KR20230102642A - 실내공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법 - Google Patents

실내공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료를 채취하기 위한 방법으로서, 분석대상 공간 내에서 필터를 갖는 공기시료채취기를 통해 설정된 시간동안 미생물이 포함된 공기샘플을 포집하는 단계;를 포함하고, 상기 분석대상공간의 실외공간에 대해서 공기시료채취기를 통해 설정된 시간동안 미생물이 포함된 공기샘플을 포집하며, 포집된 완료된 필터를 밀봉하여 -60 ~ -90도씨에서 보관하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법에 관한 것이다.

Description

실내공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법{Investigation of bacterial and fungal communities in indoor and outdoor air of classrooms by 16S rRNA gene and ITS region sequencing}
본 발명은 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법에 관한 것이다.
실내 공기에는 박테리아, 곰팡이, 바이러스와 같은 다양한 미생물이 부유하고 있으며, 이러한 부유 미생물은 공 기 감염 및 환경성 질병을 유발하여 건강에 나쁜 영향을 미친다. 공기 중에 존재하는 미생물의 분리, 검침이 다양하게 있는데, 배지를 이용한 중력침강법, 임팩터를 이용한 포집방법과 같은 고전적인 방법에서부터 미생물의 형광 염색을 이용한 유세포 분류방법(flow cytometry) 및 미생물의 유전정보를 이용하여 미생물을 동정하는 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction) 등 여러 가지 방법이 사용되고 있다.
그러나, 이와 같은 방법들은 미생물의 분리 및 정제를 위해 최소 2∼3일의 배양시간과 미생물 판별시간이 필요하며, 형광 염색 및 유전자 추출을 위한 복잡한 전처리 과정이 요구됨과 함께 미생물 분석을 위한 고가의 장비 가 필요하다는 단점이 있다. 또한, 'Continuous separation of breast cancer cells from blood sample using multi-orifice flow fractionation and dielectrophoresis, Hui-sung Moon et al., Lab chip, 2011, 11, 1118-1125'은 혈액 내에 순환하고 있는 암 유발세포를 전기영동법을 이용하여 분리하는 기술을 제시하고 있으나, 체액 내에 존재하는 미생물을 분리, 검침함에 한정되어 있어 공기 중 미생물 검침에 적용하기에는 한계가 있다.
또한 공기질 유지 수준과 관련하여 국가(대한민국)에서는 미세먼지, 이산화탄소, 포름알데히드, 일산화탄소, 이산화 탄소와 같은 실내공기 내 유해물질을 실시간으로 측정하도록 하고 있다. 그러나 총 부유 세균이나 총 부유 곰팡 이와 같이 부유미생물 입자의 농도는 실시간으로 측정하지 않고 1년에 1회 또는 2년에 1회 측정하도록 하고 있어서 측정의 실효성이 매우 낮은 문제점이 있다. 일반적으로 부유미생물의 농도 측정을 위해서는 최소 24시간 이상의 배양 시간이 필요하므로, 실시간으로 부유미생물의 농도를 정량화 하기에는 어려움이 따른다.
현재까지 부유미생물(airborne microorganism)을 탐지 및 측정하는 기술과 관련해서 다양한 입자 포집 장치들이 개발됐다. 대표적인 예로, 일반 미세먼지 포집 방법과 유사한 필터 집진 방법(Filtration)과 입자가 포함된 공기를 충돌판에 충돌시켜 관성력에 의해 입자를 포집하는 관성 충돌법(inertial impaction)이 있다. 공기 중 부유미생물을 필터 집진 방식이나 관성 충돌법을 사용하여 포집하는 경우, 분석 장비나 센서를 이용하여 측정하기 위해, 멸균 증류수나 인산완충생리식염수(Phosphate buffered saline, PBS) 등을 이용하여 포집 된 시료를 액상 추출하는 과정이 필요하다. 따라서, 필터 집진 방법과 관성 충돌법을 통한 부유미생물의 농도 변화 관측은 연속 적이고 실시간으로 이루어질 수 없다.
또한, 현재 보편적으로 사용되는 미생물 탐지방법은 콜로니계수법(Colony count)과 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)이다. 특히, 콜로니계수법은 실내외 부유미생물의 농도를 정량화할 때 사용하는 대표적인 방법이다. 콜로니계수법은 시료를 평판 형태로 24시간 이상 적절한 온도와 습도에서 배양하여 나타 난 미생물 군락의 수를 계수하는 방법이다. 그러나 콜로니계수법은 특정 균류만 배양이 가능하며 배양 시간이 길다는 단점이 있다. 한편, 중합효소연쇄반응은 생물의 유전물질을 증폭하여 분석하는 방법이다. 중합효소연쇄 반응은 포집한 시료를 높은 정확도로 구체화 및 정량화할 수 있다. 그러나 중합효소연쇄반응은 많은 시간과 정교함, 전문가의 운용을 요구하기 때문에 콜로니계수법 방식과 마찬가지로 실시간으로 부유미생물의 농도 추이를 관측하기가 어려운 문제점이 있다. 또한, 이러한 장비는 현장이나 실험실에서 연구자가 직접 구동해야 하는 수동형 장치로서 연속적인 부유미생물 포집 및 탐지에 관한 전반적인 장치의 개발에는 해결해야 할 난제가 많이 남아있는 상황이다.
실내 공기 중 미생물은 실내에 거주 및 생활하고 있는 사람의 건강, 면역 기능에 영향이 크다. 그러나 현재까지 실내 공기 중 미생물의 분석 검출은 CFU 기준만 있어 미생물을 종류별로 나누지 않고 15분 동안 배지에 노출한 상태로 채취 후에 배양 후 콜로니수를 검출하는 방법만 채택 시행되고 있다.
그러나 미생물은 종, 속 수준까지 분석이 가능하며, 이를 정성분석과 정량 분석으로 미생물의 군집 특성을 파악할 수 있다.
초등학교는 취약계층에 속하는 만 13세 이하의 어린이가 등교 후 장시간 생활하는 공간이며. 특히 실내 교실의 경우 그 실내환경 내의 미생물 군집 영향은 학생들의 건강, 면역기능에 직접적인 영향이 있다.
초등학교에 맞는 공기 중 실내 부유 미생물의 포집법에 대한 공정시험법이 없고, 이에 대한 기술이 확립되지 있지 않다. 또한 초등학교 실내공기 중 부유미생물에 대한 NGS 분석과 이를 통한 특정 미생물을 속수준으로 분석 제시한 기술이 없어 초등학교 공기질 분석을 위한 특정 속 수준의 미생물을 제시하여 미생물 분석의 효율과 빠른 분석이 가능할 수 있는 기술이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 10-2221557 대한민국 공개특허 10-2013-0004626 대한민국 등록특허 10-2159346 대한민국공개특허10-2020-0030314
따라서 본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 실시예에 따르면, 1) 어린이의 생활 공간인 초등학교에서 부유 및 표면 미생물을 포집, 채취하는 방법에 대한 기술, 2) 채취된 시료를 안정적으로 보관하는 기술 3) 채취된 시료에서 gDNA를 추출한 후 4) 이를 차세대염기서열분석(Nest generation sequencing, NGS) 분석을 시행하는 방법 4) NGS 분석으로 인해 초등학교 교실 특성 및 어린이의 특성에 맞는 부유미생물(세균, 진균)을 속(genus) 수준에서 분석하여 5) 초등학교 특유의 세균, 진균을 속 별로 분류하여 이를 기반으로 초등학교 교실 내 공기 중 부유미생물을 분석할 수 있는 미생물 군집 분류 기술, 그리고 5) 표면먼지를 채취하는 기술 및 이를 보관하고, 여기서 세균, 진균을 분석하는 기술을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 초등학교에 맞는 공기 중 실내 부유 미생물의 포집법에 대한 공정시험방법과, 또한 초등학교 실내공기 중 부유미생물에 대한 NGS 분석과 이를 통한 특정 미생물을 속수준으로 분석하고, 미생물 분석의 효율과 빠른 분석이 가능할 수 있는, 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
한편, 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 제1목적은 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료를 채취하기 위한 방법으로서, 분석대상 실내공간 내에서 필터를 갖는 공기시료채취기를 통해 설정된 시간동안 미생물이 포함된 공기샘플을 포집하는 단계;를 포함하고, 상기 분석대상공간의 실외공간에 대해서 공기시료채취기를 통해 설정된 시간동안 미생물이 포함된 공기샘플을 포집하며, 포집이 완료된 필터를 밀봉하여 보관하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법으로서 달성될 수 있다.
그리고 상기 분석대상 공간은 초등학교 교실이고, 상기 공기시료채취기는 130 ~ 170cm 높이에서 교실 사물함 부근에서 채취하고, 실외공간은 학교 운동장 조회대에서 채취하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 필터는 PVC 필터이고, 상기 공기시료채취기의 유량은 3.5 ~ 4.5L/min이며, 채취시간은 학생의 등원시간에서 하원시간의 20분에서 60분뒤까지인 것을 특징으로 할 수 있다.
그리고 채취기간에서의, 실내 환경요인과, 실외 환경요인을 기록하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 실내 환경요인은 학생수, 온도, 상대습도, 환기시간 및 공기청정기 작동시간 중 적어도 어느 하나이고, 상기 실외 환경요인은 풍속, 강수량, 기온 및 상대습도 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
그리고 상기 포집이 완료된 필터는 -60 ~ -90 ℃에서 보관되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 실험재료 및 장비는 멸균처리, DNA 프리처리된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 제2목적은 앞서 언급한 제1목적에 따른 포집방법으로 포집된 미생물 공기시료에 대한 미생물 군집분석방법으로서, 포집된 필터의 미생물 군집확인을 위해 gDNA를 추출하는 단계; 상기 NGA 분석을 통해 미생물 종류 파악하고 종류별 농도를 분석, 분류하는 단계; 및 상기 실내 환경요인과, 실외 환경요인과 상관관계를 통계분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법으로서 달성될 수 있다.
그리고 qPCR분석을 통해 시료에서의 총 미생물양인 정량분석을 진행하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 gDNA를 추출하는 단계는, 고순도 PCR 템플릿 준비 키트(High Pure PCR Template Preparation Kit)를 사용하여 추출되는 것을 특징으로 할 수 있다.
그리고 상기 NGA 분석을 통해 미생물 종류 파악하고 종류별 농도를 분석, 분류하는 단계는, 샘플 필터에서 gDNA를 추출하여 샘플의 cDNA의 농도를 QC library로 제작하는 단계; 시퀀싱을 하여 NGS 분석하는 단계; NGS 분석을 진행한 샘플의 Taxonomy와 Rarefaction과 Alpha,Beta Diversity에 대한 데이터를 받는 단계; 및 NMDS(Nonmetric Mutidimensional Scaling)를 제작하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 NGS 분석하는 단계는 공기 중 부유미생물에 대한 시료이므로 QC library에 4 ~ 6 ng/uL보다 높은 샘플만 16S rRNA와 ITS region에 맞춰 시퀀싱을 하여 NGS 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다.
그리고 상기 NMDS(Nonmetric Mutidimensional Scaling)를 제작하는 단계는, Taxonomy에 있는 데이터를 Genus level로 가공하여 Relative Abundance를 확인하고, 이를 이용하여 Beta diversity 분석을 추가로 진행하여 NMDS(Nonmetric Mutidimensional Scaling)를 제작하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 미생물 군집분석은 시료의 풍부도, 균등도, 군집 유사도 분석을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 1) 어린이의 생활 공간인 초등학교에서 부유 및 표면 미생물을 포집, 채취하는 방법에 대한 기술, 2) 채취된 시료를 안정적으로 보관하는 기술 3) 채취된 시료에서 gDNA를 추출한 후 4) 이를 차세대염기서열분석(Nest generation sequencing, NGS) 분석을 시행하는 방법 4) NGS 분석으로 인해 초등학교 교실 특성 및 어린이의 특성에 맞는 부유미생물(세균, 진균)을 속(genus) 수준에서 분석하여 5) 초등학교 특유의 세균, 진균을 속 별로 분류하여 이를 기반으로 초등학교 교실 내 공기 중 부유미생물을 분석할 수 있는 미생물 군집 분류 기술, 그리고 5) 표면먼지를 채취하는 기술 및 이를 보관하고, 여기서 세균, 진균을 분석하는 기술을 제공할 수 있는 효과를 갖는다.
본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법에 따르면, 초등학교에 맞는 공기 중 실내 부유 미생물의 포집법에 대한 공정시험방법과, 또한 초등학교 실내공기 중 부유미생물에 대한 NGS 분석과 이를 통한 특정 미생물을 속수준으로 분석하고, 미생물 분석의 효율과 빠른 분석이 가능할 수 있는 효과를 갖는다.
한편, 본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술적 사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석 되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 포집 및 군집분석방법의 흐름도,
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 포집방법의 흐름도,
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석방법의 흐름도,
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 gDNA 추출 방법의 흐름도,
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 세균 정량분석방법의 흐름도를 도시한 것이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에서, 어떤 구성요소가 다른 구성요소 상에 있다고 언급되는 경우에 그것은 다른 구성요소 상에 직접 형성될 수 있거나 또는 그들 사이에 제 3의 구성요소가 개재될 수도 있다는 것을 의미한다. 또한 도면들에 있어서, 구성요소들의 두께는 기술적 내용의 효과적인 설명을 위해 과장된 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소는 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
아래의 특정 실시예들을 기술하는데 있어서, 여러 가지의 특정적인 내용들은 발명을 더 구체적으로 설명하고 이해를 돕기 위해 작성되었다. 하지만 본 발명을 이해할 수 있을 정도로 이 분야의 지식을 갖고 있는 독자는 이러한 여러 가지의 특정적인 내용들이 없어도 사용될 수 있다는 것을 인지할 수 있다. 어떤 경우에는, 발명을 기술하는 데 있어서 흔히 알려졌으면서 발명과 크게 관련 없는 부분들은 본 발명을 설명하는데 있어 별 이유 없이 혼돈이 오는 것을 막기 위해 기술하지 않음을 미리 언급해 둔다.
이하에서는 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료채취방법 및 분석방법에 대해 설명하도록 한다.
본 발명의 실시예에서는 1) 어린이의 생활 공간인 초등학교에서 부유 및 표면 미생물을 포집, 채취하는 방법에 대한 기술, 2) 채취된 시료를 안정적으로 보관하는 기술 3) 채취된 시료에서 gDNA를 추출한 후 4) 이를 차세대염기서열분석(Nest generation sequencing, NGS) 분석을 시행하는 방법 4) NGS 분석으로 인해 초등학교 교실 특성 및 어린이의 특성에 맞는 부유미생물(세균, 진균)을 속(genus) 수준에서 분석하여 5) 초등학교 특유의 세균, 진균을 속 별로 분류하여 이를 기반으로 초등학교 교실 내 공기 중 부유미생물을 분석할 수 있는 미생물 군집 분류 기술, 그리고 5) 표면먼지를 채취하는 기술 및 이를 보관하고, 여기서 세균, 진균을 분석하는 기술을 포함한다.
먼저 도 1은 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 포집 및 군집분석방법의 흐름도를 도시한 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 대상학교 선정, 시료 포집단계(S10), 포집된 시료 필터에서 gDNA를 추출하는 단계(S20), 미생물 총량을 정량분석하는 단계(S30), 미생물 군집 분석, 통계분석 단계(S40)를 포함하고 있음을 알 수 있다.
이하에서는 먼저, 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 포집방법에 대해 구체적으로 설명하도록 한다. 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 포집방법의 흐름도를 도시한 것이다.
분석대상 실내공간 내에서 필터를 갖는 공기시료채취기를 통해 설정된 시간동안 미생물이 포함된 공기샘플을 포집하게 된다.
구체적으로 먼저 포집대상이 되는 교실을 선정하게 된다(S11). 본 발명의 구체적 실시예에서는 초등학교 당 4개의 교실에서 샘플(시료)을 포집한다. 교실 선정 기준으로는 활동도가 높고, 환경유해인자에 더 취약할 수 있는 1, 2, 3 학년의 교실로 한다.
실외 환경요인과 대기중의 미생물 군집이 교실 내 공기중의 미생물 군집과 연관성이 있는 지를 분석하기 위해 교실 실내공기 샘플을 포집하는 날과 동일한 날에 실외 공기샘플을 포집한다(S12, S14).
이때 공기샘플의 포집을 위한 포집 지점으로는 한국의 초등학생 평균신장은 150 cm 이하인 것을 고려하여, 학생들의 키와 비슷한 실내 교실의 사물함 위와 실외 학교 운동장의 조회대를 포집 지점으로 한다.
포집기는 공기시료 채취기로 유량 4 L/min로 교실 내 소음을 줄이기 위해 실외보다 실내의 유량을 낮게 하여 공기중의 부유먼지를 포집한다.
Polyvinyl Chloride(PVC) filter는 복잡한 pore structure를 가져 pore size에 관계없이 미생물 포집 효율이 일정하기 때문에, 부유 미생물 포집을 위해 PVC(Pore size 5 μm, diameter 37 mm) Filter(SKC, Inc., USA)를 사용한다.
모든 단계에 사용된 실험재료 및 장비는 멸균처리, DNA 프리 처리를 하여 사용한다.
포집 시간은 학생들이 학교에 있는 시간 동안 발생하는 부유 미생물을 알아보기 위해 공기 중 부유 미생물들의 침강속도를 고려하고, 학생들이 학교에 있는 시간에서 30분 내외로 추가 측정한다.
한국의 초등학생은 하루 5 ~ 6시간 동안 학교에서 활동하므로, 총 390분(8:30-15:00 ± 30 min)동안 공기샘플을 포집한다.
포집이 완료된 filters는 이동 중 오염 및 온도와 수분으로 인한 미생물 군집의 변화를 최소화하기 위해 밀봉한 filters를(S16) 아이스박스에 넣어 이동하였고, -80℃에서 분석 전까지 보관한다(S17).
학생들의 활동 유형(pattern)으로는 등교하는 날은 각 40분 수업 후 10분간 휴식 시간이며, 휴식 시간에 실내에는 주로 사물함 근처의 공간에 머무는 것으로 관찰된다.
학생 재실에 따른 실내외 미생물 군집영향을 비교하기 위해 학생이 등교하는 평일과 등교하지 않는 휴일에 실내와 실외 공기샘플을 포집한다.
공기샘플을 포집한 날의 각 학교의 환경요인을 기록하였다(S13, S15). 실내공기샘플의 환경요인은 학생 수, 온도, 상대습도, 환기 시간 및 공기청정기 작동 시간으로 설정한다.
샘플을 포집하는 동안 학생들의 활동과 모든 환경요인에 개입하지 않아 평소 학교생활과 같은 조건을 유지한다. 실외공기샘플의 환경요인으로는 풍속, 강수량, 기온 및 상대습도로 정하고 기록한다.
이하에서는 포집된 공기샘플에 대한 미생물 군집분석방법에 대해 설명하도록 한다. 먼저, 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 초등학교 교실 공기 중 부유 및 표면 미생물 군집분석방법의 흐름도를 도시한 것이다.
먼저, 샘플(시료) 필터에서 gDNA를 추출하고 시료의 cDNA의 농도를 QC library로 제작하게 된다(S41).
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 gDNA 추출 방법의 흐름도를 도시한 것이다.
포집된 공기 필터의 미생물 군집을 확인하기 위해 genomic DNA(gDNA)는 고순도 PCR 템플릿 준비 키트(High Pure PCR Template Preparation Kit)를 사용하여 추출한다.
구체적으로 필터를 212-300 μm 살균 유리비드(sterilized Glass beads) 300 mg, 초순수 water 650 μL와 함께 2 mL 스크류 캡 마이크로 센터리퓨지 튜브(screw-cap microcentrifuge tube)에 넣는다(S21).
그리고 균질기(Homogenizer)를 이용하여 4,350 rpm으로 30초간 2회 분쇄하고(S22), 20,000 × g로 1분간 원심분리한 후, 상등액 모아 다시 20,000 × g로 1분간 원심분리한다(S23).
그리고 상등액 400 μL를 모아 이를 전처리 샘플로 사용한다(S24).
그런 다음 시료를 kit 제조자가 권장한 대로 column에서 용출하여 -20℃에 보관한다(S25).
그리고 공기 중 부유미생물에 대한 시료이므로 QC library에 약 5ng/uL보다 높은 샘플만 16S rRNA와 ITS region에 맞춰 시퀀싱을 하여 NGS 분석을 한다(S42).
그리고 NGS 분석을 진행한 샘플의 Taxonomy와 Rarefaction과 Alpha,Beta Diversity에 대한 데이터를 받게 된다(S43). 그리고 Taxonomy에 있는 데이터를 Genus level로 가공하여 Relative Abundance를 확인한다(S44).
또한 이를 이용하여 Beta diversity 분석을 추가로 진행하여 NMDS(Nonmetric Mutidimensional Scaling)를 제작하게 된다(S45)
그리고 qPCR을 이용하여 Copy number를 구하여 정량적인 분석을 진행한다(NGS 동일한 V3-V4 영역에서)(S45).
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 세균 정량분석방법의 흐름도를 도시한 것이다. 세균의 정량분석으로 구체적 실시예에서는 16S rRNA region 중 518F, 800R을 활용하여 qPCR을 수행한다.
구체적으로 5x　HOT　FIREPol　EvaGreen qPCR Supermix 4 μL, Nuclease-Free Water (QIAGEN, Germany) 14.6 μL, Forward primer와 Reverse primer를 각각 0.2 μL와 DNA template 1 μL를 혼합하여(S31), 95℃로 12분간 Initial denaturation을 진행한다(S32). 그리고 변성(denaturation)단계 95℃로 15초(S33), 결합(annealing)단계 55℃ 20초(S34), 그리고 신장(elongation)단계를 72℃ 30초로 40 cycle을 수행한다(S35).
qPCR은 LineGene 9600 장비를 사용하고, qPCR 절대정량법을 활용하기 위해 희석된 Escherichia coli (E. coli) 샘플과 함께 qPCR을 진행하여 Standard curve를 그리고 PCR 효율을 확인한다. 희석된 샘플의 Cycle threshold value (Ct value)에 따라 계산되는 gDNA 양을 Bacteria의 Copy number로 환산하며, Melting curve를 통하여 specificity를 확인한다.
Bacteria sample에 있는 세균 수를 정량하기 위해 희석된 E. coli의 Ct value와 Bacteria sample의 Ct value를 측정한다. 실험에 사용된 E. coli sample의 원액의 OD600값은 0.7이었으며, DNA 추출 후 측정한 DNA 농도는 54.99 ng/μL였다. 희석배율은 10배로 원액의 10-5배까지 희석하여 qPCR을 진행하게 된다(S36).
마지막으로 Alpha diversity 및 Copynumber와 환경 요인과의 상관 관계 분석을 진행하게 된다(S46).
본 발명의 실시예에서 미생물 분석은 풍부도와 균등도, 군집유사도, 통계분석을 진행하게 된다.
샘플의 풍부도와 균등도를 알아보기 위해 생태학에서 널리 사용되는 다양성 지수로서 종의 풍부도를 나타내는 Shannon-Wiener index(SI)와 군집의 균등도를 나타내는 Pielou's evenness index(EI)를 사용하였으며 수식은 다음의 수학식 1, 수학식 2와 같다.
[수학식 1]Shannon-Wiener index
Figure pat00001
S는 총 종의 수(Total number of species in the community)이고, pi는 i번째 종으로 구성된 S의 비율(Proportion of S made up of the ith species)이다.
[수학식 2] Pielou's evenness index
Figure pat00002
또한 샘플간 미생물 군집 유사도를 분석은 Bray-Curtis dissimilarity를 기반으로 하여, Principal Coordinates Analysis(PCoA)를 이용한다.
통계 분석은 R 4.0 version으로 진행하였고, 환경요인을 비롯한 여러 지수 간의 상관관계를 알아보기 위해 세균과 곰팡이 샘플을 실내와 실외로 나누어 Spearman correlation analysis를 수행한다. 앞서 언급한 바와 같이, 실내 환경은 학생 수, 기온, 상대습도, 환기시간, 공기청정기 작동시간, SI, EI간의 상관관계를 분석하였고, 실외 환경은 풍속, 강수량, 기온, 상대습도, SI, EI를 분석하였다. 세균의 경우 qPCR을 통해 얻어진 copy number도 포함하였다. p < 0.05 수준에서 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
또한, 상기와 같이 설명된 장치 및 방법은 상기 설명된 실시예들의 구성과 방법이 한정되게 적용될 수 있는 것이 아니라, 상기 실시예들은 다양한 변형이 이루어질 수 있도록 각 실시예들의 전부 또는 일부가 선택적으로 조합되어 구성될 수도 있다.

Claims (14)

  1. 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료를 채취하기 위한 방법으로서,
    분석대상 실내공간 내에서 필터를 갖는 공기시료채취기를 통해 설정된 시간동안 미생물이 포함된 공기샘플을 포집하는 단계;를 포함하고,
    상기 분석대상공간의 실외공간에 대해서 공기시료채취기를 통해 설정된 시간동안 미생물이 포함된 공기샘플을 포집하며,
    포집이 완료된 필터를 밀봉하여 보관하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분석대상 공간은 초등학교 교실이고, 상기 공기시료채취기는 130 ~ 170cm 높이에서 교실 사물함 부근에서 채취하고, 실외공간은 학교 운동장 조회대에서 채취하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 필터는 PVC 필터이고, 상기 공기시료채취기의 유량은 3.5 ~ 4.5L/min이며, 채취시간은 학생의 등원시간에서 하원시간의 20분에서 60분뒤까지인 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    채취기간에서의, 실내 환경요인과, 실외 환경요인을 기록하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 실내 환경요인은 학생수, 온도, 상대습도, 환기시간 및 공기청정기 작동시간 중 적어도 어느 하나이고,
    상기 실외 환경요인은 풍속, 강수량, 기온 및 상대습도 중 적어도 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 포집이 완료된 필터는 -60 ~ -90 ℃에서 보관되는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    실험재료 및 장비는 멸균처리, DNA 프리처리된 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석을 위한 시료 채취방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 포집방법으로 포집된 미생물 공기시료에 대한 미생물 군집분석방법으로서,
    포집된 필터의 미생물 군집확인을 위해 gDNA를 추출하는 단계;
    상기 NGA 분석을 통해 미생물 종류 파악하고 종류별 농도를 분석, 분류하는 단계; 및
    상기 실내 환경요인과, 실외 환경요인과 상관관계를 통계분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    qPCR분석을 통해 시료에서의 총 미생물양인 정량분석을 진행하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 gDNA를 추출하는 단계는, 고순도 PCR 템플릿 준비 키트(High Pure PCR Template Preparation Kit)를 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 NGA 분석을 통해 미생물 종류 파악하고 종류별 농도를 분석, 분류하는 단계는,
    샘플 필터에서 gDNA를 추출하여 샘플의 cDNA의 농도를 QC library로 제작하는 단계;
    시퀀싱을 하여 NGS 분석하는 단계;
    NGS 분석을 진행한 샘플의 Taxonomy와 Rarefaction과 Alpha,Beta Diversity에 대한 데이터를 받는 단계; 및
    NMDS(Nonmetric Mutidimensional Scaling)를 제작하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 NGS 분석하는 단계는
    공기 중 부유미생물에 대한 시료이므로 QC library에 4 ~ 6 ng/uL보다 높은 샘플만 16S rRNA와 ITS region에 맞춰 시퀀싱을 하여 NGS 분석하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 NMDS(Nonmetric Mutidimensional Scaling)를 제작하는 단계는,
    Taxonomy에 있는 데이터를 Genus level로 가공하여 Relative Abundance를 확인하고, 이를 이용하여 Beta diversity 분석을 추가로 진행하여 NMDS(Nonmetric Mutidimensional Scaling)를 제작하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법.
  14. 제 9항에 있어서,
    상기 미생물 군집분석은 시료의 풍부도, 균등도, 군집 유사도 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 부유 및 표면 미생물 군집분석방법.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200030314A (ko) 2018-09-12 2020-03-20 주식회사 코젠바이오텍 공기중 부유 미생물 포집 장치 및 방법
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130004626A (ko) 2011-07-04 2013-01-14 한국과학기술연구원 공기 중 미생물의 실시간 분리 및 검침 장치 및 방법
KR102221557B1 (ko) 2014-07-28 2021-03-02 엘지전자 주식회사 부유미생물 측정장치 및 그 측정방법
KR20200030314A (ko) 2018-09-12 2020-03-20 주식회사 코젠바이오텍 공기중 부유 미생물 포집 장치 및 방법
KR102159346B1 (ko) 2019-11-13 2020-09-23 한국과학기술연구원 부유미생물 실시간 측정 장치 및 방법

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