KR20230108628A - Non-esterified fatty acids(NEFA) measurement means and a method of a manufacturing the same - Google Patents
Non-esterified fatty acids(NEFA) measurement means and a method of a manufacturing the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230108628A KR20230108628A KR1020220004273A KR20220004273A KR20230108628A KR 20230108628 A KR20230108628 A KR 20230108628A KR 1020220004273 A KR1020220004273 A KR 1020220004273A KR 20220004273 A KR20220004273 A KR 20220004273A KR 20230108628 A KR20230108628 A KR 20230108628A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- esterified fatty
- layer
- fatty acids
- coenzyme
- reaction
- Prior art date
Links
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 108
- 150000005830 nonesterified fatty acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 107
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title abstract description 18
- DRCWOKJLSQUJPZ-DZGCQCFKSA-N (4ar,9as)-n-ethyl-1,4,9,9a-tetrahydrofluoren-4a-amine Chemical compound C1C2=CC=CC=C2[C@]2(NCC)[C@H]1CC=CC2 DRCWOKJLSQUJPZ-DZGCQCFKSA-N 0.000 title 1
- 101001008429 Homo sapiens Nucleobindin-2 Proteins 0.000 title 1
- 102100027441 Nucleobindin-2 Human genes 0.000 title 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 82
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 claims abstract description 79
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 79
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 79
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 79
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 78
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 claims abstract description 78
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 claims abstract description 78
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 78
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 26
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 22
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 19
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 15
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 13
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 11
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 10
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- -1 accelerators Substances 0.000 claims description 10
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 claims description 9
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 claims description 8
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 8
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 4
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 abstract description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 abstract description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 abstract description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000032050 esterification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 27
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 6
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 6
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 6
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 6
- 230000004140 ketosis Effects 0.000 description 6
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical group OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 3
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- KRNUKKZDGDAWBF-UHFFFAOYSA-N 2-(n-ethyl-n-m-toluidino)ethanol Chemical compound OCCN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 KRNUKKZDGDAWBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIIIXQJBDGSIKL-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;hydrate Chemical compound O.OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 MIIIXQJBDGSIKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005870 Coenzyme A Ligases Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011449 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- RNVCVTLRINQCPJ-UHFFFAOYSA-N o-toluidine Chemical compound CC1=CC=CC=C1N RNVCVTLRINQCPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- QVLTXCYWHPZMCA-UHFFFAOYSA-N po4-po4 Chemical compound OP(O)(O)=O.OP(O)(O)=O QVLTXCYWHPZMCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 1-dodecoxydodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCCCCCCCCCCC CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODWNBAWYDSWOAF-UHFFFAOYSA-N 2,4,4-trimethylpentan-2-yloxybenzene Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)OC1=CC=CC=C1 ODWNBAWYDSWOAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDBHVMTTYXWHLI-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tribromo-3-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(Br)C=C(Br)C(O)=C1Br YDBHVMTTYXWHLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTIDJAQNJLWPTI-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 BTIDJAQNJLWPTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008146 Acetate-CoA ligase Human genes 0.000 description 1
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 102000004539 Acyl-CoA Oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108020001558 Acyl-CoA oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014311 Cushing syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102100037458 Dephospho-CoA kinase Human genes 0.000 description 1
- 241001191009 Gymnomyza Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101000952691 Homo sapiens Dephospho-CoA kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000031964 Other metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000009527 neddylation Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- 229920002114 octoxynol-9 Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006395 oxidase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940113115 polyethylene glycol 200 Drugs 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical group 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 201000009395 primary hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HLXGRHNZZSMNRX-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(C)=CC(C)=C1 HLXGRHNZZSMNRX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZPCAZHPYLUKSMY-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 ZPCAZHPYLUKSMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
- G01N33/521—Single-layer analytical elements
- G01N33/523—Single-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5023—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures with a sample being transported to, and subsequently stored in an absorbent for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0887—Laminated structure
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비에스테르화 지방산과 이를 분해하는 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색하며, 가시광선 측정기를 통해 간편하게 비에스테르화 지방산의 농도를 측정할 수 있는 측정수단 및 그 제조방법, 이를 이용한 측정방법에 관한 것이다.
본 발명의 측정수단은 혈액 샘플이 확산층, 코엔자임 A 제거층, 적혈구 제거층, 반응층을 차례대로 통과하는 구조를 형성하여 반응 전 과잉 코엔자임 A와 적혈구를 제거함에 따라 전혈 형태로 반응을 진행하여도 정확하고 안정적인 결과를 제공하고, 부피가 작고 저렴하여 간편하게 휴대 가능하며, 별도의 전처리 없이 전혈을 이용하여 비에스테르화 지방산의 양을 측정하되, 반응 전 과잉 코엔자임 A 및 적혈구를 제거하여 결과의 정확도를 높이며, 가시광선 영역에서 측정이 가능한 효과가 있다.The present invention relates to a means for measuring non-esterified fatty acids in blood and a method for producing the same, and more particularly, to non-esterified fatty acids and an enzymatic reaction that decomposes them to develop color in the visible light region, and to easily detect non-esterification through a visible light measuring instrument. It relates to a measuring means capable of measuring the concentration of fatty acids, a manufacturing method thereof, and a measuring method using the same.
The measurement means of the present invention forms a structure in which the blood sample passes through the diffusion layer, the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the reaction layer in order to remove excess coenzyme A and red blood cells before the reaction, even if the reaction proceeds in the form of whole blood. It provides accurate and stable results, is compact and inexpensive, and is easily portable. The amount of non-esterified fatty acids is measured using whole blood without separate pretreatment, but excess coenzyme A and red blood cells are removed before the reaction to improve the accuracy of the results. It has an effect that can be measured in the visible light region.
Description
본 발명은 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비에스테르화 지방산과 이를 분해하는 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색하며, 가시광선 측정기를 통해 간편하게 비에스테르화 지방산의 농도를 측정할 수 있는 측정수단 및 그 제조방법, 이를 이용한 측정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a means for measuring non-esterified fatty acids in blood and a method for producing the same, and more particularly, to non-esterified fatty acids and an enzymatic reaction that decomposes them to develop color in the visible light region, and to easily detect non-esterification through a visible light measuring instrument. It relates to a measuring means capable of measuring the concentration of fatty acids, a manufacturing method thereof, and a measuring method using the same.
비에스테르화 지방산(Non-esterified fatty acids, NEFA)은 지방조직에서 방출된 분자로 알부민 등의 혈장 단백질과 결합하여 간세포 내로 유입된다. 증가된 지방조직에서 지방의 분해는 혈중 비에스테르화 지방산의 증가로 이어지며, 당뇨병 2형, 인슐린 저항성, 비만, 대사 증후군 및 악성 질환은 모두 혈중 비에스테르화 지방산 농도와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 지질 및 관련 물질과 관련된 지방산 검사는 대한민국 등록특허 제10-2035772호와 같이 병리학 분야에서 임상화학 검사로 사용될 뿐만 아니라 반추류 동물의 생산성 및 건강 모니터링에도 유용하게 사용되고 있다. Non-esterified fatty acids (NEFA) are molecules released from adipose tissue that bind to plasma proteins such as albumin and enter hepatocytes. Decomposition of fat in increased adipose tissue leads to an increase in non-esterified fatty acids in the blood, and it is known that type 2 diabetes, insulin resistance, obesity, metabolic syndrome, and malignant diseases are all related to the concentration of non-esterified fatty acids in blood. Accordingly, fatty acid tests related to lipids and related substances are not only used as clinical chemical tests in the field of pathology, as shown in Korean Patent Registration No. 10-2035772, but are also usefully used for productivity and health monitoring of ruminants.
반추류에 있어 혈중 유리지방산이 증가하게 되면 간에서 이를 케톤이나 중성지방으로 산화시키게 되는데 반추류의 경우 저밀도 지질단백의 배출 비중에 현저하게 낮아 상승된 비에스테르화 지방산이 지질 대상의 장애로 쉽게 이어지기도 한다. 근래에는 케토시스와 더불어 지방간 역시 반추대동물의 건강에 악영향을 끼치고 있는데, 지방간은 케토시스와 함께 나타나지만 눈에 띄는 외부적인 증상이 나타나지는 않는다. 따라서, 수의학적 소견이 나타나기 이전에 소가 죽거나 하는 양상을 보일 수도 있으며, 특히 분만 2-3주 전의 소나 분만 직후의 소가 케토시스 치료에 아무런 효과를 보이지 않거나 반복 치료로도 호전이 없는 경우, 개체의 회복에도 상당한 시간이 걸려 비용 및 생산성의 문제로 직결되기도 한다.In ruminants, when free fatty acids in the blood increase, the liver oxidizes them to ketones or triglycerides. In the case of ruminants, the proportion of low-density lipoprotein excretion is remarkably low, and elevated non-esterified fatty acids easily lead to lipid target disorders. also lose Recently, along with ketosis, fatty liver also has an adverse effect on the health of ruminant animals. Fatty liver appears along with ketosis, but does not show any noticeable external symptoms. Therefore, cows may die before veterinary findings appear, especially if cows 2-3 weeks before calving or cows immediately after calving do not show any effect on ketosis treatment or if there is no improvement even with repeated treatment, the subject It takes a considerable amount of time to recover, which is directly linked to problems of cost and productivity.
이 때 부의 영양 상태를 유발시켜 지방간의 원인이 되는 비에스테르화 지방산의 증가는 혈액 검사를 통해 확인되어 병리학적 진단을 진행할 수 있는 수의학적 지표가 되기도 한다. 지방간은 주로 케토시스와 함께 발병하지만, 부의 영양 상태에 있는 경우에는 분만을 전후로 하여 다른 대사성 질병과 함께 발생하기도 하므로 소의 경우에 있어 비에스테르화 지방산의 증가는 케토시스 초기에 증가하는 지표 또는 지방간 등의 대사질환을 판별하는 데 도움을 주는 좋은 바이오마커가 될 수 있다. At this time, the increase in non-esterified fatty acids, which causes fatty liver by inducing nutritional status of the part, is confirmed through blood tests and is also a veterinary indicator for pathological diagnosis. Fatty liver usually develops with ketosis, but it also occurs with other metabolic diseases before and after childbirth in the case of veterinary nutrition, so in the case of cattle, the increase in non-esterified fatty acids is an indicator that increases in the early stage of ketosis or metabolism such as fatty liver. It can be a good biomarker to help discriminate the disease.
지방 조직으로부터 혈액으로 방출된 뒤 전신에 공급된 비에스테르화 지방산은 그 잔여분이 간으로 모여 일부는 케톤체로 방출되고 나머지는 지방으로 축적된다. 따라서 비에스테르화 지방산의 농도 증가를 통해 당뇨병, 중증간질환, 갑상선기능항진증, 갈색세포종증, 말단비대증, 쿠싱 증후군 그리고 비만 등을 진단할 수 있고, 농도 감소를 통해 인슐린종, 갑상선 기능 저하증, 뇌하수체기능저하증을 진단할 수 있으며 반추류에 있어서는 케토시스 또는 지방간 진단을 할 수 있다.Non-esterified fatty acids supplied to the body after being released from adipose tissue into the blood, the remainder of which are collected in the liver, are partially released as ketone bodies, and the rest are stored as fat. Therefore, diabetes, severe liver disease, hyperthyroidism, pheochromocytoma, acromegaly, Cushing's syndrome, and obesity can be diagnosed through an increase in the concentration of non-esterified fatty acids, and insulinoma, hypothyroidism, and pituitary gland through a decrease in concentration. Hypofunction can be diagnosed, and ketosis or fatty liver can be diagnosed in ruminants.
그러나 종래의 비에스테르화 지방산을 측정하는 방법은 고체 형태의 시약에 동봉된 용매제를 혼합하여 일정 시간, 일정 온도에 방치할 필요가 있고, 색도 변화를 정해진 파장대에서 읽어들이는 고가의 분광측광계를 필요로 하는 점에 한계가 있다. 이에 현재 의료기기 시장에서는 비에스테르화 지방산 측정 대신 BHBA(베타-하이드록시뷰티르산) 또는 Glucose(글루코오즈) 수치 등을 확인할 수 있는 혈당 및 케톤 자가측정장치를 주로 이용하고 있다.However, in the conventional method for measuring non-esterified fatty acids, it is necessary to mix the enclosed solvent with a reagent in solid form and leave it at a certain time and temperature, and an expensive spectrophotometer that reads the chromaticity change in a specified wavelength range. There is a limit to the point of needing. Accordingly, in the current medical device market, blood glucose and ketone self-measuring devices that can check BHBA (beta-hydroxybutyric acid) or Glucose levels are mainly used instead of measuring non-esterified fatty acids.
또한 종래 비에스테르화 지방산의 측정을 위한 샘플은 반드시 적혈구를 분리한 혈청과 혈장 상태이어야 하며, 파이펫팅 기술을 요하기 때문에 오차가 발생할 경우 정확한 검사 결과로 이어지지 못하는 문제가 있어 실험실 수준 이상의 장소에서는 숙련된 기술이 반드시 요한다. In addition, conventional samples for the measurement of non-esterified fatty acids must be in the state of serum and plasma from which red blood cells are separated, and since pipetting skills are required, there is a problem in that errors do not lead to accurate test results. skill is required
나아가 비에스테르화 지방산의 특성상 지방단백질 리포타아제, 인산리파아제 등과 같은 효소로 인해 지방 분해가 계속해서 일어나는 문제가 있어 채혈 직후 최대한 빠르게 혈청 또는 혈장 상태로 분리되어 별도 저장하거나, 샘플의 수집 즉시 측정하지 않으면 거짓된 양성 결과 값을 나타낼 수 있다. 이는 거짓된 진단 및 임상적 해석을 유발하는 요인이 될 수 있어 반드시 샘플의 전처리를 위해 전문가를 요하거나 샘플을 냉동보관하는 특수한 시설이 필요하다는 점에도 한계가 있다. Furthermore, due to the nature of non-esterified fatty acids, there is a problem in that lipolysis continues due to enzymes such as lipoprotein lipotase and phospholipase, so it is separated into serum or plasma as quickly as possible immediately after blood collection and stored separately or not measured immediately after sample collection. Otherwise, it may give false positive result values. This can be a factor that causes false diagnosis and clinical interpretation, so there is a limit to the fact that a specialist is required for pre-processing of the sample or a special facility for freezing the sample is required.
또한 효소 반응에 있어 조효소 코엔자임 A를 필요로 하는데 샘플 속에도 코엔자임 A가 과잉으로 존재하기 때문에 비에스테르화 지방산의 농도 결정에 간섭 영향을 줄 수 있다. 이에 N-ethyl-maleinimide를 이용하여 과잉 코엔자임 A를 제거하는 과정을 요하는, 상기 시약의 안정성이 낮아 시약이 혼합된 이후 빠른 시간에 사용해야 하는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 종합해 보았을 때, 과잉의 코엔자임 A를 제거하여 간섭 영향을 최소화하며 안정적으로 전혈 샘플을 그대로 이용할 수 있는 비에스테르화 지방산 측정수단이 필요하다. In addition, coenzyme A is required for the enzymatic reaction, and since coenzyme A is present in excess in the sample, it may interfere with the concentration determination of non-esterified fatty acids. Accordingly, there is a problem in that the stability of the reagent, which requires a process of removing excess coenzyme A using N-ethyl-maleinimide, is low, so that the reagent must be used quickly after mixing. Considering these problems, there is a need for a means for measuring non-esterified fatty acids that can remove excess coenzyme A to minimize interference effects and stably use whole blood samples as they are.
따라서 본 발명은 비에스테르화 지방산과 이를 분해하는 효소 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색하며, 가시광선 측정기를 통해 비에스테르화 지방산의 농도를 측정할 수 있는 측정수단을 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.Therefore, the present invention is a technical solution to provide a measuring means capable of measuring the concentration of non-esterified fatty acids by developing color in the visible light region through a non-esterified fatty acid and an enzymatic reaction that decomposes the same, and measuring the concentration of non-esterified fatty acids through a visible light meter. .
또한 본 발명은 상기 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단의 제조방법을 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.In addition, a technical solution of the present invention is to provide a method for preparing the means for measuring non-esterified fatty acids in blood.
또한 본 발명은 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for measuring non-esterified fatty acids in blood.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,In order to solve the above technical problem, the present invention,
혈액 주입구, 투영창, 진단부를 구비한 측정수단에 있어서, In the measuring means having a blood injection port, a projection window, and a diagnosis unit,
상기 진단부는, The diagnosis unit,
상기 혈액 주입구 하부에 구비되어 상기 혈액 주입구를 통해 투입된 혈액 샘플을 균일하게 확산하는 메쉬구조의 확산층;a diffusion layer having a mesh structure provided under the blood inlet and uniformly diffusing the blood sample injected through the blood inlet;
상기 확산층의 하부에 구비되어 과잉 코엔자임 A를 제거하는 코엔자임 A 제거층;a coenzyme A removal layer provided under the diffusion layer to remove excess coenzyme A;
상기 코엔자임 A 제거층의 하부에 구비되어 적혈구를 제거하는 적혈구 제거층; 및 a red blood cell removal layer provided under the coenzyme A removal layer to remove red blood cells; and
상기 적혈구 제거층의 하부에 구비되고, 비에스테르화 지방산의 효소 반응으로 생성되는 과산화수소의 과산화 반응에 의한 4-아미노안티피린 산화물이 발색하는 비에스테르화 지방산 반응층;을 포함하고,A non-esterified fatty acid reaction layer provided under the red blood cell removal layer and in which 4-aminoantipyrine oxide by a peroxidation reaction of hydrogen peroxide generated by an enzymatic reaction of non-esterified fatty acids develops color,
상기 투영창을 통해 상기 비에스테르화 지방산 반응층의 발색을 확인하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단을 제공한다.A means for measuring non-esterified fatty acid in blood is provided, characterized in that the color development of the non-esterified fatty acid reaction layer is confirmed through the projection window.
상기 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,In order to solve the above other technical problems, the present invention,
메쉬구조의 확산층을 제조하는 단계;Manufacturing a diffusion layer of a mesh structure;
노르말-에틸말레이미드 및 카제인을 포함하는 코엔자임 A 제거층을 제조하는 단계;preparing a coenzyme A removal layer containing normal-ethylmaleimide and casein;
완충제, 친수성 계면활성제, 및 하이드록시기를 포함하는 안정제를 포함하는 적혈구 제거층을 제조하는 단계;preparing a red blood cell removal layer including a buffer, a hydrophilic surfactant, and a stabilizer containing a hydroxyl group;
완충제, 발색제, 촉진제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine), 및 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)을 포함하는 비에스테르화 지방산 반응층을 제조하는 단계; 및Non-esterified fatty acids including buffers, colorants, accelerators, surfactants, oxidases, peroxidases, 4-aminoantipyrine, and adenosine 5'-triphosphate preparing a reaction layer; and
상기 확산층, 상기 코엔자임 A 제거층, 상기 적혈구 제거층, 및 상기 비에스테르화 지방산 반응층을 차례대로 적층하는 단계;를 포함하는 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 제조방법을 제공한다.It provides a method for manufacturing a means for measuring non-esterified fatty acids in blood, comprising sequentially stacking the diffusion layer, the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the non-esterified fatty acid reaction layer.
상기 또 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,In order to solve the above another technical problem, the present invention,
혈액 샘플을 메쉬구조의 확산층에 투입하는 제1 단계;A first step of injecting a blood sample into a diffusion layer having a mesh structure;
상기 확산층을 통과한 샘플이 노르말-에틸말레이미드 및 카제인을 포함하는 코엔자임 A 제거층을 통과하며 과잉 코엔자임 A를 제거하는 제2 단계;a second step of removing excess coenzyme A by passing the sample passing through the diffusion layer through a coenzyme A removing layer containing normal-ethylmaleimide and casein;
상기 제2 단계에 따라 과잉 코엔자임 A가 제거된 샘플이 적혈구 제거층을 통과하며 적혈구를 제거하는 제3 단계;a third step of removing red blood cells by passing the sample from which excess coenzyme A has been removed according to the second step through the red blood cell removal layer;
상기 제3 단계에 따라 적혈구가 제거된 샘플이 비에스테르화 지방산 반응층을 통과하며 발색하는 제4 단계; 및a fourth step in which the sample from which the red blood cells are removed according to the third step passes through the non-esterified fatty acid reaction layer to develop color; and
상기 제4 단계에 따른 발색을 이용하여 비에스테르화 지방산의 농도를 측정하는 제5 단계;를 포함하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법을 제공한다.A fifth step of measuring the concentration of non-esterified fatty acids using the color development according to the fourth step; provides a method for measuring non-esterified fatty acids in blood, including.
따라서 본 발명의 측정수단은 혈액 샘플이 확산층, 코엔자임 A 제거층, 적혈구 제거층, 반응층을 차례대로 통과하는 구조를 형성하여 반응 전 과잉 코엔자임 A와 적혈구를 제거함에 따라 전혈 형태로 반응을 진행하여도 정확하고 안정적인 결과를 제공하는 효과가 있다.Therefore, the measurement means of the present invention forms a structure in which the blood sample sequentially passes through the diffusion layer, the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the reaction layer, and proceeds with the reaction in the form of whole blood as excess coenzyme A and red blood cells are removed before the reaction. It also has the effect of providing accurate and stable results.
본 발명의 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단의 제조방법은 과잉 코엔자임 A 제거층과 적혈구 제거층을 일체형으로 포함하도록 측정수단을 제조하여 부피가 작고 저렴하며, 간편하게 휴대 가능한 측정수단을 제조하는 효과가 있다.The manufacturing method of the means for measuring non-esterified fatty acids in the blood of the present invention has the effect of manufacturing a measuring means that is compact, inexpensive, and easily portable by manufacturing the measuring means to include the excess coenzyme A removal layer and the red blood cell removal layer integrally. .
본 발명의 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법은 별도의 전처리 없이 전혈을 이용하여 비에스테르화 지방산의 양을 측정할 수 있고, 반응 전 과잉 코엔자임 A 및 적혈구를 제거하여 결과의 정확도를 높이며, 가시광선 영역에서 측정하는 효과가 있다.The method for measuring non-esterified fatty acids in blood of the present invention can measure the amount of non-esterified fatty acids using whole blood without separate pretreatment, removes excess coenzyme A and red blood cells before reaction to increase the accuracy of the results, and There is an effect measured in .
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 측정수단의 구조도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 측정수단의 케이스 사진이다.
도 3은 본 발명 시험예의 비에스테르화 지방산 농도에 따른 발색 사진이다.1 shows a structural diagram of a measuring means according to an embodiment of the present invention.
2 is a case photograph of a measuring means according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a photograph of color development according to the concentration of non-esterified fatty acid in the test example of the present invention.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.Since the present invention can make various changes and have various embodiments, specific embodiments will be illustrated in the drawings and described in detail. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and should be understood to include all modifications, equivalents, or substitutes included in the spirit and technical scope of the present invention. Like reference numerals have been used for like elements throughout the description of each figure.
본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 반응, 구성요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 반응, 구성요소 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.Terms used in the present invention are only used to describe specific embodiments, and are not intended to limit the present invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In the present invention, terms such as "comprise" or "having" are intended to designate that there is a feature, number, step, reaction, component, or combination thereof described in the specification, but one or more other features or numbers However, it should be understood that it does not preclude the possibility of the presence or addition of steps, reactions, components, or combinations thereof.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related art, and unless explicitly defined in this application, it should not be interpreted in an ideal or excessively formal meaning. don't
본 발명의 일 측면에 따르면, 혈액 주입구, 투영창, 진단부를 구비한 측정수단에 있어서, 상기 진단부는, 상기 혈액 주입구 하부에 구비되어 상기 혈액 주입구를 통해 투입된 혈액 샘플을 균일하게 확산하는 메쉬구조의 확산층; 상기 확산층의 하부에 구비되어 과잉 코엔자임 A를 제거하는 코엔자임 A 제거층; 상기 코엔자임 A 제거층의 하부에 구비되어 적혈구를 제거하는 적혈구 제거층; 및 상기 적혈구 제거층의 하부에 구비되고, 비에스테르화 지방산의 효소 반응으로 생성되는 과산화수소의 과산화 반응에 의한 4-아미노안티피린 산화물이 발색하는 비에스테르화 지방산 반응층;을 포함하고, 상기 투영창을 통해 상기 비에스테르화 지방산 반응층의 발색을 확인하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단을 제공한다.According to one aspect of the present invention, in the measuring means having a blood inlet, a projection window, and a diagnosis unit, the diagnosis unit has a mesh structure provided below the blood inlet and uniformly spreading the blood sample injected through the blood inlet. diffusion layer; a coenzyme A removal layer provided under the diffusion layer to remove excess coenzyme A; a red blood cell removal layer provided under the coenzyme A removal layer to remove red blood cells; and a non-esterified fatty acid reaction layer provided under the red blood cell removal layer and in which 4-aminoantipyrine oxide by a peroxidation reaction of hydrogen peroxide generated by an enzymatic reaction of non-esterified fatty acids develops color. It provides a means for measuring non-esterified fatty acid in blood, characterized in that the color development of the non-esterified fatty acid reaction layer is confirmed through the.
본 발명의 측정수단은 혈중 비에스테르화 지방산을 확인하는 것을 목적으로 하며, 스트립 형태로 수직 방향으로 전혈 샘플이 이동하며 비에스테르화 지방산의 양을 측정함이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. The purpose of the measuring means of the present invention is to identify non-esterified fatty acids in blood, and it is preferable to measure the amount of non-esterified fatty acids while moving a whole blood sample in a vertical direction in the form of a strip, but is not limited thereto.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 측정수단의 구조도를 나타낸 것이다. 도 1을 참고하여 설명하면, 본 발명의 측정수단은 확산층, 코엔자임 A 제거층, 적혈구 제거층, 및 반응층을 포함하는 진단부와, 혈액 주입구 및 투영창이 구비된 케이스를 포함할 수 있다. 진단부는 혈액 주입구 및 투영창이 구비된 케이스 내부에 위치할 수 있으며, 혈액 주입구를 통해 진단부의 확산층에 혈액 샘플을 주입하고, 반응층의 발색은 투영창을 통해 외부에서 확인할 수 있다. 도 2는 본 발명의 측정수단의 케이스 사진이다. (a)는 케이스의 일면에 구비된 투영창이고, (b)는 케이스의 타면에 구비된 혈액 주입구이다.1 shows a structural diagram of a measuring means according to an embodiment of the present invention. Referring to FIG. 1 , the measurement means of the present invention may include a diagnosis unit including a diffusion layer, a coenzyme A removal layer, a red blood cell removal layer, and a reaction layer, and a case provided with a blood injection port and a projection window. The diagnosis unit may be located inside a case having a blood injection port and a projection window, and a blood sample is injected into the diffusion layer of the diagnosis unit through the blood injection port, and color development of the reaction layer may be confirmed from the outside through the projection window. 2 is a case photograph of the measuring means of the present invention. (a) is a projection window provided on one surface of the case, and (b) is a blood injection port provided on the other surface of the case.
본 발명의 측정수단은 혈액(전혈)을 주입하되 결과에 간섭영향을 주는 과잉 코엔자임 A를 제거하는 층과 적혈구를 제거하는 층을 포함하여 전혈 샘플 그대로 이용할 수 있다. 혈액 샘플은 확산층을 통과하여 차례대로 코엔자임 A 제거층, 적혈구 제거층, 반응층을 따라 이동할 수 있으며, 반응층의 반응을 통해 가시광선 영역에서 발색 여부를 확인하여 비에스테르화 지방산의 농도를 측정할 수 있다.The measuring means of the present invention injects blood (whole blood), but can be used as a whole blood sample, including a layer for removing excess coenzyme A that interferes with the results and a layer for removing red blood cells. The blood sample can pass through the diffusion layer and sequentially move along the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the reaction layer. Through the reaction of the reaction layer, the concentration of non-esterified fatty acids can be measured by checking whether color is developed in the visible light region. can
진단부와 관련하여, 보다 구체적으로, 먼저 확산층에 대하여 설명한다.Regarding the diagnosis unit, more specifically, first, the diffusion layer will be described.
본 발명의 확산층은 메쉬구조이고 메쉬 사이즈는 200 ~ 300 μm일 수 있다. 메쉬 사이즈가 200㎛ 미만일 경우 전혈 샘플이 빠르게 퍼지지 않고 떨어뜨린 위치에 뭉쳐진 상태로 있어 다음 단계로의 진행이 늦어지며, 확산층은 샘플의 확산과 동시에, 적용되는 샘플에서 투입될 수 있는 미세한 이물질을 1차적으로 거르는 역할도 하기 때문에, 300㎛를 초과할 경우 메쉬 간 간격이 넓어 이러한 효과가 제대로 기능하지 못할 경우가 있다. The diffusion layer of the present invention has a mesh structure and the mesh size may be 200 to 300 μm. If the mesh size is less than 200㎛, the whole blood sample does not spread quickly and remains agglomerated at the dropped position, slowing down the progress to the next step. Since it also serves as a differential filter, when the mesh exceeds 300 μm, the gap between the meshes is wide, and this effect may not function properly.
또한 확산층은 샘플을 적용하였을 때 정해진 면적에 골고루 확산시키기 위하여 진단의 목적 및 종류에 따라 다양한 반응기로 처리될 수 있는데, 본 발명에서는 최소한의 샘플을 이용하여 확산 효과를 줄 수 있도록 하는데 목적을 두고 히드록시기가 함유된 계면활성제를 이용하여 전처리 후 사용하였다.In addition, the diffusion layer can be treated with various reactors according to the purpose and type of diagnosis in order to spread the sample evenly over a given area when the sample is applied. It was used after pretreatment using a surfactant containing
본 발명의 확산층의 경우 반응층과 결합되지 않는 과잉 코엔자임 A 제거층의 단부에 형성됨이 바람직하며, 확산층에 전혈 샘플을 떨어뜨려 샘플이 빠른 시간 내에 골고루 퍼져 결과값에 영향을 줄 수 있는 과잉 코엔자임 A를 더욱 효과적으로 제거되도록 할 수 있다. In the case of the diffusion layer of the present invention, it is preferable to be formed at the end of the excess coenzyme A removal layer that is not combined with the reaction layer, and the excess coenzyme A that can affect the result value by dropping the whole blood sample on the diffusion layer so that the sample spreads evenly in a short time can be removed more effectively.
다음으로 코엔자임 A 제거층에 대하여 설명한다. 본 발명의 비에스테르화 지방산의 농도 측정에 영향에 줄 수 있는 과잉 코엔자임 A를 제거하기 위한 코엔자임 A 제거층은 노르말-에틸말레이미드(N-ethyl-maleimide, NEM) 및 카제인(casein)을 포함할 수 있다.Next, the coenzyme A removal layer will be described. The coenzyme A removal layer for removing excess coenzyme A that may affect the concentration measurement of non-esterified fatty acids of the present invention may include normal-ethylmaleimide (NEM) and casein. can
NEM은 티올 알킬화 시약으로 유리황하이드릴기(free sulfhydryl)를 알킬화하는 목적으로 사용한다. 코엔자임 A는 말단 사슬에 황하이드릴기를 포함하는데, 황하이드릴기는 산화 효소의 반응 원리에 간섭 영향을 줄 수 있는 방해 요인이 된다. 따라서, NEM을 이용하여 과잉으로 작용할 수 있는 코엔자임 A를 불활성화, 제거할 수 있다. 즉, NEM은 시스테인 프로테이즈로 유비퀴티네이션(ubiquitination)이나 네딜레이션(NEDDylation)과 같은 가역적인 반응을 통해 유리황하이드릴기를 알킬화하여, 반응층에 간섭 영향을 줄 수 있는 과잉 코엔자임 A의 제거 효과를 부여한다. NEM is a thiol alkylating reagent used for the purpose of alkylating free sulfhydryl groups. Coenzyme A contains a sulfur hydryl group in the terminal chain, and the sulfur hydryl group is an interfering factor that can interfere with the reaction principle of oxidase. Therefore, coenzyme A, which may act in excess, can be inactivated and removed by using NEM. In other words, NEM is a cysteine proteinase that alkylates free sulfur hydryl groups through reversible reactions such as ubiquitination or NEDDylation, thereby removing excess coenzyme A that may interfere with the reaction layer. give effect
그러나 상기 시약은 안정성이 매우 낮은 시약으로 시액 타입에서는 사용 직전에 다른 반응 시약과 결합하거나, 반드시 냉장 보관이 필요하다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 카제인을 더 포함하는 것이 바람직하다. 카제인은 blocking reagent로 작용하여 비특이적인 단백질이나 물질들의 반응을 막고 멤브레인과의 결합을 막아 pH를 유지하여 NEM이 정상적으로 알킬화하는데 도움을 줄 수 있다. However, the reagent is a reagent with very low stability, and in the reagent type, it must be combined with other reagents immediately before use or must be refrigerated. In order to overcome this problem, it is preferable to further include casein. Casein acts as a blocking reagent to prevent the reaction of non-specific proteins or substances and to prevent binding to the membrane to maintain pH, thereby helping NEM to alkylate normally.
또한 카제인은 인산기를 포함하여 분자 전체가 음전하를 띄는데, 이는 칼슘이나 마그네슘 등과 같은 금속 이온과 결합하는 기능을 가진다. 산화 효소 반응에서 금속 이온은 정색 반응에 영향을 주기 때문에 이를 킬레이트시키는 시약을 추가로 요구하기도 하는데, 본 발명에서는 카제인을 첨가하여 발색 반응에 영향을 줄 수 있는 잔여 금속 이온을 1차적으로 제거하는 효과도 있다.In addition, casein contains a phosphate group and the entire molecule is negatively charged, which has a function of binding to metal ions such as calcium and magnesium. In the oxidase reaction, since metal ions affect the color reaction, a reagent for chelating them is additionally required. In the present invention, the effect of primarily removing residual metal ions that may affect the color reaction by adding casein There is also
본 발명의 코엔자임 A 제거층은 카제인 0.1%(weight/volume)를 함유할 수 있으며, 유리섬유매트릭스에 도포하여 사용한 결과, 그 효능은 최소 3개월 이상인 것으로 확인되었다. 또한 샘플이 표면장력으로 인하여 흡수되지 않는 문제점도 발생하지 않았다.The coenzyme A removal layer of the present invention may contain 0.1% (weight/volume) of casein, and as a result of application and use on a glass fiber matrix, it has been confirmed that the effect lasts at least 3 months. In addition, there was no problem that the sample was not absorbed due to surface tension.
본 발명의 코엔자임 A 제거층에 포함되는 NEM은 에탄올과 같은 유기용매에 용해할 때 가장 깨끗한 용해 상태를 보이며 용해도가 우수하나 초증류수에도 용해될 수 있다. 초증류수에 용해되는 경우, 가수분해의 정도가 실제로는 이분자 반응이지만 한 쪽 반응분자의 농도가 매우 높아 반응에 의한 변화를 무시할 수 있으며, 이에 따라 반응 속도가 다른 분자의 농도에만 비례하는 일차 반응처럼 보이는 유사 일차 반응으로 pH 의존도가 높아 용액의 상태가 매우 불안정할 수 있다. 따라서, pH에 의존하는 다른 층과는 별개의 층으로 구비하여 안정성을 높이는 것이 바람직하다. 이에 따라 본 발명의 혈중 비에스테르화 지방상 측정수단은 코엔자임 A 제거층과 그 외 기타 물질의 제거층(적혈구 제거층)을 별도로 구비함이 바람직하다.NEM included in the coenzyme A removal layer of the present invention shows the cleanest dissolution state when dissolved in an organic solvent such as ethanol, and has excellent solubility, but can also be dissolved in ultra-distilled water. When dissolved in ultra-distilled water, the degree of hydrolysis is actually a bimolecular reaction, but the concentration of one reactant molecule is so high that the change caused by the reaction can be neglected, so that the reaction rate is proportional only to the concentration of the other molecule, like a first-order reaction. The quasi-first-order reaction seen is highly dependent on pH, and the solution state can be very unstable. Therefore, it is preferable to provide a layer separate from other layers dependent on pH to increase stability. Accordingly, it is preferable that the means for measuring non-esterified lipid content in blood of the present invention separately includes a coenzyme A removal layer and a layer for removing other substances (red blood cell removal layer).
다음으로 적혈구 제거층에 대하여 설명한다. 과잉 코엔자임 A를 제거한 후, 발색에 영향을 줄 수 있는 적혈구를 제거한다. 적혈구는 철분자를 포함하는 헤모글로빈이 단백질을 가지고 있는데 이 단백질은 산소와 결합할 수 있는 성질을 가진다. 따라서, 적혈구 제거층에 친수성 성질을 가진 시약을 침지할 경우 산소와 결합하는 적혈구의 성질을 이용하여 층(멤브레인)에 부착시켜 분리할 수 있다. 이에 본 발명의 적혈구 제거층은 하이드록시기를 포함하는 안정제, 완충제, 및 친수성 계면활성제를 포함할 수 있다. 경우에 따라서 친수성 계면활성제는 미포함하여도 무방하다.Next, the red blood cell removal layer will be described. After removing excess coenzyme A, red blood cells that can affect color development are removed. Red blood cells contain a protein called hemoglobin, which contains iron molecules, and this protein has the property of being able to combine with oxygen. Therefore, when a reagent having a hydrophilic property is immersed in the red blood cell removal layer, it can be separated by being attached to the layer (membrane) using the property of red blood cells that bind to oxygen. Accordingly, the red blood cell removal layer of the present invention may include a stabilizer containing a hydroxyl group, a buffer, and a hydrophilic surfactant. In some cases, a hydrophilic surfactant may not be included.
적혈구 제거층에 사용되는 고체 매트릭스는 유리 섬유 재질로, 전혈 샘플이 적용될 때 샘플의 균일성을 가지게 하며, 적혈구가 바람직하게 제거되는 양상을 보이는 장점이 있다. 유리 섬유 매트릭스의 두께는 250~400 ㎛인 것이 바람직하다. 두께가 250 ㎛ 미만일 경우에는 두께가 얇아 상대적으로 무게가 무거운 적혈구를 제대로 걸러주지 못할 수 있으며, 400 ㎛를 초과하는 경우에는 필요 이상으로 두께가 두꺼워져 과잉 샘플이 요구되거나, 반응 시간이 길어지는 문제가 있어 바람직하지 못하다. The solid matrix used in the red blood cell removal layer is a glass fiber material, and has advantages in that the sample has uniformity when a whole blood sample is applied and that red blood cells are preferably removed. The thickness of the glass fiber matrix is preferably 250 to 400 μm. If the thickness is less than 250 ㎛, the thickness is thin and relatively heavy red blood cells may not be properly filtered, and if it exceeds 400 ㎛, the thickness is thicker than necessary, requiring excessive sample or lengthening the reaction time. It is not desirable to have
적혈구 제거층의 사이즈는 폭 가로, 세로 5 mm 내외가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 적혈구 제거층은 샘플의 빠른 흐름을 위해서 유량의 속도와 두께를 충분히 고려하여 결정함이 바람직하며, 모세관 유량은 cm 당 10초 내외가 바람직하다. 모세관 유량이 너무 빠를 경우에는 적혈구를 제거하기 위해 침지된 시약과 제대로 반응하지 않아 결과 값에 부정적인 영향을 줄 수 있으며 모세관 유량이 너무 느릴 경우에는 반응 시간이 길어져 효율적으로 테스트 결과를 확인하기 어려운 문제점이 있어 바람직하지 못하다. 보다 바람직하게는 적혈구 제거층의 사이즈는 5 mm, 샘플량은 8-10 μL일 때 적절하게 적혈구가 제거되어 혈청 및 혈장 상태로 분리될 수 있다. The size of the red blood cell removal layer is preferably about 5 mm in length and width, but is not limited thereto. In addition, the red blood cell removal layer is preferably determined in consideration of the speed and thickness of the flow rate for rapid flow of the sample, and the capillary flow rate is preferably about 10 seconds per cm. If the capillary flow rate is too fast, it will not react properly with the immersed reagent to remove red blood cells, which can negatively affect the result value. If the capillary flow rate is too slow, the reaction time will be long, making it difficult to check the test results efficiently. there is not desirable More preferably, when the size of the red blood cell removal layer is 5 mm and the sample amount is 8-10 μL, red blood cells are appropriately removed and separated into serum and plasma.
적혈구 제거층에 침지 및 도포되는 시약은 완충제, 친수성 계면활성제 및 하이드록시기를 포함하는 안정제 등을 포함한다. 경우에 따라서 친수성 계면활성제는 미포함할 수도 있다.Reagents to be immersed and applied to the red blood cell removal layer include a buffer, a hydrophilic surfactant, and a stabilizer containing a hydroxyl group. In some cases, a hydrophilic surfactant may not be included.
적혈구 제거층의 완충제(buffer)는 혈액의 상태와 유사한 성분을 가질 수 있도록 하여 급격한 삼투압으로 적혈구가 깨져버리는 현상 등을 방지하면서 다음 단계에서 적용되는 반응층의 완충제 pH와도 적절하게 반응될 수 있어야 한다. 이에 본 발명의 적혈구 제거층에 사용되는 완충제의 바람직한 pH 범위는 6.0 내지 7.5 이며, pH가 6.5 미만일 경우 발색 반응이 일어나는 반응층에 영향을 주게되어 발색 반응이 낮아지는 결과로 이어지고, 7.5를 초과할 경우 발색 안정도가 떨어진다는 문제가 생긴다. 더욱 바람직하게는 6.3 내지 7.3의 pH일 수 있다.The buffer of the red blood cell removal layer should have a component similar to that of blood, so that it can react properly with the pH of the buffer of the reaction layer applied in the next step while preventing the phenomenon that red blood cells are broken due to rapid osmotic pressure. . Therefore, the preferred pH range of the buffer used in the red blood cell removal layer of the present invention is 6.0 to 7.5, and when the pH is less than 6.5, it affects the reaction layer where the color reaction occurs, leading to a decrease in the color reaction. In this case, there is a problem that the stability of color development is lowered. More preferably, it may be a pH of 6.3 to 7.3.
적혈구 제거층의 완충제는 HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES(1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris(hydroxymethyl)aminomethane , MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, 포스페이트(Phosphate) 계 완충제 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 포스페이트 완충제일 수 있으며, 10 내지 50 mM 농도로 이루어지는 것이 바람직하다. 완충제의 농도는 완충제의 pH와 같은 영향을 끼치게 된다. 즉 완충제의 농도가 15 mM 미만일 경우 스트립의 안정성이 저하되거나 적혈구가 원활하게 제거되지 않는 문제점이 발생하며, 이에 따라 반응층에서 적혈구의 영향으로 인해 결과값이 올바르게 나타나지 않는 문제점이 생길 수 있다. 또한 완충제의 농도가 50 mM를 초과할 경우에는 시약의 과량반응으로 반응층에 얼룩이 생성되는 문제가 발생하고 과량의 시약이 발색을 오히려 저하시키는 단점이 발생할 수 있다. 보다 바람직하게는 20 mM일 수 있다.The buffer of the red blood cell removal layer is HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris (hydroxymethyl) aminomethane , MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, phosphate ( Phosphate)-based buffers and mixtures thereof. More preferably, it may be a phosphate buffer, and it is preferably composed of 10 to 50 mM concentration. The concentration of the buffer has the same effect as the pH of the buffer. That is, if the concentration of the buffer is less than 15 mM, the stability of the strip may deteriorate or the red blood cells may not be smoothly removed, and accordingly, the result may not be displayed correctly due to the effect of the red blood cells in the reaction layer. In addition, when the concentration of the buffer exceeds 50 mM, stains may occur in the reaction layer due to an excessive reaction of the reagent, and an excessive amount of reagent may cause a disadvantage in that color development is rather deteriorated. More preferably, it may be 20 mM.
또한 적혈구의 제거를 위하여, 친수성분자인 Polyethylene glycol 200, 1000, 4000 등 폴리올(polyol) 그룹을 가진 안정제 혹은 계면활성제 등을 사용할 수 있다.In addition, for the removal of red blood cells, a stabilizer or surfactant having a polyol group such as polyethylene glycol 200, 1000, 4000, which is a hydrophilic component, may be used.
코엔자임 A와 적혈구의 제거는 그 순서에 제한되지 않으나 바람직하게는 과잉 코엔자임 A를 먼저 제거한 후 적혈구 등 기타 물질을 제거함이 바람직하다. 제거되는 코엔자임 A와 적혈구는 반응층에서 결과값에 영향을 주는 요인이므로, 가공되지 않은 샘플을 그대로 측정할 때 발생하는 간섭, 문제점을 최소화하기 위하여 코엔자임 A 및 적혈구를 제거한 후 반응을 진행하여 결과의 정확도를 높일 수 있다.The removal of coenzyme A and red blood cells is not limited to the order, but it is preferable to remove excess coenzyme A first and then remove other substances such as red blood cells. Coenzyme A and red blood cells to be removed are factors that affect the result value in the reaction layer, so in order to minimize interference and problems that occur when measuring unprocessed samples as they are, coenzyme A and red blood cells are removed before the reaction is carried out. accuracy can be increased.
다음으로 비에스테르화 지방산 반응층에 대하여 설명한다. 본 발명의 비에스테르화 지방산 반응층은 효소 반응으로 생성되는 과산화수소의 과산화 반응에 의한 4-아미노안티피린 산화물이 발색하게 된다. 이를 위하여 본 발명의 비에스테르화 지방산 반응층은 완충제, 발색제, 촉진제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine), 및 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)을 포함할 수 있다.Next, the non-esterified fatty acid reaction layer will be described. In the non-esterified fatty acid reaction layer of the present invention, 4-aminoantipyrine oxide by the peroxidation reaction of hydrogen peroxide generated by an enzymatic reaction develops color. To this end, the non-esterified fatty acid reaction layer of the present invention contains a buffer, a coloring agent, an accelerator, a surfactant, an oxidizing enzyme, a peroxidase, 4-aminoantipyrine, and adenosine 5'-triphosphate. 5'-triphosphate) may be included.
반응층의 완충제는 HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES(1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris(hydroxymethyl)aminomethane , MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, 포스페이트(Phosphate)계 완충제 및 이의 혼합으로 이루어진 군에서 선택되어 질 수 있다. 바람직하게는 포스페이트(Phosphate)계 완충제일 수 있으며, 농도는 50 내지 100 mM로 이루어지는 것이 바람직하다. 완충제의 농도가 50 mM 미만일 경우에는, 함께 포함된 효소가 안정화되지 않는 문제가 있고 100 mM을 초과하는 경우에는 반응층의 과잉 시약 함유로 인해 발색이 얼룩져 나타나는 점에서 바람직하지 못하다. The buffer of the reaction layer is HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid), PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid), Tris (hydroxymethyl) aminomethane , MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) hydrate, phosphate (Phosphate )-based buffers and mixtures thereof. Preferably, it may be a phosphate-based buffer, and the concentration is preferably made of 50 to 100 mM. When the concentration of the buffer is less than 50 mM, there is a problem in that enzymes contained therein are not stabilized, and when it exceeds 100 mM, it is not preferable in that color development appears uneven due to excessive reagent content in the reaction layer.
발색제는 비에스테르화 지방산이 산화반응효소와 반응한 다음 가시광선 영역에서 확인될 수 있도록 첨가하는 것으로, 과산화수소의 분광 측정과 관련된 발색제로 물에 녹는 아닐린(aniline) 계열의 시약이 바람직하다. The coloring agent is added so that it can be confirmed in the visible light region after the non-esterified fatty acid reacts with the oxidation reaction enzyme, and a water-soluble aniline-based reagent is preferable as a coloring agent related to spectroscopic measurement of hydrogen peroxide.
아닐린 계열의 시약은 -Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline(MAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline(DAOS), 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine, 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride, o-Toluidine, 3-Methyl-N-Ethyl-N-(β-Hydroxyethyl)-Aniline(MEHA), 2,4,6-tribromo-3-hydroxy-benzoic acid(TBHB) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. Aniline-based reagents are -Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylaniline (MAOS), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline (TOOS) ), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (DAOS), 3,3'-,5,5'-Tetramethylbenzidine, 3,3'-,5,5' -Tetramethylbenzidine dihydrochloride, o-Toluidine, 3-Methyl-N-Ethyl-N-(β-Hydroxyethyl)-Aniline (MEHA), 2,4,6-tribromo-3-hydroxy-benzoic acid (TBHB) and mixtures thereof It is preferably selected from the group consisting of
이 중 비에스테르화 지방산은 측정 범위가 작고 민감하기 때문에 0 내지 1.5 mmol/L에서 구간 측정 범위가 넓은 적색 계열의 발색제를 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 발색제의 농도는 5 내지 20mM인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 15mM일 수 있다. 발색제의 농도가 5mM 미만일 경우 측정수단의 발색 감도가 낮아지고, 20mM를 초과할 경우 발색 감도가 높아 과산화수소의 발색 구분이 낮아져 민감도가 떨어지고, 과잉 반응으로 오히려 직선성이 확보되지 않는 경우가 발생할 수 있다.Among them, since non-esterified fatty acids have a small and sensitive measurement range, it is preferable to use a red-based coloring agent having a wide measurement range from 0 to 1.5 mmol/L, but is not limited thereto. The concentration of the coloring agent may be 5 to 20 mM, preferably 10 to 15 mM. If the concentration of the coloring agent is less than 5 mM, the color sensitivity of the measuring means is lowered, and if it exceeds 20 mM, the color sensitivity is high, so that the color development of hydrogen peroxide is lowered and the sensitivity is lowered. .
촉진제로는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate)를 이용할 수 있으며, 비에스테르화 지방산을 검출하기 위해 포함된 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)의 안정성에 도움을 줌과 동시에 효소의 co-factor로 작용시킬 수 있다. 마그네슘 설페이트 농도는 10 내지 50 mM이 바람직하며, 마그네슘 이온의 농도가 10 mM 미만인 경우에는 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)가 안정화 되지 않아 발색 반응이 약해지는 단점이 있고, 50 mM을 초과하는 농도에서는 그 효과가 미미하므로 시약 단가를 고려할 때 경제적이지 못하다. Magnesium sulfate can be used as an accelerator, and it helps the stability of adenosine 5'-triphosphate, which is included to detect non-esterified fatty acids, and acts as a co-factor of enzymes. can act as The concentration of magnesium sulfate is preferably 10 to 50 mM, and when the concentration of magnesium ions is less than 10 mM, there is a disadvantage in that adenosine 5'-triphosphate is not stabilized and the color reaction is weakened. At a concentration exceeding , the effect is insignificant, so it is not economical considering the unit price of the reagent.
계면활성제로는 Triton X-100(t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether), Brij® L23(Polyoxyethylene (23) lauryl ether), TWEEN® 20(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate, Polyoxyethylenesorbitan monolaurate), Lauryl sulfate sodium salt, CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate 등 보편적으로 널리 알려진 계면활성제는 어느 것이든 사용하여도 무방하다. 바람직하게는 친수부가 비전해질인, 이온화되지 않는 친수성기를 가진 비이온 계면 활성제를 이용함이 시약의 용해에 있어 안정한 상태로 계면활성제의 효과를 확보할 수 있어 바람직하다. 계면활성제의 농도는 0.1 ~ 1 %(v/v)가 바람직하며, 너무 미미한 양을 첨가하면 그 효과를 보이지 않고, 과량으로 첨가하게 되면 비 정상적인 과잉 효과로 오히려 용해 상태에서 발색이 되게 하는 등의 문제점을 가지게 된다. As surfactants, Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether), Brij® L23 (Polyoxyethylene (23) lauryl ether), TWEEN® 20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate, Polyoxyethylenesorbitan monolaurate), Lauryl sulfate sodium salt , CHAPS, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, and other commonly known surfactants may be used. Preferably, it is preferable to use a non-ionic surfactant having a non-ionized hydrophilic group in which the hydrophilic part is a non-electrolyte, since the effect of the surfactant can be secured in a stable state in dissolving the reagent. The concentration of the surfactant is preferably 0.1 to 1% (v/v), and if too insignificant is added, the effect is not shown. have a problem
아세틸 코엔자임 A 합성 효소는 비에스테르화 지방산을 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)와 조효소 하에 아실 코엔자임 A로 합성시키는 역할을 하며, 아세틸 코엔자임 A 산화 효소는 생선된 아실 코엔자임 A를 산화시켜 정색반응을 유도하는 과산화수소(H2O2)를 형성시킨다. 아세틸 코엔자임 A 합성 효소는 50 내지 150ku/L 포함되는 것이 바람직한데, 50ku/L 미만일 경우 합성효소로써의 효과가 떨어지며, 150ku/L을 초과할 경우 더 이상의 효과가 없다고 판단하기 때문에 효소를 낭비하게 된다. 적정 농도는 120ku/L이다.Acetyl coenzyme A synthase serves to synthesize non-esterified fatty acids into acyl coenzyme A with 5'-triphosphate and coenzyme, and acetyl coenzyme A oxidase oxidizes the produced acyl coenzyme A to It forms hydrogen peroxide (H 2 O 2) that induces a color reaction. Acetyl coenzyme A synthetase is preferably included in an amount of 50 to 150 ku/L, but if it is less than 50 ku/L, the effect as a synthetase is reduced, and if it exceeds 150 ku/L, it is judged that there is no further effect, so the enzyme is wasted. . A suitable concentration is 120 ku/L.
아세틸 코엔자임 A 산화효소는 200 내지 400 ku/L가 바람직한데, 직선성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 적정 농도는 300 ku/L이다. 산화반응효소와의 효소반응을 통해 비에스테르화 지방산으로부터 과산화수소가 발생되고 이 과산화수소와 발색제가 반응하여 비에스테르화 지방산의 양을 확인할 수 있다. 이와 같이 비에스테르화 지방산로부터 과산화수소가 발생되고, 과산화수소가 발색되기 위해서는 퍼옥시다아제 및 4-아미노안티피린이 필요하다. Acetyl coenzyme A oxidase is preferably 200 to 400 ku/L, which plays an important role in maintaining linearity. A suitable concentration is 300 ku/L. Hydrogen peroxide is generated from non-esterified fatty acids through an enzymatic reaction with an oxidation reaction enzyme, and the amount of non-esterified fatty acids can be confirmed by reacting the hydrogen peroxide with the coloring agent. In this way, hydrogen peroxide is generated from non-esterified fatty acids, and peroxidase and 4-aminoantipyrine are required for hydrogen peroxide to develop color.
과산화수소는 퍼옥시다아제 효소와 반응을 통해 4-아미노안티피린을 산화형으로 만든다. 이와 같이 산화된 4-아미노안티피린은 발색제(TOOS)와 반응하여 보라색 산화물을 생성한다. 이와 같이 보라색 산화물은 가시광선 측정기를 통해 그 양을 확인할 수 있으며, 측정된 양을 통해 체내의 비에스테르화 지방산의 양을 측정할 수 있다. 여기서 퍼옥시다아제 효소의 농도는 10 내지 300ku/L가 바람직한데, 10ku/L 미만일 경우 반응이 제대로 일어나지 않으며 300ku/L를 초과할 경우 다른 반응시약의 비율에 영향을 끼치게 된다.Hydrogen peroxide converts 4-aminoantipyrine into an oxidized form through a reaction with the peroxidase enzyme. The oxidized 4-aminoantipyrine reacts with a color former (TOOS) to produce a purple oxide. As such, the amount of purple oxide can be checked through a visible light meter, and the amount of non-esterified fatty acids in the body can be measured through the measured amount. Here, the concentration of the peroxidase enzyme is preferably 10 to 300 ku / L. If the concentration is less than 10 ku / L, the reaction does not occur properly, and if it exceeds 300 ku / L, the ratio of other reaction reagents is affected.
즉, 본 발명의 반응층에서는 샘플 내의 비에스테르화 지방산을 조효소 코엔자임 A와 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)의 존재하에 아실 코엔자임 A 합성효소로 아실화 코엔자임 A로 변환시킨 후, 아실 코엔자임 A 산화효소에 의해 아실화 코엔자임 A를 산화시켜 생성되는 과산화수소(H2O2)로부터 과산화 반응에 의해 형성된 산화물의 발색 반응이 진행된다.That is, in the reaction layer of the present invention, non-esterified fatty acids in the sample are converted to acylated coenzyme A with acyl coenzyme A synthetase in the presence of coenzyme A and adenosine 5'-triphosphate, A color reaction of an oxide formed by a peroxidation reaction proceeds from hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) produced by oxidizing acylated coenzyme A by an acyl coenzyme A oxidase.
본 발명의 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단은 혈액 샘플이 확산층, 코엔자임 A 제거층, 적혈구 제거층, 반응층을 차례대로 통과하는 구조를 형성하여 반응 전 과잉 코엔자임 A와 적혈구를 제거함에 따라 전혈 형태로 반응을 진행하여도 정확하고 안정적인 결과를 제공한다.The means for measuring non-esterified fatty acids in blood of the present invention forms a structure in which a blood sample passes through a diffusion layer, a coenzyme A removal layer, an erythrocyte removal layer, and a reaction layer in order to remove excess coenzyme A and red blood cells before the reaction, thereby obtaining whole blood. It provides accurate and stable results even when the reaction is in progress.
본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 메쉬구조의 확산층을 제조하는 단계; 노르말-에틸말레이미드 및 카제인을 포함하는 코엔자임 A 제거층을 제조하는 단계; 완충제, 친수성 계면활성제, 및 하이드록시기를 포함하는 안정제를 포함하는 적혈구 제거층을 제조하는 단계; 완충제, 발색제, 촉진제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine), 및 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)을 포함하는 비에스테르화 지방산 반응층을 제조하는 단계; 및 상기 확산층, 상기 코엔자임 A 제거층, 상기 적혈구 제거층, 및 상기 비에스테르화 지방산 반응층을 차례대로 적층하는 단계;를 포함하는 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 제조방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, manufacturing a diffusion layer of a mesh structure; preparing a coenzyme A removal layer containing normal-ethylmaleimide and casein; preparing a red blood cell removal layer including a buffer, a hydrophilic surfactant, and a stabilizer containing a hydroxyl group; Non-esterified fatty acids including buffers, colorants, accelerators, surfactants, oxidases, peroxidases, 4-aminoantipyrine, and adenosine 5'-triphosphate preparing a reaction layer; and sequentially stacking the diffusion layer, the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the non-esterified fatty acid reaction layer.
확산층, 코엔자임 A 제거층, 적혈구 제거층, 및 비에스테르화 지방산 반응층은 시약의 도포의 용이성과 효과를 위해 각각 제조한 후 이를 결합시키는 것이 바람직하나다. 상기 확산층, 코엔자임 A 제거층, 적혈구 제거층, 및 비에스테르화 지방산 반응층은 차례대로 적층되어 진단부를 구성한다.The diffusion layer, the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the non-esterified fatty acid reaction layer are preferably prepared separately and then combined for the ease and effect of reagent application. The diffusion layer, the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the non-esterified fatty acid reaction layer are sequentially stacked to constitute the diagnostic unit.
혈액 주입구와 투영창을 포함하는 케이스가 상기 진단부의 외부를 케이싱할 수 있다. 구체적으로, 상기 확산층의 상부에 구비되고 혈액 주입구를 포함하는 상부 케이스와 상기 반응층의 하부에 구비되고 투영창을 포함하는 하부 케이스를 결합하는 단계를 더 포함하여 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 제조방법을 제공할 수 있다.A case including a blood inlet and a projection window may encase the outside of the diagnosis unit. Specifically, the method of manufacturing non-esterified fatty acid measuring means in blood further comprising the step of combining an upper case provided on the upper part of the diffusion layer and including a blood inlet and a lower case provided on the lower part of the reaction layer and including a projection window. can provide.
본 발명의 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단의 제조방법은 과잉 코엔자임 A 제거층과 적혈구 제거층이 진단부에 차례대로 포함하도록 측정수단을 제조하여 부피가 작고 저렴하며, 간편하게 휴대 가능한 측정수단을 제조할 수 있다.In the method of manufacturing a means for measuring non-esterified fatty acids in blood of the present invention, a measuring means that is compact, inexpensive, and easily portable can be manufactured by manufacturing a measuring means so that the excess coenzyme A removal layer and the red blood cell removal layer are sequentially included in the diagnostic unit. can
본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 혈액 샘플을 메쉬구조의 확산층에 투입하는 제1 단계; 상기 확산층을 통과한 샘플이 노르말-에틸말레이미드 및 카제인을 포함하는 코엔자임 A 제거층을 통과하며 과잉 코엔자임 A를 제거하는 제2 단계; 상기 제2 단계에 따라 과잉 코엔자임 A가 제거된 샘플이 적혈구 제거층을 통과하며 적혈구를 제거하는 제3 단계; 상기 제3 단계에 따라 적혈구가 제거된 샘플이 비에스테르화 지방산 반응층을 통과하며 발색하는 제4 단계; 및 상기 제4 단계에 따른 발색을 이용하여 비에스테르화 지방산의 농도를 측정하는 제5 단계;를 포함하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a first step of injecting the blood sample into the diffusion layer of the mesh structure; a second step of removing excess coenzyme A by passing the sample passing through the diffusion layer through a coenzyme A removing layer containing normal-ethylmaleimide and casein; a third step of removing red blood cells by passing the sample from which excess coenzyme A has been removed according to the second step through the red blood cell removal layer; a fourth step in which the sample from which the red blood cells are removed according to the third step passes through the non-esterified fatty acid reaction layer to develop color; and a fifth step of measuring the concentration of non-esterified fatty acids using the color development according to the fourth step.
먼저 혈액 샘플은 메쉬구조의 확산층에 투입된다. 혈액 샘플은 확산층에 빠른 시간 내에 골고루 퍼져 이후 제거 및 반응이 효과적으로 진행되도록 할 수 있다. 확산층의 경우 메쉬로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 측정수단에서 설명한 것과 같이 메쉬 사이즈는 200 ~ 300 μm임이 바람직하다.First, a blood sample is put into a diffusion layer having a mesh structure. The blood sample can be evenly spread over the diffusion layer in a short period of time so that subsequent removal and reaction can proceed effectively. In the case of the diffusion layer, it is preferable to be made of a mesh, and as described in the measuring means, the mesh size is preferably 200 to 300 μm.
확산층을 통과한 샘플은 균일하게 코엔자임 A 제거층을 통과하는데, 본 발명의 코엔자임 A 제거층은 노르말-에틸말레이미드와 카제인을 포함하여 안정적이고 효과적으로 코엔자임 A를 제거한다. 자세한 내용은 상기 측정수단에서 설명한 것과 같다.Samples passing through the diffusion layer uniformly pass through the coenzyme A removal layer, and the coenzyme A removal layer of the present invention contains normal-ethylmaleimide and casein and stably and effectively removes coenzyme A. Details are the same as those described in the above measuring means.
코엔자임 A 제거층을 통과한 샘플은 적혈구 제거층을 통과하는데, 본 발명의 적혈구 제거층은 하이드록시기를 포함하는 안정제, 완충제, 및 친수성 계면활성제를 포함하며, 산소와 결합하는 적혈구의 성질을 이용하여 적혈구를 제거한다. 경우에 따라서 친수성 계면활성제는 미포함하여도 무방하다. 자세한 내용은 상기 측정수단에서 설명한 것과 같다.The sample passing through the coenzyme A removal layer passes through the red blood cell removal layer. The red blood cell removal layer of the present invention includes a stabilizer containing a hydroxyl group, a buffer, and a hydrophilic surfactant, and uses the property of red blood cells that bind to oxygen to remove red blood cells In some cases, a hydrophilic surfactant may not be included. Details are the same as those described in the above measuring means.
코엔자임 A 제거층 및 적혈구 제거층을 통과하여 반응이나 발색에 영향을 줄 수 있는 과잉 코엔자임 A 및 적혈구가 제거된 샘플은 비에스테르화 지방산 반응층을 통과하며 발색한다. 비에스테르화 지방산의 효소 반응으로 생성되는 과산화수소의 과산화 반응에 의한 4-아미노안티피린 산화물이 발색하게 된다. 보다 구체적으로, 샘플 내의 비에스테르화 지방산을 조효소 코엔자임 A와 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)의 존재하에 아실 코엔자임 A 합성효소로 아실화 코엔자임 A로 변환시킨 후, 아실 코엔자임 A 산화효소에 의해 아실화 코엔자임 A를 산화시켜 생성되는 과산화수소(H2O2)로부터 과산화 반응에 의해 형성된 산화물의 발색 반응이 진행된다. 자세한 내용은 상기 측정수단에서 설명한 것과 같다.A sample from which excess coenzyme A and red blood cells, which may affect reaction or color development, are removed by passing through the coenzyme A removal layer and the red blood cell removal layer passes through the non-esterified fatty acid reaction layer and develops color. 4-aminoantipyrine oxide by the peroxidation reaction of hydrogen peroxide produced by the enzymatic reaction of non-esterified fatty acids develops color. More specifically, non-esterified fatty acids in the sample are converted to acylated coenzyme A with acyl coenzyme A synthetase in the presence of coenzymes coenzyme A and adenosine 5'-triphosphate, followed by oxidation of acyl coenzyme A. The color reaction of the oxide formed by the peroxidation reaction proceeds from hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) produced by oxidizing acylated coenzyme A by an enzyme. Details are the same as those described in the above measuring means.
상기 발색을 이용하여 비에스테르화 지방산의 농도를 측정한다. 발색된 산화물은 가시광선 측정기를 이용하여 측정되고, 이를 통해 비에스테르화 지방산의 양을 확인할 수 있다. 자세한 내용은 상기 측정수단에서 설명한 것과 같다.The color development is used to determine the concentration of non-esterified fatty acids. The colored oxide is measured using a visible light meter, through which the amount of non-esterified fatty acids can be confirmed. Details are the same as those described in the above measuring means.
본 발명의 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법은 별도의 전처리 없이 전혈을 이용하여 비에스테르화 지방산의 양을 측정할 수 있고, 반응 전 과잉 코엔자임 A 및 적혈구를 제거하여 결과의 정확도를 높이며, 가시광선 영역에서 측정하는 점에서 우수하다. 가시광선 영역에서 측정 가능하도록 효소 반응을 이용하고 발색제를 첨가하여 간편하게 측정을 진행할 수 있다.The method for measuring non-esterified fatty acids in blood of the present invention can measure the amount of non-esterified fatty acids using whole blood without separate pretreatment, removes excess coenzyme A and red blood cells before reaction to increase the accuracy of the results, and It is excellent in terms of measuring in Measurement can be carried out conveniently by using an enzyme reaction and adding a coloring agent so that it can be measured in the visible light region.
이하에서는 본 발명의 일 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 다만, 이하의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 이에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, it will be described in more detail with reference to an embodiment of the present invention. However, the following examples are only examples to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby.
<실시예><Example>
샘플의 과잉 코엔자임 A를 제거할 수 있는 층, 전혈의 혈구를 제거할 수 있는 적혈구 제거층, 비에스테르화 지방산 반응층(완충제, 촉진제, 아실 코엔자임 A 합성 및 산화효소, 발색제, 계면활성제, 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine) 포함)을 준비한다. A layer capable of removing excess coenzyme A from the sample, a red blood cell removal layer capable of removing blood cells from whole blood, a non-esterified fatty acid reaction layer (buffer, accelerator, acyl coenzyme A synthesis and oxidase, coloring agent, surfactant, peroxidase (peroxidase) and 4-aminoantipyrine (including 4-aminoantipyrine) are prepared.
하기 표 1은 과잉 코엔자임 A 제거층, 표 2는 적혈구 제거층, 표 3은 비에스테르화 지방산 반응층의 조성을 나타낸 것이다.Table 1 below shows the composition of the excess coenzyme A removal layer, Table 2 the red blood cell removal layer, and Table 3 the non-esterified fatty acid reaction layer.
상기 성분 및 농도로 준비된 각 시약에 각각 준비된 다공성 매트릭스를 침지시켜 각각의 성분이 충분히 스며들게 한다. 그 후 침지된 매트릭스를 꺼낸 후 유리봉으로 과잉의 시약을 제거하고, 40℃ 열풍건조기에서 10분 정도 건조하여 각 제거층 및 반응층을 얻는다. 얻어진 각 매트릭스는 가로 세로 각각 5mm 사이즈로 제단하여 사용한다. 이러한 제거층 및 반응층은 측정 샘플의 전개가 수직 흐름으로 되도록 수직 방향으로 배치한 후, 최종적으로 비에스테르화 지방산 측정수단을 제조하였다.The prepared porous matrix is immersed in each reagent prepared with the above components and concentrations so that each component is sufficiently permeated. Thereafter, after taking out the immersed matrix, excess reagent is removed with a glass rod, and dried in a hot air dryer at 40° C. for about 10 minutes to obtain each removal layer and reaction layer. Each of the obtained matrices is used after being cut to a size of 5 mm in each of the vertical and horizontal directions. After the removal layer and the reaction layer were disposed in a vertical direction so that the measurement sample was developed in a vertical flow, a means for measuring non-esterified fatty acids was finally prepared.
<시험예><Test Example>
본 발명의 실시예에 따른 측정수단에 상이한 비에스테르화 지방산 농도를 가지는 혈액 샘플을 첨가한 후 발색의 정도를 확인하였다. 도 3은 본 발명 시험예의 비에스테르화 지방산 농도에 따른 발색 사진이다. (a), (b), (c), (d), (e)는 각각 0.12, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5 mmol/L의 비에스테르화 지방산 농도에 따른 발색이다. 도 3을 참고하면, 비에스테르화 지방산의 농도가 증가함에 따라 발색의 정도도 함께 증가함을 확인할 수 있다.After adding blood samples having different concentrations of non-esterified fatty acids to the measurement means according to the embodiment of the present invention, the degree of color development was confirmed. Figure 3 is a photograph of color development according to the concentration of non-esterified fatty acid in the test example of the present invention. (a), (b), (c), (d), and (e) are color development according to concentrations of non-esterified fatty acids of 0.12, 0.25, 0.5, 1.0, and 1.5 mmol/L, respectively. Referring to Figure 3, it can be seen that the degree of color development also increases as the concentration of non-esterified fatty acids increases.
또한 본 발명의 실시예를 통해 제조된 본 발명의 비에스테르화 지방산 측정수단과, 이미 확립되어 병원에서 사용되어지고 있는 NEFA-HR(2) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Japan) 제품을 비교하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.In addition, by comparing the non-esterified fatty acid measuring means of the present invention prepared through the examples of the present invention with the NEFA-HR (2) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Japan) product already established and used in hospitals The results are shown in Table 4.
표 4의 데이터를 참고하면, 두 제품의 상관계수 R**=0.929로 양호한 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.Referring to the data in Table 4, it was confirmed that the correlation coefficient of the two products R ** = 0.929, indicating a good correlation.
종래의 비에스테르화 지방산 측정수단의 경우 혈구 분리가 필요한 혈청 또는 혈장을 샘플로 하는 방법이며, 정색 반응된 시약을 수치화할 수 있는 고가의 측정 장비를 포함하여 실험 전문 도구들이 있어야 한다는 단점과 측정 물질 특성상 적혈구로부터 빨리 분리되어 신속한 시간 내에 측정되어야 한다는 점, 그리고 정확한 분석을 위해 샘플 속 과잉의 코엔자임 A를 제거하는 시약을 사용하는데 이 시약이 비교적 안정성이 좋지 않은 점 등 여러 번거로운 점이 존재하고 있었다. In the case of the conventional non-esterified fatty acid measurement method, it is a method of taking serum or plasma as a sample that requires blood cell separation, and the disadvantages of requiring specialized experimental tools, including expensive measuring equipment capable of quantifying the color-reacted reagent, and measurement materials Due to its characteristics, there are several cumbersome points such as the fact that it must be quickly separated from red blood cells and measured within a rapid time, and that a reagent that removes excess coenzyme A in the sample is used for accurate analysis, but this reagent has relatively poor stability.
이에 비해 본 발명의 비에스테르화 지방산 측정수단은 측정수단 내에 샘플 속에 존재하는 과잉의 코엔자임 A를 제거하는 층과 신속한 측정을 위해 샘플을 채취 후 별도로 전처리하여 분리하는 과정을 거치지 않은 채로 채취 즉시 전혈 샘플을 그대로 떨어뜨려도 비에스테르화 지방산의 양을 정확히 측정하기 때문에 사용자가 이용하기 매우 편리한 점에서 우수하다. On the other hand, the non-esterified fatty acid measurement means of the present invention is a whole blood sample immediately after collection without a layer for removing excess coenzyme A present in the sample within the measurement means and a separate pretreatment and separation process after taking the sample for rapid measurement. It is excellent in that it is very convenient for users to use because it accurately measures the amount of non-esterified fatty acid even if it is dropped as it is.
또한 본 발명의 경우 가시광선 영역에서 측정 가능하도록 비에스테르 지방산과 효소 간의 반응을 이용함에 따라 부피가 작고 저렴한 가시광선 광원을 통해 흡광도를 측정할 수 있다. 이로 인해 간편하게 휴대가 가능하고, 측정 비용이 저렴하여 비에스테르 지방산의 측정이 용이한 점에서 우수하다.In addition, in the case of the present invention, the absorbance can be measured through a small and inexpensive visible light source by using the reaction between the non-ester fatty acid and the enzyme so that it can be measured in the visible light region. Therefore, it is excellent in that it can be easily carried and the measurement cost is low and the measurement of non-ester fatty acid is easy.
이상의 설명은 본 발명의 기술적 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서 본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것도 아니다. 본 발명의 보호범위는 특허청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.The above description is merely an example of the technical idea of the present invention, and various modifications and variations can be made to those skilled in the art without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention, but to explain, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. The protection scope of the present invention should be construed according to the claims, and all technical ideas within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (10)
상기 진단부는,
상기 혈액 주입구 하부에 구비되어 상기 혈액 주입구를 통해 투입된 혈액 샘플을 균일하게 확산하는 메쉬구조의 확산층;
상기 확산층의 하부에 구비되어 과잉 코엔자임 A를 제거하는 코엔자임 A 제거층;
상기 코엔자임 A 제거층의 하부에 구비되어 적혈구를 제거하는 적혈구 제거층; 및
상기 적혈구 제거층의 하부에 구비되고, 비에스테르화 지방산의 효소 반응으로 생성되는 과산화수소의 과산화 반응에 의한 4-아미노안티피린 산화물이 발색하는 비에스테르화 지방산 반응층;을 포함하고,
상기 투영창을 통해 상기 비에스테르화 지방산 반응층의 발색을 확인하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단.In the measuring means having a blood injection port, a projection window, and a diagnosis unit,
The diagnosis unit,
a diffusion layer having a mesh structure provided under the blood inlet and uniformly diffusing the blood sample injected through the blood inlet;
a coenzyme A removal layer provided under the diffusion layer to remove excess coenzyme A;
a red blood cell removal layer provided under the coenzyme A removal layer to remove red blood cells; and
A non-esterified fatty acid reaction layer provided under the red blood cell removal layer and in which 4-aminoantipyrine oxide by a peroxidation reaction of hydrogen peroxide generated by an enzymatic reaction of non-esterified fatty acids develops color,
A non-esterified fatty acid measuring means in blood, characterized in that for confirming the color development of the non-esterified fatty acid reaction layer through the projection window.
상기 확산층의 메쉬 사이즈는 200 ~ 300 μm인 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단.According to claim 1,
A means for measuring non-esterified fatty acids in blood, characterized in that the mesh size of the diffusion layer is 200 to 300 μm.
상기 코엔자임 A 제거층은 노르말-에틸말레이미드(N-ethyl-maleimide, NEM) 및 카제인(casein)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단.According to claim 1,
The method for measuring non-esterified fatty acids in blood, characterized in that the coenzyme A removal layer contains normal-ethylmaleimide (N-ethyl-maleimide, NEM) and casein.
상기 적혈구 제거층은 하이드록시기를 포함하는 안정제, 완충제, 및 친수성 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단.According to claim 1,
The means for measuring non-esterified fatty acids in blood, characterized in that the red blood cell removal layer includes a stabilizer containing a hydroxyl group, a buffer, and a hydrophilic surfactant.
상기 비에스테르화 지방산 반응층은 완충제, 발색제, 촉진제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine), 및 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단.According to claim 1,
The non-esterified fatty acid reaction layer is a buffer, a coloring agent, an accelerator, a surfactant, an oxidation reaction enzyme, peroxidase, 4-aminoantipyrine, and adenosine 5'-triphosphate ), Non-esterified fatty acid measuring means in the blood, characterized in that it comprises.
노르말-에틸말레이미드 및 카제인을 포함하는 코엔자임 A 제거층을 제조하는 단계;
완충제, 친수성 계면활성제, 및 하이드록시기를 포함하는 안정제를 포함하는 적혈구 제거층을 제조하는 단계;
완충제, 발색제, 촉진제, 계면활성제, 산화반응효소, 퍼옥시다아제(peroxidase), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrine), 및 아데노신 5'-트리포스페이트(adenosine 5'-triphosphate)을 포함하는 비에스테르화 지방산 반응층을 제조하는 단계; 및
상기 확산층, 상기 코엔자임 A 제거층, 상기 적혈구 제거층, 및 상기 비에스테르화 지방산 반응층을 차례대로 적층하는 단계;를 포함하는 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 제조방법.Manufacturing a diffusion layer of a mesh structure;
preparing a coenzyme A removal layer containing normal-ethylmaleimide and casein;
preparing a red blood cell removal layer including a buffer, a hydrophilic surfactant, and a stabilizer containing a hydroxyl group;
Non-esterified fatty acids including buffers, colorants, accelerators, surfactants, oxidases, peroxidases, 4-aminoantipyrine, and adenosine 5'-triphosphate preparing a reaction layer; and
A method of manufacturing a means for measuring non-esterified fatty acids in blood, comprising sequentially stacking the diffusion layer, the coenzyme A removal layer, the red blood cell removal layer, and the non-esterified fatty acid reaction layer.
상기 확산층의 상부에 구비되고 혈액 주입구를 포함하는 상부 케이스와 상기 반응층의 하부에 구비되고 투영창을 포함하는 하부 케이스를 결합하는 단계;를 더 포함하는 혈중 비에스테르화 지방산 측정수단 제조방법.According to claim 6,
The method of manufacturing a means for measuring non-esterified fatty acids in blood, further comprising: combining an upper case provided on the upper portion of the diffusion layer and including a blood inlet and a lower case provided on the lower portion of the reaction layer and including a projection window.
상기 확산층을 통과한 샘플이 노르말-에틸말레이미드 및 카제인을 포함하는 코엔자임 A 제거층을 통과하며 과잉 코엔자임 A를 제거하는 제2 단계;
상기 제2 단계에 따라 과잉 코엔자임 A가 제거된 샘플이 적혈구 제거층을 통과하며 적혈구를 제거하는 제3 단계;
상기 제3 단계에 따라 적혈구가 제거된 샘플이 비에스테르화 지방산 반응층을 통과하며 발색하는 제4 단계; 및
상기 제4 단계에 따른 발색을 이용하여 비에스테르화 지방산의 농도를 측정하는 제5 단계;를 포함하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법.A first step of injecting a blood sample into a diffusion layer having a mesh structure;
a second step of removing excess coenzyme A by passing the sample passing through the diffusion layer through a coenzyme A removing layer containing normal-ethylmaleimide and casein;
a third step of removing red blood cells by passing the sample from which excess coenzyme A has been removed according to the second step through the red blood cell removal layer;
a fourth step in which the sample from which the red blood cells are removed according to the third step passes through the non-esterified fatty acid reaction layer to develop color; and
A method for measuring non-esterified fatty acids in blood comprising a fifth step of measuring the concentration of non-esterified fatty acids using the color development according to the fourth step.
상기 제4 단계는 비에스테르화 지방산의 효소 반응으로 생성되는 과산화수소의 과산화 반응에 의한 4-아미노안티피린 산화물이 발색하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법.According to claim 8,
The fourth step is characterized in that 4-aminoantipyrine oxide by the peroxidation reaction of hydrogen peroxide produced by the enzymatic reaction of non-esterified fatty acids develops color, a method for measuring non-esterified fatty acids in blood.
상기 제5 단계는 가시광선 측정기를 이용하는 것을 특징으로 하는, 혈중 비에스테르화 지방산 측정방법.According to claim 8,
The fifth step is a method for measuring non-esterified fatty acids in blood, characterized in that using a visible light meter.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220004273A KR20230108628A (en) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | Non-esterified fatty acids(NEFA) measurement means and a method of a manufacturing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220004273A KR20230108628A (en) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | Non-esterified fatty acids(NEFA) measurement means and a method of a manufacturing the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230108628A true KR20230108628A (en) | 2023-07-18 |
Family
ID=87423484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220004273A KR20230108628A (en) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | Non-esterified fatty acids(NEFA) measurement means and a method of a manufacturing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230108628A (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102035772B1 (en) | 2016-12-08 | 2019-10-25 | 재단법인 아산사회복지재단 | Biomarker comprising of free fatty acid for prognosis of idiopathic pulmonary fibrosis |
-
2022
- 2022-01-11 KR KR1020220004273A patent/KR20230108628A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102035772B1 (en) | 2016-12-08 | 2019-10-25 | 재단법인 아산사회복지재단 | Biomarker comprising of free fatty acid for prognosis of idiopathic pulmonary fibrosis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2518501B1 (en) | Dry test strip and method for measuring creatinine | |
| Talalak et al. | A facile low-cost enzymatic paper-based assay for the determination of urine creatinine | |
| US5516700A (en) | Automated urinalysis method | |
| CN109239059B (en) | Glycated serum protein assay kit and preparation method and application thereof | |
| US20070154976A1 (en) | Method of determining substrate contained in hemoglobin-containing sample | |
| EP2319937B1 (en) | Blood component measurement method utilizing hemolyzed whole blood, and kit for the method | |
| JP5906604B2 (en) | Whole blood sample component measurement method | |
| KR102211991B1 (en) | Blood sample assay method | |
| CN111808921A (en) | Trinder reaction-based detection kit and application thereof | |
| CN106086161A (en) | A kind of lipoprotein phospholipase A2 detectable and preparation thereof and using method | |
| CN106290346A (en) | Mensuration reagent of superoxide dismutase and preparation method thereof | |
| JP7182724B2 (en) | Calibrators and Controls for Determining Percent Glycated Hemoglobin in Patient Fluid Test Samples | |
| KR20230108628A (en) | Non-esterified fatty acids(NEFA) measurement means and a method of a manufacturing the same | |
| JP7484998B2 (en) | Biological component measurement kit and biological component measurement method with improved measurement sensitivity | |
| EP3498860B1 (en) | Method for measuring hba1c | |
| JPWO2006030866A1 (en) | Method for quantitative determination of uric acid | |
| JP3403407B2 (en) | Control reagents containing hydroxylamine or antioxidants | |
| CN110398586B (en) | Fructosamine assay kit | |
| US5776780A (en) | Method for quantitatively measuring white blood cells esterase activity in urine | |
| KR102033466B1 (en) | 1,5-anhydroglucitol measurement means and a method of manufacturing the same | |
| JP7206631B2 (en) | Method for quantifying 4-hydroxyantipyrine, method for producing biological component measurement kit, and biological component measurement kit | |
| KR102033470B1 (en) | Method of manufacturing 1,5-anhydroglucitol measurement means | |
| KR101716322B1 (en) | Homocysteine measurement means and a method of manufacturing the same | |
| JP2002238598A (en) | Composition for calcium ion assay and assaying method | |
| EP4289963A1 (en) | Stabilizer and stabilizing method for color developing agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |