KR20230118029A

KR20230118029A - ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicle containing diselenide-bearing hydrocarbon and loaded with mitochondrial-targeted sonosensitizers and its sonodynamic therapy

Info

Publication number: KR20230118029A
Application number: KR1020230012176A
Authority: KR
Inventors: 심민석
Original assignee: 인천대학교 산학협력단
Priority date: 2022-02-03
Filing date: 2023-01-30
Publication date: 2023-08-10

Abstract

본 발명은 디셀레나이드 함유 탄화수소를 포함하고 미토콘드리아 표적형 초음파감작제가 탑재된 ROS/GSH 이중 감응성 세포 외 소포체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 디셀레나이드를 함유하여 ROS/GSH 이중 감응성을 가지고 미토콘드리아 표적형 초음파감작제가 탑재되어 있어, 초음파 조사에 의해 초음파감작제에 의해 발생하는 ROS에 의해 세포 외 소포체가 분해되고 또한 세포 내 높은 GSH 조건에서 세포 외 소포체가 분해되면서 초음파감작제와 항암제의 세포 내 전달 효율이 개선된 ROS/GSH 이중 감응성 세포 외 소포체 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicle containing a diselenide-containing hydrocarbon and loaded with a mitochondrial-targeted ultrasonic sensitizer and a use thereof, and more particularly, to a ROS/GSH dual-sensitivity containing diselenide. It is loaded with a mitochondrial-targeted ultrasonic sensitizer, so when irradiated with ultrasonic waves, ROS generated by the ultrasonic sensitizer degrades extracellular vesicles and also under high intracellular GSH conditions, extracellular vesicles are disassembled, thereby reducing the effects of ultrasonic sensitizers and anticancer agents. It relates to ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicles with improved intracellular delivery efficiency and uses thereof.

Description

ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicle containing diselenide-containing hydrocarbon and loaded with mitochondrial-targeted sonosensitizer {ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicle containing diselenide-bearing hydrocarbon and loaded with mitochondrial-targeted sonosensitizers and its sonodynamic therapy}

본 발명은 디셀레나이드 함유 탄화수소를 포함하고 미토콘드리아 표적형 초음파감작제가 탑재된 ROS/GSH 이중 감응성 세포 외 소포체 및 이를 이용한 초음파역학 치료제에 관한 것으로, 더 상세하게는 디셀레나이드를 함유하여 ROS/GSH 이중 감응성을 가지고 미토콘드리아 표적형 초음파감작제가 탑재되어 있어, 초음파 조사에 의해 초음파감작제에 의해 발생하는 ROS 또는 암세포 내 높은 GSH 농도에 의해 세포 외 소포체가 분해되어 탑재된 초음파감작제와 항암제의 세포 내 전달 효율이 개선된 ROS/GSH 이중감응성 세포 외 소포체 및 이를 이용한 초음파역학 치료제에 관한 것이다.The present invention relates to ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicles containing diselenide-containing hydrocarbons and loaded with a mitochondrial-targeted sonosensitizer, and to sonodynamic therapeutics using the same, and more particularly, to ROS/GSH containing diselenide. It has dual sensitivity and is loaded with a mitochondrial-targeted ultrasonic sensitizer. ROS generated by the ultrasonic sensitizer or high concentration of GSH in cancer cells degrades extracellular vesicles by ultrasonic irradiation, and the loaded ultrasonic sensitizer and anticancer drug enter the cells. It relates to ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicles with improved delivery efficiency and sonodynamic therapeutics using the same.

활성 산소종 (ROS)은 살아있는 유기체의 세포 대사 반응의 부산물이며 세포 신호 및 항상성에 관여한다. ROS를 통하여 암 세포를 사멸할 수 있음이 밝혀지면서, 세포 내 ROS를 조절하는 새로운 항암 요법이 대두되고 있다. 광역학 요법 (PDT)은 광조사 하에서 감광제에 의해 생성된 외인성 ROS를 사용하는 최소 침습 치료 방법이다. PDT는 전신 독성이 낮고, 종양을 선택적으로 파괴할 수 있음에도 불구하고, 빛이 조직 내 침투할 수 있는 깊이의 제한으로, 이를 임상 적용하는데 한계가 있다. 따라서, 심부 조직에서 ROS를 생성할 수 있는 새로운 치료 시스템에 대한 관심이 집중되고 있는데, 초음파역학 치료 (sonodynamic therapy, SDT)는 초음파 (US) 노출시 초음파감작제에서 생성된 ROS를 활용하기 때문에 암 치료에서 PDT의 잠재적인 대안으로 큰 주목을 받고 있다. 초음파는 더 깊은 조직까지 침투할 수 있어, SDT는 PDT로 효과적으로 치료할 수 없는 심부 종양 치료에 적용될 수 있는 장점이 있다. 또한 SDT는 초음파가 특정 종양 부위에 정밀한 초점을 맞출 수 있기 때문에 주변 정상 세포에 대한 손상을 최소화하며 암세포를 선택적으로 파괴할 수 있는 장점이 있다. Reactive oxygen species (ROS) are by-products of cellular metabolic reactions in living organisms and are involved in cell signaling and homeostasis. As it has been found that cancer cells can be killed through ROS, new anticancer therapies that regulate intracellular ROS have emerged. Photodynamic therapy (PDT) is a minimally invasive treatment method using exogenous ROS generated by photosensitizers under light irradiation. Although PDT has low systemic toxicity and can selectively destroy tumors, its clinical application is limited due to the limited depth at which light can penetrate into tissues. Therefore, attention is focused on a new treatment system that can generate ROS in deep tissue. Sonodynamic therapy (SDT) utilizes ROS generated from sonosensitizer when exposed to ultrasound (US), so cancer cancer It is receiving great attention as a potential alternative to PDT in therapy. Since ultrasound can penetrate deeper tissues, SDT has the advantage of being applicable to the treatment of deep tumors that cannot be effectively treated with PDT. In addition, SDT has the advantage of being able to selectively destroy cancer cells while minimizing damage to surrounding normal cells because ultrasound can be precisely focused on a specific tumor site.

SDT의 치료 효과는 초음파감작제의 효과에 의존적이기 때문에, SDT를 성공하기 위해서는 안전하고 효율적인 초음파감작제의 개발이 특히 중요하다. 대부분의 유기 초음파감작제는 소수성이므로 생리 환경에서 응집이 발생하기 쉽다. 또한 약동학적 특성이 좋지 않고 암 특이성이 낮다. 초음파감작제의 이러한 한계를 극복하기 위하여 최근 나노전달체(nano carrier)가 개발되었다(Maeda, H. et al., J. Controlled Release 2000, 65, 271-284). 나노전달체는 난용성 초음파감작제의 세포 내 전달을 크게 개선시킬 수 있으며 향상된 투과성 및 유지 (enhanced permeability and retention, EPR) 효과를 통해 종양 영역에 초음파감작제를 우선적으로 수송할 수 있다. 그러나 일부 합성 나노전달체는 예상치 못한 독성과 면역원성을 유도할 수 있어, 초음파감작제를 캡슐화하는 안전하고 생체 적합성인 나노전달체를 개발하는 것이 SDT의 임상 적용을 위해 매우 중요하다.Since the therapeutic effect of SDT is dependent on the effect of the ultrasonic sensitizer, the development of a safe and efficient ultrasonic sensitizer is particularly important for the success of SDT. Since most organic sonosensitizers are hydrophobic, they are prone to aggregation in physiological environments. It also has poor pharmacokinetic properties and low cancer specificity. In order to overcome these limitations of ultrasonic sensitizers, nano carriers have recently been developed (Maeda, H. et al., J. Controlled Release 2000, 65, 271-284). The nanocarrier can greatly improve the intracellular delivery of poorly soluble sonosensitizers and preferentially transport the sonosensitizers to the tumor region through enhanced permeability and retention (EPR) effects. However, some synthetic nanocarriers can induce unexpected toxicity and immunogenicity, so developing safe and biocompatible nanocarriers encapsulating sonosensitizers is very important for the clinical application of SDT.

세포에서 생성된 나노 크기 (30-150 nm) 막 소포인 엑소좀이 최근 다목적 생체 적합성 나노 운반체로 등장하였는데, 엑소좀은 내인성 기원이므로, 뛰어난 생체 적합성과 긴 혈액 순환 반감기를 가지며, 면역원성이 거의 없다. 따라서 엑소좀은 다양한 소수성 및 친수성 약물을 효율적으로 운반할 수 있는 임상적으로 이용 가능한 약물 운반체로 간주되어 왔으며, 또한 엑소좀은 EPR 효과를 통해 종양에 선택적으로 축적될 수 있다는 장점을 갖는다(Antimisiaris, S. et al., Pharmaceutics, 2018, 10, 218).Cell-generated nano-sized (30-150 nm) membrane vesicles, exosomes, have recently emerged as a multipurpose biocompatible nanocarrier. Because exosomes are of endogenous origin, they have excellent biocompatibility, a long blood circulation half-life, and almost no immunogenicity. does not exist. Therefore, exosomes have been considered as clinically available drug carriers that can efficiently deliver various hydrophobic and hydrophilic drugs, and also have the advantage that exosomes can selectively accumulate in tumors through the EPR effect (Antimisiaris, S. et al., Pharmaceutics, 2018, 10, 218).

한편, 미토콘드리아는 세포 내 에너지 대사에 관여하는 중요한 세포 내 소기관으로서 미토콘드리아 파괴는 세포 사멸과 직결되어 항암제의 표적 기관으로 간주된다. 특히, 미토콘드리아 표적형 초음파감작제를 사용하게 되면 초음파 조사시 미토콘드리아 내에 활성산소를 발생시켜 미토콘드리아를 파괴하고 이를 통한 에너지 생성을 차단함으로써 세포 사멸을 유도할 수 있고, 초음파를 사용하므로 특정 암세포에만 선택적인 세포 사멸을 유도할 수 있다. On the other hand, mitochondria are an important intracellular organelle involved in intracellular energy metabolism, and mitochondrial destruction is directly related to cell death and is considered a target organ of anticancer drugs. In particular, when a mitochondrial-targeted ultrasonic sensitizer is used, cell death can be induced by generating active oxygen within the mitochondria during ultrasonic irradiation to destroy the mitochondria and block energy generation through it. can induce cell death.

특히, ROS-감응성 세포 외 소포체를 이용하여 초음파감작제를 암세포로 전달하면, 초음파를 조사할 때 초음파감작제에서 발생하는 ROS에 의해 세포 외 소포체가 분해되어 초음파감작제를 세포 내로 많은 양 전달할 수 있고, 다른 항암제를 같이 탑재하는 경우 초음파에 의해 on-demand 방식으로 항암제 방출을 유도하여 암세포 표적형 항암 치료 효능을 구현할 수 있는 장점이 있다.In particular, when ultrasonic sensitizers are delivered to cancer cells using ROS-sensitive extracellular vesicles, the extracellular vesicles are disassembled by ROS generated from ultrasonic sensitizers when ultrasonic waves are irradiated, so that a large amount of ultrasonic sensitizers can be delivered into cells. When loaded with other anticancer drugs, there is an advantage in realizing the efficacy of cancer cell-targeted anticancer treatment by inducing the release of anticancer drugs in an on-demand manner by ultrasound.

또한, 암조직 주변의 미세환경은 정상조직의 미세환경과 다르게 항산화물질인 GSH (글루타치온)의 농도가 높으며 이로 인해 암세포의 성장과 전이가 발생하고, 특히, 세포 내부는 세포 외부보다 GSH의 농도가 훨씬 더 높은 것으로 알려져 있다. In addition, unlike the microenvironment of normal tissue, the microenvironment around cancer tissue has a high concentration of the antioxidant GSH (glutathione), which causes cancer cell growth and metastasis. In particular, the concentration of GSH inside the cell is higher than that outside the cell. known to be much higher.

본 발명자들은 세포 외 소포체가 나노 약물 전달체로 이용되고 있으나, 약물 방출을 능동적으로 제어하기 어렵다는 점에 착안하여 초음파감작제의 암세포 내 전달 효율을 향상시킴과 동시에 능동적으로 약물을 방출할 수 있는 방법을 모색하던 중, ROS와 GSH에 모두 감응하여 분해되는 디셀레나이드기를 함유하는 탄화수소를 신규하게 합성할 수 있었고 이를 세포 외 소포체와 혼합하여 인큐베이션 시키는 경우 간이한 방법으로 ROS/GSH 이중 감응성 세포 외 소포체가 제작될 수 있음을 확인하였으며, 상기 세포 외 소포체 내부에 초음파감작제 또는 항암제를 탑재하고, 이들 초음파감작제 또는 항암제에 미토콘드리아 표적 물질을 부착하는 경우, 초음파역학 치료 효과가 현저히 개선될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Although extracellular vesicles are used as nano-drug delivery systems, the present inventors focused on the fact that it is difficult to actively control drug release, and developed a method for actively releasing drugs while improving the delivery efficiency of ultrasonic sensitizers into cancer cells. During the search, it was possible to newly synthesize a hydrocarbon containing a diselenide group that is responsive to both ROS and GSH and degraded. When this is mixed with extracellular vesicles and incubated, ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicles can be obtained by a simple method. It was confirmed that it can be manufactured, and it was confirmed that the effect of sonodynamic therapy can be significantly improved when an ultrasonic sensitizer or an anticancer agent is loaded inside the extracellular vesicle and a mitochondrial target substance is attached to the ultrasonic sensitizer or anticancer agent. By doing so, the present invention was completed.

Maeda, H. et al., J. Controlled Release 2000, 65, 271-284Maeda, H. et al., J. Controlled Release 2000, 65, 271-284 Antimisiaris, S. et al., Pharmaceutics, 2018, 10, 218Antimisiaris, S. et al., Pharmaceutics, 2018, 10, 218

본 발명의 목적은 ROS/GSH 이중감응성 신규 화합물, 이를 포함하는 세포 외 소포체 및 이의 용도를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a novel ROS/GSH dual-sensitive compound, an extracellular vesicle containing the same, and a use thereof.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명은 10 내지 100개의 탄소 및 디셀레나이드를 함유하는, 디셀레나이드 함유 탄화수소를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a diselenide-containing hydrocarbon containing 10 to 100 carbons and diselenide.

본 발명에 있어서, 상기 디셀레나이드 함유 탄화수소는 화학식 Ⅰ로 표시되는 것을 특징으로 한다:In the present invention, the diselenide-containing hydrocarbon is characterized in that it is represented by Formula I:

화학식 ⅠFormula I

본 발명은 또한 상기 디셀레나이드 함유 탄화수소를 포함하는 세포 외 소포체를 제공한다. The present invention also provides an extracellular vesicle containing the diselenide-containing hydrocarbon.

본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 미토콘드리아 표적형 초음파감작제가 탑재되어 있는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the extracellular endoplasmic reticulum is characterized in that a mitochondria-targeted ultrasonic sensitizer is loaded.

본 발명에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적형 초음파감작제는 Triphenylphosphine(TPP), guanidine, (E)-4-(1H-Indol-3-ylvinyl)-N-methylpyridinium iodide 및 dequalinium로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 미토콘드리아 표적 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the mitochondrial targeting ultrasonic sensitizer is any one selected from the group consisting of triphenylphosphine (TPP), guanidine, (E) -4- (1H-Indol-3-ylvinyl) -N-methylpyridinium iodide and dequalinium It is characterized in that it contains a mitochondrial targeting substance of.

본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 항암제가 추가로 탑재되어 있는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the extracellular endoplasmic reticulum is characterized in that an anticancer agent is additionally loaded.

본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 ROS/GSH 자극에 이중으로 반응하여 세포 내부로 세포 외 소포체에 탑재되는 약물 및/또는 초음파감작제를 방출하는 것을 특징으로 한다. In the present invention, the extracellular vesicles are characterized in that they release drugs and/or ultrasonic sensitizers loaded on extracellular vesicles into cells in a dual response to ROS/GSH stimulation.

본 발명은 또한, 상기 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는, 종양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating tumors, comprising the extracellular vesicles as an active ingredient.

본 발명은 또한, 상기 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는, 영상 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnostic imaging comprising the extracellular vesicles as an active ingredient.

본 발명에 따른 디셀레나이드기가 함유된 탄화수소는 우수한 ROS/GSH 이중 감응성을 발휘하며, 간단한 제조방법으로 세포 외 소포체에 혼입될 수 있고, 내부에 초음파감작제를 탑재하는 경우 초음파 조사에 따라 초음파감작제에 의해 발생하는 ROS에 의해 세포 외 소포체가 분해되며 탑재된 초음파감작제를 암세포 내로 효율적, 선택적으로 전달할 수 있는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 세포 외 소포체는 디셀레나이드에 포함된 셀레늄이 CT 조영제로 사용될 수 있는바, 영상화와 동시에 초음파역학 치료가 가능하여 테라그노스틱 (theragnostic) 초음파역학치료제로 활용이 가능할 것이다. The hydrocarbon containing the diselenide group according to the present invention exhibits excellent ROS/GSH dual sensitivity, can be incorporated into extracellular vesicles by a simple manufacturing method, and is ultrasonically sensitized by ultrasonic irradiation when an ultrasonic sensitizer is loaded therein. Extracellular vesicles are degraded by ROS generated by the agent, and the loaded ultrasonic sensitizer can be efficiently and selectively delivered into cancer cells. In addition, the extracellular vesicles according to the present invention can be used as a theragnostic sonodynamic therapy because selenium contained in diselenide can be used as a CT contrast agent, sonodynamic treatment can be performed simultaneously with imaging. .

도 1은 디셀레나이드(Diselenide)기를 함유하는 탄화수소(hydrocarbon) 합성 방법을 나타낸다.
도 2A는 미토콘드리아 표적형 TPP가 결합된 IR780 합성 방법을 나타내고, 도 2B는 초음파감작제인 TPP-IR780과 IR780의 미토콘드리아 표적 효율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 디셀레나이드(Diselenide) 기를 함유하는 탄화수소가 포함된 EV의 TEM 사진을 나타낸다. Scale bar = 100 nm
도 4는 디셀레나이드(Diselenide) 기를 함유하는 탄화수소가 포함된 EV의 Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) 맵핑을 나타낸다. Scale bar = 50 nm
도 5는 초음파 (US) 조사 및 ROS 조건에서 DSe-EV(TPP-IR780)의 약물 방출 거동을 보여준다 (pH 7.4, 37 ℃초음파 조사와 H₂O₂ 존재하에서 더 많은 TPP-IR780이 방출되었다.
도 6은 초음파 (US) 조사 및 GSH 조건에서 DSe-E(T-Ce6/FX11)의 T-Ce6(A)와 FX11(B)의 약물 방출 거동을 보여준다
도 7은 EV(TPP-IR780)와 SeSe-EV(TPP-IR780)의 초음파 조사에 따른 MCF-7 내 ROS 생성 비교한 결과이다.
도 8은 EV(TPP-IR780)와 SeSe-EV(TPP-IR780)의 초음파 조사 (1 MHz, 0.3 W/cm², 2 min)에 따른 MCF-7 내 세포 독성 비교한 결과이다.
도 9는 T-Ce6, FX11, E(T-Ce6/FX11), DSe-E(T-Ce6/FX11)의 초음파 조사 (1 MHz, 0.3 W/cm², 2 min)에 따른 MCF-7 내 세포 독성 비교한 결과이다.
도 10은 T-Ce6, FX11, E(T-Ce6/FX11), DSe-E(T-Ce6/FX11)의 정맥 투여 및 US 방사선 조사 후 14일 동안 MCF-7 종양 보유 마우스(n = 4)의 종양 성장 비율을 정규화(A)하고, 정맥 투여 후 14일 동안 MCF-7 종양 보유 마우스(n = 4)의 체중 변화(B)를 관찰한 결과이다.
도 11은 디셀레나이드(Diselenide) 기를 함유하는 탄화수소가 포함된 EV가 농도 의존적으로 강한 CT 신호를 발생시킴을 확인한 결과이다. 1 shows a method for synthesizing a hydrocarbon containing a diselenide group.
2A shows a method for synthesizing IR780 coupled with mitochondria-targeting TPP, and FIG. 2B shows a result of comparing mitochondrial targeting efficiencies of TPP-IR780 and IR780, which are ultrasonic sensitizers.
3 shows a TEM picture of EVs containing hydrocarbons containing a diselenide group. Scale bar = 100 nm
4 shows energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) mapping of EVs containing hydrocarbons containing a diselenide group. Scale bar = 50 nm
Figure 5 shows the drug release behavior of DSe-EV (TPP-IR780) under ultrasonic (US) irradiation and ROS conditions (pH 7.4, 37 °C ultrasonic irradiation and H ₂ O ₂ more TPP-IR780 was released.
Figure 6 shows the drug release behavior of T-Ce6 (A) and FX11 (B) of DSe-E (T-Ce6/FX11) under ultrasonic (US) irradiation and GSH conditions.
7 is a comparison result of ROS generation in MCF-7 according to ultrasonic irradiation of EV (TPP-IR780) and SeSe-EV (TPP-IR780).
8 is a comparison result of cell toxicity in MCF-7 according to ultrasonic irradiation (1 MHz, 0.3 W/cm ² , 2 min) of EV (TPP-IR780) and SeSe-EV (TPP-IR780).
Figure 9 is the MCF-7 according to ultrasonic irradiation (1 MHz, 0.3 W / cm ² , 2 min) of T-Ce6, FX11, E (T-Ce6 / FX11), DSe-E (T-Ce6 / FX11) This is the result of comparing cytotoxicity.
Figure 10 shows MCF-7 tumor-bearing mice (n = 4) for 14 days after intravenous administration of T-Ce6, FX11, E (T-Ce6/FX11), DSe-E (T-Ce6/FX11) and US irradiation. This is the result of normalizing the tumor growth rate of (A) and observing the weight change (B) of MCF-7 tumor-bearing mice (n = 4) for 14 days after intravenous administration.
FIG. 11 is a result confirming that EVs containing a hydrocarbon containing a diselenide group generate a strong CT signal in a concentration-dependent manner.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is one well known and commonly used in the art.

본 발명에서는 ROS/GSH 이중 감응성 디셀레나이드기를 함유하는 탄화수소를 신규하게 합성하고 이를 세포 외 소포체와 혼합하여 인큐베이션 시키는 경우 간이한 방법으로 ROS/GSH 이중 감응성 세포 외 소포체가 제작될 수 있음을 확인하였으며, 상기 세포 외 소포체 내부에 초음파감작제를 탑재하고 상기 초음파감작제에 미토콘드리아 표적 물질을 부착하는 경우, 초음파역학 치료 효과가 현저히 개선될 수 있음을 확인하였다. In the present invention, it was confirmed that ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicles can be prepared by a simple method when a hydrocarbon containing a ROS/GSH dual-sensitive diselenide group is newly synthesized and mixed with extracellular vesicles for incubation. , It was confirmed that the sonodynamic treatment effect can be remarkably improved when the sonosensitizer is loaded inside the extracellular endoplasmic reticulum and the mitochondrial target material is attached to the sonosensitizer.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 10 내지 100개의 탄소 및 디셀레나이드를 함유하는, 디셀레나이드 함유 탄화수소에 관한 것이다.Accordingly, the present invention in one aspect relates to diselenide-containing hydrocarbons containing 10 to 100 carbons and diselenide.

본 발명에 있어서, 상기 디셀레나이드 함유 탄화수소는 화학식 Ⅰ로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:In the present invention, the diselenide-containing hydrocarbon may be characterized in that it is represented by Formula I:

화학식 ⅠFormula I

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 탄화수소는 총 10 내지 100개의 탄소를 함유하도록 포화 또는 불포화 탄화수소의 수가 변경될 수 있다. In the present invention, the number of saturated or unsaturated hydrocarbons may be changed so that the hydrocarbons of formula (I) contain 10 to 100 carbons in total.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 디셀레나이드 함유 탄화수소를 포함하는 세포 외 소포체에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an extracellular vesicle containing the diselenide-containing hydrocarbon.

본 명세서에서, 상기 디셀레나이드 함유 탄화수소를 포함하는 세포 외 소포체는 SeSe-EV 또는 DSe-EV의 약어로 표시될 수 있다. In the present specification, the extracellular vesicles containing the diselenide-containing hydrocarbons may be abbreviated as SeSe-EV or DSe-EV.

본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 미토콘드리아 표적형 초음파감작제가 탑재되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the extracellular endoplasmic reticulum may be characterized in that a mitochondrial-targeted ultrasonic sensitizer is loaded.

본 발명에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적형 초음파감작제는 Triphenylphosphine(TPP), guanidine, (E)-4-(1H-Indol-3-ylvinyl)-N-methylpyridinium iodide 및 dequalinium로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 미토콘드리아 표적 물질을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. In the present invention, the mitochondrial targeting ultrasonic sensitizer is any one selected from the group consisting of triphenylphosphine (TPP), guanidine, (E) -4- (1H-Indol-3-ylvinyl) -N-methylpyridinium iodide and dequalinium It may be characterized in that it includes a mitochondrial target material of, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 초음파감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 로다민(rhodamine)계 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물, 보디피계 (BODIPY) 화합물 및 인도시아닌 그린으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 바람직하게는 상기 초음파감작제는 IR780일 수 있다. In the present invention, the ultrasonic sensitizer is a porphyrin compound, a phthalocyanine compound, a rhodamine compound, a naphthalocyanine compound, a BODIPY compound, and an indocyanine. It may be any one or more selected from the group consisting of green, but is not limited thereto, and preferably, the ultrasonic sensitizer may be IR780.

본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 항암제가 추가로 탑재되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the extracellular endoplasmic reticulum may be characterized in that an anticancer agent is additionally loaded thereon.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 해당작용 억제제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. In the present invention, the anticancer agent may be a glycolysis inhibitor, but is not limited thereto.

예컨대, 상기 해당작용 억제제는 FX11일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.For example, the glycolysis inhibitor may be FX11, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 발루비신(valrubicin)으로 구성된 군에서 선택되는 항암제인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. In the present invention, the anticancer agent is cyclophosphamide, mecholrethamine, uramustine, melphalan, chlorambucil, ifosfamide , bendamustine, carmustine, lomustine, streptozocin, busulfan, dacarbazine, temozolomide, thiotepa ), altretamine, duocarmycin, cisplatin, carboplatin, nedaplatin, oxaliplatin, satraplatin, triple Triplatin tetranitrate, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, capecitabine, cladribine, clofarabine ), cystarbine, floxuridine, fludarabine, gemcitabine, hydroxyurea, methotrexate, pemetrexed, pentostatin (pentostatin), thioguanine, camptothecin, topotecan, irinotecan, etoposide, teniposide, mitoxantrone, paclitaxel ), docetaxel, izabepilone, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, estramustine, maytansine ), DM1 (mertansine), DM4, dolastatin, auristatin E, auristatin F, monomethyl auristatin E, monomethyl An anticancer agent selected from the group consisting of auristatin F (monomethyl auristatin F), doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin and valrubicin It may be characterized, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 초음파 조사하여 ROS를 생성하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the extracellular vesicles may be characterized by generating ROS by irradiating with ultrasound.

본 발명에 있어서, 상기 초음파는 0.3 내지 1.0 W/cm², 바람직하게는 0.4 내지 0.7 W/cm²의 강도로 조사되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the ultrasound may be irradiated with an intensity of 0.3 to 1.0 W/cm ² , preferably 0.4 to 0.7 W/cm ² , but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 ROS/GSH 자극에 이중으로 반응하여 세포 내부로 세포 외 소포체에 탑재되는 임의의 약물 및/또는 초음파감작제 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the extracellular vesicles may be characterized in that they release any drug and/or sonosensitizer loaded on the extracellular vesicles into the cells in a dual response to ROS/GSH stimulation.

본 발명에 있어서, 종양이란 양성 종양 및 악성 종양(암)을 모두 포함한다. In the present invention, tumors include both benign tumors and malignant tumors (cancer).

본 발명에 있어서, 상기 종양은 골발생 육종, 연조직 육종, 유방암, 폐암, 뇌암, 방광암, 갑상선암, 전립선암, 결장암, 직장암, 췌장암, 위암, 간암, 자궁암, 신장암, 자궁경부암, 피부암, 식도암 및 난소암; 호지킨 림프종, 비-호지킨, 신경교세포종, 흑색종, 골수종, 윌름스 종양, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수아세포 백혈병, 별아교세포종, 신경아교종 및 망막모세포종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the tumor is osteogenic sarcoma, soft tissue sarcoma, breast cancer, lung cancer, brain cancer, bladder cancer, thyroid cancer, prostate cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, liver cancer, uterine cancer, kidney cancer, cervical cancer, skin cancer, esophageal cancer, and ovarian cancer; Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's, glioblastoma, melanoma, myeloma, Wilms' tumor, acute lymphoblastic leukemia, acute myeloblastic leukemia, astrocytoma, glioma, and retinoblastoma. It may, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 세포 외 소포체는 초음파 역학 치료의 방법 및, 동시에, 생체내 이미지형성의 방법(예를 들면 진단 영상의 방법)에도 사용될 수 있다. 이와 같은 방법에서, 이미지형성은 관심 표적 부위에서 세포 외 소포체 탑재물의 침착 및/또는 축적을 모니터링하는데 사용될 수 있다. The extracellular vesicles according to the present invention can be used in a method of sonodynamic therapy and, at the same time, a method of in vivo imaging (eg, a method of diagnostic imaging). In such a method, imaging can be used to monitor deposition and/or accumulation of extracellular endoplasmic reticulum payloads at a target site of interest.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 세포 외 소포체를 유효성분으로 포함하는, 영상 진단용 조성물에 관한 것이다.Accordingly, from another aspect, the present invention relates to a composition for diagnostic imaging comprising the extracellular vesicles as an active ingredient.

본 발명에 있어서, 상기 디셀레나이드 함유 탄화수소 내의 셀레늄 자체가 조영제로 작용할 수 있으며, 상기 디셀레나이드 함유 탄화수소는 예컨대 computed tomography (CT) 조영제로 사용될 수 있다. In the present invention, selenium itself in the diselenide-containing hydrocarbon may act as a contrast agent, and the diselenide-containing hydrocarbon may be used as a contrast agent for computed tomography (CT), for example.

따라서, 본 발명에 따른 ROS/GSH 이중 감응성 세포 외 소포체는 영상 진단과 동시에 초음파역학 치료가 가능한 바, 테라그노스틱 (theragnostic) 초음파역학치료제로 사용될 수 있다. Therefore, the ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicles according to the present invention can be used as a theragnostic sonodynamic therapy agent because they can perform sonodynamic therapy simultaneously with imaging diagnosis.

최근 연구에서는 질병 또는 암 관련 경로에 관련된 분자는 HEK-293T 세포 유래 세포 외 소포체에서 증가되지 않으며, 동물 연구에서 독성 및 면역 반응이 일반적으로 경미하다는 것이 입증된 바, 세포 외 소포체는 인간 배아 신장 HEK-293T 세포를 배양하여 분리되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 우유와 식물을 포함한 다른 세포 외 소포체 공급원의 사용도 약물 전달을 위한 대체 수단으로 고려될 수 있음은 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. Recent studies have shown that molecules involved in disease or cancer-related pathways are not increased in HEK-293T cell-derived extracellular vesicles, and animal studies have demonstrated that toxicity and immune responses are generally mild. It is preferable to isolate by culturing -293T cells, but is not limited thereto. It will be apparent to those skilled in the art that the use of other sources of extracellular vesicles, including milk and plants, may also be considered alternative means for drug delivery.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 당해 분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 제형화될 수 있다. 투여 경로는 의도한 용도에 따라 좌우될 것이다. 전형적으로, 이들은 전신으로 투여될 것이며 따라서 비경구 투여, 예를 들면 진피내, 피하, 복강내 또는 정맥내 주사에 의한 투여에 적합한 형태로 제공될 수 있다. 적합한 약제학적 형태는 세포 외 소포체를 하나 이상의 캐리어 또는 부형제와 함께 함유하는 현탁액 및 용액을 포함한다. 적합한 캐리어는 염수, 멸균수, 포스페이트 완충 식염수 및 이들의 혼합물을 포함한다. A pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated using techniques well known in the art. The route of administration will depend on the intended use. Typically, they will be administered systemically and may therefore be provided in a form suitable for parenteral administration, for example by intradermal, subcutaneous, intraperitoneal or intravenous injection. Suitable pharmaceutical forms include suspensions and solutions containing extracellular vesicles together with one or more carriers or excipients. Suitable carriers include saline, sterile water, phosphate buffered saline and mixtures thereof.

상기 약학적 조성물은 다른 제제 예컨대 유화제, 현탁화제, 분산제, 가용화제, 안정제, 완충제, 보존제, 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 종래의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다.The pharmaceutical composition may further include other agents such as emulsifiers, suspending agents, dispersing agents, solubilizers, stabilizers, buffers, preservatives, and the like. The pharmaceutical composition may be sterilized by conventional sterilization techniques.

상기 세포 외 소포체를 함유하는 용액은, 예를 들면 제제 예컨대 점도 조절제, 유화제, 가용화제, 등의 첨가에 의해 안정화될 수 있다.A solution containing the extracellular vesicles may be stabilized, for example, by the addition of agents such as viscosity modifiers, emulsifiers, solubilizers, and the like.

바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 약학적 조성물은 물 또는 염수 용액, 예를 들면 포스페이트-완충 식염수 중의 수성 현탁액의 형태로 사용될 것이다. 엑소좀은 사용현장에서 재구성을 위해, 예를 들면 물, 염수 또는 PBS에서의 재구성을 위해 동결건조된 분말의 형태로 공급될 수 있다. Preferably, the pharmaceutical compositions for use in the present invention will be used in the form of an aqueous suspension in water or saline solution, for example phosphate-buffered saline. Exosomes can be supplied in the form of a lyophilized powder for reconstitution at the point of use, for example in water, saline or PBS.

본 발명은 상기 세포 외 소포체를 함유하는 치료적 유효량의 조성물의 투여를 포함한다. 이후 세포 외 소포체를 신체의 원하는 부분 또는 표적체 부분에 분포되도록 한다. 일단 신체에 투여되면, 표적체 부분에서 원하는 치료 효과를 달성하는 빈도 및 강도로 초음파에 노출시킨다. The present invention includes administration of a therapeutically effective amount of a composition containing the extracellular vesicles. The extracellular vesicles are then distributed to the desired or target part of the body. Once administered to the body, it is exposed to ultrasound at a frequency and intensity that achieves the desired therapeutic effect in the target area.

본 발명에 기재된 조성물의 효과적인 용량은 본 발명에 따른 세포 외 소포체의 성질, 투여 방식, 치료될 병태, 환자 등에 의존적일 것이며 이에 따라 조정될 수 있다.The effective dose of the compositions described herein will depend on the nature of the extracellular vesicles according to the present invention, the mode of administration, the condition to be treated, the patient, etc. and can be adjusted accordingly.

사용될 수 있는 초음파의 빈도 및 강도는 표적 부위에서 세포 외 소포체에 탑재된 초음파감작제, 예컨대 IR780 또는 Ce-6의 활성화를 유도하기 위한 필요에 기반하여 선택될 수 있으며, 초음파 주파수는 전형적으로 의료용 초음파에 사용되는 0.1 내지 15 MHz, 바람직하게는 0.1 내지 3 MHz 범위일 것이다. 초음파의 강도 (즉 전력 밀도)는 약 0.01 W/cm² 내지 약 10 W/cm², 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 W/cm²의 범위일 수 있다. 치료 시간은 전형적으로 10초 내지 600초, 바람직하게는 30초 내지 300초의 범위일 것이고 이것은 선택된 강도에 의존적일 것이며, 즉 낮은 초음파 강도의 경우 치료 시간은 장기적일 것이고 더 높은 초음파 강도의 경우 치료 시간은 더 낮을 것이다. 초음파는 연속 또는 펄스 방식으로 적용될 수 있고 집중적이거나 주상 빔으로서 전달될 수 있다.The frequency and intensity of ultrasound that can be used can be selected based on the need to induce activation of an extracellular endoplasmic reticulum-loaded sonosensitizer, such as IR780 or Ce-6, at the target site, and the ultrasound frequency is typically medical ultrasound. will be in the range of 0.1 to 15 MHz, preferably 0.1 to 3 MHz. The intensity (ie power density) of the ultrasound may range from about 0.01 W/cm ² to about 10 W/cm ² , preferably from about 0.1 to about 1 W/cm ² . The treatment time will typically range from 10 seconds to 600 seconds, preferably from 30 seconds to 300 seconds and this will depend on the selected intensity, ie for lower ultrasound intensities the treatment time will be longer and for higher ultrasound intensities the treatment time will be longer. will be lower Ultrasound can be applied in a continuous or pulsed fashion and can be delivered as a focused or columnar beam.

음향 에너지 (예를 들면 초음파)를 생산할 수 있는 임의의 공급원이 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 공급원은 에너지를 표적 부위에 지시할 수 있어야 하며, 예를 들면, 탐침 또는 에너지를 상기 표적 조직으로 지시할 수 있는 디바이스를 포함할 수 있다. Any source capable of producing acoustic energy (eg ultrasound) can be used in the methods described herein. The source must be capable of directing energy to a target site and may include, for example, a probe or a device capable of directing energy to the target tissue.

본 발명에 따른 디셀레나이드기를 함유하는 탄화수소를 포함하는 세포 외 소포체는 내부에 탑재된 초음파감작제(예를 들어, TPP-IR780 또는 T-Ce6)가 초음파에 의해 ROS를 발생시키고 이로 인해 세포 외 소포체의 붕괴가 일어나면서 내부에 탑재된 약물(예컨대, FX11)이 방출될 수 있다. 또한 세포 내 높은 GSH 농도에 의해서도 세포 외 소포체에 포함된 디셀레나이드가 분해되면서 약물(예컨대, FX11)의 방출 효율이 증가된다. 즉, 본 발명은 초음파(외부 자극)와 GSH (세포 내 자극)에 둘다 반응하여 약물을 방출함으로써 암세포 내부로 약물 방출을 극대화시키는 효과를 발휘하느느 것으로, 초음파에 의한 On-demand 약물 방출도 추가적으로 얻을 수 있는 특징이 있다. The ultrasonic sensitizer (for example, TPP-IR780 or T-Ce6) loaded inside the extracellular vesicles containing hydrocarbons containing a diselenide group according to the present invention generates ROS by ultrasonic waves, thereby causing extracellular Disruption of the endoplasmic reticulum may release a drug (eg, FX11) loaded therein. In addition, diselenide contained in extracellular vesicles is decomposed by high intracellular GSH concentrations, increasing the release efficiency of drugs (eg, FX11). That is, the present invention exhibits the effect of maximizing drug release into cancer cells by releasing drugs in response to both ultrasound (external stimulation) and GSH (intracellular stimulation), and on-demand drug release by ultrasound is additionally performed. There are features you can get.

또한, 본 발명에 따른 ROS/GSH 이중감응성 세포 외 소포체는 디클로로메탄에 용해된 디셀레나이드 함유 탄화수소와 PBS 상의 세포 외 소포체를 혼합하고, 초음파 처리하는 단순한 제조방법으로 셀레나이드 함유 탄화수소를 세포 외 소포체 사이사이에 혼입할 수 있다. 이와 같은 제작방법은 종래 세포 외 소포체에 셀레늄을 부착하는 기술과 비교하여, 세포 외 소포체에 높은 비율의 셀레나이드 함유 탄화수소를 혼입시킬 수 있는바, ROS/GSH 반응성을 현저히 개선하고 약물 방출량을 극대화 시킬 수 있는 장점이 있다. In addition, the ROS/GSH dual-sensitive extracellular vesicles according to the present invention is a simple manufacturing method of mixing diselenide-containing hydrocarbons dissolved in dichloromethane and extracellular vesicles in PBS and ultrasonicating them, and converting selenide-containing hydrocarbons into extracellular vesicles. Can be mixed in between. Compared to the conventional technique of attaching selenium to extracellular vesicles, this manufacturing method can incorporate a high proportion of selenide-containing hydrocarbons into extracellular vesicles, significantly improving ROS / GSH reactivity and maximizing drug release. There are advantages to being able to

실시예 Example

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for exemplifying the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

이하 별도로 표시되지 않은 화합물은 Sigma Aldrich 제품을 사용하였다. Sigma Aldrich products were used for compounds not separately indicated below.

실시예 1. 디셀레나이드 함유 탄화수소(Diselenide-bearing hydrocanbon) 합성 Example 1. Synthesis of diselenide-bearing hydrocanbon

디셀레나이드 함유 탄화수소는 도 1과 같은 반응으로 합성하였다.Diselenide-containing hydrocarbons were synthesized by the same reaction as in FIG.

구체적으로, 2.3g의 Se 파우더를 10 mL 저온수에 녹여 Se 용액을 제조하고, 2.5g의 NaBH₄를 저온수 20 mL에 녹인 후, 이를 한방울씩 Se 용액에 넣어 주었다. 2.3g의 Se 파우더를 추가로 넣고 반응 용액의 색깔이 붉은 오렌지색으로 변할때까지 반응시켰다. 이후 반응온도를 105℃로 올리고, 30분 추가 반응시켰다. 6.5g의 브로모 프로피온산(bromo propionic acid)을 20 mL 물에 녹이고 이를 위 용액에 용액의 색깔이 뿌옇게 될 때까지 조금씩 넣어주었다. 색깔이 변하면 온도를 상온으로 낮추어 주었다. 반응물을 필터 페이퍼 (Whatman) 여과한 후, 필터 위에 걸리진 물질(노란색)을 pH 2-3 용액에 넣고 녹인 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출된 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) (Silica gel 60, Thermo Scientific)를 이용하여 정제하였다. Specifically, 2.3 g of Se powder was dissolved in 10 mL of cold water to prepare a Se solution, and 2.5 g of NaBH ₄ was dissolved in 20 mL of cold water, and then added drop by drop to the Se solution. 2.3 g of Se powder was additionally added and reacted until the color of the reaction solution changed to reddish orange. Thereafter, the reaction temperature was raised to 105° C., and the reaction was performed for an additional 30 minutes. 6.5 g of bromo propionic acid was dissolved in 20 mL of water and added little by little to the above solution until the color of the solution became hazy. When the color changed, the temperature was lowered to room temperature. After filtering the reactant with a filter paper (Whatman), the material (yellow) caught on the filter was dissolved in a pH 2-3 solution and extracted with ethyl acetate. The extracted product was purified using silica gel column chromatography (Silica gel 60, Thermo Scientific).

위에서 합성된 산물인 0.6g 의 3,3'-diselanediyldipropionic acid와 3.8g의 N,N,N′′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uranium hexafluorophosphate (HBTU)와 1.3g의 N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)를 2mL dimethylformamide에 넣고 30분간 상온에서 반응을 한다. 그 후 2.5g oleylamine을 넣고 12시간 상온에서 반응을 진행한다. 반응 종료 후, 혼합물을 차가운 물에 넣고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출된 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) (Silica gel 60, Thermo Scientific)을 통해 정제하였다0.6 g of 3,3'-diselanediyldipropionic acid and 3.8 g of N,N,N′′ -Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uranium hexafluorophosphate (HBTU) and 1.3 g of N ,N -Diisopropylethylamine (DIPEA) was added to 2mL dimethylformamide and reacted at room temperature for 30 minutes. After that, 2.5 g of oleylamine was added and the reaction proceeded at room temperature for 12 hours. After completion of the reaction, the mixture was poured into cold water and extracted with ethyl acetate. The extracted product was purified through silica gel column chromatography (Silica gel 60, Thermo Scientific).

실시예 2. 미토콘드리아 표적물질인 Triphenylphosphine (TPP)이 결합된 IR780 및 TPP가 결합된 Ce6 합성Example 2. Synthesis of Triphenylphosphine (TPP)-linked IR780 and TPP-linked Ce6, a mitochondrial target material

2-1. TPP-IR7802-1. TPP-IR780

1.1g의 3-Bromopropylamine hydrobromide (Sigma Aldrich)과 2.6g의 Triphenylphosphine(TPP) (Sigma Aldrich)을 50 mL acetonitrile에 녹인 후 80℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) (Silica gel 60, Thermo Scientific)을 통해 TPP-NH₂를 수득하였다. 0.3g 의 TPP-NH₂와 1 g의 IR780 iodide (TCI)를 DMF에 녹인 후 80℃에서 5시간 동안 반응을 한 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) (Silica gel 60, Thermo Scientific)를 통해 정제하여 하여 TPP-IR780을 수득하였다 (도 2A). After dissolving 1.1 g of 3-Bromopropylamine hydrobromide (Sigma Aldrich) and 2.6 g of Triphenylphosphine (TPP) (Sigma Aldrich) in 50 mL acetonitrile, reacting at 80 ° C for 12 hours, silica gel column chromatography TPP-NH ₂ was obtained through (Silica gel 60, Thermo Scientific). After dissolving 0.3 g of TPP-NH ₂ and 1 g of IR780 iodide (TCI) in DMF and reacting at 80 ° C for 5 hours, silica gel column chromatography (Silica gel 60, Thermo Scientific) was purified through to obtain TPP-IR780 (FIG. 2A).

합성된 TPP-IR780을 human breast cancer cell인 MCF-7 (ATCC, USA)에 처리하여 세포 내 미토콘드리아 흡수 효율을 IR780과 비교하였다. MCF-7 (ATCC, USA), a human breast cancer cell, was treated with the synthesized TPP-IR780, and the mitochondrial uptake efficiency in cells was compared with that of IR780.

구체적으로 샘플 처리 24시간 전 MCF 세포를 6-웰 플레이트(1 × 10⁶개 세포/웰)에 분주하였다. 그 후 10μg/mL 농도의 IR780과 TPP-IR780을 세포에 투여한 후, 4시간 후에 세포 내 미토콘드리아를 Mitochondria/Cytosol Fractionation Kit (BioVision, San Francisco Bay, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. 그 후, 미토콘드리아 내 IR780의 농도를 유세포분석기를 이용하여 정량하였다.Specifically, 24 hours before sample treatment, MCF cells were dispensed into a 6-well plate (1 × 10 ⁶ cells/well). Thereafter, IR780 and TPP-IR780 were administered to the cells at a concentration of 10 μg/mL, and after 4 hours, the mitochondria in the cells were extracted using the Mitochondria/Cytosol Fractionation Kit (BioVision, San Francisco Bay, CA, USA). Then, the concentration of IR780 in mitochondria was quantified using a flow cytometer.

그 결과, TPP-IR780이 세포 내 미토콘드리아에 40% 이상 더 많이 축적되는 것을 확인하였다 (도 2B).As a result, it was confirmed that more than 40% of TPP-IR780 was accumulated in the intracellular mitochondria (Fig. 2B).

2-2. T-Ce62-2. T-Ce6

T-Ce6를 제조하기 위해 Ce6(0.168mmol, 1당량) (Hangzhou Dayangchem Co.　Ltd. (Hangzhou, China). 100mg을 128.8mg의 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3′EDC·HCl)(0.672mmol, 4당량) (Sigma Aldrich) 및 82.1mg의 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, DMAP)(0.672mmol, 4당량) (Sigma Aldrich)와 5mL 디메틸포름아미드(dimethylforamide, DMF) (Sigma Aldrich)에서 혼합하였다. 반응 혼합물을 실온 암실에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 2mL의 DMF에 324.3mg의 2-히드록시에틸 TPP (0.84mmol, 5당량) (Sigma Aldrich)를 용해하여 상기 혼합물에 첨가하고 실온에서 24시간 동안 교반하였다. To prepare T-Ce6, Ce6 (0.168 mmol, 1 equivalent) (Hangzhou Dayangchem Co.　Ltd. (Hangzhou, China). 100 mg was mixed with 128.8 mg of 1-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)carbodiimide. (1-ethyl-3-(3′EDC HCl) (0.672 mmol, 4 equiv) (Sigma Aldrich) and 82.1 mg of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) (0.672 mmol, 4 equiv) (Sigma Aldrich) and 5 mL of dimethylformamide (DMF) (Sigma Aldrich).The reaction mixture was stirred at room temperature in the dark for 2 hours. Then, in 2 mL of DMF, 324.3 mg of 2-hydroxyethyl TPP (0.84 mmol , 5 equivalents) (Sigma Aldrich) was dissolved and added to the above mixture and stirred at room temperature for 24 hours.

조 생성물을 차가운 디에틸 에테르(Sigma Aldrich)를 사용하여 침전시키고 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.The crude product was precipitated using cold diethyl ether (Sigma Aldrich) and purified by silica gel column chromatography.

실시예 3. TPP-IR780 또는 T-Ce6이 탑재된 HEK-293 유래 세포 외 소포체 (extracellular vesicle, EV) 제조Example 3. Preparation of HEK-293-derived extracellular vesicles (EV) loaded with TPP-IR780 or T-Ce6

3-1. TPP-IR7880이 탑재된 EV3-1. EV with TPP-IR7880

디셀레나이드 함유 탄화수소(DBH, 20mg/mL) 및 TPP-IR780(20mg/mL)의 스톡 용액을 각각 디클로로메탄(DCM) 및 DMSO에서 제조하였다. 0.1mg의 DBH를 500㎕ PBS 상의 5 × 10¹¹ EV에 혼합하였다. DBH를 EV에 탑재하기 위하여, 4℃에서 DBH와 PBS 상의 EV 혼합물에 초음파 처리(20% 진폭, 30초 켜기 및 30초 끄기 6주기)하였다. 그 결과, 도 3의 TEM 이미지에서 확인되는 바와 같이, 디셀레나이드(-SeSe-)를 가지는 EV[SeSe(EV)]가 제작되었다. Stock solutions of diselenide-containing hydrocarbons (DBH, 20 mg/mL) and TPP-IR780 (20 mg/mL) were prepared in dichloromethane (DCM) and DMSO, respectively. 0.1 mg of DBH was mixed to 5×10 ¹¹ EV in 500 μl PBS. To load DBH into EVs, the mixture of DBH and EV in PBS was sonicated (6 cycles of 20% amplitude, 30 sec on and 30 sec off) at 4 °C. As a result, as confirmed in the TEM image of FIG. 3, EV [SeSe(EV)] having diselenide (-SeSe-) was produced.

이후, TPP-IR780이 탑재된 디셀레나이드(-SeSe-)-함유 세포 외 소포체[SeSe-EV(TPP-IR780)]를 제조하기 위하여, DMSO 중 0.1mg의 TPP-IR780을 인산완충식염수(PBS) 중 DBH/EV 혼합물에 첨가하고 (PBS 중 총 DMSO 백분율은 4%[v/v]로 조정됨), 4℃ 암실에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 이 과정을 통해 TPP-IR780을 EV에 캡슐화하고 EV 멤브레인을 회수하였다. SeSe-EV(TPP-IR780)는 PD G-25 탈염 컬럼을 사용하여 정제되었다. Subsequently, in order to prepare diselenide (-SeSe-)-containing extracellular vesicles [SeSe-EV (TPP-IR780)] loaded with TPP-IR780, 0.1 mg of TPP-IR780 in DMSO was added in phosphate buffered saline (PBS ) to the DBH/EV mixture (total DMSO percentage in PBS adjusted to 4% [v/v]) and incubated for 2 hours at 4°C in the dark. Through this process, TPP-IR780 was encapsulated in EV and the EV membrane was recovered. SeSe-EV (TPP-IR780) was purified using a PD G-25 desalting column.

3-2. T-Ce6와 FX11이 탑재된 EV3-2. EV with T-Ce6 and FX11

미토콘드리아 표적형 T-Ce6와 해당작용 억제제인 FX11가 동시 탑재되어 있는 디셀레나이드 함유 탄화수소가 탑재된 EV DSe-E(T-Ce6/FX11)를 다음과 같이 제조하였다. EV DSe-E (T-Ce6/FX11) loaded with diselenide-containing hydrocarbons loaded with mitochondria-targeting T-Ce6 and glycolysis inhibitor FX11 was prepared as follows.

디셀레나이드 함유 탄화수소(DBH, 0.05mg)을 PBS 함유 5 × 10¹¹ EV 480μL에 혼합하고, 혼합물을 3분 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 0.2mg의 T-Ce6 및 0.05mg의 FX11를 상기 혼합물에 첨가하고 4℃에서 4시간 동안 암실에서 교반하였다. PD G-25 탈염 컬럼을 사용하여 로드되지 않은 DBH, T-Ce6 및 FX11을 제거하였다. Diselenide-containing hydrocarbons (DBH, 0.05 mg) were mixed into 480 μL of 5×10 ¹¹ EV containing PBS, and the mixture was sonicated for 3 minutes. After sonication, 0.2 mg of T-Ce6 and 0.05 mg of FX11 were added to the mixture and stirred at 4° C. for 4 hours in the dark. Unloaded DBH, T-Ce6 and FX11 were removed using a PD G-25 desalting column.

이와 같이 정제된 SeSe-EV를 TEM grid에 올려 건조시킨 후 Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) (Talos F200X, FEI, Hillsboro, OR, USA) 분석하였다. After drying the purified SeSe-EV on a TEM grid, it was analyzed by energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) (Talos F200X, FEI, Hillsboro, OR, USA).

그 결과, 도 4에서와 같이 세포 외 소포체 내 P 원소와 Se원소의 존재를 확인하였고 이를 근거로 세포 외 소포체 내 디셀레나이드 함유 탄화수소가 포함되어 있음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 4, the presence of P element and Se element in extracellular vesicles was confirmed, and based on this, it was confirmed that diselenide-containing hydrocarbons were included in extracellular vesicles.

실시예 4. SeSe-EV(TPP-IR780 또는 T-Ce6/FX11)의 약물 방출 프로파일Example 4. Drug release profile of SeSe-EV (TPP-IR780 or T-Ce6/FX11)

SeSe-EV(TPP-IR780)(10μg/mL)는 PBS 또는 10μM H₂O₂ 함유 PBS 또는 100μM H₂O₂ 함유 PBS에서 준비되었다. 이들 각각의 샘플 용액을 lide-A-Lyzer Mini Dialysis에 첨가하고 0.9mL PBS를 포함하는 1.5mL ep 튜브의 상단에 넣어주었다. 샘플을 37℃ 암실에서 쉐이킹 인큐베이션하였다. 초음파(US) 처리군의 경우, 샘플에 1MHz US(0.3W/cm²)를 2분간 조사하였다. 바닥 튜브(bottom tube)를 수집하고 다른 시점에서 튜브를 포함하는 새로운 PBS(0.9mL)로 교체하였다. 흡광도를 측정하여 각 바닥 튜브에서 방출된 TPP-IR780의 양을 정량화하였다. SeSe-EV (TPP-IR780) (10 μg/mL) was prepared in PBS or PBS containing 10 μM H ₂ O ₂ or PBS containing 100 μM H ₂ O ₂ . Each of these sample solutions was added to the lide-A-Lyzer Mini Dialysis and put into the top of a 1.5mL ep tube containing 0.9mL PBS. Samples were incubated with shaking in the dark at 37°C. In the case of the ultrasonic (US) treatment group, 1 MHz US (0.3 W/cm ² ) was irradiated to the sample for 2 minutes. The bottom tube was collected and replaced with fresh PBS (0.9 mL) containing tubes at different time points. The absorbance was measured to quantify the amount of TPP-IR780 released from each bottom tube.

그 결과, 도 5에서와 같이, US가 조사되는 경우, H₂O₂의 농도가 높을수록 SeSe-EV(TPP-IR780)에서 방출되는 IR780의 양이 증가하는 것이 확인되었다. 이를 통해 SeSe-EV(TPP-IR780)는 US와 ROS에 대한 감응성이 있음을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 5 , when US is irradiated, it was confirmed that the higher the concentration of H ₂ O ₂ , the higher the amount of IR780 emitted from the SeSe-EV (TPP-IR780). Through this, it was found that SeSe-EV (TPP-IR780) has sensitivity to US and ROS.

한편, GSH와 초음파(US)가 DSe-E(T-Ce6/FX11)에서 T-Ce6 및 FX11의 방출에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위하여, DSe-E(T-Ce6/FX11) 100μL를 PBS 또는 10mM GSH에 혼합하였다. 이들 각각의 샘플 용액을 Slide-A-Lyzer Mini Dialysis(Thermo Scientific)에 첨가하고 0.9mL PBS를 포함하는 1.5mL ep 튜브의 상단에 넣어주었다. 샘플을 37℃암실에서 쉐이킹 인큐베이션하였다. 초음파(US) 처리군의 경우, 샘플에 1MHz US(0.3 W/cm²)를 2분간 조사하였다. Slide-A-Lyzer Mini Dialysis 아래에 있던 바닥 튜브(bottom tube)를 수집하고 새로운 PBS(0.9mL)가 담긴 바닥 튜브로 교체하였다. 흡광도를 측정하여 각 바닥 튜브로 방출된 T-Ce6와 FX11의 양을 정량화하였다 (T-Ce6의 λ= 664 nm; FX11의 λ= 664 nm). Meanwhile, in order to investigate whether GSH and ultrasound (US) affect the release of T-Ce6 and FX11 from DSe-E (T-Ce6/FX11), 100 μL of DSe-E (T-Ce6/FX11) was added to PBS. or in 10 mM GSH. Each of these sample solutions was added to Slide-A-Lyzer Mini Dialysis (Thermo Scientific) and put into the top of a 1.5mL ep tube containing 0.9mL PBS. Samples were incubated with shaking in the dark at 37°C. In the case of the ultrasonic (US) treatment group, 1 MHz US (0.3 W/cm ² ) was irradiated to the sample for 2 minutes. The bottom tube under the Slide-A-Lyzer Mini Dialysis was collected and replaced with a new bottom tube containing PBS (0.9mL). The absorbance was measured to quantify the amount of T-Ce6 and FX11 released into each bottom tube (λ of T-Ce6 = 664 nm; λ of FX11 = 664 nm).

그 결과, 도 6A 및 6B에서와 같이 DSe-E(T-Ce6/FX11)에서 GSH가 존재하는 상황에서 T-Ce6와 FX11의 방출이 증가하며 초음파가 조사되면 더 많은 양의 T-Ce6와 FX11이 방출됨을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIGS. 6A and 6B, the release of T-Ce6 and FX11 increases in the presence of GSH in DSe-E (T-Ce6/FX11), and when ultrasonic waves are irradiated, a larger amount of T-Ce6 and FX11 It was confirmed that this was released.

실시예 5. US 조사에 따른 SeSe-EV(TPP-IR780)에 의한 향상된 세포내 ROS 생성Example 5. Enhanced intracellular ROS production by SeSe-EV (TPP-IR780) according to US irradiation

TPP-IR780, EV(TPP-IR780) 및 SeSe-EV(TPP-IR780) 처리에 따른 US 노출 전후 ROS 생성을 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF-DA)를 사용하여 정량화하였다. ROS production before and after US exposure following TPP-IR780, EV (TPP-IR780) and SeSe-EV (TPP-IR780) treatments was quantified using 2',7'-dichlorofluorescein (DCF-DA).

구체적으로, 샘플 처리 24시간 전 MCF 세포를 12-웰 플레이트(1 × 10⁵개 세포/웰)에 분주하였다. 이후 세포를 PBS로 세척하고 10μM DCF-DA 용액과 함께 30분 동안 배양하였다. DCF-DA 용액을 제거하고 TPP-IR780, EV(TPP-IR780) 및 SeSe-EV(TPP-IR780)(5μg/mL의 TPP-IR780)를 처리하였다. 처리 4시간 후, 세포를 2개의 그룹으로 분리하였다 (US 조사 또는 US 미조사). 빛을 차단한 상태에서 1MHz US는 2분 동안 세포에 노출하고(0.3 W/cm²), 실온에서 30분 인큐베이션 하였다. 세포 내 ROS 생성 수준은 유세포 분석기를 이용하여 세포 내 DCF-DA에서 발생하는 녹색 형광을 정량하여 분석하였다. Specifically, 24 hours before sample treatment, MCF cells were seeded in a 12-well plate (1 × 10 ⁵ cells/well). Then, the cells were washed with PBS and incubated with 10 μM DCF-DA solution for 30 minutes. The DCF-DA solution was removed and treated with TPP-IR780, EV (TPP-IR780) and SeSe-EV (TPP-IR780) (TPP-IR780 at 5 μg/mL). After 4 hours of treatment, cells were separated into two groups (US irradiated or US unirradiated). In a state where light was blocked, 1MHz US was exposed to the cells for 2 minutes (0.3 W/cm ² ) and incubated at room temperature for 30 minutes. The intracellular ROS generation level was analyzed by quantifying green fluorescence generated from intracellular DCF-DA using a flow cytometer.

그 결과, 도 7에서와 같이, US 조사시 초음파감작제인 TPP-IR780를 처리한 세포 내 ROS 농도가 증가하는 것을 확인하였으며, EV(TPP-IR780)를 처리한 세포는 US 조사시 더 높은 농도의 ROS를 발생시켰다. 이는 EV에 의해 TPP-IR780가 세포에 흡수되는 효율이 증가하기 때문인 것으로 판단된다. ROS-감응성 SeSe-EV(TPP-IR780)은 US 조사시 가장 높은 ROS 농도를 보였는데, 그는 US 조사에 의해 TPP-IR780이 ROS를 발생시키고, 이로 인해 EV가 분해되면서 TPP-IR780의 세포 내 방출이 더 증가하기 때문으로 판단된다.As a result, as shown in FIG. 7, it was confirmed that the concentration of ROS in cells treated with TPP-IR780, an ultrasonic sensitizer, increased during US irradiation, and cells treated with EV (TPP-IR780) had higher concentrations during US irradiation. generated ROS. This is considered to be due to the increase in the efficiency of TPP-IR780 uptake into cells by EV. ROS-sensitive SeSe-EV (TPP-IR780) showed the highest ROS concentration when irradiated with US. TPP-IR780 generated ROS by US irradiation, which caused TPP-IR780 to be released into cells as EVs were decomposed. This is presumed to be due to an increase in

실시예 6. US 조사에 따른 SeSe-EV(TPP-IR780) 또는 DSe-E(T-Ce6/FX11)의 높은 초음파 독성Example 6. High ultrasonic toxicity of SeSe-EV (TPP-IR780) or DSe-E (T-Ce6/FX11) according to US investigation

샘플 처리 24시간 전 MCF 세포를 96-웰 플레이트(1 × 10⁴개 세포/웰)에 분주하였다. TPP-IR780, EV(TPP-IR780) 및 SeSe-EV(TPP-IR780)를 TPP-IR780가 5㎍/mL에 상응하도록 세포에 첨가하였다. 배양 4시간 후, 세포를 새로운 배양 배지[MEM/EBSS/10% FBS]로 배양하였다. 세포에 0.3 W/cm²의 1 MHz US를 2분 동안 조사하였다. 24시간 배양 후 기존의 MTT 분석으로 세포 생존율을 분석하였다. 24 hours before sample treatment, MCF cells were seeded in a 96-well plate (1 × 10 ⁴ cells/well). TPP-IR780, EV (TPP-IR780) and SeSe-EV (TPP-IR780) were added to the cells such that TPP-IR780 corresponded to 5 μg/mL. After 4 hours of incubation, the cells were cultured with fresh culture medium [MEM/EBSS/10% FBS]. The cells were irradiated with 0.3 W/cm ² of 1 MHz US for 2 minutes. After culturing for 24 hours, cell viability was analyzed by conventional MTT assay.

그 결과, 도 8에서와 같이, US 조사시 TPP-IR780에 의한 세포 독성이 확인되었고, EV(TPP-IR780)는 US 조사시 TPP-IR780에 비해 더 높은 세포 독성을 나타내었으며, SeSe-EV(TPP-IR780)는 US 조사시 가장 높은 세포 독성을 나타내었는데, 이는 SeSe-EV(TPP-IR780)가 가장 효과적으로 세포 내 ROS 농도를 높여, 세포 사멸을 유도하기 때문인 것으로 판단된다. 즉, ROS-감응성 SeSe-EV(TPP-IR780)는 초음파 조사시 발생되는 ROS에 의해 EV가 분해되면서 TPP-IR780의 방출이 용이해지고 세포 내 ROS 농도를 증가시켜 세포 독성이 증가하였다.As a result, as shown in FIG. 8, cytotoxicity by TPP-IR780 was confirmed during US irradiation, EV (TPP-IR780) showed higher cytotoxicity than TPP-IR780 during US irradiation, and SeSe-EV ( TPP-IR780) showed the highest cytotoxicity when irradiated with US, which is considered to be because SeSe-EV (TPP-IR780) most effectively increased intracellular ROS concentration and induced cell death. That is, the ROS-sensitive SeSe-EV (TPP-IR780) was decomposed by ROS generated during ultrasonic irradiation, thereby facilitating the release of TPP-IR780 and increasing the intracellular ROS concentration, resulting in increased cytotoxicity.

상기한 방법과 유사하게, MCF 세포에 T-Ce6, FX11, T-Ce6/FX11, T-Ce6/FX11가 동시탑재된 EV [E(T-Ce6/FX11)], T-Ce6/FX11가 동시탑재된 디셀레나이드 함유 EV [DSe-E(T-Ce6/FX11)] (10μg/mL T-Ce6, 2μg/mL FX11, 1.09 × 10¹⁰EV/mL)를 처리하였다. 배양 4시간 후, 세포를 새로운 배양 배지[MEM/EBSS/10% FBS]로 배양하였다. 세포에 0.3 W/cm²의 1 MHz US를 2분 동안 조사하였다. 24시간 배양 후 기존의 MTT 분석으로 세포 생존율을 분석하였다. Similar to the method described above, EVs coloaded with T-Ce6, FX11, T-Ce6/FX11, T-Ce6/FX11 [E(T-Ce6/FX11)], T-Ce6/FX11 co-loaded in MCF cells The loaded diselenide-containing EV [DSe-E(T-Ce6/FX11)] (10 μg/mL T-Ce6, 2 μg/mL FX11, 1.09 × 10 ¹⁰ EV/mL) was treated. After 4 hours of incubation, the cells were cultured with fresh culture medium [MEM/EBSS/10% FBS]. The cells were irradiated with 0.3 W/cm ² of 1 MHz US for 2 minutes. After culturing for 24 hours, cell viability was analyzed by conventional MTT assay.

그 결과, 도 9에서와 같이 DSe-E(T-Ce6/FX11)로 처리된 세포에서 US 조사시 가장 낮은 세포 생존률을 나타내어, 디셀레나이드 함유 탄화수소가 포함된 EV에 약물을 탑재하는 경우, MCF-7 유방암 세포주를 현저히 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 9, cells treated with DSe-E (T-Ce6/FX11) showed the lowest cell viability upon US irradiation, and when the drug was loaded into EVs containing diselenide-containing hydrocarbons, MCF It was found that -7 breast cancer cell lines could be significantly effectively removed.

실시예 7. 디셀레나이드 함유 탄화수소가 포함된 EV의 in vivo 항암 효과 Example 7. In vivo anticancer effect of EVs containing diselenide-containing hydrocarbons

모든 동물실험은 인천대학교 동물실험실무위원회의 승인을 받아 진행되었다(승인번호: INU-ANIM-2021-06). All animal experiments were conducted with the approval of the Incheon National University Animal Experiment Practice Committee (approval number: INU-ANIM-2021-06).

간략하게, 4주령(20g)의 BALB/c 누드 마우스 (오리엔트 바이오, 경기도)를 1-1.5% 이소플루란을 사용하여 흡입 마취하에 100ul PBS에 현탁된 MCF-7 세포(1 x 10⁶ 세포)를 마우스의 등 쪽에 피하 주사로 주입하여 tumor-xenograft 마우스 모델을 준비하였다. Briefly, 4-week-old (20 g) BALB/c nude mice (Orient Bio, Gyeonggi-do) were injected with MCF-7 cells (1 x 10 ⁶ cells) suspended in 100ul PBS under inhalation anesthesia using 1-1.5% isoflurane. was injected subcutaneously into the dorsal side of the mouse to prepare a tumor-xenograft mouse model.

마우스를 각 그룹당 4마리로 무작위 배정하고, 각 그룹에 PBS, T-Ce6, FX11, T-Ce6/FX11, T-Ce6/FX11가 동시탑재된 EV [E(T-Ce6/FX11)], T-Ce6/FX11가 동시탑재된 디셀레나이드 함유 EV [DSe-E(T-Ce6/FX11)]를 (1 mg/kg 농도의 T-Ce6와 0.24 mg/kg 의 FX11가 주입되도록 정맥 주사하였으며, 4시간 후 US (1 MHz, 0.5 W/cm²)를 3분 동안 조사하였다. Mice were randomly assigned to 4 mice per group, and EVs coloaded with PBS, T-Ce6, FX11, T-Ce6/FX11, and T-Ce6/FX11 [E(T-Ce6/FX11)], T Diselenide-containing EV [DSe-E(T-Ce6/FX11)] coloaded with -Ce6/FX11 was intravenously injected so that T-Ce6 at a concentration of 1 mg/kg and FX11 at a concentration of 0.24 mg/kg were injected, After 4 hours, US (1 MHz, 0.5 W/cm ² ) was irradiated for 3 minutes.

그 결과, 도 10에서와 같이, DSe-E(T-Ce6/FX11)를 주입한 마우스의 암조직에서 가장 높은 효율로 암조직 성장이 억제됨을 확인할 수 있었다. 한편, 각 샘플이 주입된 마우스 몸무게 변화를 통해 모든 샘플이 마우스에 큰 독성을 보이지 않음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 10, it was confirmed that cancer tissue growth was inhibited with the highest efficiency in cancer tissues of mice injected with DSe-E (T-Ce6/FX11). On the other hand, it was confirmed that all samples did not show significant toxicity to mice through changes in the body weight of mice injected with each sample.

실시예 8. SeSe-EV의 조영제로서의 용도Example 8. Use of SeSe-EV as a contrast agent

SeSe-EV 분산액을 0 내지 10 mg/ml로 준비하여 well plate에 넣은 후 micro CT 영상 (SkyScan 1076, Bruker, Billerica, MA, USA) 을 촬영하였다. A SeSe-EV dispersion was prepared at 0 to 10 mg/ml, put into a well plate, and micro CT images (SkyScan 1076, Bruker, Billerica, MA, USA) were taken.

그 결과, 도 11에서와 같이 SeSe-EV의 농도 의존적으록 강한 CT 신호가 발생하였으며, 이를 통해 디셀레나이드 함유 탄화수소(diselenide-bearing hydrocarbon)를 포함하는 EV가 CT 조영제로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 11, a strong CT signal was generated in a concentration-dependent manner of SeSe-EV, and through this, it was confirmed that EVs containing diselenide-bearing hydrocarbons could be used as CT contrast agents. .

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific parts of the present invention in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims

A diselenide-containing hydrocarbon containing 10 to 100 carbons and diselenide.

The method of claim 1, wherein the diselenide-containing hydrocarbon is a diselenide-containing hydrocarbon represented by Formula I:
Formula I
.

An extracellular endoplasmic reticulum comprising the diselenide-containing hydrocarbon of claim 1.

The extracellular endoplasmic reticulum according to claim 3, wherein the extracellular endoplasmic reticulum is loaded with a mitochondria-targeted ultrasonic sensitizer.

The method of claim 4, wherein the mitochondria-targeted ultrasonic sensitizer is any selected from the group consisting of triphenylphosphine (TPP), guanidine, (E) -4- (1H-Indol-3-ylvinyl) -N-methylpyridinium iodide and dequalinium An extracellular endoplasmic reticulum comprising one mitochondrial target material.

According to claim 4, wherein the extracellular endoplasmic reticulum is characterized in that the anticancer agent is additionally loaded, extracellular endoplasmic reticulum.

The extracellular vesicles according to claim 4, characterized in that the extracellular vesicles release drugs and/or ultrasonic sensitizers loaded in the extracellular vesicles into the cells in a dual response to ROS/GSH stimulation.

A pharmaceutical composition for treating tumors, comprising the extracellular vesicles of any one of claims 3 to 7 as an active ingredient.

A composition for diagnostic imaging comprising the extracellular vesicles of any one of claims 3 to 7 as an active ingredient.