KR20230107672A - 안정적 유리화 방법 - Google Patents
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Abstract
데시케이션 챔버 내의 모세관 기판 네트워크 상에 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 제공하는 단계, 및 열 에너지 및 낮아진 대기압 둘 다를 제공하여 유리화 매질 또는 생물학적 샘플이 낮아진 대기압의 결과로서의 비등 또는 극저온 온도를 나타내지 않으면서 급속 유리화를 제공하는 단계를 포함하는, 생물학적 물질의 비-극저온 유리화 방법이 개시된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 19일에 출원된 미국 가특허출원 63/115,936을 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은, 안정적 주변 온도 저장이 가능한 생물학적 물질의 유리화 및 제조 방법에 관한 것이다.
유리화는 액체로부터 무정형 유리질 상태로의 직접 전이 과정이다. 유리화 공정은 종종 생물학적 물질을 보존하기 위해 적용되며 역사적으로 생물학적 물질을 의도적으로 또는 감소된 대기압으로의 노출로 인해 극저온 온도로 냉각시키는 것을 포함한다. 극저온 온도에서, 유리화 기술은, 종래의 동결보존 동안 형성되는 것으로 공지된 얼음 결정 형성으로 인해 극저온 저장에서 통상적으로 발생하는 손상 효과 중 일부에 대한 노출을 초래할 수 있다. 이 문제의 해결을 돕기 위해, 얼음 핵형성을 피하기 위해 극저온 보호제 (CPA)가 고농도로 사용된다. 보다 낮은 농도의 CPA가 요망되지만 이들 저농도에서 보존을 달성하기 위해서는 초고속 열 전달이 요구된다.
샘플 부피를 감소시킴으로써 및/또는 냉각률을 증가시킴으로써 열 전달률을 증가시킬 수 있다. 유리화될 부피를 최소화하기 위한 얇은 스트로 또는 초박막의 사용과 같은 냉각률을 증가시키기 위한 많은 기술이 활용되었다.
주변 온도에서의 무수 유리화는 생물학적 물질을 보존하기 위한 대안적 전략이다. 자연에서, 폭넓게 다양한 유기체가 극도의 탈수에서 생존할 수 있으며, 이는 많은 경우에 세포내 공간에서의 다량의 (그의 건조 중량의 20%만큼 많은) 트레할로스 및 수크로스 등의 유리 형성 당의 축적과 상관된다. 이러한 "유리 형성" 당은 역사적으로 데시케이션의 손상 효과에 대한 보호를 제공하기 위해 형질 막의 양면 상에 존재할 필요가 있다. 데시케이션 기술은 유리질 매트릭스에서 물질의 생화학적 과정을 극적으로 제한하거나 정지시킨다. 무수 유리화에 의한 단백질 등의 많은 생물학적 물질의 유리화의 성공에도 불구하고, 세포 물질에 대한 보다 광범위한 적용은 여전히 세포 자체의 데시케이션 내성을 증가시키는 것을 필요로 한다.
데시케이션 내성을 향상시키는 방법은 트레할로스, 글리세롤, 풀룰란 및 수크로스를 함유하는 개선된 유리화 매질을 활용하는 것을 포함한다. 보호 작용제로 세포를 로딩하는 개선된 방법이 도움이 되지만, 데시케이션 동안 세포 손상을 최소화하기 위한 기술을 개발할 추가의 필요성이 존재한다. 일반적으로 건식 가공 동안 삼투압 스트레스에 대한 연장된 노출에 대한 세포의 높은 민감성으로 인해 손상 및 분해가 발생할 수 있다. 삼투압 스트레스는 트레할로스와 같은 보호 당의 존재 하에서도 상대적으로 높은 수분 함량에서 세포 사멸을 유발할 수 있다.
세포 데시케이션에 대한 가장 통상적인 접근은 현탁된 세포를 갖는 고착성 액적에서의 건조를 포함한다. 그러나, 고착성 액적의 증발 건조를 사용하는 데시케이션은 본질적으로 느리고 성질상 불균일하다. 세포가 유리 형성 용액 중에서 데시케이션될 때 샘플의 액체/증기 계면에서 유리질 스킨이 형성된다. 이 유리질 스킨은 특정 수준의 건조를 넘어서는 샘플의 추가 데시케이션을 늦추고 궁극적으로 막으며 샘플에 걸쳐 물 함량의 상당한 공간적 불균일성을 유도한다. 그 결과, 유리질 스킨 아래에서 부분적으로 데시케이션된 샘플 내에 갇힌 세포는 높은 분자 이동성으로 인해 유리화되지 않고 분해될 수 있다.
샘플에 걸쳐 매우 낮고 균일한 최종 수분 수준을 달성하기 위한 빠르고 실용적인 데시케이션 기술의 개발은 무수 유리화 기술의 단점을 극복할 수 있다. 건조 보존은 유리화 용액이 세포외 공간에 집중됨에 따라 직면하는 누적 화학적 스트레스에 의한 생물학적 물질의 분해로 인해 장기간 저장에 있어 큰 제한을 겪는다.
데시케이션을 위한 이전 기술은 유리 전이 온도 미만의 온도에서 세포를 급속히 건조시키기 위해 진공을 적용하였다. 그러나, 진공의 적용은 생물학적 샘플의 온도를 상당히 낮출 수 있고, 그에 따라 샘플이 얼음 결정 형성을 겪으며, 이는 세포 손상을 초래할 수 있다. 또한, 진공에 의해 제공되는 대기 변화는 그 안의 물질의 비점에도 영향을 미쳐, 물질을 손상시킬 추가의 위험을 제공한다. 본 개시내용은 비-극저온 온도에서 생물학적 물질의 장기간 저장을 상당히 용이하게 할 뿐만 아니라 이전의 극저온 유리화 및 저장 기술과 관련된 문제를 극복하기 위해 샘플 내에서의 동결 방지를 통해, 또한 용액 비등 없이 유리화된 생물학적 물질의 개선된 생존가능성을 생성하는 빠른 데시케이션 방법을 제공한다.
도면은 반드시 축척에 따른 것은 아니다; 일부 특징은 특정 구성요소의 세부사항을 나타내기 위해 과장되거나 최소화될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 특정 구조적 및 기능적 세부사항은 제한적인 것으로 해석되어서는 안 되며, 단지 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 개시내용을 다양하게 사용하도록 교시하기 위한 대표적인 근거로서 해석되어야 한다. 예시적 측면은 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 보다 완전히 이해될 것이며, 도면은 하기와 같다:
도 1a는 모세관력이 점성력보다 현저히 더 높은 상단에 배치된 액체(20)의 박막과 함께 친수성 베드(10)를 나타낸다. 이는 데시케이션될 수 있는 액체(21)의 양을 제한한다.
도 1b는 윤곽이 있는 모세관 베드로 형상화된 기판을 나타내며, 여기서 데시케이션은 윤곽(30)의 피크에서 우선적으로 발생할 수 있으며, 여기서 데시케이션 동안 트로프로부터 피크를 향한 모세관 현상은 전체 유리화율을 향상시키고 도 1a에 비해 큰 샘플 부피의 유리화를 가능하게 할 수 있다.
도 1c는 윤곽이 있는 모세관(40) 내에 과도한 유체가 존재할 때 표면 패턴을 충전시키는 액체를 나타내며, 이는 감압 하에 버블 핵형성 및 비등이 지배적이 되게 하며, 이는 민감한 분자의 손상을 초래할 수 있다.
도 2a는 유리화의 일반화된 개략도를 나타낸다. 극저온 유리화는 액체 (생물학적 또는 기타 물질 함유)를 동결 대역을 우회하여 유리 전이 온도 미만으로 빠르게 냉각시킴으로써 (경로 1-2-3) 역사적으로 달성된다. 물질의 총 질량은 공정을 통해 보존된다. 유사하게, 물질의 유리화는 결정화 공정을 우회하는 빠른 데시케이션에 의해 (경로 1-5-6) 달성될 수 있다. 이 경우, 현저한 질량 손실 (주로 물)이 발생한다. 다량 물질의 극저온 유리화는 열 전달 한계로 인해 어려울 수 있고, 따라서 일반적으로 현저한 표면/부피 비율을 제공하는 바이알 내에서 수행될 수 있다. 유사하게, 빠른 데시케이션은 큰 표면/부피 비율에 의해, 또한 구체적으로 감압에서 용이해진다. 압력의 감소는 또한 액체의 비점을 감소시키고, 이는 민감한 생체분자 또는 물질을 유리화하는 동안 액체의 바람직하지 않은 비등의 위험이 있다. 1-4-6의 경로는 본 개시내용의 개략도를 나타내며, 여기서 열 및 낮은 대기압의 적용은 동결 온도를 겪는 것을 피하면서 빠른 유리화를 가능하게 한다.
도 2b는 삼중점 및 그에 따라 유리화 동안 동결을 피하는 표적화된 샘플 온도 T1을 갖는 물의 삼중점의 개략도를 나타낸다.
도 3은 유리를 형성하기 위해 진공 하에 보다 큰 부피의 액체의 빠른 데시케이션을 용이하게 하는 예시적 모세관 기판 (멤브레인)을 나타낸다.
도 4는 (A)에서 모세관 기판의 표면 상에 과도한 액체가 축적될 때 모세관 효과가 실현되지 않고 진공 하에 축적된 액체에서 여전히 비등이 발생할 수 있으며 이는 바람직하지 않음을 보여준다. 모세관 효과를 실현하기 위해 액체는 모세관 기판의 기공 내에 수용되어 메니스커스를 형성할 수 있다. 기복이 있는 표면 상에서의 이러한 국소화는 유사하며 물질의 피크 및 트로프에 의해 형상화된다. 모세관 계면에서의 액체 분율 (ξ), 즉 액체가 차지하는 면적 (2차원 도식에서)은 모세관 증발의 최적화를 가능하게 하는 하나의 파라미터이다. 모세관 구동 증발은 액체의 점성 압력 강하가 액체-증기 계면에서 최대 모세관 압력을 능가할 때 발생한다. 액체 분율 ξ는 벌크로부터 액체-증기 계면까지의 전체 압력 강하와 관련된다. 대기압 및 열 유속 (B) 비-적용 하에 액체는 넓은 영역을 커버링하여, 액체 분율, ξ→1이 된다. 이들 조건 하에 모세관 구동 증발률은 최소이다. (C)에 나타낸 바와 같이 주변 압력의 감소는 ξ를 감소시키고, 또한 증발률을 증가시킨다. 그러나, 특정 임계 압력 강하를 넘어서면, 바람직하지 않은 핵형성 비등이 발생할 수 있다. (D)에 나타낸 바와 같이 적용된 열 유속 Q는 또한 증발률을 향상시킬 수 있지만, 또한 바람직하지 않은 필름 비등의 위험이 존재한다. (E)에 나타낸 바와 같이 모세관 메니스커스의 표면으로부터의 열 유속의 적용은, 필름 비등의 위험을 제거한다. (F)에 나타낸 바와 같이 카운터 구배 방식으로 적용되는 큰 ΔP 및 Q는 기공에 한정된 액체 메니스커스, 즉 액체 분율 ξ << 1 (예를 들어 ~0.25)로 이어져, 비등을 피하면서 최고 증발률을 제공한다. 따라서, 표면과 벌크 액체 사이의 온도 구배의 유지는, 빠른 증발이 달성될 수 있는, (F)에 예시된 바와 같은 모세관 증발로 이어진다. 액체 수준이 모세관 기판 내로 후퇴함에 따라, 압력 구배 및 온도 구배가 유지되는 한 모세관 증발 현상이 여전히 실현된다.
도 5는 (A)에서 4% BSA, 15% 트레할로스 이수화물, 0.75% 글리세롤, 2% 트윈(Tween)-20, 및 물을 함유하는 액체로 로딩된 다양한 형상의 유리 멤브레인 (모세관 기판)에 대한 예시적 결과를 나타낸다. 멤브레인의 mm2 당 액체 로딩은 모든 경우에 0.316 ml에서 유지되었다. 케이스 1의 경우, 멤브레인을 0.25 인치 직경 원으로 절단하고, 각각에 10 ml 액체를 로딩하였다. 480 ml를 함유하는 총 48개의 샘플을 진공 챔버 내부의 가열된 (37℃) 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 2의 경우, 각각 470 ml 액체를 함유하는 3개의 긴 멤브레인 스트립 (240 mm x 6.23 mm)을 가열된 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 3의 경우, 1700 ml 액체를 함유하는 단일 스트립 (240 mm x 22 mm)을 활용하였다. 챔버를 29.5 mmHg로 비웠다. 온도-시간 플롯은 유리화 공정의 스테이지를 나타낸다. 비우기 공정 개시시, 멤브레인의 스캐폴드가 대부분 액체를 함유하면서 압력이 빠르게 강하하고 예상과 같이 압력 강하와 함께 온도가 떨어진다. 와이어 메쉬/베드로부터의 공급된 열 유속은 동결 체제로의 스캐폴드 온도의 추가 강하를 막는다. 동결점은 유리화 부형제/액체의 제제화에 따라 영하의 온도까지 확장될 수 있음을 인지해야 한다. 동결을 막는 것 이외에도, 베드로부터의 공급된 열 유속은 또한 상기에 예시된 바와 같이 (도 4의 F에서) 감압 하에 액체의 비등을 막으면서 모세관 증발을 용이하게 한다. 스캐폴드로부터 수분이 증발함에 따라, 온도가 베드 온도에 도달할 때까지 상승한다. 열 유속은 스캐폴드 온도가 세트 온도, 통상적으로 베드 온도를 초과하지 않도록 제어된다. 도 5로부터 보이는 바와 같이, 멤브레인 스캐폴드 온도가 베드 온도에 도달하는 데 걸리는 시간은 스캐폴드 구성 뿐만 아니라 그에 로딩된 액체의 양에 따라 달라진다. 베드 온도에 도달하는 데 걸리는 시간은 1차 유리화 시간의 척도이며, 이는 대부분의 액체가 이 기간 동안 증발됨을 의미한다. 그러나, 데시케이션 공정은 일부 잔류 수분을 제거하기 위해 여전히 이 기간을 넘어 연장될 수 있고, 이는 2차 데시케이션이라 불릴 수 있으며, 이는 모세관 현상에 의존하지 않는다. 공정 파라미터 및 스캐폴드 기하구조는 주어진 시간에 1차 데시케이션 공정을 겪을 수 있는 액체의 부피를 최적화하도록 선택된다. 일반적으로, 도 2a에 나타낸 결정 침전 상 경계를 우회하고 유리 형성을 보장하기 위해서는 보다 빠른 데시케이션 속도가 바람직하다. 그러나, 유리화가 보장되는 임계 속도는 액체의 화학, 친수성, 다공성 및 치수 등의 모세관 기판 특징에 따라 달라진다. 모세관 네트워크 유리화 스캐폴드 (솔리드 자취) 및 비-다공성 유리 표면 (점선) 및 스캐폴드 샘플에 대해 얻어진 잔류 수분 수준 (개방 원)을 사용하여 수행된 유리화 사이클에 대한 온도 프로파일 (B). 1-6분 시간 윈도우에서 유리 지지체 사용시 나타난 온도 변동이 액체가 버블링하고 비등하는 것으로 나타난 관찰과 동시에 기록되었다. 스캐폴드 상에서 유리화된 샘플에 대해서는 버블링이 관찰되지 않았다.
도 6a는, 데시케이션 장치 자체가 윤곽이 있는 벽을 특징으로 하는 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 데시케이션 장치는 실린더 형상으로 롤링된 친수성 모세관 기판 (멤브레인)으로 형성될 수 있다. 실린더는 도 4와 유사한 멤브레인 내에 유리화 매질을 하우징함으로써 개선된 유리화를 촉진할 수 있다.
도 6b는, 다공성 물질 모세관 기판이 진공에 작동가능하게 연결되고 멤브레인 상에 배치된 샘플의 유리화를 위해 밀봉될 수 있는 실린더 내에 배치되어 있고, 멤브레인이 유리화를 위한 연속 모세관 네트워크를 제공하는 것인, 본 개시내용의 추가의 측면을 나타낸다.
도 7a는, 모세관 증발을 촉진하고 스캐폴드 온도가 동결 체제로 떨어지는 것을 막도록 지향성 열 유속을 제공하기 위해 실린더형 데시케이션 장치가 가열된 블록 내에 배치되어 있는, 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 가열 방법은 성질상 전도성 또는 방사성일 수 있다.
도 7b는, 실린더의 내부로부터 추가의 열 공급원이 제공되어 있는, 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 가열 방법은 성질상 전도성 또는 방사성일 수 있다. 열 유속은 모세관 기판의 단지 하나의 표면 또는 양쪽 표면으로부터 제공될 수 있다.
도 8은 카트리지 (도 6b)와 평평한 모세관 기판 (멤브레인) (도 3) 사이의 120 IU/mL의 유리화 혼합물 (VM) 중의 농도에서의 인슐린의 유리화를 나타낸다. 각 샘플은 15 IU (125 μL VM)를 갖는다. 여섯 (6)개의 "카트리지" 샘플 및 세 (3)개의 평평한 멤브레인 샘플이 진공 챔버 내부에서 함께 유리화되었다 (열 없음). 유리화 공정 후 수분 잔류비 (MRR) 및 단백질 회수율을 평가하여 그래프에 나타내었다.
도 9는 (A)에서 친수성 물질로 제조된 모세관 기판을 사용하여 생성된 개선된 유리화를 나타낸다. 원래 소수성인 멤브레인을 친수성으로 만들기 위해 저온 플라즈마로 처리하였다. 멤브레인 상의 약물 제제 현탁시, 액체는 거의 구형의 액적을 형성한 반면 (좌측 상단), 친수성 멤브레인은 액체가 모세관 채널로 유동하는 것을 가능하게 하였다. 유리화 공정 동안 소수성 멤브레인 상의 액체 액적은 먼저 비등되고 이어서 동결된 반면, 친수성 멤브레인 상의 액체는 급속히 유리화되어 유리질 단일체를 형성하였다. 진공의 해제시, 동결된 액적은 다시 액체가 되었지만, 부분적 수분 손실로 크기가 감소하였다. 유리화에 대한 모세관 보조 증발의 효능은 친수성 멤브레인 활용시 명백하다. 원형 스캐폴드 (좌측)에 적용되거나 고체 유리 기판 (우측)에 적용되고 진공에 적용된 유리화 매질의 사진 (B). 유리 표면 상에 배치된 유리화 매질의 불규칙한 외관은 버블의 급속한 형성 및 파열로 인한 것이며 비등의 증거이다. 스캐폴드 사용시에는 버블이 관찰되지 않았다.
도 10은 열이 적용되지 않은 실린더형 5 ml 챔버 내의 멤브레인 상에서 제조된 인슐린의 유리화 결과를 나타내며, 이는 MRR이 이들 조건 하에 생물학적 물질 로딩에 의해 극적으로 영향 받음을 보여준다.
도 11은 도 10에 나타낸 바와 같은 인슐린 유리화로부터 기록된 중량 손실을 나타낸다.
도 12는 도 10에 기재된 바와 같은, 그러나 유리화되는 샘플에 열 에너지를 제공하기 위해 실린더의 벽에 열이 적용된, 유리화된 인슐린에 대한 MMR을 나타낸다.
도 13은 도 12에 기재된 유리화된 인슐린에서 나타난 물 손실을 나타낸다.
도 14는낮은 출발 부피로부터의 유리화된 mRNA의 성공적인 재구성 및 유지된 기능을 나타낸다. (A)는 액체 mRNA (레인 2 및 3), 재구성된 mRNA (레인 4 및 5) 및 동일한 저장 조건에 적용된 유리화되지 않은 mRNA (레인 5 및 6)를 나타내는 아가로스 겔을 나타낸다. (B)는 신선한 mRNA (상단), 유리화되지 않은 mRNA (중앙) 및 재구성된 유리화된 mRNA (저부)로의 트랜스펙션 후 발현된 녹색 형광 단백질 (GFP)을 나타낸다. (C)는 포지티브 대조군에 대한 GFP의 형광의 퍼센트를 나타낸다. 유리화 공정은 회수된 mRNA의 양 또는 그의 기능에 부정적 영향을 주지 않았다.
도 15는 낮은 출발 질량의 항체의 유지된 양 및 기능을 나타낸다. 재구성된 알칼리-포스파타제 (ALP) 컨쥬게이션된 IgG는 신선한 유리화되지 않은 항체와 ELISA에서 검출 항체 (Ab)와 유사한 반응을 제공하였다. 유리화 공정은 55℃에서 저장시에도 기능을 변경하지 않은 반면, 유리화되지 않은 항체에서의 55℃는 기능을 극적으로 감소시켰다.
도 16은 재구성된 공동-유리화된 루시퍼라제 및 루시페닌과 신선한 유리화되지 않은 루시퍼라제 및 루시페린 사이의 비교를 나타낸다. 유리화 공정은 ATP가 추가됨에 따라 기능적 활성 또는 발광에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
도 17은 (A)에서 항원, 포획 항체, 및 검출 항체가 모두 유리화된 ELISA를 나타내고, (B)는 신선한 항원과 유리화된 포획 항체 및 검출 항체가 검정된 활성을 나타낸다. (A) 및 (B) 둘 다 ELISA에 대한 비교를 나타내며, 여기서 3개 성분 모두 대조군으로서 유리화되지 않았다. 유리화 공정은 검정에서 항체 또는 항원 기능적 활성을 변경하지 않았다.
도 18은 유리화되지 않은 신선한 시약과 ELISA에서 4개 성분에 대한 유리화를 비교하는 ELISA를 나타낸다. 유리화 공정은 검정에서 적절하게 기능하는 임의의 성분의 능력을 변경하지 않았다.
도 19는 600 mM 트레할로스, 5% 글리세롤 (트레할로스의 중량에 대하여) 및 나머지 PBS를 함유하는 1X 유리화 매질을 제조하고 유리화를 위해 1 인치 직경 8 ㎛ PES 멤브레인에 첨가하는 것을 나타낸다. 4개 유리화 사이클에서, 2개 샘플의 온도 프로파일이 기록되고, 또 다른 유리화 사이클에서, 1개 샘플의 온도 프로파일이 기록된다. 전체적으로, 9개 샘플에 대한 온도 데이터 (실행간, 실행내)가 기록되고 에러 바의 존재와 함께 플롯팅된다. 데이터는 공정의 일관성, 강건성 및 반복성을 나타낸다.
도 1a는 모세관력이 점성력보다 현저히 더 높은 상단에 배치된 액체(20)의 박막과 함께 친수성 베드(10)를 나타낸다. 이는 데시케이션될 수 있는 액체(21)의 양을 제한한다.
도 1b는 윤곽이 있는 모세관 베드로 형상화된 기판을 나타내며, 여기서 데시케이션은 윤곽(30)의 피크에서 우선적으로 발생할 수 있으며, 여기서 데시케이션 동안 트로프로부터 피크를 향한 모세관 현상은 전체 유리화율을 향상시키고 도 1a에 비해 큰 샘플 부피의 유리화를 가능하게 할 수 있다.
도 1c는 윤곽이 있는 모세관(40) 내에 과도한 유체가 존재할 때 표면 패턴을 충전시키는 액체를 나타내며, 이는 감압 하에 버블 핵형성 및 비등이 지배적이 되게 하며, 이는 민감한 분자의 손상을 초래할 수 있다.
도 2a는 유리화의 일반화된 개략도를 나타낸다. 극저온 유리화는 액체 (생물학적 또는 기타 물질 함유)를 동결 대역을 우회하여 유리 전이 온도 미만으로 빠르게 냉각시킴으로써 (경로 1-2-3) 역사적으로 달성된다. 물질의 총 질량은 공정을 통해 보존된다. 유사하게, 물질의 유리화는 결정화 공정을 우회하는 빠른 데시케이션에 의해 (경로 1-5-6) 달성될 수 있다. 이 경우, 현저한 질량 손실 (주로 물)이 발생한다. 다량 물질의 극저온 유리화는 열 전달 한계로 인해 어려울 수 있고, 따라서 일반적으로 현저한 표면/부피 비율을 제공하는 바이알 내에서 수행될 수 있다. 유사하게, 빠른 데시케이션은 큰 표면/부피 비율에 의해, 또한 구체적으로 감압에서 용이해진다. 압력의 감소는 또한 액체의 비점을 감소시키고, 이는 민감한 생체분자 또는 물질을 유리화하는 동안 액체의 바람직하지 않은 비등의 위험이 있다. 1-4-6의 경로는 본 개시내용의 개략도를 나타내며, 여기서 열 및 낮은 대기압의 적용은 동결 온도를 겪는 것을 피하면서 빠른 유리화를 가능하게 한다.
도 2b는 삼중점 및 그에 따라 유리화 동안 동결을 피하는 표적화된 샘플 온도 T1을 갖는 물의 삼중점의 개략도를 나타낸다.
도 3은 유리를 형성하기 위해 진공 하에 보다 큰 부피의 액체의 빠른 데시케이션을 용이하게 하는 예시적 모세관 기판 (멤브레인)을 나타낸다.
도 4는 (A)에서 모세관 기판의 표면 상에 과도한 액체가 축적될 때 모세관 효과가 실현되지 않고 진공 하에 축적된 액체에서 여전히 비등이 발생할 수 있으며 이는 바람직하지 않음을 보여준다. 모세관 효과를 실현하기 위해 액체는 모세관 기판의 기공 내에 수용되어 메니스커스를 형성할 수 있다. 기복이 있는 표면 상에서의 이러한 국소화는 유사하며 물질의 피크 및 트로프에 의해 형상화된다. 모세관 계면에서의 액체 분율 (ξ), 즉 액체가 차지하는 면적 (2차원 도식에서)은 모세관 증발의 최적화를 가능하게 하는 하나의 파라미터이다. 모세관 구동 증발은 액체의 점성 압력 강하가 액체-증기 계면에서 최대 모세관 압력을 능가할 때 발생한다. 액체 분율 ξ는 벌크로부터 액체-증기 계면까지의 전체 압력 강하와 관련된다. 대기압 및 열 유속 (B) 비-적용 하에 액체는 넓은 영역을 커버링하여, 액체 분율, ξ→1이 된다. 이들 조건 하에 모세관 구동 증발률은 최소이다. (C)에 나타낸 바와 같이 주변 압력의 감소는 ξ를 감소시키고, 또한 증발률을 증가시킨다. 그러나, 특정 임계 압력 강하를 넘어서면, 바람직하지 않은 핵형성 비등이 발생할 수 있다. (D)에 나타낸 바와 같이 적용된 열 유속 Q는 또한 증발률을 향상시킬 수 있지만, 또한 바람직하지 않은 필름 비등의 위험이 존재한다. (E)에 나타낸 바와 같이 모세관 메니스커스의 표면으로부터의 열 유속의 적용은, 필름 비등의 위험을 제거한다. (F)에 나타낸 바와 같이 카운터 구배 방식으로 적용되는 큰 ΔP 및 Q는 기공에 한정된 액체 메니스커스, 즉 액체 분율 ξ << 1 (예를 들어 ~0.25)로 이어져, 비등을 피하면서 최고 증발률을 제공한다. 따라서, 표면과 벌크 액체 사이의 온도 구배의 유지는, 빠른 증발이 달성될 수 있는, (F)에 예시된 바와 같은 모세관 증발로 이어진다. 액체 수준이 모세관 기판 내로 후퇴함에 따라, 압력 구배 및 온도 구배가 유지되는 한 모세관 증발 현상이 여전히 실현된다.
도 5는 (A)에서 4% BSA, 15% 트레할로스 이수화물, 0.75% 글리세롤, 2% 트윈(Tween)-20, 및 물을 함유하는 액체로 로딩된 다양한 형상의 유리 멤브레인 (모세관 기판)에 대한 예시적 결과를 나타낸다. 멤브레인의 mm2 당 액체 로딩은 모든 경우에 0.316 ml에서 유지되었다. 케이스 1의 경우, 멤브레인을 0.25 인치 직경 원으로 절단하고, 각각에 10 ml 액체를 로딩하였다. 480 ml를 함유하는 총 48개의 샘플을 진공 챔버 내부의 가열된 (37℃) 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 2의 경우, 각각 470 ml 액체를 함유하는 3개의 긴 멤브레인 스트립 (240 mm x 6.23 mm)을 가열된 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 3의 경우, 1700 ml 액체를 함유하는 단일 스트립 (240 mm x 22 mm)을 활용하였다. 챔버를 29.5 mmHg로 비웠다. 온도-시간 플롯은 유리화 공정의 스테이지를 나타낸다. 비우기 공정 개시시, 멤브레인의 스캐폴드가 대부분 액체를 함유하면서 압력이 빠르게 강하하고 예상과 같이 압력 강하와 함께 온도가 떨어진다. 와이어 메쉬/베드로부터의 공급된 열 유속은 동결 체제로의 스캐폴드 온도의 추가 강하를 막는다. 동결점은 유리화 부형제/액체의 제제화에 따라 영하의 온도까지 확장될 수 있음을 인지해야 한다. 동결을 막는 것 이외에도, 베드로부터의 공급된 열 유속은 또한 상기에 예시된 바와 같이 (도 4의 F에서) 감압 하에 액체의 비등을 막으면서 모세관 증발을 용이하게 한다. 스캐폴드로부터 수분이 증발함에 따라, 온도가 베드 온도에 도달할 때까지 상승한다. 열 유속은 스캐폴드 온도가 세트 온도, 통상적으로 베드 온도를 초과하지 않도록 제어된다. 도 5로부터 보이는 바와 같이, 멤브레인 스캐폴드 온도가 베드 온도에 도달하는 데 걸리는 시간은 스캐폴드 구성 뿐만 아니라 그에 로딩된 액체의 양에 따라 달라진다. 베드 온도에 도달하는 데 걸리는 시간은 1차 유리화 시간의 척도이며, 이는 대부분의 액체가 이 기간 동안 증발됨을 의미한다. 그러나, 데시케이션 공정은 일부 잔류 수분을 제거하기 위해 여전히 이 기간을 넘어 연장될 수 있고, 이는 2차 데시케이션이라 불릴 수 있으며, 이는 모세관 현상에 의존하지 않는다. 공정 파라미터 및 스캐폴드 기하구조는 주어진 시간에 1차 데시케이션 공정을 겪을 수 있는 액체의 부피를 최적화하도록 선택된다. 일반적으로, 도 2a에 나타낸 결정 침전 상 경계를 우회하고 유리 형성을 보장하기 위해서는 보다 빠른 데시케이션 속도가 바람직하다. 그러나, 유리화가 보장되는 임계 속도는 액체의 화학, 친수성, 다공성 및 치수 등의 모세관 기판 특징에 따라 달라진다. 모세관 네트워크 유리화 스캐폴드 (솔리드 자취) 및 비-다공성 유리 표면 (점선) 및 스캐폴드 샘플에 대해 얻어진 잔류 수분 수준 (개방 원)을 사용하여 수행된 유리화 사이클에 대한 온도 프로파일 (B). 1-6분 시간 윈도우에서 유리 지지체 사용시 나타난 온도 변동이 액체가 버블링하고 비등하는 것으로 나타난 관찰과 동시에 기록되었다. 스캐폴드 상에서 유리화된 샘플에 대해서는 버블링이 관찰되지 않았다.
도 6a는, 데시케이션 장치 자체가 윤곽이 있는 벽을 특징으로 하는 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 데시케이션 장치는 실린더 형상으로 롤링된 친수성 모세관 기판 (멤브레인)으로 형성될 수 있다. 실린더는 도 4와 유사한 멤브레인 내에 유리화 매질을 하우징함으로써 개선된 유리화를 촉진할 수 있다.
도 6b는, 다공성 물질 모세관 기판이 진공에 작동가능하게 연결되고 멤브레인 상에 배치된 샘플의 유리화를 위해 밀봉될 수 있는 실린더 내에 배치되어 있고, 멤브레인이 유리화를 위한 연속 모세관 네트워크를 제공하는 것인, 본 개시내용의 추가의 측면을 나타낸다.
도 7a는, 모세관 증발을 촉진하고 스캐폴드 온도가 동결 체제로 떨어지는 것을 막도록 지향성 열 유속을 제공하기 위해 실린더형 데시케이션 장치가 가열된 블록 내에 배치되어 있는, 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 가열 방법은 성질상 전도성 또는 방사성일 수 있다.
도 7b는, 실린더의 내부로부터 추가의 열 공급원이 제공되어 있는, 본 개시내용의 하나의 예시적 측면을 나타낸다. 가열 방법은 성질상 전도성 또는 방사성일 수 있다. 열 유속은 모세관 기판의 단지 하나의 표면 또는 양쪽 표면으로부터 제공될 수 있다.
도 8은 카트리지 (도 6b)와 평평한 모세관 기판 (멤브레인) (도 3) 사이의 120 IU/mL의 유리화 혼합물 (VM) 중의 농도에서의 인슐린의 유리화를 나타낸다. 각 샘플은 15 IU (125 μL VM)를 갖는다. 여섯 (6)개의 "카트리지" 샘플 및 세 (3)개의 평평한 멤브레인 샘플이 진공 챔버 내부에서 함께 유리화되었다 (열 없음). 유리화 공정 후 수분 잔류비 (MRR) 및 단백질 회수율을 평가하여 그래프에 나타내었다.
도 9는 (A)에서 친수성 물질로 제조된 모세관 기판을 사용하여 생성된 개선된 유리화를 나타낸다. 원래 소수성인 멤브레인을 친수성으로 만들기 위해 저온 플라즈마로 처리하였다. 멤브레인 상의 약물 제제 현탁시, 액체는 거의 구형의 액적을 형성한 반면 (좌측 상단), 친수성 멤브레인은 액체가 모세관 채널로 유동하는 것을 가능하게 하였다. 유리화 공정 동안 소수성 멤브레인 상의 액체 액적은 먼저 비등되고 이어서 동결된 반면, 친수성 멤브레인 상의 액체는 급속히 유리화되어 유리질 단일체를 형성하였다. 진공의 해제시, 동결된 액적은 다시 액체가 되었지만, 부분적 수분 손실로 크기가 감소하였다. 유리화에 대한 모세관 보조 증발의 효능은 친수성 멤브레인 활용시 명백하다. 원형 스캐폴드 (좌측)에 적용되거나 고체 유리 기판 (우측)에 적용되고 진공에 적용된 유리화 매질의 사진 (B). 유리 표면 상에 배치된 유리화 매질의 불규칙한 외관은 버블의 급속한 형성 및 파열로 인한 것이며 비등의 증거이다. 스캐폴드 사용시에는 버블이 관찰되지 않았다.
도 10은 열이 적용되지 않은 실린더형 5 ml 챔버 내의 멤브레인 상에서 제조된 인슐린의 유리화 결과를 나타내며, 이는 MRR이 이들 조건 하에 생물학적 물질 로딩에 의해 극적으로 영향 받음을 보여준다.
도 11은 도 10에 나타낸 바와 같은 인슐린 유리화로부터 기록된 중량 손실을 나타낸다.
도 12는 도 10에 기재된 바와 같은, 그러나 유리화되는 샘플에 열 에너지를 제공하기 위해 실린더의 벽에 열이 적용된, 유리화된 인슐린에 대한 MMR을 나타낸다.
도 13은 도 12에 기재된 유리화된 인슐린에서 나타난 물 손실을 나타낸다.
도 14는낮은 출발 부피로부터의 유리화된 mRNA의 성공적인 재구성 및 유지된 기능을 나타낸다. (A)는 액체 mRNA (레인 2 및 3), 재구성된 mRNA (레인 4 및 5) 및 동일한 저장 조건에 적용된 유리화되지 않은 mRNA (레인 5 및 6)를 나타내는 아가로스 겔을 나타낸다. (B)는 신선한 mRNA (상단), 유리화되지 않은 mRNA (중앙) 및 재구성된 유리화된 mRNA (저부)로의 트랜스펙션 후 발현된 녹색 형광 단백질 (GFP)을 나타낸다. (C)는 포지티브 대조군에 대한 GFP의 형광의 퍼센트를 나타낸다. 유리화 공정은 회수된 mRNA의 양 또는 그의 기능에 부정적 영향을 주지 않았다.
도 15는 낮은 출발 질량의 항체의 유지된 양 및 기능을 나타낸다. 재구성된 알칼리-포스파타제 (ALP) 컨쥬게이션된 IgG는 신선한 유리화되지 않은 항체와 ELISA에서 검출 항체 (Ab)와 유사한 반응을 제공하였다. 유리화 공정은 55℃에서 저장시에도 기능을 변경하지 않은 반면, 유리화되지 않은 항체에서의 55℃는 기능을 극적으로 감소시켰다.
도 16은 재구성된 공동-유리화된 루시퍼라제 및 루시페닌과 신선한 유리화되지 않은 루시퍼라제 및 루시페린 사이의 비교를 나타낸다. 유리화 공정은 ATP가 추가됨에 따라 기능적 활성 또는 발광에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
도 17은 (A)에서 항원, 포획 항체, 및 검출 항체가 모두 유리화된 ELISA를 나타내고, (B)는 신선한 항원과 유리화된 포획 항체 및 검출 항체가 검정된 활성을 나타낸다. (A) 및 (B) 둘 다 ELISA에 대한 비교를 나타내며, 여기서 3개 성분 모두 대조군으로서 유리화되지 않았다. 유리화 공정은 검정에서 항체 또는 항원 기능적 활성을 변경하지 않았다.
도 18은 유리화되지 않은 신선한 시약과 ELISA에서 4개 성분에 대한 유리화를 비교하는 ELISA를 나타낸다. 유리화 공정은 검정에서 적절하게 기능하는 임의의 성분의 능력을 변경하지 않았다.
도 19는 600 mM 트레할로스, 5% 글리세롤 (트레할로스의 중량에 대하여) 및 나머지 PBS를 함유하는 1X 유리화 매질을 제조하고 유리화를 위해 1 인치 직경 8 ㎛ PES 멤브레인에 첨가하는 것을 나타낸다. 4개 유리화 사이클에서, 2개 샘플의 온도 프로파일이 기록되고, 또 다른 유리화 사이클에서, 1개 샘플의 온도 프로파일이 기록된다. 전체적으로, 9개 샘플에 대한 온도 데이터 (실행간, 실행내)가 기록되고 에러 바의 존재와 함께 플롯팅된다. 데이터는 공정의 일관성, 강건성 및 반복성을 나타낸다.
상세한 설명
필요에 따라, 본 개시내용의 상세한 측면이 본원에 개시되지만; 개시된 측면은 다양하고 대안적인 형태로 구현될 수 있는 개시내용의 단지 예시임을 이해해야 한다.
본 개시내용은 비-극저온 온도에서 장기간 저장 후 생물학적 활성을 유지하는 생물학적 샘플 및/또는 생성물의 유리화 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법은, 일부 측면에서, 데시케이션 및 유리화 동안 생물학적 샘플에 제어된 온도 및 제어된 분위기를 제공하는 것에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 개시내용은, 샘플이 동결 조건 또는 비등을 겪는 것을 막기 위해 생물학적 샘플에 열 에너지를 제공하면서 그에 보다 낮은 대기압을 적용하는 것에 관한 것이다. 도 4에서 입증되는 바와 같이, 낮은 대기압의 적용은 생물학적 샘플의 현저한 온도 강하를 초래하여, 생물학적 샘플 내의 얼음 결정 형성을 위한 조건 (예를 들어 동결 조건)을 제공할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 추가의 측면은, 샘플이 동결 조건을 겪는 것을 막기 위해, 또한 데시케이션 동안 생물학적 샘플 내의 결정 형성을 막기 위해 생물학적 샘플에 열을 제공하는 것이다.
본원에서 사용되는 하기 용어 또는 어구는 적어도 하나의 측면과 관련하여 하기에 나열되는 예시적 의미를 갖는다:
본원에서 사용되는 바와 같이, "극저온" 온도 또는 "극저온발생(cryogenesis)"을 위한 온도 또는 유사어는 생물학적 샘플이 동결 조건에 노출되는 온도를 지칭한다. 일부 측면에서, 극저온 온도는 생물학적 샘플 및/또는 유리화 매질의 동결 온도를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 극저온 온도는 화씨 또는 섭씨 온도의 특정 임계값 또는 값의 범위에 의해 국한되지 않으며, 대신에 관심 유리화 혼합물에 대한 온도, 압력 및 분자 에너지 사이의 관계에 의해 결정될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "극저온발생" 및 그의 유사 파생어는, 기재된 바와 같은 정의 내에서 확실히 가능하지만, 1 atm 또는 약 -80℃에서 액체 질소와 관련된 온도로 제한되지는 않음을 이해해야 한다.
따라서, "극저온 온도 초과"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유리화 혼합물의 동결점 초과의 온도를 지칭한다. "극저온 온도 초과"의 지점은 주변 대기 및 분자 에너지와 관련하여 동결 조건이 부재하는 온도 값을 추가로 포함할 수 있다. 실온은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 약 25℃의 온도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비등"은, 종종 주변 대기로 탈출하고 그 안에서 소실될 수 있는 물질 내의 증기 버블의 형성에 의해 마킹되는, 물질이 증기로 전이되는 지점을 지칭할 수 있다.
"유리 전이 온도"는 그 초과에서는 물질이 액체처럼 거동하고 그 미만에서는 물질이 고체 상과 유사한 방식으로 거동하고 무정형/유리질 상태로 진입하는 온도를 의미한다. 이는 온도의 고정된 지점이 아니며, 대신에 관심 유리화 혼합물의 특징에 따라 가변적이다. 일부 측면에서, 유리질 상태는 유리화 혼합물이 그의 유리 전이 온도 미만으로 떨어짐에 따라 진입하는 상태를 지칭할 수 있다.
"무정형" 또는 "유리"는 0.3 이하의 질서 파라미터를 참조하는 원자 위치의 장거리 질서가 존재하지 않는 비-결정질 물질을 지칭한다. 유리질 고체의 고화는 유리 전이 온도 Tg에서 일어난다. 일부 측면에서, 유리화 매질은 무정형 물질일 수 있다.
"결정"은 주기적으로 반복되고 격자 또는 단위 셀이라 불리는 하나의 질서 있는 특정 기하학적 배열로 이루어진 3차원 원자, 이온, 또는 분자 구조를 의미한다.
"결정질"은, 유리질 또는 무정형과 대조적으로, 원자 수준에서 질서화된 구조로 배열된 구성성분으로 구성된 물질의 형태를 의미한다. 결정질 고체의 고화는 결정화 온도 Tc에서 일어난다.
"유리화"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 무정형 물질로의 물질의 전환 과정이다. 무정형 고체는 임의의 결정질 구조를 갖지 않을 수 있다.
"유리화 혼합물"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 물질(들) 및 유리화 작용제를 함유하는 유리화 매질 및 임의로 다른 물질의 불균질 혼합물을 의미한다.
"생물학적 물질" 또는 "생물학적 샘플"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 살아 있는 유기체로부터 단리되거나 유래될 수 있는 물질을 지칭한다. 생물학적 물질의 예는 단백질, 세포, 조직, 기관, 세포-기반 구축물, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 생물학적 물질은 포유동물 세포를 지칭할 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 물질은 인간 중간엽 줄기 세포, 쥐 섬유아세포, 혈소판, 박테리아, 바이러스, 포유동물 세포막, 리포좀, 효소 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 조합을 지칭할 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 물질은 정자 세포, 정모세포, 난모세포, 난자, 배반포, 배아, 배낭, 또는 이들의 조합을 포함한 생식 세포를 지칭할 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 물질은 전혈, 적혈구, 백혈구, 혈소판, 바이러스, 박테리아, 조류, 진균, 또는 이들의 조합을 지칭할 수 있다.
"유리화 작용제"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유리화 작용제 및 다른 물질(들)의 혼합물이 냉각되거나 데시케이션됨에 따라, 무정형 구조를 형성하는, 또는 다른 물질(들)에서의 결정의 형성을 억제하는 물질이다. 유리화 작용제(들)는 또한 삼투압 보호를 제공하거나 다른 방식으로 탈수 동안 세포 생존을 가능하게 할 수 있다. 일부 측면에서, 유리화 작용제(들)는 생물학적 물질의 저장을 위해 적합한 무정형 구조를 제공하는 임의의 수용성 용액일 수 있다. 다른 측면에서, 유리화 작용제는 세포, 조직, 또는 기관 내에 흡수될 수 있다.
"저장가능 또는 저장"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 추후에 사용을 위해 보존되고 생존가능하게 유지되는 생물학적 물질의 능력을 지칭한다.
"친수성"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 물 분자를 우선적으로 끌어당기거나 그와 회합됨을 의미한다. 물에 대한 특별한 친화도를 갖는 친수성 물질은 물과의 접촉을 최대화하고 소수성 물질에 비해 물과의 보다 작은 접촉각을 갖는다.
"소수성"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 물에 대한 친화도 부족을 의미한다. 소수성인 물질은 자연적으로 물을 밀어내어 액적 형성을 유발하고 물과의 큰 접촉각을 갖는다.
"모세관"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 약 2000 ㎛2 이하의 단면적을 갖는 미세 구멍의 튜브에서와 같거나 그에서 발생하거나 그에 관한 것이다.
"동결보존"은 전형적으로, 직접 침지에 의해 소량의 생물학적 물질, 또는 종종 액체 물질을 급속 냉각시킬 액체 질소의 저온으로 인한 액체 질소의 사용을 통한 생물학적 샘플의 급속 냉각을 지칭한다. 냉각 속도는 물질의 분자가 열역학적으로 보다 유리한 결정 상태로 패킹될 수 있기 전에 이들의 이동성을 감소시킨다. 보다 연장된 기간에 걸쳐, 분자는 결정화되도록 배열될 수 있고, 이는 특히 생물학적 샘플에서 해로운 결과를 생성할 수 있다. 물은 이것이 빠르게 결정화될 수 있음에 따라 생물학적 샘플에서 중요한 관심사이며, 살아 있는 조직에서의 그의 풍부성은 결정화가 허용될수록 현저히 손상된다고 증명될 수 있다. 주요 구성성분이 결정화되는 능력을 방해하는, 종종 동결 보호제로서 언급되는 보호 첨가제는 무정형/유리화된 물질을 생성할 수 있다.
극저온 온도 초과에서 저장시 강건한 안정성을 갖는 유리화된 생물학적 샘플의 제조 방법 뿐만 아니라 그에 의해 생성될 수 있는 키트, 검정, 및 물질이 제공된다. 예시적으로, 하기 단계를 포함하는, 극저온 온도 초과에서의 하나 이상의 생물학적 물질의 유리화 공정이 제공된다: 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물을, 모세관 네트워크를 포함하는 기판 상에 오버레잉하는 단계로서, 여기서 기판은 데시케이션 챔버 내에 있는 것인 단계; 데시케이션 챔버 내의 대기압을 낮추는 단계; 표면으로부터 열 에너지를 유리화 혼합물에 제공하는 단계로서, 여기서 열 에너지는 유리화 혼합물이 동결 조건을 겪는 것을 막기에 충분한 것인 단계; 및 유리화 혼합물이 유리질 상태에 진입할 때까지 유리화 혼합물을 모세관 작용에 의해 데시케이션시키는 단계. 유리화 동안 맞춤화된 온도 및 압력의 사용은, 어느 쪽이든 생물학적 물질(들)의 생존가능성을 감소시킬 수 있는 동결 조건 또는 비등으로의 노출 위험을 감소시키거나 제거하면서, 유리화 및 생물학적 물질의 안정성을 향상시킨다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 동결 조건 및/또는 결정화로의 노출을 피하면서 생물학적 샘플 및 유리화 매질의 유리화 혼합물을 유리화하는 것에 관한 것이다. 생물학적 샘플은 세포, 세포의 집합체, 조직 샘플, 세포 단편, 단리된 및/또는 재조합 단백질, 단리된 또는 합성 핵산 서열 (RNA, DNA, 그의 단일 가닥 및 이중 가닥 포함), 발현 벡터, 체액, 호르몬, 스테로이드, 세포 수용체, 비리온, 원핵생물, 단순 진핵생물, 인지질, 및/또는 세포 소기관을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 유리 형성 작용제를 포함할 수 있는 유리화 매질과의 생물학적 샘플의 유리화에 관한 것이다. 유리 형성 작용제의 식별은 조직의 성공적인 보존에 대한 기회를 열었다. 적절한 유리 형성 작용제의 존재 하에, 탈수에 의해 달성된 유리화로 극저온 온도 초과에서 유리화된 매트릭스 내에서 생물학적 물질을 저장하는 것이 가능하다. 일부 동물 및 수많은 식물은 완전한 탈수에서 생존할 수 있다. 건조 상태 (무수생물태(anhydrobiosis))에서 생존하는 이러한 능력은 여러 복잡한 세포내 물리화학적 및 유전적 메커니즘에 따라 달라진다. 이들 메커니즘 중에는 데시케이션 동안 보호제로서 작용하는 당 (예를 들어, 사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드)의 세포내 축적이 있다. 트레할로스는 데시케이션 내성 유기체에서 자연적으로 생성되는 디사카라이드의 일례이다.
트레할로스 등의 당은 여러 상이한 방식으로 데시케이션 내성 유기체에 보호를 제공할 수 있다. 트레할로스 분자는 트레할로스 분자 상의 히드록실 기의 독특한 배치로 인해 그의 입체형태적 기하구조 및 폴딩의 변화 없이 폴딩된 단백질의 표면으로부터 수소-결합 물 분자를 효과적으로 대체할 수 있다. 당 분자는 또한 지질 이중층의 인지질 헤드와 결합하여 재수화 동안 세포질 누출을 막을 수 있다. 또한, 많은 당은 높은 유리 전이 온도를 가져서, 이들이 극저온 온도 초과 또는 실온 유리를 낮은 물 함량으로 형성할 수 있게 한다. 고도로 점성인 '유리질' 상태는 분자 이동성을 감소시키고, 이는 또한 세포 기능의 열화 및 사멸을 초래하는 분해적 생화학 반응을 막는다. 유리 형성 당 트레할로스의 존재 하에 탈수에 의한 생물학적 물질의 유리화는 개시되어 있다 (하기 문헌 참조: N Chakraborty, et al., Biopreservation and Biobanking, 2010, 8 (2), 107-114).
본 개시내용은, 유리화 혼합물 중의 생물학적 샘플의 균일하고 급속한 유리화를 달성하도록 낮은 대기압 및 열 에너지를 조합하는 유리화 공정에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 유리화 혼합물에 대한 열 에너지의 적용에 관한 것이며, 이로써 유리화가 감소된 대기압 하에 일어난다. 일부 측면에서는, 유리화 혼합물의 결정화 또는 동결 조건으로의 노출을 막기 위해 유리화 혼합물에 열 에너지가 적용된다.
추가의 측면에서, 유리화 혼합물의 온도는 데시케이션 및/또는 유리화 동안 제어된다. 예를 들어, 유리화 혼합물이 데시케이션 챔버 내에 배치되고, 유리화 혼합물이 동결 조건을 겪는 것을 제한하거나 막기 위해 유리화 혼합물에 열 에너지가 적용된다. 일부 측면에서는, 그 안에서의 결정화를 막기 위해 유리화 혼합물에 열 에너지가 전달된다.
일부 측면에서, 생물학적 샘플의 온도는 유리화 혼합물의 주위의 대기압 감소 또는 진공 적용 내에서 제어된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 낮은 대기압의 적용은 유리화 혼합물의 온도를 현저히 낮추어 유리화 혼합물의 결정화를 유발하고/거나 극저온발생으로 진행될 수 있다. 생물학적 샘플이 동결 조건으로 진입하면, 돌이킬 수 없는 손상이 그 안에서 일어날 수 있고, 이는 재구성시 임의의 요망되는 활성 또는 사용에 부정적 영향을 줄 수 있다. 또한 본원에서 식별되는 바와 같이, 유리화 혼합물 주위의 대기압 감소는 유리화 혼합물 내의 분자 활성을 변경할 수 있고, 그에 따라 비점이 감소한다. 동결과 유사하게, 생물학적 샘플 및/또는 유리화 매질의 비등 또는 과열은 해로울 수 있다. 유리화 혼합물의 비등은 생물학적 샘플 3차 구조의 손실, 단백질, 지방 산 및 핵산 등을 포함한 그 안의 성분의 가교 및 분해를 초래하여, 재구성시 임의의 활성이 손상될 수 있다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 공정은 진공, 부분 진공과 같이 낮은 대기압에 또는 일반적으로 감압 분위기에 있으면서 극저온 온도 초과의 온도에서 유리화 혼합물을 유지하는 것에 관한 것이다.
특정 측면에서, 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 데시케이션 동안 이들의 온도를 제어하기 위해 직접 가열될 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 전도, 대류 및/또는 방사 수단에 의해 제어된 이러한 온도를 가질 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 유리화 혼합물의 온도를 제어하기 위해 데시케이션 챔버 외부의 온도를 제어하고 데시케이션 챔버 또는 그의 부분을 통한 전도에 의존함으로써 제어된 그의 온도를 가질 수 있다. 이러한 경우, 데시케이션 챔버의 벽의 물리적 특성을 고려할 필요가 있을 것임이 인식될 것이다. 예를 들어, 데시케이션 챔버의 낮은 열 전도성 물질은 유리화 혼합물이 적절한 열 에너지를 수용할 수 있도록 하기 위해 유리화 혼합물에 의해 요구되는 것과 상이한 적용 온도를 필요로 할 수 있다. 이러한 필수적 적응은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식될 것이다. 일부 측면에서, 열은 가열 패드, 가열 배쓰, 화염, 가열 베드, 예컨대 유리 비드, 가열된 블록 등을 통해 적용될 수 있다. 일부 경우에, 열 에너지는 생성된 열의 전기 공급원 및/또는 연소에 의해 방출된 열 에너지 및/또는 전기 저항에 의해 생성된 열 에너지로부터 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 열 에너지는 기저에 있는 지지 기판을 통해 유리화 혼합물에 제공될 수 있다. 연속 모세관 네트워크의 다공성 물질이 또한 유리화 혼합물에 열 에너지를 제공할 수 있지만, 일부 경우에 다공성 물질은 유리 또는 중합체와 같은 낮은 열 전도성 물질이다. 그러나, 기저에 있는 기판은 금속 또는 유사하게 효율적인 전도성 물질의 것이고 데시케이션 챔버 외부의 열 공급원 또는 전기 공급원에 용이하게 연결되고 그 안에서 생성된 저항에 의해 열을 제공할 수 있다. 고체 지지체로부터의 열 에너지의 적용은 모세관 증발을 보조하기 위한 온도 구배를 추가로 제공할 수 있다 (예를 들어, 도 2a 참조).
일부 측면에서, 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물은 낮은 대기압 하에 유리화 동안 그의 극저온 온도 초과의 온도에서 유지된다. 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 낮은 대기압 하에 데시케이션 전에 예열된다. 다른 측면에서, 유리화 혼합물은 낮은 대기압 하에 유리화 동안 가열된다. 다른 측면에서, 열은 유리화가 개시되는 시간에 또는 그 즈음에 적용된다. 유리화 혼합물에 적용되는 열 에너지의 양은 낮은 대기압 공정 하에 유리화 동안 달라질 수 있거나 일정할 수 있음이 인식될 것이다. 일부 측면에서, 데시케이션 챔버 내의 낮은 대기압의 도입은 유리화 혼합물의 급속한 온도 강하를 유발할 수 있다. 이러한 측면에서, 열 에너지를 수용할 준비가 되었거나 이미 수용하는 유리화 혼합물을 갖는 것은 온도 강하로부터 회수율을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 도 4 참조).
특정 측면에서는, 일정한 온도를 유리화 혼합물에 적용하고, 그에 따라 유리화 혼합물이, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 및 39℃를 포함한, 유리화 혼합물의 약 Tg (℃) 내지 약 40℃의 온도에서 유지된다. 특정 측면에서는, 유리화 혼합물에 필수적 열 에너지를 제공하기 위해 데시케이션 챔버 또는 다공성 물질에 보다 높은 온도가 적용될 수 있다. 이러한 적용 온도는, 데시케이션 챔버의 크기 및 생물학적 샘플 및/또는 유리화 매질로의 효과적 전달을 위해 이용가능한 전도성 수단에 따라, 예시적으로 약 15℃ 내지 약 70℃일 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 낮은 대기압에서의 생물학적 샘플의 유리화에 관한 것이다. 일부 측면에서, 데시케이션은 데시케이션 챔버 내에서 일어날 수 있고, 이로써 유리화 혼합물이 그 안에 배치되어 낮은 대기압에 노출될 수 있다. 이러한 데시케이션 챔버는 낮은 대기압을 생물학적 샘플에 적용하기 위해 진공 공급원에 연결될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유리화 혼합물은 유리화 매질 또는 동결보존제, 예컨대 트레할로스와 함께 제조되고, 진공 적용을 통한 것과 같이, 낮은 대기압에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 낮은 대기압은 약 0.9 atm 내지 약 0.005 atm이며, 이는 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.65, 0.6, 0.55, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.255, 0.25, 0245, 0.24, 0.235, 0.23, 0.225, 0.22, 0.215, 0.21, 0.205, 0.2, 0.195, 0.19, 0.185, 0.18, 0.175, 0.17, 0.165, 0.16, 0.155, 0.15, 0.145, 0.14, 0.135, 0.13, 0.125, 0.12, 0.115, 0.11, 0.105, 0.1, 0.095, 0.09, 0.085, 0.08, 0.075, 0.07, 0.065, 0.06, 0.055, 0.05, 0.045, 0.04, 0.035, 0.03, 0.025, 0.02, 0.015, 및 0.01 atm을 포함한다.
다른 측면에서, 데시케이션 챔버 내의 압력은 유리화 혼합물의 삼중점 초과의 지점으로 낮아진다. 다른 측면에서, 압력은 물의 삼중점 초과의 지점, 예컨대 0.006 atm 초과로 낮아진다. 본원에 기재된 바와 같이, 낮아진 대기압은 유리화 혼합물의 온도를 낮추면서 또한 그의 비점을 감소시킨다. 일부 측면에서, 데시케이션 챔버 내의 압력은 약 0.04 atm 또는 약 29 mmHg로 낮아진다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 승온에서 진공 또는 부분 진공에 배치되거나 적용된 대기압에서 유리화 혼합물의 극저온 초과의 온도에서 유지되고, 그에 따라 유리화 혼합물은 대기압의 급속 감소 동안 동결 조건을 겪지 않는다. 추가의 측면에서, 유리화 혼합물의 온도는 생물학적 샘플의 유리화를 가능하게 하기 위해 유리화 매질의 Tg 미만으로 떨어질 것이다.
일부 경우에, 낮은 대기압의 유지는 데시케이션 챔버와 같은 밀봉된 인클로저 내에 유리화 혼합물을 함유할 것을 필요로 할 수 있다. 유리화 혼합물 주위의 낮은 대기압의 제공 및/또는 유지는 전형적으로, 데시케이션 챔버가 그 안에서 저압을 견딜 수 있을 것을 필요로 할 것임이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 이는, 충분한 밀봉 및 충분한 벽 강도를 필요로 하는, 그 안에서 낮은 대기압을 유지하기 위한 요건에 의해 제약되는 임의의 적합한 또는 요망되는 형상 및/또는 물질의 것일 수 있다. 데시케이션 챔버는 그 안의 대기압을 낮추기 위해 진공 공급원에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 추가로 유리화 완료시 공기가 복귀하는 것을 가능하게 할 수 있다. 데시케이션 챔버는 적용된 진공이 데시케이션 챔버 내의 대기압을 요망되는 범위로 효과적으로 낮추는 것을 가능하게 하도록 충분히 밀봉되거나 폐쇄될 수 있다.
일부 측면에서, 유리화 혼합물은 유리화 혼합물의 유리화를 향상시키기 위해 모세관 네트워크 상에 또는 모세관 네트워크 내에 배치된다. 추가의 측면에서, 모세관 네트워크는 감소된 대기압 하에 유리화 혼합물이 비등하는 것을 막을 수 있다. 모세관 보조 증발의 원리는 US 10,568,318에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 측면에서, 모세관 네트워크는 액체 또는 유체가 그의 표면 상에 축적되는 것을 제한하기에 충분한 두께를 갖는다. 모세관 효과를 실현하기 위해 액체는 모세관 기판의 기공 내에 수용되어 메니스커스를 형성해야 한다. 모세관 계면에서의 액체 분율 (ξ), 즉 액체가 차지하는 부피는 모세관 증발을 위한 고려사항에 대한 파라미터이다. 모세관 구동 증발은 액체에서의 점성 압력 강하가 액체-증기 계면에서의 최대 모세관 압력을 능가할 때 일어난다. 액체 분율 ξ는 벌크로부터 액체-증기 계면으로의 전체적 압력 강하와 관련된다. 대기압 하에, 또한 적용된 열 유속 없이 (도 4B), 액체는 큰 면적을 커버링하고, 액체 분율, ξ→1이 된다. 이들 조건 하에, 모세관 구동 증발률은 최소이다. 도 4C에 나타낸 바와 같이 주변 압력의 감소는 ξ를 감소시키고 또한 증발률을 증가시킨다. 그러나, 특정 임계 압력 강하를 넘어서면, 바람직하지 않은 핵형성 비등이 일어날 수 있다. 도 4D에 나타낸 바와 같이 적용된 열 유속 Q는 또한 증발률을 향상시킬 수 있지만, 필름 비등의 위험이 존재하고, 이것 또한 바람직하지 않다. 도 4E에 나타낸 바와 같이 모세관 메니스커스의 표면으로부터의 열 유속의 적용은, 필름 비등의 위험을 제거한다. 도 4F에 나타낸 바와 같이 카운터 구배 방식으로 적용된 큰 ΔP 및 Q 하에, 기공에 한정된 액체 메니스커스, 즉, 액체 분율 ξ << 1 (~0.25)로 이어지고, 이는 비등을 피하면서 최고 증발률을 제공한다 (ξ=
, 여기서 p는 모세관 기판의 융기 사이의 거리 또는 높이이고, d는 액체 메니스커스의 형상에 의해 형성된 원의 직경임). 따라서, 표면과 벌크 액체 사이의 온도 구배 유지는 도 4F에 예시된 바와 같이 모세관 증발로 이어지고, 여기서 빠른 증발이 달성될 수 있다. 액체 수준이 모세관 기판으로 후퇴함에 따라, 모세관 증발 현상은 압력 구배 및 온도 구배가 유지되는 한 여전히 실현된다. 일부 측면에서, mRNA 또는 그의 조성물 하에 모세관 네트워크는 데시케이션 동안 증발 과정을 보조할 수 있다.
일부 측면에서는, 유리화 혼합물이 모세관 네트워크 상에서 유리화를 겪음에 따라 그에 열 에너지가 적용된다. 일부 측면에서, 기저에 있는 모세관 네트워크는 유리화 혼합물을 비등으로부터 보호하면서 열 에너지를 수용하는 유리화 혼합물의 균일하고 완전한 유리화를 가능하게 할 수 있다. 모세관 네트워크는 모세관의 연속 네트워크일 수 있으며, 이는 모세관의 제1 말단과 모세관의 제2 말단 사이에 분지화가 존재하지 않음을 의미한다. 일부 경우에, 모세관 기판 네트워크는 기저에 있는 다공성 물질, 예컨대 멤브레인, 또는 기저에 있는 윤곽이 있는 또는 융기된 표면에 의해 제공될 수 있고, 여기서 그의 트로프 및 피크는 유리화 동안 액체 유리화 혼합물을 모세관 작용에 적용하기에 충분한 베드를 제공한다.
도 1a를 참조하면, 유리화 혼합물(20)의 얇은 액체 층의 적용에 의해 커버링된 연속 친수성 베드(10)가 도시되어 있다. 일부 측면에서, 유리화 혼합물의 보호 유체 층은 생물학적 샘플을 낮은 대기압으로의 노출 동안 비등으로부터 보호할 수 있다. 도 1a에 나타낸 바와 같이 친수성 표면 상에 극도로 얇은 액체 필름을 사용하면 감소된 분위기 하에 비등의 방지가 회피되고/거나 감소될 수 있다. 그러나, 비등의 방지는 가능하지만, 액체의 두께에서의 제한으로 인해, 이용가능한 표면적은 유리화될 수 있는 액체의 양을 감소시킨다. 도 1b에 나타낸 바와 같은 윤곽이 있는 표면의 존재는 피크에서 우선적인 데시케이션이 일어나고 이로써 유리화 공정 동안 수분을 끌어올리는 것으로 인해 유리화 혼합물이 모세관 작용에 적용될 수 있는 표면을 효과적으로 제공하고, 이는 유사하게 생물학적 샘플 (주로 윤곽 또는 융기의 정점에 있음)을 비등으로부터 보호할 수 있고, 현저히 큰 샘플 부피가 유리화될 수 있게 한다. 또한, 샘플이 윤곽의 피크에서 유리화됨에 따라, 모세관 작용은 기저에 있는 트로프로부터 유체를 끌어당김으로써 유리화 혼합물의 탁월한 유리화 및 데시케이션을 촉진한다. 유사하게, 모세관 멤브레인의 다공성 물질이 모세관 내에서 생물학적 샘플을 지지하는 경우, 모세관 작용은 유리화 공정 동안 모세관 채널로부터 유체를 끌어당기고 더 큰 부피의 생물학적 샘플의 균일하고 완전한 유리화 및 데시케이션을 제공할 것이다. 그러나, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 지나치게 큰 유체 로딩의 경우와 같이 모세관 작용이 유체를 성공적으로 끌어올릴 수 없는 경우, 액체는 표면 패턴을 충전시키거나 트로프에서 유지되고, 여기서 버블 핵형성 및 비등이 감압 하에 지배적이 되고 이는 그 안에 함유된 민감한 분자의 손상을 초래할 수 있다.
도 2a는 본 개시내용의 유리화 공정의 측면의 개요이다. 전형적인 유리화가 경로 1-2-3에 나타나 있고, 여기서는 유리 전이 미만으로의 액체 (생물학적 또는 다른 물질 함유)의 빠른 냉각이 동결 대역을 우회한다. 물질의 총 질량은 공정을 통해 보존된다. 다량 물질의 극저온 유리화는 열 전달 제한으로 인해 도전적일 수 있고, 따라서 일반적으로 상당한 표면/부피 비율을 제공하는 바이알 내에서 수행된다. 물질의 유리화는 또한 경로 1-5-6에서 보이는 데시케이션 (결정화 공정 우회)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 측면에서, 상당한 질량 손실 (주로 물)이 나타난다. 생물학적 물질에 대한 전형적인 탈수 접근은 기판 상에 고착성 액적을 확립하고 낮은 습도의 인클로저에서 증발 데시케이션시키는 데 중점을 두었다. 공정은 느린 속도 및 불균일한 데시케이션에 의해 마킹된다. 그 안의 생물학적 물질이 데시케이션됨에 따라 액체와 증기 사이의 계면에 유리질 스킨이 형성된다. 유리질 스킨의 형성은 생물학적 샘플의 추가 데시케이션을 늦추고 궁극적으로 막음으로써, 생물학적 샘플을 샘플에 걸쳐 물 함량의 상당한 공간적 비-균일성을 갖는 특정 수준의 건조로만 제한한다. 그 결과, 일부 영역은 유리화되지 않지만 높은 분자 이동성을 유지함으로 인해 이제 분해될 것이다. 데시케이션율은 큰 표면 대 부피 비율에 의해, 또한 구체적으로 감압에서 촉진될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 도 2a의 경로 1-4-6에 관한 것이며, 여기서 유리화 혼합물의 요망되는 온도 및 저압의 유지는 거의 극저온 온도 및 데시케이션의 하이브리드를 제공한다. 그러나, 보다 낮은 압력에서는 비점이 감소한다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 물의 삼중점 초과의 저압 유지는 유리화 혼합물의 유리화에 대한 동결과 비등 사이의 온도 윈도우를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 적용된 온도는 낮은 적용 압력에서 유리화 혼합물의 극저온점 초과의 온도를 유지한다. 추가로 도 2 및 도 4에 도시된 바와 같이, 적용된 낮은 주변 압력으로부터의 온도 감소는 유리화 혼합물의 온도가 비등 없이 유리 전이 온도 미만으로 떨어지는 것을 가능하게 하여, 유리화 혼합물 전반에 걸쳐 균일한 유리화를 제공한다.
도 4A는, 연속 모세관 채널의 기판의 도입을 통한 것과 같이, 모세관 증발을 용이하게 하기 위해 모세관의 네트워크의 다공성 물질을 배치함으로써 진공 하에 보다 큰 부피의 액체의 빠른 데시케이션이 어떻게 편리하게 달성될 수 있는지를 나타낸다. 그러나, 액체가 모세관 기판의 표면 상에 축적될 때, 축적된 액체에서 비등이 여전히 일어날 수 있고, 이는 본원에 기재된 바와 같이 바람직하지 않을 수 있다. 표면과 벌크 액체 사이의 온도 구배의 존재는 도 4E 및 4F에 예시된 바와 같이 모세관 증발을 가능하게 하고, 여기서 빠른 증발이 달성될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면에서, 유리화 혼합물 중에 존재하는 유체의 부피는, 유체가 표면 상에서의 넘침 또는 고임 없이 모세관 네트워크를 충전시킬 수 있도록 확립될 수 있다.
특정 측면에서, 데시케이션 챔버 또는 그 안에 함유된 모세관 기판은, 챔버 또는 모세관 기판의 벽이 그 안에 배치시 유리화 혼합물에 모세관 네트워크를 제공하도록 적합하게 패턴화될 수 있다. 예를 들어, 도 1b에 도시된 것과 같은 윤곽 또는 융기가 챔버의 벽을 따라 늘어서 (예를 들어, 도 6a 참조) 기저에 있는 모세관 네트워크를 제공할 수 있다. 다른 측면에서, 그 안에 유리화 혼합물을 갖는 연속 모세관 네트워크의 다공성 물질은 밀봉가능 데시케이션 챔버 내에 제공된다 (예를 들어, 도 6b 참조). 특정 측면에서, 다공성 물질은 복수의 연속 모세관 채널의 멤브레인을 포함할 수 있다.
도 7a는 유리화 혼합물이 Tg 미만의 온도를 겪는 것을 피하도록 그 자체가 가열될 수 있는 지지체 내의 모세관 기판의 배치를 나타낸다. 일부 측면에서, 열이 생성되는 표면으로부터 모세관 기판을 분리하기 위해 모세관 기판이 위치한 임의의 챔버의 측면 또는 가열 블록과 모세관 기판 사이에 지지체 스캐폴드가 포함될 수 있다. 이는, 일부 측면에서, 멤브레인 물질의 트로프에 보다 많은 열이 노출되는 것을 피하거나 두 방향으로부터의 데시케이션을 실질적으로 가능하게 하도록 샘플 아래로부터의 직접적인 가열을 막는다.
도 7b에 나타낸 바와 같이, 가열 부재가 대신에 또는 추가로 챔버 내에 도입될 수 있고, 이는 유리화 모세관 기판의 표면으로의 지향된 열 적용을 가능하게 함으로써 멤브레인 내의/상의 요망되는 위치에서의 효과적인 유리화를 촉진하여 탁월한 모세관 작용을 촉진하고 유리화 동안 유리화 매질의 비등을 막는다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 윤곽 및/또는 융기의 존재는 유리화를 향상시키도록 모세관 융기를 제공한다. 표면 위의 유리화 혼합물의 존재는, 또한 모세관 작용에 의해 피크를 향해 유리화 혼합물을 끌어당김으로써, 피크로부터의 빠른 증발을 가능하게 한다. 연속 모세관 네트워크의 존재는 추가로 유리화 혼합물의 유체 부피가 균일하게 증발하고 비등을 막으면서 또한 과량의 유체 축적 (이는 또한 손상을 주는 비등을 겪게 할 수 있음)을 막는 것을 가능하게 한다. 유사하게, 연속 모세관 채널의 멤브레인 또는 기판 등의 다공성 물질은 기저에 있는 모세관 네트워크를 제공할 수 있다. (예를 들어, 도 3 참조). 이러한 측면에서, 다공성 물질, 예컨대 멤브레인 또는 기판은 유리화 혼합물을 하우징하고, 그 안에서의 모세관 작용은 향상된 유리화를 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 연속 모세관 네트워크 상에 배치된다. 추가의 측면에서, 유리화 혼합물은 패턴화된 및/또는 융기된 및/또는 윤곽이 있는 임의로 다공성 물질 상에 배치된다. 추가의 측면에서, 연속 모세관 네트워크는 데시케이션 챔버의 벽 내의 패턴 및/또는 융기 및/또는 윤곽에 의해 형성된다. 다른 측면에서, 모세관 네트워크는 복수의 연속 모세관 채널을 포함하는 다공성 물질에 의해 제공된다.
데시케이션 챔버는 또한 그 안에 유리화 혼합물을 하우징하도록 배열되거나 이것이 가능해야 한다. 일부 측면에서, 데시케이션 챔버는 다공성 물질 및/또는 지지 기판 상에 유리화 혼합물을 하우징할 수 있어야 한다. 일부 측면에서, 유리화 혼합물은 기판 상으로의 배치에 의해 유리화를 위해 준비된다. 일부 측면에서, 기판은 다공성 물질, 예컨대 배열된 모세관의 멤브레인 및/또는 베드일 수 있다. 추가의 측면에서, 데시케이션 챔버의 벽은 지지 기판으로서 작용하고 그 안에 모세관 네트워크를 제공하도록 융기되고/거나 패턴화되고/거나 윤곽이 있다.
추가의 측면에서, 지지 기판은 유리화 혼합물에 열 에너지를 제공하고/거나 전달하기 위해 활용될 수 있다. 유리화 혼합물에 열 에너지를 효과적으로 제공하기 위해, 지지 기판은 일부 측면에서 우수한 전도성 물질, 예컨대 금속의 것일 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 다른 측면에서, 모세관의 연속 네트워크를 제공하기 위한 다공성 물질은 유리화 혼합물과 기저에 있는 고체 지지 기판 사이에 위치할 수 있다.
도 1 및 4에 도시된 바와 같이, 모세관은 급속 증발을 위한 계면을 제공할 수 있다. 멤브레인 등의 다공성 물질, 예컨대 멤브레인의 또는 기저에 있는 패턴화된 융기된 지지체로부터 형성된 모세관 네트워크는 독성이 아니고 생체물질 또는 생물학적 샘플에 대해 반응성이 아니고 유리화 매질과 화학적 또는 물리적으로 반응하지 않는 물질로 제조될 수 있다. 물질은 적합한 중합체, 금속, 세라믹, 유리, 또는 이들의 조합의 것일 수 있다. 일부 측면에서, 모세관 네트워크는 다른 것들 중에서도 특히 폴리디메틸실록산 (PDMS), 폴리카르보네이트, 폴리우레탄, 폴리에테르술폰 (PES), 폴리에스테르 (예를 들어 폴리에틸렌 테레프탈레이트)의 물질로부터 형성된다. 본원에 제공된 장치 및 공정에서 표면으로서 적합한 모세관 채널 함유 멤브레인의 예시적 예는 미국 매사추세츠주 벨레리카 소재의 이엠디 밀리포어(EMD Millipore)에 의해 판매되는 것들과 같은 친수성 여과 멤브레인을 포함한다. 특정 측면에서, 다공성 물질은 생물학적 샘플 및/또는 유리화 매질의 성분에 실질적으로 결합하거나, 이를 변경하거나, 또는 달리 그와 화학적 또는 물리적 회합을 생성하지 않는다. 다공성 물질은 임의로 유도체화되지 않는다. 임의로, 모세관 채널은 PDMS 형성 기술, 레이저 드릴링, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 구멍 형성 기술에 의해 요망되는 물질 및 두께의 기판 (예를 들어 데시케이션 챔버 벽)에 형성될 수 있다.
일부 측면에서, 모세관 네트워크는 액체 또는 유체가 그의 표면 상에 축적되는 것을 제한하기에 충분한 두께를 갖는다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 표면 상의 증가된 유체 또는 액체 축적은 해로운 또는 손상을 주는 비등을 초래할 수 있다. 모세관 네트워크의 두께 및/또는 층의 증가는 모세관 채널 내의 또는 트로프 내의 증가된 유체를 취급하기 위한 증가된 공간을 제공할 수 있다. 도 4E에 나타낸 바와 같이, 액체 분율은 메니스커스에 의해 형성된 원의 면적과 융기 사이의 거리 또는 높이 사이의 관계에 의해 결정된다: ξ=
. 최적으로, ξ는 약 0.25이며, 상한은 약 1이다. 0.25 미만의 값에서, 시스템은 요망되는 유리화 전에 건조되기 시작할 수 있다.
일부 측면에서, 생물학적 샘플 하의 모세관 네트워크는 데시케이션 동안 증발 과정을 보조할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 기저에 있는 모세관 베드를 효과적으로 제공하기 위해 데시케이션 챔버의 벽을 패턴화하거나 윤곽화함으로써 또는 멤브레인 사용과 같이 연속 모세관 네트워크의 다공성 물질을 제공함으로써 모세관이 제공될 수 있다. 일부 측면에서, 다공성 물질 및/또는 패턴화된 및/또는 윤곽이 있는 표면에 의해 제공된 모세관 네트워크는, 기공이 유리화를 보조하기 위해 기저에 있는 모세관을 제공하도록 약 20 ㎛ 이하의 기공을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 기공 또는 피크 대 피크 거리는 약 20 ㎛ 내지 약 0.1 ㎛의 평균 개구를 가질 수 있고, 이는 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 및 0.2 ㎛를 포함한다. 모세관 채널은 채널을 형성하는 기판의 두께 또는 하나 또는 복수의 개별 채널 자체에 의해 임의로 정의된 길이를 가질 수 있다. 모세관 채널 길이는 임의로 약 1 밀리미터 이하이지만, 이러한 치수로 제한되도록 해석되어선 안 된다. 임의로, 모세관 채널 길이는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 1000 마이크로미터, 또는 임의의 이들 사이의 값 또는 범위이다. 임의로, 모세관 채널 길이는 약 5 내지 약 100 마이크로미터, 임의로 약 1 내지 약 200 마이크로미터, 및/또는 임의로 약 1 내지 약 100 마이크로미터이다. 모세관 채널 길이는 임의로 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 마이크로미터이다. 일부 측면에서, 모세관 채널의 길이는, 임의로 불균일한 변동으로, 복수의 모세관 채널 전반에 걸쳐 달라진다.
모세관 채널(들)의 단면적은 약 2000 ㎛2 이하일 수 있다. 임의로 단면적은 약 0.01 ㎛2 내지 약 2000 ㎛2, 임의로 약 100 ㎛2 내지 약 2000 ㎛2, 또는 임의의 이들 사이의 값 또는 범위이다. 임의로, 모세관 채널(들)의 단면적은 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 또는 2000 ㎛2 이하이다.
모세관 보조 증발률은 하기 둘 다에 의해 영향 받을 수 있다: 대기 요건 (증발 표면에서의 공기/기체의 습도, 온도 및 속도), 및 (i) 구동 모세관력을 생성하는 모세관 채널의 특징, (ii) 액체 메니스커스 깊이, 및 (iii) 모세관을 통한 유동에 대한 점성 저항. 그 결과, 모세관 특성, 수송 공정, 및 경계 조건 사이의 복잡하고 고도로 동적인 상호작용은 폭넓은 범위의 증발 거동을 초래한다. 빠른 건조를 위해, 핵심 파라미터는 하기를 포함할 수 있다: (1) 증발 표면에서 형성을 지지하고 액체 네트워크를 유지하는 조건 및 (2) 증발 표면에서 물을 공급하기에 충분한 유동을 유도하는 모세관 압력의 형성을 촉진하는 특징.
일부 측면에서, 다공성 물질은 융기되고/거나 윤곽이 있을 수 있거나 융기된 및/또는 윤곽이 있는 기저에 있는 지지 기판 상에 배치될 수 있고, 그에 따라 다공성 물질은 그 위에 배치되거나 압착될 때 유사한 형상을 채택한다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 패턴화된 물질의 윤곽 및/또는 융기는 표면적을 증가시켜 증발에 대한 증가된 노출을 제공할 수 있다.
추가의 측면에서, 다공성 물질의 증가된 표면적은 멤브레인의 배열 또는 형상화에 의해 달성될 수 있다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 윤곽이 있는 벽을 갖는 데시케이션 챔버는 다공성 물질에 대한 증가된 표면적을 제공할 수 있다. 그러나, 도 6b에 도시된 바와 같이, 다른 방식의 평평한 다공성 물질의 형상화는 효율적인 모세관 보조 유리화를 위한 개선된 표면적을 추가로 제공할 수 있다. 도 8은 평평한 멤브레인과 실린더형 데시케이션 챔버 내의 곡선화된 멤브레인 사이의 비교를 나타낸다. 결과 그래프에서 보이는 바와 같이, 데시케이션 챔버 내의 멤브레인의 곡선화는 평평한 멤브레인에 비해 더 낮은 수분 잔류비를 제공하였다.
일부 측면에서, 모세관 네트워크는 친수성 물질의 것이다. 다른 측면에서, 모세관 네트워크는 소수성 물질의 것일 수 있고, 성질상 친수성 또는 보다 친수성이 되도록, 플라즈마로의 노출을 통한 것과 같이 추가로 처리될 수 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, 원래 소수성인 멤브레인을 저온 플라즈마로 처리하여 이를 보다 친수성으로 만들었다. 멤브레인 상의 약물 제제 현탁에 따라, 액체는 거의 구형인 액적 (좌측 상단)을 형성한 반면 친수성 멤브레인은 액체가 기저에 있는 모세관 채널 내로 유동할 수 있게 하였다. 유리화 공정 동안, 소수성 멤브레인 상의 액체 액적은 먼저 비등되고 이어서 동결된 반면, 친수성 멤브레인 상의 액체는 급속히 유리화되어 유리질 단일체를 형성하였다. 진공 해제에 따라, 동결된 액적은 다시 액체로 되었지만, 크기가 감소되어 부분적 수분 손실이 있었다. 유리화에 대한 모세관 증발의 효능은 친수성 멤브레인에서 보이는 균일한 유리화에서 명백하다.
일부 측면에서, 생물학적 샘플은 유리화 매질 중에 배치되거나 커버링되거나 혼합되어 유리화 혼합물을 형성한다. 유리화 매질 중의 적절한 유리화 작용제의 존재는, 생물학적 샘플이 본원에 기재된 바와 같이 주변 조건 하에 데시케이션됨에 따라, 필수적일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 빠른 데시케이션 방법 그 자체가 데시케이션 후 세포 또는 다른 유리화된 생물학적 물질의 생존가능성에서의 성공을 반드시 보장하지는 않는다. 유리를 형성하고/거나 다른 물질에서의 결정의 형성을 억제하는 유리화 매질이 요구될 수 있다. 유리화 매질은 또한 삼투압 보호를 제공하거나 다른 방식으로 생물학적 샘플의 탈수 동안 세포 생존을 가능하게 할 수 있다. 유리화 매질 중에 포함될 작용제의 예시적 예는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 디메틸술폭시드, 글리세롤, 당, 폴리알콜, 메틸아민, 베틴, 동결방지 단백질, 합성 핵형성 방지 작용제, 폴리비닐 알콜, 시클로헥산트리올, 시클로헥산디올, 무기 염, 유기 염, 이온성 액체, 또는 이들의 조합. 일부 측면에서, 유리화 매질은 임의로 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 유리화 작용제를 함유한다.
일부 측면에서, 유리화 매질은 유리화 작용제의 정체에 따라 달라지는 농도로 유리화 작용제를 포함할 수 있다. 임의로, 유리화 작용제의 농도는 유리화되는 생물학적 샘플에게 독성이 될 농도 미만인 농도이며, 여기서 독성은 후속 샘플 사용시 기능적 또는 생물학적 생존가능성이 달성되지 않도록 한다. 유리화 작용제의 농도는 임의로 약 500 μM 내지 약 6 M, 또는 이들 사이의 값 또는 범위이며, 이는 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 M을 포함한다. 유리화 작용제 트레할로스의 경우, 농도는 임의로 약 1 M 내지 약 6 M이며, 이는 2, 3, 4, 또는 5 M을 포함한다. 임의로, 조합시 모든 유리화 작용제의 총 농도는 임의로 약 1 M 내지 약 6 M이며, 이는 2, 3, 4, 또는 5 M을 포함한다.
유리 형성 당인 트레할로스는 무수 유리화에서 사용되었고, 여러 방식으로 데시케이션 내성을 제공할 수 있다. 그러나, 물 중의 유리화된 1.8 몰/리터 (M) 트레할로스는 -15 내지 43℃의 유리 전이 온도를 갖는다. 0℃ 초과에서의 유리화를 달성하기 위해, 보다 높은 농도 (6-8 M)가 요구되며, 이는 생물학적 물질을 손상시킬 수 있다. 대안적으로, 유리화 매질은 VM의 Tg 값을 증가시키기 위해 완충 작용제 및/또는 염을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 유리화 매질은 임의로 물 또는 용매 및/또는 완충 작용제 및/또는 하나 이상의 염 및/또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 완충 작용제는 25℃에서 약 6 내지 약 8.5의 pKa를 갖는 임의의 작용제일 수 있다. 완충 작용제의 예시적 예는 다른 것들 중에서도 특히 HEPES, TRIS, PIPES, MOPS를 포함할 수 있다. 완충 작용제는 유리화 매질의 pH를 요망되는 수준으로 안정화시키기에 적합한 농도로 제공될 수 있다.
1.8 M 트레할로스, 20 mM HEPES, 120 mM ChCl, 및 60 mM 베틴을 포함하는 유리화된 매질은 +9℃의 유리 전이 온도를 제공한다. 본원에 개시된 모세관 보조 유리화 방법을 위한 예시적 유리화 매질은 트레할로스, 및 큰 유기 이온 (>120 kDa)을 함유하는 하나 이상의 완충 작용제, 예컨대 콜린 또는 베틴 또는 HEPES 뿐만 아니라 K 또는 Na 또는 Cl 등의 작은 이온을 함유하는 완충 작용제(들)를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 생물학적 샘플은 코팅되고 유리화 매질 중에 침지되고 지지 기판 상에 배치되어 본원에 기재된 바와 같은 유리화 단계 동안 생물학적 샘플을 유지한다. 특정 측면에서, 모세관 네트워크는 유리화 혼합물의 일부를 흡수하면서 유체의 박층이 유지될 수 있게 한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 생물학적 샘플, 임의로 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 생물학적 샘플 또는 물질의 유리화 방법에 관한 것이다. 방법은 본원에 기재된 부분의 조립을 통해 유리화 혼합물을 제조하는 것을 포함한다. 예를 들어, 생물학적 샘플 및 유리화 매질의 유리화 혼합물이 고체 지지 기판 상에 또는 그와 접촉하여 배치된다. 일부 측면에서, 기저에 있는 고체 지지체는 기저에 있는 모세관 네트워크를 제공하도록 윤곽이 있고/거나 융기된다. 일부 측면에서, 기저에 있는 지지체는 데시케이션 챔버의 부분, 예컨대 그의 벽이다. 다른 측면에서, 다공성 멤브레인이 유리화 혼합물과 고체 지지체 사이에 배치될 수 있다. 일부 측면에서, 연속 모세관 네트워크는 유리화 혼합물을 지지하고 그로부터 유체를 끌어들인다. 모세관 네트워크 및/또는 다공성 물질은 모세관 네트워크의 표면 위에 액체의 존재 또는 고임을 피하도록 충분한 두께 또는 양을 가져야 한다.
본 개시내용의 유리화 방법은 생물학적 샘플을 함유하는 유리화 혼합물을 데시케이션 챔버 내에 배치하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 데시케이션 챔버는 그 안의 대기압 감소를 위한 진공 또는 다른 수단에 작동가능하게 연결된다. 특정 측면에서, 생물학적 샘플은 데시케이션 챔버 내의 다공성 또는 윤곽이 있는 물질 상에서 제 위치에서 유지된다. 일부 측면에서, 생물학적 샘플은 데시케이션 챔버의 부분 상에 배치되며, 여기서 부분은 기저에 있는 모세관 네트워크를 제공하도록 패턴화 및/또는 윤곽화된다. 일부 측면에서, 고체 지지 기판, 다공성 물질, 예컨대 멤브레인, 및 생물학적 샘플은 데시케이션 챔버 내에 배치된다.
생물학적 샘플은 임의로 데시케이션 챔버 내에서 유리화 매질로 코팅되고/거나 그와 혼합될 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 샘플은 데시케이션 챔버 내의 배치 전에 유리화 매질과 함께 제조될 수 있다.
일단 조립되면, 본 개시내용의 방법은, 유리화 혼합물 주위의 대기압을 감소시키고/거나, 유리화 혼합물에 모세관-보조 증발을 제공하고/거나, 그 안에서의 비등 유도 없이 유리화 혼합물/모세관 네트워크에 열 에너지를 적용하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 세 가지 모두의 적용은, 극저온 온도를 겪는 것을 피하고 비등을 피하면서, 유리화 혼합물의 급속하고 균일한 유리화 및 데시케이션을 제공함으로써, 공정 동안 생물학적 샘플에 대한 임의의 손상을 현저히 감소시킬 수 있다.
특정 측면에서, 방법은 생물학적 샘플을 낮은 또는 감소된 대기압에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 낮은 대기압으로의 노출은 데시케이션 챔버에 연결된 진공을 작동시킴으로써 일어난다. 일부 측면에서, 대기압은 생물학적 샘플 및/또는 유리화 매질의 삼중점 초과의 지점으로 낮아진다. 다른 측면에서, 압력은 약 0.04 atm 또는 29.5 mmHg로 낮아진다.
일부 측면에서, 방법은 낮은 대기압으로의 노출 동안 생물학적 샘플에 열 에너지를 적용하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 열 에너지의 공급원은 또한 데시케이션 챔버에 작동가능하게 연결되거나 그 안에 배치된다. 일부 측면에서, 열 에너지의 공급원은 다공성 물질 및/또는 모세관 기판 아래의 기저에 있는 고체 지지체에 적용된다. 열 에너지의 공급원은, 일부 측면에서, 모세관의 한쪽 또는 양쪽 말단으로부터 또는 기복이 있는 유리화 멤브레인 표면에서 피크의 방향으로부터 유리화 혼합물에 열을 제공하도록 작동가능하게 배치됨이 인식될 것이다. 추가의 측면에서, 열 에너지 공급원은 증발을 보조하기 위해 모세관 기판 및/또는 다공성 멤브레인에 걸친 온도 구배를 제공한다. 추가의 측면에서, 열 에너지는 데시케이션 챔버의 외부에 적용될 수 있다.
유리화 혼합물이 데시케이션 챔버 내에 배치되면, 그 안의 대기압을 낮춘다. 일부 측면에서는, 대기압이 그 안의 생물학적 샘플의 삼중점 초과의 지점까지 낮아진다. 다른 측면에서는, 대기압이 물의 삼중점 초과의 지점까지 낮아진다. 추가의 측면에서는, 압력이 데시케이션 챔버 내에서 약 0.04 atm까지 낮아진다.
도 5는 기저에 있는 고체 지지체로서의 와이어 메쉬 및 모세관 기판으로서의 그 위의 유리 멤브레인으로부터의 37℃ 열 적용에서 나타난 결과를 도시한 것이다. 도 5는 액체 로딩이 일정하게 유지될 때 압력이 낮아진 후 생물학적 샘플 온도가 회복되는 속도와 멤브레인 및 부피 크기 사이의 비교를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 경우에, 진공의 적용은 유리화 혼합물의 온도의 급속한 강하를 초래하지만, 보다 작은 멤브레인은 출발 온도로의 복귀에 의해 관찰되는 바와 같이 보다 빠른 완전한 유리화를 생성하였다. 추가로 도 5를 참조하면, 유리화가 완료되면 생물학적 샘플의 온도가 정체됨이 보인다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 유리화 혼합물의 모세관 보조 증발을 제공하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 윤곽이 있는 및/또는 융기된 지지체에 의해 또는 다공성 멤브레인에 의해 제공된 기저에 있는 모세관 기판은 증발 향상을 위해 필요한 필수적 특징을 제공할 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 데시케이션 시간 동안 수행될 수 있다. 데시케이션 시간은 유리화 매질을 유리화하기 위한 적합한 건조를 촉진하기에 충분한 시간이다. 데시케이션 시간은 임의로 약 1초 내지 약 1시간이며, 이는 약 10 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min 및 55 min을 포함하나 이를 초과하지 않는다. 임의로, 데시케이션 시간은 약 1초 내지 약 30 min, 임의로 약 5초 내지 약 10 min이다.
생물학적 물질이 극저온 온도 초과에서의 저장 동안 유리화된 상태로 생존가능하게 유지될 수 있는 지속기간은 샘플 물질마다 다를 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 물질은 2-20일 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 물질은 10주 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 물질은 최대 1년 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 생물학적 물질은 최대 10년 동안 극저온 온도 초과에서 저장되면서 생존가능하게 유지될 수 있다.
대안적으로, 본 개시내용의 교시 및 장치를 사용한 극저온 온도 초과에서의 유리화 후, 유리화된 생물학적 물질은 물질 내의 결정 형성의 위험 없이 매우 장기간 동안 극저온 온도에서 및/또는 액체 질소 중에서 저장될 수 있다. 많은 생물학적 물질의 경우, 이는 극저온 온도에서 직접 유리화 동안 통상적으로 발생하는 극저온손상을 피하기 위해 바람직한 접근이다. 하나의 측면에서 바람직한 접근은 낮은 농도의 유리화 작용제 (예를 들어 <2 M 트레할로스)를 활용하여 실온에서 생물학적 물질을 유리화하고 이어서 즉시 극저온 온도에서 저장하는 것이다. 따라서, 상기 장치는 임의로 본 개시내용의 교시에 따른 유리화 후 -196℃ 내지 60℃의 온도에서 저장가능한 물질로 제조된다.
본 개시내용의 하나의 측면은, 보다 작은 부피의 샘플이 또한 성공적으로 유리화되고 재구성시 완전한 또는 예외적으로 높은 성능을 제공할 수 있는 것이다. 일부 측면에서, 10 μL 이하의 부피가 본원에 기재된 바와 같은 공정을 통해 유리화되고 재구성시 완전한 능력을 유지할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 유리화 공정은 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9 μL의 샘플을 포함한 약 0.1 μL 내지 10 μL 이상의 샘플을 유리화할 수 있다. 예를 들어, 본원 실시예에 기재된 바와 같이, 3 μL의 리보핵산을 유리화 혼합물에 제공하고 생성된 유리화된 물질을 실온 훨씬 초과의 온도에서 3개월 초과 동안 저장하면 재구성시 출발 3 μg으로부터 3 ng 미만의 물질 손실이 나타났다. 또한, 리보핵산이 전형적으로 손상 및 분해되기 쉬움에도 불구하고, 본원의 유리화 공정은 작은 부피의 리보핵산을 성공적으로 보호하였고, 그에 따라 재구성시, 신선하게 트랜스펙션된 샘플과 비교하여 75% 초과의 트랜스펙션 활성을 유지하였고, 이는 본원에 기재된 유리화 공정이 작은 부피의 샘플을 안전하게 효과적으로 보존할 수 있음을 나타낸다.
일부 측면에서, 보다 작은 부피의 샘플은 샘플이 차지하는 단위 면적에 대한 것이다. 일부 측면에서, 유리화될 샘플은 약 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 및 0.24 μL/mm2를 포함한 약 0.10 μL/mm2 내지 약 0.25 μL/mm2로 제공된다. 따라서, 10 μL 샘플은 약 40 내지 100 mm2를 차지한다. 일부 측면에서, 샘플은 약 0.5 mm2 내지 약 100 mm2의 기판 영역을 커버링할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 낮은 질량의 샘플의 탁월한 회수를 가능하게 하는 유리화 공정을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에서의 공정은 약 4, 3, 2, 및 1 μg의 샘플을 포함한 5 μg 이하의 질량을 갖는 샘플의 탁월한 회수를 가능하게 한다. 일부 측면에서, 샘플의 질량은 1 μg 미만일 수 있고, 이는 100 ng 이하의 질량을 포함한다. 일부 측면에서, 유리화될 샘플의 질량은 약 0.1 내지 1 μg이며, 이는 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 0.9 μg을 포함한다. 예를 들어, 본원 실시예에 기재된 바와 같이, 1 μg 미만의 항체 단편을 본원에 기재된 공정에 따라 유리화하고, 저장하고, 이어서 재구성하고, 활성에 대해 평가하였다. 유리화 공정은, -20℃ 내지 55℃ 범위의 저장 조건에서도, 후속 ELISA에서 유리화되지 않은 신선한 대조군과 비교하여 항체 활성을 눈에 띄게 방해하거나 변경하지 않았다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 유리화 공정은 성공적인 저장 및 보존을 위해 하나 초과의 샘플 또는 물질에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 다수의 샘플이 동일한 유리화 혼합물 내에서 유리화될 수 있다. 일부 샘플은 요망되는 최종 사용 전에 다른 물질로부터의 단리를 필요로 할 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 측면에서, 분리된 물질이, 단리를 위한 물리적 공간을 활용하여, 동일한 모세관 기판 상의 별도의 유리화 혼합물에서 유리화될 수 있다. 다른 측면에서는, 하나의 물질이 이전에 유리화된 제2의 물질 상에서 유리화되고, 기타 등등이 되도록 순차적 유리화가 활용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 모세관 기판의 동일한 영역 내에서 유리화된 둘 이상의 물질에 관한 것이다. 임의로, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과의 생물학적 물질 또는 시약이 단일 모세관 기판 내로 유리화될 수 있다. 이는 공동-유리화에 의해 또는 연속적 유리화 단계에 의해, 또는 이들의 조합에 의해 달성될 수 있다. 일부 측면에서, 고정화된 생물학적 물질과 같은 하나 이상의 물질이 기저에 있는 모세관 기판에 결합될 수 있다. 예를 들어, 모세관 기판 상의 항체의 고정화는 단일 사용이 일어날 수 있는 영역을 제공하고, 그에 따라 검출가능한 신호가 모세관 기판 상에 제공된다. 하나 이상의 물질이 모세관 기판 상에 고정화될 수 있을 뿐만 아니라 모든 물질이 고정화될 필요는 없음이 명백할 것이다. 예를 들어, ELISA를 위해, 하나의 항체가 고정화될 수 있고, 또 다른 것은 검정을 수행하고 고정화된 항체에 연결될 때까지 고정화되지 않을 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 그 안의 유리화된 물질을 활용하는 검정 또는 측정과 같은 단일 사용을 위해 필요한 하나 이상의 유리화된 물질을 갖는 모세관 기판을 제공한다. 일부 측면에서, 하나 초과의 모세관 기판 또는 그의 부분이 검정을 위해 각 물질에 활용될 수 있다. 일부 측면에서, 단일 사용을 위한 둘 이상의 물질이, 멤브레인의 동일한 영역 내에서 또는 동일한 유리화 매질 내에서 유리화되거나 공동-유리화됨으로써, 함께 유리화될 수 있다. 다른 측면은 모세관 기판의 동일한 영역 내에서 유리화된 둘 이상의 물질을 포함할 수 있고, 검정을 위한 하나 이상의 물질이 별도의 모세관 기판 상에서, 전적으로 상이한 기판 상에서 또는 동일한 기판의 상이한 영역 또는 구역 상에서 유리화됨이 명백할 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 검정과 같은 단일 사용을 위해 모두가 재구성될 수 있는 시점까지 저장을 가능하게 하도록 유리화된 다수의 물질에 관한 것이다. 본원에 기재된 실시예는 생물학적 물질의 양 및 기능 유지를 입증하지만, 다른 물질이 그에 대한 변경 또는 손실 없이 유사하게 유리화될 수 있음이 인식될 것이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 단일 사용을 가능하게 하거나 이를 제공하기 위한 유리화된 물질의 키트 또는 조립체에 관한 것이다. 일부 측면에서, 이는 하나 이상의 유리화된 생물학적 물질을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 이는 단일 사용을 위한 하나 이상의 유리화된 시약을 포함할 수 있다. 시약은 완충제, 염, 기질, 효소 기질, 항원, 화학적 화합물, 펩티드, 및 소 핵산, 예컨대 프라이머 또는 siRNA를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 단일 사용 조립체 또는 키트는 하나 이상의 유리화되지 않은 물질, 예컨대 재구성을 위한 액체 용액, 비-부패성 또는 산화-민감성 화학물질 또는 염, 완충제, 세포 배지, 항균제, 등을 필요로 하거나 임의로 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 단일 사용을 위한 키트를 위해 모든 물질이 유리화될 필요는 없음이 추가로 인식될 것이다. 예를 들어, 사용자는 유리화된 물질(들)이 함께 그의 분석 또는 관찰에 사용될 수 있는 시험 물질 또는 샘플을 공급할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 공정에 의해 유리화된 하나 이상의 물질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 이는 하나 이상의 유리화된 생물학적 샘플, 하나 이상의 유리화된 시약, 및/또는 하나 이상의 동반 용액을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 키트는 단지 하나 또는 그 초과의 유리화된 생물학적 샘플 또는 단지 하나 또는 그 초과의 유리화된 시약을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 키트는 적어도 하나의 유리화된 생물학적 샘플 및 적어도 하나의 유리화된 시약을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 키트는 또 다른 생물학적 샘플 및/또는 적어도 하나의 시약과 공동-유리화된 적어도 하나의 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 키트의 모든 또는 일부 성분은, 공유된 기저에 있는 기판의 별도의 구역 또는 영역 상에서 또는 개개의 기판 상에서, 또는 이들의 조합에서, 독립적으로 유리화될 수 있다.
일부 측면에서, 키트는 단일 사용 적용의 모두 또는 부분을 제공할 수 있다. 이러한 적용은 폴리머라제 사슬 반응 (PCR), 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 세포 배양, 의료 샘플 수득, 의약품 제공, 백신 제공, 실험실 검정, 효소 검정, 세포 트랜스펙션, DNA 돌연변이유발 또는 편집, 외인성 단백질 또는 펩티드의 발현 등을 위한 물질을 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 유리화된 핵산, 단백질, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 사슬, DNA, RNA, mRNA, tRNA, 항체, 완충제, 염, 효소, 효소-기질, 지질, 양이온성 지질, 이온화성 지질, 스테롤, 스테로이드, 치료제, 아주반트, 담체, 부형제, 기질, 촉매, 아미노산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP), 이들의 조합 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 포획 항체, 항원, 및 검출 항체의 유리화는 결과 ELISA 검정에 불리하게 영향을 미치지 않음이 확인된다. 따라서, 키트는 유리화된 포획 항체, 항원, 및/또는 검출 항체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트는 또한 유리화된 검출 시약을 포함할 수 있다. 키트는 재구성 용액을 포함할 수 있다. 키트는 유리화 매질과 같은 유리화를 가능하게 하여 물질의 저장을 가능하게 하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, PCR의 경우, 키트는 유리화된 프라이머(들), 유리화된 폴리머라제, 유리화된 역전사효소, 유리화된 벡터, 유리화된 템플레이트 DNA/RNA, 유리화된 dNTP 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 키트는 유리화된 효소 및/또는 효소에 대한 유리화된 기질을 제공할 수 있다.
실시예
1. 샘플 가열 및 모세관 기판 크기
낮은 대기압 하에 데시케이션 공정에 열을 적용하는 역할 및 진공 적용 후 샘플 온도를 되돌리는 능력에 대한 모세관 기판 크기의 영향을 평가하기 위해 초기 예를 배열하였다.
상이한 형상의 유리 멤브레인 (알슬트롬(Ahlsltrom) 8951)에 4 wt% BSA, 15 wt% 트레할로스 이수화물, 0.75 wt% 글리세롤, 2 wt% 트윈-20, 및 물을 함유하는 액체를 로딩하였다. 멤브레인의 mm2 당 액체 로딩은 모든 경우에 0.316 ml에서 유지하였다. 케이스 1의 경우, 멤브레인을 0.25 인치 직경 원으로 절단하고, 각각에 10 ml 액체 샘플을 로딩하였다. 480 ml를 함유하는 총 48개의 멤브레인 샘플을 진공 챔버 내부의 가열된 (즉, 37℃) 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 2의 경우, 각각 470 μl 액체를 함유하는 3개의 긴 멤브레인 스트립 (240 mm x 6.23 mm)을, 또한 37℃에서, 가열된 와이어 메쉬 상에 로딩하였다. 케이스 3의 경우, 1700 μl 액체를 함유하는 단일 스트립 (240 mm x 22 mm)을 활용하였다. 챔버를 각 경우에 29.5 mmHg로 비웠다. 온도-시간 플롯은 액체가 데시케이션 공정을 겪음을 나타낸다. 도 5는 적용된 진공의 시간 경과에 따른 샘플 온도를 나타낸다.
도 5에서 보이는 바와 같이, 각각의 샘플은 급격한 온도 강하를 겪었다. 와이어 메쉬를 통해 샘플을 표면 가열함으로써 강하를 극저온 온도 초과에서 유지하도록 관리하였다. 데시케이션 공정을 통해 물 손실이 발생함에 따라, 대부분의 물이 손실될 때까지 샘플 온도가 상승하였고, 이는 유리화 공정이 거의 완료되었음을 나타낸다. 단위 면적 당 액체 로딩은 일정하였지만, 증발을 유발하는 모세관 기판의 수 및 치수는 유리화 공정에 걸리는 시간에 영향을 미쳤다. 이들 데이터는, 더 큰 부피의 물질에 대해, 더 작은 멤브레인을 사용하고 그에 따라 유리화 매질을 분할함으로써 더 급속한 유리화가 달성될 수 있음을 입증한다.
2. 친수성 모세관 기판
친수성 및 소수성 모세관 시스템의 적합성에 대한 분석은, 약물 조성물을 유리화 매질 중에 현탁시키고 각각을 동일한 부피로 각각의 유형의 멤브레인 상에 침착시킴으로써 평가하였다. 원래 소수성인 멤브레인을 친수성으로 만들기 위해 저온 플라즈마로 처리하였다. 도 9는 유리화 전과 후의 결과를 나타낸다. 소수성 멤브레인 상의 약물 제제 현탁시, 적용된 액체는 거의 구형의 액적을 형성한 반면 (좌측 상단), 친수성 멤브레인은 액체가 기저에 있는 모세관 채널로 유동하는 것을 가능하게 하였다. 유리화 공정 동안, 소수성 멤브레인 상의 액체 액적은 먼저 비등되고 이어서 동결된 반면, 친수성 멤브레인 상의 액체는 급속히 유리화되어 유리질 단일체를 형성하였다. 진공의 해제시, 동결된 액적은 다시 액체가 되었지만, 부분적 수분 손실로 인해 크기가 감소하였다. 유리화에 대한 모세관 증발의 효능은 전환된 친수성 모세관 멤브레인 상에서의 제시된 균일한 유리화에서 명백하다.
3. 데시케이션 챔버
모세관 패턴 (예를 들어 도 1b)으로 카트리지의 표면을 패턴화하는 대신에 (도 6a), 데시케이션 챔버의 벽을 정렬하는 친수성 모세관 기판을 제공함으로써 모세관 시스템을 생성할 수 있다 (도 6b). 본 실시예에서는, 밀봉되고 진공 공급원에 작동가능하게 연결되는 능력으로 인해 중공 시린지를 활용하였다. 실린더형 성질은 그 안의 샘플에 열을 적용하기 위한 간단한 형상을 추가로 제공하였다.
친수성 멤브레인을 곡선화하여 실린더형 본체 내부에 삽입하였다. 유리화 용액의 현탁시, 액체는 멤브레인이 액체로 완전히 로딩될 때까지 기저에 있는 멤브레인의 모세관 채널 내로의 그의 경로를 찾았다.
평가를 위해, 120 IU/mL의 VM 중의 농도로 인슐린 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich))의 유리화 용액을 제조하였다. 각각의 샘플은 15 IU (125 μL VM)를 가졌다.
곡선화된 챔버 내의 총 6개 샘플 및 3개의 평평한 멤브레인 샘플을 초기에 열의 적용 없이 진공 챔버 내에서 함께 유리화하였다. 유리화 공정 후 수분 잔류비 (MRR) 및 단백질 회수율을 평가하였다 (도 8).
수성 매질에 대한 생물학적 샘플의 혼합비를 검사하였다. 다시 인슐린을 활용하고 표 1에 기재된 바와 같이 PBS와 혼합하였다:
유리화 공정을 열의 존재 하에 또는 열 적용 없이 30 min 동안 진공에서 수행하였고, MRR 및 중량 손실을 측정하였다. 도 10 및 11은 열 적용 없이 얻어진 결과를 나타내고, 도 12 및 13은 극저온 온도 초과에서 샘플을 유지하고 이로써 동결 조건으로의 노출을 막기 위해 유리화 공정 동안 열을 적용한 결과를 나타낸다.
4. 작은 샘플 부피
유리화 공정으로부터 작은 샘플을 회수하는 능력을 평가하기 위해, 작은 부피의 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 mRNA를 활용하였다. 유리화 공정을 위해, 8 ㎛ PES 멤브레인 (모세관 기판)을 먼저 ¼ 인치 직경 크기로 절단하고 오토클레이빙하였다. PBS 중의 22.7 mg/mL 글리세롤 및 1200 mM (또는 454 mg/mL) 트레할로스를 함유하는 2X 유리화 매질 (VM)을 제조하고 이어서 등부피의 mRNA (대셔 GFP mRNA, 3870FS 알데브론) 스톡과 혼합하였다. 혼합물을 각각의 유리화 모세관 기판에 대한 6 μL 피펫팅 전에 5분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 멤브레인 상에 피펫팅한 후, 샘플을 중합체 뚜껑으로 커버링하고 유리화 챔버 내로 로딩하였다. 각각의 유리화된 샘플에 대하여, 총 6 μL를 유리화 전에 멤브레인으로 로딩하였고, 그 안에 3 μg의 mRNA를 포함하는 3 μL의 네이키드 mRNA 스톡이 존재하였다.
유리화 후, 샘플을 마일라 파우치 내에 밀봉하고 55℃에서 저장 후 시험하였다.
55℃에서의 유리화 저장 100일 후, 샘플을 짧은 와동으로 mRNA를 방출시키며 50 μL의 플루오로브라이트 매질로 재구성하였다. 이어서 바이오텍 시너지(BioTek Synergy) H1 마이크로플레이트 판독기에서 Take3 플레이트를 사용하여 mRNA를 정량화하였다. 표 2는 얻어진 정량화를 나타낸다.
표 2
이어서 mRNA의 부분을 트랜스펙션을 위해 또는 아가로스 겔 상에서의 가시화를 위해 사용하였다.
아가로스 겔에 대하여, 1.2% 아가로스 겔의 제1 레인에 3 μL의 염료 및 5 μL의 물을 갖는 3 μL의 밀레니움(Millennium)™ RNA 마커 (AM7150)의 래더를 사용하였다. 포지티브 대조군에 대하여, 스톡 mRNA를 하기 3개의 포지티브 대조군으로 125 ng/μL로 희석하였다: 묽은 mRNA 스톡을 125 ng/μL로, 이어서 1 μL의 묽은 스톡을 3 μL의 염료 및 5 μL의 물과 혼합하였다. 유리화된 샘플에 대하여, 125 ng의 재구성된 mRNA를 3 μL의 염료 및 5 μL의 물과 혼합하였다. 겔을 85V에서 1시간 동안 진행시킨 후, 겔을 SYBR 그린 II로 30 min 동안 진탕기 상에서 염색하였고, 이는 바이오라드(BioRad) 투과조명기로 판독되었다. 도 14A는 겔의 캡처 이미지를 나타내며, 레인 2 및 3은 -80℃에서 저장된 신선한 mRNA이고, 레인 4 및 5는 재구성된 유리화된 mRNA이고, 레인 5 및 6은 55℃에서 저장된 유리화되지 않은 mRNA이다.
트랜스펙션을 위해, 4 μL 리포펙타민 (리포펙타민(Lipofectamine)™ 메신저(Messenger)MAX™ 트랜스펙션 시약, 리포펙타민™ 메신저MAX™ 트랜스펙션 시약)의 포지티브 대조군을 16 μL 매질에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션하였다. 또 다른 튜브에서, 1 μL의 mRNA (신선한 샘플)를 19 μL의 매질에 첨가하고, 10 min 동안 인큐베이션하였다. 이어서 두 용액을 혼합하고, 추가의 5분 동안 인큐베이션한 후 0.9x106 세포/mL CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포로 시딩된 10 μL 세포 플레이트로 옮겼다. 네가티브 대조군 및 유리화된 샘플에 대하여, 정량화 후 mRNA의 부피를 1 μg의 mRNA를 만드는 데 필요한 양으로 정규화하고, 10분 인큐베이션 후 리포펙타민에 첨가하였다. 도 14B는 GFP 발현의 수집된 이미지를 나타내며, 상단 패널은 신선한 mRNA의 포지티브 대조군이고, 중앙 패널은 55℃에서 저장된 유리화되지 않은 mRNA의 네가티브 대조군이고, 저부 패널은 재구성된 mRNA이다. 도 14C는 포지티브 대조군으로 얻은 것에 비해 얻어진 트랜스펙션 효율의 백분율을 나타낸다.
PES 멤브레인 상에서 유리화되고 55℃에서 100일 동안 저장된 mRNA는, -80℃에서 저장된 신선한 액체 mRNA와 유사한 mRNA 온전성, 순도, 및 안정성을 유지한다.
5. 낮은 질량 유리화
다음으로 알칼리 포스파타제 토끼 항-인간 IgG를 활용하여 보다 작은 질량의 샘플을 유리화하고 재구성하고 기능을 유지할 수 있는 능력을 평가하였다. 0.6 mg/mL 어피니퓨어 토끼 항-인간(AffiniPure Rabbit Anti-Human) IgG (H+L) (Cat: 309-055-082, 잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈, 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브))의 스톡 1.2 μL를 36.3 μL PBS와 혼합하고 이어서 PBS 중의 1200 mM (또는 454 mg/mL) 트레할로스 및 22.7 mg/mL 글리세롤의 준비된 2X 유리화 매질의 추가의 37.5 μL와 혼합하였다. 65 μL를 취출하여 1 인치 직경, 8 μm 기공 크기 PES 멤브레인 상에 분주하였다. 총 2개 샘플을 37℃로 설정된 베드 가열 온도로 30 min 동안 유리화한다.
유리화 후, 하나의 샘플은 -20℃에서 저장하고, 다른 샘플은 55℃에서 저장하였다. 4.8 μL의 항체 스톡을 255.2 μL의 PBS와 혼합하여 액체 대조군을 제조하고, 55℃에서 저장하였다.
샘플을 재구성하고 항체의 존재 및 기능 유지에 대해 ELISA에서 검정하였다. 포획 항체 (어피니퓨어 마우스 항-인간(AffiniPure Mouse Anti-Human) IgG, F(ab')2 단편 특이적, 잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈, Cat 209-005-097)를 1 μg /mL로 희석하고, 웰 당 100 μL를 사용하여 ELISA 플레이트 상에 코팅하였고, 이를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서 플레이트를 RT에서 1시간 동안 200 μL/웰 검정 희석제로 블록킹한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다.
이어서 의도된 항원을 희석 플레이트 상에서 3배 연속 희석 (인간 IgG 전체 분자, 락랜드(Rockland), Cat 009-0102)하고, 100 μL의 희석된 항원을 상응하는 웰로 옮기고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 100 μL/웰의 재구성된 ALP 컨쥬게이션된 항체를 플레이트에 첨가하고, RT에서 1 hr 동안 인큐베이션한 후, 검정 희석제 300 μL/웰로 3회 세척하였다. 다음으로, 100 μL/웰 4-MUP 기질 용액을 첨가하고, RT에서 암소에서 20 min 인큐베이션하였다. 바이오텍 시너지 H1 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광 신호를 플레이트로부터 판독하고, 이어서 데이터를 처리하였다. 도 15는 검정된 각각의 농도/희석에서의 상대적 형광 단위 (RFU)를 나타낸다. 0.84 μg의 유리화된 알칼리-포스파타제 검출 항체는, -20℃ 또는 55℃에서의 저장에 관계없이, 포지티브 대조군과 유사한 ELISA 반응을 제공하였고, 이는 유리화된 ALP 컨쥬게이션된 검출 항체가 유리화 및 저장 전의 원래의 양 및 기능 둘 다를 유지함을 나타낸다. 또한 도 15에서 보이는 바와 같이, 액체 항체 (즉, 유리화되지 않은)의 하룻밤 저장조차도 현저한 기능 감소를 나타내었다.
6. 다중 샘플 유리화
다음으로, 효소와 그의 화학적 기질의 공동-유리화 후 기능 및 양을 유지하는 능력을 평가하였다. 이 시리즈의 시험을 위해, 루시퍼라제 스톡 (퀀티룸(QuantiLum)®재조합 루시퍼라제, 프로메그(Promeg), E170) 및 루시페린 기질 (딱정벌레 루시페린, 칼륨 염, 프로메가(Promega), E1601)을 사용하였다. 2 μL의 루시퍼라제 스톡 및 55.6 μL의 루시페린을 PBS 중의 1200 mM 트레할로스 및 22.7 mg/mL 글리세롤을 함유하는 유리화 매질 57.6 μL와 혼합하였다. 혼합물을 1 인치 직경 8 μm PES 멤브레인 상에 분주하고, 37℃의 가열 베드 온도로 30분 동안 유리화하였다.
재구성 후, 유리화된 루시퍼라제/루시페린을 ATP 첨가에 따라 신선한 루시퍼라제 및 루시페린으로 얻은 활성과 비교하였다. ATP 표준은 2배 연속 희석으로 1 mM ATP 용액으로부터 제조하였다. 50 μL의 상응하는 ATP를 각 웰에 첨가하였다. 신선한 루시퍼라제/루시페린의 경우, 2.3 μL의 루시퍼라제 스톡을 71.7 μL의 루시페린 스톡 및 1426 μL의 4.7 mM MgSO4/EPPS와 혼합하였고, 각 웰에 50 μL를 넣었다. 유리화된 샘플의 경우, 재구성된 부피에 1164.1 μL의 4.5 MgSO4/EPPS를 첨가하였고, 웰 당 50 μL를 사용하였다. 도 16은 신선한 및 유리화된 샘플 사이의 비교를 나타낸다. 단일 사용 루시페라제 및 루시페린 유리화된 제제는 신선하게 제조된 액체 루시퍼라제 및 루시페린과 유사한 발광 신호를 나타내고, 이는 기능적 활성 및 발광 신호가 유리화 및 비-극저온 저장에 의해 손상되지 않음을 나타낸다.
추가로, 도 19에 나타낸 바와 같이, 유리화 공정이 다수회 반복될 수 있다. 도 19는 유리화를 위해 1 인치 직경 8 ㎛ PES 멤브레인에 첨가된 유리화 매질 (600 mM 트레할로스, 5% 글리세롤 (트레할로스의 중량에 대하여) 및 PBS)을 나타낸다. 4개 유리화 사이클에서, 2개 샘플의 온도 프로파일이 기록되었고, 또 다른 유리화 사이클에서, 1개 샘플의 온도 프로파일이 기록된다. 전체적으로, 9개 샘플에 대한 온도 데이터 (실행간, 실행내)가 기록되고 에러 바의 존재와 함께 플롯팅된다. 데이터는 공정의 일관성, 강건성 및 반복성을 나타낸다.
7. 개개의 다성분 유리화
다음으로, 검정을 위한 단리된 성분이 개별적으로 유리화되고 여전히 양 및 기능을 유지할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 따라서, ELISA를 개별적으로 유리화된 항원, 포획 항체 및 검출을 위한 알칼리 포스파타제 컨쥬게이션된 항체로 수행하였다. PBS 중의 1200 mM 트레할로스 및 22.7 mg/mL 글리세롤을 함유하는 유리화 매질을 사용하여 개별적으로 유리화하였다: 20 μL를 55 μL PBS 및 75 μL 유리화 매질과 조합함으로써 포획 어피니퓨어 마우스 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이적 (잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈, Cat 209-005-097); 12 μL를 63 μL PBS 및 75 μL의 유리화 매질과 조합함으로써 전체 인간 IgG의 항원 (인간 IgG 전체 분자, 락랜드, Cat 009-0102); 또한, 3.6 μL를 71.4 μL PBS 및 75 μL의 유리화 매질과 조합함으로써 검출 항체 (알칼리 포스파타제 어피니퓨어 토끼 항-인간 IgG (H+L), 잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈, 인코포레이티드, 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브, Cat 309-055-082). 50 μL의 각 혼합물을 멤브레인에 적용하고, 37℃로 설정된 가열 베드 온도로 30 min 동안 유리화하였다.
유리화된 시약 각각을 상응하는 ELISA 단계에 사용하기 전에 하기 부피의 검정 희석제 중에서 재구성하였다: 포획 12 mL, 항원 2 mL, 검출 12 mL. 조건의 요약이 표 3에 나타나 있다.
표 3
ELISA 자체에서, 신선한 액체 대조군에 대하여, 포획 항체를 1 μg/mL로 희석하고, 웰 당 100 μL를 사용하여 상응하는 웰 내에서 코팅하였다. 유리화된 포획 항체 샘플에 대하여, 상응하는 웰을 웰 당 100 μL로 코팅하였다. 둘 다 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서 플레이트를 RT에서 1시간 동안 200 μL/웰 검정 희석제로 블록킹한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 희석 플레이트 상에서 신선한 항원 및 유리화된 항원 둘 다에 대한 3배 연속 희석액을 제조하고, 이어서 100 μL의 희석된 항원을 상응하는 웰로 옮기고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 100 μL/웰의 신선한 또는 유리화된 ALP 컨쥬게이션된 항체를 플레이트에 첨가하고, RT에서 1 hr 동안 인큐베이션한 후, 300 μL/웰의 검정 희석제로 3회 세척하였다. 이어서, 100 μL/웰의 4-MUP 기질 용액을 첨가하고, RT에서 암소에서 20 min 인큐베이션하였다. 이어서 형광 신호를 판독하였다.
도 17A 및 17B에서 보이는 바와 같이, 유리화된 ELISA 항체 및/또는 항원은 신선하게 제조된 액체, 유리화되지 않은 대조군에서 관찰된 것과 유사한 신호를 갖는다. 도 17A는 유리화된 항원, 포획 및 검출 항체의 ELISA를 나타내고, 도 17B는 유리화되지 않은 항원과 유리화된 포획 및 검출 항체를 나타낸다. 유리화 공정은 검정에서 항체 또는 항원 기능적 활성을 변경하지 않았다.
이어서 4-부분 검정을 위한 추가의 유리화된 성분을 평가하였다. 따라서, 양 및/또는 기능의 손실을 평가하기 위해 ELISA에서 추가 매개자로서 스타필로콕쿠스(Staphylococcus) 장독소 B (SEB)를 도입하였다. 따라서, 포획 (토끼 항-SEB 다클론성, Cat AB-R-SEB) 스톡을 560 μg/mL로 희석하고, 이어서 10.8 μL를 14.2 μL PBS 및 25 μL의 유리화 매질과 혼합하였다. 항원 (스타필로콕쿠스 장독소 B (SEB))은 23.7 μL PBS 및 25 μL 유리화 매질과 혼합하기 위해 1.3 μL가 필요하였다. 검출 항체 (마우스 항-SEB mab, Cat AB-R-MAB) 스톡은 19.2 μL PBS 및 25 μL 유리화 매질과 5.8 μL를 사용하여 420 μg/mL의 농도로부터의 것이었다. 알칼리 포스파타제 (ALP) 컨쥬게이트 (알칼리 포스파타제 컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치 래보래토리즈, 115-055-146)를, 4.8 μL를 20.2 μL PBS 및 25 μL의 유리화 매질과 조합하여 혼합하였다. 세척된 멤브레인에 각각 50 μL를 적용하고, 이어서 37℃로 설정된 가열 베드 온도로 30 min 동안 유리화하였다. 유리화된 시약 각각을 상응하는 ELISA 단계에서 사용하기 전에 하기 부피의 검정 희석제 중에서 재구성하였다: 포획 12 mL, 항원 2 mL, 검출 12 mL. 표 4는 활용된 부피 및 농도의 요약을 나타낸다.
표 4
ELISA를 위해, 신선한 포지티브 대조군으로서 포획 항체를 0.5 μg/mL로 희석하고, 웰 당 100 μL를 사용하여 상응하는 웰 내에서 코팅하였다. 유리화된 포획 항체 샘플에 대하여, 상응하는 웰을 웰 당 100 μL로 코팅하였다. 웰을 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 200 μL/웰 검정 희석제로 RT에서 1시간 동안 블록킹한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다.
다음으로, 희석 플레이트 상에서 10 μg/mL의 출발 농도로부터 신선한 항원 및 유리화된 항원 둘 다에 대하여 2배 연속 희석을 수행하고, 이어서 100 μL의 희석된 항원을 상응하는 웰로 옮기고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 검정 희석제로 300 μL/웰을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 이어서, 100 μL/웰의 신선한 또는 유리화된 검출 항체를 플레이트에 첨가하고, RT에서 1 hr 동안 인큐베이션한 후, 300 μL/웰의 검정 희석제로 3회 세척하였다. 다음으로, 100 μL/웰의 신선한 또는 유리화된 ALP 컨쥬게이션된 항체를 플레이트에 첨가하고, RT에서 1 hr 동안 인큐베이션한 후, 300 μL/웰의 검정 희석제로 2회 세척하였다. 마지막으로, 100 μL/웰의 4-MUP 기질 용액을 첨가하고, RT에서 암소에서 20 min 인큐베이션하였다. 바이오텍 시너지 H1 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 플레이트로부터의 형광 신호를 판독하고, 데이터를 적절히 처리하였다.
도 18에서 보이는 바와 같이, 검정에서 모든 4개 성분의 유리화는 신선하게 제조된 액체, 유리화되지 않은 대조군에서 관찰된 것과 유사한 결과를 여전히 제공하였다. 따라서, 유리화 공정은, 항체 또는 SEB 항원에 대한 양 또는 기능을 변경하지 않는다.
추가예
본 개시내용의 제1 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, a) 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물을, 모세관 네트워크를 포함하는 기판 상에 오버레잉하는 단계로서, 여기서 상기 기판은 데시케이션 챔버 내에 있는 것인 단계; b) 데시케이션 챔버 내의 대기압을 낮추는 단계; c) 표면으로부터 열 에너지를 유리화 혼합물에 제공하는 단계로서, 여기서 열 에너지는 유리화 혼합물이 동결 조건을 겪는 것을 막기에 충분한 것인 단계; 및 d) 유리화 혼합물이 유리질 상태에 진입할 때까지 유리화 혼합물을 모세관 작용에 의해 데시케이션시키는 단계를 포함하는, 극저온 온도 초과에서의 하나 이상의 생물학적 물질의 유리화 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제2 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 모세관 네트워크가 기판의 표면을 따르는 윤곽에 의해 제공된 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제3 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 기판이 데시케이션 챔버의 벽이거나 데시케이션 챔버의 벽과 회합된 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제4 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 데시케이션 챔버 내의 모세관 네트워크가 기저에 있는 고체 지지 기판에 의해 접촉된 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제5 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물의 유리화가 30분 미만 내에 일어나는 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제6 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물의 유리화가 10분 미만 내에 일어나는 것인, 제5 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제7 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 열 에너지를 유리화 혼합물의 가열에 의해 제공하는 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제8 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 대기압을 약 0.9 atm 내지 약 0.005 atm의 값으로 낮추는 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제9 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 대기압을 약 0.004 atm으로 낮추는 것인, 제8 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제10 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제공된 열 에너지가 유리화 동안 유리화 혼합물 내의 결정화를 막기에 충분한 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제11 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제공된 열 에너지가 상기 유리화 동안 생물학적 샘플을 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도에서 유지하기에 충분한 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제12 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 상기 유리화 매질이 트레할로스, 글리세롤 및 베틴 및/또는 콜린을 포함하는 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제13 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 모세관 네트워크가 친수성인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제14 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 모세관 네트워크가 연속 모세관 채널을 포함하는 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제15 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 핵산, 아미노산, 폴리뉴클레오티드 사슬, 펩티드, 단백질, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제1 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제16 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 상기 유리화 혼합물을 10 μL 이하의 부피로 상기 기판 상에 오버레잉하는 것인, 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제17 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플의 총 부피가 0.1 μL 내지 10 μL인, 제16 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제18 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 상기 생물학적 샘플이 1 μg 이하로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인, 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제19 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 5 μg 이하, 임의로 1 μg 미만의 총 질량을 갖는 것인, 제18 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제20 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 0.1 μg 내지 1 μg의 총 질량을 갖는 것인, 제19 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제21 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물이 제2 물질을 추가로 포함하는 것인, 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제22 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 물질이 생물학적 샘플에 대한 시약인, 제21 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제23 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물이 제1 시약 물질을 추가로 포함하는 것인, 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제24 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물이 제2 시약 물질을 추가로 포함하는 것인, 제23 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제25 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 시약 물질이 효소 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인, 제24 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제26 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 효소 또는 그의 활성 단편과 효소-촉매화 반응을 겪는 화학적 화합물을 포함하는 것인, 제25 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제27 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 시약 물질이 제1 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인, 제24 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제28 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 항원 또는 제2 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하고, 제2 항체 또는 그의 활성 단편은 제1 항체 또는 그의 활성 단편과 상이한 에피토프에 결합하는 것인, 제27 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제29 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 시약 물질이 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 것인, 제24 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제30 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 것인, 제29 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제31 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물이 효소를 추가로 포함하는 것인, 제29 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제32 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드 사슬이 발현 벡터를 포함하는 것인, 제29 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제33 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 효소를 포함하는 것인, 제32 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제34 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 기판에 결합된 것인, 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제35 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물이 기판에 결합되지 않은 적어도 하나의 생물학적 샘플을 추가로 포함하는 것인, 제34 측면의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제36 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물이 완충제를 추가로 포함하는 것인, 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제37 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 단계 d) 후에 제2 유리화 혼합물을 기판 상에 오버라잉하고 단계 b), c), 및 d)를 반복하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 제2 유리화 혼합물은 모세관 기판 상의 제2 시약 혼합물 및 유리화 매질을 포함하고, 제2 시약 혼합물은 제2 시약 물질을 포함하는 것인, 제1 내지 제15 측면 중 어느 하나의 공정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제38 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 내지 제15 또는 제37 측면 중 어느 하나의 공정에 의해 제조된 둘 이상의 물질의 유리화된 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제39 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플 및 제2 시약 물질을 포함하는, 제38 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제40 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 생물학적 샘플을 추가로 포함하는, 제39 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제41 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 효소 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인, 제38 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제42 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 효소 또는 그의 활성 단편과 효소-촉매화 반응을 겪는 화학적 화합물을 포함하는 것인, 제41 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제43 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 제1 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인, 제39 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제44 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 제2 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하고, 제2 항체 또는 그의 활성 단편은 제1 항체 또는 그의 활성 단편과 상이한 에피토프에 결합하는 것인, 제43 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제45 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 물질이 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 것인, 제39 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제46 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 것인, 제45 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제47 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 혼합물이 효소를 추가로 포함하는 것인, 제46 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제48 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 물질이 제2 폴리뉴클레오티드 사슬을 추가로 포함하는 것인, 제45 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제49 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드 사슬이 발현 벡터를 포함하는 것인, 제45 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제50 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 효소를 포함하는 것인, 제45 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제51 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 물질 또는 제2 시약이 기판에 결합된 것인, 제39 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제52 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 또는 제2 시약 물질이 모세관 기판에 공유 결합된 것인, 제51 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제53 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 혼합물이 완충제를 추가로 포함하는 것인, 제39 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제54 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 5 μg 이하로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인, 제38 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제55 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 1 μg 이하로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인, 제54 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제56 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 0.1 μg 내지 1 μg으로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인, 제54 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제57 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플의 총 부피가 0.1 μL 내지 10 μL인, 제56 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제58 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물이 10 μL 이하의 부피인, 제38 측면의 혼합물에 관한 것이다.
본 개시내용의 제59 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제38 측면의 시약 물질을 일정 부피의 용액으로 재구성하는 단계; 및 시험 물질을 그에 첨가하는 단계를 포함하며, 임의로 여기서 상기 용액은 상기 시험 물질을 포함하는 것인, 검정에 관한 것이다.
본 개시내용의 제60 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 내지 제15 또는 제37 측면 중 어느 하나의 공정에 의해 제조된 유리화된 물질을 하우징하는 하나 이상의 기판을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제61 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제1 모세관 기판이 생물학적 물질을 포함하고, 제2 모세관 기판이 제2 시약 물질을 포함하는 것인, 제60 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제62 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화된 물질이 효소 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인, 제61 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제63 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 효소 또는 그의 활성 단편과 효소-촉매화 반응을 겪는 화학적 화합물을 포함하는 것인, 제62 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제64 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화된 물질이 제1 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인, 제61 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제65 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 제2 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하고, 제2 항체 또는 그의 활성 단편은 제1 항체 또는 그의 활성 단편과 상이한 에피토프에 결합하는 것인, 제64 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제66 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화된 물질이 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 것인, 제61 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제67 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 제2 시약 물질이 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 것인, 제66 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제68 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화된 효소를 포함하는 제3 모세관 기판을 추가로 포함하는, 제67 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제69 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 폴리뉴클레오티드 사슬이 발현 벡터를 포함하는 것인, 제66 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제70 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 물질이 모세관 기판에 결합된 것인, 제60 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제71 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 물질이 모세관 기판에 공유 결합된 것인, 제70 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제72 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 5 μg 이하의 총 질량으로 상기 모세관 기판 내로 유리화된 것인, 제60 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제73 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 1 μg 이하의 총 질량으로 상기 모세관 기판 내에 존재하는 것인, 제72 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제74 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 생물학적 샘플이 0.1 μg 내지 1 μg의 총 질량으로 상기 모세관 기판 내로 유리화된 것인, 제72 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제75 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물의 총 부피가 0.1 μL 내지 10 μL인, 제60 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 제76 측면은, 단독으로 또는 본원의 임의의 다른 측면과 조합되어, 유리화 혼합물의 총 부피가 10 μL 이하인, 제60 측면의 키트에 관한 것이다.
본 개시내용의 측면이 예시되고 기재되었지만, 이들 측면이 본 개시내용의 모든 가능한 형태를 예시하고 기재하는 것으로 의도되지는 않는다. 그보다는, 본 명세서에서 사용된 단어는 제한이 아닌 설명의 단어이며, 본 개시내용의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 그에 대한 다양한 변형 및 대체가 이루어질 수 있음이 이해된다.
특허 문헌 참조
비-특허 참조
본원에 나타내고 기재된 것들에 추가로, 본 개시내용의 다양한 변형이 상기 설명의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 시약은 관련 기술분야에 공지된 공급원에 의해 수득가능함이 인식된다.
또한, 특정 성분 및/또는 조건은 물론 변할 수 있기 때문에, 본 개시내용은 본원에 기재된 특정 측면 및 방법으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 본 개시내용의 특정 측면을 설명하기 위한 것이며 어떠한 방식으로든 제한되도록 의도되지 않는다. 또한, 용어 "제1", "제2", "제3" 등이 본원에서 다양한 요소, 성분, 영역, 층, 및/또는 섹션을 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이들 요소, 성분, 영역, 층, 및/또는 섹션이 이들 용어에 의해 제한되어선 안 됨이 이해될 것이다. 이들 용어는 단지 하나의 요소, 성분, 영역, 층, 또는 섹션을 또 다른 요소, 성분, 영역, 층, 또는 섹션과 구별하기 위해 사용된다. 따라서, 하기에서 논의되는 "제1 요소", "성분", "영역", "층" 또는 "섹션"은 본원 교시로부터 벗어나지 않으면서 제2 (또는 다른) 요소, 성분, 영역, 층, 또는 섹션으로 불릴 수 있다. 유사하게, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한, "적어도 하나"를 포함한 복수형을 포함하도록 의도된다. "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 관련 나열 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다. 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는" 및/또는 "포함한"은 본 명세서에서 사용시 언급된 특징, 영역, 정수, 단계, 작업, 요소, 및/또는 성분의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 영역, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분, 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않음이 추가로 이해될 것이다. 용어 "또는 이들의 조합"은 상기 요소 중 적어도 하나를 포함하는 조합을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어 (기술적 및 과학적 용어 포함)는 본 개시내용이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 통상적으로 사용되는 사전에 정의된 것들과 같은 용어는 관련 기술 및 본 개시내용의 맥락에서 그의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본원에 명시적으로 그와 같이 정의되지 않는 한, 이상적인 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않을 것임이 추가로 이해될 것이다.
본 발명자들에게 현재 공지된 본 개시내용을 실시하는 최선의 모드를 구성하는, 본 개시내용의 예시적 조성물, 측면 및 방법을 상세히 참조한다. 도는 반드시 축척에 따른 것은 아니다. 그러나, 개시된 측면은 다양하고 대안적인 형태로 구현될 수 있는 본 개시내용의 단지 예시임을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 개시된 특정 상세사항은 제한적인 것으로 해석되어선 안 되며, 단지 본 개시내용의 임의의 측면에 대한 대표적인 기초 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 개시내용을 다양하게 사용하도록 교시하기 위한 대표적인 기초로서 해석되어야 한다.
본 명세서에 언급된 특허, 공개, 및 출원은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 이들 특허, 공개, 및 출원은 각각의 개별 특허, 공개, 또는 출원이 본원에 구체적 및 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
상기 설명은 본 개시내용의 특정 실시양태의 예시이지만, 그의 실행에 대한 제한을 의미하지는 않는다. 그의 모든 등가물을 포함한 하기 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하도록 의도된다.
Claims (76)
- a) 생물학적 샘플 및 유리화 매질을 포함하는 유리화 혼합물을, 모세관 네트워크를 포함하는 기판 상에 오버레잉하는 단계로서, 여기서 상기 기판은 데시케이션 챔버 내에 있는 것인 단계;
b) 데시케이션 챔버 내의 대기압을 낮추는 단계;
c) 표면으로부터 열 에너지를 유리화 혼합물에 제공하는 단계로서, 여기서 열 에너지는 유리화 혼합물이 동결 조건을 겪는 것을 막기에 충분한 것인 단계; 및
d) 유리화 혼합물이 유리질 상태에 진입할 때까지 유리화 혼합물을 모세관 작용에 의해 데시케이션시키는 단계
를 포함하는, 극저온 온도 초과에서의 하나 이상의 생물학적 물질의 유리화 방법. - 제1항에 있어서, 모세관 네트워크가 기판의 표면을 따르는 윤곽에 의해 제공된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 기판이 데시케이션 챔버의 벽이거나 데시케이션 챔버의 벽과 회합된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 데시케이션 챔버 내의 모세관 네트워크가 기저에 있는 고체 지지 기판에 의해 접촉된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 유리화 혼합물의 유리화가 30분 미만 내에 일어나는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 유리화 혼합물의 유리화가 10분 미만 내에 일어나는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 열 에너지를 유리화 혼합물의 가열에 의해 제공하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 대기압을 약 0.9 atm 내지 약 0.005 atm의 값으로 낮추는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 대기압을 약 0.004 atm으로 낮추는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 제공된 열 에너지가 유리화 동안 유리화 혼합물 내의 결정화를 막기에 충분한 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 제공된 열 에너지가 상기 유리화 동안 생물학적 샘플을 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도에서 유지하기에 충분한 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 유리화 매질이 트레할로스, 글리세롤 및 베틴 및/또는 콜린을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 모세관 네트워크가 친수성인 방법.
- 제1항에 있어서, 모세관 네트워크가 연속 모세관 채널을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 핵산, 아미노산, 폴리뉴클레오티드 사슬, 펩티드, 단백질, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유리화 혼합물을 10 μL 이하의 부피로 상기 기판 상에 오버레잉하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 생물학적 샘플의 총 부피가 0.1 μL 내지 10 μL인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 1 μg 이하로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 생물학적 샘플이 5 μg 이하, 임의로 1 μg 미만의 총 질량을 갖는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 생물학적 샘플이 0.1 μg 내지 1 μg의 총 질량을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 유리화 혼합물이 제2 물질을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 제2 물질이 생물학적 샘플에 대한 시약인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 유리화 혼합물이 제1 시약 물질을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 유리화 혼합물이 제2 시약 물질을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 제1 시약 물질이 효소 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 제2 시약 물질이, 효소 또는 그의 활성 단편과 효소-촉매화 반응을 겪는 화학적 화합물을 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 제1 시약 물질이 제1 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 제2 시약 물질이 항원 또는 제2 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하고, 제2 항체 또는 그의 활성 단편은 제1 항체 또는 그의 활성 단편과 상이한 에피토프에 결합하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 제1 시약 물질이 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 제2 시약 물질이 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 유리화 혼합물이 효소를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 사슬이 발현 벡터를 포함하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 제2 시약 물질이 효소를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 기판에 결합된 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 유리화 혼합물이, 기판에 결합되지 않은 적어도 하나의 생물학적 샘플을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 유리화 혼합물이 완충제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 후에 제2 유리화 혼합물을 기판 상에 오버라잉하고, 단계 b), c), 및 d)를 반복하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 제2 유리화 혼합물은 모세관 기판 상의 제2 시약 혼합물 및 유리화 매질을 포함하고, 제2 시약 혼합물은 제2 시약 물질을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 및 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 둘 이상의 물질의 유리화된 혼합물.
- 제38항에 있어서, 생물학적 샘플 및 제2 시약 물질을 포함하는 혼합물.
- 제39항에 있어서, 제2 생물학적 샘플을 추가로 포함하는 혼합물.
- 제38항에 있어서, 생물학적 샘플이 효소 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인 혼합물.
- 제41항에 있어서, 제2 시약 물질이, 효소 또는 그의 활성 단편과 효소-촉매화 반응을 겪는 화학적 화합물을 포함하는 것인 혼합물.
- 제39항에 있어서, 생물학적 샘플이 제1 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인 혼합물.
- 제43항에 있어서, 제2 시약 물질이 제2 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하고, 제2 항체 또는 그의 활성 단편은 제1 항체 또는 그의 활성 단편과 상이한 에피토프에 결합하는 것인 혼합물.
- 제39항에 있어서, 생물학적 물질이 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 것인 혼합물.
- 제45항에 있어서, 제2 시약 물질이 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 것인 혼합물.
- 제46항에 있어서, 효소를 추가로 포함하는 혼합물.
- 제45항에 있어서, 생물학적 물질이 제2 폴리뉴클레오티드 사슬을 추가로 포함하는 것인 혼합물.
- 제45항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 사슬이 발현 벡터를 포함하는 것인 혼합물.
- 제45항에 있어서, 제2 시약 물질이 효소를 포함하는 것인 혼합물.
- 제39항에 있어서, 생물학적 물질 또는 제2 시약이 기판에 결합된 것인 혼합물.
- 제51항에 있어서, 제1 또는 제2 시약 물질이 모세관 기판에 공유 결합된 것인 혼합물.
- 제39항에 있어서, 완충제를 추가로 포함하는 혼합물.
- 제38항에 있어서, 생물학적 샘플이 5 μg 이하로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인 혼합물.
- 제54항에 있어서, 생물학적 샘플이 1 μg 이하로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인 혼합물.
- 제54항에 있어서, 생물학적 샘플이 0.1 μg 내지 1 μg으로 상기 유리화 혼합물 중에 존재하는 것인 혼합물.
- 제56항에 있어서, 생물학적 샘플의 총 부피가 0.1 μL 내지 10 μL인 혼합물.
- 제38항에 있어서, 유리화 혼합물이 10 μL 이하의 부피인 혼합물.
- 제38항의 시약 물질을 일정 부피의 용액으로 재구성하는 단계; 및
시험 물질을 그에 첨가하는 단계
를 포함하며, 임의로 여기서 상기 용액은 상기 시험 물질을 포함하는 것인
검정. - 제1항 내지 제15항 및 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 유리화된 물질을 하우징하는 하나 이상의 기판을 포함하는 키트.
- 제60항에 있어서, 제1 모세관 기판이 생물학적 물질을 포함하고, 제2 모세관 기판이 제2 시약 물질을 포함하는 것인 키트.
- 제61항에 있어서, 유리화된 물질이 효소 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인 키트.
- 제62항에 있어서, 제2 시약 물질이, 효소 또는 그의 활성 단편과 효소-촉매화 반응을 겪는 화학적 화합물을 포함하는 것인 키트.
- 제61항에 있어서, 유리화된 물질이 제1 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하는 것인 키트.
- 제64항에 있어서, 제2 시약 물질이 제2 항체 또는 그의 활성 단편을 포함하고, 제2 항체 또는 그의 활성 단편은 제1 항체 또는 그의 활성 단편과 상이한 에피토프에 결합하는 것인 키트.
- 제61항에 있어서, 유리화된 물질이 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 사슬을 포함하는 것인 키트.
- 제66항에 있어서, 제2 시약 물질이 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함하는 것인 키트.
- 제67항에 있어서, 유리화된 효소를 포함하는 제3 모세관 기판을 추가로 포함하는 키트.
- 제66항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 사슬이 발현 벡터를 포함하는 것인 키트.
- 제60항에 있어서, 생물학적 물질이 모세관 기판에 결합된 것인 키트.
- 제70항에 있어서, 생물학적 물질이 모세관 기판에 공유 결합된 것인 키트.
- 제60항에 있어서, 생물학적 샘플이 5 μg 이하의 총 질량으로 상기 모세관 기판 내로 유리화된 것인 키트.
- 제72항에 있어서, 생물학적 샘플이 1 μg 이하의 총 질량으로 상기 모세관 기판 내에 존재하는 것인 키트.
- 제72항에 있어서, 생물학적 샘플이 0.1 μg 내지 1 μg의 총 질량으로 상기 모세관 기판 내로 유리화된 것인 키트.
- 제60항에 있어서, 유리화 혼합물의 총 부피가 0.1 μL 내지 10 μL인 키트.
- 제60항에 있어서, 유리화 혼합물의 총 부피가 10 μL 이하인 키트.
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