KR20230110090A - Method for detecting Hook effect by using free antigen in immunoassays - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 이용하여 면역검정법의 성능 및 진단 정확성이 향상된 후크 효과 감지 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a hook effect detection method with improved performance and diagnostic accuracy of an immunoassay using the same free target material as a target material.
Description
본 발명은 유리 항원을 이용하여 면역 검정법의 성능 및 진단 정확성 향상을 위한 후크 효과를 감지하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting the hook effect for improving the performance and diagnostic accuracy of an immunoassay using free antigen.
면역 검정법(immunoassay)은 분석하고자 하는 샘플에서 특정 물질을 확인하고 측정하기 위해 항원-항체 간의 특이적 결합에 기반한 면역 검사 방법으로서, 과도한 항원 또는 항체로 인하여 발생하는 후크 효과(Hook effect)에 의해 영향을 받는다. Immunoassay is an immunoassay method based on specific antigen-antibody binding to identify and measure a specific substance in a sample to be analyzed, and is affected by the Hook effect caused by excessive antigen or antibody.
상기 후크 효과(Hook effect)는 여러 면역학적 및 혈청학적 분석법에 널리 공지되어 있는 일반적인 현상이고, 임상 실험실에서 빈번하게 발생하는 문제로서, 이를 감지하는데는 많은 어려움이 있다. 특히, 면역 검정에서 후크 효과는 위음성(false negative)의 원인이 되어 정확한 진단 및 치료의 방해가 되므로, 의학적 측면에서 심각한 문제를 야기할 수 있다. 따라서, 샘플에 대한 면역 검정에서 후크 효과를 방지하고 유효한 결과를 얻기 위하여 검사하고자 하는 단일 샘플에 대한 다수의 검정이 수행될 필요가 있다.The hook effect is a common phenomenon widely known in various immunological and serological assays, and as a problem that frequently occurs in clinical laboratories, it is difficult to detect it. In particular, since the hook effect in an immunoassay causes false negatives and interferes with accurate diagnosis and treatment, it can cause serious problems in terms of medicine. Therefore, multiple assays for a single sample to be tested need to be performed in order to avoid the hook effect and obtain valid results in the immunoassay for the sample.
이러한 문제를 극복하기 위하여, 일부 연구에서는 면역 검정법 중 하나인 측방유동면역분석법(lateral flow immunoassays, LFIAs)에서 성분의 방출을 지연시키거나(delayed-release components), 대조선(control line)을 사용하는 방법, 또는 스파이크 샘플(spiking sample)을 사용하는 방법을 통해 후크 효과를 감소시키고자 하였다. 그러나, 성분의 방출을 지연시키는 방법은 오직 측방유동면역분석법(LFIAs)에만 적용가능하고, 중간 패드(intermediate pad), 접합 패드(conjugation pad) 및 별도의 멤브레인과 같은 부가적인 재료들을 필요로 하며, 및 대조선을 이용하는 방법 또한 측방유동면역분석법(LFIAs)에 국한되어 있고, 다른 종류의 추가적인 항체의 사용을 필요로 한다. 또한, 스파이크 샘플(spiking sample)를 사용하는 방법은 반응 시간에 따른 성능 편차가 고려되어야 하고, 더욱이, 대조선 및 스파이크 샘플을 이용하는 방법은 임상적 검증의 성능 및 후크 효과의 검출 범위를 개선하기 위한 추가적인 연구가 필요한 실정이다.In order to overcome this problem, some studies have delayed the release of components in lateral flow immunoassays (LFIAs), one of the immunoassay methods, or used a control line. Or a method using a spiked sample (spiking sample) was attempted to reduce the hook effect. However, the method of delaying the release of a component is applicable only to lateral flow immunoassays (LFIAs), requires additional materials such as intermediate pads, conjugation pads and separate membranes, and methods using control lines are also limited to lateral flow immunoassays (LFIAs) and require the use of additional antibodies of different types. In addition, the method using the spiked sample should consider the performance deviation according to the reaction time, and furthermore, the method using the control line and the spiked sample improves the performance of the clinical verification and the detection range of the hook effect. Additional research is needed.
특히, 면역 검정법은 체외진단 의료기기(in vitro diagnostics, IVD)에 적용하여 현장 진료(Point-of-care, POC)에 많이 이용되는데, 후크 효과로 공지된 간섭 현상으로 인해 의료 진단 분야에 부정적인 영향을 미치는 것으로 관찰된다. 이러한 후크 효과를 방지하여 유효한 결과를 얻고자 이전 연구들을 현장 진료에 적용하였고, 현재 주로 상업화된 IVD 제품에는 시약 완충액(reagent buffer)을 이용하여 샘플을 희석하는 방법이 이용되고 있다. 이는 분석하고자 하는 샘플에 대한 후크 효과를 감지하기 위하여 희석된 샘플 및 희석되지 않은 샘플을 사용하여 두 가지 검사를 수행함으로써 이루어지나, 상기 방법은 막대한 시간과 노력을 필요로 하고, 및 분석에 사용되는 시약의 비용적 측면에서도 문제를 발생시킨다. 또한, 분석 샘플 이외의 별도의 샘플을 준비해야 하는 불편함이 있을 뿐 아니라, 처리과정 중 오류가 발생할 수 있어 오히려 부정확한 결과를 초래할 수 있으므로 근본적인 해결책으로 보기는 힘들다In particular, the immunoassay method is applied to in vitro diagnostics (IVD) and is widely used in point-of-care (POC). In order to obtain effective results by preventing such a hook effect, previous studies have been applied to point-of-care treatment, and a method of diluting a sample using a reagent buffer is used in currently commercialized IVD products. This is done by performing two tests using diluted and undiluted samples to detect the hook effect on the sample to be analyzed, but the method requires a great deal of time and effort, and also causes problems in terms of cost of reagents used for analysis. In addition, it is inconvenient to prepare a separate sample other than the analysis sample, and it is difficult to see it as a fundamental solution because errors may occur during the processing process, which may lead to inaccurate results.
그러므로, 면역 검정법에서의 진단 정확성에 심각한 문제를 초래하는 후크 효과를 미연에 감지하여 유효한 결과를 얻을 수 있도록 임상 실험실에서뿐 아니라, 상업적 측면의 직접적인 현장 진료에도 효과적으로 적용할 수 있는 더 나은 후크 효과 감지 방법을 개발할 필요가 있다.Therefore, it is necessary to develop a better hook effect detection method that can be effectively applied not only in clinical laboratories but also in direct point-of-care in commercial aspects so that effective results can be obtained by detecting hook effects that cause serious problems in diagnostic accuracy in immunoassays in advance.
본 발명자들은 면역 검정법에서의 진단 정확성에 심각한 문제를 초래하는 후크 효과를 미연에 감지하고자 임상 실험실에서뿐 아니라, 상업적 측면의 직접적인 현장 진료에도 효과적으로 적용할 수 있는 후크 효과 감지 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유리 물질을 이용하여 면역 검정법에서의 후크 효과 감지 방법을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have intensively researched to develop a hook effect detection method that can be effectively applied not only in clinical laboratories but also in direct point-of-care in commercial aspects in order to detect hook effects that cause serious problems in diagnostic accuracy in immunoassays in advance. As a result, the present invention was completed by identifying a hook effect detection method in an immunoassay using a glass material.
따라서, 본 발명의 목적은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 이용하여 면역 검정법에서 효과적으로 후크 효과를 감지하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for effectively detecting the hook effect in an immunoassay using the same free target material as a target material.
본 발명의 다른 목적은 별도의 물질을 추가하지 않고 후크 효과를 감지하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting the hook effect without adding a separate material.
본 발명의 또 다른 목적은 별도의 시료를 희석하는 과정 없이 후크 효과를 감지하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting the hook effect without a separate sample dilution process.
결과적으로, 본 발명의 목적은 임상 실험실에서뿐 아니라, 직접적인 현장 진료에 있어서 후크 효과를 미연에 감지하여 진단 정확성을 높이는 방법을 제공하는 것이다. As a result, an object of the present invention is to provide a method for improving diagnosis accuracy by detecting hook effect in advance not only in clinical laboratories but also in direct point-of-care.
본 발명에서는 면역 검정법에서 효과적으로 후크 효과를 감지하기 위한 후크 효과 감지 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 목표 검출물질과 동일한 유리 물질을 이용하여 미연에 후크 효과를 감지하여 면역 검정법의 진단 정확성의 향상을 규명하였다.In the present invention, an attempt was made to develop a hook effect detection method for effectively detecting the hook effect in an immunoassay. As a result, the improvement in diagnostic accuracy of the immunoassay was identified by detecting the hook effect in advance using the same glass material as the target detection material.
본 발명은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하여 후크 효과 유무를 감지할 수 있는 면역 검정법에 관한 것이다.The present invention relates to an immunoassay method capable of detecting the presence or absence of a hook effect by first adding a free target material identical to a target material.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 후크 효과(Hook effect) 유무를 감지가능한 면역검정법(immunoassay)에 있어서, 상기 면역검정법에서 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하기 전에 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는, 면역검정법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, in an immunoassay capable of detecting the presence or absence of a hook effect, the present invention provides an immunoassay method in which a free target material identical to a target material is first added before adding a sample to be detected in the immunoassay to a detection container.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정법은 다음 단계를 포함한다:In one embodiment of the present invention, the immunoassay comprises the following steps:
i) 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하는 단계;i) adding a sample to be detected into a detection container;
ii) 면역검정에 필요한 시약을 검출 용기에 첨가하는 단계; 및 ii) adding reagents required for the immunoassay to the detection vessel; and
iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계.iii) performing measurement to detect the target detection substance.
본 명세서의 용어, "면역검정법(immunoassay)"은 항원-항체반응에 의한 응집반응 및 효소반응에 대해 탁도나 흡광도와 같은 광학적 성질의 변화에 기초하여 분석하고자 하는 시료 내 항원 또는 항체를 검출 또는 정량하는 방법을 의미한다. As used herein, the term "immunoassay" refers to a method of detecting or quantifying an antigen or antibody in a sample to be analyzed based on a change in optical properties such as turbidity or absorbance for an agglutination reaction and an enzymatic reaction by an antigen-antibody reaction.
본 명세서의 용어, "검출 용기"는 분석의 대상이 되는 목표 검출물질의 검출 및 정량을 위한 면역검정법을 수행할 수 있는 용기를 의미하며, 샘플의 양 및 사용하는 검출분석기기에 따라 6웰 플레이트, 12웰 플레이트, 24웰 플레이트, 48웰 플레이트, 96웰 플레이트, 또는 192웰 플레이트 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. As used herein, the term "detection vessel" refers to a vessel capable of performing an immunoassay for detection and quantification of a target detection substance to be analyzed, and may be selected from a 6-well plate, a 12-well plate, a 24-well plate, a 48-well plate, a 96-well plate, or a 192-well plate, depending on the amount of sample and the detection and analysis equipment used, but is not limited thereto.
본 명세서의 용어, "유리 물질"은 면역검정법의 목표 검출물질과 동일한 종류의 물질이나 검출대상 샘플에 들어있지 않고, 본 발명의 실시자가 검출 용기 내 추가로 첨가하는 물질을 의미한다.As used herein, the term "free material" refers to a material of the same kind as the target detection material of the immunoassay or a material that is not included in the sample to be detected and is additionally added to the detection container by the practitioner of the present invention.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 먼저 첨가되는 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)은 항원, 항체, 핵산, 화합물, 펩타이드, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the same free target material as the target material added first may be an antigen, antibody, nucleic acid, compound, peptide, or a combination thereof, but is not limited thereto.
상기 유리 물질은 일반적인 면역검정법에서 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하기 전에 첨가되고, 이러한 첨가과정을 스파이킹이라고 표현하기도 한다.The glass material is added before adding a sample to be detected in a detection vessel in a general immunoassay, and this addition process is sometimes referred to as spiking.
상기 유리 물질의 농도는 수행하는 면역검정법의 종류, 샘플 희석 배수, 및 항체 농도 등 다양한 요소에 따라 후크 효과 발생 여부가 달라질 수 있으므로, 이러한 요소들에 따라 최적화할 수 있다. The concentration of the free material may be optimized depending on the type of immunoassay to be performed, sample dilution factor, and antibody concentration, since the occurrence of the hook effect may vary depending on these factors.
또한, 상기 유리 물질의 농도는 구체적으로 후크 효과가 발생되는 표적물질의 농도를 상기 유리 물질의 농도로 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, as the concentration of the glass material, the concentration of the target material at which the hook effect occurs may be used as the concentration of the glass material, but is not limited thereto.
일반적으로 면역검정법에 의한 샘플 내 표적물질의 검출 또는 정량은 목표 검출물질에 대한 반응을 수행한 후, 1회 측정함으로써 수행된다.In general, detection or quantification of a target substance in a sample by an immunoassay is performed by performing a reaction on the target substance and then measuring it once.
반면, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정법은 상기 iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계에서 소정의 시간 간격을 두고 1차 측정 및 2차 측정을 수행한다.On the other hand, in one embodiment of the present invention, in the immunoassay, the first measurement and the second measurement are performed at predetermined time intervals in the step iii) measurement for detecting the target detection substance.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 소정의 시간 간격은 10초 내지 300초, 10초 내지 10분, 10초 내지 20분, 10초 내지 30분, 30초 내지 300초, 30초 내지 10분, 30초 내지 20분, 30초 내지 30분, 60초 내지 300초, 60초 내지 10분, 60초 내지 20분, 60초 내지 30분, 90초 내지 300초, 90초 내지 10분, 90초 내지 20분, 90초 내지 30분, 120초 내지 5분, 120초 내지 10분, 120초 내지 20분, 120초 내지 30분, 150초 내지 300초, 150초 내지 10분, 150초 내지 20분 또는 150초 내지 30분 또는 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In a specific embodiment of the present invention, the predetermined time interval is 10 seconds to 300 seconds, 10 seconds to 10 minutes, 10 seconds to 20 minutes, 10 seconds to 30 minutes, 30 seconds to 300 seconds, 30 seconds to 10 minutes, 30 seconds to 20 minutes, 30 seconds to 30 minutes, 60 seconds to 300 seconds, 60 seconds to 10 minutes, 60 seconds to 20 minutes, 60 seconds to 30 minutes, 90 seconds to 300 seconds, 90 seconds to 10 minutes, 90 seconds to 20 minutes, 90 seconds to 30 minutes, 120 seconds to 5 minutes, 120 seconds to 10 minutes, 120 seconds to 20 minutes, 120 seconds to 30 minutes, 150 seconds to 300 seconds, 150 seconds to 10 minutes, 150 seconds to 20 minutes or 150 seconds to 30 minutes or may be, but is not limited thereto.
본 명세서의 용어, "후크 효과(Hook effect)"는 면역검정에 있어서 분석하고자 하는 샘플 내 높은 목표 검출물질의 농도가 실제로 목표 검출물질에 대한 검정 반응 신호에서의 감소를 유발하여 "후크" 형태의 농도가 감소하는 양상을 관찰할 수 있고, 이로써 위음성의 결과를 발생시키는 효과를 의미한다.As used herein, the term "hook effect" refers to an effect in which a high concentration of a target detectable substance in a sample to be analyzed in an immunoassay actually causes a decrease in the assay reaction signal for the target detectable substance, so that a pattern in which the concentration in the form of a "hook" decreases can be observed, thereby generating a false negative result.
본 명세서의 용어, "위음성(false negative)"은 검사하고자 하는 샘플 내 목표 검출물질이 포함되어 있음에도 불구하고, 면역검정법에 있어서 양성을 나타내는 신호가 발생하지 않는 것을 의미한다. 이와 같이, 후크 효과로 유발되는 위음성은 의학적 진단에 심각한 문제를 야기할 수 있기에 후크 효과 유무의 판단은 매우 중요하다.As used herein, the term "false negative" means that a signal indicating a positive signal is not generated in the immunoassay despite the fact that a target detection substance is included in a sample to be tested. As such, false negatives caused by the hook effect can cause serious problems in medical diagnosis, so determining whether or not there is a hook effect is very important.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 후크 효과 유무의 판단은 상기 1차 측정값(W1) 및 2차 측정값(W2)을 구하여 도출한 측정값의 비(W1/W2)가 소정의 후크 효과 감지 기준보다 크거나 같을 경우 검출 대상 샘플에 검출가능 범위를 초과하는 후크 효과가 있는 것으로 판정하고, 측정값의 비(W1/W2)가 후크 효과 감지 기준보다 작은 경우 검출 대상 샘플에 후크 효과가 없는 것으로 판정함으로써 이루어진다.In one embodiment of the present invention, the presence or absence of the hook effect is determined by determining that the sample to be detected has a hook effect exceeding the detectable range when the ratio (W1/W2) of the measured values obtained by obtaining the first measured value (W1) and the second measured value (W2) is greater than or equal to a predetermined hook effect detection criterion, and determining that the sample to be detected has no hook effect when the ratio (W1/W2) of the measured values is smaller than the criterion for detecting the hook effect.
상기 후크 효과 감지 기준은 서로 다른 농도를 가진 검출 대상 물질을 포함하는 복수개의 검출 대상 샘플에서 목표 검출물질을 측정하였을 때 목표 검출물질에 대한 측정값의 비(W1/W2)가 수렴하는 값을 의미한다.The hook effect detection criterion refers to a value at which a ratio (W1/W2) of measured values for a target detection material converges when the target detection material is measured in a plurality of detection target samples including detection targets having different concentrations.
본 발명에 있어서, 상기 목표 검출물질에 대한 측정값의 비(W1/W2)가 수렴하는 값은, 검출 대상 물질의 농도별 측정값의 비(W1/W2)에 관한 그래프를 도시하는 경우의 점근선의 값의 ±10% 이내의 값에서 선택된다. 보다 구체적으로는 상기 점근선의 값의 ±10% 이내의 값, 점근선의 값의 ±5% 이내의 값, 점근선의 값의 ±3% 이내의 값, 점근선의 값의 ±2% 이내의 값, 또는 점근선의 값의 ±1% 이내의 값에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the value at which the ratio of measured values for the target detection substance (W1 / W2) converges is selected from values within ± 10% of the value of the asymptotic line in the case of showing a graph of the ratio of measured values (W1 / W2) for each concentration of the detection target substance. More specifically, a value within ± 10% of the value of the asymptote, a value within ± 5% of the value of the asymptote, a value within ± 3% of the value of the asymptote, a value within ± 2% of the value of the asymptote, or a value within ± 1% of the value of the asymptote, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 면역검정법이 ELISA이고 검출대상 물질의 검출을 위한 측정 수단이 흡광도인 경우, 기질을 첨가한 후, 1차 흡광도(W1) 및 2차 흡광도(W2)를 측정하고 흡광도의 비(W1/W2)를 산출하여 후크 효과 감지 기준을 설정하며, 상기 후크 효과 감지 기준을 이용하여 표적 물질의 정량분석에서 후크 효과를 감지할 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, when the immunoassay method is ELISA and the measurement means for detecting the target substance is absorbance, after adding the substrate, the first absorbance (W1) and the second absorbance (W2) are measured and the absorbance ratio (W1 / W2) is calculated to set the hook effect detection criterion, and the hook effect can be detected in the quantitative analysis of the target substance using the hook effect detection criterion.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 면역검정법이 ELISA이고 검출대상 물질의 검출을 위한 측정 수단이 흡광도인 경우, 상기 측정 샘플의 흡광도 비가 상기 후크 효과 감지 기준보다 크거나 같을 경우, 검출 범위를 벗어나는 후크 효과를 갖는 샘플로 식별되고; 및 상기 후크 효과 감지 기준보다 작을 경우, 후크 효과가 없는 것으로 판정한다.In a more specific embodiment of the present invention, when the immunoassay is ELISA and the measurement means for detecting the target substance is absorbance, the absorbance ratio of the measurement sample is greater than or equal to the hook effect detection criterion, the sample is identified as having a hook effect that is out of the detection range; and when it is smaller than the hook effect detection criterion, it is determined that there is no hook effect.
이때 후크 효과가 없는 것으로 판정될 경우, 검출 대상 샘플의 흡광도에 대한 농도를 산출하면 실제 검출 대상 샘플 내 목표 검출물질의 농도를 측정할 수 있다.In this case, if it is determined that there is no hook effect, the concentration of the target detection substance in the sample to be detected can be measured by calculating the concentration of the absorbance of the sample to be detected.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 검출 대상 샘플에 후크 효과가 없는 것으로 판정된 샘플 내 목표 검출물질의 농도는 1차 측정값으로 도출된다.In a more specific embodiment of the present invention, the concentration of the target detection substance in the sample determined to have no hook effect in the detection target sample is derived as a first measurement value.
본 발명의 일 구현예에 있어서, iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정 수단이 흡광도 측정인 경우, 상기 1차 흡광도(W1) 측정은 기질 첨가 후 1초 내지 20초에 수행하고, 2차 흡광도(W2) 측정은 기질 첨가 후 250초 내지 350초에 수행된다.In one embodiment of the present invention, iii) when the measuring means for detecting the target detection material is absorbance measurement, the first absorbance (W1) measurement is performed 1 second to 20 seconds after the substrate is added, and the second absorbance (W2) is measured 250 seconds to 350 seconds after the substrate is added.
상기 목표 검출물질의 흡광도 측정은 분광광도계(spectrophotometer)와 같은 광학분석기기를 이용하여 수행되고, 상기 흡광도 측정에 사용되는 파장대는 목표 검출물질에 따라 달라질 수 있다.The absorbance of the target detection material is measured using an optical analysis device such as a spectrophotometer, and a wavelength band used for the absorbance measurement may vary depending on the target detection material.
본 명세서의 용어, 상기 "목표 검출물질"은 샘플 내 검출하고자 하는 대상이 되는 물질로서, 광학분석기기에 의해 측정할 수 있는 시료 내 분석하고자 하는 표적물질을 의미한다.As used herein, the term "target detection substance" is a target substance to be detected in a sample, and refers to a target substance to be analyzed in a sample that can be measured by an optical analysis device.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출 대상 샘플은 검사하고자 하는 상기 목표 검출물질을 포함하는 임의의 샘플일 수 있고, 예를 들어, 혈액, 뇌척수액, 림프액, 분변, 뇨, 눈물, 땀, 담즙, 양수, 조직액, 조직, 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the detection target sample may be any sample including the target detection substance to be tested, and may be selected from the group consisting of, for example, blood, cerebrospinal fluid, lymph fluid, feces, urine, tears, sweat, bile, amniotic fluid, tissue fluid, tissue, and cells, but is not limited thereto.
상기 목표 검출물질, 또는 표적물질은 이의 검출 신호를 확인하기 위한 표지물질에 의해 발생하는 신호에 의하여 존재 여부 및 존재 수준이 측정될 수 있다. The presence or absence of the target substance or the target substance may be measured by a signal generated by a labeling substance for confirming its detection signal.
본 발명의 면역검정법은 상기 표지물질에 의해 발생하는 신호의 검출 원리 및 방법에 따라 응집반응에 의한 신호를 검출하는 면역비탁법(turbidimetric immunoassay; TIA), 라텍스응집 면역비탁법(latex immunoassay; LIA) 및 혼탁측정법(nephelometry), 방사성 동위원소를 사용하여 신호를 검출하는 방사면역분석법 (radio immunoassay; RIA), 효소에 의한 신호증폭을 사용하는 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA, 또는 enzyme immunoassay; EIA), 형광을 이용하여 검출하는 면역형광법(immunofluorescent assay; IFA), 및 화학발광을 사용하는 화학발광면역측정법( chemiluminescence immunoassay; CLIA)등을 포함하고, 그 밖에도 표지 물질의 사용 방법이나 기질의 종류에 따라 다양하게 분류될 수 있으며, 목적에 따라 적절하게 선택하여 사용될 수 있다. The immunoassay method of the present invention, according to the detection principle and method of the signal generated by the marker, includes turbidimetric immunoassay (TIA), latex immunoassay (LIA) and nephelometry, radioimmunoassay (RIA), which detects signals by aggregation reactions, and enzyme-linked immunoassay (RIA), which uses signal amplification by enzymes. -linked immunosorbent assay (ELISA, or enzyme immunoassay; EIA), immunofluorescent assay (IFA) detecting using fluorescence, and chemiluminescence immunoassay (CLIA) using chemiluminescence, etc. In addition, it can be classified in various ways according to the method of using the labeling material or the type of substrate, and can be appropriately selected and used according to the purpose.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 검정법은 바람직하게 효소면역측정법(ELISA), 방사면역분석법(radio immunoassay; RIA), 면역조직화학법(immunohistochemistry, IHC), 또는 유세포분석법(flow cytometry)일 수 있고, 보다 바람직하게 효소면역측정법(ELISA)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the immunoassay may preferably be enzyme-linked immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunohistochemistry (IHC), or flow cytometry, more preferably enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정 반응으로부터 물질의 검출 신호를 확인하기 위한 표지 물질은 화합물 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광표지, 화학발광 표지 또는 FRET 표지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the label material for confirming the detection signal of the substance from the immunoassay reaction may be a compound label, enzyme label, radioactive label, fluorescent label, luminescent label, chemiluminescent label, or FRET label, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 표지 물질로 사용되는 효소 표지는 통상적으로 기질과 반응하여 흡광도 변화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 페록시다아제(Peroxidase), 홀스래디쉬 페록시다아제(horseradish peroxidase; HRP), 글루코오스 산화효소(glucose oxidase), 루시퍼레이즈(luciferase), 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 베타-글루쿠론산분해효소(beta-glucuronidase), 베타-락타메이즈(beta-lactamase), 베타-갈락토시데이즈(β-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이즈(Chloramphenicol acetyltransferase), 산화철 나노입자(iron oxide nanoparticle), 및 헤민-포함 복합체(hemin-containing compelx)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In a specific embodiment of the present invention, the enzyme label used as the labeling material is not particularly limited as long as it can induce a change in absorbance by reacting with a conventional substrate. For example, peroxidase, horseradish peroxidase (HRP), glucose oxidase, luciferase, alkaline phosphatase, It may be at least one selected from the group consisting of beta-glucuronidase, beta-lactamase, beta-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, iron oxide nanoparticle, and hemin-containing compelx. It is not limited.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 표지 물질로 사용되는 형광 표지는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 형광 단백질(fluorescent protein)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 근적외선(near infrared) 형광 단백질인 IFP1.4; 적색(red) 형광 단백질인 RFP(red fluorescent protein), eRFP(enhanced red fluorescent protein), mRFP(modified red fluorescent protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein), mCherry (monomeric cherry fluorescent protein), PAmcherry(photoactivatable mCherry fluorescent protein), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, mScarlet, mScarlet-i, mStrawberry(monomeric strawberry fluorescent protein), mRaspberry, mPlum, mApple, mGrape1, mGrape2, tdTomato, E2-Crimson, HcRed1, mKate, mKate2, mNeptune, mRubby, mRubby2, J-Red, mEOS4, katushka 및 mTangerine; 주황색(orange) 형광 단백질인 mOrange(monomeric orange fluorescent protein), PSmOrange(photoconvertible orange fluorescent protein), mKO 및 mKO2; 노란색(yellow) 형광 단백질인 YFP (yellow fluorescent protein), eYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein), SYFP, TagYFP, PhiYFP, mBanana, mCitrine, Venus, Topaz, mEos2, Ypet 및 ZsYellow; 초록색(green) 형광 단백질인 GFP(green fluorescent protein), eGFP(enhanced green fluorescent protein), mGFP(Modified Green Fluorescent Protein), GFPuv(cycle 3 variant of GFP), AzG(Azami Green), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, Emerald GFP, T-Sapphire, mUkG. mHoneydew, Dronpa, Clover, kaede 및 Zsgreen; 파란색(blue) 형광 단백질인 BFP(blue fluorescent protein), eBFP(enhanced blue fluorescent protein), Azurite, mKalamal, PS-CFP2, mTag BFP 및 mTag BFP2; 청록색(cyan) 형광 단백질인 CFP(cyan fluorescent protein), eCFP(enhanced cyan fluorescent protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), TagCFP, mTurquoise, mTurquosie2, CyPet, Cerulean 및 mTFP(monomeric teal fluorescent protein); 초록-빨강 형광 단백질인 KikGR(green-red photoconvertible fluorescent protein); 및 원적외선 형광 단백질(far-red fluorescent protein).In another specific embodiment of the present invention, the fluorescent label used as the labeling material may be at least one fluorescent protein selected from the group consisting of, but is not limited thereto: IFP1.4, a near infrared fluorescent protein; Red fluorescent protein RFP (red fluorescent protein), eRFP (enhanced red fluorescent protein), mRFP (modified red fluorescent protein), DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), HcR (HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein), mCherry (monomeric cherry fluorescent protein), PAmcherry (photoactivatable mCherry fluorescent protein), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, mScarlet, mScarlet-i, mStrawberry (monomeric strawberry fluorescent protein), mRaspberry, mPlum, mApple, mGrape1, mGrape2, tdTomato, E2-Crimson, HcRed1, mKate, mKate2, mNeptune, mRubby, mRubby2, J-Red, mEOS4, katushka, and mTanger ine; orange fluorescent proteins mOrange (monomeric orange fluorescent protein), PSmOrange (photoconvertible orange fluorescent protein), mKO and mKO2; yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, mBanana, mCitrine, Venus, Topaz, mEos2, Ypet and ZsYellow; GFP (green fluorescent protein), eGFP (enhanced green fluorescent protein), mGFP (Modified Green Fluorescent Protein), GFPuv (cycle 3 variant of GFP), AzG (Azami Green), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, Emerald GFP, T-Sapphire, mUkG. mHoneydew, Dronpa, Clover, kaede and Zsgreen; blue fluorescent proteins (BFP), enhanced blue fluorescent protein (eBFP), Azurite, mKalamal, PS-CFP2, mTag BFP and mTag BFP2; cyan fluorescent protein (CFP), enhanced cyan fluorescent protein (eCFP), cyan green fluorescent protein (CGFP), TagCFP, mTurquoise, mTurquosie2, CyPet, Cerulean, and monomeric teal fluorescent protein (mTFP); green-red photoconvertible fluorescent protein (KikGR), a green-red fluorescent protein; and far-red fluorescent protein.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역 검정 반응에 사용되는 기질(substrate)은 사용한 표지 물질과 반응하여 흡광도 변화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 표지 물질의 종류에 따라서, 적절한 기질을 선택하는 것은 당업계에 잘 알려진 기술이므로 기질에 대한 구체적인 기재는 생략한다.In one embodiment of the present invention, the substrate used in the immunoassay reaction is not particularly limited as long as it can induce a change in absorbance by reacting with the label material used, and selecting an appropriate substrate depending on the type of label material is a well-known technique in the art, so a detailed description of the substrate is omitted.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 당업자라면 상기 면역검정법을 수행하기 위한 "면역검정에 필요한 시약"은 1차 항체, 2차 항체, 및 그 외 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 면역검정법 키트에 포함된 솔루션 용액을 포함하며 제한적으로 해석되지 않는다는 것을 쉽게 이해할 수 있다. In one embodiment of the present invention, those skilled in the art can easily understand that "reagents required for immunoassay" for performing the immunoassay include primary antibodies, secondary antibodies, and solutions included in immunoassay kits commonly used in the art of the present invention, and are not limited to interpretation.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역검정법은 a) 상기 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는 실험군, 및 b) 유리 물질을 첨가하지 않는 실험군을 포함하여 수행된다.In one embodiment of the present invention, the immunoassay is performed including a) an experimental group in which the free target material is added first, and b) an experimental group in which the free target material is not added.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 b) 유리 물질을 첨가하지 않는 실험군에서는 iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계에서 1회만 측정이 수행된다.In a specific embodiment of the present invention, in b) the experimental group in which no glass material is added, measurement is performed only once in step iii) measurement for detecting the target detection material.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 면역 검정법은 a) 상기 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는 실험군만을 포함하여 수행될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the immunoassay may be performed including only an experimental group in which a) the free target material is added first.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 이용한 면역 검정법에서의 후크 효과를 미연에 감지하는 방법을 제공한다.(a) The present invention provides a method for detecting the hook effect in advance in an immunoassay using the same free target material as a target material.
(b) 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 이용하는 경우, 별도의 물질의 추가 없이 후크 효과를 미연에 감지할 수 있다 (b) In the case of using the hook effect detection method of the present invention, the hook effect can be detected in advance without the addition of a separate material.
(c) 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 이용하는 경우, 별도의 시료를 희석하는 과정 없이 후크 효과를 미연에 감지할 수 있다(c) In the case of using the hook effect detection method of the present invention, the hook effect can be detected in advance without a separate sample dilution process.
도 1은 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 수행하기 위한 샘플 웰 및 후크 웰에서의 실험 과정을 나타낸다.
도 2a는 IgG 농도에 따른 샘플 웰 및 후크 웰에서의 흡광도 측정값을 나타낸다.
도 2b는 IgG 농도에 따른 10초 및 300초에서 측정된 후크 웰에서의 측정값에 대한 비(10초/300초)를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 샘플 웰 및 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지 방법에 대한 개략도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 수행하기 위한 후크 웰만을 이용하는 실험 과정을 나타낸다.
도 5는 IgG 농도에 따른 후크 웰에서의 흡광도 측정값(10초), 10초 및 300초에서 측정된 후크 웰에서의 측정값에 대한 비(10초/300초)를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 후크 웰만을 이용한 후크 효과 감지 방법에 대한 개략도를 나타낸다.1 shows an experimental process in a sample well and a hook well for carrying out the hook effect detection method of the present invention.
Figure 2a shows the absorbance measurement values in the sample well and the hook well according to the IgG concentration.
Figure 2b shows the ratio (10 sec / 300 sec) to the measured value in the hook well measured at 10 sec and 300 sec according to the IgG concentration.
Figure 3 shows a schematic diagram of the hook effect detection method using the sample well and the hook well of the present invention.
4 shows an experimental process using only hook wells for carrying out the hook effect detection method of the present invention.
Figure 5 shows the ratio (10 sec / 300 sec) to the measured value in the hook well measured at 10 sec and 300 sec and the absorbance measured in the hook well according to the IgG concentration (10 sec).
6 shows a schematic diagram of a method for detecting a hook effect using only a hook well according to the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.Throughout this specification, unless otherwise specified, "%" used to indicate the concentration of a particular substance is (weight/weight) % for solids/solids, (weight/volume) % for solids/liquids, and (volume/volume) % for liquids/liquids.
실시예Example
ELISA 검사에 의한 IgG 항원의 정량분석Quantitative analysis of IgG antigen by ELISA test
면역 검정법 중 하나인, ELISA 검사법을 이용하여 IgG 항원의 정량분석을 수행함으로써, 본 발명의 후크 효과 감지 방법을 검증하고 이를 적용하기 위한 후크 효과 감지 기준을 결정하였다. 본 실시예는 당업계에서 통상적으로 사용되는 ELISA 검사법을 이용하여 수행하였다.By performing quantitative analysis of the IgG antigen using ELISA, one of the immunoassay methods, the hook effect detection method of the present invention was verified and the hook effect detection criteria for application thereof were determined. This Example was performed using an ELISA assay commonly used in the art.
ELISA 검사법에 의한 IgG 항원의 검출 가능한 농도 범위는 1 내지 10 mg/mL이나, 측정된 샘플에 사용된 IgG 항원의 농도는 1 내지 200 mg/mL로서, 본 발명의 후크 효과 감지 방법의 효과를 확인하고자 20배 이상의 고농도를 포함하는 측정 샘플을 사용하였다. 즉, 사용된 IgG 항원의 농도는 1 mg/mL, 4 mg/mL, 7 mg/mL, 10 mg/mL, 13 mg/mL, 15 mg/mL, 18 mg/mL, 21 mg/mL, 24 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 60 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL 및 200 mg/mL이다. The detectable concentration range of the IgG antigen by the ELISA test method is 1 to 10 mg / mL, but the concentration of the IgG antigen used in the measured sample is 1 to 200 mg / mL. That is, the concentrations of IgG antigen used are 1 mg/mL, 4 mg/mL, 7 mg/mL, 10 mg/mL, 13 mg/mL, 15 mg/mL, 18 mg/mL, 21 mg/mL, 24 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 60 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL and 200 mg/mL.
실험예 1. 2개의 웰을 이용한 후크 효과 감지 방법Experimental Example 1. Hook effect detection method using two wells
2개의 웰(각각 샘플 웰 및 후크 웰)에서 IgG 항원을 분석대상 물질(샘플)로 사용하여 ELISA 검사법을 통해 IgG 항원의 농도를 측정함으로써, 본 발명의 후크 효과 감지 기준을 결정하고 확인하였다. The hook effect detection criterion of the present invention was determined and confirmed by measuring the concentration of the IgG antigen through an ELISA assay using the IgG antigen as an analyte (sample) in two wells (sample well and hook well, respectively).
실험예 1.1. 샘플 웰 및 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지Experimental Example 1.1. Hook effect detection using sample wells and hook wells
샘플 웰에는 분석대상 물질(샘플)만을 첨가하였고, 후크 웰에는 샘플을 첨가하기 전에 분석대상 물질로 사용된 IgG의 유리 항원을 첨가하였다. 본 발명의 실험예에 있어서, TMB(tetramethyl benzidine)를 기질로 사용하여 분석대상 물질을 검출하기 위한 효소-기질반응을 수행하였고, 분광광도계를 사용하여 650 nm 파장대에서 총 2회에 걸쳐 흡광도를 측정하였다. 1차 흡광도의 측정은 기질을 첨가하고 10초 후에 수행하였고, 2차 흡광도는 300초 후에 측정하였다. 모든 실험과정은 도 1에 나타낸 바와 같이 수행되었다.Only the analyte (sample) was added to the sample well, and the free antigen of IgG used as the analyte was added to the hook well before adding the sample. In the experimental example of the present invention, an enzyme-substrate reaction for detecting the analyte was performed using TMB (tetramethyl benzidine) as a substrate, and absorbance was measured twice in the 650 nm wavelength band using a spectrophotometer. The first absorbance was measured 10 seconds after the addition of the substrate, and the second absorbance was measured after 300 seconds. All experimental procedures were performed as shown in FIG. 1 .
도 2a는 10초 및 300초에 측정된 후크 웰에서의 흡광도 및, 300초에 측정된 샘플 웰에서의 흡광도 값을 나타내고, 샘플로 사용된 IgG 농도에 따른 흡광도의 측정값을 그래프로 나타내었다. 두 웰에서 300초에 측정된 흡광도 값을 비교하였을 때, IgG 항원의 농도가 ≥ 10 mg/mL인 경우, 후크 웰에서 측정된 흡광도 값과 비교하여 샘플 웰은 낮은 흡광도 값을 나타내며 부정확한 결과값이 측정됨으로써 후크 효과가 가지는 것을 확인하였다. 특히, 농도가 ≥ 30 mg/mL인 경우, 후크 효과로 인해 모든 흡광도 측정값이 감소하는 것을 확인하였다.Figure 2a shows the absorbance values in the hook well measured at 10 seconds and 300 seconds, and the absorbance values in the sample well measured at 300 seconds, and the absorbance values according to the IgG concentration used as the sample are graphed. When the absorbance values measured at 300 seconds in the two wells were compared, when the concentration of the IgG antigen was ≥ 10 mg/mL, the sample wells showed low absorbance values compared to the absorbance values measured in the hook wells, and inaccurate results were obtained. As a result, it was confirmed that the hook effect had a hook effect. In particular, when the concentration was ≥ 30 mg/mL, it was confirmed that all measured absorbance values decreased due to the Hook effect.
실험예 1.2. 샘플 웰 및 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지 기준 결정Experimental Example 1.2. Determining Hook Effect Detection Criteria Using Sample Wells and Hook Wells
후크 웰에서 측정된 1차 흡광도 및 2차 흡광도의 비(W1/W2)를 이용하여 ELISA 검사법에서의 후크 효과 감지 기준을 결정하였다. The criterion for detecting the hook effect in the ELISA assay was determined using the ratio (W1/W2) of the primary absorbance and the secondary absorbance measured in the hook well.
도 2b는 후크 웰에서 10초 및 300초에 측정된 1차 흡광도 및 2차 흡광도 값의 비(10초/300초)로 나타낸 그래프로서, 여기에서 IgG 항원의 농도가 증가함에 따라 한계비(threshold ratio)가 명확하게 구별되고, 특히, ≥ 30 mg/mL에서 상기 흡광도 값의 비가 포화상태(saturated)에 도달한 것을 확인하였다. 즉, 상기 실험예 1.1에서 후크 효과가 감지되었던 ≥ 30 mg/mL에서 흡광도 값의 비(10초/300초)가 약 ≥ 1.2의 값으로 포화상태에 이르는 것을 확인함으로써, 이를 후크 효과 감지 기준으로 결정하였다.Figure 2b is a graph showing the ratio (10 seconds / 300 seconds) of the first absorbance and the second absorbance values measured at 10 seconds and 300 seconds in the hook well, where the threshold ratio was clearly distinguished as the concentration of the IgG antigen increased, and in particular, it was confirmed that the absorbance ratio reached saturation at ≥ 30 mg / mL. That is, by confirming that the absorbance value ratio (10 sec/300 sec) reached saturation at a value of about ≥ 1.2 at ≥ 30 mg/mL, where the hook effect was detected in Experimental Example 1.1, this was determined as the hook effect detection criterion.
도 3에서 나타낸 바와 같이, 후크 효과 감지를 위해 결정된 기준값을 바탕으로 흡광도의 측정값이 기준보다 높은 경우, 후크 효과로 인해 농도 검출 범위를 벗어나는 것으로 간주하였다. 반면, 기준보다 낮은 경우, 흡광도의 측정값에 대한 샘플의 농도를 산출하였다. As shown in Figure 3, based on the reference value determined for detecting the hook effect, if the measured value of absorbance was higher than the reference value, it was considered to be out of the concentration detection range due to the hook effect. On the other hand, if lower than the standard, the concentration of the sample for the measured value of absorbance was calculated.
실험예 2. 1개의 웰을 이용한 후크 효과 감지 방법Experimental Example 2. Hook effect detection method using one well
2개의 웰(샘플 웰 및 후크 웰)을 사용하지 않고, 후크 웰만을 사용하여 후크 효과 감지 및 정량 분석이 동시에 수행할 수 있음을 확인하였다.It was confirmed that hook effect detection and quantitative analysis can be simultaneously performed using only the hook well without using two wells (sample well and hook well).
상기 실험예 1과 같이, IgG 항원을 분석대상 물질(샘플)로 사용하여 ELISA 검사법을 통해 IgG 항원의 농도를 측정함으로써, 본 발명의 후크 효과 감지 기준을 결정하고 확인하였다. As in Experimental Example 1, the hook effect detection criterion of the present invention was determined and confirmed by measuring the concentration of the IgG antigen through an ELISA test using the IgG antigen as an analyte (sample).
실험예 2.1. 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지Experimental Example 2.1. Hook Effect Detection Using Hook Wells
후크 웰에 샘플을 첨가하기 전에 분석대상 물질로 사용된 IgG의 유리 항원을 선첨가 후, 샘플을 첨가하여 검사를 수행하였으며, 모든 실험은 후크 웰만을 사용하여 수행되었다. TMB를 기질로 사용하여 분석대상 물질을 검출하기 위한 효소-기질반응을 수행하였고, 분광광도계를 사용하여 650 nm 파장대에서 총 2회에 걸쳐 흡광도를 측정하였다. 1차 흡광도의 측정은 기질을 첨가하고 10초 후에 수행하였고, 2차 흡광도는 300초 후에 측정하였다. 모든 실험과정은 도 4에 나타낸 바와 같이 수행되었다.Before adding the sample to the hook well, free antigen of the IgG used as the analyte material was pre-added and then the sample was added to perform the test, and all experiments were performed using only the hook well. An enzyme-substrate reaction was performed to detect the analyte using TMB as a substrate, and absorbance was measured twice in the 650 nm wavelength band using a spectrophotometer. The first absorbance was measured 10 seconds after the addition of the substrate, and the second absorbance was measured after 300 seconds. All experimental procedures were performed as shown in FIG. 4 .
그 결과로써, 10초에 1차로 측정된 흡광도 값과 함께, 10초(1차) 및 300초(2차)에 측정된 흡광도 값의 비를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 1차 흡광도 측정값은 IgG 항원의 농도가 증가함에 따라 증가하였으나, ≥ 30 mg/mL에서는 오히려 측정값이 감소하여 부정확한 값이 측정되는 것을 통해 붉은색 박스로 표시된 구역이 후크 효과가 있는 후크 효과 구역(hook effect region)인 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 후크 웰만 사용한 경우에도, 2개의 웰을 사용하여 수행되었던 상기 실험예 1.1의 결과와 같이 후크 효과를 감지할 수 있음을 확인하였다. As a result, the ratio of absorbance values measured at 10 seconds (1st) and 300 seconds (2nd) together with the absorbance values measured at 10 seconds (1st) are shown in FIG. 5 . As shown in FIG. 5, the primary absorbance measurement value increased as the concentration of the IgG antigen increased, but at ≥ 30 mg/mL, the measurement value decreased and an inaccurate value was measured. It was confirmed that the area marked with a red box was a hook effect region with a hook effect. Through this, it was confirmed that even when only the hook well was used, the hook effect could be detected as in the result of Experimental Example 1.1 performed using two wells.
실험예 2.2. 후크 웰을 이용한 후크 효과 감지 기준 결정Experimental Example 2.2. Determination of Hook Effect Detection Criteria Using Hook Wells
후크 웰에서 측정된 1차 흡광도 및 2차 흡광도의 비(W1/W2)를 이용하여 ELISA 검사법에서의 후크 효과 감지 기준을 결정하였다. The criterion for detecting the hook effect in the ELISA assay was determined using the ratio (W1/W2) of the primary absorbance and the secondary absorbance measured in the hook well.
도 5에 나타낸 바와 같이, 10초 및 300초에 측정된 흡광도 값의 비가 ≥ 30 mg/mL에서 즉, 파란색 박스로 표시된 구역에서 포화상태에 도달한 것을 확인함으로써, 30 mg/mL에서의 흡광도 비를 후크 효과 감지 기준으로 결정하였다.As shown in FIG. 5, by confirming that the ratio of the absorbance values measured at 10 seconds and 300 seconds reached saturation at ≥ 30 mg/mL, that is, in the area indicated by the blue box, the absorbance ratio at 30 mg/mL was determined as a hook effect detection criterion.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 후크 효과 감지를 위해 결정된 기준값을 바탕으로 흡광도의 측정값이 기준보다 높은 경우, 후크 효과로 인해 농도 검출 범위를 벗어나는 것으로 간주하였다. 반면, 기준보다 낮은 경우, 흡광도의 측정값에 대한 샘플의 농도를 산출하였다.As shown in Figure 6, based on the reference value determined for detecting the hook effect, if the measured value of absorbance was higher than the reference value, it was considered to be out of the concentration detection range due to the hook effect. On the other hand, if lower than the standard, the concentration of the sample for the measured value of absorbance was calculated.
측정된 흡광도 값으로부터 샘플 내 분석물질의 농도를 산출하기 위한 보정(calibration)은 흡광도 값과 표준 농도간의 기준이 되는 표준 곡선(standard curve)을 이용하여 수행되었다. 상기 방법은 일반적인 바이오분석법에서 널리 공지되어 있는 방법으로써, 이는 당업자라면 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 적용하는 것임을 쉽게 이해할 수 있다.Calibration for calculating the concentration of the analyte in the sample from the measured absorbance value was performed using a standard curve as a standard between the absorbance value and the standard concentration. The above method is a method widely known in general bioassay methods, and those skilled in the art can easily understand that a method commonly used in the technical field of the invention is applied.
Claims (8)
상기 면역검정법에서 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하기 전에 목표 검출물질(target material)과 동일한 유리 물질(free target material)을 먼저 첨가하는, 면역검정법:
상기 면역검정법은 다음 단계를 포함함:
i) 검출의 대상이 되는 샘플을 검출 용기에 첨가하는 단계;
ii) 면역검정에 필요한 시약을 검출 용기에 첨가하는 단계; 및
iii) 목표 검출물질을 검출하기 위한 측정을 수행하는 단계.
In an immunoassay capable of detecting the presence or absence of a hook effect,
An immunoassay method in which a free target material identical to a target material is first added before adding a sample to be detected in the detection container in the above immunoassay method:
The immunoassay comprises the following steps:
i) adding a sample to be detected into a detection container;
ii) adding reagents required for the immunoassay to the detection vessel; and
iii) performing measurement to detect the target detection substance.
The immunoassay according to claim 1, wherein the first measurement and the second measurement are performed at predetermined time intervals in the step of iii) measuring a target detection substance.
측정값의 비(W1/W2)가 후크 효과 감지 기준보다 작은 경우 검출 대상 샘플에 후크 효과가 없는 것으로 판정하는 것인, 면역검정법.
The method of claim 2, wherein when the ratio (W1 / W2) of the measured values derived by obtaining the first measured value (W1) and the second measured value (W2) is greater than or equal to a predetermined hook effect detection criterion, the detection target sample is determined to have a hook effect exceeding the detectable range,
If the ratio of the measured values (W1 / W2) is smaller than the hook effect detection criterion, it is determined that the detection target sample has no hook effect.
The immunoassay method according to claim 3, wherein the hook effect detection criterion is a value at which a ratio (W1/W2) of the measured value for the target substance converges when the target substance is measured in a plurality of detection target samples including the detection target substance having different concentrations.
The immunoassay according to claim 3, wherein the concentration of the target detection substance in the sample determined to have no hook effect in the detection target sample is derived as a first measurement value.
The immunoassay according to claim 2, wherein iii) when the measurement for detecting the target detecting substance is absorbance measurement, the first absorbance (W1) measurement is performed 1 second to 20 seconds after addition of the substrate, and the second absorbance (W2) measurement is performed 250 seconds to 350 seconds after addition of the substrate.
The immunoassay according to any one of claims 1 to 6, wherein the immunoassay is performed including a) an experimental group in which the free target material is added first, and b) an experimental group in which the free target material is not added.
The immunoassay according to any one of claims 1 to 6, wherein the immunoassay is performed including only an experimental group in which a) the free target material is added first.
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|---|---|---|---|---|
| KR100429382B1 (en) | 2001-12-17 | 2004-04-29 | 삼화콘덴서공업주식회사 | Axial type polymer ptc device of electrode terminal with a hole |
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|---|---|---|---|---|
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