KR20230125923A - 우슨아민 a를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

우슨아민 a를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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KR20230125923A
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유희민
조남기
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한국표준과학연구원
전남대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 우슨아민 A를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 우슨아민 A(usenamine A) 및 이를 함유하는 약학 조성물은 세포사멸 및 자가포식의 촉진을 통해 MDA-MB-231 암세포의 성장을 효율적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 UBA5의 억제를 통한 암 치료에 적용이 가능하다.

Description

우슨아민 A를 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising usnic acid or derivative thereof}
본 발명은 우슨아민 A를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
최근 몇 년 동안 유방암은 여성에게 가장 흔한 형태의 암이자, 두 번째로 흔한 암 관련 사망을 초래하고 있다. 세계 보건기구(WHO) 산하 국제 암 연구소(IARC)가 발표한 최신 글로벌 암 데이터에 의하면, 전 세계적으로 가장 많이 진단되는 암이 종래 폐암에서 226만 건의 신규 발병률을 기록한 유방암으로 대체되었다.
지난 수십 년 동안 유방암의 여러 아형(subtypes)은 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2의 발현을 기준으로 분류되었다. 기저 유사(basallike) 또는 삼중 음성 유방암(triple-negative breast cancer; TNBC)은 아서 언급한 수용체의 발현이 결여된 아형이며, 모든 침습성 유방암 사례의 약 15%를 차지한다.
단일 클론 항체이나 면역 관문 억제제인 아테졸리주맙(atezolizumab)이 현재 TNBC의 치료에 승인되었으나, TNBC의 치료를 위해 병원에서 제공하는 확실하고 효과적인 소분자 약물은 여전히 부족하다.
세포사멸(apoptosis) (I형 세포사라고도 함) 및 자가포식(II형 세포사라고도 함)은 예정세포사(programmed cell death)의 두 가지 중요한 기전이다. 세포사멸은 원형질 막 수포, 핵 및 염색질 응축, 미토콘드리아 막 전위의 약화를 포함하는 형태학적 및 구조적 변화를 특징으로 하며, 자가포식은 손상된 세포질 단백질 또는 세포 소기관이 분해되고, 리소좀으로 전달되어 세포 항상성을 유지하는데 재활용되는 중요한 이화 세포 작용(catalitic cell process)이다. 자가포식은 주로 세포 생존을 촉진하지만, 지속적인 활성화는 자가포식 세포사 또는 세포사멸을 유도할 수 있다. 또한, 다양한 스트레스 경로를 통해, 같은 세포에서 세포사멸과 자가포식이 동시에 일어날 수도 있다.
유비퀴틴화(ubiquitination)와 유사하게, UFMylation 시스템은 UFM1의 표적 단백질에 대한 접합을 촉진한다. 일반적으로, UFMylation 시스템은 약리학적 소포체 스트레스(endoplasmic reticulum stress; ER stress)에 따라 활성화되고, 비정상적인 조건에서 세포를 보호한다. 종래 연구 결과에 의하면, UFMylation 시스템의 억제를 통해 다양한 종양에 대한 효과적인 치료가 가능하다.
UBA5는 UFMylation 시스템에서 필수적인 역할을 하는 E1 활성화 효소이다. 종래 연구에서는 UBA5의 넉다운(knockdown)이 유방암의 성장을 효과적으로 예방하거나, UBA5의 선택적 억제가 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 췌장암의 발병을 방해할 수 있음을 확인하였다. UBA5는 암 치료의 유망한 표적이지만, 문헌상으로는 두 가지 UBA5 억제제(inhibitor)만이 보고된 바 있어, 이에 대한 해결이 절실한 상황이다.
중국 등록특허공보 제107149600 B호(2021.03.09).
상기와 같은 문제점의 해결을 위해 본 발명에서는 암, 특히 유방암의 치료에 유용한 천연물인 (Usnea longissimi)의 추출물을 이루는 성분인 우슨아민 A(usenamine A)를 함유하는 약학 조성물을 제공하고자 하였다.
본 발명의 일 양태에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 화학식 1로 이루어진 우슨아민 A를 유효성분으로 함유할 수 있다.
[화학식 I]
본 발명의 일 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 암은 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA), 자궁 경부 편평세포 암종(cervical squamous cell carcinoma, CESC) 및 결장 선암종(colon adenocarcinoma, COAD)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 암은 UBA5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5)를 과발현하는 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA)일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 우슨아민 A는 UBA5의 ATP 결합 포켓(ATP binding pocket)에 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 우슨아민 A는 G2/M 단계에서 위상 정지(phase arrest) 또는 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 유발하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따른 의약용 제제는 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 암 예방 또는 치료방법은 하기 화학식 1로 이루어진 우슨아민 A를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
[화학식 I]
본 발명의 일 예에 따른 암 예방 또는 치료방법에 있어서, 상기 우슨아민 A는 10 uM 내지 20 uM의 농도로 투여하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 암 예방 또는 치료방법에 있어서, 상기 암은 UBA5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5)를 과발현하는 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA)일 수 있다.
본 발명을 통해, 우슨아민 A(usenamine A) 및 이를 함유하는 약학 조성물은 세포사멸 및 자가포식의 촉진을 통해 MDA-MB-231 암세포의 성장을 효율적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 UBA5의 억제를 통한 암 치료에 적용이 가능하다.
도 1은 UBA5의 발현 수준 및 생존 분석 검증에 관한 것이고,
(A, B) 각각 GEPIA 및 UALCAN 공개 데이터베이스를 기반으로 하는 UBA5의 mRNA 발현 수준, (C) Human Protein Atlas 데이터베이스에서 얻은 다양한 정상 조직의 UBA5 단백질 발현 수준, (D) 각 유형의 암에 대한 Human Protein Atlas 데이터베이스를 기반으로 하는 암 환자의 UBA5 단백질 발현을 나타내고, 색으로 구분된 막대는 단백질 발현 수준이 높거나 중간인 환자(최대 12명)의 비율을 나타냄, (E) 유방암에서 UBA5의 전체 생존 분석 (TPM: transcripts per million)
도 2는 PPI 네트워크 및 GO 분석에 관한 것이고,
(A) UBA5의 PPI 네트워크, (B) 생물학적 공정(biological processes), (C) 세포 구성 요소, (D) 분자 기능, 버블의 크기는 관련된 유전자의 수를 나타내며, 밝은 색상은 더 작은 p-값을 나타냄
도 3은 우슨아민 A의 항-증식 및 항-침투 능력에 관한 것이고,
(A) 우슨아민 A의 화학 구조, (B) MTT 시험을 통한 MDA-MB-231 세포 생존력 분석, 결과는 상대 세포 생존율(%)로 표시, (C) MCF-7 세포의 세포 생존율, (D) 정상 세포에 대한 우슨아민 A의 세포 독성, (E) 우슨아민 A에 의한 MDA-MB-231 세포의 집락 형성 능력 억제, (F) 트랜세웰 시험에 의해 검출된 우슨아민 A에 의한 MDA-MB-231 세포의 침습 능력 억제, (G) 48시간 동안 우슨아민 A로 처리한 후 5-에티닐-20-데옥시우리딘(EdU)-양성 MDA-MB-231 세포 수, 막대 차트에서 데이터는 평균 ± 표준편차(n=3)을 나타내고, 대조군 그룹에 대해 *p<0.05, **p<0.01 및 ***P<0.001
도 4는 우슨아민 A로 처리한 MDA-MB-231 세포의 세포 사멸 및 세포 주기 분포 분석에 관한 것이고,
(A, B) 48시간 동안 우슨아민 A를 0, 5, 10, 20 uM 처리한 후 유세포 분석을 통해 결정된 세포사멸, 세포사멸율은 초기 세포사멸 비율과 후기 세포사멸 비율의 합, (C) 세포사멸 관련 단백질의 대표적인 웨스턴 블롯, 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표하거나, 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차, (D, E) 48시간 동안 우슨아민 A를 0, 5, 10, 20 uM 처리한 후 유세포 분석을 통해 결정된 세포 주기 분포, (F) G2/M 관련 단백질의 대표적인 웨스턴 블롯. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차를 나타내고, 대조군 그룹에 대해 *p<0.05, **p<0.01 및 ***P<0.001
도 5는 MDA-MB-231 암세포에서 우슨아민 A로 유도된 ER 스트레스 및 자가포식에 관한 것이고,
(A) MDA-MB-231 세포에서 UBA5 발현의 웨스턴 블롯 분석 결과로, 세포를 0, 5, 10, 20 uM 농도의 우슨아민 A와 함께 배양, (B) MDA-MB-231 세포에서 ER 스트레스 관련 단백질의 웨스턴 블롯 분석, 세포를 표준 성장 배지에서 48 시간 동안 5, 10, 20 uM 농도의 우슨아민 A와 함께 배양, (C) MDA-MB-231 세포에서 ER 스트레스 관련 단백질의 웨스턴 블롯 분석, 세포를 표준 성장 배지에서 0, 4, 8, 12, 24시간 동안 10 uM 약물과 함께 배양, (D) MDA-MB-231 세포에서 자가포식 관련 단백질의 웨스턴 블롯 분석, 세포를 다양한 5, 10, 20 uM 농도의 우슨아민 A와 함께 48시간 동안 배양, (E) MDA-MB-231 세포에서 자가포식 관련 단백질의 대표적인 웨스턴 블롯, 세포를 표준 성장 배지에서 배양하고 0, 4, 8, 12, 24시간 동안 10 uM 약물과 함께 배양, *p<0.05, **p<0.01 및 ***P<0.001
도 6은 UBA5의 과발현이 MDA-MB-231 세포에서 자가포식 활동을 억제한 것에 관한 것이고,
(A) UBA5의 과발현 유무에 따른 MDA-MB-231 세포에서 UBA5 및 LC3B 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석, 세포를 UBA5로 24시간 동안 형질감염한 후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하고 세포를 10, 20 uM 우슨아민 A로 처리하거나 처리하지 않은 채로 두었다, (B) RFP-LC3B(빨간색)의 면역 형광, 세포를 UBA5 및 RFP-LC3B로 24시간 동안 형질감염한 후, 세포를 표준 성장 배지에서 배양하고, 10, 20 uM 우슨아민 A로 처리하거나 처리하지 않은 채로 두었다. *p<0.05, **p<0.01 및 ***P<0.001
도 7은 UBA-UFM1 복합체를 사용한 우슨아민A의 계산된 결합 모드에 관한 것이다.
(A) ATP 결합 포켓의 개요, (B) 잠재적 결합 포켓의 개요, (C) ATP 결합 포켓에서 우슨아민 A의 결합 모드, (D) 잠재적 결합 포켓에서 우슨아민 A의 결합 모드, (E) ATP 결합 포켓에서 우슨아민 A의 2D 표현, (F) 잠재적 결합 포켓에서 우슨아민 A의 2D 표현
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "성분", "조성물", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약학적 활성제", "활성제", "치유" "치료법" "치료" 또는 "약제"는 대상체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 화합물(들) 또는 물질의 조성물을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료법"(뿐만 아니라 그의 상이한 형태)는 예방적 (예: 예방적 치료), 치유적 또는 경감성 치료를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료하는"은 상태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 유해 또는 부정적 효과 또는 증상을 경감시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 본 발명의 용어 "예방", “개선” 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중 하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 화학식 1로 이루어진 우슨아민 A를 유효성분으로 함유할 수 있다.
[화학식 I]
상기 암의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 일예로 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA), 자궁 경부 편평세포 암종(cervical squamous cell carcinoma, CESC) 및 결장 선암종(colon adenocarcinoma, COAD)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 UBA5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5)를 과발현하는 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA)일 수 있으며, 상기 암에 대한 자가 포식 및 세포사멸 유도 효과가 현저히 우수하다.
상기 우슨아민 A는 작용 기전 상 UBA5의 ATP 결합 포켓(ATP binding pocket)에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 이를 통해 상기 우슨아민 A는 암세포에 대해 G2/M 단계에서 위상 정지(phase arrest) 또는 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 유발하여 암 세포의 증식 및 성장을 차단하는 효과가 있다.
상기 약학 조성물은 상기 약학 조성물을 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비제한적으로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형이 바람직하며 이 중에서도, 과립, 분말 펠렛의 제형이 가장 바람직하다. 이외의 제형으로, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 암 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 당업자에게 인식될 수 있는 각종 치료법 및 다른 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 등과 함께 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 주사제, 캡슐제, 환제, 정제, 용액제 등의 경구 투여제, 발포제, 패치제, 페이스트제 등의 피부 도말 제제, 현탁제 또는 분무제의 제형일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 고상 투여형 또는 액상 투여형일 수 있으며, 경구, 비경구, 비내, 구소, 구강, 설하, 기도 분사 또는 직장 투여용일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따른 의약용 제제는 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따른 암 예방 또는 치료방법은 하기 화학식 1로 이루어진 우슨아민 A를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
[화학식 I]
상기 우슨아민 A는 특별히 제한되는 것은 아니나, 일예로 6 내지 50 uM, 좋게는 8 내지 35 uM, 더욱 좋게는 10 uM 내지 20 uM의 농도로 투여하는 것일 수 있으며, 상기 범위에서 암 세포에 대한 자가포식 또는 세포사멸 효과가 향상될 수 있어 바람직하다.
상기 암의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, UBA5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5)를 과발현하는 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA)일 수 있으며, 상기 암에 대해 상대적으로 현저히 높은 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
상기 투여 시, 투여 방식은 특별히 제한되는 것은 아니나, 일예로 경구 복용될 수 있으며, 다른 방법으로는 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수도 있다. 상기 투여 시, 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 투여의 방법과 투여량 등의 변수가 결정된다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[재료/시약/방법]
1. 생물정보학 분석
다양한 종류의 종양에서 UBA5 발현 수준을 측정하기 위해 GEPIA 데이터베이스(Gene Expression Profiling Interactive Analysis; Available online: https://www.gepia.cancer-pku.cn/) 및 UALCAN 분석 도구(Available online: https://www.ualcan.path.uab.edu/)를 사용하였다.
환자는 사분위수(quartiles)를 이용하여 두 그룹으로 나누고, 평균 생존 시간(median survival)을 계산하였다.
2. 유전자 온톨로지(gene ontology, GO) 분석
기능적 단백질 결합 네트워크(functional protein association network)는 STRING(Available online: https://www.string-db.org/)을 이용하여 분석하였고, 유전자 온톨로지 분석은 DAVID(Huang et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37, 1-13)를 이용하여 수행하였다.
3. 세포 배양
인간 백인 유방 선암종 세포주인 MDA-MB-231은 한국 세포주 은행(KCLB, 대한민국)에서 구입하였다.
MDA-MB-231 세포의 배양을 위해, 세포는 소 태아 혈청(FBS) 1x 항생제/항진균제(Gibco, Germany)가 보충된 RPMI-1640(Gibco, Germany) 배지를 포함하는 37℃, 5% CO2 분위기의 배양 플라스크에 주입하였다.
4. 세포 생존 분석
우슨아민 A 처리 시, MDA-MB-231 암세포의 세포 증식을 다음과 같이 측정하였다.
총 8 x 103개의 세포를 96웰 플레이트에 분주하고, 밤새 배양한 후, 서로 다른 농도의 약물에 48시간 노출시켰다.
이후, MTT((3-4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2 tetrazolium bromide) 용액을 각 웰에 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2 분위기에서 4시간 배양하였다.
배양액을 제거하고, 각 웰에 5 uL DMSO를 첨가하여, 포르마잔 결정을 용해시켰다.
세포 생존은 생성된 용액을 분광광도계(DTX880, Beckman Coulter, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 판독하여 측정하였다.
5. 현미경 분석
MDA-MB-231 세포의 형태 변화 분석은, 위상차 현미경(phase-contrast microscope)을 이용하여 수행하였다.
우슨아민 A 처리 24시간 후 및 48시간 후에 세포의 현미경 사진을 촬영하여 세포 수의 변화를 분석하였다.
6. 콜로니 형성 분석
MDA-MB-231 세포를 12웰 접착 배양 플레이트에 800개 세포/웰의 밀도로 분주하여 밤새 부착되도록 하였다. 세포를 37℃의 표준 성장 배지에서 15일 동안 배양하고, 5, 10 및 20 uM의 우슨아민 A와 함께 각각 배양하여 콜로니 성장을 평가하였다.
콜로니를 PBS(phosphate-buffered saline)으로 2회 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 15분간 고정한 후, 0.04% 크리스탈 바이올렛으로 15분간 염색하였다.
증류수로 2회 세척한 후, 콜로니를 광학현미경으로 관찰하였다. 이 때 콜로니는 3개의 독립적인 실험을 통해 계산되었다.
7. EdU(5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine)을 이용한 염색 시험
EdU 염색 시험을 위해 MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에 분주하였다.
48시간 동안 처리한 후, 50 uM EdU 용액을 가하고, 세포를 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 EdU 염색 증식 키트(EdU staining proliferation kit; Beyotime, Shanghai, China)로 처리하고, Nikon 형광 현미경으로 관찰하였다.
8. 세포 주기(cell cycle) 분포 분석
상기 설명한 것과 동일하게 MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에서 배양하고, 우슨아민 A로 처리하였다. 이어서 트립신 처리 후, 세포를 수집하여 PBS로 세척하고, 4℃에서 70% 에탄올에 24시간 고정시켰다.
세포를 다시 PBS로 세척한 다음, 실온에서 50 ug/mL 프로피디움 요오드(propidium iodide, PI) 및 100 ug/mL의 Rnase 용액으로 30분간 염색하였다.
세포 주기 분포는 FACSalibur 유세포 분석기(BD Biosciences, NJ, USA)를 사용하여 평가하였다.
9. 세포사멸(apoptosis) 분석
세포사멸 분석은 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD Biosicences, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
먼저 세포를 24시간 동안 6웰 플레이트에 접종하여 방치하고, 48시간 동안 우슨아민 A를 처리하였다. 이후, 세포를 수확하여 PBS로 세척한 후, 1x 결합 완충액(binding buffer)에 재현탁하였다.
이어서 5 uL 프로피움 요오드(PI) 및 5 uL FITC Annexin V를 첨가하고, 15분간 배양한 후, 400 uL 1x 결합 완충액을 튜브에 첨가하고, 유세포 분석기(BD Biosciences, NJ, USA)로 염색된 세포를 분석하였다.
10. 트랜스웰(transwell) 시험
세포 침습의 분석을 위해, Transwell® 투과성 지지체, 폴리카보네이트 멤브레인(Corning Incorporated, Corning, NY, USA)을 사용하였다.
세포를 처리한 후, 무혈청 배지를 사용하여 1 x 106 개/mL의 농도가 되도록 제조하였다.
세포를 50 uL 마트리겔(Matrigel) 코팅된 Transwell 삽입물에 플레이팅하고, 10% FBS를 함유한 600 uL 배지를 하부 챔버(lower chamber)에 첨가하였다.
제조된 100 uL 세포 현탁액을 각 그룹에서 상부 챔버(upper chamber)로 피펫팅한 후, 24웰 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.
24시간 경과 후, 챔버의 액체와 세포를 버리고, 세포를 미리 데운 PBS로 3회 세척한 후, 실온에서 15분간 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 챔버 멤브레인 상의 세포를 재증류수(DDW)로 3회 세척하였다. 그런 다음 크리스탈 바이올렛으로 5분간 세포를 염색하고, 다시 재증류수와 30% 빙초산을 함께 사용하여 챔버를 헹궈 크리스탈 바이올렛 용액을 형성시켰다.
마지막으로 560 nm에서 용액의 흡광도를 측정하였다.
11. 플라스미드 형질감염
플라스미드 pCMV-Tag3-UBA5 (구입처, 국가) 및 RFP-LC3B (구입처, 국가)는 폴리에틸렌이민(PEI) 시약을 이용하여 형질감염시켰다. 플라스미드 발현은 24시간 동안 허용하였다.
12. 웨스턴 블롯(western blot) 시험
세포는 용해한 후 10분간 가열하였다. 이어서, 단백질은 SDS-PAGE로 분리한 후, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 5% 분유에서 블로킹한 다음, 1x TBST로 1.5시간 세척한 후, 상기 PVDF 막을 이하 Santa Cruz Biotechnology(TX, USA) 또는 Cell Signaling Technologies(MA, USA)에서 구입한 Bax, Cleaved-caspase-3, Bcl-2, Cyclin B1, Cdc2, Cyclin A, Bip, Ire1α, Perk, Chop, p62, LC3B, Beclin1, p62, Atg-7, UBA5 및 GAPDH에 대한 1차 항체(primary antibodies)와 함께 배양하였다.
ECL 웨스턴 블롯 검출 시약은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였으며, 추가 분석은 ChemiDoc MP(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 수행하였다.
13. RFP-LC3B 부점 시험(Puncta Assay)
자사포식 분석은 오토파고솜(autophagosome)의 형광 부점의 형성을 시험하여, RFP-LC3B로 형질감염된 세포를 사용하여 수행하였다. 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 6웰 플레이트에서 2 ug/mL RFP-LC3B 플라스미드로 형질감염되었다.
24시간 동안 형질감염시킨 후, 세포를 다른 조건에서 처리하였다. 이미지는 형광 현미경을 이용하여 획득하였다.
14. 분자 도킹(Molecular docking)
ChemOffice 15.0(ChemOffice, MA, USA)를 사용하여 우슨아민 A의 3차원 구조를 구성하고, 에너지 최소화를 수행하였다. UBA5-UFM1 복합체(PDB ID: 6h77)의 결정 구조는 PDB(Protein Data Bank, Available online: https://rcsb.org).
구조 최적화 과정에 따라, AutoDockTools(Scripps Research Institute, CA, USA)를 사용하여 우슨아민 A 분자 및 UBA5 단백질을 pdbqt 형식으로 준비하였다. 이 때, 분자 도킹 프로그램은 Autodock4(Scripps Research Institute, CA, USA)를 사용하였으며, PyMOL 2.4(NY, USA) 및 LigPlot 1.4(European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK)를 사용하여 시각화하였다.
ATP 결합 포켓(ATP binding pocket)의 격자 상자 크기(grid box size)는 x, y 및 z축에 대해 각각 42 Å, 44 Å 및 44 Å로 설정하였고, 격자 중심(grid center)는 x, y 및 z축에 대해 각각 10.032 Å, 9.421 Å 및 78.333 Å이다.
또한, UFM1과 UBA5 사이의 잠재적 결합 포켓(potential binding pocket)의 그리드 상자 크기는 x, y 및 z축에 대해 각각 86 Å, 84 Å 및 88 Å로 설정하였고, 격자 중심은 x, y 및 z축에 대해 각각 24.488 Å, 14.346 Å 및 90.199 Å이다.
상기 분자 도킹 계산에는 라마키안 유전 알고리즘(Lamarckian genetic algorithm; LGA)를 적용하였다.
15. 우슨아민 A의 분리
우슨아민 A의 분리를 위해, 우스네아 롱기시미(Usnea longissimi)의 지상 부분의 에틸 아세테이트 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 적용하고, 100:1~1:100 (v/v)의 디클로로메탄(CH2Cl2)-메탄올(MeOH) 용매 혼합물로 용출하여 E1-E7의 7개 분획을 얻었다.
이 중 E3 분획은 20%~90% 메탄올을 이용한 RP C-18-MPLC를 이용하여 추가로 분리하였다. 순도 98% 초과의 우슨아민 A(S1-S5)는 물에 70% 아세토니트릴(CH3CN)이 포함된 반 분취(semi-preparative) HPLC를 사용하여, 하위 분획 E3-7을 분리한 후 수득하였다.
16. 통계 분석(Statistical Analysis)
데이터는 스튜던트 양측 t-검정(Student's two-tailed/unpaired t-test)를 이용하여 분석하였다. P-값은 도면에 표시하였다(*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001).
[실시예 1] UBA5 발현 분석
다른 유형의 암에서 UBA5의 mRNA 발현 레벨은 상기 GEPIA 및 UALCAN 데이터베이스로부터 확보하였다.
상기 발현 분석 방법에 따라 UBA5 mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 도 1에 도시하였다.
이로부터, UBA5는 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA), 자궁 경부 편평세포 암종(cervical squamous cell carcinoma, CESC) 및 결장 선암종(colon adenocarcinoma, COAD)을 포함한 여러 종양 유형에서 상향 조절(upregulation)되었다(도 1A). 반면, 난소 장액성 낭선암(ovarian serous cystadenocarcinoma, OV)에서 UBA5는 종양 샘플보다 정상 샘플에서 더 높게 발현되었는데, 이는 UALCAN 데이터베이스에서도 확인된 결과이다(도 1B).
추가로, UBA5의 차별적 발현을 확인하기 위해, 인간 단백질 아틀라스 데이터베이스(Human Protein Atlas Database, Available online: https://www.proteinatlas.org/)를 사용하여, 단백질 발현 수준을 평가한 결과, UBA5는 난소 등 다른 인간의 조직 대비 유방에서 더 많이 발현되는 것을 확인하였다(도 1C).
또한, 가장 높은 UBA5 발현에 따른 상이한 암 환자의 백분율 순위로 나열한 바와 같이, UBA5는 유방암 환자에서 과발현되었다(도 1D).
또한, 생존 분석 결과는 UBA5가 좋지 않은 예후와 관련되어 있음을 시사한다(도 1E).
상기 결과로부터, 유방암에서 UBA5의 고발현을 확인하였으며, UBA5 발현은 유방암 환자의 위험 인자일 수 있다는 것을 시사한다.
[실시예 2] PPI (protein-protein interaction) 네트워크 및 유전자 온톨로지 분석
UBA5의 생물학적 역할(biological role)을 특성화하기 위해 유전자 온톨로지 분석을 상기 방법으로 수행하였다.
UBA5를 중심으로, PPI 네트워크를 STRING을 통해 최초 구성하였다. 이 때 전체 21개의 메인 노드(main node)가 포함되었다(도 2A). 유전자 온톨로지 해석을 위해, 생물학적 공정(biological process, BP), 세포 조성(cell composition, CC) 및 분자 기능(molecular functionm, MF)의 세 가지 측면을 고려하였다.
이로부터 10개의 가장 유의한 유전자 온톨로지 용어가 시각화되었으며, 이를 도 2B-2D에 도시하였다.
그 결과 상위 10개의 BP 용어에는 protein NEDDylation, protein K69-linked UFMylation, protein UFMylation, NIK/NF-kappaB signaling, transcriptioncoupled nucleotide-excision repair, mRNA splicing 및 transforming growth factor beta receptor signaling pathway가 포함되었고(도 2B), 대부분의 상위 BP 용어는 번역 후 변성(post-translational modification)과 연관되었다.
또한, MF 용어에서 대부분의 항목은 유비퀴틴-단백질 리가아제(ubiquitin-protein ligase) 활성과 같은 유비퀴틴화에 집중되었다(도 2C). 최상위 CC 용어는 catalytic step 2 spliceosome, cytosol 및 Prp19 complex로 구성되었다.
[실시예 3] 우슨아민 A는 MDA-MB-231 세포의 증식 및 침습을 억제한다
우슨아민 A의 세포 독성 확인을 위해 상기 방법으로 MDA-MB-231 세포에 다양한 농도의 우슨아민 A를 처리한 후, MTT 시험을 통해 세포 생존율을 조사하였다.
그 결과, 우슨아민 A는 기저-유사(basal-like) 유방암(MDA-MB-231 및 Hs578T) 및 내강 유방암(MCF-7) 세포 모두의 세포 생존율을 용량 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 3B, 3C 참조). 또한, 우슨아민 A가 정상 유방 세포에 대해 더 낮은 세포 독성을 갖는다는 중요한 결과를 확인하였다(MCF-10A, 도 3D 참조).
콜로니 형성 분석 결과, 약물 처리군에서는 콜로니 수의 감소가 관찰된 반면(도 3E), 20 uM 농도에서는 콜로니 형성이 거의 되지 않았다.
또한, 유방암 세포 증식에 대한 우슨아민 A의 효과를 추가로 하기 위해 상기 방법으로 EdU 시험을 수행하였다. 그 결과, 우슨아민은 EdU-양성 세포의 수를 유의적으로 감소시켰으며, 10 uM 및 20 uM 농도에서 EdU-양성 세포는 거의 관찰되지 않았다(도 3E).
이어서, 전이(metastasis)가 유방암 환자의 주요 사망 원인이라는 점을 감안하여, 상기 트랜스웰(transwell) 시험을 통해 MDA-MB-231 세포 침윤에 대한 우슨아민 A의 영향을 측정하였다. 그 결과, 우슨아민 A는 트랜스웰 필터를 유방암 세포의 침윤을 용량 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였고, 10 uM 및 20 uM 농도로 우슨아민 A를 처리한 후, 침윤 세포는 단지 3.6% 및 0.45%각각 관찰될 뿐이었다(도 3F).
상기 결과는 우슨아민 A는 유방암 세포의 악성 증식 및 침윤을 효과적으로 억제한다는 점을 시사한다.
[실시예 4] 우슨아민 A는 MDA-MB-231 세포의 세포 사멸(apoptosis) 및 G2/M 위상 정지(phase arrest)를 유도한다.
세포사멸 및 세포 주기 분포는 상기 유세포 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정하였다.
이로부터, 세포사멸은 우슨아민 A에 의해 용량 의존적으로 유도되는 것을 확인하였다(도 4A, 4B). 또한, 웨스턴 블롯 결과, 우슨아민 A의 처리가 절단된 카스파제-3의 발현 수준을 증가시키며, Bcl-2의 발현 수준을 감소시켜, 유세포 분석 결과와 일치하는 것을 확인하였다(도 4C). 다만 Bax의 변화는 크지 않았다.
또한, 상기 세포 주기 분포 분석을 통해 우슨아민 A는 MDA-MB-231 세포가 용량 의존적으로 G2/M 단계에서 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 겪도록 유도하는 것을 확인하였다(도 4D, 4E).
또한, 상기 웨스턴 블롯 시험을 통해 우슨아민 A의 처리가 Cyclin B1, Cdc2 및 Cyclin A의 발현을 용량 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 4F).
상기 결과는 우슨아민 A가 MDA-MB-231 세포에서 세포사멸 및 G2/M 위상 정지를 유도한다는 것을 입증한다.
[실시예 5] 우슨아민 A는 ER 스트레스를 활성화하고, MDA-MB-231 세포에서 자가포식을 유도한다
여러 보고에 의하면, UFMylation은 소포체(ER) 스트레스에 관여하며, UFMylation 활성화는 세포사멸 및 자가포식을 유발할 수 있다.
상기 실시예로부터 얻은 결과인, 우슨아민 A가 유방암 세포에서 UBA5 세포 발현을 용량 의존적으로 억제한다는 점을 고려하여, ER 스트레스를 활성화하고 자가포식을 유도할 수 있는지 여부를 측정하였다(도 5A).
그 결과, 우슨아민 A 처리는 용량 의존적으로 Bip, Perk 및 Chop의 발현을 유의적으로 증가시킨 반면, Ire1α는 유의적인 변화를 나타내지 않았다.
또한 MDA-MB-231 세포에 10 uM 농도의 우슨아민 A를 처리하고, Bip 및 Perk의 발현 수준을 0, 4, 8, 12, 24 시간의 5가지 시점에서 측정한 결과, Bip의 발현은 12시간 시점에서 급격히 증가하였으며, Perk의 발현도 시간 의존적으로 유의하게 증가한 것을 확인하였다(도 5C).
또한, 우슨아민 A의 처리는 시간 의존적으로 LC3B의 발현 수준을 높이는 것을 확인하였다(도 5E).
상기 결과는 우슨아민 A가 소포체 스트레스를 활성화하고, MDA-MB-231 세포에서 자가포식을 유도할 수 있음을 시사한다.
[실시예 6] UBA5 과발현은 MDA-MB-231 세포에서 자가포식을 감소시킬 수 있다
우슨아민 A에 의해 유도된 자가포식에서 UBA의 역할을 추가로 조사하기 위해, UBA5 과발현 플라스미드 및 RFP-LC3B 플라스미드를 상기 방법으로 제작하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 세포를 RFP-LC3B 및 UBA5 과발현 플라스미드(UBA5+) 또는 RFP-LC3B 플라스미드(UBA5-)로 형질감염시켰다.
24시간 배양 후, 0, 10 20 uM로 각각 우슨아민 A를 처리하였다.
웨스턴 블롯 결과, UBA5 과발현 플라스미드로 형질감염시킨 후, UBA5의 발현이 증가된 것을 확인하였다(도 6A).
UBA5를 과발현시킨 후, 우슨아민 A를 처리한 세포는, 그렇지 않은 그룹과 비교하여 유의한 UBA5 발현 억제를 나타내지 않았다.
우슨아민 A는 20 uM 농도에서 약간의 UBA5 억제 활성을 나타내었다.
우슨아민 A를 처리하지 않은 UBA5와 비교하여, 마찬가지로 우슨아민 A를 처리하지 않은 UBA5 과발현 그룹에서 LC3B 발현이 감소한 것을 확인하였다.
그러나, 우슨아민 A 처리 후 LC3B의 발현 증가가 다시 관찰되었으며, 이는 우슨아민 A가 UBA5의 과발현에 의해 유도된 자가포식의 억제를 뒤바꿀 수 있음을 나타낸다.
RFP-LC3B 부점 형성 시험(puncta formation assay)에서도 이와 유사한 결과가 얻어졌는데, 우슨아민 A 미처리 그룹에서 24시간 경과 시점에서 UBA45를 과발현한 후, 약화된 LC3B-양성 부점을 확인할 수 있었다(도 6B). 또한, 우슨아민 A 처리한 세포는 LC3B-양성 부점이 증가하였다.
상기 결과는, UBA5 과발현이 자가포식 흐름(autophagic flux)를 억제하고, 차례로 우슨아민 A에 의해 뒤바뀐 것임을 시사한다.
[실시예 7] UBA5의 우슨아민에 대한 분자 도킹(molecular docking)
UBA5와 상호작용하는 우슨아민 A의 가능성을 더 조사하기 위해, 상기 방법으로 분자 도킹을 수행하였다.
구체적으로, UBA5-UFM1 복합체(6h77)의 결정 구조는 PDB(Protein Data Bank) 데이터베이스에서 다운로드하였다. UBA5-UFM1 복합체의 구조는 두 개의 결합 가능한 포켓이 있음을 보여주었다. 이 중 한 곳은 UFM1과 UBA5 사이로 간주되며, UFM1 및 UBA는 각각 노란색 및 녹색으로 표시하였다.
분자 도킹 결과, Asn112, Arg115, Ala251, Val249 및 Lys245를 포함하여 수소 결합이 다수 형성된 것으로 나타났으나, ATP 포켓에 결합하는 우슨아민 A의 도킹 스코어는 -5.43 kcal/mol에 불과하였다(도 7C).
게다가, ATP 포켓에 결합하는 우슨아민 A의 2차원(2D) 표현은 소수성 상호작용(hydrophobic interactions)이 더 적은 것으로 나타났다(도 7E).
도 7D는 -10.52 kcal/mol의 결합 에너지로 잠재적인 결합 포켓(potential binding pocket)에서 우슨아민 A의 최적의 형태를 보이며, 이는 ATP 결합 포켓에 대한 결합 에너지보다 현저히 높다.
이 경우, 우슨아민 A의 C14 및 C5 위치에 있는 산소 원자는 UBA5의 His215 및 Tyr282 잔기와 각각 2개의 강한 수소 결합을 형성하였다.
또한, C11 위치의 NH2 그룹은 UBA5의 Gln217 잔기의 주쇄 아미노 그룹의 산소 원자와 수소 결합에 관여하는 반면, C9 위치의 산소 원자는 UMF1의 Thr46과 또 다른 수소 결합을 형성하였다. 또한 도 7F에 도시한 바와 같이, 넓은 소수성 상호작용이 형성되었다.
상기 결과는 우슨아민 A가 UBA5 및 UFM1 사이의 결합 인터페이스를 차지할 가능성이 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 이루어진 우슨아민 A를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 I]
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA), 자궁 경부 편평세포 암종(cervical squamous cell carcinoma, CESC) 및 결장 선암종(colon adenocarcinoma, COAD)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 암은 UBA5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5)를 과발현하는 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA)인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 우슨아민 A는 UBA5의 ATP 결합 포켓(ATP binding pocket)에 결합하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 우슨아민 A는 G2/M 단계에서 위상 정지(phase arrest) 또는 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 유발하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 함유하는 의약용 제제.
  7. 하기 화학식 1로 이루어진 우슨아민 A를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료방법.
    [화학식 I]
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 우슨아민 A는 10 uM 내지 20 uM의 농도로 투여하는 것인, 암 예방 또는 치료방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 암은 UBA5(ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5)를 과발현하는 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma, BRCA)인, 암 예방 또는 치료방법.
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