KR20230111736A - 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법 - Google Patents

화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 화학 요법제의 분포 평가 방법은 암 조직을 투명화 시키는 단계를 포함하며, 이마리스(Imaris) 프로그램을 통해 상기 암 조직에서의 약물 분포를 정량화하여 암 조직에서의 약물 전달 효과를 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 화학 요법제 분포 평가 방법은 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 병용 투여 필요성 및 화학 요법제의 효능을 평가하는 데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법{Method for evaluating the distribution of chemotherapeutic agents when performing transarterial chemoembolization used in combination with chemotherapeutic agents}
본 발명은 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법에 관한 것이다.
최근 영상 기술이 발전하여 몸 안에 숨어 있는 암의 정확한 위치를 찾아내어 방사선 조사, 내시경 수술 등 여러가지 방법으로 제거할 수 있게 되었다. 하지만, 암의 위치를 정확히 발전하더라도 암이 전체 장기에 퍼져 있거나, 다른 장기와 붙어 있는 경우 등 여러 가지 이유로 인해 수술적 제거가 불가능한 경우가 있다. 또한, 간암, 췌장암은 발견하더라도 수술적 완치가 불가능한 경우가 많다.
현재, 간 종양의 치료에 가장 많이 시행되고 있는 시술인 화학색전술은 간 종양에 영양을 공급하는 동맥을 찾아 항암제를 투여한 다음 혈관을 막아주는 치료법이다. 경동맥 화학색전술에는 리피오돌을 이용하는 통상적 경동맥 화학색전술(conventional TACE; cTACE), 약물 용출 색전술(drug-eluting embolic TACE; DEE-TACE) 등이 있으며, 항암제를 투여하지 않고 단순한 색전 물질만 주입하는 경동맥 색전술(transarterial embolization; TAE)이 존재한다.
간 조직은 소장 및 대장 등을 돌아 나오는 문맥 (portal vein)과 대동맥에서 직접 나오는 간동맥을 통하여 산소와 영양을 공급받는데, 정상 간 조직은 주로 문맥에서, 종양 조직은 주로 간동맥에서 혈액을 공급받는다. 따라서, 종양에 영양을 공급하는 간동맥에 항암제를 투여하고 혈관을 막아주면 정상 간 조직에 해를 입히지 않으면서 종양만을 선택적으로 괴사시킬 수 있다. 이러한 치료법은 암의 진행 정도에 따른 제약이 없이 적용범위가 넓고, 치료 대상의 제한이 적은 등 장점이 많기 때문에 현재 간암 치료율 향상에 가장 큰 기여를 하고 있는 방법이다. 화학색전술은 먼저 서혜부에 위치한 대퇴동맥에 카테터를 삽입하여 간동맥으로 접근한 후 혈관 조영제를 주사하여 종양의 위치, 크기 및 혈액 공급 양상 등 치료에 필요한 정보를 얻고, 치료 방침이 정해지면 약 1mm 정도 굵기의 가는 관을 카테터에 삽입하여 표적이 되는 동맥을 찾아 시술한다.
경동맥 화학색전술을 위하여 주입되는 색전 물질, 항암제 혼합액은 색전 물질과 항암제로 이루어진 에멀젼(emulsion)으로, 색전 물질인 리피오돌(Lipiodol)과 항암제인 아드리아마이신(Adriamycin)을 1:4 비율로 혼합하여 에멀젼(emulsion) 형태로 사용되는 것이 일반적이다. 이때 아드리아마이신은 리피오돌과 비중이 비슷한 Xray 조영제인 파미레이에 용해시켜 사용되어 장시간 에멀젼 형태로 유지할 수 있도록 한다. 본 혼합액에 의해 간암 치료 효과는 리피오돌의 색전 효과와 함께 항암제가 간암으로 집중 전달됨으로써, 영양분 공급을 차단함과 동시에 항암 효과의 극대화가 유도된다.
하지만, 화학색전술에 의해 종양이 괴사되기 전에 동맥에서 약물이 얼마나 멀리 전달되는지는 불분명하다. 가장 가까운 동맥에서의 약물 전달의 3차원 분석은, 불투명한 생물학적 조직의 얇은 단면 샘플을 사용하는 기존의 방법으로 제한된다. 종양에 있는 미세혈관의 3차원 그물과 같은 구조를 감안할 때, 이러한 혈관으로부터의 약물 유출은 3차원 조직 분석을 통해서만 정확하게 측정할 수 있다. 이때 CLARITY라는 조직 투명화 시스템은 조직을 광학적으로 투명하게 만들어 생물학적 구조의 3D 평가를 가능하게 한다(비특허문헌, Jensen, K. H. R.; Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem. Neuroanat. 2017, 86, 19.)
본 발명자들은 상기 조직 투명화를 이용하여 간세포암종 모델에서 경동맥 화학색전술 시행시 화학 요법제의 분포, 색전 효과 및 면역 원성 반응을 평가하기 위한 방법을 발명하여 암 관련 연구 등에 활용하고자 하였다.
본 발명의 일 목적은 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 경동맥 화학색전술 시행 후 색전 효과를 평가하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 경동맥 화학색전술 시행 후 면역 원성 반응을 평가하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 병용 투여 필요성 평가 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법을 제공한다.
(a) 간암 세포를 배양한 배양액 또는 상기 간암 세포를 기반으로 하는 스페로이드를 동물(인간 제외)에 이식하여 간암 조직을 형성하는 단계;
(b) 색전 물질과 화학 요법제를 간동맥에 주입하는 경동맥 화학색전술을 시행하는 단계;
(c) 상기 간암 조직을 채취하여 투명화하는 단계; 및
(d) 상기 간암 조직 시료를 대상으로 화학 요법제의 분포를 평가하는 단계.
다른 측면에서,
상기 방법에서 간암 조직 시료를 대상으로 색전 효과를 평가하는 단계를 더 포함하는, 평가 방법을 제공한다.
다른 측면에서,
상기 방법에서 간암 조직 시료를 대상으로 면역 원성 반응을 평가하는 단계를 더 포함하는, 평가 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서,
하기 단계를 포함하는, 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 병용 투여 필요성 평가 방법을 제공한다.
(a``) 간암 세포를 배양한 배양액 또는 상기 간암 세포를 기반으로 하는 스페로이드를 동물(인간 제외)에 이식하여 간암 조직을 형성하는 단계;
(b``) 색전 물질과 화학 요법제를 간동맥에 주입하는 경동맥 화학색전술을 시행하는 단계;
(c``) 상기 간암 조직을 채취하여 투명화하는 단계;
(d``) 상기 간암 조직 시료 대상으로 색전 효과 및 화학 요법제의 분포를 평가하는 단계; 및
(e``) 색전 효과와 화학 요법제의 분포를 비교 평가하여 화학 요법제의 병용 투여 필요성을 평가하는 단계.
본 발명에 따른 화학 요법제의 분포 평가 방법은 암 조직을 투명화 시키는 단계를 포함하며, 이마리스(Imaris) 프로그램을 통해 상기 암 조직에서의 약물 분포를 정량화하여 암 조직에서의 약물 전달 효과를 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 화학 요법제 분포 평가 방법은 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 병용 투여 필요성 및 화학 요법제의 효능을 평가하는 데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 간암 조직을 준비하고, 경동맥 화학색전술 시행 후 이미징하여 분석하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 DOX(독소루비신)와 Ru(루테늄)의 약물 방출 프로필을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 미소구체를 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 cTACE 시행 6시간 후 화학 요법제의 3차원 분포를 나타낸 것이다.
도 4b는 cTACE 시행 24시간 후 화학 요법제의 3차원 분포를 나타낸 것이다.
도 5a DEE-TACE 시행 6시간 후 화학 요법제의 3차원 분포를 나타낸 것이다.
도 5b는 DEE-TACE 시행 24시간 후 화학 요법제의 3차원 분포를 나타낸 것이다.
도 6a는 cTACE 시행 6시간 후 가장 가까운 혈관으로부터 화학 요법제가 흡수된 종양 세포 사이의 거리를 나타낸 것이다.
도 6b는 cTACE 시행 24시간 후 가장 가까운 혈관으로부터 화학 요법제가 흡수된 종양 세포 사이의 거리를 나타낸 것이다.
도 6c는 DEE-TACE 시행 6시간 후 가장 가까운 혈관으로부터 화학 요법제가 흡수된 종양 세포 사이의 거리를 나타낸 것이다.
도 6d는 DEE-TACE 시행 24시간 후 가장 가까운 혈관으로부터 화학 요법제가 흡수된 종양 세포 사이의 거리를 나타낸 것이다.
도 6e는 cTACE 및 DEE-TACE 시행 6시간 후 Ru를 포함하는 암세포의 누적 백분율 측면에서 가장 가까운 혈관으로부터의 거리를 나타낸 것이다.
도 6f는 cTACE 및 DEE-TACE 시행 24시간 후 Ru를 포함하는 암세포의 누적 백분율 측면에서 가장 가까운 혈관으로부터의 거리를 나타낸 것이다.
도 7은 cTACE, DEE-TACE, TAE 및 허위 절차 시행 후 시간에 따른 종양의 괴사율을 나타낸 것이다.
도 8은 cTACE, DEE-TACE, TAE 및 허위 절차 시행 후 면역 원성 반응을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은,
하기 단계를 포함하는, 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법을 제공한다.
(a) 간암 세포를 배양한 배양액 또는 상기 간암 세포를 기반으로 하는 스페로이드를 동물(인간 제외)에 이식하여 간암 조직을 형성하는 단계;
(b) 색전 물질과 화학 요법제를 간동맥에 주입하는 경동맥 화학색전술을 시행하는 단계;
(c) 상기 간암 조직을 채취하여 투명화하는 단계; 및
(d) 상기 간암 조직 시료를 대상으로 화학 요법제의 분포를 평가하는 단계.
상기 평가 방법은 간암 조직 시료를 대상으로 색전 효과를 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 평가 방법은 간암 조직 시료를 대상으로 면역 원성 반응을 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 면역 원성 반응 평가는 초기 면역 반응 또는 잔류 면역 반응 평가일 수 있다.
이때 상기 색전 효과 평가 및 면역 원성 반응 평가를 하는 경우, 상기 (c) 단계에 따른 투명화 단계를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 상기 방법을 설명하기 위하여 도 1을 참조한다.
먼저 간암 조직을 형성시킨 간암 동물 모델에 대해서 경동맥 화학색전술을 시행하고(step 1), 경동맥 화학색전술을 시행한 간암 조직을 채취하여 조직을 투명화한 후(step 2), 투명화된 조직을 3차원 이미지로 구성한 후(step 3), 3차원 이미지를 분석하여 화학 요법제의 분포를 평가하는 과정(step 4)을 통하여 본 발명을 수행할 수 있다.
상기 (a) 단계의 "스페로이드(spheroid)"는 3차원 세포배양을 통하여 만들어지는 작은'구'체로, 스페로이드는 일종의 작은'조직'으로서, 외부와 내부가 구분되어 기능이 나뉘기도 하며, 조직의 기능적 단위를 모사하는 형태를 띤다. 스페로이드 배양은 동물이나 인체 조직이 가지고 있는 고유 형태나 성질이 비슷할 뿐만 아니라, 이를 적용하여 연구에 활용할 수 있는 플랫폼으로 개발되고 있다. 암세포를 이용하여 만들어진 스페로이드는 좀더 종양 조직과 유사한 형태를 띠어 항암제에 대한 효능이 평면배양된 암세포에 비해 좀 더 비슷한 결과를 보여준다. 간암 세포를 스페로이드로 배양할 경우, 2차 평면에서의 결과보다 더욱 in vivo 데이터와 가까운 간독성 실험결과를 얻을 수 있다고 보고되었다.
상기 (a) 단계의 동물은 인간을 제외한 포유류라면 그 종류에 특별히 제한이 없으며, 예컨대 비-인간 영장류, 쥐, 개, 고양이, 토끼, 말, 또는 소일 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 동물은 쥐일 수 있다.
상기 (b) 단계의 경동맥 화학색전술은 cTACE(conventional TACE), 또는 DEE-TACE(drug-eluting embolic TACE)일 수 있으며, 화학 요법제를 함께 투여하여 화학 요법제 분포를 평가할 수 있다. 또한, 3차원적 혈관 형태 평가를 위해 상기 경동맥 화학색전술 시행 이전에 렉틴을 주입하여 혈관을 염색할 수 있다.
상기 (b) 단계의 색전 물질은 리피오돌, 콜라겐, 트롬빈, 젤라틴, 알기닉산, 알기네이트, 초산 섬유소, 폴리아세트산비닐, 폴리에틸렌비닐알코올, 에틸렌-비닐알코올 공중합체, 폴리비닐 알코올, 폴리락트산, PLGA 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 이에 특별히 한정되지 않고, 상기 색전 물질은 화학 요법제가 복합화된 에멀젼 또는 화학 요법제가 복합화된 미소구체 형태로서 제공될 수 있다. 일 실시예로서 리피오돌을 이용한 에멀전 또는 PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) 기반의 미소구체 형태일 수 있다.
상기 (b) 단계의 화합 요법제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 독소루비신(DOX), 에피루비신, 시스플라틴, 및 미토마이신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 화학 요법제는 DOX일 수 있다.
cTACE 또는 DEE-TACE의 시행에 있어서, 상기 화학 요법제는 상기 색전 물질과의 복합체 형태일 수 있다. 예를 들면, cTACE에 있어서 화학 요법제는 조영제의 역할을 수행하는 리피오돌과 함께 에멀젼 형태로 제공되며, DEE-TACE에 있어서 화학 요법제는 PLGA와 같은 생분해성 고분자와 함께 미소구체 형태로 제공될 수 있다.
상기 (c) 단계는 간암 조직을 채취하여 조직을 투명화하는 단계이며, 알려진 조직 투명화 방법 또는 시스템을 제한 없이 사용할 수 있으며, 생체 조직의 투명화용 조성물을 이용하여 알려진 방법에 따라서 조직을 투명화하는 단계이다.
조직의 투명화는 상업화된 시스템 또는 실험실적인 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 본 발명에서는 일례로서 상업화된 시스템을 선택하여 수행하였다.
조직의 투명화를 위한 시스템으로서 하이드로겔을 통한 조직 구조화와 전기영동 방식을 통한 지질 제거 방식을 채용한 방법이 알려져 있고, 예시적으로 X-CLARITY™ 조직 투명화 시스템을 사용할 수 있다.
하이드로겔과 전기영동을 이용한 조직 투명화 방법은, 예시적으로,
(a`) 고정 용액으로 상기 동물의 간암 조직 시료를 고정시키는 단계;
(b`) 상기 간암 조직 시료 내에 하이드로겔을 침투시키는 단계; 및
(c`) 상기 간암 조직 시료를 투명화용 용액 내에서 전기영동하여 지질을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 고정 용액은 파라포름알데하이드일 수 있으며, 상기 간암 조직 시료를 고정시키는 단계는 0 내지 10℃, 12시간 내지 36시간 동안 진행될 수 있다.
상기 하이드로겔은 조직의 구조를 유지시킬 수 있는 것이면 제한 없이 가능하며, 하이드로겔의 침투를 원활하게 하기 위하여 단량체 또는 올리고머, 또는 비가교 상태로 침투시킨 후, 중합 또는 가교를 시키는 방법으로 침투시킬 수 있으며, 상기 간암 조직 시료 내에 하이드로겔을 침투시키는 단계는 0 내지 10℃, 12시간 내지 36시간 동안 진행될 수 있다.
상기 전기영동하여 지질을 제거하는 단계는 지질의 제거를 위하여 계면활성제를 포함하는 조성물 내에서 0.5 내지 1.5A의 전류 하에서 이루어질 수 있다.
상기 (d) 단계는 상기 투명화된 간암 조직 시료를 대상으로 화학 요법제의 분포를 평가하는 단계이다. 평가를 위하여, 상기 투명화된 간암 조직 시료를 3차원으로 이미징할 수 있다. 3차원 이미징화는 1차적으로 획득된 공초점 Z-스택 이미지를 3차원 영상으로 재구성하여 수행되며, 이때 재구성을 위하여 3차원 영상화를 위한 소프트웨어를 사용할 수 있다.
3차원으로 재구성된 이미지는 소프트웨어를 이용하여 사용된 화학 요법제의 조직 내 분포를 정량화할 수 있다. 화학 요법제 분포를 정량화할 때 사용하는 소프트웨어는 특별히 제한되지 않으나, 일례로 이마리스(Imaris) 프로그램을 이용할 수 있다. 화학 요법제 분포의 정량화를 위하여, 3차원 이미지 내에서 핵, 화학 요법제 및 혈관을 검출하고, 화학 요법제를 포함하는 암세포를 검출하며, 가장 가까운 혈관에서 화학 요법제가 포함된 암세포까지의 거리를 정량화할 수 있다.
화학 요법제 분포의 정량화는 화학 요법제의 양과 함께 위치가 3차원 이미지 내에 표시됨으로써, 경동맥 화학색전술의 시행 시 화학 요법제가 전달되는 정도를 평가할 수 있게 한다.
본 발명의 또 다른 측면은,
하기 단계를 포함하는, 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 병용 투여 필요성 평가 방법을 제공한다.
(a``) 간암 세포를 배양한 배양액 또는 상기 간암 세포를 기반으로 하는 스페로이드를 동물(인간 제외)에 이식하여 간암 조직을 형성하는 단계;
(b``) 색전 물질과 화학 요법제를 간동맥에 주입하는 경동맥 화학색전술을 시행하는 단계;
(c``) 상기 간암 조직을 채취하여 투명화하는 단계;
(d``) 상기 간암 조직 시료를 대상으로 색전 효과 및 화학 요법제의 분포를 평가하는 단계; 및
(e``) 색전 효과와 화학 요법제의 분포를 비교 평가하여 화학 요법제의 병용 투여 필요성을 평가하는 단계.
상기 병용 투여 필요성 평가 방법에 있어서, 전술한 화학 요법제 분포 평가 방법이 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
다음과 같이 본 발명을 위한 실험을 준비 및 실시하였다.
1. 동물 모델의 준비
1-1. 동물 모델
본 발명에 따른 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 기관 지침에 따라 수행되었다. 체중 400-450 g의 총 114마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐가 실험에 사용되었다. 쥐는 안정적인 온도(20-24℃)와 12시간 위상 변화가 있는 표준 명암 일정으로 동물 실험 시설에서 별도의 케이지에 유지되었다. HCC(간세포 암종)의 쥐 모델은 인간 HCC에 비해 저혈관성이기 때문에 N1S1 쥐 HCC 세포주(CRL-1604; ATCC, Manassas, VA, USA)는 재조합 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A) cDNA를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염되었다. 각 쥐는 zolazepam(5 mg/kg, Zoletil; Virbac, Carros, France)과 xylazine(10 mg/kg, Rompun; Bayer Schering, Berlin)의 혼합물을 주입하여 종양 이식 전에 마취되었다. 미니 개복술 후 RPMI-1640에서 유지되는 5 × 106 VEGF-형질감염된 N1S1 세포를 간에 주사하였다. 절개 부위는 2중 봉합술로 봉합하였고, 수술 후 통증은 2일 동안 멜록시캄(2 mg/kg/day)을 피하 주사하여 관리하였다. 자발적인 종양 퇴행을 방지하기 위해 종양 이식 1일 전부터 수술 후 2일까지 사이클로스포린 A(20mg/kg/day)를 피하 투여했다.
1-2. 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging)
종양 유도 14일 후 자기공명영상(MR)을 통해 직경 1.0~1.5cm 종양의 성장을 확인하였다. 3.0-Tesla MR 스캐너(TrioTim; Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany)와 6채널 쥐 몸체 코일(Stark Contrast, Erlangen, Germany)을 사용하여 축 T2 강조 이미지를 얻었다. 반복 시간/에코 시간: 3800 /78ms; 대역폭: 199Hz; 슬라이스 두께: 2mm; 시야각: 120 × 109 mm; matrix: 256 × 197. 축상 영상에서 가장 긴 직경으로 측정한 종양 크기가 1.0cm 미만 또는 1.5cm보다 크거나 혈관 침범이 있는 경우 쥐는 추가 실험에서 제외되었다.
2. 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행을 위한 재료 준비
2-1. Ru와 DOX의 방출 프로필 비교
DOX는 경동맥 화학색전술에 대해 가장 자주 사용되는 화학 요법제이지만, DOX는 CLARITY 조직 제거 및 3차원 이미징 시스템에서 식별할 수 없으므로, 본 발명의 일 실시예에서 종양 내 약물 분포의 3차원 평가에 Ru가 사용되었다. 따라서 Ru와 DOX의 약물 방출 프로필을 비교하여 Ru가 DOX를 대신할 수 있는지 여부를 결정했다.
DOX-PLGA, Ru-PLGA 및 두 가지 요오드화 양귀비씨 오일(Lipiodol Ultra-Fluid; Guerbet, Villepinte, France) 에멀젼의 시험관 내 약물 방출 프로필을 비교했다. DOX 또는 Ru이 로딩된 PLGA 및 에멀젼의 구체적인 제조 방법은 하기 2-2와 2-3에 기재하였으며, 방출 프로필 비교 방법은 다음과 같다.
DOX-Lip(DOX 3.3mg에 해당), Ru-Lip(Ru-NH2 1.3mg에 해당), DOX-PLGA(DOX 0.22mg에 해당) 및 Ru-PLGA(DOX 0.13mg에 해당)의 분취량 Ru-NH2)를 개별 Spectra/Por® 투석 막(분자 컷오프 12-14 KDa)에 각각 로딩했다. 튜브를 30 mL의 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 담그고 100rpm으로 회전하는 진탕조(37°C)에서 인큐베이션했다. 미리 결정된 시간(0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 및 24시간)에 부분 표본(0.5 mL)을 수집하고 동일한 부피의 새로운 PBS로 교체했다. 방출된 DOX 또는 Ru-NH2의 양은 UV-Vis 분광법(Evolution 60; Thermoscientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 결정되었다. DOX 및 Ru-NH2의 흡광도는 각각 480 및 461 nm의 파장에서 검출되었으며, 약물 방출 프로필 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 보면, DOX-Lip과 Ru-Lip은 모두 점진적인 약물 방출을 나타낸 반면, DOX-PLGA와 Ru-PLGA는 초기 폭발 후 상대적으로 지속되는 약물 방출을 나타내었다. 이와 같이 DOX와 Ru의 약물 방출 경향이 유사하므로, Ru가 DOX를 대신할 수 있는 것으로 평가된다.
2-2. DEE-TACE를 위한 미소구체의 준비
인간과 쥐의 크기 차이로 인해 시판되는 색전 물질은 HCC 쥐 모델에 사용하기에는 너무 클 수 있다. 따라서 S/O/W(Solid-in-oil-in-water) 에멀젼 공법을 통해 poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 기반의 작은 색전 물질을 만들어 본 발명의 실험에 활용하였다. 구체적인 제작 방법은 다음과 같다.
PLGA(40 ± 2 mg, m.wt: 66,000-107,000)를 아세톤(0.7 mL)에 용해하고 디메틸 설폭사이드(200 μL)에 2.9 mg의 Ru 또는 2 mg의 DOX와 혼합했다. 고분자 혼합물을 100 mL 유리 비이커에 옮기고 유기 용매를 70℃에서 3시간 동안 질소 가스 흐름 하에 증발시켜 Ru 또는 DOX가 로딩된 PLGA 필름 층을 형성하였다. 필름층을 1 mL의 디클로로메탄(DCM)에 녹이고 20 mL의 1% 폴리비닐알코올(PVA)을 가하였다. 그런 다음, PVA 용액의 폴리머(에멀젼)를 3,200rpm에서 균질화기를 사용하여 30초 동안 교반했다. 약물-로딩된 PLGA 마이크로스피어를 360rpm에서 3시간 동안 교반하면서 경화되도록 하였다. 그 후, DCM 용매를 실온에서 천천히 증발시켰다. 약물이 로딩된 PLGA 입자를 50 mL 팔콘 튜브로 옮기고 5분 동안 5,000rpm에서 원심분리하여 입자를 수집했다. 그 다음, 입자를 5 L 원심분리 튜브에 옮기고 2,500rpm에서 1분간 원심분리하였다. 수집된 입자를 탈이온수로 3회 세척하였다. Ru 또는 DOX가 적재된 PLGA 펠릿을 탈이온수에 재현탁하고 입자를 동결건조기를 사용하여 24시간 동안 건조시켰다. 약물을 첨가하지 않고 위에서 언급한 동일한 합성 방법을 사용하여 bland PLGA 미소구체를 제조하였다.
도 3에 미소구체를 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과를 나타내었다. 도 3의 (A)와 (B)는 bland PLGA 및 Ru-PLGA를 관찰한 것이며, 각각 평균 크기가 9 및 11 μm인 균일한 구형 미소구체인 것을 확인할 수 있다.
2-3. cTACE를 위한 에멀젼의 준비
에멀젼의 경우 DOX 또는 Ru를 요오드화 양귀비씨 오일(Lipiodol Ultra-Fluid; Guerbet, Villepinte, France)과 1:2 부피 비율(각각 DOX-Lip 및 Ru-Lip)로 혼합하여 제조하였다.
2-4. 경동맥 색전술 또는 화학색전술의 시행
모든 절차는 X선 형광투시 가이드 하에 중재방사선 전문의가 수행했다. 단일 종양(크기 1.0-1.5cm)이 있는 쥐에게 자기공명 영상 촬영 1일 후에 cTACE, DEE-TACE, TAE 또는 허위 절차(shame procedure)를 시행하였다. 종양유도수술과 동일한 방법으로 마취를 유도한 후 좌측 총경동맥을 노출시키고 18-gauge 혈관카테터로 천자하고 1.7-Fr 마이크로카테터(Progreat lambda; Terumo Medical Corporation, Tokyo, Japan)로 카테터를 삽입하였다. 동맥 경련을 피하기 위해 마이크로 카테터를 적절한 간동맥으로 조심스럽게 전진시키고 색전 물질을 주입하여 전방 혈류의 완전한 정지를 달성했다.
cTACE는 쥐당 0.2 mL의 화학 에멀젼(DOX-Lip 또는 Ru-Lip)과 0.3 mL의 요오드화 조영제(Visipaque 320; GE Healthcare, Chicago, IL, USA)와 혼합된 bland PLGA 미소구체(10 mg)를 사용하여 수행되었다. DEE-TACE의 경우 DOX-PLGA 또는 Ru-PLGA 15mg을 조영제 0.5mL와 혼합하고 적절한 간동맥을 통해 주입했다. TAE의 경우 15mg의 bland PLGA 미소구체가 동일한 방식으로 사용되었다. 모든 그룹에서 미리 정해진 양의 색전 물질을 주입한 후 디지털 감산 혈관 조영술을 수행했다. 종양 염색이나 진행성 혈류가 남아 있으면 폴리비닐 알코올 입자(Contour 45-150 μm; Boston Scientific, Marlborough, MA, USA)를 사용하여 완전한 정지를 달성하기 위해 추가 색전술을 수행했다. 적절한 간동맥 카테터 삽입 후 조영제 0.5mL를 주입하여 허위 절차를 수행했다.
<실시예 1> 화학 요법제 분포 평가
1-1. 조직 샘플링 및 투명화
화학 요법제의 분포를 평가하기 위해 쥐의 동맥을 통해 치료하는 동안 화학색전술 10분 전에 적절한 간동맥을 통해 Dylight 649 Lycopersicon esculentum(토마토) 렉틴 1mL(1mg/1mL)를 투여하여 혈관을 염색했다. 핵을 염색하기 위해, 제거된 종양 조직을 Hoechst 33342 염색 용액(1:100 희석; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 37℃에서 24시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
6마리의 종양 보유 쥐를 각 처리 그룹(cTACE, DEE-TACE 및 TAE)에 2마리씩 할당하고 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 6시간, 24시간 및 7일 후에 안락사시켰다. 경동맥 색전술 또는 화학색전술의 시행 방법은 전술한 바와 같다. 쥐에서 종양을 채취하고 1x PBS(phosphate-buffered saline)로 두 번 헹구고 4% paraformaldehyde에 4℃에서 24시간 동안 고정시켰다. 고정된 종양을 1mm 두께로 절단하고 하이드로겔 단량체가 샘플 전체에 고르게 퍼질 수 있도록 4°C에서 24시간 동안 X-CLARITYTM 하이드로겔 용액(Logos Biosystems, 경기도, 한국)에 담그었다. 다음으로, 샘플 튜브에 질소 가스를 5분 동안 펌핑하여 산소를 제거한 후 샘플을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 하이드로겔 중합을 개시하였다. 중합 후, 조직을 1x PBS로 헹구고 X-CLARITYTM 조직 제거 시스템(한국 경기도 안양시 로고스 바이오시스템즈)에 넣었다. 이 시스템은 조직에서 지질 제거를 촉진하기 위해 나트륨 도데실 설페이트를 포함하는 전기영동 조직 제거 용액(Logos Biosystems)으로 순환되었다. 샘플을 투명해질 때까지 5.5시간 동안 0.9A의 전류로 37°C에서 인큐베이션했다. 제거 후, 조직을 37℃에서 1일 동안 1x PBS로 세척하여 잔류하는 나트륨 도데실 설페이트를 제거하였다.
1-2. 3차원 이미지의 획득
투명화된 종양 조직을 0.2% PBS-T(1x PBS 및 0.2% Triton X-100)로 37℃에서 밤새 세척하였다. 그 후, 샘플을 이미징 및 보관을 위해 실온에서 6시간 동안 X-CLARITYTM 마운팅 용액(굴절률 = 1.46, Logos Biosystems)에 넣었다. 10×/0.40 DRY 대물렌즈(HC PL APO CS, Leica Microsystems)가 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경(TCS SP8 DMI8-CS; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 이미지를 획득했다. Z-스택 기능은 종양 조직에서 3차원 형광 이미지를 캡처하는 데 사용되었다(단계 크기: 8μm; 스캔 깊이: 300-500μm; Hoechst 33342: 405 nm: Ru: 488 nm; 혈관 여기 파장: 633 nm).
1-3. 화학 요법제의 분포 평가를 위한 이미지 분석
3차원으로 재구성된 이미지는 이마리스(Imaris) 소프트웨어 버전 9.3.0(Bitplane AG, Zurich, Switzerland)을 사용하여 처리되었다. 먼저, 획득한 공초점 Z-스택 이미지를 소프트웨어를 통해 3차원 형식으로 재구성한 다음 분할 및 거리 변환을 수행하여 약물 분포를 정량화했다. Ru-Lip 또는 Ru-PLGA의 핵 부피, Ru 및 혈관은 별도로 얻었다. 채널 1: 핵(파란색); 채널 2: Ru(녹색); 및 채널 3: 혈관(빨간색). 핵을 정량화하기 위해 가이드 크기가 3.6 μm인 핵 반점을 선택하여 핵을 분할했다. 핵 반점 검출에 사용되는 가이드 매개변수는 슬라이스 뷰의 측정 기능을 기반으로 결정되었다. 그 후, 표면 함수에서 광학 필터 값으로 평활화한 후 수동으로 선택된 임계값을 사용하여 혈관을 분할했다. 마찬가지로 Ru-Lip 또는 Ru-PLGA 신호는 다른 표면 기능의 광학 필터 값으로 평활화한 후 수동으로 선택한 임계값을 사용하여 분할되었다. 그 후, Ru의 분할 이미지(5μm 이내)로 둘러싸인 핵 반점을 선택하여 Ru를 차지하는 암세포를 식별했다. 마지막으로 Ru에 가까운 반점이 있는 분할된 혈관 외부에 3차원 유클리드 거리 변환이 자동으로 생성되어 가장 가까운 혈관에서 Ru가 포함된 암세포까지의 거리를 계산했다. 소프트웨어에서 결정된 거리 변환을 스프레드시트(Excel; Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA)로 내보내고 다른 그룹의 데이터를 비교하여 그래프를 생성했다. Ru를 흡수한 종양 세포의 수는 10 μm마다 획득되었고 백분율 값은 10 μm마다 플롯되었다. 그 결과를 도 4a 내지 도 6f에 나타내었다.
도 4a 및 4b는 각각 cTACE 시행 6시간 및 24시간 후 화학 요법제의 3차원 분포를 나타내며, 도 5a 및 도 5b는 각각 DEE-TACE 시행 6시간 및 24시간 후 화학 요법제의 3차원 분포를 나타낸다. 이때 도 4a 내지 도 5b에서 a)는 혈관, Ru, 및 염색된 핵(Hoechst-blue)이 있는 암 세포의 분포를 보여주는 전체 볼륨의 3차원 형광 이미지가 중첩된 것이다. b)는 형광 표지된 렉틴으로 염색된 혈관(적색), c)는 Ru(녹색)의 3차원 분포를 나타낸 것이다. d)는 혈관과 Ru의 공간적 관계를 보여주는 병합 이미지이며, 혈관 내 Ru는 노란색으로 표시된다. e)는 b)의 점선 영역을 확대한 것이며, f)는 Ru와 가장 가까운 혈관 사이의 거리를 계산하기 위하여 재구성한 3차원 이미지이다. 5 μm 이내의 핵 및 Ru 형광의 공동 국소화는 반점으로 표시되었고, 스펙트럼 색상은 가장 가까운 혈관으로부터의 거리를 반영하였다. 융합 이미지는 확대된 스팟 분포와 해당 원본(raw) 이미지를 보여주었다. 모든 스케일 바는 200 μm이다.
도 4a 내지 도 5b를 보면, Ru는 대부분 혈관 근처에 존재했으며, 종양 내 혈관 구조는 cTACE 6시간 후(도 4a e))에 비해 cTACE 24시간 후(도 4b e)) 더 많이 손상되는 것으로 관찰되었다. 종양 내 혈관 손상은 cTACE보다 DEE-TACE에서 더 심각했다(도 5b e)). cTACE의 경우 Ru와 가장 가까운 혈관 사이의 최대 거리는 화학색전술 시행 6시간과 24시간 뒤 각각 82 및 115 μm였다. DEE-TACE의 경우 Ru와 가장 가까운 혈관 사이의 최대 거리는 화학색전술 시행 6시간과 24시간 뒤 각각 101 및 206 μm 였다.
도 6a 내지 도 6f는 cTACE 및 DEE-TACE 시행 후 가장 가까운 혈관으로부터 화학 요법제가 흡수된 종양 세포 사이의 거리를 나타낸 것이다. 도 6a 내지 도 6d는 각각 cTACE 시행 6시간, 24시간 후 및 DEE-TACE 시행 6시간, 24시간 후 Ru를 포함하는 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 도 6e 및 도 6f는 Ru를 포함하는 암세포의 누적 백분율 측면에서 가장 가까운 혈관으로부터의 거리를 나타내는 직렬 막대 그래프로서, 검정, 빨강, 파랑 및 분홍색 막대는 각각 Ru 함유 암 세포의 누적 백분율의 50, 70, 80 및 95%를 나타낸다.
도 6a를 보면, cTACE 시행 6시간 후에 Ru를 흡수한 종양 세포의 98%가 혈관의 50 μm 내에서 관찰되었다. 도 6b를 보면, cTACE 후 24시간에 Ru를 흡수한 종양 세포의 98%-99%가 혈관에서 80 μm 거리 내에 분포했다. 도 6c를 보면, DEE-TACE 시행 6시간 후에 Ru를 흡수한 종양 세포의 96%-98%가 혈관의 60 μm 내에서 관찰되었다. 도 6d를 보면, DEE-TACE 시행 24시간 후에 Ru를 흡수한 종양 세포의 95%-99.5%가 혈관의 최대 110 μm 내에서 관찰되었다. 도 6e 및 도 6f를 통해 혈관 손상이 심한 DEE-TACE의 경우 Ru이 이동한 거리가 증가한다는 것을 알 수 있다.
<실시예 2> 시간 의존적 색전 효과의 평가
39마리의 종양이 있는 쥐를 4개의 그룹으로 나누었다(cTACE [n = 12], DEE-TACE [n = 12], TAE [n = 12] 및 허위 절차 [n = 3]). 각 처리군에서 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 후 3시간, 6시간, 24시간, 7일에 각각 3마리의 쥐를 안락사시켰다. 경동맥 색전술 또는 화학색전술의 시행 방법은 전술한 바와 같다. 동맥경화 치료 후 응고 괴사 과정을 평가하기 위해 종양을 채취하였다. 조직을 10% 완충 포름알데히드 용액에 고정하고 파라핀을 포매하였다. 그 후, 절편을 종양의 중심을 통해 슬라이스한 다음 hematoxylin & eosin(H&E) 및 말단 deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL)을 사용하여 염색했다. 전체 조직학 섹션은 정량적 분석을 위해 디지털화되었다. 치료군 배정을 맹검한 병리학자가 동일한 피험자의 H&E 염색 영상을 참조하여 TUNEL 염색 영상을 이용하여 인접 간 종양을 분할하고, ImageJ(버전 1.53c, 미국 메릴랜드 베데스다 국립보건원) 사용하여 색분할에 따라 종양 괴사 부분(%)을 계산하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7을 보면, 허위 절차를 시행한 동물의 종양에서 평균 괴사율은 9.4%였고, 경동맥 색전술 또는 화학색전술의 유형에 관계없이 시행 후 3시간에서 24시간 사이에 종양 세포 사멸이 광범위하게 진행됨을 알 수 있다. 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 3시간, 6시간, 24시간 및 7일 후 종양 괴사율은 3.3-21.9, 10.9-30.5, 85.3-97.2, 88.0-96.9%였다(3시간, 6시간, 24시간 및 7일에 각각 p = .430, .733, .432, .561).
상기 실시예 1 및 2의 결과를 통해, 화학 요법제는 경동맥 화학색전술 시행 후 24시간 동안 전체 종양을 덮기에는 불충분한 짧은 거리를 이동한 반면, 24시간 이내에 종양 전체의 괴사가 이루어져, 본 발명의 실시예에 따른 화학 요법제는 병용 투여의 필요성이 낮은 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 평가 방법은 화학 요법제의 3차원적 분포, 이동 거리 및 이로 인한 화학 요법제의 병용 투여 필요성 평가에 유용할 것이 기대된다.
<실시예 3> 면역 원성 반응의 평가
3-1. 초기 면역 반응의 평가
경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 후 초기 면역 반응을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용했다. 24마리의 종양이 있는 쥐를 4개의 그룹(cTACE, DEE-TACE, TAE 및 허위 절차; 그룹당 n = 6)으로 나누고 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 24시간 후에 종양을 채취했다. 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 방법은 전술한 바와 같다. 새로 수집한 표본을 즉시 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 옮기고 6mL의 RPMI-1640에서 가위를 사용하여 잘게 썰었다. RPMI-1640 50 mL + 콜라게나제 D 100 mg(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) + DNase I(Sigma-Aldrich, Munich, Germany) 10 mg을 포함하는 소화 용액을 준비된 샘플에 첨가하고, 튜브를 37℃에서 1시간 동안 120rpm에서 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플을 70μm 셀 스트레이너로 여과하고 15℃에서 2,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 그런 다음 세포 펠렛을 DPBS로 세척하고 실온에서 5분 동안 1X RBC 용해 완충액(Biolegend, San Diego, CA, USA)으로 처리했다. 세포를 DPBS로 다시 세척하고 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액(DPBS, 1% 소태아혈청 및 0.1% 아지드화나트륨)으로 처리하였다. 세포 내 마커(인터루킨[IL]-17A 및 인터페론[IFN]-γ)를 검출하기 위해 2 × 106 세포의 분취량을 각 웰에 넣은 다음 1 mg/mL의 PMA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 25 μg/mL의 이오노마이신(Sigma-Aldrich) 및 10 mg/mL의 brefeldin A 용액(Sigma-Aldrich)에 3시간 동안 반응시켰다. 이어서, 세포를 2% 파라포름알데히드 완충액에 고정하고 10분 동안 0.1% 트리톤 X-100(Sigma Aldrich)을 포함하는 투과성 버퍼를 처리하였다. 세포를 혼합 항체 세트로 염색하고, FACS 완충액으로 희석하고, 빛을 차단하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 염색된 세포는 유세포 분석기(Attune NxT; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 FlowJo V10(Tree Star Inc., Ashland, OR, USA)에 의해 분석되었다. 유세포 분석에 사용된 항체는 표 1에 나타내었으며, 분석 결과는 도 8의 A 내지 G에 나타내었다.
항목 마커 항체 제조사 카탈로그 번호
CD32 FC Purified Mouse Anti-Rat CD32 Clone D34-485/0.5mg BD Bioscience 550271
CD3 1F4 APC anti-rat CD3 Antibody Biolegend 155606
CD4 OX-35 FITC anti-rat CD4 (domain 2) Antibody Biolegend 203305
CD8 OX-8 PerCP anti-rat CD8a Antibody Biolegend 201712
CD45 OX-1 PE/Cyanine7 anti-rat CD45 Antibody Biolegend 202214
Granulocyte HIS48 FITC Mouse Anti-Rat Granulocytes BD Bioscience 554907
F4/80 BM8.1 F4/80 Rat mAb (redFluor(TM) 710 Conjugate) cell signaling 94009
CD172a OX-41 PE anti-rat CD172a (SIRPα) Antibody Biolegend 204706
MHC Class II M5/114.15.2 MHC Class II (I-A/I-E) Rat mAb (APC Conjugate) cell signaling 64776S
IL-17 17B7 Anti-Mouse/Rat IL-17A PE biogems 73812-60
IFN-γ DB-1 PE anti-rat IFN-γ　Antibody Biolegend 507806
도 8에서 A 내지 G는 허위 절차, cTACE, DEE-TACE 및 TAE 시행 후 각각 CD4 T 세포, IL-17+ CD4 T 세포, 과립구, M1 대식세포, M2 대식세포, IFN-γ+ CD8 세포, 및 단핵구의 백분율을 나타낸 것이다.도 8을 보면, CD4 T 세포의 백분율은 허위 절차 그룹과 비교하여 cTACE, DEE-TACE 및 TAE 그룹에서 유의하게 증가했다(p = .003). 그러나 세 가지 그룹 간에는 유의한 차이가 없었다. 전체 CD4 T 세포 중 IL-17+ CD4 T(Th17) 세포의 백분율은 허위 절차 그룹에 비해 cTACE 그룹에서 유의하게 증가했으며, DEE-TACE 및 TAE 그룹에서 추가로 증가했다(p = .002). 과립구(p = .002) 및 M1 대식세포(p = .002)의 백분율도 cTACE, DEE-TACE 및 TAE 시행 후에 유의하게 증가했다. M2 대식세포의 비율은 cTACE 및 TAE 후에 유의하게 증가했지만, DEE-TACE 후에는 증가가 유의하지 않았다(p = .001). 분석된 모든 면역 세포에서 DEE-TACE와 TAE 그룹 간에는 유의한 차이가 없었다.
3-2. 잔류 면역 반응의 평가
초기 단계 이후의 잔류 면역 반응은 면역조직화학(IHC)에 의해 평가되었다. 24마리의 종양이 있는 쥐를 4개의 그룹(cTACE, DEE-TACE, TAE, 허위 절차, 그룹당 n = 6)으로 나누고 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 7일 후에 종양을 채취했다. 경동맥 색전술 또는 화학색전술 시행 방법은 전술한 바와 같다. 조직을 10% 완충된 포름알데히드에 고정하고 파라핀을 삽입하고 H&E, CD4 및 CD8 염색을 위해 종양 중앙을 가로질러 슬라이스했다. 염색된 섹션은 Aperio ScanScope(Aperio Technologies, Vista, CA, USA)를 사용하여 스캔되었고, CD4+ 및 CD8+ 종양 침윤 림프구(TIL)는 수정된 핵 면역조직화학 알고리즘을 사용하여 계산되었다. 병리학자가 조직을 평가하고 종양당 3개의 면역학적 핫스팟을 선택했다. 얼룩 양성은 알고리즘에 따라 0, 1+, 2+ 또는 3+로 기록되었으며, 병리학자는 2+ 및 3+ 점수 셀에서 위양성을 제외했다. CD4+ 및 CD8+ TIL의 밀도는 2+ 및 3+ 스코어링된 세포의 총 수(가양성 제외)를 총 면적(mm2)으로 나눈 값으로 계산되었으며, 3개의 핫스팟의 평균을 각 종양의 대표 값으로 사용했다. 그 결과는 도 8의 H 내지 K에 나타내었다.
도 8의 H 내지 K는 경동맥 화학색전술 시행 7일 후 종양 침윤 림프구(TILs)를 나타낸 것이다. 구체적으로, H 및 I에 각각 CD4+ TIL 과 CD8+ TIL의 밀도를 나타내었다. J 및 K에는 a) 허위 절차, b) cTACE, c) DEE-TACE, d) TAE 시행 후 종양의 대표 이미지를 나타내었다.
도 8의 H 내지 K를 보면, 경동맥 화학색전술의 유형은 종양에서 림프구 동원에 유의한 영향을 미치지 않은 것을 알 수 있다. 세 치료 그룹과 허위 절차 그룹 사이에 CD4+ TIL 밀도에는 유의한 차이가 없었다(p = .354). CD8+ TIL 밀도는 세 치료 그룹에서 비슷했지만, 허위 절차 그룹에서 유의하게 더 높았다(p = .008). 이를 통해 본 발명의 평가 방법은 경동맥 화학색전술 시행 후 색전 효과나 화학 요법제 분포뿐만 아니라, 면역 원성 반응 평가에도 유용함을 알 수 있다.
통계 분석
종양 크기, 유세포 분석에서 얻은 면역 세포 수 및 그룹 간의 조직학적 데이터(TUNEL, IHC)를 Kruskal-Wallis 테스트와 사후 Conover 테스트로 비교했다. 초기 및 잔류 면역 반응 실험을 위한 동물의 수는 자원 방정식 접근법에 따라 결정되었다. 양측 p 값 < .05는 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다. 모든 통계 분석은 상용 통계 소프트웨어(MedCalc, 버전 19.6; MedCalc Software, Ostend, Belgium)를 사용하여 수행되었다.

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는, 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 분포 평가 방법:
    (a) 간암 세포를 배양한 배양액 또는 상기 간암 세포를 기반으로 하는 스페로이드를 동물(인간 제외)에 이식하여 간암 조직을 형성하는 단계;
    (b) 색전 물질과 화학 요법제를 간동맥에 주입하는 경동맥 화학색전술을 시행하는 단계;
    (c) 상기 간암 조직을 채취하여 투명화하는 단계; 및
    (d) 상기 간암 조직 시료를 대상으로 화학 요법제의 분포를 평가하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 간암 조직 시료를 대상으로 색전 효과를 평가하는 단계를 더 포함하는, 평가 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 간암 조직 시료를 대상으로 면역 원성 반응을 평가하는 단계를 더 포함하는, 평가 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역원성 반응 평가는 초기 면역 반응 또는 잔류 면역 반응 평가인 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 동물은 쥐인 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 색전 물질은 리피오돌 또는 PLGA 기반의 색전 물질인 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 화학 요법제는 DOX(독소루비신), 에피루비신, 시스플라틴, 및 미토마이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 경동맥 화학색전술은 cTACE(conventional TACE), 또는 DEE-TACE(drug-eluting embolic TACE)인 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 조직을 투명화하는 단계는,
    (a`) 고정 용액으로 상기 동물의 간암 조직 시료를 고정시키는 단계;
    (b`) 상기 간암 조직 시료 내에 하이드로겔을 침투시키는 단계; 및
    (c`) 상기 간암 조직 시료를 투명화용 용액 내에서 전기영동하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 평가 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 상기 투명화된 간암 조직 시료를 3차원 이미징하여 화학 요법제의 분포를 평가하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (d) 단계는 이마리스(Imaris) 프로그램을 이용하는 것을 특징으로 하는, 평가 방법.
  12. 하기 단계를 포함하는, 화학 요법제를 병용 투여하는 경동맥 화학색전술 시행 시 화학 요법제의 병용 투여 필요성 평가 방법:
    (a``) 간암 세포를 배양한 배양액 또는 상기 간암 세포를 기반으로 하는 스페로이드를 동물(인간 제외)에 이식하여 간암 조직을 형성하는 단계;
    (b``) 색전 물질과 화학 요법제를 간동맥에 주입하는 경동맥 화학색전술을 시행하는 단계;
    (c``) 상기 간암 조직을 채취하여 투명화하는 단계;
    (d``) 상기 간암 조직 시료를 대상으로 색전 효과 및 화학 요법제의 분포를 평가하는 단계; 및
    (e``) 색전 효과와 화학 요법제의 분포를 비교 평가하여 화학 요법제의 병용 투여 필요성을 평가하는 단계.
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