KR20230118612A - 헤테로다이머화를 위한 직교 돌연변이 - Google Patents

헤테로다이머화를 위한 직교 돌연변이 Download PDF

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KR20230118612A
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조나단 해리 데이비스
니콜라스 엠. 마쉘
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인벤라 인코포레이티드
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Abstract

헤테로다이머화를 유도하는 직교 돌연변이를 가진 헤테로다이머화 도메인, 특히 헤테로다이머화 항체 CH3 도메인, 이러한 헤테로다이머화 도메인을 포함하는 헤테로다이머 폴리펩티드, 및 이러한 헤테로다이머 폴리펩티드를 포함하는 항체 구축물이 제공된다.

Description

헤테로다이머화를 위한 직교 돌연변이
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 12월10일에 출원된 미국 임시출원 제63/123,915호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열목록을 포함하며, 이로써 전체가 참조로 본원에 포함된다. 202X년, XX월에 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 XXXXX_sequencelisting.txt이고, 크기가 XXX 바이트이다.
세포 내 단백질 헤테로다이머(heterodimer)의 적절한 어셈블리(assembly)는 구성성분 폴리펩티드 사슬의 호모다이머화(homodimerization)보다 헤테로다이머화(heterodimerization)를 선호하는 단백질:단백질 상호작용을 요구한다. 단백질에서 폴리펩티드의 수가 증가함에 따라 특유의 폴리펩티드 사슬의 특정한 회합을 유도할 필요성이 증가된다. 예를 들어, 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 가진 2가 이중특이적 항체의 올바른 어셈블리는 제1 중쇄에 대한 제1 경쇄의, 제2 중쇄에 대한 제2 경쇄의, 그리고 제2 중쇄에 대한 제1 중쇄의 특정한 헤테로다이머화를 요구한다. 효율적인 어셈블리는 다양한 헤테로다이머들의 회합을 유도하는 단백질:단백질 상호작용이 각각의 그러한 헤테로다이머 쌍에 대해 상이할 것을 요구한다.
노브-인-홀(KIH: knob-in-hole) 돌연변이(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 제5,807,706호; 및 제5,821,333호 참조); 전하 쌍 돌연변이(예를 들어, 미국 특허 제9,358,286호 참조); 디설파이드-안정화 KIH 돌연변이(예를 들어, 미국 특허 제7,951,917호; 제8,642,745호 및 제9,409,989호 참조); 등을 비롯한, 특정한 조작된 항체 도메인의 우선적인 헤테로다이머화를 유도하는 다양한 직교 돌연변이(orthogonal mutation)가 개발되었다.
단독으로, 그리고 알려진 헤테로다이머화 특징과 조합되어 사용하기 위한, 특정한 헤테로다이머화 및 멀티머화(multimerization)를 유도하기 위한 추가의 접근법이 당업계에서 필요하다.
본 출원인은 다중 폴리펩티드 사슬의 특정한 헤테로다이머화를 유도할 수 있는 새로운 직교 돌연변이를 조작하여, 특히 다가, 다중특이적 항체 구축물에 유용한 폴리펩티드의 고 충실도 회합을 촉진시켰다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양태 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 첨부의 도면과 관련해 더 잘 이해될 것이다:
도 1a 내지 도 1e는 본 발명의 예시적인 직교 돌연변이를 가진 헤테로다이머 CH3 도메인을 보여준다. 도 1a는 어떠한 추가적인 돌연변이도 갖지 않는 다이머화된 CH3 도메인을 나타낸다. 도 1b는 추가적인 노브-인-홀 돌연변이를 가진 다이머화된 CH3 도메인을 나타내며, 여기서 노브는 E357W 돌연변이와 동일한 도메인에 있다. 도 1c는 추가적인 노브-인-홀 돌연변이를 가진 다이머화된 CH3 도메인을 나타내며, 여기서 노브는 E357W 돌연변이의 반대편 도메인에 있다. 도 1d는 E357W 돌연변이를 가진 도메인의 반대편인 CH3 도메인에서의 추가의 "캐스케이드" 돌연변이를 나타낸다. 도 1e는 E357W 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인에서의 추가의 "캐스케이드" 돌연변이를 나타낸다.
도 2는 본원에 기재된 다양한 2가 항체 구축물에 대한 각각의 명명 방식과 함께 개략적인 구조를 제공한다.
도 3은 예시적인 2가 항체 구축물 "BC1"의 도메인 내용물을 보여주는 개략도를 제공한다. 본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
도 4는 예시적인 2가 항체 구축물 "BC6"의 도메인 내용물을 보여주는 개략도를 제공한다. 본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
도 5는 예시적인 2가 항체 구축물 "BC28"의 도메인 내용물을 보여주는 개략도를 제공한다. 본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 B:G 페어링된 도메인 또는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
도 6은 예시적인 2가 항체 구축물 "BC44"의 도메인 내용물을 보여주는 개략도를 제공한다. 본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 B:G 페어링된 도메인 또는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
도 7은 본원에 기재된 다양한 직교 돌연변이를 포함하는 예시적인 2가 항체 구축물 "BC-96"의 도메인 내용물을 보여주는 개략도를 제공한다.
도 8a 내지 도 8d는 BC96 및 다양한 대체물의, CH1 정제 후의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 결과를 나타낸다. 도 8a는 도메인 B에 K370 돌연변이가 없고 도메인 G에 E357 돌연변이가 없다는 점에서 BC96과는 상이한 변이체의 결과를 나타낸다. 도 8b는 도메인 B에 K370 돌연변이가 없다는 점에서 BC96과는 상이한 변이체의 결과를 나타낸다. 도 8c는 도메인 G에서 E357 돌연변이가 없다는 점에서 BC96과는 상이한 변이체의 결과를 나타낸다. 도 8d는 도메인 B에서 K370R 돌연변이 및 도메인 G에서 E357W 돌연변이 양자 모두를 포함하는 BC96의 결과를 나타낸다.
도 9는 개별 돌연변이에 의해 부여되는 직교성 정도를 평가하기 위해 생성된 구축물의 개략도를 제공한다. 원하는 생성물 및 오염체(contaminant)에 해당하는 밴드를 보여주는 대표적인 SDS-PAGE 겔이 호모다이머 오염체의 개략도와 함께 나타내어진다.
도 10a 내지 도 10c는 다양한 구축물의, 단백질 A 정제 후의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 도 10a는 제1 CH3 도메인이 S354C 돌연변이를 함유하고, 제2의 반대편 CH3 도메인은 Y349C 도메인을 함유하는 구축물의 결과를 나타낸다. 도 10b는 제1 CH3 도메인이 S354C 및 E357W 돌연변이를 함유하고, 제2의 반대편 CH3 도메인은 Y349C 도메인을 함유하는 구축물의 결과를 나타낸다. 도 10c는 제1 CH3 도메인이 S354C, E357W, 및 S364R 돌연변이를 함유하고 제2의 반대편 CH3 도메인은 Y349C 도메인을 함유하는 구축물의 결과를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 다양한 구축물의, CH1 정제 후의 SEC 및 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 도 11a는 제1 CH3 도메인이 S354C 및 E357W 돌연변이를 함유하고 제2의 반대편 CH3 도메인은 Y349C 도메인을 함유하는 구축물의 결과를 나타낸다. 도 11b는 제1 CH3 도메인이 S354C, E357W, 및 S364R 돌연변이를 함유하고 제2의 반대편 CH3 도메인은 Y349C 도메인을 함유하는 구축물의 결과를 나타낸다.
6.1. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 바, 하기의 용어는 아래에 부여되는 의미를 가진다.
"항원 결합 부위"(ABS)는 주어진 항원 또는 에피토프를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는 항체 구축물의 영역을 의미한다. ABS 및 이러한 ABS를 포함하는 항체 구축물은 ABS가 특이적으로 결합하는 에피토프(또는 보다 일반적으로 항원)를 "인식"한다고 언급되며, 에피토프(또는 보다 일반적으로 항원)는 ABS의 "인식 특이성" 또는 "결합 특이성"을 제공하는 것으로 언급된다.
ABS는 특정 친화도로 그의 특정 항원 또는 에피토프에 결합한다고 언급된다. 본원에서 설명되는 바와 같이, "친화도"는 한 분자와 또 다른 분자 사이의 비공유 분자간 힘의 상호작용의 강도를 지칭한다. 친화도, 즉 상호작용의 강도는 해리 평형 상수(KD)로 표현될 수 있으며, 여기서 KD 값이 낮을수록 분자들 사이의 상호작용이 더 강함을 의미한다. 항체 구축물의 KD 값은 생물층 간섭계(예를 들어, Octet/FORTEBIO®), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(예를 들어, Biacore®) 및 세포 결합 검정을 포함하지만 이로 제한되지 않는 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 측정된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 목적을 위해 친화도는 Octet/FORTEBIO®를 사용하여 생물층 간섭계에 의해 측정된 해리 평형 상수이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 KD 값이 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 또는 10-10 M 미만인 ABS와 그의 동족 항원 또는 에피토프 사이의 친화도를 지칭한다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서 ABS의 수는 항체 구축물의 "결합가(valency)"를 정의한다. 단일 ABS를 갖는 항체 구축물은 "1가"이다. 복수의 ABS를 갖는 항체 구축물은 "다가"라고 언급된다. 2개의 ABS를 갖는 다가 항체 구축물은 "2가"이다. 3개의 ABS를 갖는 다가 항체 구축물은 "3가"이다. 4개의 ABS를 갖는 다가 항체 구축물은 "4가"이다.
항체 구축물의 다양한 다가 실시형태에서, 모든 복수의 ABS는 동일한 인식 특이성을 갖는다. 이러한 구축물은 "단일특이적" "다가" 항체 구축물이다. 다른 다가 실시형태에서, 복수의 ABS 중 적어도 2개는 상이한 인식 특이성을 갖는다. 이러한 항체 구축물은 다가이고 "다중특이적"이다. ABS가 집합적으로 2개의 인식 특이성을 갖는 다가 실시형태에서, 결합 분자는 "이중특이적"이다. ABS가 집합적으로 3개의 인식 특이성을 갖는 다가 실시형태에서, 결합 분자는 "삼중특이적"이다.
ABS가 집합적으로 동일한 항원에 존재하는 상이한 에피토프에 대한 복수의 인식 특이성을 갖는 다가 실시형태에서, 항체 구축물은 "다중 파라토프"이다. ABS가 동일한 항원 상의 2개의 에피토프를 집합적으로 인식하는 다가 실시형태는 "이중 파라토프"이다.
다양한 다가 실시형태에서, 항체 구축물의 다가 특성은 특정 표적에 대한 결합 분자의 결합력을 개선시킨다. 본원에서 설명되는 바와 같이, "결합력(avidity)"은 2개 이상의 분자, 예를 들어 특정 표적에 대한 다가 결합 분자들 사이의 상호작용의 전체 강도를 나타내며, 여기서 결합력은 다중 ABS의 친화도에 의해 제공되는 상호작용의 누적 강도이다. 결합력은 위에서 설명한 바와 같이 친화도를 결정하는 데 사용되는 것과 동일한 방법으로 측정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 특이적 표적에 대한 결합 분자의 결합력은 상호작용이 특이적 결합 상호작용이 되도록 하는 것이며, 여기서 2개의 분자 사이의 결합력은 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 또는 10-10 M 미만의 KD 값을 갖는다. 특정 실시형태에서, 특이적 표적에 대한 결합 분자의 결합력은 상호작용이 특이적 결합 상호작용이 되도록 하는 KD 값을 갖고, 여기서 개별 ABS의 하나 이상의 친화도는 각각의 항원 또는 에피토프에 자체적으로 특이적으로 결합하는 것으로 인정되는 KD 값을 갖지 않는다. 특정 실시형태에서, 결합력은, 개별 세포에서 발견되는 개별 항원과 같은, 공유된 특정 표적 또는 복합체 상의 개별 항원에 대한 다중 ABS의 친화도에 의해 제공되는 상호작용의 누적 강도이다. 특정 실시형태에서, 결합력은 공유된 개별 항원 상의 개별 에피토프에 대한 다중 ABS의 친화도에 의해 제공되는 상호작용의 누적 강도이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "B-Body"는 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 도 2에 도시된 바와 같은 항체 구축물을 지칭하며, 여기서 (a) 제1 폴리펩티드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 CH3 아미노산 서열을 갖고, 도메인 D는 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고; (b) 제2 폴리펩티드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 CH3 아미노산 서열 서열을 갖고; (c) 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용 및 B 도메인과 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 항체 구축물을 형성한다. B-Body는 미국 특허 US 2018/0118811호 및 국제공개 WO 2019/204522호에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 설명되는 바와 같이, "직교 변형" 또는 동일어로서 "직교 돌연변이"는 직교 변형의 부재 하에서의 제1 도메인과 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 변경하는 항체 도메인의 아미노산 서열의 하나 이상의 조작된 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 직교 변형은 직교 변형의 부재 하에서의 제1 도메인과 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 직교 변형은 직교 변형의 부재 하에서의 제1 도메인과 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 변경하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 직교 변형은 직교 변형의 부재 하에서의 제1 도메인과 제2 도메인의 결합과 비교하여, 상보적 직교 변형을 갖는 제2 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 제1 도메인의 결합 친화도를 증가시킨다. 특정 바람직한 실시형태에서, 직교 변형은 상보적 직교 변형이 결여된 도메인에 대한 직교 변형을 갖는 도메인의 친화도를 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 직교 변형은 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같은, 조작된 디설파이드 브릿지, 노브-인-홀 돌연변이, 및 전하쌍 돌연변이를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 직교 변형은 조작된 디설파이드 브릿지, 노브-인-홀 돌연변이, 및 전하쌍 돌연변이로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 직교 변형의 조합을 포함한다.
6.2. 기타 해석 규칙
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 "서열"에 대한 모든 언급은 아미노산 서열에 대한 것이다. "내인성 서열" 또는 "천연 서열"은 유기체, 조직 또는 세포에서 유래하고 인위적으로 변형되거나 돌연변이되지 않은, 상황에 따라 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 임의의 서열을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 항체 불변 영역 잔기 넘버링은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs에 기재된 Eu 인덱스에 따르고,
이것은 본원에서 설명되는 항체 구축물의 사슬 내의 잔기의 물리적 위치에 관계없이 내인성 불변 영역 서열에서의 그의 위치에 따라 잔기를 식별한다.
달리 명시되지 않는 한, 상보성 결정 영역(CDR)에 대한 모든 언급은 카바트(Kabat) 정의 CDR이다.
용어 "제1", "제2", "제3", "제4" 등은 폴리펩티드 사슬(예를 들어, "제1" 폴리펩티드 사슬, "제2" 폴리펩티드 사슬 등 또는 폴리펩티드 "사슬 1", "사슬 2" 등)과 관련하여 사용될 때, 본원에서 다량체 분자를 형성하는 특정 폴리펩티드 사슬에 대한 고유 식별자로서 사용되며, 항체 구축물 내의 상이한 폴리펩티드 사슬의 순서 또는 양을 의미하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "제1", "제2", "제3", "제4" 등은 CH3 도메인과 관련하여 사용될 때 특정 도메인을 지정하는 데 사용되며, 도메인의 순서 또는 양을 의미하는 것으로 의도되지 않는다.
본 개시내용에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는", "갖는", "포괄하다", "포괄하는" 및 이들의 언어적 변형은 미국 특허법에서 부여된 의미를 갖고, 명시적으로 언급된 것 이외의 추가의 구성요소의 존재를 허용한다.
본원에서 제공되는 범위는 인용된 종점을 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 이루어진 군의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 용어 단수형태("a", "an" 및 "the")는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 관련 기술 분야의 정상 허용 오차 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. 약은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 달리 특정되지 않는 한, "약"은 명시된 값의 10% 이내를 의미한다.
6.3. 헤테로다이머 단백질
제1 양태에서, 헤테로다이머 단백질이 제공된다. 헤테로다이머 단백질은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기서
a) 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 CH3 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 CH3 도메인을 포함하고,
b) 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C),
c) 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C),
d) 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고,
상기 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 것이다.
다양한 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 프롤린(P), 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, 방향족 아미노산 잔기는 히스티딘(H), 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 및 티로신(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 아미노산으로 치환된다. 특정 실시형태에서, 상기 소수성 아미노산 잔기는 메티오닌(M)이다(E357M).
특정 실시형태에서, 제2 CH3 도메인의 E357은 방향족 아미노산으로 치환된다. 특정 실시형태에서, 상기 방향족 아미노산 잔기는 트립토판(W)이다(E357W).
6.3.1. CH3 도메인
본원에서 설명되는 헤테로다이머 단백질의 CH3 도메인은 상기 돌연변이가 그 내부로 조작되는, 항체 중쇄의 C-말단에 자연적으로 위치하는 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 실시형태에서, CH3 서열은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시형태에서, CH3 서열은 인간 서열이다. 특정 실시형태에서, CH3 서열은 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 이소형(isotype)으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, CH3 서열은 IgG 이소형으로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, CH3 서열은 IgG1 이소형으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, CH3 서열은 IgA 이소형으로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, CH3 서열은 IgE 또는 IgM 이소형으로부터의 CH4 서열이다.
특정 실시형태에서, CH3 서열은 내인성 서열이다. 특정 실시형태에서, CH3 서열은 UniProt 수탁 번호 P01857 아미노산 224 내지 330이다. 다양한 실시형태에서, CH3 서열은 내인성 CH3 서열의 세그먼트이다. 특정 실시형태에서, CH3 서열은 N-말단 아미노산 G224 및 Q225가 결여된 내인성 CH3 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, CH3 서열은 C-말단 아미노산 P328, G329, 및 K330이 결여된 내인성 CH3 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, CH3 서열은 N-말단 아미노산들(G224 및 Q225)과 C-말단 아미노산들(P328, G329 및 K330) 양자 모두가 결여된 내인성 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, CH3 서열은 문헌이 교시하는 모든 내용에 대해 그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌[Stickler et al. (Genes Immun. 2011 Apr; 12(3): 213-221)]에 보다 상세하게 설명된 바와 같이 하나의 동종이인자형(allotype)의 특정 아미노산을 또 다른 동종이인자형의 아미노산으로 대체함(본원에서 동종동질이형체(isoallotype) 돌연변이로 언급됨)으로써 면역원성을 감소시키도록 조작된다. 특정 실시형태에서, G1m1 동종이인자형의 특정 아미노산이 대체된다. 바람직한 실시형태에서, 동종동질이형체 돌연변이 D356E 및 L358M은 CH3 서열에서 만들어진다.
일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 CH3 도메인에 추가의 조작된 돌연변이가 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, CH3 서열은 아래에서 설명되는 바와 같이 상기 기재된 것에 추가로 하나 이상의 조작된 돌연변이를 갖는 내인성 서열이다.
6.3.2. CH3 도메인에서 추가의 조작된 직교 돌연변이
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 CH3 도메인 내에 조작된 적어도 하나의 추가의 직교 돌연변이가 존재한다.
6.3.2.1. 캐스케이드 돌연변이
다양한 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 CH3 도메인은 E357 돌연변이, 예컨대 E357W 돌연변이에 의해 새롭게 가능해진 돌연변이("캐스케이드" 돌연변이)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, E357 돌연변이를 함유하는 반대편 CH3 도메인은 K370에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 리신(K)은 A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 돌연변이된다. 특정 실시형태에서, 리신(K)은 D, E, F, H, M, N, Q, R, S, T, W, 또는 Y로 돌연변이된다. 특정 실시형태에서, 돌연변이는 K370R이다.
일부 실시형태에서, E357 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인은 S364에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 세린(S)은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y로 돌연변이된다. 특정 실시형태에서, 세린은 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, T, W 또는 Y로 돌연변이된다. 바람직한 실시형태에서, 세린은 R로 돌연변이된다.
일부 실시형태에서, E357 돌연변이를 함유하는 반대편 CH3 도메인은 K370에 돌연변이를 추가로 포함하고, E357 돌연변이를 함유하는 도메인은 S364에 돌연변이를 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, K370은 D, E, F, H, M, N, Q, R, S, T, W, 또는 Y로 돌연변이된다. 특정 실시형태에서, 돌연변이는 K370R이다. 다양한 실시형태에서, S364는 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, T, W 또는 Y로 돌연변이된다.
6.3.2.2. 노브-인-홀
다양한 실시형태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 직교 노브-인-홀("K-I-H") 돌연변이를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 도메인이 상보적 입체 돌연변이가 없는 도메인과의 회합에 비해 상보적 입체 돌연변이를 갖는 제2 도메인과 우선적으로 회합하도록 제1 도메인의 표면의 입체적 특징을 변경하는 돌연변이이다. 노브-인-홀 돌연변이는 미국 특허 제5,821,333호 및 제8,216,805호에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이들 특허는 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가의 조작된 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 노브 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 홀 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 도메인에 홀 돌연변이가 존재하고, 제2 CH3 도메인에 노브 돌연변이가 존재한다.
특정 실시형태에서, 노브 돌연변이는 T366W 또는 T366Y이다.
특정 실시형태에서, 홀 돌연변이는 T366S, L368A, F405T, Y407V, 또는 Y407T로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 홀 돌연변이는 F405T이다.
특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366W 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 Y407A 돌연변이이다. 특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366W 돌연변이 및 제1 CH3 도메인에서의 Y407A 돌연변이이다.
특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 제2 도메인에서의 Y407T 돌연변이이다. 특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 제1 도메인에서의 Y407T 돌연변이이다.
특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T394W 및 제2 CH3 도메인에서의 F405A이다. 특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T394W 및 제1 CH3 도메인에서의 F405A이다.
특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이와 F405A 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 T394W 돌연변이와 Y407T 돌연변이이다. 특정 실시형태에서, 노브-인-홀 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이와 F405A 돌연변이 및 제1 CH3 도메인에서의 T394W 돌연변이와 Y407T 돌연변이이다.
6.3.2.3. 조작된 전하쌍
다양한 실시형태에서, 제1 및 제2 CH3 도메인은 직교 전하쌍 돌연변이를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 전하쌍 돌연변이는 도메인이 상보적 전하쌍 돌연변이가 없는 도메인과의 회합에 비해 상보적 전하쌍 돌연변이를 갖는 제2 도메인과 우선적으로 회합하도록 도메인 표면의 아미노산의 전하에 영향을 미치는 돌연변이이다. 특정 실시형태에서, 전하쌍 돌연변이는 특정 도메인들 사이의 직교 회합을 개선한다. 전하쌍 돌연변이는 미국 특허 제8,592,562호; 제9,248,182호; 및 제9,358,286호에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이들은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 전하쌍 돌연변이는 제1 CH3 도메인에서의 T366K 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 L351D 돌연변이이다. 특정 실시형태에서, 전하쌍 돌연변이는 제2 CH3 도메인에서의 T366K 돌연변이 및 제1 CH3 도메인에서의 L351D 돌연변이이다.
6.4. 항체 구축물
6.4.1. 가변 도메인
다양한 실시형태에서, 헤테로다이머 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬 중 적어도 하나는 면역글로불린 가변 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬 양자 모두는 면역글로불린 가변 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬 양자 모두는 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬 양자 모두는 VL 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 VH 도메인을 포함하고 제2 폴리펩티드 사슬은 VL 도메인을 포함하거나, 제1 폴리펩티드 사슬은 VL 도메인을 포함하고 제2 폴리펩티드 사슬은 VH 도메인을 포함한다. 이들 실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 가변 도메인과 제2 폴리펩티드의 가변 도메인은 회합하여 제1 항원 결합 부위(ABS)를 형성하고, 헤테로다이머 단백질은 항체 구축물이다.
특정 항체 구축물에서, VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 CH2 도메인 및 제3 CH3 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 상기 도메인들은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬된다:
a) VH-제1 CH3-CH2-제3 CH3,
b) VH-제2 CH3-CH2-제3 CH3,
c) VH-제3 CH3-CH2-제1 CH3, 또는
d) VH-제3 CH3-CH2-제2 CH3.
특정 실시형태에서, VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬된다:
a) VH-제1 CH3-CH2-제3 CH3, 또는
b) VH-제2 CH3-CH2-제3 CH3.
특정 항체 구축물 실시형태에서, VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 CH2 도메인 및 제3 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 도 2를 참조하면, 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬된다:
특정 실시형태에서, 도 2를 참조하면, VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬된다:
특정 실시형태에서, 도 2를 참조하면, VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 도메인 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 각각 다음과 같이 정렬된다:
a) 제1 폴리펩티드 사슬
제2 폴리펩티드 사슬
또는
b) 제1 폴리펩티드 사슬
제2 폴리펩티드 사슬
다양한 실시형태에서, 도 2를 참조하면, 항체 구축물은 제3 폴리펩티드 사슬 및 제4 폴리펩티드 사슬을 추가로 포함하며, 여기서,
(a) 제3 폴리펩티드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J 및 도메인 K를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고;
(b) 제4 폴리펩티드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고;
(c) 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드는 제2 항원 결합 부위(ABS)를 형성하는 H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용 및 I 도메인과 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고;
(d) 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 D 도메인과 J 도메인 사이의 상호작용 및 E 도메인과 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합된다.
특정 실시형태에서, 도메인 H는 VL 도메인이고; 도메인 I는 CL 도메인이고; 도메인 J는 CH2 도메인이고; 도메인 K는 제4 CH3 도메인이다. 특정 실시형태에서, 도메인 L은 VH 도메인이고; 도메인 M은 CH1 도메인이다.
특정 실시형태에서, 도메인 A는 VL 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 도메인 A는 VH 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체 구축물은 천연 항체 구조를 포함하며, 여기서 도메인 A 및 H는 VH 아미노산 서열을 포함하고, 도메인 F 및 L은 VL 아미노산 서열을 포함하고, 도메인 B 및 I는 CH1을 포함하고, 도메인 G 및 M은 CL을 포함하고, 도메인 D 및 J는 CH2를 포함하고, 도메인 E 및 K는 CH3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 구축물은 B-Body™이다. B-Body™ 항체 구축물은 미국 특허출원공개 US 2018/0118811호 및 국제공개 WO 2019/204522호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함되며, 특정 실시형태는 아래에서 추가로 설명된다.
일부 실시형태에서, 항체 구축물은 CrossMab™이다. CrossMab™ 항체는 미국 특허 제8,242,247호; 제9,266,967호; 및 제8,227,577호, 미국 특허출원공개 20120237506호, US20090162359호, 국제공개 WO2016016299호, WO2015052230호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 항체 구축물은 a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 2가의 이중특이적 항체이고, 여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체된다.
일부 실시형태에서, 항체 구축물은 미국 특허 제8,871,912호 및 국제공개 WO 2016/087650호에 기재된 일반적인 구조를 갖는 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체 구축물은 VL-CH3으로 구성된 경쇄(LC) 및 VH-CH3-CH2-CH3을 포함하는 중쇄(HC)를 포함하는 도메인 교환된 항체이고, 여기서 LC의 VL-CH3은 HC의 VH-CH3과 다이머화하여, CH3LC/CH3HC 도메인 쌍을 포함하는 도메인 교환된 LC/HC 다이머를 형성한다.
일부 실시형태에서, 항체 구축물은 국제공개 WO 2017/011342호에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 항체 구축물은 국제공개 WO 2006/093794호에 기재된 바와 같다.
6.4.1.1.1 VH 도메인
다양한 실시형태에서, VH 도메인은 인간 서열을 포함하는 포유동물 서열, 인간화 서열, 합성 서열, 또는 인간, 비인간 포유동물 및/또는 합성 서열의 조합인 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 실시형태에서, VH 아미노산 서열은 자연 발생 서열의 돌연변이된 서열이다.
6.4.1.1.2 VL 도메인
다양한 실시형태에서, VL 도메인은 인간 서열을 포함하는 포유동물 서열, 인간화 서열, 합성 서열, 또는 인간, 비인간 포유동물 및/또는 합성 서열의 조합인 아미노산 서열을 갖는다. 다양한 실시형태에서, VL 아미노산 서열은 자연 발생 서열의 돌연변이된 서열이다.
특정 실시형태에서, VL 아미노산 서열은 람다(λ) 경쇄 가변 도메인 서열이다. 특정 실시형태에서, VL 아미노산 서열은 카파(κ) 경쇄 가변 도메인 서열이다.
6.4.1.1.3 상보성 결정 영역
본원에서 설명되는 항체 구축물의 VH 및 VL 도메인은 "상보성 결정 영역"(CDR), 일반적으로 3개의 CDR(CDR1, CD2, 및 CDR3)이라고 명명되는 고도로 가변적인 서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, CDR은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시형태에서, CDR은 인간 서열이다. 다양한 실시형태에서, CDR은 자연 발생 서열이다. 다양한 실시형태에서, CDR은 특정 항원 또는 에피토프에 대한 항원 결합 부위의 결합 친화도를 변경하도록 돌연변이된 자연 발생 서열이다. 특정 실시형태에서, 자연 발생 CDR은 친화도 성숙 및 체세포 과돌연변이를 통해 생체 내의 숙주에서 돌연변이된 것이다. 특정 실시형태에서, CDR은 PCR 돌연변이 유발 및 화학적 돌연변이 유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법을 통해 시험관 내에서 돌연변이된 것이다. 다양한 실시형태에서, CDR은 무작위 서열 CDR 라이브러리 및 합리적으로 설계된 CDR 라이브러리로부터 수득된 CDR을 포함하지만 이에 제한되지 않는 합성 서열이다.
6.4.1.1.4 프레임워크 영역 및 CDR 이식
본원에서 설명되는 항체 구축물의 VH 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역"(FR) 서열을 포함한다. FR은 일반적으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 배열(N-말단에서 C-말단으로)에서, 산재된 CDR에 대한 스캐폴드 역할을 하는 일반적으로 보존된 서열 영역이다. 다양한 실시형태에서, FR은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시형태에서, FR은 인간 서열이다. 다양한 실시형태에서, FR은 자연 발생 서열이다. 다양한 실시형태에서, FR은 합리적으로 설계된 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 합성 서열이다.
다양한 실시형태에서, FR과 CDR은 양자 모두 동일한 자연 발생 가변 도메인 서열로부터 유래한다. 다양한 실시형태에서, FR 및 CDR은 상이한 가변 도메인 서열로부터 유래되고, 여기서 CDR은 특정 항원에 대한 특이성을 제공하는 CDR과 함께 FR 스캐폴드 상에 이식된다. 특정 실시형태에서, 이식된 CDR은 모두 동일한 자연 발생 가변 도메인 서열로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 이식된 CDR은 상이한 가변 도메인 서열로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 이식된 CDR은 무작위 서열 CDR 라이브러리 및 합리적으로 설계된 CDR 라이브러리로부터 수득된 CDR을 포함하지만 이에 제한되지 않는 합성 서열이다. 특정 실시형태에서, 이식된 CDR 및 FR은 동일한 종으로부터 유래한다. 특정 실시형태에서, 이식된 CDR 및 FR은 상이한 종으로부터 유래한다. 바람직한 이식된 CDR 실시형태에서, 항체는 "인간화"되고, 여기서 이식된 CDR은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀 및 염소 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비인간 포유동물 서열이고, FR은 인간 서열이다. 인간화 항체는 미국 특허 제6,407,213호에 기재되어 있으며, 상기 특허는 그것이 교시하는 모든 내용에 대해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 다양한 실시형태에서, 한 종에서 유래한 FR의 일부 또는 특정 서열을 사용하여 또 다른 종의 FR의 일부 또는 특정 서열을 대체한다.
6.4.2 CH1 및 CL 도메인
다양한 실시형태에서, 항체 구축물의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬 중 적어도 하나는 면역글로불린 CH1 도메인을 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 헤테로다이머 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬 중 적어도 하나는 면역글로불린 CL 도메인을 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 CH1 도메인을 추가로 포함하고, 제2 폴리펩티드는 CL 도메인을 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 제2 폴리펩티드는 CH1 도메인을 추가로 포함하고, 제1 폴리펩티드는 CL 도메인을 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, CH1 서열은 내인성 서열이다. 다양한 실시형태에서, CH1 서열은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시형태에서, CH1 서열은 인간 서열이다. 특정 실시형태에서, CH1 서열은 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgM 이소형으로부터 유래한다. 바람직한 실시형태에서, CH1 서열은 IgG1 이소형으로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, CH1 서열은 UniProt 수탁 번호 P01857 아미노산 1 내지 98이다.
본원에서 설명되는 항체 구축물의 CL 도메인은 항체 경쇄 불변 도메인이다. 특정 실시형태에서, CL 도메인은 내인성 서열인 서열을 갖는다. 다양한 실시형태에서, CL 서열은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 낙타, 당나귀, 염소 및 인간 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 서열이다. 바람직한 실시형태에서, CL 서열은 인간 서열이다.
특정 실시형태에서, CL 아미노산 서열은 람다(λ) 경쇄 불변 도메인 서열이다. 특정 실시형태에서, CL 아미노산 서열은 인간 람다 경쇄 불변 도메인 서열이다. 바람직한 실시형태에서, 람다(λ) 경쇄 서열은 UniProt 수탁 번호 P0CG04이다.
특정 실시형태에서, CL 아미노산 서열은 카파(κ) 경쇄 불변 도메인 서열이다. 바람직한 실시형태에서, CL 아미노산 서열은 인간 카파(κ) 경쇄 불변 도메인 서열이다. 바람직한 실시형태에서, 카파 경쇄 서열은 UniProt 수탁 번호 P01834이다.
특정 실시형태에서, CH1 서열과 CL 서열은 양자 모두 내인성 서열이다.
CH1 도메인 폴딩은 전형적으로 IgG 분비의 속도 제한 단계이다(문헌[Feige et al. Mol Cell. 2009 Jun 12;34(5):569-79]; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, CH1 포함 폴리펩티드 사슬의 속도 제한 성분에 기초하여 본원에서 설명되는 항체 구축물을 정제하는 것은 불완전한 사슬로부터 완전한 복합체를 정제하는, 예를 들어, 하나 이상의 비-CH1 포함 사슬만을 갖는 복합체로부터 제한 CH1 도메인을 갖는 복합체를 정제하는 수단을 제공할 수 있다.
논의되는 바와 같이, CH1 제한 발현이 일부 측면에서 이점이 될 수 있지만, CH1이 완전한 항체 구축물의 전체 발현을 제한할 가능성이 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 발현은 완전한 복합체를 형성하는 항체 구축물의 효율을 개선하도록 조정된다. 예시적인 예에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 발현하도록 구축된 플라스미드 벡터의 비는 다른 폴리펩티드 사슬을 발현하도록 구축된 플라스미드 벡터에 비해 증가될 수 있다. 또 다른 예시적인 예에서, CL 서열(들)을 포함하는 폴리펩티드 사슬과 비교할 때 CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 2개의 폴리펩티드 사슬 중에서 더 작을 수 있다. 또 다른 특정 실시형태에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 발현은 어떤 폴리펩티드 사슬이 CH1 서열(들)을 갖는지를 제어함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, CH1 도메인이 4-도메인 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 본원에서 설명되는 제3 폴리펩티드 사슬) 내의 CH1 서열의 천연 위치 대신에 2-도메인 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 본원에서 설명되는 제4 폴리펩티드 사슬)에 존재하도록 항체 구축물을 조작하는 것은 CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 발현을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 다른 측면에서, 다른 사슬에 비해 너무 높은 CH1 함유 사슬의 상대적인 발현 수준은 CH1 사슬은 갖지만 각각의 다른 사슬은 갖지 않는 불완전한 복합체를 생성할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, CH1 서열(들)을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 발현은 CH1 함유 사슬이 없는 불완전한 복합체의 형성을 감소시키고 CH1 함유 사슬이 존재하지만 완전한 복합체에 존재하는 다른 사슬이 없는 불완전한 복합체의 형성을 감소시키기 위해 조정된다.
특정 실시형태에서, CH1 서열 및 CL 서열은 아래에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 내인성 CH1 및 CL 서열에 각각 직교 변형을 개별적으로 포함한다. 바람직하게는, CH1 서열의 직교 돌연변이는 CH1 도메인과 정제에 사용되는 CH1 특이적 결합 시약 사이의 특이적 결합 상호작용을 제거하지 않는다.
6.4.2.1 CH1 및 CL 직교 변형
특정 실시형태에서, CH1 서열 및 CL 서열은 각각 내인성 CH1 및 CL 서열의 직교 변형을 추가로 포함한다. CH1/CL 직교 변형은 CH1 도메인의 변형된 잔기와 CL 도메인의 상응하는 변형된 또는 비변형된 잔기 사이의 상호 작용을 통한 CH1/CL 도메인 페어링에 영향을 미칠 수 있다.
특정 실시형태에서, 직교 변형은 동종동질이형체 돌연변이와 같은 면역원성을 감소시키는 아미노산 치환과 조합될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, CH1/CL 쌍의 하나의 서열은 적어도 하나의 변형을 포함하는 반면, CH1/CL 쌍의 다른 서열은 각각의 직교 아미노산 위치에 변형을 포함하지 않는다.
CH1 및 CL 서열은 또한 내인성 또는 변형된 서열의 일부일 수 있으므로, CH1 서열을 갖는 도메인 또는 그의 일부는 CH1 서열을 갖는 도메인 또는 그의 일부와 회합할 수 있다. 또한, 본원에서 설명되는 CH1 서열의 일부를 갖는 항체 구축물은 CH1 결합 시약에 의해 결합될 수 있다.
6.4.2.1.1 예시적인 CH1/CL 직교 변형: 조작된 디설파이드 브릿지
CH1/CL 직교 변형의 일부 실시형태는 CH1 및 CL 내의 조작된 시스테인 사이의 조작된 디설파이드 브릿지를 포함한다. 이러한 조작된 디설파이드 브릿지는 변형된 CH1을 포함하는 폴리펩티드와, 상응하는 변형된 CL을 포함하는 폴리펩티드 사이의 상호작용을 안정화할 수 있다.
조작된 디설파이드 브릿지를 포함하는 직교 CH1/CL 변형은 예를 들어 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 위치 128, 129, 138, 141, 168, 또는 171에 조작된 시스테인을 갖는 CH1 도메인을 포함한다. 조작된 디설파이드 브릿지를 포함하는 이러한 직교 CH1/CL 변형은 예를 들어 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 위치 116, 118, 119, 164, 162, 또는 210에 조작된 시스테인을 갖는 CL 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, CH1/CL 직교 변형은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,053,562호 및 미국 특허 제9,527,927호에서 넘버링되고 보다 상세하게 설명된 바와 같이 CH1 서열의 위치 138 및 CL 서열의 위치 116, CH1 서열의 위치 128 및 CL 서열의 위치 119, 또는 CH1 서열의 위치 129 및 CL 서열의 위치 210에서의 조작된 시스테인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 141 및 CL 서열의 위치 118에 조작된 시스테인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 168 및 CL 서열의 위치 164에 조작된 시스테인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 128 및 CL 서열의 위치 118에 조작된 시스테인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CH1/CL 직교 변형은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 171 및 CL 서열의 위치 162에 조작된 시스테인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CL 서열은 CL-람다 서열이다. 바람직한 실시형태에서, CL 서열은 CL-카파 서열이다. 일부 실시형태에서, 조작된 시스테인은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열의 위치 128 및 CL 카파 서열의 위치 118에 존재한다.
하기 표 1은 EU 인덱스에 따라 넘버링된, CH1과 CL 사이에 조작된 디설파이드 브릿지를 포함하는 예시적인 CH1/CL 직교 변형을 제공한다.
일련의 바람직한 실시형태에서, 비내인성(조작된) 시스테인 아미노산을 제공하는 돌연변이는 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열에서의 상응하는 A141C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 F118C 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 L128C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 F118C 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 H168C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 T164C 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 P171C 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 S162C 돌연변이이다.
6.4.2.1.2 CH1/CL 직교 변형: 조작된 전하쌍 돌연변이
다양한 실시형태에서, CL 서열 및 CH1 서열의 직교 변형은 전하쌍 돌연변이이다.
특정 실시형태에서, 전하쌍 돌연변이는 EU 인덱스에 의해 넘버링되고 그 교시하는 모든 내용에 대해 본원에 참고로 포함되는 문헌[Bonisch et al. (Protein Engineering, Design & Selection, 2017, pp. 1-12)]에 보다 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, CH1 서열에서의 상응하는 A141L 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 F118S, F118A 또는 F118V 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 K147D 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 T129R 돌연변이이다.
일부 경우에, CH1/CL 전하쌍 돌연변이는 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 CH1 서열에서의 상응하는 G166D 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 N138K 돌연변이, 또는 CH1 서열에서의 상응하는 G166K 돌연변이와 함께 CL 서열에서의 N138D 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 전하쌍 돌연변이는 상응하는 CL 서열에서의 상응하는 E123K 돌연변이와 함께 CH1 서열에서의 P127E 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 전하쌍 돌연변이는 상응하는 CL 서열에서의 상응하는 E123(돌연변이되지 않음)과 함께 CH1 서열에서의 P127K 돌연변이이다.
하기 표 2는 예시적인 CH1/CL 직교 전하쌍 변형을 제공한다.
6.4.2.1.3 CH1/CL 직교 변형의 조합
특정 실시형태에서, 단일 CH1/CL 쌍의 CH1 및 CL 도메인은 내인성 CH1 및 CL 서열에 2개 이상의 각각의 직교 변형을 개별적으로 함유한다. 예를 들어, CH1 및 CL 서열은 내인성 CH1 및 CL 서열에서의 제1 직교 변형 및 제2 직교 변형을 포함할 수 있다. 내인성 CH1 및 CL 서열에서의 2개 이상의 각각의 직교 변형은 본원에서 설명되는 CH1/CL 직교 변형 중 임의의 변형으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 직교 변형은 직교 전하쌍 돌연변이이고, 제2 직교 변형은 직교 조작된 디설파이드 브릿지이다. 일부 실시형태에서, 제1 직교 변형은 표 2에 기재된 바와 같은 직교 전하쌍 돌연변이이고, 추가의 직교 변형은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,053,562호 및 미국 특허 제9,527,927호에서 넘버링되고 보다 상세하게 설명된 바와 같이 CH1 서열의 위치 138 및 CL 서열의 위치 116, CH1 서열의 위치 128 및 CL 서열의 위치 119, 또는 CH1 서열의 위치 129 및 CL 서열의 위치 210에서의 조작된 시스테인으로부터 선택되는 조작된 디설파이드 브릿지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 직교 변형은 표 2에 기재된 바와 같은 직교 전하쌍 돌연변이이고, 추가의 직교 변형은 표 1에 기재된 바와 같은 조작된 디설파이드 브릿지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 직교 변형은 CH1 서열에서의 L128C 돌연변이 및 CL 서열에서의 F118C 돌연변이를 포함하고, 제2 직교 변형은 동일한 CH1 서열에서의 잔기 166의 변형 및 동일한 CL 서열에서의 잔기 138의 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 직교 변형은 CH1 서열에서의 L128C 돌연변이 및 CL 서열에서의 F118C 돌연변이를 포함하고, 제2 직교 변형은 CH1 서열에서의 G166D 돌연변이 및 CL 서열에서의 N138K 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 직교 변형은 CH1 서열에서의 L128C 돌연변이 및 CL 서열에서의 F118C 돌연변이를 포함하고, 제2 직교 변형은 CH1 서열에서의 G166K 돌연변이 및 CL 서열에서의 N138D 돌연변이를 포함한다.
6.4.3. CH2 도메인
다양한 실시형태에서, 항체 구축물의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬 중 적어도 하나는 CH2 도메인을 추가로 포함한다. 다양한 실시형태에서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 양자 모두 CH2 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 구축물은 CH2 도메인의 한 쌍을 초과하는 세트를 갖는다. 다양한 이들 실시형태에서, 페어링된 CH2 도메인의 제1 세트는 제1 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열 및 또 다른 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열의 하나 이상의 이종상동성(orthologous) 세트를 갖는다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 이종상동성 CH2 아미노산 서열은 공유 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열과 상호작용할 수 있지만, 항체 구축물에 존재하는 또 다른 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열과는 유의하게 상호작용하지 않는다.
특정 실시형태에서, CH2 아미노산 서열의 제1 세트는 항체 구축물의 다른 비-CH2 도메인과 동일한 이소형으로부터 유래한다. 특정 실시형태에서, 제1 세트는 IgG 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열을 갖고, 하나 이상의 이종상동성 세트는 IgM 또는 IgE 이소형으로부터의 CH2 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, CH2 아미노산 서열의 세트 중 하나 이상은 내인성 CH2 서열이다. 다른 실시형태에서, CH2 아미노산 서열의 세트 중 하나 이상은 하나 이상의 돌연변이를 갖는 내인성 CH2 서열이다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 돌연변이는 직교 노브-홀 돌연변이, 직교 전하쌍 돌연변이 또는 직교 소수성 돌연변이이다. 본원에서 설명되는 항체 구축물에 유용한 이종상동성 CH2 아미노산 서열은 국제공개 WO2017/011342호 및 WO2017/106462호에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, CH2 아미노산 서열의 모든 세트는 동일한 종으로부터 유래한 것이다. 바람직한 실시형태에서, CH2 아미노산 서열의 모든 세트는 인간 CH2 아미노산 서열이다. 다른 실시형태에서, CH2 아미노산 서열의 세트는 상이한 종으로부터 유래한 것이다.
6.4.4. 특정 2가 항체 구축물
다양한 실시형태에서, 항체 구축물은 도 2에 나타낸 구조를 갖는다.
6.4.4.1 도메인 A
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 A는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 도메인 A는 VL 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 도메인 A는 VH 항체 도메인 서열을 갖고, 도메인 F는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 A의 C-말단은 도메인 B의 N-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 도메인 A는 도메인 A와 도메인 B 사이의 접합부에서 그의 C-말단에서 돌연변이된 VL 아미노산 서열을 갖는다.
6.4.4.2 도메인 B
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 B는 불변 영역 도메인 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 도메인 B는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 CH3 서열, 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 브릿지를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 제1 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 제2 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다. 특정 실시형태에서, 제2 CH3 도메인은 E357W 돌연변이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖는다: P343V; Y349C; 및 트리펩티드 삽입, 즉 445P, 446G, 447K. 다른 바람직한 실시형태에서, 도메인 B는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: T366K; 및 트리펩티드 삽입, 즉 445K, 446S, 447C. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 도메인 B는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: Y349C 및 트리펩티드 삽입, 즉 445P, 446G, 447K.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 내인성 CH3 서열에 통합된 K447C 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 불변 영역 서열은 이종상동성 CH2 서열이다. 일부 실시형태에서, 도메인 B는 IgE로부터의 CH2 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 도메인 B는 IgM으로부터의 CH2 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 예를 들어 결합 분자의 결합가가 3 또는 3 초과인 경우, 불변 영역 서열은 CH1 또는 CL 서열이다. 일부 실시형태에서, 도메인 B는 CH1 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 불변 영역 서열은 CL 서열이다. 일부 실시형태에서, CH1 또는 CL 서열은 본원에서 설명되는 하나 이상의 CH1 또는 CL 직교 변형을 포함한다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 B의 N-말단은 도메인 A의 C-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 도메인 B는 도메인 A와 도메인 B 사이의 접합부에서 그의 N-말단에서 돌연변이된 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 B의 C-말단은 도메인 D의 N-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 도메인 B는 도메인 B와 도메인 D 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 도메인 B는 인간 IgA CH3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgA CH3 서열은 CH3 링커 서열을 포함한다.
6.4.4.3 도메인 D
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 D는 불변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
일련의 바람직한 실시형태에서, 도메인 D는 CH2 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, CH2 서열은 내인성 서열이다. 특정 실시형태에서, 서열은 UniProt 수탁 번호 P01857 아미노산 111 내지 223이다. 바람직한 실시형태에서, CH2 서열은 N-말단 가변 도메인-불변 도메인 세그먼트를 CH2 도메인에 연결하는 N-말단 힌지 영역 펩티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원에서 설명되는 항체 구축물에서, 도메인 D의 N-말단은 도메인 B의 C-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 도메인 B는 도메인 D와 도메인 B 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
6.4.4.4 도메인 E
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 E는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 불변 영역 서열은 CH3 서열이다.
특정 실시형태에서, 도메인 E는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 E는 CH3 서열 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 브릿지를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 E는 제1 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환된다(Y349C).
특정 실시형태에서, 도메인 E는 제2 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다. 특정 실시형태에서, 제2 CH3 도메인은 E357W 돌연변이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 불변 영역 도메인 서열은 CH1 서열이다. 특정 실시형태에서, 도메인 E의 CH1 아미노산 서열은 결합 분자에서 유일한 CH1 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, CH1 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다.
특정 실시형태에서, 불변 영역 서열은 CL 서열이다. 특정 실시형태에서, CL 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다.
6.4.4.5 도메인 F
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 F는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 도메인 F는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 도메인 F는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
6.4.4.6 도메인 G
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 G는 불변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 도메인 G는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 G는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: S354C; 및 트리펩티드 삽입, 즉 445P, 446G, 447K. 일부 실시형태에서, 도메인 G는 다음과 같은 돌연변이 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: S354C; 및 445P, 446G, 447K 트리펩티드 삽입. 일부 바람직한 실시형태에서, 도메인 G는 다음과 같은 변화를 갖는 인간 IgG1 CH3 서열을 갖는다: L351D, 및 445G, 446E, 447C의 트리펩티드 삽입.
특정 실시형태에서, 도메인 G는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 G는 CH3 서열 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 브릿지를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 G는 제1 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환된다(Y349C).
특정 실시형태에서, 도메인 G는 제2 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다. 특정 실시형태에서, 제2 CH3 도메인은 E357W 돌연변이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 도메인 G는 인간 IgA CH3 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 도메인 G는 CL 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 도메인 G는 IgE로부터의 CH2 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 도메인 G는 IgM으로부터의 CH2 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 예를 들어 결합 분자의 결합가가 3 또는 3 초과인 경우, 불변 영역 서열은 CH1 또는 CL 서열이다. 도메인 B가 CL 서열인 일부 실시형태에서, 도메인 G는 CH1 서열이다. 일부 실시형태에서, CH1 또는 CL 서열은 본원에서 설명되는 하나 이상의 CH1 또는 Cl 직교 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 도메인 G의 C-말단은 도메인 D의 N-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 도메인 G는 도메인 G와 도메인 D 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
6.4.4.7 도메인 H
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 H는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 도메인 H는 VL 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 도메인 H는 VH 항체 도메인 서열을 갖는다.
6.4.4.8 도메인 I
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 I는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다.
결합 분자의 일련의 바람직한 실시형태에서, 도메인 I는 CL 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 일련의 실시형태에서, 도메인 I는 CH1 아미노산 서열을 갖는다.
6.4.4.9 도메인 J
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 J는 CH2 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, CH2 아미노산 서열은 도메인 J를 도메인 I에 연결하는 N-말단 힌지 영역을 갖는다. 일부 실시형태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, CH2 서열은 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 조절하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, CH2 서열은 FcRN 결합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
도메인 J의 C-말단은 도메인 K의 N-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 도메인 J는 CH1 아미노산 서열 또는 CL 아미노산 서열을 갖는 도메인 K의 N-말단에 연결된다.
6.4.4.10 도메인 K
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 K는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 도메인 K는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 K는 "노브-인-홀"("KIH") 직교 돌연변이를 포함하는 CH3 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 K는 CH3 서열 및 직교 돌연변이를 함유하는 CH3 도메인과 조작된 디설파이드 브릿지를 형성하는 S354C 또는 Y349C 돌연변이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 K는 제1 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환된다(Y349C).
특정 실시형태에서, 도메인 K는 제2 CH3 도메인 서열을 갖고, 여기서 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다. 특정 실시형태에서, 제2 CH3 도메인은 E357W 돌연변이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 노브-인-홀 직교 돌연변이는 동종동질이형체 돌연변이와 조합된다. 특정 실시형태에서, 노브 돌연변이는 T366W 또는 T366Y이다. 특정 실시형태에서, 홀 돌연변이는 T366S, L368A, F405T, Y407V, 또는 Y407T로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 홀 돌연변이는 F405T이다.
특정 실시형태에서, 불변 영역 도메인 서열은 CH1 서열이다. 특정 실시형태에서, 도메인 K의 CH1 아미노산 서열은 결합 분자에서 유일한 CH1 아미노산 서열이다. 특정 실시형태에서, CH1 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다. 특정 실시형태에서, 불변 영역 서열은 CL 서열이다. 특정 실시형태에서, CL 도메인의 N-말단은 CH2 도메인의 C-말단에 연결된다.
6.4.4.11 도메인 L
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 L은 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 도메인 L은 VH 항체 도메인 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 도메인 L은 VL 항체 도메인 서열을 갖는다.
6.4.4.12 도메인 M
도 2를 참조하면, 본원에서 설명되는 항체 구축물의 다양한 실시형태에서, 도메인 M은 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖는다. 일련의 바람직한 실시형태에서, 도메인 I는 CH1 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 CL 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 일련의 바람직한 실시형태에서, 도메인 I는 CL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 CH1 아미노산 서열을 갖는다.
6.4.4.13 도메인 A와 도메인 F의 페어링
도 2에 예시된 항체 구축물에서, 도메인 "A" VL 또는 VH 아미노산 서열과 동족 도메인 "F" VH 또는 VL 아미노산 서열은 회합되어 항원 결합 부위(ABS)를 형성한다. A:F 항원 결합 부위(ABS)는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
다양한 다가 실시형태에서, 도메인 A와 도메인 F(A:F)에 의해 형성된 ABS는 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 ABS와 서열이 동일하고, 따라서 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 서열이 동일한 ABS와 동일한 인식 특이성을 갖는다.
다양한 다가 실시형태에서, A:F ABS는 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 ABS와 서열이 동일하지 않다. 특정 실시형태에서, A:F ABS는 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 서열이 동일하지 않은 ABS의 인식 특이성과 상이한 인식 특이성을 갖는다. 특정 실시형태에서, A:F ABS는 결합 분자에서 적어도 하나의 다른 서열이 동일하지 않은 ABS에 의해 인식되는 것과 상이한 항원을 인식한다. 특정 실시형태에서, A:F ABS는 결합 분자 내의 적어도 하나의 다른, 서열이 동일하지 않은 ABS에 의해 또한 인식되는 항원의 상이한 에피토프를 인식한다. 이들 실시형태에서, 도메인 A 및 F에 의해 형성된 ABS는 항원의 에피토프를 인식하며, 여기서 결합 분자 내의 하나 이상의 다른 ABS는 동일한 항원을 인식하지만 동일한 에피토프는 인식하지 않는다.
6.4.4.14 도메인 B와 도메인 G의 페어링
도 2에 예시된 항체 구축물에서, 도메인 "B" 불변 영역 아미노산 서열과 도메인 "G" 불변 영역 아미노산 서열은 회합된다.
일부 실시형태에서, 도메인 B 및 도메인 G는 CH3 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 제1 CH3 도메인이고, 도메인 G는 제2 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시형태에서, 도메인 B는 제2 CH3 도메인이고, 도메인 G는 제1 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
다양한 실시형태에서, B 및 G 도메인의 아미노산 서열은 동일하다. 이들 중 특정 실시형태에서, 서열은 내인성 CH3 서열이다. 서열은 인간 IgG1의 CH3 서열일 수 있다. 서열은 인간 IgA로부터의 서열일 수 있다.
다양한 실시형태에서, B 및 G 도메인의 아미노산 서열은 상이하고, 내인성 CH3 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 B 도메인은 G 도메인과 상호작용하고, B 도메인과 G 도메인은 모두 직교 변형이 결여된 CH3 도메인과 유의하게 상호작용하지 않는다.
특정 실시형태에서, CH3 서열을 함유하는 도메인 B 또는 G와, CH3 서열을 또한 함유하는 도메인 E 및 K의 원하지 않는 회합을 감소시키는 것이 바람직하다. 그러한 경우, 도메인 B 및/또는 G에서 인간 IgA로부터의 CH3 서열(IgA-CH3)을 사용하면, 이러한 바람직하지 않은 회합을 감소시켜 항체 어셈블리 및 안정성을 향상시킬 수 있다. 도메인 E 및 K가 IgG-CH3 서열을 포함하는 결합 분자의 일부 실시형태에서, 도메인 B 및 G는 IgA-CH3 서열을 포함한다.
6.4.4.15 도메인 E와 도메인 K의 페어링
특정 실시형태에서, 도메인 E는 제1 CH3 도메인이고, 도메인 K는 제2 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시형태에서, 도메인 E는 제2 CH3 도메인이고, 도메인 K는 제1 CH3 도메인이며, 여기서 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C), 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되며, 여기서 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된다.
특정 실시형태에서, 상이한 서열은 내인성 CH3 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 E 도메인은 K 도메인과 상호작용하고, E 도메인과 K 도메인은 모두 직교 변형이 결여된 CH3 도메인과는 유의하게 상호작용하지 않는다. 특정 실시형태에서, 직교 변형은 조작된 디설파이드 브릿지, 노브-인-홀 돌연변이, 및 전하쌍 돌연변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 직교 변형은 조작된 디설파이드 브릿지, 노브-인-홀 돌연변이, 및 전하쌍 돌연변이로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 직교 변형의 조합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 직교 변형은 동종동질이형체 돌연변이와 같은 면역원성을 감소시키는 아미노산 치환과 조합될 수 있다.
다양한 실시형태에서, E 및 K 도메인의 아미노산 서열은 동일하다.
6.4.4.16 도메인 H와 도메인 L의 페어링
다양한 실시형태에서, 도메인 H는 VL 서열을 갖고, 도메인 L은 VH 서열을 갖고, 도메인 "H" VL 도메인 "L" VH 아미노산 서열은 회합되어 항원 결합 부위(ABS)를 형성한다. H:L 항원 결합 부위(ABS)는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 도메인 H는 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 CL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 L은 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 CH1 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 실시형태에서, H 도메인 및 L 도메인의 아미노산 서열은 내인성 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 H 도메인은 L 도메인과 상호작용하고, H 도메인과 L 도메인은 모두 직교 변형이 없는 도메인과 유의하게 상호 작용하지 않는다. 일련의 실시형태에서, H 도메인의 직교 돌연변이는 VL 서열에 있고, L 도메인의 직교 돌연변이는 VH 서열에 있다. 특정 실시형태에서, 직교 돌연변이는 VH/VL 계면에서의 전하쌍 돌연변이이다. 바람직한 실시형태에서, VH/VL 계면에서의 전하쌍 돌연변이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Igawa et al. (Protein Eng. Des. Sel., 2010, vol. 23, 667-677)]에 보다 상세하게 기재된 바와 같이 VL의 상응하는 Q38K와 함께 VH의 Q39E, 또는 VL의 상응하는 Q38E와 함께 VH의 Q39K이다.
특정 실시형태에서, A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용은 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고, H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 특정 실시형태에서, A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용은 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고, H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용은 제1 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
6.4.4.17 도메인 I와 도메인 M의 페어링
다양한 실시형태에서, 도메인 I는 CL 서열을 갖고, 도메인 M은 CH1 서열을 갖는다.
다양한 실시형태에서, I 도메인 및 M 도메인의 아미노산 서열은 내인성 서열에 각각의 직교 변형을 개별적으로 포함하고, 여기서 I 도메인은 M 도메인과 상호작용하고, I 도메인과 M 도메인은 모두 직교 변형이 결여된 도메인과 유의하게 상호작용하지 않는다. 일련의 실시형태에서, I 도메인의 직교 돌연변이는 CL 서열에 있고, M 도메인의 직교 돌연변이는 CH1 서열에 있다.
6.4.4.18 도메인 접합부
6.4.4.18.1 VL 도메인과 CH3 도메인을 연결하는 접합부
다양한 실시형태에서, VL 도메인의 C-말단과 CH3 도메인의 N-말단 사이의 접합부를 형성하는 아미노산 서열은 조작된 서열이다.
특정 실시형태에서, VL 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시형태에서, A111은 VL 도메인의 C-말단에서 결실된다. 특정 실시형태에서, CH3 도메인의 N-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시형태에서, P343은 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시형태에서, P343 및 R344는 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시형태에서, VL 도메인의 C-말단과 CH3 도메인의 N-말단 양자 모두에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시형태에서, A111은 VL 도메인의 C-말단에서 결실되고 P343은 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 바람직한 실시형태에서, A111 및 V110은 VL 도메인의 C-말단에서 결실된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, A111 및 V110은 VL 도메인의 C-말단에서 결실되고, CH3 도메인의 N-말단은 P343V 돌연변이를 갖는다.
6.4.4.18.2 VH 도메인과 CH3 도메인을 연결하는 접합부
다양한 실시형태에서, VH 도메인의 C-말단과 CH3 도메인의 N-말단 사이의 접합부를 형성하는 아미노산 서열은 조작된 서열이다.
특정 실시형태에서, VH 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시형태에서, K117 및 G118은 VH 도메인의 C-말단에서 결실된다. 특정 실시형태에서, CH3 도메인의 N-말단에서 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 부가된다. 특정 실시형태에서, P343은 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시형태에서, P343 및 R344는 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시형태에서, P343, R344, 및 E345는 CH3 도메인의 N-말단에서 결실된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산이 VH 도메인의 C-말단과 CH3 도메인의 N-말단 양자 모두에서 결실되거나 부가된다. 바람직한 실시형태에서, T116, K117, 및 G118은 VH 도메인의 C-말단에서 결실된다.
6.4.4.18.3 CH3 C-말단을 CH2 N-말단에 연결하는 접합부(힌지)
본원에서 설명되는 항체 구축물의 일부 실시형태에서, CH2 도메인의 N-말단은 "힌지" 영역 아미노산 서열을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 힌지 영역은 항체의 N-말단 가변 도메인-불변 도메인 세그먼트와 항체의 CH2 도메인을 연결하는 항체 중쇄의 서열이다. 또한, 힌지 영역은 전형적으로 N-말단 가변 도메인-불변 도메인 세그먼트와 CH2 도메인 사이의 유연성뿐만 아니라, 중쇄(예를 들어, 제1 및 제3 폴리펩티드 사슬) 사이에 디설파이드 브릿지를 형성하는 아미노산 서열 모티프를 제공한다.
다양한 실시형태에서, CH3 아미노산 서열은 CH3 도메인의 C-말단과 CH2 도메인의 N-말단 사이의 접합부에서 C말단에서 연장된다. 특정 실시형태에서, CH3 아미노산 서열은 CH3 도메인의 C-말단과 힌지 영역 사이의 접합부에서 C-말단에서 연장되며, 상기 힌지 영역은 다시 CH2 도메인의 N-말단에 연결된다. 바람직한 실시형태에서, CH3 아미노산 서열은 CH3 아미노산 연장 서열("CH3 링커 서열" 또는 "CH3 링커")을 삽입함으로써 연장된다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열 다음에 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프가 존재한다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열의 길이는 3 내지 10개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열의 길이는 3 내지 8개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열의 길이는 3 내지 6개의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 PGK 트리펩티드이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGC 트리펩티드이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 GEC 트리펩티드이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGKC이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 PGKC이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGKGC이다. 일부 실시형태에서, CH3 아미노산 연장 서열은 AGKGSC이다.
특정 실시형태에서, CH3 도메인의 C-말단에서의 연장부는 또 다른 CH3 도메인의 직교 C-말단 연장부와 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, CH3 도메인의 C-말단에서의 연장부는, 카파 경쇄의 GEC 모티프를 포함하는 또 다른 CH3 도메인의 직교 C-말단 연장부와 디설파이드 결합을 형성하는 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프로 이어지는, KSC 트리펩티드 서열을 포함한다.
도메인 B 및 G가 CH3 아미노산 서열을 포함하는 결합 분자의 일부 실시형태에서, 도메인 B는 제1 CH3 링커 서열을 포함하고, 도메인 G는 제2 CH3 링커 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커 서열은, 제1 CH3 링커 서열과 제2 CH3 링커 서열의 시스테인 잔기들 사이에서의 디설파이드 브릿지의 형성에 의해, 제2 CH3 링커 서열과 회합된다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 길이가 1 내지 6개의 아미노산만큼 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커 및 제2 CH3 링커는 길이가 1 내지 3개의 아미노산만큼 상이하다.
바람직한 실시형태에서, 제1 CH3 링커는 AGC이고, 제2 CH3 링커는 AGKGSC이다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커는 AGKGC이고, 제2 CH3 링커는 AGC이다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커는 AGKGSC이고, 제2 CH3 링커는 AGC이다. 일부 실시형태에서, 제1 CH3 링커는 AGKC이고, 제2 CH3 링커는 AGC이다.
6.4.4.18.4 CL C-말단과 CH2 N-말단을 연결하는 접합부(힌지)
다양한 실시형태에서, CL 아미노산 서열은 그의 C-말단을 통해 힌지 영역에 연결되고, 상기 힌지 영역은 다시 CH2 도메인의 N-말단에 연결된다.
6.4.4.18.5 CH2 C-말단을 불변 영역 도메인에 연결하는 접합부
다양한 실시형태에서, CH2 아미노산 서열은 그의 C-말단을 통해 불변 영역 도메인의 N-말단에 연결된다. 바람직한 실시형태에서, CH2 서열은 그의 내인성 서열을 통해 CH3 서열에 연결된다. 다른 실시형태에서, CH2 서열은 CH1 또는 CL 서열에 연결된다. CH2 서열을 CH1 또는 CL 서열에 연결하는 것을 논의하는 예는 미국 특허 제8,242,247호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
6.4.4.19 2가 이중특이적 B-Body "BC1"
도 2 및 도 3을 참조하면, 일련의 실시형태에서, 항체 구축물은 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩티드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 T366K 돌연변이가 있고 KSC 트리펩티드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산을 갖고; (b) 제2 폴리펩티드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 L351D 돌연변이가 있고 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (c) 제3 폴리펩티드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 K는 Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩티드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 CH1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용 및 B 도메인과 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드는 H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용 및 I 도메인과 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 D 도메인과 J 도메인 사이의 상호작용 및 E 도메인과 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A와 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H와 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 상기 구축물의 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.4.4.20 2가 이중특이적 B-Body "BC6"
도 2 및 도 4를 참조하면, 일련의 실시형태에서, 결합 분자는 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩티드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 KSC 트리펩티드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 가진 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산을 갖고; (b) 제2 폴리펩티드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 GEC 아미노산 디설파이드 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 가진 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (c) 제3 폴리펩티드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩티드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용 및 B 도메인과 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드는 H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용 및 I 도메인과 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 D 도메인과 J 도메인 사이의 상호작용 및 E 도메인과 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A와 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H와 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.4.4.21 2가 이중특이적 B-Body "BC28"
도 2 및 도 5를 참조하면, 일련의 실시형태에서, 결합 분자는 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩티드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 Y349C 돌연변이가 있고 PGK 트리펩티드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 가진 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산을 갖고; (b) 제2 폴리펩티드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 S354C 돌연변이가 있고 PGK 트리펩티드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 가진 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (c) 제3 폴리펩티드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 Y349C, D356E, L358M, T366S, L368A 및 Y407V를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩티드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 CH1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용 및 B 도메인과 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드는 H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용 및 I 도메인과 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 D 도메인과 J 도메인 사이의 상호작용 및 E 도메인과 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A와 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H와 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 B:G 페어링된 도메인 또는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.4.4.22 2가 이중특이적 B-Body "BC44"
도 2 및 도 6을 참조하면, 일련의 실시형태에서, 결합 분자는 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬을 갖고, 여기서 (a) 제1 폴리펩티드 사슬은 도메인 A, 도메인 B, 도메인 D, 및 도메인 E를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 A-B-D-E 배향으로 배열되고, 도메인 A는 제1 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 B는 Y349C 돌연변이, P343V 돌연변이가 있고, PGK 트리펩티드 서열에 이어 IgG1 힌지 영역의 DKTHT 모티프를 포함하는 C-말단 연장부를 가진 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고, 도메인 D는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, 도메인 E는 S354C 돌연변이 및 T366W 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (b) 제2 폴리펩티드 사슬은 도메인 F 및 도메인 G를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 F-G 배향으로 배열되고, 도메인 F는 제1 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 G는 S354C 돌연변이가 있고 PGK 트리펩티드 서열을 포함하는 C-말단 연장부를 가진 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (c) 제3 폴리펩티드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J, 및 도메인 K를 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 제2 VL 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 인간 CL 카파 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 인간 IgG1 CH2 아미노산 서열을 갖고, K는 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 아미노산 서열을 갖고; (d) 제4 폴리펩티드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 갖고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 제2 VH 아미노산 서열을 갖고, 도메인 M은 인간 IgG1 아미노산 서열을 갖고; (e) 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 A 도메인과 F 도메인 사이의 상호작용 및 B 도메인과 G 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (f) 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드는 H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용 및 I 도메인과 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; (g) 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 D 도메인과 J 도메인 사이의 상호작용 및 E 도메인과 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되어 결합 분자를 형성하고; (h) 도메인 A와 도메인 F는 제1 항원에 특이적인 제1 항원 결합 부위를 형성하고; (i) 도메인 H와 도메인 L은 제2 항원에 특이적인 제2 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 설명되는 직교 돌연변이는 B:G 페어링된 도메인 또는 E:K 페어링된 도메인으로 추가로 조작될 수 있다.
6.5. 실시예
아래에서 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 실시형태의 예를 제시한다. 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 약간의 실험적 오류와 편차는 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술 분야의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세하게 설명되어 있다.
6.5.1. 실시예 1 - "BC96" 2가 항체 구축물
본 발명자들은 특정 헤테로다이머화를 유도하기 위해 다양한 직교 돌연변이를 포함하는, 제1 항원인 "항원 A" 및 제2 항원인 "항원 B"에 대해 특이적인, "BC96"으로 명명되는 새로운 2가 이중특이적 구축물을 구축하였다. 예시적인 "BC96" 구조의 핵심적인 특징은 도 7에 도시된다.
보다 상세하게는, 도 2에 따른 도메인 및 폴리펩티드 사슬 참조, 괄호 안에 표시된 야생형 서열의 돌연변이, 및 하기 섹션 5에 제시된 서열을 사용해 그 구조는 하기와 같다:
제1 폴리펩티드 사슬 (SEQ ID NO:1)
도메인 A=VL ("항원 A")
도메인 B=CH3 (Y349C; K370R) (SEQ ID NO:5)
도메인 D=CH2 (SEQ ID NO:6)
도메인 E=CH3 (T366W) (SEQ ID NO:7)
제2 폴리펩티드 사슬 (SEQ ID NO:2)
도메인 F=VH ("항원 A")
도메인 G=CH3 (G341A; S354C; E357W) (SEQ ID NO:8)
제3 폴리펩티드 사슬 (SEQ ID NO:3)
도메인 H=VL ("항원 B")
도메인 I=CL (카파) (SEQ ID NO:9)
도메인 J=CH2 (SEQ ID NO:10)
도메인 K=CH3 (D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V) (SEQ ID NO:11)
제4 폴리펩티드 사슬 (SEQ ID NO:4)
도메인 L=VH ("항원 B")
도메인 M=CH1 (SEQ ID NO:12).
A 도메인 및 F 도메인은 "항원 A"에 특이적인 항원 결합 부위(A:F)를 형성한다. H 도메인과 L 도메인은 회합하여 "항원 B"에 특이적인 항원 결합 부위(H:L)를 형성한다.
B 도메인(SEQ ID NO:5)은 두 개의 돌연변이인 Y349C 및 K370R을 가진 인간 IgG1 CH3의 서열을 가진다. Y349C 돌연변이는 도메인 G에서 동족 C354 돌연변이와 디설파이드를 형성할 수 있는 시스테인을 도입하는 반면, K370R 돌연변이는 사슬 G에서 357W 돌연변이의 맥락에 포함될 경우 올바르게 형성된 분자의 수율을 증가시킬 수 있다.
도메인 D(SEQ ID NO:6)는 인간 IgG1 CH2의 서열을 가진다.
도메인 E(SEQ ID NO:7)는 돌연변이 T366W가 있는 인간 IgG1 CH3의 서열을 가진다. 366W는 "노브" 돌연변이이다.
도메인 G(SEQ ID NO:8)는 돌연변이 G341A, S354C, 및 E357W를 가진 인간 IgG1 CH3의 서열을 가진다. G341A 돌연변이는 올바르게 형성된 분자의 수율을 증가시킬 수 있고, 354C 돌연변이는 도메인 B에서 동족 349C 돌연변이와 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 시스테인을 도입하고, E357W 돌연변이는 헤테로다이머 계면의 직교성을 개선시키고 올바르게 형성된 분자의 수율을 증가시킬 수 있다.
도메인 I(SEQ ID NO:9)는 인간 C 카파 경쇄(Cκ)의 서열을 가진다.
도메인 J(SEQ ID NO:10)는 인간 IgG1 CH2의 서열을 갖고, 도메인 D의 서열과 동일하다.
도메인 K(SEQ ID NO:11)는 변경 D356E, L358M, T366S, L368A, Y407V가 있는 인간 IgG1 CH3의 서열을 가진다. 356E 및 L358M은 면역원성을 감소시키는 동종동질이형체 아미노산을 도입한다. 366S, 368A, 및 407V는 "홀" 돌연변이이다.
도메인 M(SEQ ID NO:12)은 인간 IgG1 CH1의 서열을 가진다.
SEQ ID NO:1 내지 12에서 밑줄 그은 야생형으로부터 돌연변이된 모든 위치와 함께 서열들을 하기의 섹션 5에 제공한다. 4개의 가변 도메인에 대한 서열은 완전히 제공되지 않으나, 그 대신 항원 결합 부위 "A" 및 "B" 각각에 대해 <VL-A>, <VH-A>, 및 <VL-B>, <VH-B>로 표시한다. 접합 융합 지점을 표시하기 위해, "EIK"인 전형적인 인간 카파 VL 도메인에서의 마지막 3개의 아미노산이 포함되고 이탤릭체로 표시되며, "VSS"인 전형적인 인간 VH 도메인에서의 마지막 3개의 아미노산이 포함되고 이탤릭체로 표시된다.
구축물 BC-1, BC-6, BC-28, 및 BC-44와 대조적으로, 도 7에 나타낸 BC-96의 실시형태는 도메인 E:K에서 조작된 디설파이드가 생략되어 있다. 묘사된 구조와 대안적인 실시형태는 하기를 포함한다: (a) 도메인 E:K에서 조작된 디설파이드 결합을 포함하는 것; (b) 도메인 E:K 사이의 노브-인-홀 돌연변이를 뒤집는 것(flipping); (c) 도메인 B:G에서 Y+K:S+E 쌍을 뒤집는 것; 또는 이들의 임의의 하위세트 또는 조합. 추가적으로, CH3 도메인에서 기타 알려진 직교 돌연변이가, 도메인 E:K에서 노브-인-홀 돌연변이 대신에 또는 이에 덧붙여서 사용될 수 있다.
"BC96"은 100 μg/ml 초과의 농도에서 포유동물 발현을 이용하여 높은 수준에서 손쉽게 발현될 수 있다. 본 발명자들은 2가 이중특이적 "BC96" 단백질이 ThermoFisher의 CH1-특이적 CaptureSelect™ 친화성 수지를 이용하여 단일 단계로 용이하게 정제될 수 있음을 알아냈다.
BC96의 적절한 어셈블리에 대한 다양한 돌연변이의 기여도를 탐구하기 위해, BC96 단백질을 대체물과 함께 발현하였다. 각 구축물의 CH1 정제 후의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 결과는 제1 CH3 도메인에서 E357W 돌연변이 및 제1 CH3 도메인의 반대편에 있는 제2 CH3 도메인에서 K370R 돌연변이의 존재가 더 높은 순도의 적절히 어셈블리된 생성물을 생산하는 데 중요하다는 점을 입증한다(도 8a 내지 도 8d). 도메인 B에서 K370 돌연변이와 도메인 G에서 E357 돌연변이 양자 모두가 결여되고(도 8a), 도메인 B에서 K370 돌연변이가 결여되어 있으나 도메인 G에서 E357W 돌연변이를 함유하고(도 8b), 도메인 B에서 K370R을 함유하나 도메인 G에서 E357 돌연변이가 결여된(도 8c) BC96 변이체를, 도메인 B에서 K370R 돌연변이와 도메인 G에서 E357W 돌연변이 둘 모두를 함유하는 BC96(도 8d)과 비교하였다. 그 결과는, 제1 CH3 도메인에서 E357W 돌연변이 및 반대편 CH3 도메인에서 K370R의 존재가 BC96 항체 구축물의 적절한 어셈블리 및 2개의 도메인의 다이머화의 효율을 현저하게 개선시킨다는 점을 입증한다.
6.5.2. 실시예 2 - 개선된 CH3 다이머화를 위한 CH3 변형 평가
개별 돌연변이에 의해 부여된 직교성 정도를 평가하기 위해, 뚜렷하게 상이한 질량을 갖는 두 측으로 이루어진 비대칭 항체 구축물을 생성하였다(도 9). Fc 영역의 CH3 도메인에서(도메인 E 및 K) 돌연변이를 만들었다. 구축물의 각 편을 구성하는 폴리펩티드를 공동 발현하고, SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용해 호모다이머 오염체 및 원하는 헤테로다이머 생성물의 어셈블리를 평가하였다(도 10a 내지 도 10c 및 도 11a 및 도 11b).
평가된 각 구축물은 Y349C 돌연변이가 있는 CH3 도메인(도메인 E) 및 S354C 돌연변이가 있는 반대편 CH3 도메인(도메인 K)을 함유했고, 적절히 어셈블리된 생성물에서 2개의 CH3 도메인 사이에 조작된 디설파이드를 생성하였다(도 9). 도메인 K의 CH3 서열에 추가적인 치환을 가하여, E357W 및/또는 S364R 돌연변이도 또한 함유하는 구축물을 생성하였다. 정제 후, SDS-PAGE 겔을 이용하여, 큰 호모다이머 오염체(오염체 1)와 작은 호모다이머 오염체(오염체 2)의 존재를 크기에 의해 원하는 헤테로다이머와 용이하게 구별할 수 있다.
그 결과, 도메인 K의 CH3 서열에서 E357과 S364 돌연변이 양자 모두의 부재 하에서 두 호모다이머 오염체 모두의 유의미한 어셈블리가 나타났다(도 10a). 도메인 K의 CH3 서열이 E357W 돌연변이를 함유하나 S364 돌연변이를 함유하지 않는 경우, 더 적은 오염체 1 호모다이머가 생성되었다(도 10b 및 도 11a). 반대로, 도메인 K의 CH3 서열이 E357W 돌연변이와 S364R 돌연변이 양자 모두를 함유하는 경우, 어떠한 오염체 1 호모다이머도 사실상 검출가능하지 않았다(도 10c 및 도 11b).
도 10a 내지 도 10c의 결과는 단백질 A로 정제 후의 SEC 및 SDS-PAGE에 의한 생성물의 분석을 나타낸다. 도 11a 및 도 11b의 결과는 CH1로 정제 후의 SEC 및 SDS-PAGE에 의한 생성물의 분석을 나타낸다.
그 결과는, 제1 CH3 도메인에서 S354C, E357W 및 S364R 돌연변이 및 제1 도메인의 반대편인 제2 CH3 도메인에서 Y349C 돌연변이의 존재가 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인의 다이머화를 필요로 하는 생성물의 어셈블리의 효율을 현저히 개선시킬 수 있음을 시사한다.
7. 서열
BC96 사슬 1 SEQ ID NO:1
BC96 사슬 2 SEQ ID NO:2
BC96 사슬 3 SEQ ID NO:3
BC96 사슬 4 SEQ ID NO:4
BC96 도메인 B SEQ ID NO:5
BC96 도메인 D SEQ ID NO:6
BC96 도메인 E SEQ ID NO:7
BC96 도메인 G SEQ ID NO:8
BC96 도메인 I SEQ ID NO:9
BC96 도메인 J SEQ ID NO:10
BC96 도메인 K SEQ ID NO:11
BC96 도메인 M SEQ ID NO:12
BC96 사슬 1 DNA 서열 (VL을 포함하지 않음) SEQ ID NO:13
BC96 사슬 2 DNA 서열 (VH를 포함하지 않음) SEQ ID NO:14
사슬 3 DNA 서열 (VH를 포함하지 않음) SEQ ID NO:15
사슬 4 DNA 서열 (VH를 포함하지 않음) SEQ ID NO:16
BC96-A 사슬 1 SEQ ID NO:17
BC96-A 사슬 2 SEQ ID NO:18
BC96-A 도메인 B SEQ ID NO:19
BC96-A 도메인 G SEQ ID NO:20
8. 균등물 및 참조에 의한 포함
본 발명은 특히 바람직한 실시형태 및 다양한 대체 실시형태를 참조하여 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고, 그 형태 및 상세 사항에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
본 명세서의 본문 내에서 인용된 모든 참조문헌, 발행된 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.

Claims (38)

  1. 헤테로다이머 단백질로서,
    제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며,
    여기서,
    a) 제1 폴리펩티드 사슬은 제1 CH3 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드 사슬은 제2 CH3 도메인을 포함하고,
    b) 제1 CH3 도메인의 Y349는 시스테인(C)으로 치환되고(Y349C),
    c) 제2 CH3 도메인의 S354는 시스테인(C)으로 치환되고(S354C), 및
    d) 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 또는 방향족 아미노산으로 치환되고,
    상기 위치는 Eu 인덱스에 따라 넘버링된 것인, 헤테로다이머 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 소수성 아미노산 잔기는 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 프롤린(P), 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 헤테로다이머 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 CH3 도메인의 E357은 소수성 아미노산으로 치환되는, 헤테로다이머 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 소수성 아미노산 잔기는 메티오닌(M)인(E357M), 헤테로다이머 단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 방향족 아미노산 잔기는 히스티딘(H), 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 및 티로신(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 헤테로다이머 단백질.
  6. 제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, E357은 방향족 아미노산으로 치환되는, 헤테로다이머 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 방향족 아미노산 잔기는 트립토판(W)인(E357W), 헤테로다이머 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CH3 도메인의 S364는 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 리신(K), 류신(L), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 트레오닌(T), 트립토판(W), 및 티로신(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되는, 헤테로다이머 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CH3 도메인의 S364는 아르기닌(R)으로 치환되는(S364R), 헤테로다이머 단백질.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CH3 도메인의 K370은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 및 티로신(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되는, 헤테로다이머 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 제1 CH3 도메인의 K370은 아르기닌(R)으로 치환되는(K370R), 헤테로다이머 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각 CH3 도메인은 독립적으로 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgGA1, 또는 IgGA2 CH3 도메인으로부터 선택되는, 헤테로다이머 단백질.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 양 CH3 도메인은 동일하게 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgGA1, 또는 IgGA2 CH3 도메인으로부터 선택되는, 헤테로다이머 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 양 CH3 도메인은 인간 IgG1 도메인인, 헤테로다이머 단백질.
  15. 제13항에 있어서, 양 CH3 도메인은 인간 IgG4 도메인인, 헤테로다이머 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 CH3 도메인에 어떠한 추가의 조작된 돌연변이도 존재하지 않는, 헤테로다이머 단백질.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 CH3 도메인에 적어도 하나의 추가의 조작된 돌연변이가 존재하는, 헤테로다이머 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 조작된 돌연변이 중 적어도 하나는 제1 CH3 도메인에서의 노브 돌연변이 및 제2 CH3 도메인에서의 홀 돌연변이인, 헤테로다이머 단백질.
  19. 제17항에 있어서, 제1 CH3 도메인에 홀 돌연변이가 존재하고, 제2 CH3 도메인에 노브 돌연변이가 존재하는, 헤테로다이머 단백질.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 노브 돌연변이는 T366W인, 헤테로다이머 단백질.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 홀 돌연변이는 T366S, L368A, F405T, 또는 Y407V로부터 선택되는, 헤테로다이머 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 홀 돌연변이는 F405T인, 헤테로다이머 단백질.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 조작된 돌연변이 중 적어도 하나는 조작된 전하쌍인, 헤테로다이머 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 제1 CH3 도메인은 L351D 돌연변이를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 T366K 돌연변이를 포함하는, 헤테로다이머 단백질.
  25. 제23항에 있어서, 제2 CH3 도메인은 L351D 돌연변이를 포함하고, 제1 CH3 도메인은 T366K 돌연변이를 포함하는, 헤테로다이머 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬 각각은 면역글로불린 가변 도메인을 추가로 포함하는, 헤테로다이머 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는, 헤테로다이머 단백질.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는, 헤테로다이머 단백질.
  29. 제26항에 있어서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬 양자 모두는 VH 도메인을 포함하는, 헤테로다이머 단백질.
  30. 제26항에 있어서,
    (a) 제1 폴리펩티드 사슬은 VH 도메인을 포함하고 제2 폴리펩티드 사슬은 VL 도메인을 포함하거나, 또는
    (b) 제1 폴리펩티드 사슬은 VL 도메인을 포함하고 제2 폴리펩티드 사슬은 VH 도메인을 포함하고, 및
    여기서 제1 폴리펩티드의 가변 도메인과 제2 폴리펩티드의 가변 도메인은 회합하여 제1 항원 결합 부위(ABS)를 형성하고, 상기 헤테로다이머 단백질은 항체 구축물을 형성하는 헤테로다이머 단백질.
  31. 제30항에 있어서, VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 CH2 도메인 및 제3 CH3 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬되는, 항체 구축물:
    a) VH-제1 CH3-CH2-제3 CH3,
    b) VH-제2 CH3-CH2-제3 CH3,
    c) VH-제3 CH3-CH2-제1 CH3, 또는
    d) VH-제3 CH3-CH2-제2 CH3.
  32. 제31항에 있어서, VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬되는, 항체 구축물:
    a) VH-제1 CH3-CH2-제3 CH3, 또는
    b) VH-제2 CH3-CH2-제3 CH3.
  33. 제30항에 있어서, VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬은 CH2 도메인 및 제3 CH3 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬되는, 항체 구축물:
  34. 제33항에 있어서, VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 도메인은 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬되는, 항체 구축물:
  35. 34항에 있어서, VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 도메인은 각각 N 말단에서 C 말단으로 다음과 같이 정렬되는, 항체 구축물:
    a)
    제1 폴리펩티드 사슬

    제2 폴리펩티드 사슬
    , 또는
    b)
    제1 폴리펩티드 사슬

    제2 폴리펩티드 사슬
  36. 제35항에 있어서, 상기 항체 구축물은 제3 폴리펩티드 사슬 및 제4 폴리펩티드 사슬을 추가로 포함하며, 여기서
    (a) 제3 폴리펩티드 사슬은 도메인 H, 도메인 I, 도메인 J 및 도메인 K를 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 H-I-J-K 배향으로 배열되고, 도메인 H는 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 I는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 도메인 J는 CH2 아미노산 서열을 갖고, 및 도메인 K는 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고;
    (b) 제4 폴리펩티드 사슬은 도메인 L 및 도메인 M을 포함하고, 여기서 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 L-M 배향으로 배열되고, 도메인 L은 가변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고, 및 도메인 M은 불변 영역 도메인 아미노산 서열을 갖고;
    (c) 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드는 제2 항원 결합 부위(ABS)를 형성하는 H 도메인과 L 도메인 사이의 상호작용 및 I 도메인과 M 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되고; 및
    (d) 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 D 도메인과 J 도메인 사이의 상호작용 및 E 도메인과 K 도메인 사이의 상호작용을 통해 회합되는, 항체 구축물.
  37. 제36항에 있어서,
    도메인 H는 VL 도메인이고;
    도메인 I는 CL 도메인이고;
    도메인 J는 CH2 도메인이고; 및
    도메인 K는 제4 CH3 도메인인, 항체 구축물.
  38. 제37항에 있어서,
    도메인 L은 VH 도메인이고; 및
    도메인 M은 CH1 도메인인, 항체 구축물.
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