KR20230094597A - Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230094597A
KR20230094597A KR1020210183885A KR20210183885A KR20230094597A KR 20230094597 A KR20230094597 A KR 20230094597A KR 1020210183885 A KR1020210183885 A KR 1020210183885A KR 20210183885 A KR20210183885 A KR 20210183885A KR 20230094597 A KR20230094597 A KR 20230094597A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
neurofibromatosis
ras
substituted
protein
therapeutic agent
Prior art date
Application number
KR1020210183885A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102665711B1 (ko
Inventor
이범희
장민후
허선희
도효상
강민지
Original Assignee
재단법인 아산사회복지재단
울산대학교 산학협력단
(주)휴먼스케이프
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 아산사회복지재단, 울산대학교 산학협력단, (주)휴먼스케이프 filed Critical 재단법인 아산사회복지재단
Priority to KR1020210183885A priority Critical patent/KR102665711B1/ko
Priority claimed from KR1020210183885A external-priority patent/KR102665711B1/ko
Priority to PCT/KR2022/020770 priority patent/WO2023121199A1/ko
Publication of KR20230094597A publication Critical patent/KR20230094597A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102665711B1 publication Critical patent/KR102665711B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4245—Oxadiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Abstract

Ras 활성도를 이용하는 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 바이오마커 조성물은 개체의 생물학적 샘플에서 GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 간단한 방법을 통하여 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성을 정확하게 진단할 수 있고, 약학적 조성물은 Ras 단백질의 활성을 억제하므로 Ras 단백질의 활성도가 증가된 신경섬유종증의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 것이다.

Description

Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Biomarker composition for predicting susceptibility to therapeutic agent for neurofibromatosis using Ras activity and Pharmaceutical composition for preventing or treating neurofibromatosis comprising inhibitor of Ras activity}
Ras 활성도를 이용하는 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경섬유종증 제1형(neurofibromatosis type 1, NF1)은 상염색체 우성 유전 질환으로, 전세계적으로 3,000명 당 1명의 빈도로 비교적 높은 발병률을 가지고 있는 유전 질환 중 하나이다. NF1 유전자 돌연변이에 의해 발병하며, 다발성 밀크커피 반점과 피부의 신경섬유종이 특징으로, 다양한 수준의 신경계, 골격계 발현과 신생물성 발현이 환자에게 큰 영향을 줄 수 있다. NF1 환자는 중추 및 말초 신경계 종양이 발생할 위험이 있고, 이는 일반인에 비해 1,000배 높은 비율이다.
기존 신경섬유종증 제1형 치료법으로는 화학 요법, 방사선 요법, 외과적 수술 절제 등의 대중요법만이 유일한 치료법이나, 다기관에 다발적으로 발생하는 경우에는 수술이 불가능한 경우가 많다.
최근, 신경섬유종증 제1형 환자의 비침습적 치료제로 MEK 억제제인 셀루메티닙(selumetinib)이 FDA 및 국내 희귀의약품으로 승인되었다. 다른 치료제로 티로신 키나제 억제제인 카보잔티닙(carbozantinib)이 임상 실험 결과 안전성 및 종양 억제 효과를 나타낸다고 보고되었지만, 다양한 종양을 축소시키거나 완전히 제거하지는 못하는게 한계점이다. 또한, 신경섬유종증 제1형을 가지고 있는 환자가 위의 치료제에 모두 반응하는 것은 아니기 때문에 더 많은 치료제가 필요한 상황이다.
한편, 한국인 신경섬유종증 환자의 유전자 돌연변이 유형에 대한 조사 결과, 약 30% 환자가 종결 코돈 돌연변이(stop-codon mutation)를 가지고 있다고 보고되었다. 또한, 최근에 조기 종결 코돈을 read-through하는 아탈루렌(Ataluren; PTC THERAPEUTICS, USA)이 근육 질환 치료제로 임상 연구가 진행되고 있어, 종결 코돈 돌연변이가 있는 신경섬유종증 환자의 치료제로 가능성이 언급되고 있으나, 이에 대한 약물 효능에 대한 연구는 없는 상황이다.
본 발명의 목적은, Ras 활성도를 이용하여 조기 종결 코돈을 read-through하는 화합물에 대한 신경섬유종증 환자의 감수성을 예측할 수 있는 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.
다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 상기 화합물에 대한 신경섬유종증 환자의 감수성 예측용 키트를 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 바이오마커 조성물을 이용하여 상기 화합물에 대한 신경섬유종증 환자의 감수성 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, Ras 활성을 억제할 수 있는 화합물을 포함하는 신경섬유종증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
용어 "RAS 단백질"은 저분자 GTP(Guanosine triphoshate) 결합 단백질의 일종으로, K-Ras 단백질, H-Ras 단백질, N-Ras 단백질 등의 이소폼(isoform)이 존재하는 단백질을 의미한다. Ras 단백질은 다양한 세포외 자극에 의한 세포의 증식, 분화, 접착 등의 시그널을 상류의 티로신 키나아제 수용체부터 하류의 이펙터로 중개하는 기능을 담당한다.
Ras 단백질은 GTP(Guanosine triphosphate)와 결합한 상태(Ras-GTP)가 활성형이고, GDP(Guanosine diphosphate)와 결합한 상태(Ras-GDP)가 비활성 형이며, 활성형과 비활성형의 상태 변경을 통하여 세포 증식 등을 조절하고 있다. 한편, 인간의 암에서는 Ras 단백질이 높은 빈도로 변이하고 있으며, 이 변이에서 기인하여 Ras 단백질이 항상적으로 활성형이 되고 있는 것이 알려져 있다.
형질전환 활성을 갖는 활성형 Ras는 GDP나 GTP의 구아닌 고리나 인산기와의 상호작용에 중요한 아미노산 변이가 있어 내재성 GTP 가수분해 활성의 저하나 GDP 해리속도의 상승을 나타낸다. 그 발현에 따라 세포 내에서 GTP를 결합한 활성형 비율이 증가하여, 세포 증식 제어에 이상을 일으킨다. GTP가 결합한 활성형 Ras는 Raf와 결합함으로써 Raf에서 MAP 인산화효소에 이르는 세린-트레오닌 인산화효소 단계적 연쇄를 직접 제어한다.
용어 "감수성"은 개개의 신경섬유종증 환자에 대하여 특정 약물이 치료 효과를 나타내는지 여부를 의미한다. 신경섬유종증 치료에 유효한 것으로 인정되고 있는 종류의 치료제라도, 개개의 환자에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 개개의 환자의 신경섬유종증에 대해 치료제가 효과를 나타내는지 여부를 치료제에 대한 감수성이라고 할 수 있다.
용어 "바이오마커"는 동반진단(Companion Diagnosis) 마커로도 쓰일 수 있으며, 생물학적 샘플에서 환자의 특정 약물 치료에 대한 반응성을 미리 예측할 수 있는 물질을 의미한다. 정상 개체로부터 수득한 생물학적 샘플에 비하여 신경섬유종증 환자에서 채취한 생물학적 샘플에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예를 들어, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(예를 들어, 단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커는 GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자일 수 있다. 이의 발현 수준이 높으면 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성이 높은 것으로 판단될 수 있으며, 반대로 이의 발현 수준이 낮은 경우에 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성이 낮은 것으로 판단될 수 있다.
상기 신경섬유종증 치료제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서
Z는 할로겐, 하이드록실, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알콕시, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬이고;
R은 수소 또는 할로겐이다.
용어 "할로겐"은 다른 언급이 없으면 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
용어 "하이드록실"은 다른 언급이 없으면 한 개의 수소 원자와 한 개의 산소 원자로 이루어진 일가의 원자단으로, 화학식 -OH를 갖는 기를 의미한다.
용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 선형 또는 분지형의 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 예를 들어, "C1-10 알킬"은 1 내지 10개 탄소로 골격이 이루어진 알킬을 의미한다. 구체적으로 C1-10 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸, t-펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 포함할 수 있다.
용어 "알콕시"는, 달리 명시되지 않는 한, 앞에 정의한 알킬기가 산소 원자를 통하여 모 화합물에 부착되어 있는, 화학식 -O-알킬을 갖는 기를 의미한다. 알콕시기의 알킬 부분은 1 내지 20개의 탄소원자(즉, C1-C20 알콕시), 1 내지 12개의 탄소원자(즉, C1-C12 알콕시), 또는 1 내지 6개의 탄소원자(즉, C1-C6 알콕시)를 가질 수 있다. 적합한 알콕시기의 예로는 메톡시(-O-CH3 또는 -OMe), 에톡시(-OCH2CH3 또는 -OEt), t-부톡시(-O-C(CH3)3 또는 -O-tBu) 등이 있다.
용어 "아릴"은 모 방향족 고리 시스템의 6개의 탄소원자로부터 1개의 수소 원자가 제거되어 유도되는 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 예를 들면, 아릴기는 6 내지 20개의 탄소원자, 6 내지 14개의 탄소원자, 또는 6 내지 12개의 탄소원자를 가질 수 있다.
용어 "사이클로알킬"은 고리 중에 탄소원자만을 포함하는 포화 모노사이클 또는 폴리-사이클을 지칭한다. 사이클로알킬은, 모노사이클로서는 3 내지 7개의 탄소원자를, 바이사이클로알킬로서는 7 내지 12 탄소원자를, 폴리-사이클로서는 최대 약 20개의 탄소원자를 가질 수 있다.
용어 "헤테로사이클"은 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 방향성 또는 비방향성의 고리를 의미하며, 포화되거나 불포화될 수 있고, 단일고리 또는 다중고리일 수 있다. 예를 들어 "4 내지 10원의 헤테로사이클"은 헤테로원자 및 탄소원자를 포함하여 총 4 내지 10개의 원자로 골격이 이루어진 헤테로사이클을 의미한다. 구체적으로 4 내지 10원의 헤테로사이클은 아제티딘, 디아제티딘, 피롤리딘, 피롤, 이미다졸리딘, 이미다졸, 피라졸리딘, 피라졸, 옥사졸리딘, 옥사졸, 이속사졸리딘, 이속사졸, 티아졸리딘, 티아졸, 이소티아졸리딘, 이소티아졸, 피페리딘, 피리딘, 피페라진, 디아진, 모폴린, 티오모폴린, 아제판, 디아제판 등을 포함할 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 고리 내에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 방향족 헤테로사이클릴을 지칭한다. 헤테로아릴의 비제한적인 예로는 피리디닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 퓨리닐, 퓨라닐, 티에닐, 벤조퓨라닐, 벤조티오페닐, 카바졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이속사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 피리다질, 피리미딜, 피라질(이들은 고리에 하나 이상의 치환기를 가질 수 있음) 등이 있다.
용어 "헤테로사이클로알킬"은 고리 내에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 비방향족 헤테로사이클릴을 지칭한다. 헤테로사이클로알킬은 이중 결합의 존재로 인해 고리가 방향성(Aromatic)을 갖지 않는 범위에서 고리 내에 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-헤테로원자 이중 결합을 가질 수 있다. 헤테로사이클로알킬의 비제한적인 예로는 아제티딘일, 아지리딘일, 피롤리딘일, 피페리딘일, 피페라진일, 호모피페라진일, 모폴리노, 티오모폴리노, 테트라히드로퓨란일, 테트라히드로티오퓨란일, 테트라히드로피란일, 피란일(이들은 고리에 하나 이상의 치환기를 가질 수 있음) 등이 있다.
용어 "헤테로원자"는 탄소(C) 이외의 원자를 의미하며, 구체적으로 질소(N), 산소(O) 또는 황(S) 원자일 수 있다.
용어 "치환"은, 지정된 원자 상의 원자가(Valence)를 초과하지 않으면서 이러한 치환으로부터 화학적으로 안정한 화합물이 되도록, 분자 구조체 내의 수소 원자를 치환기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, "그룹 A가 치환기 B로 치환"된다는 것은, 그룹 A의 골격을 구성하는 탄소 등의 원자에 결합된 수소 원자가 치환기 B로 대체되어, 그룹 A와 치환기 B가 공유 결합을 형성함을 의미할 수 있다.
상기 Z는 Z가 p-톨릴; (4-클로로메틸-페닐); (2-클로로-피리딘-3-일); (2-플루오로-페닐); (3,4-디플루오로-페닐); (4-메톡시-페닐); 벤조[1,3]디옥솔-일; (4-에틸-페닐); o-톨릴; (2-클로로-페닐); (3-메틸-티오펜-2-일); 벤조[b]티오펜-2-일; (3-플루오로-페닐); (4-tert-부틸-페닐); (2-메톡시-페닐); (2,디플루오로-페닐); 티오펜-2-일; (2,4-디플루오로-페닐); (3-클로로-페닐); m-톨릴; (4-트리플루오로메틸-페닐); (4-플루오로-페닐); (3-메톡시-페닐); 페닐; (2,6-디플루오로-페닐); (2,디메틸-푸란-3-일); (4-피롤-1-일-페닐); (3-디메틸아미노-페닐); 비페닐-4-일; (4-디메틸아미노-페닐); 벤조[1,2,5]옥사디아졸-일; m-톨릴; (2-트리플루오로메틸-페닐); (6-클로로-피리딘-3-일); (3,비스-트리플루오로메틸-페닐); 푸란-2-일; (4-니트로-페닐); (3,4-디메톡시-페닐); (3-트리플루오로메톡시-페닐); 나프탈렌-1-일; 시클로헥실; 피리딘-3-일; 피리딘-4-일; 시클로펜틸; 시클로프로필; (4-펜틸옥시-페닐); (3,4,트리메톡시-페닐); (4-이소부틸-페닐); 시클로부틸; (1-아세틸-피페리딘-4-일); 이소옥사졸-일; [2-클로로-6-플루오로-페닐)-메틸-이소옥사졸-4-일] 또는 [2-클로로-페닐)-메틸-이소옥사졸-4-일]일 수 있다. 구체적으로, 상기 Z는 (2-플루오로-페닐); (3,4-디플루오로-페닐); (2-클로로-페닐); (3-플루오로-페닐); (2,5-디플루오로-페닐); (2,4-디플루오로-페닐); (3-클로로-페닐); (4-플루오로-페닐); 또는 (2,6-디플루오로-페닐)일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 조기 종결 코돈(premature stop codons)을 read-through할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 3-[5-(2-플루오로-페닐)-[1,2,4]옥사디아졸-3-일]-벤조산일 수 있다. 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00002
.
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 아탈루렌(Ataluren), PCT124 또는 트랜스라나(Translarna)라고도 불리우며, 조기 종결 코돈(premature stop codons)을 read-through하는 것으로 알려져 있다.
상기 신경섬유종증 치료제는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 인간에 대한 독성이 낮아야 하며, 모(母) 화합물의 생물학적 활성 및 물리화학적 특성에 임의의 부정적인 영향을 주지 않아야 한다.
예를 들어, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 알칼리금속염(나트륨염 등) 또는 알칼리토금속염(칼륨염 등)일 수 있다. 상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은, 예를 들어 상기 화합물을 과량의 알칼리금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 미용해된 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발 및 건조시켜 얻을 수 있다.
또한, 상기 화합물은 키랄 탄소 중심을 가질 수 있으며, 이에 따라 R 또는 S 이성질체, 라세미 화합물, 개개의 거울상 이성질체 또는 혼합물, 개개의 부분입체 이성질체 또는 혼합물 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 입체 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명의 범주에 속할 수 있다.
또한, 상기 화합물은 상기 화합물의 수화물 및 용매화물을 포함할 수 있다. 상기 수화물 및 용매화물은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 무독성 및 수용성인 것이 바람직하다. 특히, 바람직하게는 상기 수화물 및 용매화물은 각각 물 및 알코올성 용매(특히, 에탄올 등)의 1 내지 5개의 분자가 결합된 것일 수 있다.
상기 Ras-GTP 단백질의 발현 수준 측정은 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성을 예측하기 위하여 개체의 생물학적 샘플에서 상기 단백질의 존재 여부와 그 단백질의 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것이다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 모노클로날(monoclonal) 항체, 폴리클로날(polyclonal) 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드(ligand), PNA(peptide nucleic acid), 압타머(aptamer) 및 나노파티클(nanoparticle)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏팅(Western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사선면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip), 2차원 전기영동분석, 단백질 질량 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준의 측정은 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성을 예측하기 위하여 개체의 생물학적 샘플에서 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 존재 여부와 그 유전자의 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 분자를 이용하여 유전자의 양을 확인하는 것이다.
상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오타이드(antisense nucleotide)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), RNase 보호 분석법(RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신경섬유종증은 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지는 것일 수 있다.
용어 "종결 코돈 돌연변이(stop codon mutation)"은 돌연변이에 의하여 염기서열의 일부가 종결 코돈인 UAG, UAA, UAG 중의 하나가 되어 폴리펩타이드의 합성이 중단되는 것을 의미한다.
상기 종기 코돈 돌연변이는 DNA 염기가 다른 염기와 치환되는 점 돌연변이(point mutation) 중 하나인 넌센스 돌연변이(nonsense mutation) 또는 구조이동 돌연변이(Frameshift mutation)에 의한 것일 수 있다.
용어 "넌센스 돌연변이(nonsense mutation)"는 DNA 염기서열이 단백질로 전환될 때, 염기서열의 일부가 정지코돈(UAG, UAA, UGA 중 하나)으로 전환되어 더 이상 단백질의 합성이 이루어지지 않는 돌연변이를 의미한다.
용어 "구조이동 돌연변이(Frameshift mutation)"는 DNA 염기서열에 1개 또는 2개 또는 3의 배수가 아닌 수의 뉴클레오타이드의 삽입(insert) 또는 결실(deletion)이 되는 변이로 인하여 유전자의 전사, 번역 과정을 거쳐 생성되는 단백질의 아미노산 배열은 크게 달라지는 돌연변이를 의미한다.
일 구현예에서, 상기 종결 코돈 돌연변이는 i) NF1 유전자의 DNA 염기서열에서 5242번째 염기인 시티딘(C)이 티민(T)으로 치환되면서 NF1 단백질을 구성하는 1748번째 아미노산인 아르기닌(Arg, R)이 종결코돈으로 전환, ii) NF1 유전자의 DNA 염기서열에서 2560번째 염기인 시티딘(C)이 티민(T)으로 치환되면서 NF1 단백질을 구성하는 854번째 아미노산인 글루타민(Gln, Q)이 종결코돈으로 전환, iii) NF1 유전자의 DNA 염기서열에서 4537번째 염기인 시티딘(C)이 티민(T)으로 치환되면서 NF1 단백질을 구성하는 1513번째 아미노산인 아르기닌(Arg, R)이 종결코돈으로 전환, iv) NF1 유전자의 DNA 염기서열에서 2978번째 염기인 티민(T)이 구아닌(G)으로 치환되면서 NF1 단백질을 구성하는 993번째 아미노산인 류신(Leu, L)이 종결코돈으로 전환, v) NF1 유전자의 DNA 염기서열에서 7486번째 염기인 시티딘(C)이 티민(T)으로 치환되면서 NF1 단백질을 구성하는 2496번째 아미노산인 아르기닌(Arg, R)이 종결코돈으로 전환된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 신경섬유종증 환자 중에서 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지고 있는 환자를 선별하고 선별된 환자의 섬유아세포에서 Ras-GTP 활성도를 측정한 후 아탈루렌을 처리한 결과, Ras-GTP 발현이 정상인과 비교하여 유의하게 증가된 환자 군에서 Ras-GTP 및 p-ERK 단백질의 발현이 유의하게 감소하는 것을 통하여, 아탈루렌이 신경섬유종증 치료 효과가 있음을 확인할 수 있다. 따라서, NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지는 신경섬유종증 환자 중에서 활성 상태의 Ras(Ras-GTP)의 발현 증가 여부를 통하여 아탈루렌에 대한 감수성을 예측할 수 있다.
다른 양상은, 상기 바이오마커 조성물을 포함하는 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트는 개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 이용하여 상기 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성을 예측할 수 있다. 구체적으로는, 상기 키트는 개체로부터 채취한 섬유아세포를 이용하여 상기 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성을 예측할 수 있다.
상기 키트에는 상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 해당 기술분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
상기 바이오마커 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 양상은, 개체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 개체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 측정한 발현 수준보다 증가한 경우에 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성이 높은 것으로 판단하고, 반대로 이의 발현 수준이 낮은 경우에 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성이 낮은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "생물학적 샘플"은 일 양상에 따른 Ras-GTP 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 개체로부터 수득한 모든 샘플을 의미한다.
상기 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 객담, 뇌척수액, 세포, 세포 배양액, 조직 추출물 또는 종양 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는, 상기 생물학적 샘플은 개체로부터 채취한 섬유아세포일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 해당 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
또 다른 양상은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경섬유종증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 식에서
Z는 할로겐, 하이드록실, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알콕시, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬이고;
R은 수소 또는 할로겐이다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 3-[5-(2-플루오로-페닐)-[1,2,4]옥사디아졸-3-일]-벤조산일 수 있다.
상기 신경섬유종증은 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지는 것일 수 있다.
상기 신경섬유종증은 Ras 단백질의 활성도가 증가된 것이 수 있다.
상기 신경섬유종증에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
일 구현예에서, 신경섬유종증 환자 중에서 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지고 있는 환자를 선별하고 선별된 환자의 섬유아세포에서 Ras-GTP 활성도를 측정한 후 아탈루렌을 처리한 결과, Ras-GTP 활성도가 정상인과 비교하여 유의하게 증가된 환자 군에서 Ras-GTP 및 p-ERK 단백질의 발현이 유의하게 감소하는 것을 통하여, 아탈루렌이 신경섬유종증 치료 효과가 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 아탈루렌은 활성 상태의 Ras(Ras-GTP)의 발현이 증가한 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지는 신경섬유종증 환자의 치료 용도로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 화합물을 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 90 중량%, 구체적으로 약 0.5 중량% 내지 약 75 중량%, 보다 구체적으로 약 1 중량% 내지 약 50 중량%로 함유할 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 통상적인 방법에 따라 제제로 배합되는 통상적이고 무독성인 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 사용되는 첨가제의 예는 감미제, 결합제, 용매, 용해 보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡수제, 붕해제, 산화방지제, 보존제, 윤활제, 활택제, 충전제, 향미제 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 첨가제는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스, 글리신, 실리카, 활석, 스테아르산, 스테아린, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 알루미노실리케이트, 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 알긴산, 나트륨 알기네이트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 한천, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 에센스, 딸기 에센스, 바닐라 향 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여(예를 들어, 정제, 환제, 산제, 캡슐제, 시럽 또는 에멀젼) 또는 비경구 투여(예를 들어, 근육내, 정맥내 또는 피하 주사)를 위한 다양한 제제 형태로 배합될 수 있다.
구체적으로는, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용 제제로 배합될 수 있으며, 이때 사용되는 첨가제로는 셀룰로스, 칼슘 실리케이트, 옥수수 전분, 락토오스, 수크로스, 덱스트로스, 칼슘 포스페이트, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 젤라틴, 활석, 계면활성제, 현탁제, 유화제, 희석제 등이 포함될 수 있다. 또한, 활택제(Glidant)의 예시로는 콜로이드성 이산화규소(Colloidal Silicon Dioxide), 마그네슘 실리케이트(Magnesuim Sillicate) 등이 있고; 희석제(Diluent)의 예시로는 미세결정질 셀룰로오스(Microcrystalline Cellulose), 락토오스 무수물(Lactose Anhydrous), 락토오스 일수화물(Lactose Monohydrate), 규화(silicified) MCC HD 90 등이 있으며, 붕해제(Disintegrant)의 예시로는 크로스카르멜로스 소듐(Croscarmellose Sodium), 크로스포비돈(Crospovidone) 등이 있고; 윤활제(Lubricant)의 예시로는 마그네슘 스테아레이트(Magnesium Stearate), 소듐 라우릴 설페이트(Sodium Lauryl Sulfate), 스테아르산(Stearic Acid) 등이 있다.
또한, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물에서 상기 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 1,000 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 200 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 범위는 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 약학적 조성물은 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 호르몬 치료, 골수 이식, 줄기세포 대체 치료, 다른 생물학적 치료, 수술적 개입 또는 이들의 조합과 병용하여 종양 요법을 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 장기적으로 진행되는 다른 치료 전략과 함께 보조 요법으로 사용되거나, 중증 환자에서 종양 퇴행 또는 화학 예방 요법 후 환자의 상태를 유지하기 위해 사용될 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물을 이용하면, 개체의 생물학적 샘플에서 GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 간단한 방법을 통하여 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성을 정확하게 진단할 수 있다.
일 양상에 따른 신경섬유종증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용하면, Ras 단백질의 활성을 억제하므로, Ras 단백질의 활성도가 증가된 신경섬유종증의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 양상에 의하여 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이가 존재하는 것으로 선별된 신경섬유종증 환자의 종결 코돈 돌연변이 정보를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 양상에 의하여 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이가 존재하는 것으로 선별된 신경섬유종증 환자의 GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질의 발현량을 측정한 결과이다.
도 3은 일 양상에 의하여 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이가 존재하는 것으로 선별된 신경섬유종증 환자 중에서 Ras-GTP의 발현량이 높은 환자의 섬유아세포에 아탈루렌(PTC) 30 μg/ml를 투여하기 전과 후의 Ras-GTP의 발현량의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 일 양상에 의하여 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이가 존재하는 것으로 선별된 신경섬유종증 환자 중에서 Ras-GTP의 발현량이 높은 환자의 섬유아세포에 아탈루렌(PTC-124) 20 μg/ml 또는 30 μg/ml를 투여하기 전과 후의 p-ERK의 발현량을 비교하기 위하여 전기영동한 결과이다.
도 5는 일 양상에 의하여 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이가 존재하는 것으로 선별된 신경섬유종증 환자 중에서 Ras-GTP의 발현량이 높은 환자의 섬유아세포에 아탈루렌(PTC-124) 20 μg/ml 또는 30 μg/ml를 투여하기 전과 후의 ERK와 p-ERK의 발현 비율을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 신경섬유종증 환자 중 NF1 유전자에 종결 코돈 변이가 존재하는 환자의 선별
신경섬유종증 환자로부터 추출한 DNA를 대상으로 신경섬유종증의 원인 유전자인 NF1 유전자를 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 증폭한 후 생어 염기서열 분석(sanger sequencing)을 수행하였다. 분석 결과를 기반으로, NF1 유전자에 종결 코돈 변이가 존재하는 22명의 환자를 선별하였다. 선별된 환자의 NF1 유전자에 존재하는 종결 코돈 변이 정보는 하기 표 1에 기재한 바와 같다(도 1).
Figure pat00004
실시예 2. 선별된 신경섬유종증 환자의 RAS 단백질의 활성도 측정
정상인과 실시예 1에서 선별된 신경섬유종증 환자의 피부 섬유아세포에서 다음과 같은 방법으로 RAS 단백질의 활성도를 비교하였다.
공여 받은 정상인과 신경섬유종증 환자 각각의 피부 섬유아세포를 DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin의 배지에서 배양하였다. 세포 밀도가 용기의 70-80%되도록 배양한 후에 FBS가 제외된 배지로 교체한 후 세포를 배양하여 24시간 동안 starvation 과정을 거쳤다. 다음으로, 세포를 FBS가 포함된 배지로 이동시킨 후 Ras 활성제(activator)인 EGF(epidermal growth factor)를 100 ng/ml 농도로 희석하여 처리하고 5분 동안 37℃에서 반응시켜 각 샘플을 준비하였다. RAS 단백질의 활성도 분석은 기존 측정 방식인 Pull-down assay의 단점을 보완하여 적은 양의 세포와 동시에 많은 샘플이 측정 가능한 Cytoskeleton사의 G-LISA Ras activation Assay Biochem Kit(Absorbance Based)(Cytoskeleton, Cat No. BK131)를 사용하였다.
RAS 단백질의 활성도 분석 방법을 간단하게 설명하면, EGF 처리 후 키트에 포함된 세포 용해(cell lysis) 용액을 이용하여 세포를 용해시키고, 상등액만 획득한 후 상등액에 포함된 단백질을 정량화하였다. 모든 샘플의 동일한 단백질 양을 Ras-GTP 결합 단백질(Ras-GTP binding protein)이 결합된 플레이트의 웰에 넣고 교반기에서 300 rpm 속도로 흔들어 주면서 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 세척액으로 3회 세척한 후 결합되지 않은 단백질을 제거한 다음 anti-Ras 항체를 넣고 상온에서 45분 동안 300 rpm 속도로 교반기에서 반응시킨 후, 3회 세척 과정을 거쳤다. 세척액을 완전하게 제거한 후 2차 항체를 넣어 준 후 1차 항체 반응 과정과 동일하게 상온에서 45분 동안 400 rpm 속도로 교반기에서 반응시킨 후, 3회의 세척 과정을 거쳤다. 이 과정들을 통해 활성 상태(active state)인 GTP에 결합된 Ras(GDP-bound Ras) 단백질은 남아있고, 비활성 상태(inactive state)인 GDP에 결합된 Ras(GDP-bound Ras) 단백질은 세척 과정에서 제거된다. 다음으로, HRP detection reagent를 넣고 15분 동안 상온에서 반응시킨 후에 490 nm에서 흡광도를 측정함으로써 Ras-GTP의 존재량을 통해 Ras 단백질의 활성도를 측정하는 방식이다.
그 결과, 정상인과 비교하여 대부분의 신경섬유종증 환자 유래 섬유아세포에서 Ras-GTP의 신호가 높게 측정되는 것을 통하여 Ras 단백질의 활성도가 증가되어 있음을 확인하였다(도 2).
실시예 3. 아탈루렌(Ataluren) 처리에 따른 RAS 단백질 활성도 변화 측정
공여 받은 정상인과 신경섬유종증 환자의 피부 섬유아세포를 DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin의 배지에서 아탈루렌을 20 ug/ml 및 30 ug/ml의 농도로 각각 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 세포 밀도가 용기의 70-80%되도록 배양한 후에 FBS가 제외된 배지로 교체한 후 세포를 배양하여 24시간 동안 starvation 과정을 거쳤다. 다음으로, 세포를 FBS가 포함된 배지로 이동시킨 후 Ras 활성제인 EGF(epidermal growth factor)를 100 ng/ml 농도로 희석하여 처리하고 5분 동안 37℃에서 반응시켜 각 샘플을 준비하였다. 각 샘플에서의 Ras 단백질의 활성도 측정은 실시예 2에 기재한 방법과 동일하게 수행하였다.
그 결과, 정상인과 비교하여 Ras 단백질의 활성도가 증가되어 있는 신경섬유종증 환자의 피부 섬유아세포에 아탈루렌을 처리한 경우에, Ras-GTP의 신호가 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다(도 3). 이를 통하여, 아탈루렌은 Ras 단백질의 활성도를 감소시킴으로써 신경섬유종증 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 아탈루렌 처리에 따른 p-ERK/ERK 단백질 발현량 변화 측정
NuPAGETM 4-12% Bris-Tris Gel(Invitrogen)을 이용하여 실시예 3에서 Ras 활성도를 측정한 동일한 단백질을 전기영동하였다.
그 결과, 정상인의 섬유아세포에서는 아탈루렌 처리에 따른 활성 상태의 인산화된 ERK(p-ERK) 발현의 변화가 없었으나, 아탈루렌 처리에 따른 Ras 단백질의 활성도가 감소했던 신경섬유종증 환자의 섬유아세포에서는 p-ERK 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 4).
ERK 활성도를 보다 정확하게 비교하기 위하여, 상기에서 전기영동한 단백질을 hybond-ECL membrane으로 이동(transfer)시킨 후, 3% skim milk를 이용하여 membrane을 블락킹(blocking)하였다. 다음으로, membrane에 ERK와 p-ERK 항체를 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하였다. 2차 항체는 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하였다. 세척이 끝난 membrane에서 ERK와 p-ERK의 발현 비율을 측정하였다.
그 결과, 정상인의 섬유아세포에서는 아탈루렌 처리에 따른 p-ERK 단백질의 발현 정도가 다소 증가하였지만, 아탈루렌 처리에 따른 Ras 단백질의 활성도가 감소했던 신경섬유종증 환자의 섬유아세포에서는 p-ERK 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 5).

Claims (12)

  1. GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    신경섬유종증 치료제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00005

    상기 식에서
    Z는 할로겐, 하이드록실, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알콕시, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬이고;
    R은 수소 또는 할로겐이다.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 3-[5-(2-플루오로-페닐)-[1,2,4]옥사디아졸-3-일]-벤조산인, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날(monoclonal) 항체, 폴리클로날(polyclonal) 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드(ligand), PNA(peptide nucleic acid), 압타머(aptamer) 및 나노파티클(nanoparticle)로 구성된 군에서 선택되는 것인, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오타이드(antisense nucleotide)로 구성된 군에서 선택되는 것인, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 신경섬유종증은 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지는 것인, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 바이오마커 조성물을 포함하는, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 키트.
  8. 개체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 GTP가 결합되어 활성화된 RAS(Ras-GTP) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경섬유종증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00006

    상기 식에서
    Z는 할로겐, 하이드록실, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알콕시, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클로알킬이고;
    R은 수소 또는 할로겐이다.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 3-[5-(2-플루오로-페닐)-[1,2,4]옥사디아졸-3-일]-벤조산인, 신경섬유종증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 신경섬유종증은 NF1 유전자에 종결 코돈 돌연변이를 가지는 것인, 신경섬유종증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 신경섬유종증은 Ras 단백질의 활성도가 증가된 것인, 신경섬유종증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020210183885A 2021-12-21 2021-12-21 Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR102665711B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210183885A KR102665711B1 (ko) 2021-12-21 Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
PCT/KR2022/020770 WO2023121199A1 (ko) 2021-12-21 2022-12-20 신경섬유종증의 치료적 및 진단적 타겟으로서의 활성화된 ras 및 그의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210183885A KR102665711B1 (ko) 2021-12-21 Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230094597A true KR20230094597A (ko) 2023-06-28
KR102665711B1 KR102665711B1 (ko) 2024-05-14

Family

ID=

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023121199A1 (ko) 2023-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. FoxM1 promotes β-catenin nuclear localization and controls Wnt target-gene expression and glioma tumorigenesis
Tian et al. Involvement of p21 (WAF1/Cip1) and p27 (Kip1) in intestinal epithelial cell differentiation
CN101820881B (zh) 作为ccr2调节剂用于治疗炎症的稠合杂芳基吡啶基和苯基苯磺酰胺
US20130059859A1 (en) Predictive biomarkers for pi3k/akt kinase pathway inhibitor efficacy
US20240076271A1 (en) Kdm4 inhibitors
Ahumada-Castro et al. Keeping zombies alive: The ER-mitochondria Ca2+ transfer in cellular senescence
KR20210038906A (ko) 비정상적 acvr1 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법 및 그에 사용하기 위한 acvr1 억제제
JP2005529842A (ja) 多発性骨髄腫および他の癌の処置におけるＩκＢのインヒビターとしてのカルボリン誘導体
US20090136482A1 (en) Drug target protein and target gene, and screening method
US11719696B2 (en) Methods and compounds for diagnosing threonyl-tRNA synthetase-associated diseases and conditions
KR102665711B1 (ko) Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20230094597A (ko) Ras 활성도를 이용한 신경섬유종증 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커 조성물 및 Ras 활성 억제제를 포함하는 신경섬유종증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US8058009B2 (en) Target protein and target gene in drug designing and screening method
US11225653B2 (en) Methods and compounds for reducing threonyl-tRNA synthetase activity
US8101606B2 (en) Neurofibromin pathway modulators
Zhang et al. Cytokines increase CRE binding but decrease CRE‐mediated reporter activity in rat hepatocytes by increasing c‐Jun
WO2018158898A1 (en) Method of predicting effects of cdc7 inhibitor
Kawai et al. Functional analysis of the SEPT9-ABL1 chimeric fusion gene derived from T-prolymphocytic leukemia
US8987294B2 (en) Small molecule inhibitors of the α4-paxillin interaction
WO2023038027A1 (ja) セノリシス薬のスクリーニング方法及びセノリシス薬
Guo et al. IL-37d enhances COP1-mediated C/EBPβ degradation to suppress spontaneous neutrophil migration and tumor progression
JP2022544579A (ja) Ｃｄｃ４２特異的阻害剤で対象を治療する方法
CHEN Therapeutic targeting of OLIG2 in high grade glioma
WO2023076259A1 (en) Triazolopyridazine compounds useful as rac1 inhibitors
KR20230118040A (ko) 비알코올 지방간염 환자에서 miR-4449 억제제를 유효성분으로 포함하는 간 섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right