KR20230114179A - 리그닌 광촉매 및 비특이적 퍼옥시게나아제를 포함하는 하이브리드 촉매 및 이의 용도 - Google Patents
리그닌 광촉매 및 비특이적 퍼옥시게나아제를 포함하는 하이브리드 촉매 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 리그닌 또는 그 유도체를 포함하는 광촉매; 및 비특이적 퍼옥시게나아제를 포함하는 하이브리드 촉매 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 리그닌 및 그 유도체의 뛰어난 광안정성, 광촉매성 및 순환성을 기반으로 물 및 산소를 이용하여 섬유염색공업, 반도체산업 등 다양한 분야에서 환경/생체 친화적이면서도, 고효율로 과산화수소를 제조할 수 있고, 상기 광촉매는 비특이적 퍼옥시게나아제와 연계하여 재활용산업 등의 분야에서, C-H결합을 가지는 다양한 기질의 옥시화 반응을 촉매하여 유용물질을 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 리그닌 또는 그 유도체를 포함하는 광촉매; 및 상기 광촉매와 비특이적 퍼옥시게나아제를 포함하는 하이브리드 촉매 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 광촉매; 상기 광촉매에 가시광선을 조사하여 여기시키고 H2O를 산화시키는 단계 및 O2를 환원시키는 단계를 포함하는 과산화수소의 제조방법; 상기 광촉매와 비특이적 퍼옥시게나아제를 포함하는 하이브리드 촉매; 및 상기 하이브리드 촉매에 가시광선을 조사하여 C-H결합을 가지는 기질을 옥시화 반응시키는 단계를 포함하는 유용물질의 제조방법에 관한 것이다.
리그닌은 지구에서 두 번째로 풍부한 생체중합체(지용성 페놀고분자 구조)로써 리그노셀룰로스 바이오매스(lignocellulosic biomass) 내에서 다양한 방향족 구조를 가지며, 고도로 기능화되어 있다(Wang, D., et al., ChemSusChem 13, 2807-2827 (2020); Chen, C.-C., et al., Nat. Rev. Chem. 4, 114-126 (2020)). 1차 구조이지만 오히려 여러 유형의 C-C/C-O 결합에 의해 주로 연결된 3개의 페닐프로파노이드(C9) 단위(즉, 시린길(syringyl, S), 구아이아실(guaiacyl, G) 및 p-히드록시페닐(H) 단위)의 복잡한 중합체를 나타낸다(Li, C., et al., Chem. Rev. 115, 11559-11624 (2015); Wang, M. & Wang, F. Adv. Mater. 31, 1901866 (2019)). 펄프, 종이 및 바이오 연료 산업은 연간 약 5천만 미터톤의 리그닌을 폐기물로써 생성한다. 그러나 리그닌의 95%는 복잡하고 불규칙하며 불분명한 화학 구조(Sanderson, K. Nature 474, S12-S14 (2011))로 인해 바이오리파이너리 공정에서 버려지거나 연소된다(Wang, M. & Wang, F. Adv. Mater. 31, 1901866 (2019)).
리그닌 중합체는 많은 분자 유기 광촉매가 공유하는 산화환원 부위(moieties)를 포함하고 있다. 따라서 본 발명의 발명자들은 리그닌의 전자적 특성 및 광물리적 특성을 조사하였고, 가시광선 조사 시 리그닌의 양에 민감하게 반응하는 H2O2 형성(O2 환원 및 H2O 산화를 통해) 및 O2 분화(evolution)(H2O 산화를 통해)를 확인하였다.
한편, 비활성 C-H 결합의 선택적 옥시기능화 반응은 동역학적으로 활성이 없는 C-H 결합의 재구성을 필요로 하기 때문에 합성 화학에 있어 아주 유용한 반응이다(Kille, S., et al., Nat. Chem. 3, 738-743 (2011)). 이 반응을 촉매하는 Haem-thiolate 효소는 높은 반응성, 선택성 및 넓은 기질 범위로 인하여 많은 관심을 받았다(Gumulya, Y. et al., Nat. Catal. 1, 878-888 (2018); Zhang, W. et al., Nat. Catal. 1, 55-62 (2018)). 그 중에서도 비특이적 과산화효소(UPO, 국제 생화학 및 분자 생물학 연합(IUBMB) 분류: EC1.11.2.1)는 과산화수소만을 사용하여 과산화물 션트 경로(peroxide shunt pathway)(Lee, S. H., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 57, 7958-7985 (2018))를 통해 촉매 활성 옥소페릴 헴(oxoferryl haem) (Compound I)을 생성하므로 UPO는 기존의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 (monooxygenases) 및 그 화학적 대응물에 대한 유망한 대안이다.
이에 본 발명자들은 리그닌 및 비특이적 퍼옥시게나아제의 촉매능력을 활용하여, 지속가능하면서도 고효율로 유용물질을 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, β-O-4 결합을 함유하는 리그닌의 전자적, 광물리적 특성을 조사함으로써, 가시광선 조사 시 리그닌의 양에 민감하게 반응하는 H2O2 형성(O2 환원 및 H2O 산화를 통해) 및 O2 분화(evolution)(H2O 산화를 통해)를 확인하였고, 광촉매로 촉진되는 비활성 C-H결합의 옥시화 반응을 위해 상기 광산화환원 반응을 퍼옥시게나아제 생체 촉매와 결합하여, 순도 높은 거울상이성질체 알코올과 에폭사이드를 합성할 수 있음을 확인하였으며(즉, 거울상 이성질체 과잉(e.e.) > 99%), 리그닌 광촉매가 산화 방지제로서 기능하여 OHㆍ를 매개로 하는 UPO 비활성화를 억제한다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하고, 가시광선 존재 하에 O2의 환원 및 H2O의 산화에 의해 과산화수소 생성능을 가지는 광촉매를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 광촉매를 이용한 과산화수소의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 광촉매; 및 비특이적 퍼옥시게나아제를 유효성분으로 포함하는, C-H결합을 가지는 기질의 옥시화 반응을 위한 하이브리드 촉매를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이브리드 촉매를 이용한 유용물질의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하고, 가시광선 존재 하에 O2의 환원 및 H2O의 산화에 의해 과산화수소 생성능을 가지는 광촉매를 제공한다.
본 발명은 또한, 가시광선의 존재 하에, 상기 광촉매를 이용하여 O2를 환원시키는 단계 및 H2O를 산화시키는 단계를 포함하는 과산화수소의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 광촉매 및 비특이적 퍼옥시게나아제(UPO)를 유효성분으로 포함하는, C-H결합을 가지는 기질의 옥시화 반응을 위한 하이브리드 촉매를 제공한다.
본 발명은 또한 가시광선의 존재 하에, 상기 하이브리드 촉매를 이용하여 C-H결합을 가지는 기질을 옥시화 반응시키는 단계를 포함하는 유용물질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 리그닌 및 그 유도체는 제지 산업 등에서 폐기물로 배출되는 물질로 본래 대부분이 연소되거나 버려지나, 뛰어난 광안정성, 광촉매성 및 순환성을 기반으로 하여 주변에 아주 풍부한 물 및 산소를 이용하여 환경/생체 친화적이면서도, 고효율로 과산화수소를 제조할 수 있게 한다. 또한 상기 광촉매는 비특이적 퍼옥시게나아제와 연계하여 하이브리드 촉매로써 C-H결합을 가지는 다양한 기질의 옥시화 반응을 촉매하여 유용물질을 제조할 수 있다. 본 발명의 광촉매 및 과산화수소 제조방법은 섬유염색공업, 반도체산업 등 과산화수소가 필요한 산업분야에 유용하며, 하이브리드 촉매 및 유용물질의 제조방법은 다양한 기질을 고부가가치 화합물로 변환하는 재활용산업에 유용하다.
도 1은 리그닌 광촉매 및 퍼옥시게나아제를 사용한 광효소적 옥시기능화의 개략도를 나타낸 그림이다. 리그닌 광촉매와 퍼옥시게나아제 산화환원 생체 촉매의 연계를 통한 광효소적 옥시기능화 반응을 나타낸다. 가시광선 조사 하에 리그닌 에너지 물질(예: 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌)의 광활성화는 O2가 H2O2로 환원되고 H2O가 H2O2 및 O2로 산화되는 산화환원 반응을 유발한다. in situ 생성된 H2O2는 과산화효소와 반응하여 입체선택적 옥시기능화 반응(예: 수산화 및 에폭시화)을 촉매하는 옥소페릴 헴(화합물 I, 산화환원 중심)을 형성한다.
도 2는 리그닌 모델의 구조적 조사 결과를 나타낸 그림이다. (a) 내지 (d)는 각각 리그노설포네이트, 크래프트리그닌, 셀룰로오스 분해효소 리그닌 및 리그닌 탈수소화 중합체의 hSQC 분광 분석결과를 나타낸다. 산소화된 알킬 영역(왼쪽)과 방향족 영역(오른쪽)의 1H-13C hSQC 스펙트럼이 각 리그닌 모델에 대하여 표시되었다. 다당류 및 할당되지 않은 부분(moieties)은 회색으로 표시된다. (e)는 리그닌에 존재하는 구조적 모티프를 (a) 내지 (d)의 2차원 hSQC 스펙트럼 할당에 해당하도록 색상으로 구분하여 표시한 그림이다. A는 β-아릴 에테르(β-O-4)이고; A(G)는 G 단위에 연결된 β-O-4이며; A(S)는 S 단위에 연결된 β-O-4이고; B는 페닐쿠마란(β-5)이며; C는 레지놀(β-β)이고; D는 β-5 스틸벤이며; X는 신나밀 알코올이고; E는 에놀 에테르이며; h는 p-히드록시페닐 단위이고; G는 G 단위이며; G'은 α-산화된 G 단위이고; G"은 α-술폰화된 G 단위이며; S는 S 단위이고; S'는 α-산화된 S 단위이며; S″는 α-감소된 S 단위이고; S은 α-술폰화된 G 단위이다.
도3은 리그닌 광촉매의 전자 및 광물리적 특성을 나타낸 그래프이다. (a)는 O2가 H2O2로 환원되고 H2O가 H2O2 및 O2로 산화되는 리그닌 민감성 반응의 에너지 다이어그램을 나타낸다. 삽입된 그림은 여러 분석 결과(hSQC, 31P NMR, 원소 분석 및 Ellman 분석 포함) 및 문헌을 기반으로 하는 리그노설포네이트(상단) 및 크래프트 리그닌(하단)의 가능한 구성 구조를 나타낸다. (b)는 태양광 시뮬레이션(solar-simulated) 가시광선 하에서 -0.028V(vs RHE)에서 리그닌 광촉매의 일시적인 광전류 반응을 나타낸다. (c)는 -0.028V(vs RHE)의 가시광선 하 Nyquist 플롯 형태의 전기화학적 임피던스 분광 분석결과를 나타낸다. Zre 및 Zim은 각각 실수 및 허수 임피던스를 나타낸다. 광원으로 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스 = 0.58μE cm-2 s-1)를 사용하였고, 표시된 실선은 용액 저항(Rs), 전하 이동 저항(Rct) 및 정위상 소자(CPE)로 구성된 Randles 회로 모델에 잘 부합한다.
도4는 가시광선에서 H2O2의 리그닌-감광성(Lignin-sensitized) 생산과 그 메커니즘을 나타낸 그래프이다. (a)는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌 광촉매에 의한 가시광선 구동 H2O2 생성을 나타낸다. 298.2K에서 가시광 조사/비조사(λ > 400nm, 광자 플럭스 = 0.58μE cm-2 s-1) 및 O2가 풍부한 조건에서 KPi 버퍼(100mM, ph 7.0)에 리그닌 광촉매(1mg ml-1)를 분산시키고 반응시켰다. (b)는 1,4-벤조퀴논(왼쪽)과 N2(오른쪽)가 리그닌-민감성 H2O2 생산 속도에 미치는 영향을 나타낸다. 298.2K에서 1,4-벤조퀴논(1mM)의 존재/부존재 조건에서 KPi 버퍼(100mM, ph 7.0)에 리그닌 광촉매(1mg ml-1)를 분산시키고 반응시켰다. (c)는 CEL, 리그닌 DHP, 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르(β-O-4 이량체), 코니페릴 알코올 및 시나필 알코올에 의해 구동되는 H2O2의 광화학 형성 여부를 확인한 그래프이다. 298.2K에서 가시광 조사/비조사(λ > 400nm, 광자 플럭스 = 0.58μE cm-2 s-1) 및 O2 또는N2가 풍부한 조건에서 KPi 버퍼(100mM, ph 7.0)에 리그닌(이량체) 모델 또는 모노리그놀(1mg ml-1)를 분산시키고 반응시켰다. 오차막대는 표준 편차(n=3)에 해당하며, * 및 **는 일원 분산 분석에 따라 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이가 없음을 나타낸다.
도5는 에틸벤젠 수산화에 대한 다양한 광효소 시스템의 TTNrAaeUPO 값을 나타낸 그래프이다. 본 발명의 리그닌 광촉매, rAaeUPO 및 가시광선을 결합한 최신 광효소 시스템을 사용하여 에틸벤젠 수산화에 대해 얻은 TTN 값을 다른 시스템과 비교하였다. 상기 다양한 광촉매 시스템들은 각각 금이 담지된 루틸(rutile) TiO2 나노입자(3,6), 금이 담지된 아나타제(anatase) TiO2 나노입자(3), 흑연질화탄소(8), 메틸렌 블루(7), 페노사프라닌(7) 및 플라빈 모노뉴클레오티드(7)를 포함한다. CbFDH는 칸디다 보이디니(Candida boidinii)로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소이고; NAD+는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드이다.
도 6은 크래프트 리그닌의 2차원 핵자기공명 분광분석결과를 나타낸 그래프이다. (a)는 크래프트 리그닌의 1H-13C 이핵 단일 양자 간섭 분광 분석의 할당을 나타낸 그래프이다. 회색은 다당류 또는 할당되지 않은 부분을 나타낸다. 참고: Green Chem. 19, 4104-4121(2017). (b)는 크래프트 리그닌의 구조적 특징을 나타낸 그림이다. 각각 F는 구아이아실 히드록시에틸 케톤, I는 디히드로신나밀 알코올(구아이아실 프로판올), J는 세코이소라리시레시놀을 나타낸다.
도 7은 크래프트 리그닌의 싸이올 그룹 검출을 위한 Ellman 분석에 대한 그래프와 그림이다. (a)는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)과 싸이올 함유 분자(예: 크래프트 리그닌) 사이의 Ellman 반응 메커니즘을 나타낸 것이다. 이 반응은 412nm에서 최대 흡수를 나타내는 2-니트로-5-티오벤조산을 생성한다. (b)는 크래프트 리그닌을 포함하는 Ellman 시약 용액의 차등 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 에틸렌디아민테트라아세트산(1mM)을 포함하는 인산나트륨 완충액(100mM, pH 8.0)에 0.0089mg mL-1 크래프트 리그닌 및 0.178mM Ellman 시약을 첨가하여 실험하였다(ΔA ≡ A(t) - A(t = 0분)).
도 8은 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 31P 핵자기공명(NMR) 분광 분석결과를 나타낸 것이다. (a)는 피리딘과 중수소화 클로로포름의 용매 혼합물에서 리그닌의 수산기와 2-클로로-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스폴란 사이의 인산화 반응을 나타낸 것이며; (b)는 포스피틸화 반응 후 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 31P 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다. 내부 표준물질(internal standard)은 시클로헥산올이었다. C5-치환된 OH는 축합된 OH 및/또는 시링길 OH 작용기를 포함한다. 피크 할당 참조: Green Chem. 18, 2651-2665(2016); (c)는 리그닌의 인산화된 작용기를 나타낸다.
도 9는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 광학적 특성을 나타낸 그래프이다. (a)는 0.01mg mL-1 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 UV-Vis 스펙트럼이다;(b) 및(c)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 Tauc 플롯이다.
도 10은 리그노설포네이트와 크래프트 리그닌의 광전자 분광 분석을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 자외선 광전자 스펙트럼을 나타낸다. 광원으로 21.2eV(He I 복사)에서 방출되는 헬륨 램프를 사용하였고, 리그노설포네이트와 크래프트 리그닌의 일함수는 각각 -4.24eV와 -3.27eV로 추정되었다. 광전자 방출 분광법은 유기 물질의 원자가 전자 상태를 특성화하는 데 널리 사용된다(Org. Electron. 41, 9-16 (2017)).
도 11은 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 전기화학적 분석 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 순환 전압전류도(voltammograms)를 나타낸다. 작업 전극은 유리질 탄소 전극이고 스캔 속도는 50mV s-1이며, 전해질 용액으로 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)을 사용하였고, 사이클 수는 3이었다.
도 12는 흡수 및 방출 스펙트럼의 겹침(overlap)을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 정규화된 흡수 및 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 리그노설포네이트과 크래프트 리그닌의 광물리적 성질을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 광발광 스펙트럼을 나타낸다. 리그닌 농도는 0.1mg mL-1이었다.
도 14는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 시간 분해 분광 분석을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 시간 분해 형광 붕괴 프로파일을 나타낸다. 여기 파장은 467nm, 방출 파장은 525nm, 리그닌 농도는 0.1mg mL-1이었다. 이러한 붕괴 프로파일은 하기 값을 따르는 극한 지수 함수에 맞춰졌다: (a)의 경우 τ1 = 3.1ns(52%), τ2 = 0.8ns(13%), τ3 = 9.2ns(35%), χ2 = 1.12; (b)의 경우 τ1 = 14.0ns(46%), τ2 = 0.7ns(25%), τ3 = 374.6ns(20%), τ4 = 2.5ns(9%), χ2 = 1.09이다.
도 15는 리그닌과 O2의 상호작용을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 어두운 조건 및 298.2K온도 및 KPi 완충액(100mM, pH 7.0) 조건에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 차등 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 리그닌 농도는 1mg mL-1이었다. (c)는 리그닌이 없는 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)의 차등 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다. ΔA ≡ A(t) - A(t = 0h)이고, 주어진 시간(t) 동안 샘플을 O2로 퍼지했다. UV-Vis 흡수 스펙트럼을 얻기 전에 모든 샘플을 100배 희석했다. LS 및 KL의 흡광도는 O2 퍼징 시간에 따라 점차 증가했고, O2 퍼징을 중단했을 때 흡광도가 회복되었다.
도 16은 리그닌/O2 상호작용 연구결과 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 인산 D2O 완충액(100mM, pH 7.0)에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 1H NMR 스펙트럼의 변화를 나타낸다. 리그닌 농도는 2mg mL-1였다. O2가스를 12시간 동안 퍼징한 후에 중단했다. O2의 짝을 이루지 않은 전자와 인접한 핵의 결합은 화학적 이동 변화를 유발할 수 있다(Sci. Rep. 6, 20534 (2016)). 상기 화학적 이동(chemical shift)은 O2 퍼징을 중단한 후 되돌아 올 수 있는 것으로 나타났다.
도 17은 페녹시기를 가지는 화합물의 O2 매개 산화를 나타낸 그래프이다. (a), (b), (c) 및 (d) 는 각각 1,4-벤젠디올, 1,2-벤젠디올, 4-메틸페놀 및 도파민의 UV-Vis(좌) 및 1H NMR(우) 스펙트럼의 변화를 나타낸다. 페녹시 분자의 농도는 1mM이고, UV-Vis 흡수 스펙트럼을 얻기 전에 모든 샘플을 10배 희석했다. 나트륨트리메틸실릴프로판술포네이트(DSS)는 1H 화학적 이동의 보정 및 페녹시기를 가지는 분자의 정량화에 사용되었다. 정량적 NMR 분석은 O2 퍼지 후 상기 4개 분자의 농도에 변화가 없음을 보여준다.
도 18은 가시 광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1) 하에서 리그닌 에너지 물질이 존재/부존재 조건에서 H2O2의 광촉매 생성을 나타낸 그래프이다. 실험군의 반응 조건은 298.2K에서 O2가 풍부한 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 리그닌을 1mg mL-1 용해하였다. 오차 막대는 표준 편차(n = 3)에 해당한다.
도 19는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 작용 스펙트럼의 측정결과를 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 H2O2 형성에 대한 흡수 및 작용 스펙트럼을 나타낸다. 양자 수율은 (양자 수율(%) = [H2O2 (mol)] × [리그닌 광촉매에 의해 흡착된 총 광자 수(mol)]-1 × 100)의 식을 통해 계산되었다. 반응 샘플은 298.2K조건에서 O2가 풍부한 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 0.1mg mL-1 리그닌을 포함시켜 구성되었다. 그 양자 수율은 물을 전자 공여체로 사용하는 다른 가시광 활성 광촉매의 겉보기 양자 수율보다 낮았다(Appl. Catal. B Environ. 232, 19-25 (2018); ChemCatChem 10, 2070-2077 (2018)).
도 20은 광촉매 시험 후 리그닌의 분광학적 조사결과를 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트와 크래프트 리그닌 흡광도의 분광광도 변화를 나타낸다. UV-Vis 스펙트럼을 얻기 전에 샘플을 탈이온수에 10배 희석했다. (c)와 (d)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 광발광 스펙트럼의 변화를 나타낸다. (e)는 리그노설포네이트, 크래프트 리그닌 및 탈이온수의 감쇠된(attenuated) 전반사 푸리에 변환 적외선(ATR-FTIR) 스펙트럼을 나타낸다. 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)를 광원으로 사용하였고, 리그닌 농도는 1mg mL-1, 온도는 298.2K이었으며, 용매는 O2-포화 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)을 사용하였다.
도 21은 리그노설포네이트 또는 크래프트 리그닌 존재 시 H2O2의 안정성을 나타낸 그래프이다. (a, b) 및 (c, d)는 각각 298.2K조건, KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에서 1mg mL-1 리그노설포네이트 및 1mg mL-1 크래프트 리그닌이 존재할 때 H2O2 농도의 시간 프로파일을 나타낸다. (e, f) 및 (g, h)는 각각 298.2K조건, KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌에 의한 H2O2 분해에 대한 리그닌 농도의 영향을 나타낸다. H2O2의 초기 농도는 0.2mM이며, 리그노설포네이트의 유사 1차 속도 상수(k1 및 k2)는 다음 방정식을 사용하여 각각 0.0054min-1 및 0.0055L g-1 min-1로 계산되었다. (d[H2O2]/dt = k1 [H2O2]) 및 (d[H2O2]/dt = k2 [Lignosulfonate][H2O2]).
도 22는 가시광선 조사 시 리그닌 광촉매에 의한 O2 *-의 형성을 나타낸 그래프이다. (a) 리그닌 촉매(예: 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌)에 의해 형성된 슈퍼옥사이드 이온을 검출하기 위한 니트로블루 테트라졸륨 분석(NBT)의 그림이다. NBT formazan은 560nm에서 분광광도계로 모니터링되었다. (b)는 다른 반응 조건에서, 560nm파장으로 측정한 NBT 용액의 흡광도 변화를 나타낸다. KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에서 1mg mL-1리그닌 및 10μM NBT조건에서 실험하였다. 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)를 광원으로 사용하였다. 온도는 298.2K였고, ND는 감지되지 않았음을 의미한다. 리그닌의 LUMO 수준은 O2(aq)(-0.16 VRHE)의 표준 1-전자 환원 전위보다 더 음수로 나타났다(Free Radical Biol. Med. 49, 317-322 (2010); Singlet Oxygen: Applications in Biosciences and Nanosciences Vol. 1 1-21 (The Royal Society of Chemistry, 2016)).
도 23은 가시 광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)하에서 리그닌 광촉매에 의해 구동되는 O2 생산을 나타낸 그래프이다. N2 퍼지된 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 1mg mL-1 리그닌의 존재 하에 298.2K 온도 조건에서 반응시켰다.
도 24는 셀룰로오스 분해 효소 리그닌 및 리그닌 탈수소화 중합체의 31P NMR 분광 분석결과를 나타낸 그래프이다. (a)는 2-클로로-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스폴란과 리그닌의 수산기 사이의 포스피틸화 반응 후 셀룰로오스 분해 효소 리그닌과 리그닌 탈수소 중합체의 31P NMR 스펙트럼 측정결과를 나타낸다. C5-치환된 OH는 축합된 OH 및/또는 시링길 OH 작용기를 포함한다(Green Chem. 18, 2651-2665(2016)). (b)는 인산화된 작용기들을 표시한 것이다.
도 25는 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르의 분자 구조를 나타낸 그림이다.
도 26은 O2의 광화학적 환원 전후의 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르의 분광 및 분광 분석결과를 나타낸 그래프이다. (a)는 광화학 반응 전후의 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르의 ATR-FTIR 스펙트럼을 나타낸다. 유리 기판에 이량체 용액을 분사하고 주변 조건에서 건조하여 샘플을 제조했다. (b)는 광화학 반응 후 반응 용액의 기체 크로마토그래피-질량 분석 크로마토그램을 나타낸다. 광 구동 반응 후, 디클로로메탄을 사용하여 분석물을 추출하였다. (c) 및 (d)는 각각 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르 및 그 α-산화된 형태의 가스 크로마토그래피-질량 분석(GC-MS) 스펙트럼을 나타낸다. 상기 (a, b)의 반응 용액은 KPi 완충액(100mM, pH 7.0) 및 1mg mL-1 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르이고, (a, b)의 광원은 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)이다. 패널(a)는 1650cm-1 근처에서 흡광도의 증가를 보여주며, 이는 어두운 조건이 아닌 밝은 조건에서 C=O 스트레칭(stretching)에 할당된다(Angew. Chem. Int. Ed. 57, 13825-13828 (2018); Procedia Eng. 148, 1312-1319 (2016)). 또한, GC-MS 분석은 이량체의 Cα-OH가 카르보닐기로 산화되었음을 보여준다.
도 27은 에틸벤젠의 광생체촉매 하이드록실화에서 각 반응 성분(즉, 리그닌, 빛, rAaeUPO 및 기질)에 대한 제어 실험결과를 나타낸 그래프이다. 가시광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s -1)조사 하에 298.2K에서 실험하였고, H2O2제거제로써 피루브산 500mM를 사용하였으며, 1시간 반응시켰다. 리그닌/UPO 커플(Couple)은 가시광선에서 아세토페논을 생성하지 않았다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다(n = 3). ND는 감지되지 않았음을 표시한다. 산화적으로 더 불안정한 π-관능기(functionality)에 인접한 메틸렌 C-H 결합의 하이드록실화가 매우 어렵기 때문에 에틸벤젠을 모델 기질로 설정하였다(Nat. Chem. 11, 213-221 (2019)). 리그닌과 rAaeUPO 사이의 상호작용은 직접적으로 LS와 KL에 의한 rAaeUP의 광활성화를 초래하지는 않았다. H2O2 스캐빈저(피루브산)이 존재하는 경우 1-페닐에탄올 수율은 아주 적었다. 위 결과는 화합물 I의 재생이 H2O2 션트(shunt) 경로에서만 발생함을 나타낸다.
도 28은 광효소 생성물의 가스 크로마토그래피-질량 분석 스펙트럼(위) 및 질량 스펙트럼 라이브러리(아래)를 나타낸 그래프이다. (a), (b), (c), (d) 및 (e)는 각각 1-페닐에탄올, 1-페닐-1-프로판올, 1,2,3,4-테트라히드로-1-나프톨, 시클로헥산올, 및 1-페닐프로필렌 옥사이드 효소생성물을 분석한 결과를 나타낸다.
도 29는 순수 화학물질(위) 및 광활성화 리그닌/rAaeUPO 하이브리드에 의한 생성물(아래)의 대표적인 가스 크로마토그램을 나타낸 그래프이다. (a), (b), (c), (d) 및 (e)는 각각 1-페닐에탄올 및 아세토페논; 1-페닐-1-프로판올 및 프로피오페논; 1,2,3,4-테트라히드로-1-나프톨 및 3,4-디히드로-2H-나프탈렌-1-온; 시클로헥산올 및 시클로헥사논; 1-페닐프로필렌 옥사이드, 1-페닐-1-프로판올 및 1-페닐-2-프로판올에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 30은 리그닌 모델 또는 모노리그놀을 사용한 광효소 하이드록실화 반응결과를 나타낸 그래프이다. 리그닌 모델 또는 모노리그놀의 농도는 1mg mL-1이고, 용매는 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠을 함유하는 O2-퍼지된 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)이었으며, 광원은 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)이고, 온도는 298.2K, 반응 시간은 1시간이었다. ND는 감지되지 않았음을 의미한다.
도 31은 산소 동위 원소 라벨링 실험결과를 나타낸 것이다. (a)는 N2가 풍부한 조건에서 H2 18O 용매에 광활성화된 리그닌과 퍼옥시게나아제를 사용하여 18O로 표지된 알코올 생성물의 형성을 나타낸 그림이다. (b)는 LS/rAaeUPO 및 KL/rAaeUPO 하이브리드가 N2 포화 H2 18O에서 합성된 18O로 표지된 (R)-1-페닐에탄올의 가스 크로마토그래피-질량 분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 32는 광효소 하이드록실화 반응의 역학을 나타낸 그래프 및 그림이다. (a)는 rAaeUPO-촉매 수산화 반응에 대한 TOFrAaeUPO에 대한 리그닌 농도의 영향을 나타낸 그래프이다. 가시광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)조사 하에 298.2K에서, KPi 완충액(100mM, pH 7.0, O2 퍼지)에 리그닌, 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠을 포함하는 조건에서 실험하였다. (b)는 광자 플럭스에 대한 TOFrAaeUPO의 의존성을 나타내는 그래프이다. 298.2K에서 O2가 풍부한 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 8mg mL-1 리그닌, 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠이 존재하는 조건에서 실험하였다. TOFrAaeUPO 값은 2시간 반응으로 결정하였다. (c)는 rAaeUPO 및 에틸벤젠을 함유하는 리그닌 용액의 사진이다. KPi 완충액(pH 7.0, 100mM)에 50nM RarAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠이 존재하는 조건에서 실험하였다(사진제공: 김진현, 한국과학기술원). (a)에서 볼 수 있듯이, rAaeUPO의 전환 빈도(TOFrAaeUPO)는 8mg/mL 이상의 리그닌 농도로 포화되었으며, 이는 H2O2 형성이 속도 제한 단계에 해당함을 의미한다. (b)에서 볼 수 있듯이, 고정된 리그닌 농도(8mg mL-1)에서 광자 플럭스를 변화시켰을 때 LS/rAaeUPO의 TOFrAaeUPO는 1.16μE cm-2 s-1 이상에서 KL/rAaeUPO의 TOFrAaeUPO보다 컸다. (c)에서 볼 수 있듯이 상기 결과는 KL에 비해 LS이 더 높은 광학적 투명도를 가지기 때문으로 생각된다; KL의 자가 차광 효과는 빛 투과를 감소시켜 일부 KL 광촉매를 반응 용액에서 불활성화시켰고, 하이드록실화 반응은 1.74μE cm-2 s-1 이상에서 포화된 TOFrAaeUPO를 나타냈다.
도 33은 rAaeUPO와 리그닌 사이의 상호작용을 나타낸 그래프이다. (a) 및 (b)는 각각 298.2 K에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 첨가에 의한 110nM rAaeUPO의 흡광도의 분광광도학적 변화를 나타낸다. 리그닌 거대분자는 비공유 결합(소수성, 정전기, 수소 결합 상호작용)을 통해 효소와 상호작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Biotechnol. Adv. 35, 466-489 (2017)).
도 34는 리그닌 광촉매 및 rAaeUPO에 의해 구동되는 장기(long-term) 광효소 반응의 시간 프로필을 나타낸 그래프이다. O2가 풍부한 KPi 완충액 (100mM, pH 7.0)에 8mg mL-1 리그닌 광촉매, 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠이 존재하는 조건에 가시광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 1.74μE cm-2 s-1)을 조사하여 298.2K에서 반응시켰다. 반응용액(10μL)을 일정 간격으로 채취하여 5mM 1-옥탄올(내부표준)이 포함된 에틸아세테이트 용액(40μL)과 혼합하여 옥시기능화 생성물을 추출하였다. 또한 가스 크로마토그래피를 사용하여 추출된 생성물을 정량화하고 방정식(TTN = [주어진 시간에 대한 생성물의 최대 농도] × [rAaeUPO 농도]-1)을 사용하여 총 회전수(TTN)를 계산했다.
도 35는 리그닌 광촉매에 의해 형성된 하이드록실 라디칼의 검출을 나타낸 것이다. (a)는 테레프탈산과 하이드록실 라디칼의 반응을 나타낸 것이다. 테레프탈산은 OH*와 반응하여 2-하이드록시테레프탈산을 생성하며, 이는 315nm 여기(excitation)하에 430nm에서 분광형광법으로 모니터링할 수 있다. (b)는 430nm(λex = 315nm)에서 반응 용액의 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 36은 적철광(α-Fe2O3) 필름의 특성을 나타낸 것이다. (a)는 나노구조 적철광 필름의 평면도 주사 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 500nm이다. (b)는 α-Fe2O3의 X선 회절 패턴 및 JCPDS #01-085-0599(적철광)의 표준 회절 패턴을 나타낸다. 별표는 FTO의 회절 패턴을 나타낸다. (c)는 Fe 2p에 대한 적철광 필름의 X선 광전자 스펙트럼을 나타낸다. (d)는 α-Fe2O3 전극의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 37은 리그닌 물질의 항산화 특성을 나타낸 것이다. (a)는 α-Fe2O3 광전기촉매에 의해 구동되는 광전기화학적 H2O 산화에서 OH*로의 에너지 다이어그램을 나타낸다. α-Fe2O3 막의 광감작(Photosensitization)은 각각 가전자대와 전도대에서 광여기(photoexcited)된 정공과 전자를 생성한다. 상기 정공은 반도체|전해질 계면으로 이동하여 H2O를 하이드록실 라디칼로 산화시키고 리그닌에 의해 제거된다. (b)는 리그닌(예: 리그노설포네이트, 크래프트 리그닌) 유/무에 따른 0.3mM 테레프탈산을 함유하는 적철광 전해액의 형광 강도(λex = 315nm, λem = 430nm) 변화를 나타낸다. 적철광 전극의 기하학적 표면적은 2.5cm2이고, 적용된 바이어스는 0.622VRHE(0VAg/AgCl)이며, 광원으로 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 1.74μE cm-2 s-1)를 사용하였다. ND는 감지되지 않았음을 의미한다.
도 38은 그라운드(ground)/여기(exited) 산화 전위를 기반으로 하는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌에 의해 구동되는 H2O2 및 O2 형성의 산화적 소광(quenching) 경로를 나타낸 그림이다. 리그닌은 빛을 흡수하여 광활성화 상태인 리그닌*이 되며, 이는 상응하는 바닥 상태와 비교하여 더 강력한 환원력을 나타낸다. LS* 및 KL*은 여기 상태 전위[E(LS·+/LS*), -1.56 VRHE; E(KL·+/KL*), -1.19 VRHE]가 O2의 산화환원 전위[E(O2/H2O2), 0.68VRHE]보다 음의 값을 가지기 때문에 O2를 H2O2로 환원시킬 수 있다. 결과적으로, LS*와 KL*은 상응하는 기저 상태 산화 전위[E(LS·+/LS), 2.29VRHE; E(KL·+/KL), 2.40 VRHE]와 함께 산화된 상태인 리그닌·+이 된다. 상기 산화된 리그닌는 H2O 산화를 통해 원래 상태로 되돌아간다. 왜냐하면 LS와 KL의 기저 상태 전위는 H2O의 산화환원 전위보다 더 양성이기 때문이다[예시로, E(O2/H2O), 1.23 VRHE; E(H2O2/H2O), 1.76 VRHE].
도 2는 리그닌 모델의 구조적 조사 결과를 나타낸 그림이다. (a) 내지 (d)는 각각 리그노설포네이트, 크래프트리그닌, 셀룰로오스 분해효소 리그닌 및 리그닌 탈수소화 중합체의 hSQC 분광 분석결과를 나타낸다. 산소화된 알킬 영역(왼쪽)과 방향족 영역(오른쪽)의 1H-13C hSQC 스펙트럼이 각 리그닌 모델에 대하여 표시되었다. 다당류 및 할당되지 않은 부분(moieties)은 회색으로 표시된다. (e)는 리그닌에 존재하는 구조적 모티프를 (a) 내지 (d)의 2차원 hSQC 스펙트럼 할당에 해당하도록 색상으로 구분하여 표시한 그림이다. A는 β-아릴 에테르(β-O-4)이고; A(G)는 G 단위에 연결된 β-O-4이며; A(S)는 S 단위에 연결된 β-O-4이고; B는 페닐쿠마란(β-5)이며; C는 레지놀(β-β)이고; D는 β-5 스틸벤이며; X는 신나밀 알코올이고; E는 에놀 에테르이며; h는 p-히드록시페닐 단위이고; G는 G 단위이며; G'은 α-산화된 G 단위이고; G"은 α-술폰화된 G 단위이며; S는 S 단위이고; S'는 α-산화된 S 단위이며; S″는 α-감소된 S 단위이고; S은 α-술폰화된 G 단위이다.
도3은 리그닌 광촉매의 전자 및 광물리적 특성을 나타낸 그래프이다. (a)는 O2가 H2O2로 환원되고 H2O가 H2O2 및 O2로 산화되는 리그닌 민감성 반응의 에너지 다이어그램을 나타낸다. 삽입된 그림은 여러 분석 결과(hSQC, 31P NMR, 원소 분석 및 Ellman 분석 포함) 및 문헌을 기반으로 하는 리그노설포네이트(상단) 및 크래프트 리그닌(하단)의 가능한 구성 구조를 나타낸다. (b)는 태양광 시뮬레이션(solar-simulated) 가시광선 하에서 -0.028V(vs RHE)에서 리그닌 광촉매의 일시적인 광전류 반응을 나타낸다. (c)는 -0.028V(vs RHE)의 가시광선 하 Nyquist 플롯 형태의 전기화학적 임피던스 분광 분석결과를 나타낸다. Zre 및 Zim은 각각 실수 및 허수 임피던스를 나타낸다. 광원으로 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스 = 0.58μE cm-2 s-1)를 사용하였고, 표시된 실선은 용액 저항(Rs), 전하 이동 저항(Rct) 및 정위상 소자(CPE)로 구성된 Randles 회로 모델에 잘 부합한다.
도4는 가시광선에서 H2O2의 리그닌-감광성(Lignin-sensitized) 생산과 그 메커니즘을 나타낸 그래프이다. (a)는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌 광촉매에 의한 가시광선 구동 H2O2 생성을 나타낸다. 298.2K에서 가시광 조사/비조사(λ > 400nm, 광자 플럭스 = 0.58μE cm-2 s-1) 및 O2가 풍부한 조건에서 KPi 버퍼(100mM, ph 7.0)에 리그닌 광촉매(1mg ml-1)를 분산시키고 반응시켰다. (b)는 1,4-벤조퀴논(왼쪽)과 N2(오른쪽)가 리그닌-민감성 H2O2 생산 속도에 미치는 영향을 나타낸다. 298.2K에서 1,4-벤조퀴논(1mM)의 존재/부존재 조건에서 KPi 버퍼(100mM, ph 7.0)에 리그닌 광촉매(1mg ml-1)를 분산시키고 반응시켰다. (c)는 CEL, 리그닌 DHP, 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르(β-O-4 이량체), 코니페릴 알코올 및 시나필 알코올에 의해 구동되는 H2O2의 광화학 형성 여부를 확인한 그래프이다. 298.2K에서 가시광 조사/비조사(λ > 400nm, 광자 플럭스 = 0.58μE cm-2 s-1) 및 O2 또는N2가 풍부한 조건에서 KPi 버퍼(100mM, ph 7.0)에 리그닌(이량체) 모델 또는 모노리그놀(1mg ml-1)를 분산시키고 반응시켰다. 오차막대는 표준 편차(n=3)에 해당하며, * 및 **는 일원 분산 분석에 따라 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이가 없음을 나타낸다.
도5는 에틸벤젠 수산화에 대한 다양한 광효소 시스템의 TTNrAaeUPO 값을 나타낸 그래프이다. 본 발명의 리그닌 광촉매, rAaeUPO 및 가시광선을 결합한 최신 광효소 시스템을 사용하여 에틸벤젠 수산화에 대해 얻은 TTN 값을 다른 시스템과 비교하였다. 상기 다양한 광촉매 시스템들은 각각 금이 담지된 루틸(rutile) TiO2 나노입자(3,6), 금이 담지된 아나타제(anatase) TiO2 나노입자(3), 흑연질화탄소(8), 메틸렌 블루(7), 페노사프라닌(7) 및 플라빈 모노뉴클레오티드(7)를 포함한다. CbFDH는 칸디다 보이디니(Candida boidinii)로부터 유래된 포르메이트 탈수소효소이고; NAD+는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드이다.
도 6은 크래프트 리그닌의 2차원 핵자기공명 분광분석결과를 나타낸 그래프이다. (a)는 크래프트 리그닌의 1H-13C 이핵 단일 양자 간섭 분광 분석의 할당을 나타낸 그래프이다. 회색은 다당류 또는 할당되지 않은 부분을 나타낸다. 참고: Green Chem. 19, 4104-4121(2017). (b)는 크래프트 리그닌의 구조적 특징을 나타낸 그림이다. 각각 F는 구아이아실 히드록시에틸 케톤, I는 디히드로신나밀 알코올(구아이아실 프로판올), J는 세코이소라리시레시놀을 나타낸다.
도 7은 크래프트 리그닌의 싸이올 그룹 검출을 위한 Ellman 분석에 대한 그래프와 그림이다. (a)는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)과 싸이올 함유 분자(예: 크래프트 리그닌) 사이의 Ellman 반응 메커니즘을 나타낸 것이다. 이 반응은 412nm에서 최대 흡수를 나타내는 2-니트로-5-티오벤조산을 생성한다. (b)는 크래프트 리그닌을 포함하는 Ellman 시약 용액의 차등 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다. 에틸렌디아민테트라아세트산(1mM)을 포함하는 인산나트륨 완충액(100mM, pH 8.0)에 0.0089mg mL-1 크래프트 리그닌 및 0.178mM Ellman 시약을 첨가하여 실험하였다(ΔA ≡ A(t) - A(t = 0분)).
도 8은 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 31P 핵자기공명(NMR) 분광 분석결과를 나타낸 것이다. (a)는 피리딘과 중수소화 클로로포름의 용매 혼합물에서 리그닌의 수산기와 2-클로로-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스폴란 사이의 인산화 반응을 나타낸 것이며; (b)는 포스피틸화 반응 후 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 31P 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 것이다. 내부 표준물질(internal standard)은 시클로헥산올이었다. C5-치환된 OH는 축합된 OH 및/또는 시링길 OH 작용기를 포함한다. 피크 할당 참조: Green Chem. 18, 2651-2665(2016); (c)는 리그닌의 인산화된 작용기를 나타낸다.
도 9는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 광학적 특성을 나타낸 그래프이다. (a)는 0.01mg mL-1 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 UV-Vis 스펙트럼이다;(b) 및(c)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 Tauc 플롯이다.
도 10은 리그노설포네이트와 크래프트 리그닌의 광전자 분광 분석을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 자외선 광전자 스펙트럼을 나타낸다. 광원으로 21.2eV(He I 복사)에서 방출되는 헬륨 램프를 사용하였고, 리그노설포네이트와 크래프트 리그닌의 일함수는 각각 -4.24eV와 -3.27eV로 추정되었다. 광전자 방출 분광법은 유기 물질의 원자가 전자 상태를 특성화하는 데 널리 사용된다(Org. Electron. 41, 9-16 (2017)).
도 11은 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 전기화학적 분석 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 순환 전압전류도(voltammograms)를 나타낸다. 작업 전극은 유리질 탄소 전극이고 스캔 속도는 50mV s-1이며, 전해질 용액으로 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)을 사용하였고, 사이클 수는 3이었다.
도 12는 흡수 및 방출 스펙트럼의 겹침(overlap)을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 정규화된 흡수 및 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 리그노설포네이트과 크래프트 리그닌의 광물리적 성질을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 광발광 스펙트럼을 나타낸다. 리그닌 농도는 0.1mg mL-1이었다.
도 14는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 시간 분해 분광 분석을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 시간 분해 형광 붕괴 프로파일을 나타낸다. 여기 파장은 467nm, 방출 파장은 525nm, 리그닌 농도는 0.1mg mL-1이었다. 이러한 붕괴 프로파일은 하기 값을 따르는 극한 지수 함수에 맞춰졌다: (a)의 경우 τ1 = 3.1ns(52%), τ2 = 0.8ns(13%), τ3 = 9.2ns(35%), χ2 = 1.12; (b)의 경우 τ1 = 14.0ns(46%), τ2 = 0.7ns(25%), τ3 = 374.6ns(20%), τ4 = 2.5ns(9%), χ2 = 1.09이다.
도 15는 리그닌과 O2의 상호작용을 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 어두운 조건 및 298.2K온도 및 KPi 완충액(100mM, pH 7.0) 조건에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 차등 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 리그닌 농도는 1mg mL-1이었다. (c)는 리그닌이 없는 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)의 차등 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다. ΔA ≡ A(t) - A(t = 0h)이고, 주어진 시간(t) 동안 샘플을 O2로 퍼지했다. UV-Vis 흡수 스펙트럼을 얻기 전에 모든 샘플을 100배 희석했다. LS 및 KL의 흡광도는 O2 퍼징 시간에 따라 점차 증가했고, O2 퍼징을 중단했을 때 흡광도가 회복되었다.
도 16은 리그닌/O2 상호작용 연구결과 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 인산 D2O 완충액(100mM, pH 7.0)에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 1H NMR 스펙트럼의 변화를 나타낸다. 리그닌 농도는 2mg mL-1였다. O2가스를 12시간 동안 퍼징한 후에 중단했다. O2의 짝을 이루지 않은 전자와 인접한 핵의 결합은 화학적 이동 변화를 유발할 수 있다(Sci. Rep. 6, 20534 (2016)). 상기 화학적 이동(chemical shift)은 O2 퍼징을 중단한 후 되돌아 올 수 있는 것으로 나타났다.
도 17은 페녹시기를 가지는 화합물의 O2 매개 산화를 나타낸 그래프이다. (a), (b), (c) 및 (d) 는 각각 1,4-벤젠디올, 1,2-벤젠디올, 4-메틸페놀 및 도파민의 UV-Vis(좌) 및 1H NMR(우) 스펙트럼의 변화를 나타낸다. 페녹시 분자의 농도는 1mM이고, UV-Vis 흡수 스펙트럼을 얻기 전에 모든 샘플을 10배 희석했다. 나트륨트리메틸실릴프로판술포네이트(DSS)는 1H 화학적 이동의 보정 및 페녹시기를 가지는 분자의 정량화에 사용되었다. 정량적 NMR 분석은 O2 퍼지 후 상기 4개 분자의 농도에 변화가 없음을 보여준다.
도 18은 가시 광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1) 하에서 리그닌 에너지 물질이 존재/부존재 조건에서 H2O2의 광촉매 생성을 나타낸 그래프이다. 실험군의 반응 조건은 298.2K에서 O2가 풍부한 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 리그닌을 1mg mL-1 용해하였다. 오차 막대는 표준 편차(n = 3)에 해당한다.
도 19는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 작용 스펙트럼의 측정결과를 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 H2O2 형성에 대한 흡수 및 작용 스펙트럼을 나타낸다. 양자 수율은 (양자 수율(%) = [H2O2 (mol)] × [리그닌 광촉매에 의해 흡착된 총 광자 수(mol)]-1 × 100)의 식을 통해 계산되었다. 반응 샘플은 298.2K조건에서 O2가 풍부한 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 0.1mg mL-1 리그닌을 포함시켜 구성되었다. 그 양자 수율은 물을 전자 공여체로 사용하는 다른 가시광 활성 광촉매의 겉보기 양자 수율보다 낮았다(Appl. Catal. B Environ. 232, 19-25 (2018); ChemCatChem 10, 2070-2077 (2018)).
도 20은 광촉매 시험 후 리그닌의 분광학적 조사결과를 나타낸 그래프이다. (a)와 (b)는 각각 리그노설포네이트와 크래프트 리그닌 흡광도의 분광광도 변화를 나타낸다. UV-Vis 스펙트럼을 얻기 전에 샘플을 탈이온수에 10배 희석했다. (c)와 (d)는 각각 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 광발광 스펙트럼의 변화를 나타낸다. (e)는 리그노설포네이트, 크래프트 리그닌 및 탈이온수의 감쇠된(attenuated) 전반사 푸리에 변환 적외선(ATR-FTIR) 스펙트럼을 나타낸다. 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)를 광원으로 사용하였고, 리그닌 농도는 1mg mL-1, 온도는 298.2K이었으며, 용매는 O2-포화 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)을 사용하였다.
도 21은 리그노설포네이트 또는 크래프트 리그닌 존재 시 H2O2의 안정성을 나타낸 그래프이다. (a, b) 및 (c, d)는 각각 298.2K조건, KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에서 1mg mL-1 리그노설포네이트 및 1mg mL-1 크래프트 리그닌이 존재할 때 H2O2 농도의 시간 프로파일을 나타낸다. (e, f) 및 (g, h)는 각각 298.2K조건, KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌에 의한 H2O2 분해에 대한 리그닌 농도의 영향을 나타낸다. H2O2의 초기 농도는 0.2mM이며, 리그노설포네이트의 유사 1차 속도 상수(k1 및 k2)는 다음 방정식을 사용하여 각각 0.0054min-1 및 0.0055L g-1 min-1로 계산되었다. (d[H2O2]/dt = k1 [H2O2]) 및 (d[H2O2]/dt = k2 [Lignosulfonate][H2O2]).
도 22는 가시광선 조사 시 리그닌 광촉매에 의한 O2 *-의 형성을 나타낸 그래프이다. (a) 리그닌 촉매(예: 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌)에 의해 형성된 슈퍼옥사이드 이온을 검출하기 위한 니트로블루 테트라졸륨 분석(NBT)의 그림이다. NBT formazan은 560nm에서 분광광도계로 모니터링되었다. (b)는 다른 반응 조건에서, 560nm파장으로 측정한 NBT 용액의 흡광도 변화를 나타낸다. KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에서 1mg mL-1리그닌 및 10μM NBT조건에서 실험하였다. 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)를 광원으로 사용하였다. 온도는 298.2K였고, ND는 감지되지 않았음을 의미한다. 리그닌의 LUMO 수준은 O2(aq)(-0.16 VRHE)의 표준 1-전자 환원 전위보다 더 음수로 나타났다(Free Radical Biol. Med. 49, 317-322 (2010); Singlet Oxygen: Applications in Biosciences and Nanosciences Vol. 1 1-21 (The Royal Society of Chemistry, 2016)).
도 23은 가시 광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)하에서 리그닌 광촉매에 의해 구동되는 O2 생산을 나타낸 그래프이다. N2 퍼지된 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 1mg mL-1 리그닌의 존재 하에 298.2K 온도 조건에서 반응시켰다.
도 24는 셀룰로오스 분해 효소 리그닌 및 리그닌 탈수소화 중합체의 31P NMR 분광 분석결과를 나타낸 그래프이다. (a)는 2-클로로-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스폴란과 리그닌의 수산기 사이의 포스피틸화 반응 후 셀룰로오스 분해 효소 리그닌과 리그닌 탈수소 중합체의 31P NMR 스펙트럼 측정결과를 나타낸다. C5-치환된 OH는 축합된 OH 및/또는 시링길 OH 작용기를 포함한다(Green Chem. 18, 2651-2665(2016)). (b)는 인산화된 작용기들을 표시한 것이다.
도 25는 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르의 분자 구조를 나타낸 그림이다.
도 26은 O2의 광화학적 환원 전후의 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르의 분광 및 분광 분석결과를 나타낸 그래프이다. (a)는 광화학 반응 전후의 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르의 ATR-FTIR 스펙트럼을 나타낸다. 유리 기판에 이량체 용액을 분사하고 주변 조건에서 건조하여 샘플을 제조했다. (b)는 광화학 반응 후 반응 용액의 기체 크로마토그래피-질량 분석 크로마토그램을 나타낸다. 광 구동 반응 후, 디클로로메탄을 사용하여 분석물을 추출하였다. (c) 및 (d)는 각각 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르 및 그 α-산화된 형태의 가스 크로마토그래피-질량 분석(GC-MS) 스펙트럼을 나타낸다. 상기 (a, b)의 반응 용액은 KPi 완충액(100mM, pH 7.0) 및 1mg mL-1 구아이아시글리세롤-β-구아이아실 에테르이고, (a, b)의 광원은 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)이다. 패널(a)는 1650cm-1 근처에서 흡광도의 증가를 보여주며, 이는 어두운 조건이 아닌 밝은 조건에서 C=O 스트레칭(stretching)에 할당된다(Angew. Chem. Int. Ed. 57, 13825-13828 (2018); Procedia Eng. 148, 1312-1319 (2016)). 또한, GC-MS 분석은 이량체의 Cα-OH가 카르보닐기로 산화되었음을 보여준다.
도 27은 에틸벤젠의 광생체촉매 하이드록실화에서 각 반응 성분(즉, 리그닌, 빛, rAaeUPO 및 기질)에 대한 제어 실험결과를 나타낸 그래프이다. 가시광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s -1)조사 하에 298.2K에서 실험하였고, H2O2제거제로써 피루브산 500mM를 사용하였으며, 1시간 반응시켰다. 리그닌/UPO 커플(Couple)은 가시광선에서 아세토페논을 생성하지 않았다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다(n = 3). ND는 감지되지 않았음을 표시한다. 산화적으로 더 불안정한 π-관능기(functionality)에 인접한 메틸렌 C-H 결합의 하이드록실화가 매우 어렵기 때문에 에틸벤젠을 모델 기질로 설정하였다(Nat. Chem. 11, 213-221 (2019)). 리그닌과 rAaeUPO 사이의 상호작용은 직접적으로 LS와 KL에 의한 rAaeUP의 광활성화를 초래하지는 않았다. H2O2 스캐빈저(피루브산)이 존재하는 경우 1-페닐에탄올 수율은 아주 적었다. 위 결과는 화합물 I의 재생이 H2O2 션트(shunt) 경로에서만 발생함을 나타낸다.
도 28은 광효소 생성물의 가스 크로마토그래피-질량 분석 스펙트럼(위) 및 질량 스펙트럼 라이브러리(아래)를 나타낸 그래프이다. (a), (b), (c), (d) 및 (e)는 각각 1-페닐에탄올, 1-페닐-1-프로판올, 1,2,3,4-테트라히드로-1-나프톨, 시클로헥산올, 및 1-페닐프로필렌 옥사이드 효소생성물을 분석한 결과를 나타낸다.
도 29는 순수 화학물질(위) 및 광활성화 리그닌/rAaeUPO 하이브리드에 의한 생성물(아래)의 대표적인 가스 크로마토그램을 나타낸 그래프이다. (a), (b), (c), (d) 및 (e)는 각각 1-페닐에탄올 및 아세토페논; 1-페닐-1-프로판올 및 프로피오페논; 1,2,3,4-테트라히드로-1-나프톨 및 3,4-디히드로-2H-나프탈렌-1-온; 시클로헥산올 및 시클로헥사논; 1-페닐프로필렌 옥사이드, 1-페닐-1-프로판올 및 1-페닐-2-프로판올에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 30은 리그닌 모델 또는 모노리그놀을 사용한 광효소 하이드록실화 반응결과를 나타낸 그래프이다. 리그닌 모델 또는 모노리그놀의 농도는 1mg mL-1이고, 용매는 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠을 함유하는 O2-퍼지된 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)이었으며, 광원은 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)이고, 온도는 298.2K, 반응 시간은 1시간이었다. ND는 감지되지 않았음을 의미한다.
도 31은 산소 동위 원소 라벨링 실험결과를 나타낸 것이다. (a)는 N2가 풍부한 조건에서 H2 18O 용매에 광활성화된 리그닌과 퍼옥시게나아제를 사용하여 18O로 표지된 알코올 생성물의 형성을 나타낸 그림이다. (b)는 LS/rAaeUPO 및 KL/rAaeUPO 하이브리드가 N2 포화 H2 18O에서 합성된 18O로 표지된 (R)-1-페닐에탄올의 가스 크로마토그래피-질량 분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 32는 광효소 하이드록실화 반응의 역학을 나타낸 그래프 및 그림이다. (a)는 rAaeUPO-촉매 수산화 반응에 대한 TOFrAaeUPO에 대한 리그닌 농도의 영향을 나타낸 그래프이다. 가시광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 0.58μE cm-2 s-1)조사 하에 298.2K에서, KPi 완충액(100mM, pH 7.0, O2 퍼지)에 리그닌, 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠을 포함하는 조건에서 실험하였다. (b)는 광자 플럭스에 대한 TOFrAaeUPO의 의존성을 나타내는 그래프이다. 298.2K에서 O2가 풍부한 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 8mg mL-1 리그닌, 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠이 존재하는 조건에서 실험하였다. TOFrAaeUPO 값은 2시간 반응으로 결정하였다. (c)는 rAaeUPO 및 에틸벤젠을 함유하는 리그닌 용액의 사진이다. KPi 완충액(pH 7.0, 100mM)에 50nM RarAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠이 존재하는 조건에서 실험하였다(사진제공: 김진현, 한국과학기술원). (a)에서 볼 수 있듯이, rAaeUPO의 전환 빈도(TOFrAaeUPO)는 8mg/mL 이상의 리그닌 농도로 포화되었으며, 이는 H2O2 형성이 속도 제한 단계에 해당함을 의미한다. (b)에서 볼 수 있듯이, 고정된 리그닌 농도(8mg mL-1)에서 광자 플럭스를 변화시켰을 때 LS/rAaeUPO의 TOFrAaeUPO는 1.16μE cm-2 s-1 이상에서 KL/rAaeUPO의 TOFrAaeUPO보다 컸다. (c)에서 볼 수 있듯이 상기 결과는 KL에 비해 LS이 더 높은 광학적 투명도를 가지기 때문으로 생각된다; KL의 자가 차광 효과는 빛 투과를 감소시켜 일부 KL 광촉매를 반응 용액에서 불활성화시켰고, 하이드록실화 반응은 1.74μE cm-2 s-1 이상에서 포화된 TOFrAaeUPO를 나타냈다.
도 33은 rAaeUPO와 리그닌 사이의 상호작용을 나타낸 그래프이다. (a) 및 (b)는 각각 298.2 K에서 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌의 첨가에 의한 110nM rAaeUPO의 흡광도의 분광광도학적 변화를 나타낸다. 리그닌 거대분자는 비공유 결합(소수성, 정전기, 수소 결합 상호작용)을 통해 효소와 상호작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Biotechnol. Adv. 35, 466-489 (2017)).
도 34는 리그닌 광촉매 및 rAaeUPO에 의해 구동되는 장기(long-term) 광효소 반응의 시간 프로필을 나타낸 그래프이다. O2가 풍부한 KPi 완충액 (100mM, pH 7.0)에 8mg mL-1 리그닌 광촉매, 50nM rAaeUPO 및 10mM 에틸벤젠이 존재하는 조건에 가시광선(λ > 400nm, 광자 플럭스: 1.74μE cm-2 s-1)을 조사하여 298.2K에서 반응시켰다. 반응용액(10μL)을 일정 간격으로 채취하여 5mM 1-옥탄올(내부표준)이 포함된 에틸아세테이트 용액(40μL)과 혼합하여 옥시기능화 생성물을 추출하였다. 또한 가스 크로마토그래피를 사용하여 추출된 생성물을 정량화하고 방정식(TTN = [주어진 시간에 대한 생성물의 최대 농도] × [rAaeUPO 농도]-1)을 사용하여 총 회전수(TTN)를 계산했다.
도 35는 리그닌 광촉매에 의해 형성된 하이드록실 라디칼의 검출을 나타낸 것이다. (a)는 테레프탈산과 하이드록실 라디칼의 반응을 나타낸 것이다. 테레프탈산은 OH*와 반응하여 2-하이드록시테레프탈산을 생성하며, 이는 315nm 여기(excitation)하에 430nm에서 분광형광법으로 모니터링할 수 있다. (b)는 430nm(λex = 315nm)에서 반응 용액의 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 36은 적철광(α-Fe2O3) 필름의 특성을 나타낸 것이다. (a)는 나노구조 적철광 필름의 평면도 주사 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 500nm이다. (b)는 α-Fe2O3의 X선 회절 패턴 및 JCPDS #01-085-0599(적철광)의 표준 회절 패턴을 나타낸다. 별표는 FTO의 회절 패턴을 나타낸다. (c)는 Fe 2p에 대한 적철광 필름의 X선 광전자 스펙트럼을 나타낸다. (d)는 α-Fe2O3 전극의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 37은 리그닌 물질의 항산화 특성을 나타낸 것이다. (a)는 α-Fe2O3 광전기촉매에 의해 구동되는 광전기화학적 H2O 산화에서 OH*로의 에너지 다이어그램을 나타낸다. α-Fe2O3 막의 광감작(Photosensitization)은 각각 가전자대와 전도대에서 광여기(photoexcited)된 정공과 전자를 생성한다. 상기 정공은 반도체|전해질 계면으로 이동하여 H2O를 하이드록실 라디칼로 산화시키고 리그닌에 의해 제거된다. (b)는 리그닌(예: 리그노설포네이트, 크래프트 리그닌) 유/무에 따른 0.3mM 테레프탈산을 함유하는 적철광 전해액의 형광 강도(λex = 315nm, λem = 430nm) 변화를 나타낸다. 적철광 전극의 기하학적 표면적은 2.5cm2이고, 적용된 바이어스는 0.622VRHE(0VAg/AgCl)이며, 광원으로 크세논 램프(λ > 400nm, 광자 플럭스: 1.74μE cm-2 s-1)를 사용하였다. ND는 감지되지 않았음을 의미한다.
도 38은 그라운드(ground)/여기(exited) 산화 전위를 기반으로 하는 리그노설포네이트 및 크래프트 리그닌에 의해 구동되는 H2O2 및 O2 형성의 산화적 소광(quenching) 경로를 나타낸 그림이다. 리그닌은 빛을 흡수하여 광활성화 상태인 리그닌*이 되며, 이는 상응하는 바닥 상태와 비교하여 더 강력한 환원력을 나타낸다. LS* 및 KL*은 여기 상태 전위[E(LS·+/LS*), -1.56 VRHE; E(KL·+/KL*), -1.19 VRHE]가 O2의 산화환원 전위[E(O2/H2O2), 0.68VRHE]보다 음의 값을 가지기 때문에 O2를 H2O2로 환원시킬 수 있다. 결과적으로, LS*와 KL*은 상응하는 기저 상태 산화 전위[E(LS·+/LS), 2.29VRHE; E(KL·+/KL), 2.40 VRHE]와 함께 산화된 상태인 리그닌·+이 된다. 상기 산화된 리그닌는 H2O 산화를 통해 원래 상태로 되돌아간다. 왜냐하면 LS와 KL의 기저 상태 전위는 H2O의 산화환원 전위보다 더 양성이기 때문이다[예시로, E(O2/H2O), 1.23 VRHE; E(H2O2/H2O), 1.76 VRHE].
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서, 용어 “총 회전수(total turnover number)”는 “TTN”으로 약칭된다. TTN은 효소학에 있어서, 주어진 시간에 대해 기준농도의 효소가 있는 경우에 기질 분자에서 생성물로의 최대 화학적 전환 수로 정의되는 개념이다.
본 명세서에서, 용어 “회전 빈도(turnover frequency)”는 “TOF”로 약칭된다. TOF는 효소학에 있어서, 단위시간 당 효소의 기준농도에 대하여 생성되는 생성물의 양으로 정의되는 개념이다.
본 발명의 일 실시예에서, 발명자들은 β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체에 가시광선 조사 시 상기 β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체가 여기되고, 여기된 리그닌 또는 그 유도체는 환원제로써 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하고 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼로 산화되며, 상기 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼은 산화제로써 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고 리그닌 또는 그 유도체로 환원되는 것을 확인하였다.
추가로, β-O-4 결합을 함유하는 크래프트 리그닌, 리그노설포네이트, 셀룰로오스 분해효소 리그닌 및 리그닌 탈수소화 중합체를 포함하는 광촉매의 경우 성공적으로 과산화수소를 생성하였으나, 리그닌 합성의 주요한 모노리그놀로써, 상기 β-O-4 결합을 함유하지 않는 코니페릴알코올(4-히드록시-3-메톡시신나밀알코올)과 시나필알코올(4-히드록시-3,5-디메톡시신나밀알코올)은 광화학 반응을 수행하지 않는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하고, 가시광선 존재 하에 O2의 환원 및 H2O의 산화에 의해 과산화수소 생성능을 가지는 광촉매에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 리그닌 또는 그 유도체는 크래프트 리그닌, 리그노설포네이트, 셀룰로오스 분해효소 리그닌, 리그닌 탈수소화 중합체, 염기성 리그닌, 올가노졸브 리그닌 및 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 크래프트 리그닌 또는 리그노설포네이트인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리그닌 또는 그 유도체는 가시광선 조사시에 여기되고, 여기된 리그닌 또는 그 유도체(리그닌*)는 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하며, 상기 여기된 리그닌 또는 그 유도체는 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼(리그닌ㆍ+)로 산화되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼은 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고 리그닌 또는 그 유도체로 환원되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “β-O-4 결합”은 이량체 이상의 리그닌 중합체가 가질 수 있는 결합으로, 하나의 유닛의 4번 탄소-산소(O)-다른 유닛의 β탄소가 순서대로 연결되는 결합을 말한다. 여기서 "유닛"이란, 리그닌을 구성하는 세 종류의 구성물질을 의미하며 메톡시화(methoxylation)된 쿠마릴 알코올 (p-coumaryl alcohol), 코니퍼릴 알코올 (coniferyl alcohol), 시내필 알코올 (sinapyl alcohol)이 이에 해당한다. 상기 유닛은 "C9 유닛", "C9 단위"또는"모노리그놀(monolignol)"과 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 상기 유닛은 페닐프로판 분자 구조를 가지고 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “리그닌”은 상기 세 가지 유닛의 중합체로서 다량의 방향족 화합물을 포함하기 때문에 소수성을 띄며 복합한 구조를 가진 고분자이다. 상기 리그닌은 화학적으로 강한 내구성을 가지고 있어서 분해가 어렵다. 목질계 바이오 매스 내에서 리그닌은 헤미셀룰로오스와 공유결합으로 연결되고 헤미셀룰로오스는 셀룰로오스와 수소결합을 통해 연결되어 있으므로, 전체적으로 직선형인 셀룰로오스 마이크로파이브릴(microfibril)을 헤미셀룰로오스가 수소 결합으로 감싸고, 이러한 헤미셀룰로오스를 다시 리그닌이 공유결합으로 둘러싼 형태를 갖는다.
본 발명의 용어 ”유도체”는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물을 지칭한다. 용어 “리그닌 유도체”는 리그닌의 일부가 화학적으로 변화되어 생성되는 유사한 화합물을 지칭한다. 상기 “화학적 변화”는 치환반응, 첨가반응, 산화환원반응 등 반응의 종류에 한정되지 않고 모든 화학 반응을 통하여 이루어지는 변화를 모두 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 리그닌 유도체에는 크래프트 리그닌, 리그노설포네이트, 셀룰로오스 분해효소 리그닌, 리그닌 탈수소화 중합체, 염기성 리그닌, 올가노졸브 리그닌 및 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 ”크래프트 리그닌”은 크래프트 펄프 공정에서 얻어지는 산업용 리그닌을 지칭한다. 크래프트 펄프공정은 침엽수를 펄프로 만드는 주요 공정이다. 펄프화 과정에서, 리그닌 거대 분자가 부서지고, 분자량이 감소하며 리그닌이 알칼리성 용액에 용해되어 용액이 암갈색으로 변한다.
본 발명의 용어 “리그노설포네이트”는 아황산염 펄프 공정을 통한 목재 펄프 생산의 부산물을 지칭한다. 상기 크래프트 리그닌 및 리그노 설포네이트는 모두 β-O-4 결합을 포함하는 대표적인 리그닌이며, 펄프 산업 등 다양한 산업을 통해 많은 양이 발생한다.
본 발명의 용어 “셀룰로오스 분해효소 리그닌”은 목질바이오매스를 효소로 가수분해하여 얻어지는 리그닌이다. 자연에 존재하는 리그닌과 상당히 유사한 리그닌 유도체로써, 효소 (예: 셀룰라아제)를 이용하여 자연에 존재하는 리그닌-탄수화물 연합체에서 추출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 셀룰로오스 분해 효소 리그닌은 오일 팜의 빈 과일 다발(Empty fruit bunches,EFB)을 분쇄하고 체질한 후, 셀룰라아제 효소를 이용한 가수분해를 통해 수득될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “리그닌 탈수소화 중합체”는 생체 내 자연적 목질화 과정과 유사한 과정인, 과산화효소 매개 탈수소 중합 반응을 통하여 합성될 수 있는 리그닌이다. 즉, 리그닌의 화학적 성질을 연구하기 위해 인공적으로 합성될 수 있는 리그닌 고분자이다. 상기 리그닌 탈수소화 중합체는 페록시다아제 효소와 리그닌의 단위체를 이용하여 합성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 리그닌 탈수소화 중합체는 호스라디쉬의 페록시다아제(HRP, 25 UmL-1)를 포함하는 용액을 시나필알코올 및 코니페릴알코올과 함께 중합 반응시켜 수득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "염기성 리그닌(soda lignin)"은 알칼리 제지 공정의 부산물로써 생성되는 리그닌 유도체를 지칭한다.
본 발명의 용어, “올가노졸브 리그닌(organosolv lignin)”은 유기용매로 전처리 과정을 거친 리그닌 유도체를 지칭하며, 용어 ”유기용매 리그닌”과 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어"구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르"는 β-O-4 결합을 함유하는 C9유닛의 이량체 구조를 가지는 리그닌 유도체이다. 도 25에 나타난 화학식으로 표현된다. 상기 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르는 자연계 리그닌이 가장 많이 가지고 있는 리그닌 이량체 모델(lignin dimer model)이다.
본 발명의 용어 “여기(excitation)”는 원자에 존재하는 전자가 외부로부터 에너지를 흡수하여 에너지 준위가 높은 전자궤도로 이동하는 것을 의미하며, 용어 “들뜸”과 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용될 수 있다. 최저 비점유 분자 오비탈(LUMO)와 같은 높은 에너지 준위를 갖는 전자 궤도에 있는 전자는 불안정하여 에너지를 다시 방출하며 형광 방사, 촉매작용, 산화환원 등 다양한 역할을 수행할 수 있다. 본 발명에서는 리그닌 또는 그 유도체의 전자가 여기된 후 그 에너지를 이용하여 광촉매 작용을 한다.
본 발명의 용어 “라디칼”은 한 개 또는 그 이상의 비공유전자를 갖고 독립하여 존재할 수 있는 화학종을 말한다. 전자는 일반적으로 하나의 궤도에 2개씩 짝을 지어 안정하게 수용되지만, 상기 비공유전자는 하나의 전자로 하나의 전자궤도 또는 하나의 분자궤도를 점유하는 전자이다. 따라서 비공유전자를 갖는 분자는 일반적으로 불안정하고 다른 것으로부터 전자를 빼앗거나 비공유전자를 그 외 다른 곳으로 줌으로써 안정화되고자 하는 성질이 강하다. 라디칼은 “ㆍ“로 표시되며(예, OHㆍ, O2 ㆍ-등), 본 발명에서, 여기된 리그닌 및 그 유도체는 전자를 O2에 공여하여 환원시키고 리그닌 및 그 유도체 라디칼이 생성되며, 생성된 리그닌 및 그 유도체 라디칼은 반응성이 높아 H2O로부터 전자를 빼앗아 산화시키고 기저상태의 리그닌 및 그 유도체로 돌아간다. 본 발명의 일 실시예에서 여기된 리그닌이 O2에 전자를 공여하고 생긴 라디칼 양이온은 “ㆍ+“로 표시된다.
본 발명에 있어서, 용어 “광촉매”는 광 조사시 빛에너지를 흡수하여 화학반응을 촉진할 수 있는 물질을 말한다. “촉매”란 자신의 상태를 유지한 상태로 반응속도에 관여하는 물질로서, 반응 속도를 빠르게 하는 정촉매 및 느리게 하는 부촉매를 포함한다. 광촉매는 광학적으로 활성이 있어야 하면서도, 광에 부식되지 않는 광안정성이 있어야 한다. 광촉매는 일반적으로 빛의 조사 시 자유 라디칼을 생성하는 능력을 가진다. 대표적인 광촉매로는 이산화티타늄(TiO2)이 있으며, 본 발명자들은 광물리적 특성 규명을 통해 리그닌이 광촉매에 해당함을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 발명자들은 상기 광촉매의 존재 하에 가시광선을 조사하는 경우, 지속적으로 과산화수소가 생성되는 것을 확인하였고, 그 메커니즘을 탐구하여, 가시광선의 조사에 따른 리그닌 또는 그 유도체가 여기되는 단계; 상기 여기된 리그닌 및 그 유도체가 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하고, 리그닌 라디칼 및 그 유도체 라디칼로 산화되는 단계; 상기 리그닌 라디칼 및 그 유도체 라디칼이 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고 리그닌 및 그 유도체로 환원되는 단계를 통하여 과산화수소가 생성됨을 확인하였으며, 크래프트 리그닌 및 리그노설포네이트를 포함하는 광촉매를 사용한 경우에 한 시간 및 촉매 1g 당, 80 ± 20 및 160 ± 30mM의 비율로 H2O2를 점진적으로 축적하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체를 광촉매로 활용하는 경우에 다른 인공 전자공여체가 없이 물을 활용함으로써 산화환원반응을 수행할 수 있다는 장점이 있고, 상기 광촉매가 H2O를 산화시키는 단계에서 O2가 발생되어 광촉매 주위에 국부적으로 O2 농도가 높아짐으로써 O2의 환원 반응의 속도가 빨라지며, O2의 환원 및 H2O의 산화반응이 순환적으로 반복됨으로써 지속적으로 산화환원반응이 수행될 수 있어, 종국적으로 고효율로 과산화수소를 제조할 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 가시광선의 존재 하에, 상기 광촉매를 이용하여 O2를 환원시키는 단계 및 H2O를 산화시키는 단계를 포함하는 과산화수소의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 과산화수소의 제조방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) 상기 광촉매에 가시광선을 조사하여 리그닌 또는 그 유도체를 여기시키는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 여기된 리그닌 또는 그 유도체에 의해 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 여기된 리그닌 또는 그 유도체는 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼로 산화되는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 산화된 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼에 의해 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼은 리그닌 또는 그 유도체로 환원되는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c) 단계는 순환적으로 반복되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 발명자들은 상기 광촉매와 비특이적 퍼옥시게나아제 및 C-H결합을 가지는 기질(에틸 벤젠, 프로필 벤젠, 테트랄린, 사이클로헥산 및 시스-β-메틸스티렌 중 어느 하나)을 포함하는 반응 샘플을 준비하고 가시광선을 조사한 결과, 옥시화 반응이 수행되어 알코올 또는 에폭사이드를 생성하는 것을 확인하였다. 또한, β-O-4 결합을 가지지 않는 코니퍼릴 알코올 및 시내필 알코올을 포함하는 광촉매를 이용하는 경우에는 옥시화 반응을 일으키지 않는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 광촉매; 및 비특이적 퍼옥시게나아제(UPO)를 유효성분으로 포함하는, C-H결합을 가지는 기질의 옥시화 반응을 위한 하이브리드 촉매에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 C-H결합을 가지는 기질은 에틸 벤젠, 프로필 벤젠, 테트랄린, 사이클로헥산 및 시스-β-메틸스티렌으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 용어 ”비특이적 퍼옥시게나아제”는 유기합성에서 상당히 중요한 선택적 옥시화 반응을 유도할 수 있는 효소이다. 상기 비특이적 퍼옥시게나아제의 촉매작용을 위해서는 과산화수소의 존재는 필수이나, 상기 비특이적 퍼옥시게나아제는 고농도의 과산화수소에 의하여 비활성화되므로 적절한 농도의 과산화수소가 요구된다.
특정 실시 양태에서, 상기 비특이적 퍼옥시게나아제는 하기 문헌의 방법에 따라 Pichia pasteris에서의 재조합 발현을 통해 얻어질 수 있다(ACS Catal. 9, 7409-7417 (2019); ACS Catal. 9, 10562-10566 (2019)). 또는, 하기 업체들을 통해서도 공급받을 수 있다.
1) Creative enzymes® (Cat No. EXWM-0512, https://www.creative-enzymes.com/product/unspecific-peroxygenase_10682.html)
2) EvoEnzyme (EVOkit (12종의 PaDa-I UPO variant 포함), https://evoenzyme.com/evokit/)
3) Novozymes A/S (UPO from Coprinopsis cinerea (rCciUPO), UPO from Humicola insolens등의 퍼옥시게나아제를 공급받을 수 있음)
또한, 상기 비특이적 퍼옥시게나아제는 다양한 종류의 옥시화 반응을 촉매하는 것으로 알려진 생체촉매이다. 상기 “옥시화 반응”은 하기 반응들(하이드록시화 및 에폭시화)을 포함하는 개념으로, 기질에 산소원자를 추가하는 반응이다. 본 발명의 “옥시화 반응”은 거울상 선택적 생성물을 만드는 반응일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 퍼옥시게나아제를 촉매로 하여 수행될 수 있는 “옥시화 반응”은 다음과 같다.
1. 하이드록시화
하이드록시화 반응은 크게 aliphatic C-H bond의 hydroxylation, aromatic C-H bond의 hydroxylation 2종류로 나눌 수 있다(Biotechnology Advances 2021, 51, 107615). 반응의 기질 (substrate)은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
상기 치환된 알킬기(R1, R2)는 aromatic 혹은 aliphatic일 수 있다. 또한 R1과 R2는 서로 연결되어 고리형 혹은 방향족 탄화수소를 형성할 수 있다.
Hydroxylation은 알코올을 생성하는 반응이다. hydroxylation 반응에 의해 1차적으로 생성된 알코올은 한번 더 퍼옥시게나아제에 의해 반응하면서 알데하이드와 케톤을 생성할 수도 있다.
1-1. 지방족 C-H결합의 하이드록시화
알케인, 사이클로알케인뿐만 아니라 지방산, 알킬벤젠 등의 기질의 하이드록시화도 수행할 수 있다.
1-2. 방향족 C-H결합의 하이드록시화
벤젠 고리에 있는 C-H결합이 비특이적 퍼옥시게나아제의 존재 하에 과산화수소와 반응하여 하이드록시기로 전환되는 반응이다. 반응 기질은 하기 화학식 2로 표현될 수 있다.
[화학식 2]
및 그 유도체.
2. 에폭시화
본 발명에서, 용어”하이브리드 촉매”는 C=C 이중결합의 에폭시화 반응을 통해 에폭사이드를 생성하는 반응이다. 반응은 다음과 같으며, 반응 기질은 하기 화학식 3으로 표현될 수 있다.
[화학식 3]
;
본 발명의 일 실시예에서, 발명자들은 상기 하이브리드 촉매 및 C-H결합을 가지는 기질(에틸 벤젠, 프로필 벤젠, 테트랄린, 사이클로헥산 및 시스-β-메틸스티렌 중 어느 하나)을 포함하는 반응 샘플을 준비하고 가시광선을 조사한 결과, 옥시화 반응이 수행되어 알코올 또는 에폭사이드가 생성되는 것을 확인하였고, 그 메커니즘을 조사하여 상기 하이브리드 촉매의 리그닌 및 그 유도체가 상기 방식으로 과산화수소를 생성하여 비특이적 퍼옥시게나아제(UPO)에 공급할 뿐만 아니라, UPO와의 상호작용을 통하여 상기 UPO가 보다 쉽게 인접한 과산화수소를 이용하여 옥시화 반응을 수행할 수 있도록 촉진함을 확인하였다. 추가로, 상기 하이브리드 촉매에 포함되는 리그닌 또는 그 유도체가 항산화 능력을 가져, 상기 UPO의 불활성화를 방지하여 지속적인 촉매활성을 나타낼 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 가시광선의 존재 하에, 상기 하이브리드 촉매를 이용하여 C-H결합을 가지는 기질을 옥시화 반응시키는 단계를 포함하는 유용물질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유용물질의 제조방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) 상기 광촉매에 가시광선을 조사하여 리그닌 또는 그 유도체를 여기시키는 단계 (b) 상기 (a)단계에서 여기된 리그닌 또는 그 유도체에 의해 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 여기된 리그닌 또는 그 유도체는 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼로 산화되는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 산화된 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼에 의해 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼은 리그닌 또는 그 유도체로 환원되는 단계; 및 (d) 비특이적 퍼옥시게나아제의 존재 하에, 상기 (b)단계 및 (c)단계에서 제조된 과산화수소와 C-H결합을 가지는 기질을 옥시화 반응시키는 단계.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c) 단계는 순환적으로 반복되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 C-H결합을 가지는 기질은 다음 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 기질인 것을 특징으로 할 수 있다.
[화학식 1]
;
[화학식 2]
및 그 유도체;
[화학식 3]
.
상기 화학식 1 내지 3에서 R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 아미노, 아미드, 니트릴기, 니트로기, 니트로소기, 히드록시 또는 벤질; C1-30의 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬, 알킬아민, 알콕시, 알콕시알킬, 알킬에스터, 알킬에터, 알킬아미드, 할로알킬, 알킬카보닐 또는 알콕시카보닐; C3-30의 헤테로사이클릭아민, 사이클로알킬, 사이클로알킬카보닐, 또는 사이클로알콕시; C2-30의 알릴; 또는 C6-30의 아릴카보닐, 알킬아릴카보닐, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 헤테로아릴, 알콕시헤테로아릴 또는 알킬헤테로아릴이고;
또는 상기 R1과 R2는 서로 연결되어 치환 또는 비치환된 고리형 탄화수소 또는 방향족 탄화수소를 형성한다.
본 발명에 있어서, 상기 알킬, 알킬아민, 알콕시, 알콕시알킬, 알킬에스터, 알킬에터, 알킬아미드, 할로알킬, 알킬카보닐 또는 알콕시카보닐은 바람직하게는 C1-15, 더욱 바람직하게는 C1-10, 가장 바람직하게는 C1-7인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "C1-30 알킬"은 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖는, 오직 탄소와 수소 원자로만 이루어진 1가 선형 또는 분지형 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 이러한 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. "분지형 알킬"의 예는 아이소프로필, 아이소부틸, 3급-부틸 등이 있다.
용어 "C1-30 알콕시"는 화학식 -O-C1-30 알킬을 의미하며, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시, 3급-부톡시 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "할로겐(또는 할로(halo))"의 구체적인 예로는 플루오르(F), 클로린(Cl), 브롬(Br) 및 요오드(I)를 들 수 있다.
용어 "아미노"는 암모니아에서 수소원자가 한 개 떨어져 나간 형태의 작용기를 의미하며, 하나 이상의 수소가 탄화수소 등의 잔기로 치환된 아민기를 포함하고, 아민기는 치환된 알킬 개수에 따라 1차, 2차, 3차 알킬아민을 포함할 수 있다. "헤테로사이클릭아민"은 헤테로 고리 화합물의 일종으로, 질소가 고리의 일부로 되어 있는 아민을 지칭한다.
용어 "C6-30 아릴(aryl)"은 공유 파이 전자계를 가지는 적어도 하나의 환을 포함하며, 예를 들어 모노사이클릭 또는 융합환 폴리사이클릭(즉, 탄소 원자들의 인접한 쌍들을 나눠가지는 링들)그룹을 포함한다. 즉, 본 명세서에서 아릴은 달리 정의하지 않는 한 페닐, 나프틸 등과 바이아릴을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 아릴은 탄소수 6 내지 30의 방향족 고리를 지칭한다.
용어 "C3-30 사이클로알킬(Cycloalkyl)"은 3 내지 30개의 탄소 원자를 갖는, 오직 탄소와 수소 원자로만 이루어진 고리형의 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 본 발명에서, 바람직하게는 5 내지 6개의 탄소를 갖는 사이클로알킬이 치환기로써 적절하다. 이러한 사이클로알킬 기의 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "헤테로아릴"은 달리 정의하지 않는 한 N, O 및 S로 이루어진 그룹에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함하는 고리원자수 5 또는 6의 방향족 고리이거나, 또는 상기 헤테로아릴 고리가 벤젠 고리 또는 다른 헤테로아릴 고리에 융합된 2환식 고리를 지칭한다. 모노사이클릭 헤테로아릴의 예로는 티아졸릴, 옥사졸릴, 티오페닐, 퓨라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 이소옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 트리아지닐, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 옥사디아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비사이클릭 헤테로아릴의 예로는 인돌릴, 아자인돌릴, 인돌리닐, 벤조티오페닐, 벤조퓨라닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈티아디아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퓨리닐, 퓨로피리디닐 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 R1 내지 R4은 바람직하게는 각각 다음의 치환기 이거나,, , , 또는 ; 또는 R1과 R2는 또는 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 C-H결합을 가지는 기질은 하기 화학식 1-1 내지 1-4, 하기 화학식 2-1 및 2-2 및 하기 화학식 3-1로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
[화학식 1-1]
;
[화학식 1-2]
;
[화학식 1-3]
;
[화학식 1-4]
;
[화학식 2-1]
;
[화학식 2-2]
;
[화학식 3-1]
.
또한 본 발명에 있어서, 상기 유용물질은, 상기 기질이 화학식 1로 표시되는 화합물인 경우, 알코올, 알데하이드 또는 케톤이고; 상기 기질이 화학식 2로 표시되는 화합물인 경우, 페놀 또는 페놀 유도체이며; 상기 기질이 화학식 3으로 표시되는 화합물인 경우, 에폭사이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 C-H결합을 가지는 기질은 에틸 벤젠, 프로필 벤젠, 테트랄린 및 사이클로헥산일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 화학 물질과 재료 합성 및 준비
과산화수소는 Junsei Chemical Co., Ltd.(Tokyo, Japan)에서 구입했다. 인산칼륨 단염과 인산칼륨 중염기는 삼천화학(서울, 한국)에서 구입했다 크래프트 리그닌과 리그노설포네이트는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)와 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.(Chuo-ku, Japan)에서 구입했다. 호스라디쉬의 페록시다아제, 니트로테트라졸륨 블루클로라이드, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디암모늄염, 황산마그네슘, H2 18O, 디메틸설폭사이드(DMSO), 3-(트리메틸실릴)-1-프로판설폰산나트륨염(DSS), 에틸 아세테이트, 1-옥탄올, (R)-1-페닐에탄올, (S)-1-페닐에탄올, 아세토페논, 염화철(III) 육수화물, 소듐 니트레이트, 및 시나필 알코올 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했다. 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르와 코니페릴 알코올은 각각 Tokyo Chemical Industry(Tokyo, Japan) 및 Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, Massachusetts, USA)에서 구입했다. O2 및 N2 가스(순도: 99.999%)는 Special Gas Co.(대전, 한국)에서 구입했다. Direct-Q® 5 UV 초순수(ultrapure water) 정수 시스템(Millipore Corp., USA)의 Type 1 초순수(ultrapure water)(18MΩ cm)를 사용했다. 문헌을 참조하여 Agrocybe aegerita(rAaeUPO)의 재조합 비특이적 퍼옥시게나아제를 준비했다(ACS 카탈로그. 9, 7409-7417(2019); ACS 카탈. 9, 10562-10566(2019)).
실시예 2: 리그닌의 전자 및 광물리적 특성 분석
실시예 2-1: 자외선 광전자 분광 분석
자외선 광전자 스펙트럼은 광자 에너지가 21.2eV(He I 방사선)인 Sigma Probe(Thermo VG Scientific, United Kingdom)를 사용하여 기록되었다. 광전자 분광 분석을 위한 샘플을 만들기 위해, 불소가 도핑된 산화주석(FTO)에 리그닌 용액(80mg mL-1)을 4번 떨어뜨리고 상온/상압 조건에서 건조했다. 하기 수학식 1을 사용하여 eV(진공 대비) 단위로 일 함수(W)를 추정했다.
[수학식 1]
여기서 hν는 입사광(21.2 eV)의 에너지, Ecutoff,high는 높은 결합 에너지 컷오프, EF는 페르미 준위이며 제로 결합 에너지로 설정된다. Au 금속의 EF를 측정하여 페르미 에지 보정(Fermi edge calibration)을 수행했다. HOMO 수준은 하기 수학식 2에 따라 계산되었다.
[수학식 2]
여기서 Ecutoff,low는 낮은 결합 에너지 컷오프이다. eV에서 VRHE로의 단위 변환(진공 대비)은 하기 수학식 3에 따른다.
[수학식 3]
여기서 EeV는 eV 단위의 에너지(vs. 진공), ERHE는 VRHE 단위의 전위, e는 기본 전하이다.
실시예 2-2: 시간 분해 분광법
상관 단일 광자 계수가 있는 Fluorolog3(HORIBA Scientific, Japan)를 사용하여 시분해 형광 감소 그래프를 얻었다. 검출기는 단일 광자를 셀 수 있는 광전자증폭관이었고, 광원은 펄스 레이저 다이오드(파장: 467 ± 10nm)였다. HORIBA Scientific 감소 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 수명을 추정했다. 소프트웨어는 다중 지수 함수에 붕괴 프로파일을 대입시켰다(수학식 4).
[수학식 4]
여기서 αi는 i번째 감쇠의 진폭, n은 총 감쇠 횟수, τi는 i번째 감쇠의 감쇠 시간을 나타낸다.
실시예 2-3: 광유도 전자 전달의 깁스 에너지 추정
광유도전자전달의 깁스 에너지(ΔGPET)를 계산했을 때, 첫 번째 싱글렛 여기 상태의 여기 상태 에너지(E0,0)는 정규화된 흡수 스펙트럼과 형광 스펙트럼의 교차점에서 추정되었다. 하기 수학식 5를 이용하여 리그닌의 여기상태 산화전위를 계산하였다.
[수학식 5]
위 식에서 Eox(리그닌*+/리그닌*)와 Eox(리그닌*+/리그닌)는 각각 리그닌의 여기 상태 산화전위와 리그닌의 바닥 상태 산화전위를 나타낸다.
기저 상태 기판(sub)에 의한 광여기된 리그닌(lignin*)의 산화를 위한 ΔGPET의 공식은 하기 수학식 6으로 표현된다.
[수학식 6]
실시예 2-4: 전하 이동 저항 추정
임피던스 분석기(ZIVE SP1, WonATech Co., Korea)를 이용하여 가시광선 하에서 전기화학적 임피던스 분광분석을 수행하였다. 10mV의 교류 전위 진폭, 100kHz ~ 0.5Hz의 주파수 범위 및 -0.028VRHE의 인가 바이어스가 적용된 조건에서 분석을 수행하였다. Nyquist 플롯(Nyquist plot)을 맞추고 전하 이동 저항을 계산하기 위해 Zman 소프트웨어(WonATech Co., Korea)를 사용했다. 소프트웨어는 Nyquist 플롯에서 반원을 외삽(extrapolated)하고 전하 이동 저항을 나타내는 직경을 계산하는데 그 직경은 전하 전달의 저항을 의미한다. 리그닌의 Nyquist 플롯은 용액 저항, 전하 이동 저항 및 상수 위상 소자로 구성된 Randle 회로 모델에 대입했다.
실시예 2-5: Ellman 분석
리그닌 샘플에서 티올 작용기의 존재를 조사하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 Ellman 시약 [5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), DTNB]을 사용한 비색 분석법을 사용했다. 에틸렌다이아민테트라아세트산(1mM)을 함유한 인산나트륨(100 mM, pH 8.0)을 반응 완충액으로 하여 DTNB 용액(10mM)과 리그닌 용액(0.1mL-1)을 제조하였다. 리그닌 용액(50μL), DTNB 용액(10μL) 및 반응 완충액(500μL)을 혼합하고 상온에서 배양하였다. DTNB가 티올기와 반응하여 2-니트로-5-티오벤조산(2-nitro-5-thiobenzoic acid)을 생성하므로 V-650 UV-Vis 흡수 분광 광도계(JASCO Inc., Japan)를 사용하여 UV-Vis 스펙트럼을 얻었다.
실시예 2-6: 리그닌의 단위간 결합의 반정량적 평가
MestReNova 프로그램(버전: 14.0.1)을 사용하여 체적 적분을 수행하고 리그닌의 단위간 결합을 반정량적으로 평가했다. 결합량은 방향족 단위[즉, 시린길(S), 구아이아실(G) 및 p-하이드록시페닐(H) 단위] 100개당 수로 표시하였다. S 신호의 절반(예: S2/6), G 신호(예: G2) 및 H 신호의 절반(예: H2/6)의 합은 100 방향족 단위로 설정되었다.
실시예 2-7: 양자 수율 측정
하기 수학식 7에 따라 리그닌 광촉매에 의해 흡수된 광자의 수를 계산하기 위해 리그닌의 흡광도를 측정했다.
[수학식 7]
여기서 Iabs(λ)는 특정 파장(λ)에서 광촉매가 흡수하는 빛의 세기, I0는 빛의 초기 세기, A(λ)는 광촉매의 흡광도이다.
실시예 2-8: 리그닌 특성 분석
V-650 UV-Vis 흡수 분광 광도계(JASCO)를 사용하여 UV-Vis 스펙트럼을 기록했다. 리그닌의 HOMO-LUMO 갭을 추정하기 위해 흡수 스펙트럼을 사용하여 Tauc 플롯(Zeng, Z. et al., Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20101-20109 (2017))을 얻었다. Tauc 플롯은 (αhν)2 대(versus) hν로 표시된다. 여기서 α는 흡수 계수, h는 플랑크 상수, ν는 광자 주파수이다. UV 광전자 스펙트럼은 리그닌의 HOMO 수준을 추정하기 위해 21.2eV (He-I방사선)의 광자 에너지로 Sigma Probe 분광계(Thermo VG Scientific)를 사용하여 측정하였다. RF-5301PC α 분광 형광 광도계(Shimadzu)를 사용하여 광발광 α 스펙트럼을 얻었다. 시간 분해 형광 붕괴 프로파일(Time-resolved fluorescence decay profiles)은 리그닌 형광 수명을 결정하기 위해 시간 상관 단일 광자 계수와 함께 Fluorolog3 분광형광계(HORIBA)를 사용하여 획득되었다. 푸리에 변환 적외선 스펙트럼(Fourier-transform infrared spectra)은 FT-IR 200 분광 광도계(JASCO)를 사용하여 얻었다. 3전극 구성을 이용하여 리그닌 광촉매의 광전기화학적 분석을 수행하기 위해 potentiostat/galvanostat(WMPG 1000, WonATech)를 사용했다(불소 도핑된 산화주석 유리 작업 전극(기하학적 표면적 = 2.52cm2), Ag/AgCl 기준 전극(3M NaCl) 및 스테인리스강 카운터 전극). 적외선 정수 필터와 400nm 컷-온 광학 필터가 장착된 크세논 램프(xenon lamp)(Newport)를 태양광 시뮬레이션 광원으로 사용했다. 전해액은 ~1 mg ml-1 리그노설포네이트 또는 크래프트 리그닌을 함유하는 KPi 완충액(100 mM, pH 7.0)으로 구성되었다. '리그닌 전하 이동 저항'은 임피던스 분석기(ZIVE SP1, WonATech)를 사용하여 전기화학적 임피던스 가시광선 분광 분석(electrochemical impedance spectroscopic analysis)에 의해 계산되었다.
실시예 2-9: 리그닌 특성 분석 결과
리그노설포네이트(lignosulfonate, LS)와 크래프트 리그닌(kraft lignin, KL)은 연간 생산량이 각각 132만 톤과 26만 미터톤으로 가장 많이 상용화된 두 가지 리그닌 공급원이기 때문에 모델 리그닌으로 선택했다(Dessbesell, L., et al., Renew. Sustain. Energy Rev. 123, 109768 (2020)). 이러한 리그닌 거대분자는 각각 아황산염 및 크래프트 펄프화 공정(sulfite and kraft pulping processes)에 의해 목질계 바이오매스로부터 분리된다(Wang, D., et al., ChemSusChem 13, 2807-2827 (2020)). 다른 화학적 처리는 천연 리그닌에 상당한 구조적 변화를 일으키고 LS와 KL에 다소 다른 화학적 및 산화환원 특성을 부여한다(Wang, M. & Wang, F. Adv. Mater. 31, 1901866 (2019)). 발명자들은 1H-13C 이핵 단일 양자 간섭(heteronuclear single quantum coherence, HSQC) 분광법을 사용하여 구조적 특성을 규명했다(도 2). 도 2a 및 도 2e에서 볼 수 있듯이 LS는 S 및 G 방향족 단위에 인접한 천연 β-아릴 에테르(β-O-4) 결합 및 아황산염 유래 설포네이트 작용기를 보유하는 반면, KL은 천연 구조 단위(예: β-O-4, 페닐쿠마란(β-5), 레지놀(β-β), 디히드로신나밀 알코올 및 세코이소라리시레시놀) 및 크래프트 유래 부분(예를 들어, β-5 스틸벤, 에놀 에테르, 구아이아실 히드록시에틸 케톤 및 설프히드릴기(도 2b, 도 2e, 도 6 및 도 7)을 포함한다(Sαez-Jimιnez, V. et al., Biotechnol. Biofuels 9, 198 (2016); Lancefeld, C. S. et al., Chem. Sci. 9, 6348-6360 (2018); Crestini, C., et al., Green Chem. 19, 4104-4121 (2017)). LS 및 KL의 황 원소 분석은 LS 및 KL에 황 작용기(예: SO3 - 및 SH)의 존재를 추가로 뒷받침한다(표 1).
LS 및 KL는 각각 상이한 작용기를 가지는 것 이외에, 지방족 히드록시, 페놀성 히드록시, C5-축합 히드록시 및 카르복시기(도 8)를 포함한 공통 치환기를 공유하며, 이는 31P 핵 자기 공명(NMR) 분광법으로 확인하였다(Constant, S. et al., Green Chem. 18, 2651-2665 (2016)). 표 2 및 3에서 빠른 정량적 HSQC 측정과 정량적 NMR 분석을 통해 추정한 C9 단위당 단위 간 결합 모티프의 양, 작용기의 양, 및 LS와 KL의 세 가지 기본 단위의 상대적 양을 열거한다.
도 3a에서 상기 다중 분석 결과를 기반으로 LS 및 KL의 구성 구조를 예상하여 표시하였다. 리그닌의 광촉매 활성의 기원을 더 잘 이해하기 위해 자외선 가시광선(UV-Vis) 분광법을 사용하여 리그닌의 광 흡수를 조사했다. KL은 LS에 비해 UV에서 가시광선 영역까지 더 강한 광흡수를 나타냈다(도 9a). LS 및 KL의 가장 높은 점유 분자 궤도(HOMO)와 가장 낮은 비점유 분자 궤도(LUMO) 사이의 에너지 갭은 Tauc 플롯을 기반으로 각각 약 2.74 및 2.93 eV로 추정되었다(도 9 b, c). 다음으로 UV 광전자 분광법을 사용하여 리그닌의 HOMO 수준을 추정했다. LS 및 KL의 HOMO 수준은 각각 2.44V 및 2.69V(가역적 수소 전극(RHE) 기준)으로 확인되었다(도 10). 따라서 LS 및 KL의 LUMO 에너지는 HOMO-LUMO 갭을 기반으로 각각 -0.30 및 -0.24V(RHE 기준)로 계산되었다(도 3a).
열역학적 지수로서의 분자 궤도 수준 외에, 광유도 전자 전달의 깁스 에너지(ΔGPET)는 여기된 광촉매와 그 기질 사이의 반응의 가능성을 평가하는 데 유용하다(Romero, N. A. & Nicewicz, D. A. Chem. Rev.116, 10075-10166 (2016)). 따라서 바닥 상태 산화 환원 전위, 첫 번째 단일항 여기 상태(first singlet excited state)(E0,0)의 여기 상태 에너지 및 LS 및 KL의 여기 상태 산화 환원 전위(excited-state redox potentials)를 추정했다. LS 및 KL의 기저 상태 산화 전위는 각각 2.29 및 2.40V(RHE 대비)로 결정되었고(도 11, 표 4) E0,0 값은 정규화된 흡수 스펙트럼과 광발광(PL) 스펙트럼(도 12) 사이의 교차점에서 각각 3.85 및 3.59eV로 추정되었다. 따라서 LS 및 KL의 여기 상태 산화 전위는 기저 상태 산화 전위와 E0,0 값을 기반으로 각각 -1.56 및 -1.19V(RHE 대비)로 추정되었다(표 4).
전하 캐리어가 인접한 기질로 전달되어야 하기 때문에, 광여기된 전하 캐리어의 분리/재결합 및 이동은 광산화환원 반응의 핵심 요소이다. 전하 분리 특성에 대한 대략적인 평가를 위해, 리그닌에 대한 정상 상태 및 시간 분해 PL 분광법을 수행했다(Jiang, Z. et al., Energ. Environ. Sci. 11, 2382-2389 (2018)). 도 13에서 볼 수 있듯이 KL의 발광 강도는 LS보다 훨씬 낮다. 또한, LS와 KL의 시간 분해 형광 감쇠 프로파일(도 14)은 KL(13.56ns)의 평균 형광 수명이 LS(2.74ns)보다 길다는 것을 보여준다. 이 두 결과는 KL이 LS보다 느린 전하 재결합을 겪는다는 것을 시사한다. 또한, 본 발명자들은 KL이 LS보다 더 나은 전하 이동 능력을 나타낸다는 것을 발견했다. ?h트-라이트 크로노암페로메트리 분석(chopped-light chronoamperometric analysis)(도 3b)에 따르면, KL의 광전류는 가시광선(λ > 400nm)에서 LS의 광전류보다 약 4배 더 높았다. 이러한 감광은 가시 범위에서 HOMO-LUMO 갭의 결과이다(도 3a 및 도 9b, c). 리그닌의 전하 수송 특성의 차이는 전기화학적 임피던스 분광법에 의해 추가로 뒷받침된다. LS 및 KL의 전하 이동 저항은 Randles 회로 모델에 장착된 Nyquist 플롯에서 각각 25.4 및 12.0kΩ으로 결정되었다(도 3c).
실시예 3: O
2
에서 H
2
O
2
로의 리그닌-민감성 환원반응
실시예 3-1: 2차원 NMR 분광법
iProbe HR 액체 프로브가 장착된 500MHz AVANCE NEO NMR 분광계(Bruker) 또는 5mm 다핵 광대역 관찰(BBO) NMR 프로브가 장착된 400MHz 푸리에 변환 NMR(FT-NMR) AVANCE III HD 분광계(Bruker)를 사용하여 리그닌의 1H-13C HSQC 스펙트럼을 기록했다. NMR 튜브의 [D6]디메틸설폭사이드([D6]DMSO; 0.6ml)에 리그노설포네이트 또는 크래프트 리그닌(~50mg)을 용해하고, HSQC 펄스 시퀀스로 hsqcedetgpsisp 2.3을 선택하였으며, HSQC 파라미터를 설정하고 문헌에 따라 HSQC 피크를 지정했다(Wang, D. et al., Green Chem. 22, 5151-5160 (2020)). 중심 DMSO 용매 피크(δH = 2.49ppm, δC = 39.52ppm)는 상관 피크의 보정에 사용되었다.
실시예 3-2: 1차원 NMR 분광법
5mm 다핵 광대역 불소 관찰(multinuclear broadband fluorine observe, BBFO) 프로브가 장착된 400MHz AVANCE III HD 나노베이 분광계(Bruker)에서 리그닌의 1H NMR 스펙트럼을 기록했다. 3-(trimethylsilyl)-1-propanesulfonic acid를 함유한 KPi D2O 완충액(100mM, pH 7.0, 1ml)에 리그노설포네이트 또는 크래프트 리그닌(2mg)을 용해했다. 상기 리그닌 용액을 스크류 캡 NMR 튜브로 옮기고 12시간 동안 O2로 퍼징하였다. NMR 펄스 시퀀스로 zg30를 사용했고, 6초와 256스캔의 재활용 지연을 사용했다. 500MHz AVANCE NEO NMR 분광계(Bruker) 또는 400MHz FT-NMR AVANCE III HD 분광계(Bruker)를 사용하여 31P NMR 스펙트럼을 기록했다. 리그닌 샘플을 무수 피리딘(anhydrous pyridine)과 중수소화 클로로포름(1.6:1, v/v) 및 활성 분자체(3 )로 구성된 건조 용매 혼합물에 용해시켜 혼합물의 수분 함량을 최소화했다. 다음으로, 사이클로헥산올 용액(8㎕ ml-1, 내부 표준물질) 및 크롬(III) 아세틸아세토네이트 용액(10mg ml-1, 인-핵(phosphorus nuclei)의 스핀-격자 이완 시간을 단축시키는 이완제)을 건조된 용매 혼합물을 사용하여 제조하였다. 마지막으로, 2-클로로-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사포스폴란(2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, TMDP; 100㎕)을 혼합물에 첨가하여 리그닌의 α히드록시기에 포스피틸화를 유도하였다. 혼합물을 몇 초 동안 흔든 후 NMR 튜브로 옮기고 즉시 분석하였다. 1초의 획득 시간, 10초의 이완 지연, ~128개의 스캔 수, 140ppm의 스펙트럼 중심 및 100ppm의 스펙트럼 폭을 갖는 역 게이트 분리 펄스 프로그램(inverse-gated decoupling pulse program)(zgig)을 사용했다. 잔류 H2O와 TMDP 사이의 반응으로부터 생성물에서 발생하는 날카로운 신호(sharp signal)를 132.2ppm으로 지정하여 31P 화학적 이동을 보정했다.
실시예 3-3: H
2
O
2
정량화
리그닌의 불용성 잔류물 여과 등 보충적 처리없이 리그닌 모델을 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 용해시켰다. 적외선 정수 필터 및 400nm 롱패스 필터가 장착된 크세논 아크 램프를 사용하여 298.2K에서 샘플을 조사했다. 리그닌 광촉매에 의해 형성된 H2O2의 양은 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 분석을 사용하여 분광광도계로 측정되었다. 반응 샘플을 비색 시약 용액(KPi 용액(100mM, pH 5.0) 중 2.5 U horseradish peroxidase 및 2mM ABTS)과 혼합하였다. 혼합물의 흡광도는 V-650 UV-Visd 흡수 분광 광도계(JASCO)를 사용하여 420nm에서 모니터링되었다. 리그닌 광촉매의 작용 스펙트럼을 얻기 위해 입사광을 74004 Cornerstone 130 1/8m 모노크로메이터(Newport)를 사용하여 단색화했다.
실시예 3-4: NBT 및 TA 분석
NBT 및 TA 분석을 사용하여 각각 O2 * 및 HO*를 검출했다(Yoon, J. et al., ACS Catal. 10, 5236-5242 (2020)). 리그닌 함유 용액에 10μM NBT 또는 300μM TA를 추가했다. 용액에 400nm 차단 필터(Newport)가 장착된 크세논 아크 램프의 태양광 시뮬레이션 가시광선을 조사했다. 리그닌 구동 광촉매 후 NBT 포르마잔 및 2-히드록시테레프탈산(HTA)을 각각 검출하기 위해 560nm에서의 흡광도 및 430nm에서의 형광 강도의 변화를 모니터링했다(λex = 315nm).
실시예 3-5: 리그닌-민감성 환원반응 분석 결과
O2/H2O2(수학식 8)반응의 환원 전위(Ered)는 리그닌의 LUMO 수준(도 3a)과 비교하여 양의 값을 가진다. 또한 음수인 ΔGPET는 위 환원반응이 엑서고닉(exergonic) 전자전달반응인 것을 의미한다(표 4). 이러한 리그닌의 전자적, 광물리적 특성을 바탕으로, 리그닌의 광촉매로써 O2를 H2O2로 환원시키는 능력을 조사했다.
[수학식 8]
O2 + 2(H+ + e) →- H2O2, Ered = 0.68V vs RHE
열역학적 조건 외에, 전자 수용체(예: O2)와 공여체(예: 리그닌) 간의 상호 작용은 산화 환원 촉매 작용에서 중요한 역할을 한다. UV-Vis 분광법을 사용하여 O2와 리그닌 사이의 가역적 상호 작용을 확인했다(도 15). 상호작용의 원인을 밝히기 위해 1H NMR 분광법으로 LS와 KL을 분석했다. O2로 퍼징할 때 6.7~7.4ppm 사이에서만 LS 및 KL 신호의 상자성 쉬프트(paramagnetic shift)라는 특징적인 현상이 관찰되었으며(도 16), 이는 리그닌의 방향족 수소 원자에 기인한 것일 수 있다(Kitahara, R., et al., Sci. Rep. 6, 20534 (2016)). 종합하면, UV-Vis 및 1H NMR 데이터는 O2와 리그닌 상호작용의 가역성을 뒷받침한다. 또한 O2 분자가 페녹시 기능화된 분자를 관련된 퀴논 기반 분자로 산화시키지 않는다는 것이 추가로 관찰되었다(도 17).
리그닌과 O2 사이의 선호되는(favourable) 비공유 상호작용을 입증한 후, O2가 풍부한 인산칼륨 완충액(KPi, 100mM, pH 7.0)에 있는 각 리그닌(1mg ml-1)을 태양광 시뮬레이터의 가시광선(λ > 400nm)에 노출시켰다. 광활성화된 LS 및 KL은 각각 한 시간 및 촉매 1g 당, 80 ± 20 및 160 ± 30mM의 비율로 H2O2를 점진적으로 축적했다(80 ± 20 및 160 ± 30mM gcat-1h-1)(도 4a). KL의 더 빠른 H2O2 생산은 더 높은 광 흡수, 전하 분리 및 전하 이동 능력에 기인한 것이다(도 9a, 13 및 14, 도 8b, c). 리그닌이나 빛이 없는 대조군 실험에서는 아주 적은 H2O2 생성만이 관찰되었다(도 4a 및 도 18). 또한, LS 및 KL의 작용 스펙트럼은 흡수 스펙트럼과 유사한 것으로 나타났는데(도 19), 이는 LS 및 KL의 광 활성화가 H2O 형성의 핵심 단계임을 의미한다. 추가로, 여러 분광 도구를 통해 실험한 결과 LS와 KL이 가시광선에서 높은 안정성을 가지는 것을 확인했다(도 20). 별개로, LS는 어두운 조건에서 H2O2 분해에 대한 촉매 활성을 보인 반면 KL은 아주 적은 활성을 나타냈다(도 21). 위 사실은 현재 시스템에 적합하지 않은 것처럼 보일 수 있지만 강력한 UPO 촉매에 필요한 in situ H2O2 농도를 낮게 유지한다.
O2의 H2O2로의 환원은 (1) 2단계 단일 전자 환원 경로(O2 → O2 * → H2O2)) 또는 (2) 1단계 2전자 환원(즉, O2 → H2O2) 경로로 진행될 수 있다(Hou, H., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 59, 17356-17376 (2020)). 리그닌-민감성 H2O2 생성 경로를 설명하기 위해 NBT(nitro blue tetrazolium) 분석법에 의해 슈퍼옥사이드 이온(O2 *)의 형성을 분석했다(도 22a). LS 및 KL 광촉매는 O2가 풍부한 환경에서 가시광선 조사 시 O2 *를 생성한 반면, N2가 풍부한 환경 또는 어두운 조건에서는 아주 적은 라디칼 이온만 감지되었다(도 22b). O2로 퍼지된 리그닌 용액에 1,4-benzoquinone(O2 * 스캐빈저)(Yoon, J. et al., ACS Catal. 10, 5236-5242 (2020))을 첨가하면 LS 및 KL 광촉매에 의한 H2O2 형성 속도가 감소했으며(도 4b, 왼쪽), 이는 O2에서 H2O2로의 반응이 2단계 환원반응임을 뒷받침한다.
실시예 4: H
2
O
2
및 O
2
로의 H
2
O 광촉매 산화
실시예 4-1: O
2
정량화
리그닌 광촉매에 의해 생성되는 O2의 양을 추정하기 위해 1mg mL-1 리그닌을 N2 퍼징된 KPi 완충액(100 mM, pH 7.0, 30 mL)에 용해시켰다. 과도한 내부 압력으로 인해 챔버가 파열되는 것을 방지하기 위해, 반응 용액을 밀폐된 챔버에 넣고 밀봉했기 때문에 광촉매 반응 중에는 N2 가스(순도: 99.999%)를 퍼지하지 않았다. 298.2K에서 상기 용액을 크세논 아크 램프(Newport Co., USA)의 가시광선(λ > 400nm)에 노출시켰다. Molsieve 5A 컬럼과 마이크로 열전도도 검출기가 장착된 마이크로 가스 크로마토그래프(Micro GC fusion, INFICON Inc., USA)를 사용하여 O2 분자를 정량하였다.
실시예 4-2: H
2
O
2
및 O
2
로의 H
2
O 광촉매 산화반응 분석 결과
H2O 용매의 H2O2로의 산화로 인하여, H2O2 형성의 불완전한 억제(incomplete depression)(도 4b, 왼쪽)가 발생할 수 있다. 따라서 H2O2의 리그닌 촉매 생산에서 인공 전자 공여체가 없다는 것을 주의하며 광활성 리그닌의 H2O를 산화 능력을 평가하였다. 리그닌의 광여기(photoexcitation)에 의해 유도된 H2O의 H2O2로의 산화(수학식 9)는 LS와 KL의 HOMO 수준이 H2O에서 H2O2로의 산화 전위(Eox)보다 더 양성이기 때문에 열역학적으로 유리하다(도 3a).
[수학식 9]
2H2O → H2O2 + 2(H+ + e), Eox = 1.76V vs RHE
O2 환원 반응에 의한 H2O2 생성을 배제하기 위해 광촉매 처리 전 및 광촉매 도중에 N2 가스로 리그닌 용액을 퍼지(purge)했다. 그 결과, H2O2 형성 속도는 LS 및 KL에 대해 각각 25 및 66mM gcat-1 h-1로 감소했다(도 4b, 오른쪽). 위 결과에서 나타난 형성속도는 O2가 풍부한 조건에서 1,4-benzoquinone(O2 *- scavenger)이 있을 때 관찰된 속도와 거의 동일하다(도 4b, 왼쪽). 이러한 결과는 O2에서 H2O2로의 1단계 환원이 거의 발생하지 않으며 물의 산화가 LS 및 KL에서 H2O2 생성을 위한 또 다른 광촉매 경로임을 의미한다. 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피(head-space gas chromatography)를 사용하여 리그닌 촉매에 의한 O2 형성(수학식 10 및 도 23)을 확인했다.
[수학식 10]
2H2O → O2 + 4(H+ + e), Eox = 1.23V vs RHE
O2 형성은 Eox(O2/H2O)가 LS 및 KL의 HOMO 수준보다 덜 양성이기 때문에 열역학적으로 유리하다. 종합하면, 리그닌 광촉매는 O2를 H2O2로 환원시키는 기능 및 H2O를 H2O2 및 O2로 산화시키는 기능을 모두 수행한다.
실시예 5: H
2
O
2
형성에 대한 리그닌 모델의 보편성 확인
실시예 5-1: 셀룰로오스 분해 효소 리그닌 및 리그닌 탈수소화 중합체의 제조
셀룰로오스 분해 효소 리그닌은 효소 가수분해 반응을 통해 합성되었다. 오일 팜의 빈 과일 다발(Empty fruit bunches,EFB)을 분쇄하고 체질하여 약 850μm 크기의 입자를 얻었다. 그 입자를 탈이온수에 담그고 463.1K에서 15분 동안 가열했다. 다음으로, 전처리된 EFB(건조 중량: 4g)를 아지드화나트륨(w/v: 0.02%) 및 셀룰라아제(글루칸 1g당 10~60 여과지 단위(filter paper unit))를 함유하는 시트르산나트륨 완충액(50mM, pH 4.8)에 첨가했다. 그 혼합물을 323.2K에서 200rpm의 속도로 진탕(shake)시켰다. 72시간 후, 0.2-μm 폴리에테르설폰으로 이루어진 막필터를 사용하여 불용성 고형물과 가수분해물의 액체를 분리하였다. 불용성 고체를 진공 조건에서 건조시켰다. 리그닌 탈수소화 중합체(DHP)는 과산화효소 매개 탈수소 중합 반응을 통해 합성되었으며, 이는 생체 내 자연적 목질화 과정에서 발생하는 말단 라디칼 축합 반응을 모방한다; H2O2에 의해 활성화된 퍼옥시다아제는 모노리그놀을 산화시켜 DHP로 중합시킨다(J. Ind. Eng. Chem. 26, 390-395 (2015)). 호스라디쉬의 페록시다아제(HRP, 25 UmL-1)를 인산칼륨 완충액(25mM, pH 3.0, 100mL)에 녹여 효소 함유 용액을 제조하였다. 또한, (i) 시나필알코올(0.56mmol)과 코니페릴알코올(2.24mmol)을 다이옥산(20 mL)에 용해하고 (ii) 과산화수소(2.8mmol)를 함유하는 인산칼륨 완충제(25mM, pH 3.0, 80 mL)를 첨가하여 모노머 함유 용액을 제조하였다. 효소 함유 용액과 단량체 함유 용액을 인산염 완충액(25mM, pH 3.0, 200mL)에 5시간 동안 적하하여 말단 중합을 유도하였다. 반응 후, 혼합물을 원심분리(13,200rpm, 15분)하여 침전물을 포집하였으며, 침전물을 탈이온수로 세척하고 308.2K의 진공 하에서 건조했다.
실시예 5-2: H
2
O
2
형성에 대한 리그닌 모델의 보편성 실험 결과
LS와 KL의 분자 구조는 여러 면에서 천연 리그닌의 분자 구조와 유사하지 않기 때문에 천연 리그닌 모델이 동일한 광촉매 반응(즉, H2O2 생성)을 수행할 수 있는지 여부를 조사했다. 셀룰로스 분해효소 리그닌(cellulolytic enzyme lignin, CEL)은 매우 대표적인 것으로 알려져 있는 천연 리그닌이다. 리그노셀룰로스 바이오매스 공급원료(예: 빈 과일 섬유다발)의 셀룰라아제-유도 가수분해 반응(Kim, J. K., et al., Biotechnol. Biofuels 12, 138 (2019))에 의해 상기 CEL을 합성했다. 1H-13C HSQC 및 31P NMR 분광법은 CEL이 β-O-4, β-5 및 β-β 결합을 포함하는 3개의 C9 단위(즉, H, G 및 S)뿐만 아니라 카르복시기 또한 보유하고 있음을 보여준다(도 2c, e, 도 24 및 표 5 및 6).
CEL 함유 용액에 가시광선 조사 시 O2가 풍부한/고갈된 조건에서 H2O2의 형성을 촉발했지만(도 4c), 어둠 속에서는 반응이 진행되지 않았다.
다음으로 H2O2 생산에서 리그닌의 구조적 역할을 확인하였다. 퍼옥시다제 매개 탈수소화 반응에 의해, 인공 리그닌 모델인 리그닌 탈수소화 중합체(DHP)(Hwang, H., et al., J. Ind. Eng. Chem. 26, 390-395 (2015))를 합성했다. 우선적(preferential)이고, 최종적인(end-wise) 중합을 위해 퍼옥시다아제(peroxidase) 함유 용액에 모노리그놀(monolignol)을 점진적으로 추가하여 기존 합성 문제(예: β-O-4 연결의 수가 매우 적음)를 해결했다. 1H-13C HSQC 및 31P NMR 분광법을 통해 DHP가 β-O-4, β-5 및 β-β 결합(37:15:13의 비율); S 및 G 단위; 및 신나밀 알코올과 C5-축합 히드록시 및 카르복시기(Kim, H. et al., Org. Biomol. Chem. 8, 576-591 (2010))를 포함하는 것을 확인했다(도 2d, e, 도 24, 표 5 및 6). 합성된 DHP는 LS, KL 및 CEL에서 관찰된 것과 동일한 광화학적 거동을 나타냈다. 따라서, 빛은 반응에 필수적이며, O2로 퍼징하면 H2O2 생성이 촉진된다(도 4c)는 것을 알 수 있다.
O2를 H2O2로 광화학적으로 환원시키는 다중 리그닌 모델(예: LS, KL, CEL 및 DHP)의 공통된 능력과, 상기 모델들이 리그닌에서 가장 지배적인 결합인 β-O-4 결합을 공유한다는 사실에 비추어 β-O-4 결합이 광산화환원 반응에 기여하는 것으로 예상된다. 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르를 페놀성 β-O-4형 리그닌 이량체 모델(도 25)로써 준비하고 이량체가 어두운 조건이 아닌, 밝은 조건에서만 H2O2를 생성함을 확인했다(도 4c). 그러나 리그닌 합성의 주요한 모노리그놀로써, β-O-4 결합이 없는 코니페릴알코올(4-히드록시-3-메톡시신나밀알코올)과 시나필알코올(4-히드록시-3,5-디메톡시신나밀알코올)은 광화학 반응을 수행하지 않았다(도 4c). 벤질 알코올(즉, Cα-OH)이 카르보닐 그룹(즉, Cα= O)으로 산화된다는 사실에 비추어 상기 β-O-4의 Cα-OH 부분이 O2 환원에 관여할 수 있다고 생각된다. 이량체 모델에서는 가시광선 조사 시에만 C=O 결합의 형성이 관찰되었다(도 26).
실시예 6: 거울상선택적 광효소 옥시기능화
실시예 6-1: 적철광(hematite) 나노구조체의 합성 및 특성화
용액 기반 처리과정 및 고온 어닐링을 거쳐 적철광(hematite) 광양극을 합성했다. 아세톤, 이소프로필 알코올 및 탈이온수로 FTO 유리를 세척했다. 상기 유리를 전구체 용액(150mM FeCl3·6H2O 및 1M NaNO3)에 담그고 Lindberg/Blue M muffle furnace(Fisher Scientific Co., USA)에서 100ºC에서 6시간 동안 가열했다. 그 후, 전극을 800°C에서 20분 동안 어닐링했다. 적철광 물질의 형태는 S-4800 전계방출현미경(Hitachi High-technologies Co., Japan)을 사용하여 조사하였다. 적철광 필름의 결정도는 Ultima IV X-ray diffractometer(Rigaku Co., Japan)를 사용하여 조사하였다. 적철광 표면의 원소 식별은 ESCALAB 250Xi X선 광전자 분광기(Thermo Scientific., USA)를 사용하여 수행하였다. 적철광 물질의 광 흡수 능력은 SolidSpec-3700 UV-VIS-NIR 분광 광도계(Shimadzu Corp., Japan)를 사용하여 조사되었다.
실시예 6-2: 적철광(hematite) 나노구조체의 합성 및 특성화
O2와 페녹시기 사이의 반응을 조사할 때 페녹시(phenoxy)기를 가진 분자(1mM)를 KPi 버퍼(100mM, pH 7.0)에 용해하고 O2 가스로 용액을 퍼지했다. NMR 샘플 준비를 위해 반응 용액을 DSS가 포함된 D2O(v/v, 9:1)와 혼합했다. DSS는 화학적 이동의 보정 및 phenoxyfunctionalized 분자의 정량화에 사용되었다. NMR 펄스 시퀀스는 zgesfpgp, 재순환 지연은 1초, 스캔 수는 128이었다. 샘플 중 분석물의 몰 농도는 하기 수학식 11에 따라 계산되었다.
[수학식 11]
여기서 Ianalyte는 분석물 피크의 적분, Istandard는 표준 피크의 적분, Nanalyte는 분석물 피크에 해당하는 proton 수, Nstandard는 표준 피크에 해당하는 proton 수, Cstandard는 표준물질의 농도를 각각 나타낸 것이다.
실시예 6-3: 광생체촉매 반응 및 분석
Eppendorf tube(SPL Life Sciences)의 KPi 용액(100mM, pH 7.0)에 리그닌, rAaeUPO 및 기질을 용해하여 반응 샘플을 준비했다. 반응 온도를 298.2K로 유지하기 위해 튜브를 수조에 담그고 크세논 아크 램프(λ > 400nm)로 조사하여 생체 촉매적 산소 기능화 반응을 촉진했다. 광효소 반응 후, 에틸 아세테이트를 사용하여 옥시기능화된 생성물을 추출하고, MgSO4로 건조시키고, 화염 이온화 검출기와 CPChirasil-Dex CB 컬럼(25m × 0.32mm × 0.25μm)이 장착된 7890A 가스 크로마토그래프(Agilent)를 사용하여 정량화했다. 자세한 오븐 온도 프로그램은 표 7에 정리되어 있다.
효소 생성물을 식별하기 위해 에틸 아세테이트를 사용하여 생성물을 추출한 후 ISQ QD300 가스 크로마토그래피-질량 분석기(ThermoScientific)를 사용하여 분석하였다. 턴오버 빈도(TOF)와 TTN은 하기 수학식 12 내지 14을 사용하여 계산되었다.
[수학식 12]
[수학식 13]
[수학식 14]
실시예 6-4: 리그닌 물질의 항산화 특성 분석
광전기화학 반응은 3전극 구성의 반응기에서 수행되었다(α-Fe2O3(기하학적 표면적 = 2.5cm2) 작업전극, Ag/AgCl(3M NaCl) 기준전극 및 스테인리스강 상대 전극). 상기 3개의 전극은 리그닌 에너지 물질(예: 크래프트 리그닌 및 리그노설포네이트)을 가지는 경우 및 가지지 않는 경우 모두 실험하였고, 0.3mM TA를 함유하는 O2-퍼징된 KPi 완충액(100mM, pH 7.0)에 담궈졌다. 0V 대(versus) Ag/AgCl(0.622 V 대(versus) RHE)에서 태양광 시뮬레이션 가시광선(λ > 400nm, 광자 플럭스 = 1.74μE cm2 s1)하에서 제어된 전위 광전기촉매(controlled potential photoelectrocatalysis)를 수행하여 수산화 라디칼을 생성했다. 리그닌 역시 가시광선 조사 하에 실험하였다. 촉매 반응 후 HTA를 정량하기 위해 430nm(λex = 315nm)에서 전해액의 형광 강도를 측정하였다.
실시예 6-5: 옥시화 반응 실험 결과
리그닌 광촉매에 의한 in situ H2O2 생성을 입증한 후, 리그닌 구동 광촉매와 퍼옥시게나아제 매개 생체 촉매를 원 포트 공정으로 결합하여 광생체촉매 옥시기능화 반응에 대한 잠재력을 조사했다. 다양한 반응을 수행할 수 있으면서도 불활성 C-H 결합에 대한 높은 활성을 가지는, Pichia pastoris에서 재조합적으로 발현된 Agrocybe aegerita에서 UPO(rAaeUPO)를 선택했다(Choi, D. S. et al., ACS Catal. 7, 1563-1567 (2017)). 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS) 및 GC에 의해 각 생성물을 확인 및 정량화했다(도 28a 및 29a). 도 27에서 볼 수 있듯이, LS-rAaeUPO 및 KL-rAaeUPO 시스템은 가시광선(λ > 400nm)에서 에틸벤젠을 거울상 선택적으로(>99% e.e.) (R)-1-페닐에탄올로 전환했다. CEL, DHP 및 구아이아실글리세롤-β-구아이아실에테르도 빛 조건에서 rAaeUPO에 의한 거울상 순수 (R)-1-페닐에탄올 생산을 유도했다(도 30). 그러나 coniferyl 알코올과 sinapyl 알코올은 효소 반응을 일으키지 않았는데(도 30), 이는 H2O2의 광화학적 생성이 아주 적었기 때문이다(도 4c). 본 발명의 광효소 반응은 종래 보고된 광효소 반응과 비교해서 전체 반응의 입체 및 화학 선택성이 매우 높다. 종래 연구에서는 비효소적 방법을 통하여 기질을 라세미 생성물로 변환하였는데, 일반적인 비효소적 방식으로는 입체선택성이 아주 적었다. 또한, 기존에 보고된 효소적 방법으로 한 종류의 거울상 이성질체 생산물을 만든 경우에는 그 생산물이 한번 더 산화반응을 거쳤기 때문에 높은 농도의 생성물을 얻기에 한계가 있었다. 리그닌, 빛 또는 기질이 생략된 조건(도 4a 및 도 18)에서는 H2O2의 형성이 너무 적어서 1-페닐에탄올의 합성으로 이어지지 않았다(도 27). 반면에 광생체촉매 반응은 H2O가 H2O2로 in situ 산화되기 때문에 O2가 고갈된 조건(도 27)에서도 이루어졌다(도 4b). 산소 동위 원소 분석을 통해 N2가 풍부한 H2 18O 용매에서 18O로 표지된 (R)-1-페닐에탄올의 형성을 확인했다(도 31). 또한, 광효소 반응의 동역학에 대한 리그닌 농도와 광자 플럭스의 영향을 확인했다(도 32).
UV-Vis 분광법으로 리그닌 광촉매와 rAaeUPO 효소 간의 상호 작용을 확인했다. 도 33에서 볼 수 있듯이 250에서 450nm 사이의 rAaeUPO의 흡광도는 LS와 KL의 농도가 증가함에 따라 점차 감소했으며, 이는 리그닌이 rAaeUPO의 방향족 작용기(~280nm)및 헴 보철기(~418nm)의 전자 상태가 변경되었음을 의미한다. 광효소 반응의 속도는 리그닌-민감성 H2O2 생성반응의 속도보다 빨랐다(도 27 및 도 4b). 이는 리그닌 광촉매에 인접한 H2O2의 농도가 광촉매로부터 떨어진 것보다 높기 때문에 상호작용이 UPO에 의한 H2O2 소비를 가속화하기 때문으로 생각된다.
다음으로, 8mg ml-1 리그닌 광촉매, 50 nM rAaeUPO 및 1.74μE cm-2 s-1 가시광선을 사용하여 에틸벤젠의 장기적(long-term) 광생체촉매 옥시기능화 반응을 수행했다. LS-rAaeUPO 및 KL-rAaeUPO 하이브리드는 각각 81,000 및 72,600의 rAaeUPO의 총 회전 수(TTNrAaeUPO)를 기록하여 최소 130시간 동안 거울상 순수 생성물을 생성했다(도 34). 또한, 리그닌-rAaeUPO 커플(couples)은 다른 거울상 선택적 옥시기능화 반응에 적용되었다(도 28, 29 및 표 8):
하기 표 9에 요약된 바와 같이, 광 구동 효소 시스템은 에틸 벤젠뿐만 아니라, 프로필벤젠, 테트랄린 및 사이클로헥산의 하이드록실화(2-4) 및 시스-β-메틸스티렌의 에폭시화(5) 역시 수행하는 것으로 확인되었다.
리그닌-rAaeUPO 하이브리드는 다른 H2O 산화 촉매-UPO 시스템보다 훨씬 강력하다. 보고된 다른 비생물적 촉매들은 상응하는 UPO를 산화적으로 비활성화시키는 하이드록실 라디칼을 생성하여 35시간 이내에 생체 촉매 반응을 중단된다. LS 및 KL을 함유하는 광생체촉매는 촉매활성을 장기적으로 유지하는 것에 착안하여, 테레프탈산(TA) 분석을 통해 상기 광생체촉매의 OH*의 형성여부를 조사했다(Simon, T. et al., Nat. Mater. 13, 1013-1018 (2014)). 광활성화된 LS 및 KL은 열역학적으로 아래의 두 가지 경로에 의한 HO* 형성을 선호하지만 가시광선 조사 시 아주 적은 라디칼만을 생성했다(도 35). 상기 두 가지 경로는 각각 H2O 산화(수학식 15) 및 H2O2 환원(수학식 16)에 의한 경로이다.
[수학식 15]
H2O → HO· + (H+ + e), Eox = 2.38V vs RHE
[수학식 16]
H2O2 + e → HO· + OH, Ered = 0.79V vs RHE
위 방법을 이용하여 리그닌 광촉매의 H2O 소거 활성을 조사하였다. HO· 라디칼을 생성하기 위해 나노 구조의 적철광 전극(α-Fe2O3, 도 36)을 합성했다. 도 37에서 볼 수 있듯이 α-Fe2O3 광양극은 가시광선에서 RHE(0V vs Ag/AgCl)기준으로 0.622V에서 O2 퍼지된 KPi 버퍼에서 HO·라디칼을 생성했다. 이에 반해, 버퍼에 리그닌 광촉매가 존재할 경우 라디칼이 검출되지 않았다. 따라서, 리그닌 물질이 항산화 특성을 가져 활성산소의 발생을 억제하는 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (17)
- β-O-4 결합을 함유하는 리그닌 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하고, 가시광선 존재 하에 O2의 환원 및 H2O의 산화에 의해 과산화수소 생성능을 가지는 광촉매.
- 제1항에 있어서, 상기 리그닌 또는 그 유도체는 크래프트 리그닌, 리그노설포네이트, 셀룰로오스 분해효소 리그닌, 리그닌 탈수소화 중합체, 염기성 리그닌, 올가노졸브 리그닌 및 구아이아실글리세롤-β-구아이아실 에테르로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 광촉매.
- 제1항에 있어서, 상기 리그닌 또는 그 유도체는 크래프트 리그닌 또는 리그노설포네이트인 것을 특징으로 하는 광촉매.
- 제1항에 있어서, 상기 리그닌 또는 그 유도체는 가시광선 조사시에 여기되고, 여기된 리그닌 또는 그 유도체(리그닌*)는 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하며, 상기 여기된 리그닌 또는 그 유도체는 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼(리그닌ㆍ+)로 산화되는 것을 특징으로 하는 광촉매.
- 제4항에 있어서, 상기 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼은 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고 리그닌 또는 그 유도체로 환원되는 것을 특징으로 하는 광촉매.
- 가시광선의 존재 하에, 제1항의 광촉매를 이용하여 O2를 환원시키는 단계 및 H2O를 산화시키는 단계를 포함하는 과산화수소의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 과산화수소의 제조방법:
(a) 제1항의 광촉매에 가시광선을 조사하여 리그닌 또는 그 유도체를 여기시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 여기된 리그닌 또는 그 유도체에 의해 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 여기된 리그닌 또는 그 유도체는 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼로 산화되는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 산화된 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼에 의해 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼은 리그닌 또는 그 유도체로 환원되는 단계.
- 제7항에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c) 단계는 순환적으로 반복되는 것을 특징으로 하는 과산화수소의 제조방법.
- 제1항의 광촉매; 및 비특이적 퍼옥시게나아제(UPO)를 유효성분으로 포함하는, C-H결합을 가지는 기질의 옥시화 반응을 위한 하이브리드 촉매.
- 제9항에 있어서, 상기 C-H결합을 가지는 기질은 에틸 벤젠, 프로필 벤젠, 테트랄린, 사이클로헥산 및 시스-β-메틸스티렌으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 촉매.
- 가시광선의 존재 하에, 제9항의 하이브리드 촉매를 이용하여 C-H결합을 가지는 기질을 옥시화 반응시키는 단계를 포함하는 유용물질의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 유용물질의 제조방법:
(a) 제1항의 광촉매에 가시광선을 조사하여 리그닌 또는 그 유도체를 여기시키는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 여기된 리그닌 또는 그 유도체에 의해 O2를 환원시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 여기된 리그닌 또는 그 유도체는 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼로 산화되는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 산화된 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼에 의해 H2O를 산화시켜 과산화수소를 생성하고, 상기 리그닌 라디칼 또는 그 유도체 라디칼은 리그닌 또는 그 유도체로 환원되는 단계; 및
(d) 비특이적 퍼옥시게나아제의 존재 하에, 상기 (b)단계 및 (c)단계에서 제조된 과산화수소와 C-H결합을 가지는 기질을 옥시화 반응시키는 단계.
- 제12항에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c) 단계는 순환적으로 반복되는 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 C-H결합을 가지는 기질은 다음 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 기질인 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법:
[화학식 1]
;
[화학식 2]
및 그 유도체;
[화학식 3]
;
상기 화학식 1 내지 3에서 R1 내지 R4은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐원자, 아미노, 아미드, 니트릴기, 니트로기, 니트로소기, 히드록시 또는 벤질; C1-30의 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬, 알킬아민, 알콕시, 알콕시알킬, 알킬에스터, 알킬에터, 알킬아미드, 할로알킬, 알킬카보닐 또는 알콕시카보닐; C3-30의 헤테로사이클릭아민, 사이클로알킬, 사이클로알킬카보닐, 또는 사이클로알콕시; C2-30의 알릴; 또는 C6-30의 아릴카보닐, 알킬아릴카보닐, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 아릴옥시, 헤테로아릴, 알콕시헤테로아릴 또는 알킬헤테로아릴이고;
또는 상기 R1과 R2는 서로 연결되어 치환 또는 비치환된 고리형 탄화수소 또는 방향족 탄화수소를 형성할 수 있음.
- 제14항에 있어서, 상기 R1 내지 R4은 각각 다음의 치환기 이거나,, , , 또는 ;
또는 R1과 R2는 또는 인 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 C-H결합을 가지는 기질은 하기 화학식 1-1 내지 1-4, 하기 화학식 2-1 및 2-2 및 하기 화학식 3-1로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법:
[화학식 1-1]
;
[화학식 1-2]
;
[화학식 1-3]
;
[화학식 1-4]
;
[화학식 2-1]
;
[화학식 2-2]
;
[화학식 3-1]
.
- 제11항에 있어서, 상기 유용물질은,
상기 기질이 화학식 1로 표시되는 화합물인 경우, 알코올, 알데하이드 또는 케톤이고;
상기 기질이 화학식 2로 표시되는 화합물인 경우, 페놀 또는 페놀 유도체이며;
상기 기질이 화학식 3으로 표시되는 화합물인 경우, 에폭사이드인 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법.
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2022
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