KR20230112858A - PRIMER SET FOR DETECTING Diaporthe eres OR Botryosphaeria dothidea, DIAGNOSTIC KIT, AND DETECTING METHOD USING THE SAME - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting kiwi soft rot bacteria, a detection kit including the same, and a detection method using the same.
키위의 Family는 Actinidiaceae이고 Genus는 Actinidia인 다년생 덩굴성 과수이다. 현재 우리나라에서 재배하고 있는 키위는 Chinese gooseberry를 20세기 초 뉴질랜드가 종자를 도입하여 개량해 보급된 것이다. 키위는 연평균 기온이 14℃ 이상 지역에서 재배가 가능하므로 전남(44%), 경남(26%), 제주(24%) 등 주로 남부지역에서 재배되고 있으며, 국내에서 키위의 소비 증가에 따라 면적도 증가하고 있는 추세이다. 하지만 키위를 수확한 후 유통하는 과정에서 몇 가지 문제들을 가지고 있다. 왜냐하면 키위는 0±1℃의 저온저장고에서 3~4개월 동안 저장한 후 후숙 기간을 거치면서 키위 무름병이 나타나기 때문에 품질의 경제적 가치가 떨어지며 특히 수출 키위는 클레임의 원인이 된다. 또한 국내에서는 키위 무름병을 일으키는 병원균에 대한 연구가 많이 이루어지지 않고 있으며 효과적인 검출 방법 역시 확립되지 않은 실정이다. 저온저장고에 키위를 보관할 때 병원균의 유무와 감염된 키위를 구별하기 어렵기 때문에 분자 생물학적인 진단을 통해서 병원균을 검출할 수 있는 방법의 개발이 절실히 필요하다. 또한 병원균이 침입하기 시작한 키위는 짧은 기간 동안 큰 감염력을 보이기 때문에 조기에 침입하는 병원균을 검출하여 저온저장고 내에서 병원균의 확산의 방지와 수확 후 무름병 발병률을 감소시킬 수 있는 방법의 개발이 매우 중요하다.The family of kiwi is Actinidiaceae and its genus is Actinidia, which is a perennial vine fruit tree. Kiwi, which is currently cultivated in Korea, is a Chinese gooseberry that was introduced and improved in the early 20th century by New Zealand. Since kiwi can be grown in areas with an annual average temperature of 14℃ or higher, it is mainly cultivated in southern regions such as Jeonnam (44%), Gyeongnam (26%), and Jeju (24%). It is a growing trend. However, there are some problems in the process of harvesting and distributing kiwifruit. Because kiwifruit is stored for 3 to 4 months in a low-temperature storage at 0 ± 1 ° C, kiwi soft rot appears during the post-ripening period, so the economic value of quality is reduced, and exported kiwifruit in particular causes claims. In addition, there are not many studies on pathogens that cause kiwi soft rot in Korea, and effective detection methods have not been established. When storing kiwifruit in a cold storage, it is difficult to distinguish between the presence of pathogens and infected kiwifruit, so it is urgently needed to develop a method for detecting pathogens through molecular biological diagnosis. In addition, since kiwifruit, which has begun to invade pathogens, shows great infectivity in a short period of time, it is very important to develop a method that can prevent the spread of pathogens in cold storage and reduce the incidence of soft rot after harvest by detecting pathogens that invade early. .
일반적인 키위 무름병의 진단 방법은 키위의 표면에 생긴 검은 점, 움푹 들어간 부위, 균사의 생장, 딱지의 형성을 통해 육안적으로 확인할 수 있다. 하지만 이러한 병징들은 보통 저장 후 유통과정을 거친 후에 소비자에게 판매될 때 발생하기 때문에 효과적인 방제가 이루어지기 어렵다. 따라서 키위 과실무름병균 검출을 위해 중합효소연쇄반응기술(PCR)이나 Loop Amplification Polymerase(LAMP) 등의 방법을 이용하여 무름병균의 특정 유전자를 증폭해서 감염 유무를 판단하는 방법으로 무름병을 진단하고 고가의 PCR 기계 등의 전문장비가 필요하고 많은 시간이 소요되거나 4개 이상의 특이적인 프라이머가 필요하다는 단점이 있다. 그러나 Recombinase Polymerase Amplification(RPA) 방법은 증폭하고자 하는 유전자를 기존의 PCR 방법보다 빠르고 정확하고 쉽게 증폭할 수 있으며 등온 조건에서 2개의 특이한 프라이머만 요구되는 분자생물학적인 진단 방법이라 할 수 있다. 따라서 본 연구는 키위 무름병균을 기존의 PCR 방법보다 빠르고 정확하며 쉽게 진단하기 위해 Recombinase Polymerase Amplification(RPA) 방법을 이용하여 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea를 조기에 검출할 수 있는 특이적인 RPA용 프라이머 세트를 개발하였다. 본 발명은 소량의 키위 과실무름병균이라도 1시간 내에 검출이 가능하므로 농업현장에서 병원균들을 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 수확 후 병원균에 감염되어 있지만 육안으로 확인이 어려운 키위들이 담겨 있는 상자들을 선발하여 그 상자들은 저장 기간을 최소화하여 유통하게 함으로써 저장기간 동안 지속적으로 다른 키위까지 감염을 시킴으로써 문제를 야기하는 키위 과실무름병의 확산을 예방할 수 있어 농업현장에서 경제적인 손실을 감소시킬 수 있는 방법으로 활용될 수 있을 것으로 전망된다.A common method for diagnosing soft rot in kiwi can be visually confirmed through black dots, dents, growth of mycelium, and formation of scabs on the surface of kiwi. However, since these symptoms usually occur when sold to consumers after storage and distribution, effective control is difficult. Therefore, to detect kiwi fruit soft rot, polymerase chain reaction technology (PCR) or Loop Amplification Polymerase (LAMP) is used to amplify specific genes of soft rot bacteria to determine the presence or absence of infection. There are disadvantages in that specialized equipment such as a PCR machine is required and a lot of time is required or four or more specific primers are required. However, the Recombinase Polymerase Amplification (RPA) method can amplify the gene to be amplified faster, more accurately, and easier than the conventional PCR method, and is a molecular biological diagnosis method that requires only two specific primers under isothermal conditions. Therefore, this study developed a specific primer set for RPA that can detect Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea at an early stage using the Recombinase Polymerase Amplification (RPA) method to diagnose Kiwi soft rot bacteria faster, more accurately, and easier than conventional PCR methods. did Since the present invention can detect even a small amount of kiwi fruit soft rot within 1 hour, pathogens can be quickly diagnosed at agricultural sites. Therefore, after harvesting, boxes containing kiwifruits that are infected with pathogens but difficult to visually check are selected, and the boxes are distributed with a minimum storage period, thereby infecting other kiwifruits continuously during the storage period, causing problems. It is expected that it can be used as a way to reduce economic losses in agricultural fields because it can prevent the spread of
본 발명은 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a primer set for detecting kiwi soft rot.
본 발명은 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 검출키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a detection kit including a primer set for detecting kiwi soft rot.
본 발명은 키위 무름병균 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for detecting kiwi soft rot bacteria.
1. 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 21 및 22 또는 서열번호 23 및 24의 프라이머를 포함하는 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트. 1. SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NOs: 15 and 16, A primer set for detecting kiwi soft rot, comprising primers of SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 21 and 22, or SEQ ID NOs: 23 and 24.
2. 위 1에 있어서, 서열번호 1 및 2의 프라이머를 포함하는 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트.2. The primer set for detecting kiwi soft rot bacteria according to 1 above, comprising the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2.
3. 위 1에 있어서, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 포함하는 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트.3. The primer set for detecting kiwi soft rot bacteria according to 1 above, comprising the primers of SEQ ID NOs: 13 and 14.
4. 위 1에 있어서, 상기 키위 무름병균은 Diaporthe eres 또는 Botryosphaeria dothidea인, 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트.4. The primer set for detecting kiwi soft rot bacteria according to 1 above, wherein the kiwi soft rot is Diaporthe eres or Botryosphaeria dothidea .
5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 키위 무름병균 검출키트.5. Kiwi soft rot detection kit comprising the primer set of any one of 1 to 4 above.
6. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 프라이머 세트로 키위 무름병균의 게놈 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는 키위 무름병균의 검출 방법.6. A method for detecting kiwi soft rot bacteria comprising the step of amplifying genomic DNA of kiwi soft rot bacteria with the primer set of any one of 1 to 4 above.
7. 위 6에 있어서, 상기 증폭은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 의한 것인, 키위 무름병균의 검출 방법.7. The method of detecting kiwi soft rot according to 6 above, wherein the amplification is by recombinase polymerase amplification (RPA).
8. 위 7에 있어서, 상기 증폭으로부터 수득한 산물을 아가로스 겔로 전기영동하여 분리하는 단계를 더 포함하는, 키위 무름병균의 검출 방법.8. The method for detecting kiwi soft rot according to 7 above, further comprising separating the product obtained from the amplification by electrophoresis on an agarose gel.
본 발명은 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 키위 무름병균을 보다 신속하고 간단하게 검출할 수 있으며, 특이적으로 키위 무름병균만을 검출할 수 있어 효과적으로 무름병균을 방제할 수 있다.The present invention relates to a primer set for detecting kiwi soft rot bacteria, a detection kit containing the same, and a detection method using the same, which can detect kiwi soft rot bacteria more quickly and simply, and can specifically detect only kiwi soft rot bacteria. It can effectively control soft rot fungi.
도 1은 인위적으로 접종된 (A,a) Diaporthe eres 와 (B,b) Botryosphaeria dothidea의 키위 병징이다.
도 2a는 In vitro에서 Diaporthe eres, Botryosphaeria dothidea의 활성 비교 실험이고, 도 2b는 In vivo에서 Diaporthe eres, Botryosphaeria dothidea의 활성 비교 실험이다.
도 3a는 Diaporthe eres의 접종 밀도와 배양 기간에 따른 병징을 확인한 것이고, 도 3b는 Botryosphaeria dothidea의 접종 밀도와 배양 기간에 따른 병징을 확인한 것이다.
도 4는 현미경으로 관찰한 키위 무름병균의 분생포자 (600 X)이다(A는 Diaporthe eres의 α-conidia, B는 β-conidia, C는 Botryosphaeria dothidea의 포자)
도 5는 RPA 증폭 과정을 간략히 나타낸 것이다.
도 6은 Diaporthe eres 검출을 위해 설계된 6가지의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 실험을 수행한 결과이다.
도 7은 Botryosphaeria dothidea 검출을 위해 설계된 7가지의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 실험을 수행한 결과이다.
도 8은 Diaporthe eres 검출을 위한 최적의 RPA용 프라이머 세트 반응 결과이다.
도 9는 Botryosphaeria dothidea 검출을 위한 최적의 RPA용 프라이머 세트 반응 결과이다.
도 10은 최적의 RPA 프라이머 세트를 이용하여 최적의 반응 시간 및 온도 조건 확립 결과이다.
도 11은 Diaporthe eres 검출 RPA 프라이머 세트로 최소검출한계를 검정한 결과이다.
도 12는 Botryosphaeria dothidea 검출 RPA 프라이머 세트로 최소검출한계를 검정한 결과이다.Figure 1 shows symptoms of artificially inoculated (A,a) Diaporthe eres and (B,b) Botryosphaeria dothidea in kiwifruit.
Figure 2a is an experiment for comparing the activities of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea in vitro, and Figure 2b is an experiment for comparing the activities of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea in vivo.
Figure 3a confirms the symptoms according to the inoculation density and culture period of Diaporthe eres , and Figure 3b confirms the symptoms according to the inoculation density and culture period of Botryosphaeria dothidea .
Figure 4 is a conidium (600 X) of kiwi soft rot bacteria observed under a microscope (A is α-conidia of Diaporthe eres , B is β-conidia, C is spores of Botryosphaeria dothidea )
5 schematically illustrates the RPA amplification process.
6 shows the results of PCR experiments using 6 primer sets designed to detect Diaporthe eres .
7 is a result of a PCR experiment using 7 primer sets designed for detecting Botryosphaeria dothidea .
8 is a reaction result of an optimal primer set for RPA for detecting Diaporthe eres .
9 is a reaction result of an optimal RPA primer set for detecting Botryosphaeria dothidea .
10 is a result of establishing optimal reaction time and temperature conditions using an optimal RPA primer set.
11 is a result of testing the minimum detection limit with a Diaporthe eres detection RPA primer set.
12 is a result of testing the minimum detection limit with the RPA primer set for detecting Botryosphaeria dothidea .
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention provides a primer set for detecting kiwi soft rot.
"프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥, 즉 주형 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 주형 가닥을 복제하기 위한 합성 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 주형 가닥의 복제를 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다."Primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied, i.e., the template strand, and can serve as a synthetic starting point for replicating the template strand. The length and sequence of the primers should permit replication of the template strand to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the complexity of the DNA or RNA target required, as well as the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength.
본 명세서에서 “서열번호 x 및 y의 프라이머”는 “서열번호 x 및 y의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 프라이머”과 동일한 의미로 사용된다. 여기서 x와 y는 각각 독립적으로 1 내지 24의 정수 중 어느 하나이다.In this specification, “the primers of SEQ ID NOs: x and y” are used in the same sense as “the primers consisting of the polynucleotides of SEQ ID NOs: x and y”. Here, x and y are each independently an integer of 1 to 24.
"상보적"이란 용어는 핵산과 관련하여 사용될 때, 그 염기들이 반대의 극성을 갖는 또 다른 핵산의 폴리뉴클레오티드의 염기들과 결합하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 한 방향의 극성을 갖는 핵산을 의미한다. 예를 들면, 5'에서 3'방향으로 서열 GCAT를 갖는 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서열 CGTA를 갖는 핵산과 상보적이다. 본 명세서에서, 상보적이라는 용어는 실질적으로 상보적인 핵산들을 포함하는 것으로 사용된다. 실질적으로 상보적이라는 것은 모든 뉴클레오티드가 또 다른 핵산의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지는 않지만 그럼에도 불구하고 두 핵산이 특정 조건하에서 안정한 혼성체를 형성할 수 있는 서열을 갖는 것을 의미한다.The term "complementary" when used in reference to a nucleic acid refers to a nucleic acid of one polarity containing a polynucleotide sequence whose bases bind with the bases of a polynucleotide of another nucleic acid of opposite polarity. . For example, a nucleic acid having the sequence GCAT in the 5' to 3' direction is complementary to a nucleic acid having the sequence CGTA in the 3' to 5' direction. In this specification, the term complementary is used to include substantially complementary nucleic acids. Substantially complementary means having a sequence in which not all nucleotides base pair with nucleotides of another nucleic acid, but nevertheless allow the two nucleic acids to form a stable hybrid under certain conditions.
"폴리뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)가 수개 이상 중합한 중합체를 의미하며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 폴리뉴클레오티드의 유사체 (예컨대, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산), 삽입 물질 등을 포함할 수 있다. “폴리뉴클레오티드”는 “염기서열”과 동일한 의미를 갖는다."Polynucleotide" means a polymer in which several or more deoxyribonucleotides or ribonucleotides are polymerized in single-stranded or double-stranded form, and unless otherwise specified, analogs of natural polynucleotides (such as , phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleic acids), intercalating materials, and the like. “Polynucleotide” has the same meaning as “base sequence”.
본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 21 및 22 또는 서열번호 23 및 24의 프라이머를 포함한다.The primer sets of the present invention are SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NOs: 15 and 16, SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 21 and 22 or SEQ ID NOs: 23 and 24.
상기 프라이머는 키위 무름병균의 게놈 DNA를 이루는 폴리뉴클오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭시키도록 디자인된 것이다.The primers are designed to amplify a polynucleotide constituting the genomic DNA of Kiwi soft rot or a polynucleotide complementary thereto.
상기 프라이머 세트는 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)을 위한 것으로, DNA 결합 단백질(binding protein)과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 시퀀스(target sequence)를 증폭시킬 수 있고, 등온의 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온조건에서도 증폭이 가능하므로 특별한 장비 없이 등온장치만 있으면 빠른 시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있다. 이러한 RPA 방법에는 비특이적 반응이 종종 발생하므로 이를 방지하기 위한 적합한 프라이머의 제작이 중요하다.The primer set is for recombination-polymerase amplification (RPA), and can rapidly and accurately amplify a target sequence using a DNA binding protein and a recombinase, , Since amplification is possible even under isothermal conditions using isothermal polymerase (mesophilic polymerase), viruses can be detected and diagnosed in a short time with an isothermal device without special equipment. Since non-specific reactions often occur in these RPA methods, it is important to prepare suitable primers to prevent this.
상기 키위 무름병균은 Diaporthe eres 또는 Botryosphaeria dothidea일 수 있다.The kiwi soft rot bacteria may be Diaporthe eres or Botryosphaeria dothidea .
서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 21 및 22 및 서열번호 23 및 24의 프라이머는 모두 키위 무름병균을 검출할 수 있어 상기 프라이머를 모두 포함하는 경우, 키위 무름병균에 대한 검출 효과를 향상시킬 수 있다.SEQ ID NOs 1 and 2, SEQ ID NOs 3 and 4, SEQ ID NOs 5 and 6, SEQ ID NOs 7 and 8, SEQ ID NOs 9 and 10, SEQ ID NOs 11 and 12, SEQ ID NOs 13 and 14, SEQ ID NOs 15 and 16, SEQ ID NOs Primers of Nos. 17 and 18, SEQ ID NOs: 21 and 22, and SEQ ID NOs: 23 and 24 can detect kiwi soft rot, so when all of the primers are included, the detection effect on kiwi soft rot can be improved.
특히 키위 무름병균 중 높은 분포 비율을 차지하는 Diaporthe eres 및 Botryosphaeria dothidea를 특이적으로 검출할 수 있어, 키위 무름병균을 조기 진단하고, 방제하는 데 보다 효과적이다.In particular, Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea , which occupy a high distribution rate among kiwi soft rot bacteria, can be specifically detected, so it is more effective in early diagnosis and control of kiwi soft rot bacteria.
본 발명은 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12의 프라이머를 포함할 수 있고, 예를 들어 서열번호 1 및 2의 프라이머를 포함할 수 있다.The present invention may include primers of SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, and SEQ ID NOs: 11 and 12, for example, the sequence Primers numbered 1 and 2 may be included.
상기 프라이머 세트는 키위 무름병균에 대해 특이적인 프라이머로서, Diaporthe eres를 특이적으로 검출할 수 있다.The primer set is a primer specific for kiwi soft rot, and can specifically detect Diaporthe eres .
본 발명은 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 21 및 22 또는 서열번호 23 및 24의 프라이머를 포함할 수 있고, 예를 들어, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 포함할 수 있다.The present invention may include primers of SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NOs: 15 and 16, SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 21 and 22 or SEQ ID NOs: 23 and 24, for example, SEQ ID NOs: 13 and 14 A primer may be included.
상기 프라이머 세트는 키위 무름균에 대해 특이적인 프라이머로서, Boryosphaeria dothidea를 특이적으로 검출할 수 있다.The primer set is a primer specific for kiwi rudimentary bacteria, and can specifically detect Boryosphaeria dothidea .
본 발명은 키위 무름병균 검출키트를 제공한다.The present invention provides a kit for detecting kiwi soft rot bacteria.
본 발명은 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 21 및 22 또는 서열번호 23 및 24의 프라이머를 포함한다.SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, SEQ ID NOs: 11 and 12, SEQ ID NOs: 13 and 14, SEQ ID NOs: 15 and 16 , SEQ ID NOs: 17 and 18, SEQ ID NOs: 21 and 22, or SEQ ID NOs: 23 and 24.
프라이머, 키위 무름병균에 관하여는 전술한 바와 같다.Primers and kiwi soft rot bacteria were as described above.
본 발명은 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 검출키트는 용기에 담겨 있는 동결건조된 프라이머를 포함할 수 있다.The present invention is not limited to a specific form, and may be implemented in various forms. According to one embodiment, the detection kit may include lyophilized primers contained in a container.
예컨대, 두 개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 경우에는, 다수의 프라이머 세트가 혼합되어 용기에 담겨 있을 수도 있고, 각각의 프라이머 세트가 개별적으로 각각의 용기에 담겨 있을 수도 있다. 예컨대, 두 개의 프라이머 세트를 포함하는 검출키트의 경우, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트가 동결건조분말 형태로 담겨 있는 용기와, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트가 동결건조분말 형태로 담겨 있는 용기가 검출키트에 포함될 수 있다. 세 개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 검출키트의 경우에도, 위와 유사한 형태로 제공될 수 있다. For example, in the case of including two or more primer sets, a plurality of primer sets may be mixed and contained in a container, or each primer set may be individually contained in each container. For example, in the case of a detection kit including two primer sets, a container containing the primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2 in the form of a lyophilized powder, and a container containing the primer sets of SEQ ID NOs: 13 and 14 in the form of a lyophilized powder may be included in the detection kit. Even in the case of a detection kit including three or more primer sets, it may be provided in a form similar to the above.
또한, 상기 검출키트는 본 발명의 프라이머 세트 외 키위 무름병균의 검출을 위해 사용할 수 있는 프라이머 세트 또한 포함될 수 있다.In addition, the detection kit may also include a primer set that can be used to detect kiwi soft rot in addition to the primer set of the present invention.
본 발명의 검출키트에는 위의 프라이머 세트 이외에도 중합효소, DNA 결합 단백질(binding protein)과 재조합효소(recombinase), Mg2+와 같은 조인자 및 버퍼 등이 포함될 수 있다. 중합효소 및 버퍼는 각각 별도의 용기에 담겨 있을 수도 있으며, 중합효소의 혼합물이 한 용기에 담겨 있고 버퍼가 별도의 용기에 담겨 있을 수도 있고, 중합효소 및 버퍼가 모두 혼합되어 한 용기에 담겨 있을 수도 있다.In addition to the above primer set, the detection kit of the present invention may include a polymerase, a DNA binding protein and recombinase, a cofactor such as Mg 2+ and a buffer. The polymerase and buffer may be contained in separate containers, the polymerase mixture may be contained in one container and the buffer may be contained in separate containers, or both polymerase and buffer may be mixed and contained in one container. there is.
본 발명의 검출키트에는 위의 프라이머, 중합효소 및 버퍼를 포함하는 반응 혼합물이 액체의 형태로 용기에 담겨 있을 수 있다. 이를 냉동 보관하였다가 필요 시 해동하여 사용할 수 있다. 이러한 검출키트의 경우, 평가 시 검체를 추가하는 것 외에는 별도의 혼합 과정이 필요하지 않으므로 평가의 편의성 및 신속성이 증대될 수 있다.In the detection kit of the present invention, the reaction mixture including the above primer, polymerase and buffer may be contained in a liquid form in a container. It can be stored frozen and thawed if necessary. In the case of such a detection kit, convenience and speed of evaluation can be increased because a separate mixing process is not required other than adding a sample during evaluation.
본 발명은 키위 무름병균의 검출 방법을 제공한다.The present invention provides a method for detecting kiwi soft rot bacteria.
본 발명은 상기 프라이머 세트로 키위 무름병균의 게놈 DNA를 증폭하는 단계를 포함한다.The present invention includes a step of amplifying genomic DNA of Kiwi soft rot with the primer set.
본 발명의 검출 방법은 키위의 과육 또는 껍질을 포함하는 모든 부위로부터 얻은 시료의 DNA를 본 발명의 프라이머 세트로 증폭하여 키위 무름병균 게놈 DNA 유무를 확인하는 것일 수 있다.The detection method of the present invention may be to confirm the presence or absence of kiwi soft rot genomic DNA by amplifying DNA of samples obtained from all parts including the flesh or peel of kiwi with the primer set of the present invention.
키위 무름병균 게놈 DNA 또는 키위로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 검출키트를 이용하여 수행할 수 있다.Methods for extracting kiwi soft rot genomic DNA or DNA from kiwifruit include a phenol/chloroform extraction method commonly used in the art, an SDS extraction method (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), It can be performed using the CTAB separation method (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) or a commercially available DNA extraction detection kit.
상기 증폭은 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA), 중합효소연쇄반응 (PCR), 실시간 중합효소연쇄반응, 리가아제 연쇄반응 (ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭 (nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템 (transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification), 복제효소에 의한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법일 수 있으며, 바람직하게는 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 의한 것일 수 있다.The amplification is recombinase-polymerase amplification (Recombinase polymerase amplification (RPA)), polymerase chain reaction (PCR), real-time polymerase chain reaction, ligase chain reaction (ligase chain reaction), nucleic acid sequence-based amplification (nucleic acid sequence- based amplification), transcription-based amplification system, strand displacement amplification, replication enzyme amplification, or any other suitable method for amplifying a nucleic acid molecule known in the art, Preferably, it may be by a recombination-polymerase amplification method (Recombinase polymerase amplification, RPA).
상기 증폭이 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification, RPA)에 의한 것인 경우, 기존 PCR로 증폭하는 경우에 비하여 더 빠르게 증폭이 가능하며, 빠른 증폭이 가능해짐에 따라 진단 시간 또한 크게 감소시킬 수 있다.If the amplification is by recombinase polymerase amplification (RPA), amplification can be performed more quickly than in the case of amplification by conventional PCR, and diagnosis time can also be greatly reduced as fast amplification is possible can
상기 증폭으로부터 수득한 산물의 검출은 지시약에 의한 검출, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광측정, 인광측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Detection of the product obtained from the amplification may be performed through detection by an indicator, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement, and phosphorescence measurement, but is not limited thereto.
본 발명은 상기 증폭으로부터 수득한 산물을 아가로스 겔로 전기영동하여 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 아가로스 겔로 전기영동하여 사다리 모양의 밴드, 증폭된 DNA에 해당하는 크기를 갖는 DNA의 존재 등이 검출되는지 여부를 판단함으로써 키위 무름병균의 유무를 판단할 수 있다.The present invention may further include separating the product obtained from the amplification by electrophoresis using an agarose gel. The presence or absence of kiwi soft rot can be determined by determining whether a ladder-shaped band, the presence of DNA having a size corresponding to the amplified DNA, and the like are detected by electrophoresis with an agarose gel.
또한, 아크릴아미드 겔 전기영동으로 증폭산물을 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머쌍에 의해 증폭된 DNA에 해당하는 크기를 갖는 DNA의 존재를 확인함으로써 증폭 산물을 검출할 수 있다.In addition, the amplification product can be separated by acrylamide gel electrophoresis, and the amplification product can be detected by confirming the presence of DNA having a size corresponding to the DNA amplified by the used primer pair.
또한, 상기 증폭으로부터 수득한 산물(증폭 산물과 동일 의미)은 효소, 효소 기질, 방사능 물질, 형광 염료, 발색소(chromophore), 화학발광 표지, 전기화학발광표지, 형광 공여체(fluorescence donor) 및 형광 수용체(fluorescence acceptor)를 포함하는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 쌍 또는 결합 파트너를 갖는 리간드로 표지될 수 있다.In addition, the product obtained from the amplification (synonymous with the amplification product) is an enzyme, an enzyme substrate, a radioactive material, a fluorescent dye, a chromophore, a chemiluminescent label, an electrochemiluminescent label, a fluorescence donor, and a fluorescence It can be labeled with a fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair containing a fluorescence acceptor or a ligand with a binding partner.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. Hereinafter, examples will be described in detail to explain the present invention in detail.
재료 및 방법Materials and Methods
1. 이병과에서 분리한 병원균의 비율1. Ratio of pathogens isolated from this department
보성, 해남, 그리고 제주도에서 품종별로 채집해온 총 284개의 이병과에서 분리한 병원균들을 감자한천배지(Potato dextrose agar, PDA)에 치상한 후 25℃, 상대 습도 90%로 설정된 배양기에서 배양한 다음 병원균들의 genomic DNA 추출하여 ITS 영역을 이용한 분자생물학적 동정을 실시하여 병원균 비율을 확인하였다(표 1).A total of 284 pathogens isolated from a total of 284 species collected from Boseong, Haenam, and Jeju Island were plated on potato dextrose agar (PDA) and cultured in an incubator set at 25℃ and 90% relative humidity. Their genomic DNA was extracted and molecular biological identification using the ITS region was performed to confirm the ratio of pathogens (Table 1).
[표 1][Table 1]
2. 인위적으로 접종된 Diaporthe eres 와 Botryosphaeria dothidea에서의 키위 병징2. Kiwifruit symptoms in artificially inoculated Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea
채집해온 이병과에서 분리한 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea가 실제로 키위에 병원성을 나타내는지 확인하였다. 포자 형성을 위해 보리 배지(Kim and Park, 1998)에서 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea를 25 ℃, 24시간 광 조건을 주어 매일 1회 흔들어 주면서 배양하였다. 보리 배지에서 약 10일 후 생성된 병자각을 관찰할 수 있었다. 병자각이 형성된 보리 배지를 50㎖ Conical tube(SPL, Cat. No. 50050)에 넣고 10㎖의 멸균수를 넣어 10분간 놓은 후 2겹의 Miracloth(Merck, Cat. No. 475855-1R)로 여과하여 포자를 수확하였다. 70% 에탄올로 60초 동안 멸균하고 멸균수로 3회 세척한 키위를 클린벤치에서 건조시킨 후 팁으로 상처를 2mm 깊이로 내어 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea 포자 희석액(1x106conidia/㎖)을 20㎕씩 접종하였다. 접종된 키위를 25℃, 상대 습도 90% 유지된 배양기에서 10일간 두고 병징을 확인하였다 (도 1).It was confirmed whether Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea , which were isolated from the collected pears, were actually pathogenic to kiwi. For sporulation, Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea were cultured in barley medium (Kim and Park, 1998) under conditions of 25 °C and 24 hours of light, shaking once a day. In the barley medium, after about 10 days, it was possible to observe the symptoms of sickness. Put the barley medium in which the sickness was formed into a 50㎖ Conical tube (SPL, Cat. No. 50050), add 10㎖ of sterilized water, let it sit for 10 minutes, and then filter with 2 layers of Miracloth (Merck, Cat. No. 475855-1R). Spores were harvested. After sterilizing with 70% ethanol for 60 seconds and washing with sterile water three times, drying the kiwi on a clean bench, cut a wound 2 mm deep with a tip and apply Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea spore dilution (1x10 6 conidia/ml) at 20 μl each. Inoculated. Symptoms were confirmed by placing the inoculated kiwifruit in an incubator maintained at 25° C. and 90% relative humidity for 10 days (FIG. 1).
3. In vitro 및 In vivo에서 Diaporthe eres 및 Botryosphaeria dothidea의 활성 비교 실험3. In vitro and in vivo activity comparison experiment of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothide a
In vitro에서 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea의 포자 희석액(1x106conidia/㎖)을 20㎕씩 감자한천배지 (Potato dextrose agar, PDA)에 접종하였다. In vivo에서 멸균하고 세척한 후 건조시킨 키위를 팁으로 상처를 2mm 깊이로 내어 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea 포자 희석액(1x106conidia/㎖)을 20㎕씩 접종하였다. 4℃에서 0일부터 30일까지 10일 간격으로 항온기에 배양한 후 각 기간 별로 생장한 균총들의 직경과 키위의 병반의 크기를 측정해 저장 기간 별 균사의 생장량 및 병징의 크기를 비교하였다 (도 2a 및 2b).In vitro, 20 μl of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea spore dilutions (1x10 6 conidia/ml) were inoculated on potato dextrose agar (PDA). In vivo, sterilized, washed and dried kiwifruit was cut to a depth of 2 mm with a tip, and 20 μl of dilution of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea spores (1x10 6 conidia/ml) was inoculated. After culturing in an incubator at 4 ° C for 10 days from 0 to 30 days, the diameter of the flora grown for each period and the size of the kiwi lesion were measured to compare the growth of mycelia and the size of symptoms for each storage period (Fig. 2a and 2b).
4. Diaporthe eres 및 Botryosphaeria dothidea의 접종 밀도와 배양 기간에 따른 병징 확인4. Identification of symptoms according to inoculation density and culture period of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea
멸균하고 세척한 후 건조시킨 키위를 팁으로 상처를 2mm 깊이로 내어 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea 포자 희석액(1x106conidia/㎖)을 20㎕씩 접종하였다. 25℃, 상대 습도 90% 유지된 배양기에서 1일부터 10일까지 1일 간격으로 배양한 후 병반의 크기를 측정해 기간에 따른 병징의 크기를 비교하였다. 또한 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea 포자 희석액을 1x101 conidia/㎖에서 1x106 conidia/㎖로 키위에 접종하여 균의 밀도에 따른 병징을 배양한 10일째 확인하였다 (도 3a 및 3b).Sterilized, washed and dried kiwifruit was cut to a depth of 2 mm with a tip, and 20 μl each of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea spore dilutions (1x10 6 conidia/ml) was inoculated. After incubation at 25°C and 90% relative humidity in an incubator at intervals of 1 day from 1 to 10 days, the size of the lesion was measured and the size of symptoms according to the period was compared. In addition, Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea spore dilutions were inoculated into kiwifruit at 1x10 1 conidia/ml to 1x10 6 conidia/ml, and symptoms according to the density of the bacteria were confirmed on the 10th day of culture (FIGS. 3a and 3b).
5. Diaporthe eres 및 Botryosphaeria dothidea 분생포자 모습 및 분자생물학적 동정 확인5. Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea conidia and molecular biological identification
분자적 동정을 위해 형태적으로 확인된 단포자가 사용되었다 (도 4). Diaporthe eres 및 Botryosphaeria dothidea 포자 생성을 위하여 보리 배지를 만들어서 사용하였다 (Kim and Park, 1998). 곰팡이 종 동정을 위해 universal primer ITS4(5’ - TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3’)과 ITS5(5’ - GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3’)를 사용하여 곰팡이의 genomic DNA가 증폭했는지를 확인하였다.Morphologically identified monospores were used for molecular identification (FIG. 4). A barley medium was prepared and used to generate Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea spores (Kim and Park, 1998). To identify fungal species, genomic DNA of fungi was amplified using universal primers ITS4 (5' - TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3') and ITS5 (5' - GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3') confirmed that it was done.
6. Recombinase Polymerase amplification (RPA) 프라이머 세트 제작6. Construction of Recombinase Polymerase amplification (RPA) Primer Set
키위 과실무름병을 일으키는 Diaporthe eres 와 Botryosphaeria dothidea 검출을 위해 RPA primer를 제작하였다. RPA primer는 TwistDx RPA 사용 설명서(TwistDX, Ltd., Cambridge, UK)의 조건에 따라 제작되었다. Diaporthe eres 검출용 RPA primer는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 Diaporthe sp.의 Histone H3(HIS) gene 염기서열(KC343494.1, MH937370.1, MH937368.1, KC343664.1 등)과 국내에서 다양한 키위 재배 지역에서 얻은 샘플에서 추출한 Macrogen사에서 확인된 Diaporthe eres의 Histone H3(HIS) gene을 BioEdit 프로그램을 이용하여 정리하였다. 그 후 MegaX 프로그램을 사용하여 alignment를 통해 보존이 잘 된 지역(region)을 정하고 primer를 제작하였다 (표 2). Botryosphaeria dothidea 검출용 RPA primer는 Diaporthe eres와 같은 방법으로 제작되었으며 NCBI에 등록된 Botryosphaeria dothidea의 β-tubulin gene(TUB) 염기서열(KU565871.1, KC864747.2, KJ801793.1, MG564762.1, MG564761.1, MG564760.1, MG564759.1, MG564758.1, MG564757.1)과 국내에서 다양한 키위 재배 지역에서 얻은 샘플에서 추출한 Macrogen사에서 확인된 Botryosphaeria dothidea의 β-tubulin gene(TUB) 염기서열을 사용하였다. 또한 Translation elongation factor(TEF) 염기서열(KU565872.1, KC864748.2, MG459974.1, MG459970.1, MG459972.1, MG459971.1 등)과 국내에서 다양한 키위 재배 지역에서 얻은 샘플에서 추출한 Macrogen사에서 확인된 Botryosphaeria dothidea의 Translation elongation factor(TEF) 염기서열을 사용하였다 (표 3).RPA primers were designed to detect Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea, which cause kiwifruit soft rot. RPA primers were prepared according to the conditions of the TwistDx RPA instruction manual (TwistDX, Ltd., Cambridge, UK). The RPA primer for Diaporthe eres detection is Histone H3 (HIS) gene base sequence (KC343494.1 , MH937370.1, MH937368.1, KC343664.1, etc.) and the Histone H3 (HIS) gene of Diaporthe eres identified by Macrogen extracted from samples obtained from various kiwifruit growing regions in Korea were organized using the BioEdit program. After that, using the MegaX program, well-conserved regions were determined through alignment and primers were produced (Table 2). RPA primers for detecting Botryosphaeria dothidea were prepared in the same way as Diaporthe eres , and the β-tubulin gene (TUB) sequences of Botryosphaeria dothidea registered at NCBI (KU565871.1, KC864747.2, KJ801793.1, MG564762.1, MG564761. 1, MG564760.1, MG564759.1, MG564758.1, MG564757.1) and β-tubulin gene (TUB) sequences of Botryosphaeria dothidea identified by Macrogen extracted from samples obtained from various kiwifruit growing regions in Korea were used. . In addition, Macrogen extracted from translation elongation factor (TEF) sequences (KU565872.1, KC864748.2, MG459974.1, MG459970.1, MG459972.1, MG459971.1, etc.) and samples from various kiwi growing regions in Korea. The confirmed translation elongation factor (TEF) sequence of Botryosphaeria dothidea was used (Table 3).
[표 2][Table 2]
[표 3][Table 3]
7. 병원균으로부터 genomic DNA 추출7. Genomic DNA extraction from pathogens
2019년 보성 지역에서 채집한 헤이워드 품종의 병든 키위를 과실의 외부와 내부의 병징 여부를 확인한 후 병반 분리를 진행하였다. 각 병징에서 건전한 부위와 병든 부위의 경계를 기준으로 각 부위에서 나타나는 병반을 감자 한천 배지 (Potato dextrose agar, PDA)에 치상한 후 25℃, 상대 습도 90%로 설정된 배양기에 배양하였다. 7일 후 형성된 균총의 끝부분을 절단하여 새로운 PDA 배지에 옮겨 배양하는 방식을 반복하여 균주를 순수 분리하였다. 배양이 완료된 균주의 균총의 표현형을 확인한 후 균사를 긁어서 모아 액체 질소에 넣어 분말화시켰다. 균주의 균사 분말에서 QIAGEN 사의 DNeasy Plant Mini Kit를 사용하여 QIAGEN 사에서 제시한 방법을 사용하여 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea의 genomic DNA를 추출하였다.Diseased kiwifruit of the Hayward variety collected in Boseong in 2019 was checked for symptoms on the outside and inside of the fruit, and then the lesions were separated. Based on the boundary between healthy and diseased areas in each symptom, lesions appearing in each area were plated on potato agar (Potato dextrose agar, PDA), and then cultured in an incubator set at 25 ° C and 90% relative humidity. After 7 days, the tip of the formed flora was cut off, transferred to a new PDA medium, and culture was repeated to isolate the pure strain. After checking the phenotype of the flora of the cultured strain, the mycelia were collected by scraping and powdered by putting them in liquid nitrogen. The genomic DNA of Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea was extracted from the mycelial powder of the strain using QIAGEN's DNeasy Plant Mini Kit using the method suggested by QIAGEN.
8. RPA 반응 조건 8. RPA Reaction Conditions
TwistAmp basic RPA kit (TwistDX, TABAS03kit)는 제조업체가 권장한 대로 일부 수정하여 사용했다. RPA product 50㎕의 반응은 39℃에서 20분 동안 진행하였다(표 4 및 도 5). 2% 아가로스 겔에 30분 동안 로딩하여 증폭 산물을 확인하였다. 동시에 100bp ladder를 탑재해 amplicon의 크기를 파악했다. 젤은 젤 문서화 시스템(Davinch-GelTM Gel Imaging System, Korea)의 UV light 아래에서 시각화 되었고 사진을 찍었다.TwistAmp basic RPA kit (TwistDX, TABAS03kit) was used as recommended by the manufacturer with some modifications. The reaction of 50 μl of RPA product was carried out at 39° C. for 20 minutes (Table 4 and FIG. 5). Amplification products were confirmed by loading on a 2% agarose gel for 30 minutes. At the same time, a 100bp ladder was loaded to determine the size of the amplicon. Gels were visualized and photographed under UV light in a gel documentation system (Davinch-Gel TM Gel Imaging System, Korea).
[표 4][Table 4]
9. RPA 특이성 검정9. RPA specificity assay
Diaporthe eres 검출용 RPA primer가 Diaporthe eres에만 특이적인지, Botryosphaeria dothidea 검출용 RPA primer가 Botryosphaeria dothidea에만 특이적인지를 확인하기 위해서 다른 병원균들의 genomic DNA를 추출하였다. 사용된 5개의 다른 병원균은 실험실에서 분리한 병원균을 사용하였다 (표 5). specificity 검정에 사용된 모든 병원균은 다음과 같다: 1. Diaporthe eres, 2. Botryosphaeria dothidea, 3. Botrytis cinerea, 4. Alternaria alternata, 5. Pestaloptiopsis sp. 6개의 병원균에서 genomic DNA를 동일하게 추출하여 같은 조건 하에 각각을 주형 가닥으로 하여 최적 반응 조건에서 RPA 반응 실험을 수행하였다 (표 4). 그리고 이를 2% 아가로스 겔에서 30분 동안 로딩하여 증폭이 된 부분의 밴드를 확인하였다.To confirm whether the RPA primers for detecting Diaporthe eres were specific for Diaporthe eres or not for Botryosphaeria dothidea , genomic DNAs of other pathogens were extracted. The 5 different pathogens used were laboratory isolated pathogens (Table 5). All pathogens used in the specificity test were as follows: 1. Diaporthe eres , 2. Botryosphaeria dothidea , 3. Botrytis cinerea , 4. Alternaria alternata , 5. Pestaloptiopsis sp. genomic DNA was identically extracted from six pathogens, and RPA reaction experiments were performed under the same conditions using each strand as a template strand under optimal reaction conditions (Table 4). Then, it was loaded on a 2% agarose gel for 30 minutes to confirm the band of the amplified part.
[표 5][Table 5]
10. RPA 민감성 검정10. RPA Sensitivity Assay
Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea RPA 프라이머 세트의 검출 한계를 확인하기 위해서 Thermo ScientificTM NanoDropTM (8.4ng/㎕)를 사용해 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea 추출한 genomic DNA의 농도를 각각 측정했다. Diaporthe eres의 genomic DNA는 8.4ng/㎕부터 0.84fg/㎕까지 10배씩 희석하고, Botryosphaeria dothidea의 genomic DNA는 12.6ng/㎕부터 1.26fg/㎕까지 10배씩 희석한 후 최적 반응 조건에서 RPA 반응을 수행하였다. RPA의 민감도 비교 실험을 위해 제작한 primer를 RPA와 일반 PCR 반응에서 동일하게 사용하여 비교 실험을 수행하였다. PCR 반응은 Enzynomics 사의 2X TOPsimpleTM DyeMIX (aliquot)-nTaq을 이용하여 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분 조건 하에서 30 cycle로 PCR을 진행하였다. 2% 아가로스 겔에서 30분 동안 로딩하여 증폭산물을 확인하였다.To confirm the detection limits of the Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea RPA primer sets, the concentrations of genomic DNA extracted from Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea were measured using Thermo Scientific TM NanoDrop TM (8.4ng/μL), respectively. The genomic DNA of Diaporthe eres was diluted 10-fold from 8.4ng/μl to 0.84 fg/μl, and the genomic DNA of Botryosphaeria dothidea was diluted 10-fold from 12.6ng/μl to 1.26fg/μl, followed by RPA reaction under optimal reaction conditions. did A comparison experiment was performed using the same primers designed for the RPA sensitivity comparison experiment in RPA and general PCR reactions. The PCR reaction was carried out in 30 cycles using Enzynomics' 2X TOPsimple TM DyeMIX (aliquot)-nTaq under conditions of 95 ° C 2 minutes, 95 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds, 72 ° C 5 minutes . Amplification products were confirmed by loading on a 2% agarose gel for 30 minutes.
결과result
1. RPA용 최적의 프라이머 세트 개발 및 조건 확립1. Development of optimal primer sets for RPA and establishment of conditions
키위 과실무름병균을 검출하기 위한 RPA용 프라이머 세트는 Diaporthe eres는 HIS 지역을 포함한 총 210bp을 대상으로 설계하였고, Boryosphaeria dothidea는 TUB 지역을 포함한 156bp을 대상으로 설계되었다. RPA Forward and Reverse primer는 국내 키위 생산 지역에서 샘플을 채집하여 제작되었다. 채집한 샘플에서 곰팡이를 분리하고 Diaporthe sp.의 균주를 동정한 후 얻은 염기서열과 National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gob/)에서 Diaporthe sp.의 염기서열을 확인하여 FASTA format으로 정리하였다. 이와 같은 방법으로 Boryosphaeria dothidea의 염기서열도 정리하였다. 이 서열과 앞서 정리한 Diaporthe sp.의 서열과 Boryosphaeria dothidea의 서열을 MegaX 프로그램을 사용하여 유전자 별로 alignment한 후 같은 길이로 정리하였다. RPA primer는 제조자 지침(TwistDX)에 따라 Forward and Reverse primer를 제작하였다. 제작된 6종류의 Diaporthe eres 검출용 프라이머 세트와 (표 2) 7종류의 Boryosphaeria dothidea 검출용 프라이머 세트를 (표 3) 각각 이용하여 증폭이 되는 primer를 선별하고자 PCR 반응을 수행하고 전기영동으로 분석했다. Diaporthe eres 검출용 프라이머 세트는 6종류 중 1,2,3,4,5,6 프라이머 세트가 Diaporthe eres에만 특이적으로 증폭된 반응을 보였다 (도 6). Primer sets for RPA to detect kiwi fruit soft rot were designed for Diaporthe eres for a total of 210 bp including the HIS region, and for Boryosphaeria dothidea for 156 bp including the TUB region. RPA Forward and Reverse primers were produced by collecting samples from domestic kiwifruit production areas. After isolating the fungus from the collected samples and identifying the strain of Diaporthe sp., the nucleotide sequence obtained and the strain of Diaporthe sp. The nucleotide sequence was confirmed and summarized in FASTA format. The base sequence of Boryosphaeria dothidea was also organized in the same way. This sequence, the previously arranged sequence of Diaporth e sp. and the sequence of Boryosphaeria dothidea were aligned by gene using the MegaX program and arranged to the same length. Forward and reverse primers were prepared according to the manufacturer's instructions (TwistDX) for RPA primers. PCR reaction was performed to select primers that could be amplified using the prepared 6 types of primer sets for detecting Diaporthe eres (Table 2) and 7 types of primer sets for detecting Boryosphaeria dothidea (Table 3), respectively, and analyzed by electrophoresis. . As for the primer sets for detecting Diaporthe eres, 1, 2, 3, 4, 5, and 6 primer sets out of 6 showed a specific amplification reaction only for Diaporthe eres (FIG. 6).
Boryosphaeria dothidea 프라이머 세트는 7종류 중 1,2,3,5,6 프라이머 세트가 Botryosphaeria dothidea에만 특이적으로 증폭된 반응을 보였다 (도 7). RPA 분석을 위한 primer의 성능을 RPA 프라이머 세트의 특이성을 통하여 비교해보았다. 키위의 주요 과실무름병균 검출을 위한 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea RPA 프라이머 세트가 Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea에 특이적인지 확인하기 위하여, Diaporthe eres와 Botryosphaeria dothidea 다음으로 키위 과실무름병의 가장 큰 원인이 되는 병원균인 Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Pestaloptiopsis sp.의 genomic DNA를 주형으로 사용하여 각기 RPA를 수행하였다. 혼합물을 RPA 반응을 수행하고 전기영동으로 분석해본 결과 Diaporthe eres 검출용 프라이머 세트에서는 Diaporthe eres에서만 특이적이게 결합하는 것들 중 안정적으로 증폭되어 밴드가 가장 밝은 1번 프라이머 세트를 최종적으로 최적의 프라이머 세트로 선택하였다 (도 8). Botryosphaeria dothidea 검출용 프라이머 세트에서는 Botryosphaeria dothidea에서만 특이적이게 결합하는 것들 중 1번이 프라이머 세트가 가장 밝았으며 다른 6개의 primer 쌍에 비해 더 나은 성능을 나타낸다 (도 9). 다음으로 RPA 분석을 위한 최적 반응 시간과 최적 반응 온도를 결정하기 위해 앞서 선택한 최적의 프라이머 세트를 이용하여 1분에서 20분의 범위와 25℃에서 39℃까지의 범위에서 반응을 한 후 전기 영동을 통해서 증폭의 여부를 육안으로 확인하였다(도 10). 각각의 온도와 시간에서 비교해본 결과 가장 빠르게 검출될 수 있는 시간인 5분과 쉽고 간편하게 사람의 체온으로도 검출될 수 있는 온도인 35℃가 최적조건으로 확립되었다.As for the Boryosphaeria dothidea primer sets, primer sets 1, 2, 3, 5, and 6 out of 7 showed specific amplification reactions only to Botryosphaeria dothidea (FIG. 7). The performance of primers for RPA analysis was compared through the specificity of RPA primer sets. In order to confirm that the Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea RPA primer set for detecting the major fruit soft rot of kiwifruit was specific to Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea , Botrytis cinerea , the most causative pathogen of kiwifruit soft rot after Diaporthe eres and Botryosphaeria dothidea, was tested. , Alternaria alternata , and Pestaloptiopsis sp. genomic DNA was used as a template to perform RPA respectively. As a result of conducting the RPA reaction and analyzing the mixture by electrophoresis, in the primer set for detecting Diaporthe eres, among those that specifically bind only to Diaporthe eres , primer set No. 1 with the brightest band due to stable amplification was finally selected as the optimal primer set. selected (FIG. 8). In the primer set for detecting Botryosphaeria dothidea , primer set No. 1 among those specifically binding only to Botryosphaeria dothidea was the brightest and showed better performance than the other 6 primer pairs (FIG. 9). Next, in order to determine the optimal reaction time and optimal reaction temperature for RPA analysis, electrophoresis was performed after reaction in the range of 1 minute to 20 minutes and from 25 ° C to 39 ° C using the optimal primer set previously selected. Whether or not amplification was confirmed visually through (FIG. 10). As a result of comparison at each temperature and time, 5 minutes, which is the fastest detectable time, and 35 ° C, which is a temperature that can be easily and simply detected by human body temperature, were established as optimal conditions.
2. 키위 과실무름병균 검출용 RPA 프라이머 세트의 민감도 확인2. Confirmation of sensitivity of RPA primer set for detecting kiwi fruit soft rot
과실무름병균 검출용 RPA의 검출한계를 확인하기 위하여 과실무름병균에서 추출한 genomic DNA를 Diaporthe eres는 8.4ng/㎕부터 0.84fg/㎕까지 단계적으로 희석하여 실험을 수행하였다. 그 결과, 희석 배수가 높아질수록 반응성이 단계적으로 낮아지는 것을 확인하였으며 8.4ng/㎕부터 8.4pg/㎕까지 검출이 가능한 것으로 판단하였다(도 11). Botryosphaeria dothidea는 12.6ng/㎕부터 1.26fg/㎕까지 단계적으로 희석하여 실험을 수행하였다. 그 결과, 희석 배수가 높아질수록 반응성이 단계적으로 낮아지는 것을 확인하였으며 12.6ng/㎕부터 126pg/㎕까지 검출이 가능한 것으로 판단하였다(도 12). 기존의 Conventional PCR의 primer와 동일 조건 실험에서 실험한 결과, RPA 방법을 이용한 과실무름병 검출 방법이 기존의 PCR 방법보다 검출 능력이 높음을 알 수 있다.In order to confirm the detection limit of RPA for detecting fruit soft rot, experiments were performed by gradually diluting genomic DNA extracted from fruit soft rot bacteria from 8.4 ng/μl to 0.84 fg/μl for Diaporthe eres . As a result, it was confirmed that the reactivity decreased stepwise as the dilution factor increased, and it was determined that detection was possible from 8.4 ng/μl to 8.4 pg/μl (FIG. 11). Botryosphaeria dothidea was diluted in stages from 12.6 ng/μl to 1.26 fg/μl, and experiments were performed. As a result, it was confirmed that the reactivity decreased stepwise as the dilution factor increased, and it was determined that detection was possible from 12.6 ng/μl to 126 pg/μl (FIG. 12). As a result of the experiment under the same conditions as the primers of the conventional PCR, it can be seen that the detection ability of the fruit soft rot detection method using the RPA method is higher than that of the conventional PCR method.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> PRIMER SET FOR DETECTING Diaporthe eres OR Botryosphaeria dothidea, DIAGNOSTIC KIT, AND DETECTING METHOD USING THE SAME <130> 21P11011 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 1 HIS_F1 <400> 1 agtccgcgcc ctccaccgga ggtgtcaaga agc 33 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 1 HIS_R1 <400> 2 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg a 31 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 2 HIS_F2 <400> 3 gtccgcgccc tccaccggag gtgtcaagaa gc 32 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 2 HIS_R1 <400> 4 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg a 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 3 HIS_F3 <400> 5 tccgcgccct ccaccggagg tgtcaagaag c 31 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 3 HIS_R1 <400> 6 gatctcacgg acctattgga 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<223> PRIMER SET 7 TUB_R1 <400> 14 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac 30 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 8 TUB_F2 <400> 15 gtgggagaac atcaatgact aaactgtagc agc 33 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 8 TUB_R2 <400> 16 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac g 31 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 9 TUB_F1 <400> 17 atcattctca gcgtgggaga acatcaatga ctaa 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 9 TUB_R3 <400> 18 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac gtgt 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 10 TUB_F1 <400> 19 atcattctca gcgtgggaga acatcaatga ctaa 34 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 10 TUB_R2 <400> 20 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac g 31 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 11 TUB_F2 <400> 21 gtgggagaac atcaatgact aaactgtagc agc 33 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 11 TUB_R1 <400> 22 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac 30 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 12 TUB_F2 <400> 23 gtgggagaac atcaatgact aaactgtagc agc 33 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 12 TUB_R3 <400> 24 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac gtgt 34 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 13 TEF_F1 <400> 25 acgtgtgctg ggttcctgcg ccgaatttgc ctta 34 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER SET 13 TEF_R1 <400> 26 agcgttggtg aggggtgttc gcgtcggtcg cac 33 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer ITS4 <400> 27 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer ITS5 <400> 28 ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22 <110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> PRIMER SET FOR DETECTING Diaporthe eres OR Botryosphaeria dothidea, DIAGNOSTIC KIT, AND DETECTING METHOD USING THE SAME <130> 21P11011 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 1 HIS_F1 <400> 1 agtccgcgcc ctccaccgga ggtgtcaaga agc 33 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 1 HIS_R1 <400> 2 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg a 31 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 2 HIS_F2 <400> 3 gtccgcgccc tccaccggag gtgtcaagaa gc 32 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 2 HIS_R1 <400> 4 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg a 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 3 HIS_F3 <400> 5 tccgcgccct ccaccggagg tgtcaagaag c 31 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 3 HIS_R1 <400> 6 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg a 31 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 4 HIS_F1 <400> 7 agtccgcgcc ctccaccgga ggtgtcaaga agc 33 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 4 HIS_R2 <400> 8 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg 30 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 5 HIS_F2 <400> 9 gtccgcgccc tccaccggag gtgtcaagaa gc 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 5 HIS_R2 <400> 10 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg 30 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 6 HIS_F3 <400> 11 tccgcgccct ccaccggagg tgtcaagaag c 31 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 6 HIS_R2 <400> 12 gatctcacgg acctattgga ggaggcgatg 30 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 7 TUB_F1 <400> 13 atcattctca gcgtgggaga acatcaatga ctaa 34 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 7 TUB_R1 <400> 14 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac 30 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 8 TUB_F2 <400> 15 gtgggagaac atcaatgact aaactgtagc agc 33 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 8 TUB_R2 <400> 16 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac g 31 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 9 TUB_F1 <400> 17 atcattctca gcgtgggaga acatcaatga ctaa 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 9 TUB_R3 <400> 18 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac gtgt 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 10 TUB_F1 <400> 19 atcattctca gcgtgggaga acatcaatga ctaa 34 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 10 TUB_R2 <400> 20 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac g 31 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 11 TUB_F2 <400> 21 gtgggagaac atcaatgact aaactgtagc agc 33 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 11 TUB_R1 <400> 22 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac 30 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 12 TUB_F2 <400> 23 gtgggagaac atcaatgact aaactgtagc agc 33 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 12 TUB_R3 <400> 24 ctgcgcgttc agaagattgc catactttac gtgt 34 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 13 TEF_F1 <400> 25 acgtgtgctg ggttcctgcg ccgaatttgc ctta 34 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PRIMER SET 13 TEF_R1 <400> 26 agcgttggtg aggggtgttc gcgtcggtcg cac 33 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> universal primer ITS4 <400> 27 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> universal primer ITS5 <400> 28 ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
Claims (8)
SEQ ID NOs 1 and 2, SEQ ID NOs 3 and 4, SEQ ID NOs 5 and 6, SEQ ID NOs 7 and 8, SEQ ID NOs 9 and 10, SEQ ID NOs 11 and 12, SEQ ID NOs 13 and 14, SEQ ID NOs 15 and 16, SEQ ID NOs 17 and 18, SEQ ID NOs: 21 and 22, or SEQ ID NOs: 23 and 24, a primer set for detecting kiwi soft rot.
The primer set according to claim 1, comprising the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 for detecting kiwi soft rot.
The primer set according to claim 1, comprising the primers of SEQ ID NOs: 13 and 14 for detecting kiwi soft rot.
The primer set according to claim 1, wherein the kiwi soft rot is Diaporthe eres or Botryosphaeria dothidea .
A kit for detecting kiwi soft rot bacteria comprising the primer set of any one of claims 1 to 4.
A method for detecting kiwi soft rot bacteria comprising the step of amplifying genomic DNA of kiwi soft rot bacteria with the primer set of any one of claims 1 to 4.
The method according to claim 6, wherein the amplification is by recombination-polymerase amplification (Recombinase polymerase amplification, RPA), Kiwi soft rot detection method.
The method according to claim 6, further comprising the step of separating the product obtained from the amplification by electrophoresis on an agarose gel.
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