해 분리된 2개의 성분은, 밸브가 2개의 성분 사이의 유체 유동을 허용하도록 구성될 수 있는 한, 여전히 유동적으로 연결된 것으로 간주될 것이다. 대조적으로, 그들 사이의 유체 경로 없이 단지 기계적으로 연결된 2개의 성분은 유동적으로 연결된 것으로 간주되지 않을 것이다. 유동적으로 연결된 성분은 직접적으로 유동적으로 연결될 수 있다 (즉, 임의의 개재하는 성분을 통해 통과하지 않는 유체 경로에 의해 연결됨). 그러나, 유동적으로 연결된 성분은 일부 경우에 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20개, 또는 그 초과의 개재하는 성분을 통한 유체 경로에 의해 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 2개의 화합물은 서로와 반응"할 수 있다." 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유도체화제는 아미노산 측쇄를 유도체화할 수 있다. 이 맥락에서, 단어 "할 수 있다"는 일부 온도 범위 내에서 화학 반응이 자발적으로 진행됨을 의미한다. 예를 들어, 서로와 반응할 수 있는 2개의 화합물은 0℃ 이상의 온도, 5℃ 이상의 온도, 10℃ 이상의 온도, 또는 그 초과에서 아미노산 측쇄와 자발적으로 화학적으로 반응할 수 있다. 서로와 반응할 수 있는 2개의 화합물은 100℃ 이하, 80℃ 이하, 50℃ 이하, 40℃ 이하, 또는 그 미만의 온도에서 아미노산 측쇄와 자발적으로 화학적으로 반응할 수 있다. 이들 범위의 조합은 가능할 수 있다. 예를 들어, 서로와 반응할 수 있는 2개의 화합물은 100℃ 이하 및 0° 이상의 온도에서 아미노산 측쇄와 자발적으로 화학적으로 반응할 수 있다.
자발적 반응은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 열역학적 의미에서 자발적인 것으로 간주됨이 이해되어야 한다. 자발적 반응은 즉각적일 필요는 없다. 예를 들어, 자발적 반응은 완결에 도달하는데 1분 초과, 5분 초과, 10분 초과, 1시간 초과, 5시간 초과, 및 또는 24시간 초과가 걸릴 수 있다. 자발적 반응의 유일한 요건은 반응의 진행이 에너지적으로 바람직한 것이다.
용어 "지방족"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 카르보시클릭 기를 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "헤테로지방족"은 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 및 헤테로시클릭 기를 지칭한다.
용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다 ("C1-20 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-10 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-9 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-8 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-7 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-6 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-5 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-4 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-3 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-2 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1 알킬"). 일부 실시양태에서, 알킬 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C2-6 알킬"). C1-6 알킬 기의 예는 메틸 (C1), 에틸 (C2), 프로필 (C3) (예를 들어, n-프로필, 이소프로필), 부틸 (C4) (예를 들어, n-부틸, tert-부틸, sec-부틸, 이소-부틸), 펜틸 (C5) (예를 들어, n-펜틸, 3-펜타닐, 아밀, 네오펜틸, 3-메틸-2-부타닐, 3차 아밀), 및 헥실 (C6) (예를 들어, n-헥실)을 포함한다. 알킬 기의 추가의 예는 n-헵틸 (C7), n-옥틸 (C8) 등을 포함한다. 달리 특정되지 않는 한, 알킬 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 알킬") 또는 하나 이상의 치환기 (예를 들어, 할로겐, 예컨대 F)로 치환된다 ("치환된 알킬"). 특정 실시양태에서, 알킬 기는 비치환된 C1-10 알킬 (예컨대 비치환된 C1-6 알킬, 예를 들어, -CH3 (Me), 비치환된 에틸 (Et), 비치환된 프로필 (Pr, 예를 들어, 비치환된 n-프로필 (n-Pr), 비치환된 이소프로필 (i-Pr)), 비치환된 부틸 (Bu, 예를 들어, 비치환된 n-부틸 (n-Bu), 비치환된 tert-부틸 (tert-Bu 또는 t-Bu), 비치환된 sec-부틸 (sec-Bu 또는 s-Bu), 비치환된 이소부틸 (i-Bu))이다. 특정 실시양태에서, 알킬 기는 치환된 C1-10 알킬 (예컨대 치환된 C1-6 알킬, 예를 들어, -CH2F, -CHF2, -CF3 또는 벤질 (Bn))이다. 알킬 기는 분지형 또는 비분지형일 수 있다.
용어 "알케닐"은 1 내지 20개의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 이중 결합)을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-20 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-12 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 11개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-11 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-10 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-9 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-8 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-7 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-6 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-5 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-4 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-3 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-2 알케닐"). 일부 실시양태에서, 알케닐 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1 알케닐"). 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부 (예컨대 2-부테닐에서) 또는 말단 (예컨대 1-부테닐에서)일 수 있다. C1-4 알케닐 기의 예는 메틸리데닐 (C1), 에테닐 (C2), 1-프로페닐 (C3), 2-프로페닐 (C3), 1-부테닐 (C4), 2-부테닐 (C4), 부타디에닐 (C4) 등을 포함한다. C1-6 알케닐 기의 예는 상기 언급된 C2-4 알케닐 기 뿐만 아니라 펜테닐 (C5), 펜타디에닐 (C5), 헥세닐 (C6) 등을 포함한다. 알케닐의 추가의 예는 헵테닐 (C7), 옥테닐 (C8), 옥타트리에닐 (C8) 등을 포함한다. 달리 특정되지 않는 한, 알케닐 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 알케닐") 또는 하나 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 알케닐"). 특정 실시양태에서, 알케닐 기는 비치환된 C1-20 알케닐이다. 특정 실시양태에서, 알케닐 기는 치환된 C1-20 알케닐이다. 알케닐 기에서, 입체화학이 특정되지 않은 C=C 이중 결합 (예를 들어, -CH=CHCH3 또는 )은 (E)- 또는 (Z)-배치이다.
용어 "헤테로알케닐"은 모 쇄 내에 (예를 들어, 그의 인접한 탄소 원자 사이에 삽입된) 및/또는 모 쇄의 하나 이상의 말단 위치(들)에 놓인 산소, 질소, 또는 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 헤테로원자)를 추가로 포함하는 알케닐 기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 20개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다 ("헤테로C1-20 알케닐"). 특정 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 12개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다 ("헤테로C1-12 알케닐"). 특정 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 11개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다 ("헤테로C1-11 알케닐"). 특정 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 10개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다 ("헤테로C1-10 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 9개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-9 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 8개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-8 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 7개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-7 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 6개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-6 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 5개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-5 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 4개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-4 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 3개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-3 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 2개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-2 알케닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 1 내지 6개의 탄소 원자, 적어도 하나의 이중 결합, 및 모 쇄 내에 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-6 알케닐"). 달리 특정되지 않는 한, 헤테로알케닐 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 헤테로알케닐") 또는 하나 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 헤테로알케닐"). 특정 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 비치환된 헤테로C1-20 알케닐이다. 특정 실시양태에서, 헤테로알케닐 기는 치환된 헤테로C1-20 알케닐이다.
용어 "알키닐"은 1 내지 20개의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 삼중 결합)을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다 ("C1-20 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-10 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-9 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-8 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-7 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-6 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-5 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-4 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-3 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1-2 알키닐"). 일부 실시양태에서, 알키닐 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다 ("C1 알키닐"). 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합은 내부 (예컨대 2-부티닐에서) 또는 말단 (예컨대 1-부티닐에서)일 수 있다. C1-4 알키닐 기의 예는 제한 없이, 메틸리디닐 (C1), 에티닐 (C2), 1-프로피닐 (C3), 2-프로피닐 (C3), 1-부티닐 (C4), 2-부티닐 (C4) 등을 포함한다. C1-6 알케닐 기의 예는 상기 언급된 C2-4 알키닐 기 뿐만 아니라 펜티닐 (C5), 헥시닐 (C6) 등을 포함한다. 알키닐의 추가의 예는 헵티닐 (C7), 옥티닐 (C8) 등을 포함한다. 달리 특정되지 않는 한, 알키닐 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 알키닐") 또는 하나 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 알키닐"). 특정 실시양태에서, 알키닐 기는 비치환된 C1-20 알키닐이다. 특정 실시양태에서, 알키닐 기는 치환된 C1-20 알키닐이다.
용어 "헤테로알키닐"은 모 쇄 내에 (예를 들어, 그의 인접한 탄소 원자 사이에 삽입된) 및/또는 모 쇄의 하나 이상의 말단 위치(들)에 놓인 산소, 질소, 또는 황으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의 헤테로원자)를 추가로 포함하는 알키닐 기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 20개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다 ("헤테로C1-20 알키닐"). 특정 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 10개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다 ("헤테로C1-10 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 9개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-9 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 8개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-8 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 7개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-7 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 6개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-6 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 5개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-5 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 4개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-4 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 3개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-3 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 2개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-2 알키닐"). 일부 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 1 내지 6개의 탄소 원자, 적어도 하나의 삼중 결합, 및 모 쇄 내에 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는다 ("헤테로C1-6 알키닐"). 달리 특정되지 않는 한, 헤테로알키닐 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 헤테로알키닐") 또는 하나 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 헤테로알키닐"). 특정 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 비치환된 헤테로C1-20 알키닐이다. 특정 실시양태에서, 헤테로알키닐 기는 치환된 헤테로C1-20 알키닐이다.
"아르알킬"은 "알킬"의 하위세트이고, 아릴 기에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서 부착점은 알킬 모이어티 상에 있다.
본원에 사용된 용어 "알콕시"는 알킬 기를 부착점에 연결하는 산소 원자를 갖는 알킬 기를 지칭한다: 즉, 알킬-O-. 알킬 부분에 대해, 알콕시 기는 임의의 적합한 수의 탄소 원자, 예컨대 C1-6 또는 C1-4를 가질 수 있다. 알콕시 기는 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소-프로폭시, 부톡시, 2-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 헥속시 등을 포함한다. 알콕시 기는 비치환되지만, 일부 실시양태에서 치환된 것으로 기재될 수 있다. "치환된 알콕시" 기는 할로, 히드록시, 아미노, 알킬아미노, 니트로, 시아노, 및 알콕시로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티로 치환될 수 있다.
용어 "시클로알킬"은 3 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는 시클릭 알킬 라디칼을 지칭한다 ("C3-10 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 3 내지 8개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-8 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C3-6 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 5 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C5-6 시클로알킬"). 일부 실시양태에서, 시클로알킬 기는 5 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C5-10 시클로알킬"). C5-6 시클로알킬 기의 예는 시클로펜틸 (C5) 및 시클로헥실 (C5)을 포함한다. C3-6 시클로알킬 기의 예는 상기 언급된 C5-6 시클로알킬 기 뿐만 아니라 시클로프로필 (C3) 및 시클로부틸 (C4)을 포함한다. C3-8 시클로알킬 기의 예는 상기 언급된 C3-6 시클로알킬 기 뿐만 아니라 시클로헵틸 (C7) 및 시클로옥틸 (C8)을 포함한다. 달리 특정되지 않는 한, 시클로알킬 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 시클로알킬") 또는 하나 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 시클로알킬"). 특정 실시양태에서, 시클로알킬 기는 비치환된 C3-10 시클로알킬이다. 특정 실시양태에서, 시클로알킬 기는 치환된 C3-10 시클로알킬이다.
본원에 사용된 용어 "헤테로알킬"은 구성요소 탄소 원자 중 하나 이상이 헤테로원자 또는 임의로 치환된 헤테로원자, 예를 들어, 질소 (예를 들어, ), 산소 (예를 들어, ), 또는 황 (예를 들어, )에 의해 대체된 본원에 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 헤테로알킬 기는 임의로 본원에 기재된 임의의 치환기로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3개, 또는 2개 이상의 탄소의 알킬 기의 경우, 4, 5, 또는 6개의 치환기로 치환될 수 있다. 헤테로알킬 기 치환기는 (1) 카르보닐; (2) 할로; (3) C6-C10 아릴; 및 (4) C3-C10 카르보시클릴을 포함한다. 헤테로알킬렌은 2가 헤테로알킬 기이다.
본원에 사용된 용어 "알콕시"는 -ORa를 지칭하고, 여기서 Ra는 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 또는 헤테로아릴이다. 알콕시 기의 예는 메톡시, 에톡시, 이소프로폭시, tert-부톡시, 페녹시, 및 벤질옥시를 포함한다.
용어 "아릴"은 방향족 고리 시스템에 제공된 6 내지 14개의 고리 탄소 원자 및 0개의 헤테로원자를 갖는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 (예를 들어, 비시클릭 또는 트리시클릭) 4n+2 방향족 고리 시스템 (예를 들어, 시클릭 어레이에서 공유된 6, 10, 또는 14개의 π 전자를 가짐)의 라디칼을 지칭한다 ("C6-14 아릴"). 일부 실시양태에서, 아릴 기는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C6 아릴"; 예를 들어, 페닐). 일부 실시양태에서, 아릴 기는 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C10 아릴"; 예를 들어, 나프틸, 예컨대 1-나프틸 및 2-나프틸). 일부 실시양태에서, 아릴 기는 14개의 고리 탄소 원자를 갖는다 ("C14 아릴"; 예를 들어, 안트라실). "아릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 아릴 고리가 하나 이상의 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴 기와 융합된 고리 시스템을 포함하고, 여기서 라디칼 또는 부착점은 아릴 고리 상에 있고, 이러한 경우, 탄소 원자의 번호는 아릴 고리 시스템에서 탄소 원자의 번호를 계속 지정한다. 달리 특정되지 않는 한, 아릴 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 아릴") 또는 하나 이상의 치환기 (예를 들어, -F, -OH 또는 -O(C1-6 알킬)로 치환된다 ("치환된 아릴"). 특정 실시양태에서, 아릴 기는 비치환된 C6-14 아릴이다. 특정 실시양태에서, 아릴 기는 치환된 C6-14 아릴이다.
용어 "아릴옥시"는 -O-아릴 치환기를 지칭한다.
용어 "헤테로아릴"은 방향족 고리 시스템에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 14원 모노시클릭 또는 폴리시클릭 (예를 들어, 비시클릭, 트리시클릭) 4n+2 방향족 고리 시스템 (예를 들어, 시클릭 어레이에서 공유된 6, 10, 또는 14개의 π 전자를 가짐)의 라디칼을 지칭하고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("5 내지 14원 헤테로아릴"). 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로아릴 기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 바와 같이 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로아릴 폴리시클릭 고리 시스템은 하나 또는 둘 다의 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로아릴"은 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴 기와 융합된 고리 시스템을 포함하고, 여기서 부착점은 헤테로아릴 고리 상에 있고, 이러한 경우, 고리 구성원의 번호는 헤테로아릴 고리 시스템에서의 고리 구성원의 번호를 계속 지정한다. "헤테로아릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 아릴 기와 융합된 고리 시스템을 포함하고, 여기서 부착점은 아릴 또는 헤테로아릴 고리 중 어느 하나 상에 있고, 이러한 경우, 고리 구성원의 번호는 융합된 폴리시클릭 (아릴/헤테로아릴) 고리 시스템에서의 고리 구성원의 번호를 지정한다. 하나의 고리가 헤테로원자를 함유하지 않는 폴리시클릭 헤테로아릴 기 (예를 들어, 인돌릴, 퀴놀리닐, 카르바졸릴 등)에서, 부착점은 어느 하나의 고리, 예를 들어 헤테로원자를 보유하는 고리 (예를 들어, 2-인돌릴) 또는 헤테로원자를 함유하지 않는 고리 (예를 들어, 5-인돌릴) 상에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 헤테로아릴은 치환된 또는 비치환된, 5- 또는 6-원, 모노시클릭 헤테로아릴이고, 여기서 헤테로아릴 고리 시스템에서의 1, 2, 3, 또는 4개의 원자는 독립적으로 산소, 질소, 또는 황이다. 특정 실시양태에서, 헤테로아릴은 치환된 또는 비치환된, 9- 또는 10-원, 비시클릭 헤테로아릴이고, 여기서 헤테로아릴 고리 시스템에서의 1, 2, 3, 또는 4개의 원자는 독립적으로 산소, 질소, 또는 황이다.
일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 방향족 고리 시스템에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10원 방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("5 내지 10원 헤테로아릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 방향족 고리 시스템에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 8원 방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("5 내지 8원 헤테로아릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 방향족 고리 시스템에 제공된 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("5 내지 6원 헤테로아릴"). 일부 실시양태에서, 5 내지 6원 헤테로아릴은 질소, 산소, 및 황으로부터 선택되는 1 내지 3개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5 내지 6원 헤테로아릴은 질소, 산소, 및 황으로부터 선택되는 1 내지 2개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5 내지 6원 헤테로아릴은 질소, 산소, 및 황으로부터 선택되는 1개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 달리 특정되지 않는 한, 헤테로아릴 기의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 헤테로아릴") 또는 하나 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 헤테로아릴"). 특정 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 비치환된 5 내지 14원 헤테로아릴이다. 특정 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 치환된 5 내지 14원 헤테로아릴이다.
용어 "헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭"은 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 3- 내지 14-원 비-방향족 고리 시스템의 라디칼을 지칭하고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("3 내지 14원 헤테로시클릴"). 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로시클릴 기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 바와 같이 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로시클릴 기는 모노시클릭 ("모노시클릭 헤테로시클릴") 또는 폴리시클릭 (예를 들어, 융합된, 가교된 또는 스피로 고리 시스템, 예컨대 비시클릭 시스템 ("비시클릭 헤테로시클릴") 또는 트리시클릭 시스템 ("트리시클릭 헤테로시클릴")) 중 어느 하나일 수 있고, 포화일 수 있거나 또는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 함유할 수 있다. 헤테로시클릴 폴리시클릭 고리 시스템은 하나 또는 둘 다의 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. "헤테로시클릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 헤테로시클릴 고리가 하나 이상의 카르보시클릴 기와 융합된 고리 시스템 (여기서 부착점은 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴 고리 중 어느 하나 상에 있음), 또는 상기 정의된 바와 같은 헤테로시클릴 고리가 하나 이상의 아릴 또는 헤테로아릴 기와 융합된 고리 시스템 (여기서 부착점은 헤테로시클릴 고리 상에 있음)을 포함하고, 이러한 경우, 고리 구성원의 번호는 헤테로시클릴 고리 시스템에서의 고리 구성원의 번호를 계속 지정한다. 달리 특정되지 않는 한, 헤테로시클릴의 각각의 경우는 독립적으로 비치환되거나 ("비치환된 헤테로시클릴") 또는 하나 이상의 치환기로 치환된다 ("치환된 헤테로시클릴"). 특정 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 비치환된 3 내지 14원 헤테로시클릴이다. 특정 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 치환된 3 내지 14원 헤테로시클릴이다. 특정 실시양태에서, 헤테로시클릴은 치환된 또는 비치환된, 3- 내지 7-원, 모노시클릭 헤테로시클릴이고, 여기서 헤테로시클릭 고리 시스템에서의 1, 2, 또는 3개의 원자는 독립적으로 원자가가 허용하는 바와 같이 산소, 질소, 또는 황이다.
일부 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 10원 비-방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("5 내지 10원 헤테로시클릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 8원 비-방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("5 내지 8원 헤테로시클릴"). 일부 실시양태에서, 헤테로시클릴 기는 고리 탄소 원자 및 1 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 5 내지 6원 비-방향족 고리 시스템이고, 여기서 각각의 헤테로원자는 독립적으로 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된다 ("5 내지 6원 헤테로시클릴"). 일부 실시양태에서, 5 내지 6원 헤테로시클릴은 질소, 산소, 및 황으로부터 선택되는 1 내지 3개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5 내지 6원 헤테로시클릴은 질소, 산소, 및 황으로부터 선택되는 1 내지 2개의 고리 헤테로원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 5 내지 6원 헤테로시클릴은 질소, 산소, 및 황으로부터 선택되는 1개의 고리 헤테로원자를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "아미노"는 -N(RN)2를 나타내고, 여기서 각각의 RN은 독립적으로, H, OH, NO2, N(RN0)2, SO2ORN0, SO2RN0, SORN0, N-보호기, 알킬, 알콕시, 아릴, 시클로알킬, 아실 (예를 들어, 아세틸, 트리플루오로아세틸, 또는 본원에 기재된 다른 것들)이고, 이들 나열된 RN 기의 각각은 임의로 치환될 수 있거나; 또는 2개의 RN은 조합되어 알킬렌 또는 헤테로알킬렌을 형성하고, 각각의 RN0은 독립적으로, H, 알킬, 또는 아릴이다. 본 개시내용의 아미노 기는 비치환된 아미노 (즉, -NH2) 또는 치환된 아미노 (즉, -N(RN)2)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치환된"은 적어도 하나의 수소 원자가 비-수소 원자, 예컨대 할로겐 원자, 예컨대 F, Cl, Br, 및 I; 기 중의 산소 원자, 예컨대 히드록실 기, 알콕시 기, 및 에스테르 기; 기 중의 황 원자, 예컨대 티올 기, 티오알킬 기, 술폰 기, 술포닐 기, 및 술폭시드 기; 기 중의 질소 원자, 예컨대 아민, 아미드, 알킬아민, 디알킬아민, 아릴아민, 알킬아릴아민, 디아릴아민, N-옥시드, 이미드, 및 엔아민; 기 중의 규소 원자, 예컨대 트리알킬실릴 기, 디알킬아릴실릴 기, 알킬디아릴실릴 기, 및 트리아릴실릴 기; 및 다양한 다른 기 중의 다른 헤테로원자 (그러나 이에 제한되지는 않음)에의 결합에 의해 대체됨을 의미한다. "치환된"은 또한 하나 이상의 수소 원자가 헤테로원자, 예컨대 옥소, 카르보닐, 카르복실, 및 에스테르 기 중의 산소; 및 기, 예컨대 이민, 옥시드, 히드라존, 및 니트릴 중의 질소에의 보다 높은-차수 결합 (예를 들어, 이중- 또는 삼중-결합)에 의해 대체됨을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 "치환된"은 하나 이상의 수소 원자가 NRgRh, NRgC(=O)Rh, NRgC(=O)NRgRh, NRgC(=O)ORh, NRgSO2Rh, OC(=O)NRgRh, ORg, SRg, SORg, SO2Rg, OSO2Rg, SO2ORg, =NSO2Rg, 및 SO2NRgRh로 대체됨을 의미한다. "치환된은 또한 하나 이상의 수소 원자가 C(=O)Rg, C(=O)ORg, C(=O)NRgRh, CH2SO2Rg, CH2SO2NRgRh로 대체됨을 의미한다.
상기에서, Rg 및 Rh는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 수소, 알킬, 알콕시, 알킬아미닐, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로시클릴, N-헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴, N-헤테로아릴 및/또는 헤테로아릴알킬이다. "치환된"은 추가로 하나 이상의 수소 원자가 아미닐, 시아노, 히드록실, 이미노, 니트로, 옥소, 티옥소, 할로, 알킬, 알콕시, 알킬아미닐, 티오알킬, 아릴, 아르알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로시클릴, N-헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 헤테로아릴, N-헤테로아릴 및/또는 헤테로아릴알킬 기에의 결합에 의해 대체됨을 의미한다. 또한, 상기 치환기의 각각은 또한 임의로 상기 치환기 중 하나 이상으로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "그의 염" 또는 "그의 염들"은 관련 기술분야에 널리 공지된 염을 지칭한다. 예를 들어, 버지(Berge) 등은 본원에 참조로 포함되는 문헌 [J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에서 제약상 허용되는 염을 상세하게 기재한다. 적합한 염에 대한 추가의 정보는 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985]에서 발견될 수 있다. 본 발명의 화합물의 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 산 부가 염의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 및 과염소산으로 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산으로 형성된 또는 관련 기술분야에 사용되는 다른 방법, 예컨대 이온 교환을 사용함으로써 형성된 아미노 기의 염이다. 다른 제약상 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 비술페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로아이오다이드, 2-히드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 제약상 허용되는 염은, 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 카운터 이온을 사용하여 형성된 아민 양이온, 예컨대 할라이드, 히드록시드, 카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 술포네이트 및 아릴 술포네이트를 포함한다.
"단백질", "펩티드", 또는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 포함한다. 상기 용어는 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질 또는 펩티드는 적어도 3개의 아미노산의 길이일 것이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 약 3 내지 약 100개의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 5 내지 약 25, 약 10 내지 약 80, 약 15 내지 약 70, 또는 약 20 내지 약 40개의 아미노산의 길이)이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 약 6 내지 약 40개의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 6 내지 약 30, 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 40, 또는 약 20 내지 약 30개의 아미노산의 길이)이다. 일부 실시양태에서, 복수의 펩티드는 복수의 각각의 펩티드 분자가 복수의 임의의 다른 펩티드 분자와는 상이한 아미노산 서열을 포함하는 복수의 펩티드 분자를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 펩티드는 적어도 1개의 펩티드 및 최대 1,000개의 펩티드 (예를 들어, 적어도 1개의 펩티드 및 최대 10, 50, 100, 250, 또는 500개의 펩티드)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 펩티드는 1 내지 5, 5 내지 10, 1 내지 15, 15 내지 20, 10 내지 100, 50 내지 250, 100 내지 500, 500 내지 1,000개, 또는 그 초과의 상이한 펩티드를 포함한다. 단백질은 개별적 단백질 또는 단백질의 집합을 지칭할 수 있다. 발명적 단백질은 바람직하게는 단지 천연 아미노산을 함유하지만, 비-천연 아미노산 (즉, 자연에서 발생하지 않지만 폴리펩티드 쇄 내로 혼입될 수 있는 화합물) 및/또는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 아미노산 유사체는 대안적으로 채용될 수 있다. 또한, 단백질에서 아미노산 중 하나 이상은 예를 들어, 화학적 실체, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합 또는 관능화를 위한 링커, 또는 다른 변형의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 단백질은 또한 단일 분자일 수 있거나 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 천연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질은 천연 발생, 재조합, 합성, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
하기 공보는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 2020년 10월 28일에 미국 특허 출원 번호 17/082,223으로서 출원되고, 발명의 명칭이 "샘플 제조를 위한 시스템 및 방법"인 2021년 4월 29일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2021-0121879; 2020년 10월 28일에 미국 특허 출원 번호 17/082,226으로서 출원되고, 발명의 명칭이 "시퀀싱을 위한 방법 및 장치"인 2021년 6월 3일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2021-0164035; 2020년 10월 28일에 미국 특허 출원 번호 17/083,126으로서 출원되고, 발명의 명칭이 "생물분석적 적용을 위한 유체의 연동 펌핑 및 연관된 방법, 시스템, 및 장치"인 2021년 4월 29일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2021-0121875; 및 2020년 10월 28일에 미국 특허 출원 번호 17/083,106으로서 출원되고, 발명의 명칭이 "유체의 연동 펌핑 및 연관된 방법, 시스템, 및 장치"인 2021년 4월 29일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호 2021-0121874.
발명의 명칭이 "펩티드 샘플 제조를 위한 장치 및 방법"인 2021년 1월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/139,332는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도되지만, 본 발명의 전체 범주를 예시하지는 않는다.
실시예 1
이 실시예는 도 14a 내지 14i에 나타내어진 유체 장치를 사용한 펩티드 샘플의 제조를 기재하고, 여기서 인큐베이션, 유도체화, 켄칭, 고정화 복합체 형성, 및 정제 단계는 단일 카트리지의 형태의 단일 유체 장치 상에서 수행되었다. 카트리지 내의 유체 수송은 상기 기재된 바와 같이 카트리지를 수용한 샘플 제조 모듈로의 연동 펌핑 메커니즘을 통해 개시되었다. 단백질을 스파이크된 혈장으로부터의 풀다운에 의해 제조하였고, 여기서 풍부화된 단백질을 고체 지지체 상의 항체 또는 DNA 압타머 중 어느 하나를 사용하여 정제하였다. 이어서 단백질을 겔 여과에 의해 또는 pH 조정에 의해 목적하는 완충제로 평형화하였다. 이어서, 2, 3, 또는 4개의 단백질의 동등한 혼합물을 포함하는 풍부화된 단백질 샘플 (100 μL 중 50 내지 200 μM)을 10 내지 20% 아세토니트릴을 갖는 100mM HEPES 또는 인산나트륨 (pH 6 내지 9)에서 제조하고, 환원제로서 작용하는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP-HCl, 물 중 200 mM, 1 μL)의 용액, 아미노산 측쇄 캡핑제로서 작용하는 신선하게 용해된 아이오도아세트아미드 용액 (500 mM을 위해 97.3 μL 물 중 9 mg, 2 μL), 및 단백질 소화제로서 작용하는 트립신 (1 μg/μL, 0.5 내지 1 μL)과 혼합하였다. 다음으로, 혼합물을 혼합물 공급원으로부터 카트리지의 인큐베이션 부분의 인큐베이션 채널 (구불구불한 구성을 가짐)로 자동으로 수송하였다. 펩티드 샘플을 인큐베이션 채널에서 37℃에서 6 내지 10시간 동안 인큐베이션하였고, 여기서 단백질은 변성되고 소화되었다. 이는 소화된 펩티드 샘플의 형성을 발생시켰다.
다음으로, 소화된 펩티드 샘플을 일련의 저장소를 통해 자동으로 수송하였고, 여기서 이는 유도체화제, 제1 (촉매) 시약, 및 제2 (pH 조정) 시약과 혼합되었다. 초기에, 소화된 펩티드 샘플을 제2 유도체화 시약 저장소로 자동으로 수송하였고, 여기서 이를 탄산칼륨 (1 M, 5 μL)에 첨가하여 pH를 10 내지 11의 값으로 조정하였다. 그 후, 소화된 펩티드 샘플을 이미다졸-1-술포닐 아지드 용액 (200 mM KOH 중 "ISA" 200 mM, 1.2 μL), 아지드 전달제를 함유하는 유도체화제 저장소로 자동으로 전달하였다. 다음으로, 소화된 펩티드 샘플을 제1 유도체화 시약 저장소로 자동으로 수송하였고, 여기서 이를 황산구리 (촉매 시약) 용액과 혼합하였다. 마지막으로, 소화된 펩티드 샘플을 유체 장치의 유도체화 영역으로 자동으로 전달하였고, 여기서 이를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이는 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 포함하는 비켄칭된 혼합물의 형성을 발생시켰다.
유도체화 영역에서의 펩티드의 관능화 후, 50 μL의 비켄칭된 샘플을 유체 장치의 켄칭 영역으로 자동으로 수송하였다. 여기서, 비켄칭된 혼합물을 복수의 폴리스티렌 비드 (고체 기재)와 혼합하고, 10개의 능동적으로 혼합된 켄칭 단계를 사용하여 켄칭하였으며, 각각의 켄칭 단계에 이어서 총 23분 동안 고정적 켄칭 단계가 이어졌다. 마지막으로, 생성된 켄칭된 혼합물을 카트리지 상 칼럼을 통해 통과시켜 이를 복수의 폴리스티렌 비드로부터 여과하였다.
다음으로, 켄칭된 펩티드 샘플의 pH를 6 μL의 1 M 아세트산의 첨가를 통해 7 내지 8로 조정하였다. 그 후, 켄칭된 혼합물을 DBCO-Q24-SV (50 μM, 6 μL), 고정화 복합체와 자동으로 혼합한 후, 장치의 인큐베이션 채널로 다시 수송하였고, 여기서 이를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 펩티드 샘플을 제바 탈염 칼럼 수지로 이루어진 유체 장치의 칼럼으로 먼저 10 mM TRIS, 10 mM 아세트산칼륨 완충제 (pH 7.5)로 평형화된 40 kDa의 컷 오프로 자동으로 수송하였다. 마지막으로, 이 작업흐름으로부터 초래된 정제된 펩티드 샘플을 동결시키고, -20℃ 미만의 온도에서 저장하였다.
나중에, 정제된 펩티드 샘플을 시퀀싱하고, 관찰된 펩티드를 단백질 서열에 대한 그들의 상응성에 기반하여 확인하였다. 도 15a 내지 15d는 막대 차트의 형태의 결과를 제시한다. 도 15a는 2개의 단백질 - GIP 및 ADM의 혼합물에 상응한다. 도 15b는 3개의 단백질 - GLP1, 인슐린, 및 ADM의 혼합물에 상응한다. 도 15c는 4개의 단백질 - GLP1, ADM, 인슐린, 및 GIP의 혼합물에 상응한다. 도 15d는 4개의 펩티드 - GLP1, ADM, 인슐린, 및 GIP의 혼합물에 상응한다. 소수의 오프-타겟 할당 (801)이 지시되지만, 일반적으로 시퀀싱된 펩티드는 펩티드 샘플에서 제조된 단백질에 정확하게 할당되었다. 더욱이, 이 실시예에서 생성된 라이브러리는 동일한 단백질 믹스의 복제물 수동으로 제조된 라이브러리보다 유사하거나 더 많은 총 판독물을 가졌다. 이 실시예는 정제된 펩티드 샘플이 본원에 개시된 유형의 유체 장치 상에서 자동화 방식으로 제조될 수 있음을 입증한다.
실시예 2
이 실시예는 인큐베이션, 유도체화, 켄칭, 고정화 복합체 형성, 및 정제 단계가 다수의 모듈식 카트리지의 형태의 다수의 유체 장치를 사용하여 수행될 수 있는 예시적인 시스템을 기재한다. 이 실시양태의 유체 장치는 연결되지 않지만, 펩티드 샘플은 실시예 1의 프로토콜에 따름으로써 제조되었다. 카트리지 내의 유체 수송을 상기 기재된 바와 같이 카트리지를 수용한 샘플 제조 모듈로의 연동 펌핑 메커니즘을 통해 개시하였다. 도 16a 내지 16b는 각각 이 실시예에 사용된 제1 유체 장치의 구체적인 실시양태의 개략적 상면도 및 저면도 예시를 제시한다. 제1 유체 장치에서, 단백질 샘플을 혼합물 공급원 (514) 내로 로딩하였다. 다음으로, 혼합물을 혼합물 공급원으로부터 제1 유체 장치의 인큐베이션 영역의 인큐베이션 채널 (512) (구불구불한 구성을 가짐)로 자동으로 수송하였다. 이어서 펩티드 샘플을 인큐베이션 채널에서 인큐베이션하였고 (예를 들어 37℃에서 5시간 동안), 여기서 단백질은 변성되고 소화되었다. 인큐베이션 카트리지는 카트리지 내의 유체의 펌핑을 용이하게 하는 펌프 레인 (570), 뿐만 아니라 시약/샘플 혼합물 공급원 (514) 및 증발-제어 물 저장소 (515)를 추가로 포함하였다.
이 유체 장치 부분에서의 인큐베이션 후, 펩티드 샘플은 소화된 펩티드 샘플이 되었다. 이어서 소화된 펩티드 샘플을 제2 유체 장치로 자동으로 전달하였고, 여기서 이를 일련의 저장소를 통해 자동으로 수송하였고, 여기서 이는 유도체화제, 제1 (촉매) 시약, 및 제2 (pH 조정) 시약과 혼합되었다. 도 17a 내지 17b는 각각 이 실시예에 사용된 제2 유체 장치의 구체적인 실시양태의 개략적 상면도 및 저면도 예시를 제시한다. 소화된 펩티드 샘플을 샘플 투입부 (529)를 통해 제2 유체 장치로 수송하였다. 소화된 펩티드 샘플을 제2 유도체화 시약 저장소, 유도체화제 저장소, 및 제1 유도체화 시약 저장소 (도 17a의 저장소 (521))를 통해 차례대로 자동으로 수송하였다. 마지막으로, 소화된 펩티드 샘플을 유체 장치의 온도 제어된 유도체화 영역의 채널 (520)로 자동으로 전달하였고, 여기서 이를 기간 (예를 들어 실온에서 1시간) 동안 인큐베이션하였다. 이는 비켄칭된 혼합물의 형성을 발생시켰다. 제2 유체 장치는 펌프 레인 (570)을 추가로 포함하였다.
비켄칭된 샘플의 부분을 샘플 투입부, 비드를 위한 필터, 작은 부피의 산성 시약 저장소, 및 혼합 채널을 포함하는 제3 유체 장치의 켄칭 영역으로 자동으로 수송하였다. 여기서, 비켄칭된 혼합물을 복수의 폴리스티렌 비드 (고체 기재)와 혼합하고, 혼합 채널에서 실온에서 가볍게 교반하였다. 마지막으로, 생성된 켄칭된 혼합물을 카트리지 상 칼럼을 통해 통과시켜 복수의 폴리스티렌 비드를 제거하고, pH를 산성 시약 저장소로부터의 아세트산의 첨가에 의해 7 내지 8로 조정하였다.
그 후, 켄칭된 혼합물을 제1 유체 장치의 혼합물 공급원에서의 DBCO-Q24-SV 고정화 복합체와 혼합한 후, 이를 제1 유체 장치의 인큐베이션 채널로 다시 수송하고, 37℃에서 인큐베이션하였다.
마지막으로, 펩티드 샘플을 켄칭된 펩티드 샘플의 유동을 상업적 제바 탈염 칼럼 수지를 통해 제어한 제4 유체 장치로 자동으로 수송하였다. 추가의 평형 완충제를 칼럼을 통해 분배하여 펩티드가 칼럼을 통해 전송된 것을 보장하였다. 정제된 펩티드 샘플을 칼럼을 통한 유체 통과의 특이적 분획으로부터 수집한 반면, 나머지 유체는 폐기물 저장소로 전송하였다. 수집된 정제된 단백질 샘플은 상기 기재된 임의의 기술을 사용한 시퀀싱에 적합하였다. 이 실시예는 일부 실시양태에서, 정제된 펩티드 샘플이 다수의 유체 장치를 포함하는 시스템을 사용하여 자동으로 생산될 수 있음을 입증한다.
본 발명의 몇몇 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하고/거나 결과 및/또는 본원에 기재된 이점의 하나 이상을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 상정할 것이고, 이러한 변동 및/또는 변형의 각각은 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 구성은 예시적인 것으로 의미되고, 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 구성은 본 발명의 교시내용이 사용되는 구체적인 적용 또는 적용들에 의존할 것임을 용이하게 인정할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 통상적인 실험 이하를 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시되며, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주 내에서, 본 발명은 구체적으로 기재되고 청구된 것과 다른 식으로 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 기재된 각각의 개별적 특색, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2개 이상의 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않는 경우, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
명세서에서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수 형태는 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서에서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉, 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 분리적으로 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는" 조항에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소는 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, 구체적으로 확인된 그러한 요소와 관련되든 비관련되든, 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적 예로서, 개방-단부 언어, 예컨대 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 실시양태에서, B 없는 A (B 이외의 요소를 임의로 포함함)를; 또 다른 실시양태에서, A 없는 B (A 이외의 요소를 임의로 포함함)를; 추가의 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
명세서에서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리하는 경우, "또는" 또는 "및/또는"은 포함적인 것으로, 즉, 요소의 수 또는 목록의 적어도 하나의 포함, 뿐만 아니라 그의 하나 초과, 및, 임의로, 추가의 비열거된 항목을 포함하는 것으로 해석될 것이다. 단지 명백하게 반대로 지시된 용어, 예컨대 "단지 하나" 또는 "정확하게 하나", 또는, 청구범위에 사용되는 경우, "이루어진"은 요소의 수 또는 목록의 정확하게 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 단지 배타성의 용어, 예컨대 "어느 하나", "하나", "단지 하나", "정확하게 하나"가 선행하는 경우, 배타적인 대안 (즉, "하나 또는 다른 것, 그러나 둘 다는 아님")을 지시하는 것으로 해석될 것이다. 청구범위에 사용되는 경우, "본질적으로 이루어진"은 특허법의 분야에 사용되는 바와 같은 그의 통상적인 의미를 가질 것이다.
하나 이상의 요소의 목록에 관하여 명세서에서 및 청구범위에서 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서의 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하지는 않으며, 요소의 목록에서의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이 정의는 또한 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가, 구체적으로 확인된 그러한 요소와 관련되는 비관련되든, 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 등가적으로, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는, 등가적으로 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는 하나 초과의 A를 임의로 포함하는 적어도 하나 (및 B 이외의 요소를 임의로 포함함)를; 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는 하나 초과의 B를 임의로 포함하는 적어도 하나 (및 A 이외의 요소를 임의로 포함함)를; 추가의 또 다른 실시양태에서, 하나 초과의 A를 임의로 포함하는 적어도 하나, 및 하나 초과의 B를 임의로 포함하는 적어도 하나 (및 다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 "wt%"는 중량 퍼센트의 약어이다. 본원에 사용된 "at%"는 원자 퍼센트의 약어이다.
일부 실시양태는 그의 다양한 실시예가 기재된 방법으로서 구현될 수 있다. 방법의 일부로서 수행되는 작용은 임의의 적합한 방식으로 순서화될 수 있다. 따라서, 기재된 것들과는 상이한 (예를 들어, 보다 많은 또는 보다 적은) 작용을 포함할 수 있는, 및/또는 작용이 상기 구체적으로 기재된 실시양태에서 순차적으로 수행되는 것으로 나타내어진다 하더라도, 일부 작용을 동시에 수행하는 것을 수반할 수 있는, 작용이 예시된 것과는 상이한 순서로 수행되는 실시양태가 구축될 수 있다.
청구항 요소를 수식하기 위해 청구범위에서의 서수 용어, 예컨대 "제1", "제2", "제3" 등의 사용은 그것만으로 또 다른 것에 비해 하나의 청구항 요소의 임의의 우선순위, 선행, 또는 순서 또는 방법의 작용이 수행되는 시간적 순서를 내포하지 않지만, 단지 청구항 요소를 구별하기 위해 특정 명칭을 갖는 하나의 청구항 요소를 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소 (그러나 서수 용어의 사용을 위해)로부터 구별하는 표지로서 사용된다.
청구범위에서, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 전이적 어구, 예컨대 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "보유하는(carrying)", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는(holding)" 등은 개방-단부인 것으로, 즉, 포함하나 이에 제한되지는 않는으로 이해되어야 한다. 단지 전이적 어구 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"은 미국 특허청 특허 심사 절차의 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이, 각각 폐쇄된 또는 반-폐쇄된 전이적 어구일 것이다.
Claims (76)
- 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치로서,
아미노산 측쇄를 유도체화할 수 있는 유도체화제를 수용하도록 구성된 유도체화제 저장소; 및
하나 이상의 마이크로채널을 통해 유도체화제 저장소에 유동적으로 연결된 켄칭 영역으로서, 여기서 켄칭 영역은 유도체화제와 반응할 수 있는 관능기를 포함하는 표면을 갖는 고체 기재를 포함하는 것인 켄칭 영역
을 포함하는 유체 장치. - 펩티드 샘플을 제조하기 위한 유체 장치로서,
샘플의 가열을 용이하게 하도록 구성된 인큐베이션 영역으로서, 여기서 인큐베이션 영역은 인큐베이션 채널을 포함하고, 여기서 인큐베이션 채널은 마이크로채널인 인큐베이션 영역;
유도체화 영역; 및
아미노산 측쇄를 유도체화할 수 있는 유도체화제를 수용하도록 구성된 유도체화제 저장소로서, 여기서 유도체화제 저장소는 유체가 인큐베이션 채널로부터, 유도체화제 저장소를 통해, 및 유도체화 영역으로 수송될 수 있도록 인큐베이션 채널 및 유도체화 영역에 유동적으로 연결되는 것인 유도체화제 저장소
를 포함하는 유체 장치. - 펩티드 샘플을 제조하기 위한 키트로서,
인큐베이션 채널을 포함하는 인큐베이션 영역을 포함하는 유체 장치로서, 여기서 인큐베이션 채널은 마이크로채널인 유체 장치; 및
환원제,
아미노산 측쇄 캡핑제, 및
단백질 소화제
로부터 선택되는 하나 이상의 시약
을 포함하고;
여기서 인큐베이션 영역은 하나 이상의 시약을 수용하도록 구성되는 것인 키트. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치가 카트리지를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지가 채널을 포함하는 표면을 갖는 베이스 층을 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제5항에 있어서, 카트리지의 채널의 일부의 적어도 부분이 채널의 표면 개구를 밀봉하도록 구성된 엘라스토머를 포함하는 표면을 갖는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치가 아미노산 측쇄를 유도체화할 수 있는 유도체화제를 수용하도록 구성된 유도체화제 저장소를 포함하는 것인 키트.
- 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체화제 저장소가 유도체화제를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체화제가 아지드 전달제를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제9항에 있어서, 아지드 전달제가 이미다졸-1-술포닐 아지드를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치가 하나 이상의 마이크로채널을 통해 유도체화제 저장소에 유동적으로 연결된 켄칭 영역을 포함하고, 켄칭 영역이 유도체화제와 반응할 수 있는 관능기를 포함하는 표면을 갖는 고체 기재를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제11항에 있어서, 고체 기재가 비드를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 고체 기재의 관능기가 아민 기를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제1항 및 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 켄칭 영역이 입구 및 출구를 포함하고, 유체 장치가 유체가 켄칭 영역의 출구로부터 켄칭 영역의 입구로 수송될 수 있도록 구성되는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제1항 및 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치가 샘플의 가열을 용이하게 하도록 구성된 인큐베이션 영역을 포함하고, 인큐베이션 영역이 인큐베이션 채널을 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 채널이 마이크로채널인 유체 장치 또는 키트.
- 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 채널이 제1 채널 부분, 제1 채널 부분에 평행한 제2 채널 부분, 및 제1 채널 부분 및 제2 채널 부분을 연결하는 턴 부분을 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제2항 및 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 채널의 적어도 부분이 구불구불한 구성을 갖는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제2항 및 제3항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 채널이 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및/또는 단백질 소화제를 포함하는 혼합물의 공급원에 유동적으로 연결되는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 채널이 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제를 포함하는 혼합물의 공급원에 유동적으로 연결되는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 측쇄 캡핑제가 시스테인 알킬화제를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제3항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 측쇄 캡핑제가 아이오도아세트아미드 및/또는 클로로아세트아미드를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 소화제가 프로테아제를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제24항에 있어서, 프로테아제가 트립신, Lys-C, Asp-N, 및/또는 Glu-C를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치가 유도체화제 및 아미노산 측쇄 사이의 반응을 용이하게 할 수 있는 유도체화 시약을 수용하도록 구성된 유도체화 시약 저장소를 추가로 포함하고, 유도체화제 저장소 및 유도체화 시약 저장소가 유체가 인큐베이션 채널로부터, 유도체화제 저장소 및 유도체화 시약 저장소를 통해, 및 유도체화 영역으로 수송될 수 있도록 유동적으로 연결되는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제26항에 있어서, 유도체화 시약이 pH 조정 시약을 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 유도체화 시약이 아미노산 측쇄 및 유도체화제 사이의 유도체화 반응을 위한 촉매를 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체화 시약이 Cu2+의 공급원을 포함하는 것인 유체 장치 또는 키트.
- 펩티드 샘플을 제조하는 방법으로서,
적어도 하나의 마이크로채널을 포함하는 유체 장치의 인큐베이션 영역에서
단백질,
환원제,
아미노산 측쇄 캡핑제, 및
단백질 소화제
를 포함하는 혼합물을 포함하는 펩티드 샘플을 인큐베이션하여 소화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계를 포함하고;
여기서 인큐베이션 동안:
환원제는 단백질의 아미노산 측쇄를 환원시켜 환원된 아미노산 측쇄를 형성하고,
아미노산 측쇄 캡핑제는 환원된 아미노산 측쇄와 공유 결합을 형성하여 캡핑된 아미노산 측쇄를 형성하고,
단백질 소화제는 캡핑된 아미노산 측쇄를 포함하는 단백질의 단백질분해를 유도하여 하나 이상의 캡핑된 펩티드를 형성하고, 그에 의해 소화된 펩티드 샘플을 형성하는 것인 방법. - 펩티드 샘플을 제조하는 방법으로서,
하나 이상의 마이크로채널을 포함하는 제1 유체 장치 부분의 인큐베이션 영역에서 펩티드 샘플을 인큐베이션하여 소화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계; 및
소화된 펩티드 샘플의 하나 이상의 펩티드를 관능화하여 관능화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 관능화 단계는
제2 유체 장치 부분의 유도체화 영역에서 유도체화제를 사용하여 하나 이상의 펩티드의 아미노산 측쇄를 유도체화하여 하나 이상의 유도체화된 펩티드 및 과량의 유도체화제를 포함하는 비켄칭된 혼합물을 형성하고,
제3 유체 장치 부분의 켄칭 영역에서 과량의 유도체화제의 적어도 일부를 제거함으로써 비켄칭된 혼합물을 켄칭하여 켄칭된 혼합물을 형성하는 것
을 포함하는 것인 방법. - 제31항에 있어서, 펩티드 샘플이 단백질, 환원제, 아미노산 측쇄 캡핑제, 및 단백질 소화제를 포함하는 혼합물을 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 인큐베이션 동안:
환원제가 단백질의 아미노산 측쇄를 환원시켜 환원된 아미노산 측쇄를 형성하고,
아미노산 측쇄 캡핑제가 환원된 아미노산 측쇄와 공유 결합을 형성하여 캡핑된 아미노산 측쇄를 형성하고,
단백질 소화제가 캡핑된 아미노산 측쇄를 포함하는 단백질의 단백질분해를 유도하여 하나 이상의 캡핑된 펩티드를 형성하고, 그에 의해 소화된 펩티드 샘플을 형성하는 것인 방법. - 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 단계 전에 펩티드 샘플을 유체 장치의 채널로부터 인큐베이션 영역으로 수송하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 단계가 펩티드 샘플을 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 또는 37℃ 이상의 온도에서 유지하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 단계가 샘플의 적어도 일부가 인큐베이션 영역의 인큐베이션 채널의 적어도 부분에 있는 동안 수행되는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 인큐베이션 채널이 마이크로채널인 방법.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 인큐베이션 채널이 제1 채널 부분, 제1 채널 부분에 평행한 제2 채널 부분, 및 제1 채널 부분 및 제2 채널 부분을 연결하는 턴 부분을 포함하는 것인 방법.
- 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 채널의 적어도 부분이 구불구불한 구성을 갖는 것인 방법.
- 제30항 및 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 포함하는 것인 방법.
- 제30항 및 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 측쇄 캡핑제가 시스테인 알킬화제를 포함하는 것인 방법.
- 제30항 및 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 측쇄 캡핑제가 아이오도아세트아미드 및/또는 클로로아세트아미드를 포함하는 것인 방법.
- 제30항 및 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 소화제가 프로테아제를 포함하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 프로테아제가 트립신, Lys-C, Asp-N, 및/또는 Glu-C를 포함하는 것인 방법.
- 제30항 및 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치에서 소화된 펩티드 샘플의 하나 이상의 펩티드를 관능화하여 관능화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제30항 및 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화가 유도체화제를 사용하여 하나 이상의 펩티드의 아미노산 측쇄를 유도체화하여 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 포함하는 비켄칭된 혼합물을 형성하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체화제가 아지드 전달제를 포함하는 것인 방법.
- 제47항에 있어서, 아지드 전달제가 이미다졸-1-술포닐 아지드를 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체화가 하나 이상의 펩티드를 유도체화제 및 하나 이상의 유도체화 시약에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제49항에 있어서, 하나 이상의 유도체화 시약이 pH 조정 시약을 포함하는 것인 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 하나 이상의 유도체화 시약이 아미노산 측쇄 및 유도체화제 사이의 유도체화 반응을 위한 촉매를 포함하는 것인 방법.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유도체화 시약이 Cu2+의 공급원을 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 유도체화가 하나 이상의 펩티드를 순서대로 pH 조정 시약, 유도체화제, 및 아미노산 측쇄 및 유도체화제 사이의 유도체화 반응을 위한 촉매에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 포함하는 비켄칭된 혼합물이 과량의 유도체화제를 포함하고, 관능화가 과량의 유도체화제의 적어도 일부를 제거함으로써 비켄칭된 혼합물을 켄칭하여 켄칭된 혼합물을 형성하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 켄칭이 과량의 유도체화제의 적어도 일부를 고체 기재의 표면 상의 관능기와 반응시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, 고체 기재가 비드를 포함하는 것인 방법.
- 제55항 또는 제56항에 있어서, 고체 기재의 관능기가 아민 기를 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 켄칭이 비켄칭된 혼합물을 켄칭 영역의 적어도 부분을 통해 재순환시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화가 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 고정화 복합체에 접합시켜 하나 이상의 고정화 복합체-접합된 펩티드를 형성하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화가 제4 유체 장치 부분의 고정화 복합체-형성 영역에서 하나 이상의 유도체화된 펩티드를 고정화 복합체에 접합시켜 하나 이상의 고정화 복합체-접합된 펩티드를 형성하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제59항 또는 제60항에 있어서, 고정화 복합체가 스트렙타비딘-보유 고정화 복합체인 방법.
- 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 접합의 적어도 일부가 인큐베이션 영역에서 수행되는 것인 방법.
- 제31항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화된 펩티드 샘플의 임의의 나머지 비-관능화된 펩티드의 적어도 일부를 제거함으로써 관능화된 펩티드 샘플을 정제하여 정제된 관능화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제31항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화된 펩티드 샘플의 임의의 나머지 비-관능화된 펩티드의 적어도 일부를 제거함으로써 관능화된 펩티드 샘플을 제5 유체 장치 부분의 정제 영역에서 정제하여 정제된 관능화된 펩티드 샘플을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제63항 또는 제64항에 있어서, 정제가 관능화된 펩티드 샘플을 크기 배제 매체를 통해 통과시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제31항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유체 장치 부분 및 제2 유체 장치 부분이 동일한 유체 장치의 일부인 방법.
- 제31항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유체 장치 부분 및 제3 유체 장치 부분이 동일한 유체 장치의 일부인 방법.
- 제31항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유체 장치 부분 및 제3 유체 장치 부분이 동일한 유체 장치의 일부인 방법.
- 제31항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 소화된 펩티드 샘플의 적어도 일부를 인큐베이션 영역으로부터 유도체화 영역으로 자동으로 수송하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제31항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 비켄칭된 혼합물의 적어도 일부를 유도체화 영역으로부터 켄칭 영역으로 자동으로 수송하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제31항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 켄칭된 혼합물의 적어도 일부를 켄칭 영역으로부터 고정화 복합체-형성 영역으로 자동으로 수송하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제59항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 관능화된 펩티드 샘플의 적어도 일부를 고정화 복합체-형성 영역으로부터 정제 영역으로 자동으로 수송하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제30항 및 제32항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치가 카트리지를 포함하는 것인 방법.
- 제73항에 있어서, 카트리지가 채널을 포함하는 표면을 갖는 베이스 층을 포함하는 것인 방법.
- 제74항에 있어서, 카트리지의 채널의 일부의 적어도 부분이 채널의 표면 개구를 실질적으로 밀봉하도록 구성된 엘라스토머를 포함하는 표면을 갖는 것인 방법.
- 제30항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 장치가 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제29항 중 어느 한 항의 유체 장치인 방법.
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