KR20230129153A - 엑소좀을 이용한 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 H5N1 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조류의 엑소좀 유래 miRNA는 간단히 조류의 혈액 채혈을 통해서 측정될 수 있어 신속한 검출이 가능하고, 이러한 조류의 엑소좀 유래 miRNA는 효소와 외부 환경에 의한 분해(degradation)로부터 보호될 수 있어 이를 이용한 H5N1 조류 독감 바이러스 진단은 비교적 안정적으로 정확한 진단이 가능하다는 장점이 있다. 이에, 조류의 엑소좀에서 차등 발현된 miRNA는 H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 조류의 면역계를 조절하고 감염 여부를 판단하는 바이오마커로서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 엑소좀을 이용한 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것이다.
조류독감(Avian Influenza)이란 조류독감 바이러스 감염에 의해 발생하는 급성 전염병으로, 조류독감 바이러스는 병원성에 따라 조류 감염 시 가벼운 호흡기 증상과 1 내지 30%의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류독감(Low Pathogenic Avian Influenza) 바이러스와 95% 이상의 높은 치사율을 보이는 고병원성 조류독감(Highly Pathogenic Avian Influenza) 바이러스로 구분할 수 있다. 국제수역사무국(International Office of Epizootics) 분류에 따르면 주로 H5형과 H7형 조류독감 바이러스가 고병원성 조류독감에 해당하며 위험도가 높아 주요 관리대상 감염원으로 지정되어 있다. 특히, H5형에 속하는 바이러스(예컨대, H5N1 바이러스 등)는 인체 감염 사례가 지속적으로 보고되고 있으며, 고병원성 조류독감 바이러스 감염에 의한 독감은 타 독감과는 달리 인체 감염 시 60% 이상의 높은 치사율을 보인다. 따라서, 지속적으로 발병하고 있는 조류독감 바이러스를 조기에 판별하는 것은 조류 독감 바이러스의 방역과 피해를 예방하는데 무엇보다 중요하였고, 종래에는 조류독감 바이러스를 진단하기 위해 조류로부터 얻은 시료를 종란에 접종하고 배양한 후 확인하는 종란접종법 등을 이용하였다.
그러나, 종란접종법을 이용한 진단방법은 숙주가 되는 세포를 확보해야 하고, 세포를 배양하는 과정 때문에 1 내지 2주 이상의 시간이 필요하며, 조류 독감이 발생한 현장으로부터 검체를 실험실로 이송하는 과정에서 바이러스 전파를 확대시킬 가능성이 있고, 특수 바이오 실험 시설(예컨대, BSL3 등)에서 배양검사를 진행하여야 하여, 진단에 장시간이 소요되고 장소적 제약이 따르며 이차적 감염의 위험성이 있었는바, 효과적인 방역과 확산 금지 정책을 수립할 수 있도록 조류 독감 바이러스 감염을 신속하게 조기에 진단할 수 있는 방법 개발이 필요한 실정이다.
한편, 엑소좀(exosome)은 거의 모든 biological fluids에 존재하는 40-100 nm 크기의 vesicle로 대부분의 세포 유형으로부터 분비된다. 엑소좀 내에는 DNA, RNA, 단백질 등이 존재하며 이러한 물질은 엑소좀이 biological fluids에서 순환을 하며 다른 세포에게 전달될 수 있다. 따라서 엑소좀은 세포 간 소통에서 매우 중요한 역할을 한다. 엑소좀 내의 다양한 물질 중 miRNA는 17-24 nt의 small, noncoding RNA로, mRNA 절단 및 번역 억제의 두 가지 메커니즘을 통해 유전자 발현을 조절함으로써 세포 분화, 질병 진행 등과 같은 여러 생물학적 활동에 영향을 미친다.
miRNA는 무작위로 엑소좀 내에 들어가지 않고, 신경 스핑고미엘리나제 2-의존성 경로(neural sphingomyelinase 2(nSMase2)-dependant pathway), 이종 핵 리보핵단백질-의존성 경로(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs)-depentdent pathway), miRNA의 3' 말단 서열-의존성 경로 등에 따라 엑소좀 내로 들어가게 된다. 따라서, 엑소좀 내 miRNA의 경우 전혈을 통해 miRNA을 확인하는 것보다 바이러스에 의해 더 특이적으로 발현이 변화된 miRNA를 확인할 수 있다. 엑소좀 내 miRNA는 biological fluids에 안정적으로 존재할 수 있으며 질병을 가진 개체와 건강한 개체 간에서 그 구성요소와 양이 차이가 나기 때문에 질병 상태를 나타내는 비침투적 바이오마커로서 잠재성이 높다. 현재, 엑소좀 내 miRNA는 대장암(colorectal cancer), 비전이성 거세저항성 전립선암(castration-resistant prostate cancer), 파킨슨병 등과 같은 질병에 대한 바이오마커로서 개발되고 있다.
본 발명자들은 바이러스의 변이에 대한 영향이 덜 하며, 안전하게 조류 독감 바이러스를 진단하기 위한 방법을 개발하고자 하였으며, 그 결과 조류 독감 바이러스 비감염 대조군과 비교하였을 때 조류 독감 바이러스에 감염된 닭의 혈청 엑소좀 내에서 차등 발현된 miRNA를 확인하고, 이의 표적 유전자들이 면역 반응 관련 신호전달 경로에 관여하는 것을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 후보물질을 투여한 조류 독감 바이러스 감염 조류로부터 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 바이러스 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조류 독감의 치료를 위한 조류 독감 치료제에 대한 반응자 특성화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조류 독감 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 miRNA는 gga-miR-146a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 miRNA는 조류의 혈액으로부터 추출된 엑소좀 내 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 혈액은 혈청, 전혈, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 miRNA의 표적 유전자는 면역 반응 관련 신호전달 경로에 관여하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 제제는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법으로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 또는
상기 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우 조류 독감 바이러스에 감염된 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 후보물질을 투여한 조류 독감 바이러스 감염 조류로부터 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 바이러스 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물의 조류 독감 바이러스 진단 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 독감 바이러스 진단용 제제의 제조를 위한 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 독감 치료제에 대한 반응자 특성화 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하고: 조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우 조류 독감 치료제에 대한 반응자로 판정하는 단계, 상기 조류 독감 치료제는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 억제제 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 촉진제인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로서, 상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감에 대한 치료용 약학적 조성물로서, 상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감에 대한 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조류의 엑소좀 유래 miRNA는 간단히 조류의 혈액 채혈을 통해서 측정될 수 있어 신속한 검출이 가능하고, 이러한 조류의 엑소좀 유래 miRNA는 효소와 외부 환경에 의한 분해(degradation)로부터 보호될 수 있어 이를 이용한 조류 독감 바이러스 진단이 비교적 안정적으로 정확한 진단이 가능하다는 장점이 있다. 이에, 조류의 엑소좀에서 차등 발현된 miRNA는 조류 독감 바이러스에 감염된 조류의 면역계를 조절하고 감염 여부를 판단하는 바이오마커로서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1a는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭의 혈청에서 엑소좀 마커 CD9 및 CD81의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 도면이다.
도 1b는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭의 혈청 유래 엑소좀의 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 2는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA 10개의 발현 수준을 대조군과 비교하여 볼케이노 플롯으로 나타낸 도면이다.
도 3은 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 10개의 miRNA에 대한 배수 변화(fold change)를 나타낸 도면이다.
도 4는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA 10개의 표적 유전자를 miRDB 데이터베이스와 TargetScan 데이터베이스를 이용하여 예측한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 생물학적 과정에서의 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 분자 기능에서의 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 세포 구성요소에서의 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 KEGG 경로에서의 유전자 온톨리지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA와 면역 반응과 관련된 표적 유전자 간의 상호 작용 네트워크를 나타낸 도면이다 (초록색: 면역 관련 유전자, 빨간색: 상향 조절된 차등 발현(DE) miRNA, 파란색: 하향 조절된 차등 발현(DE) miRNA).
도 8은 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 10개의 miRNA가 H5N1 조류 독감 바이러스의 RNA 분절(fragment)에 결합하는 위치를 나타낸 도면이다.
도 9는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 10개의 miRNA 중 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-16c-5p의 발현에 대하여 검증하기 위해 qRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭의 혈청 유래 엑소좀의 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 2는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA 10개의 발현 수준을 대조군과 비교하여 볼케이노 플롯으로 나타낸 도면이다.
도 3은 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 10개의 miRNA에 대한 배수 변화(fold change)를 나타낸 도면이다.
도 4는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA 10개의 표적 유전자를 miRDB 데이터베이스와 TargetScan 데이터베이스를 이용하여 예측한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 생물학적 과정에서의 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 분자 기능에서의 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 세포 구성요소에서의 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA에 대하여 KEGG 경로에서의 유전자 온톨리지(GO) 풍부도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 miRNA와 면역 반응과 관련된 표적 유전자 간의 상호 작용 네트워크를 나타낸 도면이다 (초록색: 면역 관련 유전자, 빨간색: 상향 조절된 차등 발현(DE) miRNA, 파란색: 하향 조절된 차등 발현(DE) miRNA).
도 8은 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 10개의 miRNA가 H5N1 조류 독감 바이러스의 RNA 분절(fragment)에 결합하는 위치를 나타낸 도면이다.
도 9는 H5N1 조류 독감 바이러스 감염 닭에서 차등 발현된 10개의 miRNA 중 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-16c-5p의 발현에 대하여 검증하기 위해 qRT-PCR을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 일 실시예에서는, H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 닭의 혈청에서 엑소좀을 추출하고, 이의 평균 크기 분포와 엑소좀 마커(CD9 및 CD81)의 발현을 확인하였으며, small RNA 시퀀싱을 수행하여 대조군(비감염닭)과 비교했을 때 H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 닭의 샘플에서 차등 발현된 총 10개의 miRNA를 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 닭에서 차등 발현된 miRNA의 표적 유전자의 생물학적 경로를 분석한 결과, 일부 표적 유전자들이 H5N1 조류 독감 바이러스 감염에 대한 면역 반응 관련 경로에 관여하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 닭에서 차등 발현된 miRNA가 H5N1 조류 독감 바이러스의 RNA을 표적으로 하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 닭에서 차등 발현된 miRNA 중 4개의 miRNA(gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-16c-5p)에 대해 qRT-PCR을 수행하여 small RNA 시퀀싱 결과를 검증한 결과, gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, 및 gga-miR-193a-5p 의 발현 수준은 H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 닭의 혈청에서 유의하게 상향 조절되고, gga-miR-16c-5p의 발현 수준은 H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 닭의 혈청에서 유의하게 하향 조절되어 small RNA 시퀀싱 결과와 높은 상관관계가 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
이에, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “바이오마커”란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정이 가능한 표지자를 의미하며, 본 발명에 따른 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류의 엑소좀 유래 miRNA는 정상 대조군(비감염닭)에 비하여 조류 독감 바이러스에 감염된 조류의 엑소좀 내에서 발현이 유의적으로 증가; 및 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류의 엑소좀 유래 miRNA는 정상 대조군에 비하여 조류 독감 바이러스에 감염된 조류의 엑소좀 내에서 발현이 유의적으로 감소되어 있는 것을 확인하였는 바,상기 miRNA는 조류 독감 바이러스, 특히, 고병원성인 H5N1 조류 독감 바이러스 진단을 위한 바이오마커로 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, “조류 독감(Avian influenza)”은 조류 독감 바이러스 감염에 의해 발생하는 조류의 급성 전염병을 의미한다. 상기 조류 독감의 원인체는 인플루엔자(influenza) A 바이러스이다.
본 발명에 있어서, “인플루엔자(influenza) A 바이러스”는 동물 및 인간에서 발생하는 통상 '독감 (flu)'으로 불리는 고전염성 호흡기 질환의 원인 바이러스로, 단일 가닥 음성 RNA 절편으로 이루어진 절편화된 게놈을 갖는 외피가 있는 RNA 바이러스를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 본 발명에서 조류 독감의 원인체인 인플루엔자 A 바이러스는 고병원성인 H5N1 조류 독감 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “H5N1 조류 독감 바이러스”는 인플루엔자 A 바이러스의 아형(亞型)으로, 고병원성 조류 독감을 일으키며, 사람을 비롯한 다른 동물들에게도 전염될 수 있는 것으로 알려져 있다. 인플루엔자 A 바이러스의 표면 단백질인 HA 단백질의 항원 특성이 H5형이고, NA 단백질의 항원 특성이 N1형인 조류 독감 바이러스를 의미하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, H5N1 조류 독감 바이러스로 A/chicken/Vietnam/NA-01/2019(H5N1) 바이러스 균주를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 조류 독감 바이러스 특히, H5N1 조류 독감 바이러스의 감염 여부를 확인하는 것이나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “측정”이란 목적하는 물질의 존재(발현) 여부를 검출 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 검출 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 상기 조류의 엑소좀 유래 miRNA의 존재 여부 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA는 gga-miR-146a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA는 조류의 혈액으로부터 추출된 엑소좀 내 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액은 혈청, 전혈, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 표적 유전자는 면역 반응 관련 신호전달 경로 특히, KEGG 경로에 관여하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 miRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 miRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 miRNA 또는 이의 cDNA의 염기서열을 참조하여 프라이머 쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 miRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.
본 발명에 있어서, “프로브(probe)”는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA, miRNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 miRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.
본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA 발현을 측정할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA는 서열번호 6 내지 15의 염기서열을 포함할 수 있으며, 각 miRNA의 염기서열은 본 발명의 표 3에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 조류 독감 바이러스, 특히, H5N1 조류 독감 바이러스 진단을 위해 상기 miRNA의 발현을 각각 측정하여 단독으로 바이오마커로서 사용할 수 있으며, 이들 마커의 조합을 바이오마커로서 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조류 독감 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 조류의 혈액을 이용하여 조류 독감 바이러스, 특히, H5N1 조류 독감 바이러스를 진단하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “키트”는 상기 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함함으로써, 조류 독감 바이러스를 진단할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 제제 외에도 이들의 측정 또는 검출 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 이때, 상기 miRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 1회 이상 횟수에 제한 없이 작용시킬 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 및 상기 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 제제를 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법으로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법 또는 조류 독감 바이러스 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보물질을 투여한 조류 독감 바이러스 감염 조류로부터 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 바이러스 특히, H5N1 조류 독감 바이러스 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 혈액 시료일 수 있고, 상기 혈액은 혈청, 전혈, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 혈청일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA 발현 수준을 검출하기 위한 방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 qRT-PCR을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 진단을 위한 정보제공방법 또는 진단 방법은 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 또는
gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우 조류 독감 바이러스, 특히, H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 후보물질 투여 전에 비해 감소한 경우, 또는
gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 후보물질 투여 전에 비해 증가한 경우, 상기 후보물질을 조류 독감 바이러스 치료용 후보물질로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “후보물질”은 조류 독감 바이러스에 감염된 조류에 투여하여 상기 엑소좀 유래 miRNA의 발현 증감을 측정하기 위하여 스크리닝에서 사용되는 미지의 물질을 의미하며, 뉴클레오티드, DNA, RNA, 아미노산, 앱타머, 단백질, 줄기세포, 줄기세포 배양액, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물, 및 천연추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물의 조류 독감 바이러스 진단 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 독감 바이러스 진단용 제제의 제조를 위한 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 조류 독감 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 조류와 대조군에서 분리된 시료에서 엑소좀 유래 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정한 후, 이 수준 차이가 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA에서는 (2배 이상으로) 증가하고, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA에서는 (2배 이상으로) 감소한 경우에는 조류 독감 바이러스, 특히, H5N1 조류 독감 바이러스 감염 리스크가 큰 조류임을 가리키는 것으로 보는, 조류 독감 바이러스 감염에 대한 감수성이 높은 조류인지 결정/분석하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우 조류 독감 바이러스, 특히, H5N1 조류 독감 바이러스에 감염된 것으로 판정하는 단계; 및
상기 조류가 조류 독감 바이러스에 감염된 것으로 판정된 경우, 조류의 조류 독감을 치료하는 단계를 포함하는, 조류 독감의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 “치료”는 목적하는 질병과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 화학 요법, 외과적 수술, 또는 생물학적 요법 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조류 독감의 치료를 위해 통상적으로 사용되는 치료 방법을 사용하거나, 통상적으로 사용되는 치료 약물을 투여할 수 있으며, 이의 종류에 제한은 없다. 본 발명에 있어서, 상기 조류 독감의 치료 약물로서, 면역 반응 관련 신호 전달에 관여하는 유전자를 표적으로 하는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 억제제 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 촉진제를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 조류 독감 치료제에 대한 반응자 특성화 방법으로서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우 조류 독감 치료제에 대한 반응자로 판정하는 단계,
상기 조류 독감 치료제는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 억제제 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 촉진제인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 miRNA는 조류 독감 바이러스, 특히, H5N1 조류 독감 바이러스의 RNA 분절에 결합하여 바이러스 복제를 억제할 수 있는바, 조류 독감 바이러스, 특히, H5N1 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, “항바이러스용 조성물”은 바이러스 감염 주기, 구체적으로 숙주세포에서 바이러스 침투(virus penetration), 바이러스 복제(virus replication), 바이러스 조립(virus assembly) 및 바이러스 방출(virus release)로 이루어진 바이러스 감염 주기의 하나 이상의 단계를 직접 또는 간접적으로 간섭 또는 억제하는 조성물을 의미한다. 이는 바이러스 감염 개체 내에서의 바이러스 역가 증가(virus titer increase)를 불특정하게 저해하거나, 또는 바이러스 역가 수준(virus titer level)을 불특정하게 감소시키는 임의의 효과를 모두 포함한다.
상기 항바이러스용 조성물의 활용 형태에는 제한이 없으며, 본 발명에 따른 항바이러스용 조성물은 항바이러스용 소독제, 소독기기, 스프레이, 비누, 연고 등으로 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 조류의 엑소좀 유래 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감에 대한 치료용 약학적 조성물로서, 상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감에 대한 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “하는) 단계” 또는 “의 단계”는 “를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 실험 조류 및 고병원성 조류 독감 바이러스(highly pathogenic avian influenza virus; HPAIV) 감염
SPF(Specific-pathogen-free) 화이트 레그혼(White Leghorn) 닭을 베트남에 있는 국립 동물 과학 연구소의 가금 연구 센터(Poultry Research Centre of the National Institute of Animal Science)에서 구입하여 매일 질병 및 폐사 징후를 관찰하였다. 모든 닭 감염 실험은 베트남에 있는 국립 수의과 연구소(National Institute of Veterinary Research)의 생화학 및 면역학과(Department of Biochemistry and Immunology)에 있는 공동 연구실의 BSL2+( biosafety level 2 plus) 시설에서 수행하였다. HPAIV 챌린지(challenge)를 위해, 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health; OIE)의 지침에 따라, 4주령의 닭 5마리에 A/chicken/Vietnam/NA-01/2019(H5N1)을 1×104 EID50(50% egg infectious dose) 포함하는 감염된 달걀로부터 채취한 요막액(allantoic fluid) 100 μL를 비강 내 투여하였다. 감염되지 않은 닭 5마리를 대조군으로 사용하였다. H5N1 AIV-감염닭은 격리 장치에 분리하여 수용하였다. 바이러스 감염에 대한 프로토콜은 베트남에 있는 국립수의학연구소(National Institute of Veterinary Research; NIVR)의 관련 위원회로부터 승인을 받아 진행하였다 (TCVN 8402:2010/TCVN 8400-26:2014).
2. 엑소좀(Exosome) 분리 및 특성화(Characterization)
감염 3일 후, 비감염닭 4마리와 감염닭 4마리의 날개 정맥에서 혈액 샘플을 채취하였다. 비감염닭과 H5N1 AIV-감염닭의 엑소좀은 종래 언급된 방법(Hong et al., 2021)에 따라 Total Exosome Isolation Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 각 혈청에서 분리하였다. 정제된 엑소좀의 크기는 SZ-100 nanoparticle analyzer (HORIBA, Kyoto, Japan)를 사용하여 측정하였다. 엑소좀 마커인 CD9(#13174, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) 및 CD81(#56039, Cell Signaling Technology)은 웨스턴 블롯팅을 사용하여 검출하였다.
3. 엑소좀 RNA 추출 및 small RNA 시퀀싱(Sequencing)
제조업체의 지침에 따라 miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 엑소좀 RNA를 추출하였다. 비감염 닭과 H5N1 AIV-감염닭에서 추출한 엑소좀에 대해 라이브러리(Library)를 구축하고 small RNA 시퀀싱을 수행하였다. 간략하게, 라이브러리는 SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina (TAKARA Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 구축하였다. Small RNA 시퀀싱은 HiSeq 2500 System (Illumina Inc., San Diego, CA)을 사용하여 Macrogen (Seoul, Republic of Korea)에서 상업적으로 수행하였다.
4. 생물정보학적(Bioinformatic) 분석
Raw sequence read는 FastQC v0.11.7(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)을 사용하여 필터링하였으며, adapter sequence는 Cutadapt 2.8(https://cutadapt.readthedocs.org/en/stable/)을 사용하여 Raw sequence read로부터 트리밍(trimming)하였다. 최종 처리된 read는 닭 참조 genome (GRCg6a), miRBase v22.1(http://www.mirbase.org/) 및 RNAcentral release 14.0에 대해 정렬하였다. 알려졌거나 새로운 miRNA는 miRDeep2(https://www.mdc-berlin.de/content/mirdeep2-documentation)를 사용하여 예측하였다. 차등 발현(differentially expressed; DE)된 miRNA는 edge R(empirical analysis of digital gene expression data in R)을 사용하여 배수 변화(fold change) 및 exactTest를 기초로 통계적으로 분석하였다. 유의성 있는 결과는 |배수 변화(fold change)|≥ 2 및 exactTest raw P-value < 0.05의 기준에 기초하여 선택하였다. DE miRNA의 표적 유전자는 miRDB(http://www.mirdb.org/) 및 TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/) 데이터베이스를 사용하여 예측하였다. 표적 스코어(target score)가 80보다 큰 표적 유전자는 TargetScan을 사용하여 결정된 보존 부위가 있는 유전자와 마찬가지로 miRDB를 사용하여 선택하였다. 표적 유전자에 대한 Gene ontology (GO) 기능 농축 분석은 Gene Ontology Resource (http://geneontology.org/)를 사용하여 수행하였으며, KEGG 경로 농축 분석은 DAVID Bioinformatics Resources 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/)을 사용하여 수행하였다. A/duck/Vietnam/QB1207/2012(H5N1)(Accession numbers: PB2; KF182738.1, PB1; KF182739.1, PA; KF182740.1, HA; KF182741.1, NP; KF182742.1, NA; KF182743.1, M1 and M2; KF182744.1, NS1 and NS2; KF182745.1)의 Genome 서열에서 miRNA 표적 위치 및 MFE(minimum free energy)는 RNAhybrid (https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)를 사용하여 예측하였다.
4. miRNA 발현에 대한 정량적 실시간 PCR(
qRT-PCR) 분석
시퀀싱된 유전자의 발현 수준을 검증하기 위해, 개별 miRNA 및 Mir-X miRNA FirstStrand Synthesis and TB Green Kit (Takara Bio, Japan)와 함께 제공되는 범용(universal) 역방향 프라이머(reverse primer)에 대한 정방향 프라이머(forward primer)를 설계하였다. 알려진 모든 닭 miRNA 서열은 miRBase(http://www.mirbase.org/)에서 얻었다. 이러한 miRNA에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머(Oligonucleotide primer)는 전장 성숙 miRNA 서열을 사용하여 설계하였다. 프라이머는 Genotech(Daejeon, South Korea)를 통해 합성하였으며, 합성한 프라이머는 표 1에 나타내었다. cDNA 합성은 제조사의 프로토콜에 따라 Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara Bio USA, Inc.)를 사용하여 수행하였다. Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit(Takara Bio)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 CFX Connect Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 miRNA 발현을 결정하였다. miRNA의 상대적 수준은 내부 대조군으로 사용한 U1A(Livak and Schmittgen, 2001)로 정규화한 후 2 -ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다. 모든 qRT-PCR 실험은 3중으로 수행하였다.
5. 통계 분석
통계 분석은 SPSS software(version 26.0; IBM, Chicago, IL)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다. 통계적 비교는 Tukey's multiple comparison test를 이용하여 수행하였고, 통계적 유의 수준은 P <0.05로 설정하였다.
[실시예]
실시예 1. 엑소좀 miRNA 발현 분석
감염닭과 비감염닭의 혈청에서 정제된 엑소좀은 엑소좀 마커 CD9 및 CD81과 크기를 기반으로 특성화하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 대응하는 항체를 사용하여 대조군과 감염닭의 엑소좀에서 엑소좀 마커 CD9와 CD81을 검출하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 감염닭에서 얻은 엑소좀의 크기 범위는 105 내지 356 nm 였으며, 대조군의 평균 크기는 141 nm, 감염닭의 평균 크기는 145 nm 였다.
감염닭 및 비감염닭(대조군)의 엑소좀 RNA 발현을 분석하기 위해 small RNA 시퀀싱을 수행하였다. Small RNA 시퀀싱은 bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)를 사용하여 GRGg6a 닭 참조 genome와 비교하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다. 대조군과 감염닭에 대해 각각 35,050,510 및 34,735,378 read가 산출되었다. 대조군 닭의 경우 read의 81.58%(28,593,494)가 매핑되었고 감염닭의 경우 read의 82.94%(28,808,111)가 매핑되었다. 성숙 miRNA 농축을 정량화하기 위해, miRBase v22.1을 사용하여 대조군과 감염닭의 처리된 read를 비교하였다. 1,235개의 알려진 닭 miRNA 중, 대조군과 감염닭에서 각각 138개와 143개의 miRNA가 검출되었다.
miRNA의 차등 발현은 edgeR을 사용하여 배수 변화(fold change) 및 exactTest 값을 기초로 결정하였다. |배수 변화(fold change)| ≥ 2 및 exactTest raw P-value < 0.05를 나타내는 miRNA를 유의하게 차등 발현된 miRNA로 선택하였다. 감염닭과 대조군에서 차등 발현된 miRNA의 발현 수준을 비교한 볼케이노 플롯(volcano plot)을 도 2에 나타내었다. 검출된 107개의 miRNA 중, 유의미하게 차등 발현된 10개의 miRNA를 확인했으며, 그 중 5개(gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p)는 대조군과 비교하여 감염닭에서 상향 조절되고, 나머지 5개(gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594)는 대조군과 비교하여 감염닭에서 하향 조절되는 것으로 나타났다. 비감염닭과 비교하여 감염닭에서 차등 발현된 miRNA 10개의 서열은 표 3에 나타내었다. 감염닭과 대조군 사이에서 차등 발현된 miRNA의 배수 변화(fold change)는 도 3에 나타내었다. 차등 발현(DE) miRNA 중 gga-miR-128-3p는 3.97의 가장 높은 상향 조절된 배수(fold)를 나타냈으며, gga-miR-1594는 -9.20의 가장 높은 하향 조절된 배수 변화(fold change)를 나타내었다.
실시예 2. 표적 유전자에 대한 유전자 온톨리지(Gene Ontology; GO) 및 KEGG 경로 풍부도 분석
차등 발현(DE) miRNA의 표적 유전자는 miRDB 및 TargetScan 데이터베이스를 사용하여 예측하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, miRDB 및 TargetScan 데이터베이스를 사용하여 각각 총 1,873개 및 3,042개의 유전자가 표적 유전자로 예측되었으며, 도출된 두 데이터베이스를 사용하여 일반적으로 표적 유전자로 예측ㄷ된 922개를 유전자 온톨리지(GO) 및 KEGG 경로 풍부도 분석에 사용하였다. 그 결과, 도 5a 내지 도 6a에 나타낸 바와 같이, 상위 30개가 생물학적 과정, 분자 기능, 및 세포 구성요소 분류의 유전자 온톨리지 (GO)에서 유의하게 풍부한 것을 확인할 수 있었다. 전체 표적 유전자에 대하여 생물학적 과정, 분자 기능, 및 세포 구성요소 분류에서 각각 405, 71, 및 42 유전자 온톨리지(GO)가 할당된 것을 확인할 수 있었다.
도 6b에 나타낸 바와 같이, KEGG 경로 풍부도 분석에서 표적 유전자는 20개의 KEGG 경로에 풍부하게 존재하는 것으로 나타났으며, 특히 MAPK 신호 경로는 차등 발현(DE) miRNA의 표적 유전자로 농축되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 차등 발현(DE) miRNA와 면역 관련 표적 유전자 사이의 상호 작용을 시각화하여 도 7에 나타내었다. 총 268개의 면역 관련 유전자가 차등 발현(DE) miRNA의 표적 유전자로 예측되었다. 특히, 대부분의 면역 관련 유전자(69개)는 gga-miR-16c-5p 및 여러 유전자에 의해 조절되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. HPAIV RNA 분절(segment)을 표적으로 하는 차등 발현 miRNA
차등 발현(DE) miRNA가 바이러스 복제를 억제하는 역할을 할 수 있는 것으로 추측되었고 이러한 가정을 입증하기 위해, RNAhybrid를 사용하여 HPAIV H5N1 RNA 분절에서에서 10개의 차등 발현(DE) miRNA의 표적 위치를 예측하였다. 각 분절에 대해, 가장 낮은 MFE 값을 나타내는 miRNA의 표적 위치를 도 8에 나타내었다. 특히, 10개의 차등 발현(DE) miRNA 모두가 HPAIV RNA 분절을 표적으로 하는 것을 확인하였다. 표 4에 miRNA가 표적으로 하는 바이러스 Genome에서의 위치 및 대응하는 MFE 값을 나타내었다.
| RNA segments | miRNAs | Position (bp) | MFE (kcal/mol) |
| PB2 (2280 bp) |
miR-146a-5p | 441 | -25.0 |
| miR-130b-3p | 594 | -21.2 | |
| miR-193a-5p | 630 | -26.0 | |
| miR-142-5p | 1631 | -20.4 | |
| miR-128-3p | 1662 | -23.2 | |
| miR-210a-3p | 828 | -25.6 | |
| miR-16c-5p | 767 | -22.9 | |
| miR-99a-3p | 653 | -23.5 | |
| miR-20a-5p | 711 | -22.2 | |
| miR-1594 | 390 | -29.4 | |
| PB1 (2274 bp) |
miR-128-3p | 176 | -25.9 |
| miR-146a-5p | 1209 | -22.6 | |
| miR-142-5p | 1820 | -21.5 | |
| miR-193a-5p | 2156 | -26.9 | |
| miR-130b-3p | 2163 | -21.4 | |
| miR-210a-3p | 1559 | -26.0 | |
| miR-16c-5p | 1512 | -21.7 | |
| miR-99a-3p | 698 | -27.4 | |
| miR-20a-5p | 647 | -25.9 | |
| miR-1594 | 188 | -32.7 | |
| PA (2151 bp) |
miR-128-3p | 336 | -25.2 |
| miR-142-5p | 550 | -16.0 | |
| miR-146a-5p | 557 | -24.6 | |
| miR-130b-3p | 856 | -25.6 | |
| miR-193a-5p | 2151 | -27.9 | |
| miR-210a-3p | 105 | -27.3 | |
| miR-16c-5p | 1002 | -21.7 | |
| miR-99a-3p | 1674 | -23.0 | |
| miR-20a-5p | 717 | -22.9 | |
| miR-1594 | 645 | -28.9 | |
| HA (1704 bp) |
miR-130b-3p | 34 | -22.8 |
| miR-193a-5p | 560 | -24.8 | |
| miR-128-3p | 1123 | -24.9 | |
| miR-146a-5p | 1310 | -20.5 | |
| miR-142-5p | 1624 | -23.0 | |
| miR-210a-3p | 33 | -23.3 | |
| miR-16c-5p | 1668 | -21.6 | |
| miR-99a-3p | 425 | -26.7 | |
| miR-20a-5p | 426 | -23.0 | |
| miR-1594 | 917 | -25.9 | |
| NP (1497 bp) |
miR-142-5p | 196 | -19.1 |
| miR-128-3p | 295 | -24.3 | |
| miR-193a-5p | 458 | -28.7 | |
| miR-146a-5p | 927 | -21.0 | |
| miR-130b-3p | 1308 | -20.7 | |
| miR-210a-3p | 530 | -27.2 | |
| miR-16c-5p | 481 | -21.0 | |
| miR-99a-3p | 809 | -24.9 | |
| miR-20a-5p | 826 | -24.2 | |
| miR-1594 | 386 | -27.8 | |
| NA (1350 bp) |
miR-193a-5p | 204 | -25.5 |
| miR-130b-3p | 213 | -20.2 | |
| miR-128-3p | 533 | -20.3 | |
| miR-142-5p | 950 | -21.4 | |
| miR-146a-5p | 965 | -23.6 | |
| miR-210a-3p | 295 | -24.2 | |
| miR-16c-5p | 530 | -20.8 | |
| miR-99a-3p | 1249 | -25.8 | |
| miR-20a-5p | 470 | -21.8 | |
| miR-1594 | 421 | -29.3 | |
| M1/M2 (982 bp) |
miR-193a-5p | 190 | -26.4 |
| miR-146a-5p | 325 | -25.5 | |
| miR-130b-3p | 771 | -21.3 | |
| miR-142-5p | 870 | -20.9 | |
| miR-128-3p | 907 | -25.5 | |
| miR-210a-3p | 62 | -25.1 | |
| miR-16c-5p | 361 | -21.8 | |
| miR-99a-3p | 203 | -24.3 | |
| miR-20a-5p | 54.3 | -21.3 | |
| miR-1594 | 42 | -26.4 | |
| NS1/NS2 (829 bp) |
miR-142-5p | 30 | -19.1 |
| miR-128-3p | 281 | -28.4 | |
| miR-193a-5p | 395 | -26.1 | |
| miR-130b-3p | 520 | -18.5 | |
| miR-146a-5p | 535 | -22.8 | |
| miR-210a-3p | 31 | -24.3 | |
| miR-16c-5p | 383 | -17.9 | |
| miR-99a-3p | 409 | -22.3 | |
| miR-20a-5p | 215 | -23.6 | |
| miR-1594 | 87 | -29.0 |
실시예 4. 차등 발현 miRNA의 qRT-PCR 분석
small RNA 시퀀싱 결과를 검증하기 위해, 10개의 차등 발현(DE) miRNA 중 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-16c-5p의 발현에 대해 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 감염닭의 경우, gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-16c-5p 각각의 발현 수준이 대조군(비감염닭)과 비교하여 2.74배, 3.08배, 1.49배, 및 0.75배인 것을 확인할 수 있었다. 감염닭과 대조군에서 이러한 발현 패턴은 small RNA 시퀀싱 결과와 일치하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (23)
- 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 miRNA는 gga-miR-146a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 miRNA는 조류의 혈액으로부터 추출된 엑소좀 내 miRNA인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 혈액은 혈청, 전혈, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 miRNA의 표적 유전자는 면역 반응 관련 신호전달 경로에 관여하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 조성물.
- 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 miRNA는 gga-miR-146a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 miRNA는 조류의 혈액으로부터 추출된 엑소좀 내 miRNA인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 혈액은 혈청, 전혈, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 제제는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 조성물.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단용 키트.
- 제13항에 있어서,
상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단용 키트.
- 조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법으로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법.
- 제15항에 있어서,
상기 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 또는
상기 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우 조류 독감 바이러스에 감염된 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법.
- 제15항에 있어서,
상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스 진단을 위한 정보제공방법.
- 후보물질을 투여한 조류 독감 바이러스 감염 조류로부터 채취된 시료에서, 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조류 독감 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
- 조류 독감 치료제에 대한 반응자 특성화 방법으로서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
조류에서 채취한 시료에서, 엑소좀 유래 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우 조류 독감 치료제에 대한 반응자로 판정하는 단계,
상기 조류 독감 치료제는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, 및 gga-miR-130b-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 억제제 또는 gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조류 엑소좀 유래 miRNA의 촉진제인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제20항에 있어서,
상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 조류의 엑소좀 유래 마이크로RNA(miRNA)를 포함하는 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로서,
상기 miRNA는 gga-miR-128-3p, gga-miR-142-5p, gga-miR-146a-5p, gga-miR-193a-5p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-210a-3p, gga-miR-16c-5p, gga-miR-99a-3p, gga-miR-20a-5p, 및 gga-miR-1594로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조류 독감 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물.
- 제22항에 있어서,
상기 조류 독감 바이러스는 H5N1 조류 독감 바이러스인 것을 특징으로 하는, 항바이러스용 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230024732A KR20230129153A (ko) | 2022-02-28 | 2023-02-24 | 엑소좀을 이용한 조류 독감 바이러스 진단용 바이오마커 및 이의 이용 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101887876B1 (ko) | 2016-08-18 | 2018-08-13 | 한국과학기술연구원 | H5형 조류독감 바이러스에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 이를 이용하는 h5형 조류독감 바이러스의 검출방법 |
-
2023
- 2023-02-24 KR KR1020230024732A patent/KR20230129153A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101887876B1 (ko) | 2016-08-18 | 2018-08-13 | 한국과학기술연구원 | H5형 조류독감 바이러스에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 이를 이용하는 h5형 조류독감 바이러스의 검출방법 |
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