KR20230086657A - 프로그램된 사멸 리간드-1(pd-li) 발현의 영상화 및 표적화 - Google Patents

프로그램된 사멸 리간드-1(pd-li) 발현의 영상화 및 표적화 Download PDF

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스리다르 님마가다
디라즈 쿠마르
마틴 길버트 폼퍼
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본원에 개시된 주제는 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출할 수 있는 영상화제를 포함하는 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 본원에 개시된 영상화제는 대상체에서 암, 감염 및 염증과 같은 질병 및 장애를 검출하는데 사용될 수 있다.

Description

프로그램된 사멸 리간드-1(PD-LI) 발현의 영상화 및 표적화
연방 후원 연구 또는 개발
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 CA236616 및 CA166131 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
광범위한 암에 걸친 면역 체크포인트 요법(ICT)의 효과적인 적용에도 불구하고, 말기 암을 갖는 환자의 서브셋만이 현저한 임상 반응 및 생존을 경험한다(Ribas and Wolchok, 2018). 임상의와 연구자 모두가 직면한 과제는 가장 효과적인 면역요법을 가능한 한 빨리 환자에게 전달하는 방법이다. 풍부한 임상 시험 데이터로부터, 단일 바이오마커가 ICT에 대한 임상 반응의 범위 및 폭을 포착할 가능성이 없다는 것이 점점 더 명백해지고 있다(Havel et al., 2019). 오히려, 약역학적 및 예측적 바이오마커 둘 모두를 포함하는 다수의 바이오마커 패널의 혼입이 필수가 되었다(Havel et al., 2019). 기준선 및 치료 중 생검으로 수행될 수 있는 시험의 수는 생검 조직의 양에 의해 제한되고, 종양간 및 종양내 이질성 및 샘플링 오류를 포함하는 몇 가지 단점이 있다. 이러한 문제는 폐 및 췌장암의 경우와 같이 접근하기 어려운 위치에서 복잡해지고 ICT의 약역학적 효과를 측정하는 우리의 능력을 제한한다. 양전자 방출 단층촬영(PET)과 같은 영상화 방법은 전신의 반복적인 샘플링을 가능하게 하고 약역학적 효과의 실시간 정량화를 용이하게 한다. 그러나, PET는 주로 면역 침윤물의 활성을 정확하게 보고하는 분자-표적화된 방사성추적자에 대한 제한된 접근으로 인해 ICT를 유도하는데 충분히 활용되지 않고 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 주제는 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 영상화제를 제공한다:
Figure pct00001
;
상기 식에서, L은 존재하거나 부재할 수 있는 링커이고, 존재하는 경우 하기 일반식을 가지며;
Figure pct00002
;
상기 식에서, X는 S 또는 O이고; a, e, f, g, i 및 j는 각각 독립적으로 0 및 1로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; b, d, h 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; c는 0 내지 40의 범위를 갖는 정수이고; 각각의 R1은 H 또는 -COOR2이고, 여기서 R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고; Ar은 치환되거나 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고; A는 킬레이트제, 방사성표지된 기질, 형광 염료, 광음향 보고 분자, 및 라만-활성 보고 분자로 구성된 군으로부터 선택된 보고 모이어티 또는 -NR3R4 또는 C≡N으로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이고, 여기서 R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 영상화 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 유효량의 화학식 (I)의 영상화제를 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화제와 접촉시키는 단계; 및 (c) PD-L1을 검출하기 위한 이미지를 만드는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 화학식 (I)의 영상화제를 포함한다.
본원에 개시된 주제에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 다루어지는 본원에 상기 언급된 본원에 개시된 주제의 특정 양태인 다른 양태는 하기 본원에 가장 잘 설명된 바와 같은 첨부된 실시예 및 도면과 관련하여 취해질 때 설명이 진행됨에 따라 명백해질 것이다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면이 있는 본 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불 시 특허청에 의해 제공될 것이다.
본원에 개시된 주제는 일반적인 용어로 설명하였으므로, 이제 반드시 일정한 비율로 도시되지 않은 첨부 도면이 참조될 것이다:
도 1A, 도 1B, 도 1C 및 도 1D는 [18F]DK222의 합성 및 시험관내 특성규명을 보여준다. 도 1A는 [18F]DK222의 제조를 위한 구조 및 반응식을 보여준다. 도 1B는 DK221, DK222 및 비-방사성 [19F]DK222가 단백질-기반 검정에서 나노몰 농도에서 PD1:PD-L1 상호작용을 억제한다는 것을 입증한다. 도 1C는 안정한 인간 PD-L1 발현을 갖는 인간 TNBC, 흑색종 및 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 PD-L1 발현의 등급화된 수준을 나타내는 흐름세포측정법 히스토그램이다. 도 1D는 세포에 대한 [18F]DK222 결합이 PD-L1 발현 의존적이고, 특이성을 나타내는 1 μM 비변형 펩티드의 존재 하에 감소된다는 것을 입증한다. 도 1D에서 짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 ****, P < 0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 2A, 도 2B, 도 2C 및 도 2D는 TNBC 이종이식편을 보유하는 마우스에서 [18F]DK222의 생체내 동역학을 보여준다. 도 2A는 [18F]DK222의 높고 특이적인 흡수가 높은 PD-L1 발현 MDAMB231 종양에서 볼 수 있지만, 차단 용량 또는 낮은 PD-L1 발현 SUM149 종양을 수용한 마우스에서는 볼 수 없음을 입증한다(n=3-4). 전신 부피는 200 mCi(7.4 MBq)의 [18F]DK222 주사 후 15, 60 및 120분에 획득된 이종이식편 보유 NSG 마우스의 PET-CT 이미지를 제공하였다. 차단 용량 마우스는 방사성추적자 주사 30분 전에 50 mg/kg의 비변형된 펩티드를 수용하였다. 도 2B는 [18F]DK222가 SUM149 종양 또는 차단 용량으로는 관찰되지 않는 수 시간 동안 MDAMB231 종양에서 빠른 축적 및 체류를 나타낸다는 것을 보여준다(n=4-5). 도 2C는 높은 표적-대-근육(및 혈액) 비율에 의해 지시된 바와 같이 순환으로부터 [18F]DK222의 빠른 제거를 나타내는 생체분포 데이터로부터 유래된 시간-활성 곡선이다(n=4-5). 데이터는 표 1에 제시된 생체분포 연구로부터 유래된다. 도 2D는 상응하는 종양의 PD-L1에 대한 IHC 염색을 보여준다. 도 2C에서 짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 ****, P < 0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 3A, 도 3B 및 도 3C는 인간 흑색종 이종이식편을 갖는 마우스에서 [18F]DK222 PET가 60분에 고 대비 이미지를 나타낸다는 것을 예시한다. 도 3A는 PD-L1을 발현하는 LOX-IMVI 종양에서의 [18F]DK222의 높고 특이적인 흡수를 보여주며, 차단 용량 또는 낮은 PD-L1 발현 MeWo 종양을 수용한 마우스에서는 그렇지 않다(n=3-4). 전신 부피는 [18F]DK222 주사 60분 후에 획득된 이종이식편 보유 마우스의 PET-CT 이미지를 제공하였다. 도 3B는 LOX-IMVI 또는 MeWo 종양을 보유하는 NSG 마우스에서 생체외 생체분포에 의한 [18F]DK222의 종양 흡수를 보여준다(n=5). 도 3C는 상응하는 종양의 PD-L1에 대한 IHC 염색이다. 도 3B에서 짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 ****, P < 0.0001; NS, 유의하지 않음;
도 4A, 도 4B, 도 4C, 도 4D, 도 4E, 도 4F 및 도 4G는 [18F]DK222 흡수가 aPD-1 치료제에 의해 유도된 종양에서의 총 PD-L1 수준과 상관관계가 있음을 입증한다. 도 4A는 실험 개략도이다. 도 4B는 A375 흑색종 종양을 갖고 7일 동안 10 mg/kg 단일 용량의 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙으로 처리된 huPBMC 마우스가 종양에서 증가된 [18F]DK222 흡수를 나타낸다는 것을 입증한다. 3마리의 마우스의 대표적인 이미지는 도 4B 및 도 4C에 제시되어 있다. 도 4C는 영상화 마우스로부터의 종양 절편의 IHC 분석이 식염수 처리된 대조군 및 NSG 마우스와 비교하여 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 처리된 마우스에서 PD-L1 및 CD3에 대한 증가된 면역반응성을 나타낸다는 것을 예시한다. 도 4D는 생체분포에 의해 정량화된 종양에서의 [18F]DK222 흡수이다(n=8-13). 도 4E 및 도 4F는 종양 및 면역 세포에 대한 PD-L1 수준(도 4E) 및 흐름세포측정법에 의해 분석된 CD45 세포의 수(도 4F)가 상이한 PD-1 항체의 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 도 4G는 종양 미세환경에서 [18F]DK222 흡수와 총 PD-L1 수준 사이에 강한 상관관계가 관찰됨을 예시한다. 도 4D에서 일원 ANOVA에 의한 ****, P < 0.0001; ***, P < 0.001; **, P < 0.01. 95% CI를 갖는 도 4G의 단순 선형 회귀 및 피어슨 계수;
도 5A, 도 5B, 도 5C, 도 5D 및 도 5E는 [18F]DK222를 사용하여 정량화된 접근 가능한 PD-L1 수준이 아테졸리주맙에 의한 용량 의존적 PD-L1 맞물림(engagement)을 나타낸다는 것을 입증한다. 도 5A는 [18F]DK222가 aPD-L1 mAb의 존재 하에 시험관내에서 접근 가능한 PD-L1 수준의 정량화를 가능하게 함을 입증하고; 도 5B는 실험 개략도이다. 도 5C 및 도 5E는 감소된 [18F]DK222 흡수가 증가된 아테졸리주맙 용량으로 LOX-IMVI 종양에서 관찰됨을 입증한다. NSG 마우스는 [18F]DK222 주사 전에 24시간 동안 상이한 용량의 아테졸리주맙으로 처리되었다. 전신 부피는 [18F]DK222 주사 후 60에 획득된 마우스의 PET-CT 이미지(도 5D)(n=3), 및 생체외 생체분포(도 5E)(n=5)를 제공하였다. 도 5E에서 일원 ANOVA 및 Tukey 다중 비교 시험에 의한 ****, P < 0.0001, **, P < 0.01;
도 6A, 도 6B, 도 6C 및 도 6D는 [18F]DK222-PET를 사용하여 종양에서 정량화된 PD-L1 치료제의 약리학적 활성을 보여준다. 도 6A는 실험 개략도이다. 도 6B는 24 및 96시간 동안 1 mg/kg의 항체로 처리된 마우스에서 LOX-IMVI 종양에서의 [18F]DK222 흡수가 항체 친화성 의존성인 종양에서 상이한 PD-L1 점유율 및 PK를 포획함을 보여준다(n=3). NSG 마우스는 [18F]DK222 주사 전에 24 및 96시간 동안 1 mg/kg 용량의 아테졸리주맙, 아벨루맙 또는 두르발루맙으로 처리되었다. 1 mg/kg의 니볼루맙 및 식염수를 대조군으로 사용하였다. 전신 부피는 [18F]DK222 주사 60분 후에 획득된 마우스의 PET-CT 이미지를 제공하였다. 도 6C 및 도 6D는 LOX-IMVI(도 6D, n=8-19) 및 MDAMB231(도 6D, n=7-18) 종양 보유 마우스에서 생체분포에 의해 정량화된 종양에서의 [18F]DK222 흡수를 보여준다;
도 7A는 비-인간 영장류(파피오 아누부스(Papio anubus))에서의 [18F]DK222 PET를 보여준다. 파피오 아누비스(Papio Anubis)에 약 5 mCi의 PET 이미지의 [18F]DK222가 주사되었고, 전신 이미지는 상이한 시점에 획득되었다. PET 이미지는 방광, 신장 및 비장에서 주요 방사능 흡수를 나타내었다. 흥미롭게도, 높은 흡수가 또한 림프절일 가능성이 있는 것에서 관찰된다;
도 8A, 도 8B, 도 8C 및 도 8D는 인간 폐암 이종이식편을 갖는 마우스에서 [18F]DK222 PET가 60분에 고 대비 이미지를 나타낸다는 것을 입증한다. 도 8A는 흐름세포측정법에 의해 분석된 폐암에서의 PD-L1 발현 수준이다. 도 8B는 폐암 세포주에서 [18F]DK222의 시험관내 흡수이다. 도 8C는 PD-L1을 발현하는 H2444 종양에서 [18F]DK222의 높고 특이적인 흡수를 보여주며, 낮은 PD-L1 발현 A549 종양을 갖는 마우스에서는 그렇지 않다(n=3-4). 전신 부피는 [18F]DK222 주사 60분 후에 획득된 이종이식편 보유 마우스의 PET-CT 이미지를 제공하였다. 도 8D는 H2444, H226 및 A549 종양을 보유하는 NSG 마우스에서 생체외 생체분포에 의한 [18F]DK222의 종양 흡수이다(n=5);
도 9A, 도 9B, 도 9C 및 도 9D는 인간 방광암 이종이식편을 갖는 마우스에서 [18F]DK222 PET가 60분에 고 대비 이미지를 나타낸다는 것을 입증한다. 도 9A는 흐름세포측정법에 의해 분석된 방광암 세포주에서 PD-L1 발현 수준이다. 도 9B는 가변 PD-L1 발현을 갖는 방광암 세포에서 [18F]DK222의 시험관내 흡수이다. 도 9C는 PD-L1을 발현하는 BFTC909 종양에서 [18F]DK222의 높고 특이적인 흡수를 보여주며, 낮은 PD-L1 발현 SCaBer 종양을 갖는 마우스에서는 그렇지 않다(n=3-4). 전신 부피는 [18F]DK222 주사 60분 후에 획득된 이종이식편 보유 마우스의 PET-CT 이미지를 제공하였다. 도 9D는 BFTC909, T24 및 SCaBER 종양을 보유하는 NSG 마우스에서 생체외 생체분포에 의한 [18F]DK222의 종양 흡수를 보여준다(n=5);
도 10은 DK221의 구조 및 [19F]DK222의 합성을 위한 개략도이다;
도 11A, 도 11B, 도 11C 및 도 11D는 다음과 같다: 도 11A, DK222의 역상 HPLC 크로마토그램. 도 11B, DK222의 ESI-MS. 도 11C, [19F]DK222의 역상 HPLC 크로마토그램. 도 11D, [19F]DK222의 ESI-MS;
도 12는 [18F]DK222의 합성을 위한 개략도이다;
도 13A, 도 13B 및 도 13C는 다음과 같다: 도 13, [18F]DK222의 미정제 반응 혼합물의 역상 HPLC 크로마토그램. 도 13B, [18F]DK222의 방사선화학적 순도. 도 13C, [18F]DK222의 화학적 정체;
도 14는 제형화된 [18F]DK222의 안정성을 보여준다;
도 15A, 도 15B 및 도 15C는 다음과 같다: 도 15A, MDAMB231 및 SUM149 종양에서 [18F]DK222 흡수에 대한 비-방사성 DK221 담체의 효과. 다양한 양의 DK221과 [18F]DK222의 공동 주사는 PD-L1 양성 MDAMB231 종양에서 증가된 담체 용량과 함께 방사능 흡수의 감소를 보여주지만 PD-L1 음성 SUM149 종양에서는 그렇지 않다. 도 15B, 95% 신뢰 구간으로 평균 %ID/g 값을 나타내는 생체분포 데이터. 도 15C, 담체 용량은 선택적 조직에서 [18F]DK222 흡수에 최소 효과를 갖는다. 30 μg 용량 그룹에서의 흡수는 알려지지 않은 이유로 모든 조직에서 일관되게 높다;
도 16은 LOX-IMVI 및 MEWO 흑색종 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 [18F]DK222의 생체외 생체분포를 보여준다. 마우스는 50 μCi의 [18F]DK222를 수용하고 60분 후에 조직이 수확되었다. 제시된 데이터는 평균 ± SEM이다(n=4-5/군). 쌍을 이루지 않은 t-검정에 의한 ****, P < 0.0001;
도 17은 흑색종 세포주에서 흐름세포측정법에 의해 평가된 PD-L1 수준에 대한 IFNγ 처리의 효과를 보여준다;
도 18은 A375 이종이식편을 보유하고 aPD-1 mAb로 처리된 huPBMC 마우스에서 [18F]DK222의 선택된 조직 생체외 생체분포를 보여준다. 마우스는 50 μCi의 [18F]DK222를 수용하고 60분 후에 조직이 수확되었다;
도 19는 LOX-IMVI 이종이식편을 보유하고 0.3 mg/kg 및 20 mg/kg 용량의 아테졸리주맙으로 처리된 NSG 마우스에서 [18F]DK222의 선택된 조직 생체외 생체분포를 보여준다. 마우스는 50 μCi의 [18F]DK222를 수용하고 60분 후에 조직이 수확되었다;
도 20은 LOX-IMVI 이종이식편을 보유하고 24시간 및 96시간 동안 1 mg/kg 용량의 aPD-L1 mAb로 처리된 NSG 마우스에서 [18F]DK222의 선택된 조직 생체외 생체분포를 보여준다;
도 21은 DK222의 MALDI-TOF MS이다;
도 22는 DK331의 ESI-MS이다;
도 23은 DK331의 MALDI-MS이다;
도 24는 DK225의 ESI-MS이다;
도 25는 DK223의 MALDI-MS이다;
도 26은 DK385의 MALDI-MS이다;
도 27은 DK254의 ESI-MS이다;
도 28은 DK265의 ESI-MS이다;
도 29는 DK365의 ESI-MS이다;
도 30은 DK360의 ESI-MS이다;
도 31은 DK388의 MALDI-TOF이다;
도 32는 미정제 [18F]PyTFP의 RP-HPLC이다;
도 33은 미정제 [18F]DK221Py의 RP-HPLC이다;
도 34는 순수한 [18F]DK221Py의 RP-HPLC이다;
도 35는 hPD-L1/CHO에서 [18F]DK221Py의 생체내 평가이다;
도 36은 DK221, DK222 및 DK291([19F]DK222)에 대한 HTRF PD1/PD-L1 결합 검정으로부터의 데이터를 보여준다;
도 37은 DK225, DK223, DK385 및 DK331에 대한 HTRF PD1/PD-L1 결합 검정으로부터의 데이터를 보여준다.
본원에 개시된 주제는 이제 본원에 개시된 주제의 전부가 아닌 일부 구현예가 제시된 첨부 도면을 참조하여 이하에서 더욱 충분히 설명될 것이다. 유사한 번호는 전체에 걸쳐 유사한 요소를 지칭한다. 본원에 개시된 주제는 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고 본원에 기재된 구현예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며; 오히려, 이러한 구현예는 본 발명의 개시가 적용 가능한 법적 요건을 충족시키도록 제공된다. 실제로, 본원에 기재된 본원에 개시된 주제의 많은 변형 및 다른 구현예는 전술한 설명 및 관련 도면에 제시된 교시의 이점을 갖는 본원에 개시된 주제가 속하는 기술 분야의 당업자에게 떠오를 것이다. 따라서, 본원에 개시된 주제는 개시된 특정 구체예로 제한되지 않으며, 변형 및 다른 구현예는 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다.
I. 프로그램된 사멸 리간드-1 (PD-LI) 발현의 영상화 및 표적화
전신에서 면역 반응을 정량화하기 위한 현재 도구는 제한적이다. 본원에 개시된 주제는 부분적으로 면역 체크포인트 요법(ICT)을 위한 환자를 선택하기 위한 가장 널리 사용되는 바이오마커, 즉, 프로그램된 사멸 리간드-1(PD-LI)에 대한 방사성의약품의 개발에 관한 것이며, 이는 여러 암에서 ICT에 대한 반응을 예측하는데 유용한 것으로 입증되었다(Garon et al., 2015; Reck et al., 2016; Reck et al., 2019; Herbst et al., 2019; Hellmann et al., 2018; Peters et al., 2019; Spigel et al., 2019; Yarchoan et al., 2019; Melosky et al., 2018). 이를 위해, 실시간으로 ICT 효능을 예측하기 위해 PD-L1 수준을 측정하기 위한 펩티드-기반 방사성의약품 및 유사체가 개발되었다.
보다 특히, 본원에 개시된 주제는 부분적으로 방사성추적자의 주사 직후 종양 및 면역 세포에서 PD-L1 발현을 검출할 수 있는 고도로 특이적인 펩티드-기반 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화제를 제공한다. 본원에 개시된 영상화제는 투여 60분 내에 영상화의 표준 임상 워크플로우 내에서 적합화되고, 만성 박테리아 감염, 파종성 결핵, 루푸스 및 류마티스 관절염의 실험 모델을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 유형의 암, 감염성 및 염증성 존재물의 영상화에 적용 가능하다.
A. 영상화제를 포함하는 조성물
일부 구현예에서, 본원에 개시된 주제는 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 영상화제를 제공한다:
Figure pct00003
;
상기 식에서, L은 존재하거나 부재할 수 있는 링커이고, 존재하는 경우 하기 일반식을 가지며;
Figure pct00004
;
상기 식에서, X는 S 또는 O이고; a, e, f, g, i 및 j는 각각 독립적으로 0 및 1로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; b, d, h 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고; c는 0 내지 40의 범위를 갖는 정수이고; 각각의 R1은 H 또는 -COOR2이고, 여기서 R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고; Ar은 치환되거나 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고; A는 킬레이트제, 방사성표지된 기질, 형광 염료, 광음향 보고 분자 및 라만-활성 보고 분자로 구성된 군으로부터 선택된 보고 모이어티 또는 -NR3R4 또는 C≡N으로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이고, 여기서 R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 C1-C4 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 및 tert-부틸을 포함한다. 용어 "아릴"은 달리 언급되지 않는 한, 함께 융합되거나 공유적으로 연결된 단일 고리 또는 다중 고리(예를 들어, 1 내지 3개의 고리)일 수 있는 방향족 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자(다중 고리의 경우 각각의 별도의 고리에서)를 함유하는 아릴 기(또는 고리)를 지칭하며, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)은 선택적으로 4차화된다.
일부 구현예에서, 링커는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
(a)
Figure pct00005
, 상기 식에서, p는 0, 1, 2, 3 및 4로부터 선택된 정수이고;
(b)
Figure pct00006
, 상기 식에서, q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
(c)
Figure pct00007
, 상기 식에서, r은 0, 1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
(d)
Figure pct00008
, 상기 식에서, s는 1 내지 40의 범위를 갖는 정수이고, t는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
(e)
Figure pct00009
, 상기 식에서, s는 1 내지 40의 범위를 갖는 정수이고, t는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
(f)
Figure pct00010
, 상기 식에서, s는 1 내지 40의 범위를 갖는 정수이고, t는 0 또는 1로부터 선택된 정수이다.
당업자는 본원에 개시된 주제의 검토시 킬레이트제/방사성금속 이온의 다양한 조합이 본원에 개시된 영상화제와 함께 사용하기에 적합하다는 것을 인지할 것이다. 대표적인 킬레이트제는 당 분야에 공지되어 있다. 비제한적인 예로서, 특정 킬레이트제 및 링커는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0246144호 및 2015/0104387호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 전체내용이 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 보고 모이어티는 킬레이트제이고, 킬레이트제는 DOTAGA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸,1-(글루타르산)-4,7,10-트리아세트산), DOTA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTA-트리스(t-부틸)에스테르, DOTAGA-(t-부틸)4, DOTA-디(t-부틸)에스테르, DOTASA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-(2-숙신산)-4,7,10-트리아세트산), CB-DO2A (10-비스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자바이사이클로[5.5.2]테트라데칸), DEPA (7-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-4,10-비스-카르복시메틸-1,4,7,10-테트라아자-사이클로도데크-1-일-아세트산)), 3p-C-DEPA (2-[(카르복시메틸)][5-(4-니트로페닐-1-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일]펜탄-2-일)아미노]아세트산)), TCMC (2-(4-이소티오시아노토벤질)-1,4,7,10-테트라아자-1,4,7,10-테트라-(2-카르바모닐 메틸)-사이클로도데칸), 옥소-DO3A (1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-5-S-(4-이소티오시아네이토벤질)-4,7,10-트리아세트산), DO3A-(t-부틸), DO3AM (2,2',2"-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트아미드), p-NH2-Bn-옥소-DO3A (1-옥사-4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-5-S-(4-아미노벤질)-4,7,10-트리아세트산), TE2A ((1,8-N,N'-비스-(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸), MM-TE2A, DM-TE2A, CB-TE2A (4,11-비스(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸), CB-TE1A1P (4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1-(메탄포스폰산)-8-(메탄카르복실산), CB-TE2P (1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,8-비스(메탄포스폰산), TETA (1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산), NOTA (1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산), NOTA(t-부틸)2, NO2A (1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-비스(아세트산)-7-(아세트아미드), NODA (1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세테이트); NODAGA (1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산), NODAGA(t-부틸)3, NOTAGA (1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산), DFO (데스페록사민), DTPA (2-[비스[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]아미노]아세트산), DTPA-테트라(t-부틸)에스테르 (디에틸렌트리아민-N,N,N",N"-테트라-tert-부틸 아세테이트-N'-아세트산), NETA ([4-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-7-카르복시메틸-[1,4,7]트리아조난-1-일}-아세트산), TACN-TM (N,N',N", 트리스(2-메르캅토에틸)-1,4,7-트리아자사이클로노난), Diamsar (1,8-디아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로(6,6,6)에이코산, 3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산-1,8-디아민), Sarar (1-N-(4-아미노벤질)-3, 6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6] 에이코산-1,8-디아민), AmBaSar (4-((8-아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로 [6.6.6] 이코산-1-일아미노)메틸)벤조산), BaBaSar, 트리스(하이드록시피리디논)(THP), THP(벤질)3, NOPO (3-(((4,7-비스((하이드록시(하이드록시메틸)포스포릴)-메틸)-1,4,7-트리아조난-1-일)메틸)(하이드록시)포스포릴)프로판산), TRAP (3,3',3"-(((1,4,7-트리아조난-1,4,7-트리일)트리스(메틸렌))트리스(하이드록시포스포릴))-트리프로판산), p-NH2-Bn-PCTA (3,6,9,15-테트라아자바이사이클로[9.3.1] 펜타데카-1(15),11,13-트리엔-4-S-(4-아미노벤질)-3,6,9-트리아세트산), 및 비오틴 (5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 킬레이트제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
.
일부 구현예에서, 킬레이트제는 DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), NOTA(1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산), NODA(1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세테이트); NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산), 및 비오틴(5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 보고 모이어티는 킬레이트제이고, 킬레이트제는 94mTc, 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 177Lu, 186Re, 188Re, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 55Co, 57Co, 44Sc, 47Sc, 225Ac, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 153Sm, 166Ho, 152Gd, 82Rb, 89Zr, 166Dy 및 Al18F로 구성된 군으로부터 선택된 방사성금속을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 기질은, 예를 들어, NOTA, NODA, 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 킬레이터에 의한 알루미늄 플루오라이드의 킬레이트화에 기반한 AlF 방법을 사용하여 18F로 표지된다. 예를 들어, 문헌[Liu S., et al., "One-step radiosynthesis of 18F-AlF-NOTA-RGD2 for tumor angiogenesis PET imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2011, 38(9):1732-41; McBride W.J., et al., "A novel method of 18F radiolabeling for PET. J Nucl Med. 2009;50:991-998; McBride W.J, D'Souza CA, Sharkey RM, Sharkey RM, Karacay H, Rossi EA, Chang C-H, Goldenberg DM. Improved 18F labeling of peptides with a fluoride-aluminum-chelate complex. Bioconjug Chem. 2010;21:1331-1340]을 참조한다.
당업자는 일부 구현예에서 화학식 (I)의 링커 "L"이 존재하지 않고, 킬레이트제가 공급된 바와 같은 킬레이트제의 일부인 링커 모이어티를 통해 DK221과 컨쥬게이션된다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 하기 본원의 실시예 1에 제공된 바와 같이, 특정 구현예에서, DK221의 리신 ε-아민은 NHS 에스테르 방법을 사용하여 이작용성 킬레이터 컨쥬게이션에 사용된다. 예를 들어, 공급된 바와 같은 킬레이트제가 NCS-MP-NODA (2,2'-(7-(4-이소티오시아네이토벤질)-1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산)인 경우, 이소티오시아네이토벤질 모이어티는 NODA 킬레이트제와 DK221의 리신 ε-아민 사이의 링커이다.
공급된 바와 같은 킬레이트제를 포함할 수 있는 다른 링커 모이어티는 말레이미드, NHS 에스테르, 무수물, NCS, NCS-벤질, NH2-PEG, BCN, -NH2, 프로파길, 아세트산, 글루탐산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 보고 모이어티는 방사성표지된 기질이고, 방사성표지된 기질은 11C, 13N, 15O, 123I, 124I, 125I, 126I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br, 80Br, 80mBr, 82Br, 83Br, 19F, 18F 및 211At로 구성된 군으로부터 선택된 방사성동위원소를 포함한다.
일부 구현예에서, 방사성표지된 기질은 18F-표지된 기질 또는 18F-표지된 기질을 포함한다.
일부 구현예에서, 19F-표지된 기질 또는 18F-표지된 기질은 2-플루오로-PABA, 3-플루오로-PABA, 2-플루오로-만니톨, 및 N-숙신이미딜-4-플루오로벤조에이트 및 2-피리딜로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 보고 모이어티는 형광 염료이고, 형광 염료는 카르보시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 투이카르보시아닌, 메로시아닌, 폴리메틴, 쿠마린, 아미노메틸쿠마린 아세테이트(AMCA), 로다민, 테트라메틸로다민(TRITC), 잔텐, 플루오레세인, FITC, 붕소-디피로메탄(BODIPY) 염료, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, VivoTag-680, VivoTag-S680, VivoTag-S750, AlexaFluor350, AlexaFluor405, AlexaFluor488, AlexaFluor546, AlexaFluor555, AlexaFluor594, AlexaFluor633, AlexaFluor647, AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor700, AlexaFluor750, AlexaFluor790, Dy677, Dy676, Dy682, Dy752, Dy780, DyLight350, DyLight405, DyLight488, DyLight547, DyLight550, DyLight594, DyLight633, DyLight647, DyLight650, DyLight680, DyLight755, DyLight800, HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 680, HiLyte Fluor 750, IR Dye 800, IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 700DX, ADS780WS, ADS830WS, ADS832WS, 캐스케이드 블루(Cascade Blue) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 보고 모이어티는 광음향 보고 분자이고, 광음향 보고 분자는 염료 또는 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 염료는 형광 염료를 포함한다. 일부 구현예에서, 형광 염료는 인도시아닌-그린(indocyanine-green; ICG), Alexa Fluor 750, 에반스 블루(Evans Blue), BHQ3, QXL680, IRDye880CW, MMPSense 680, 메틸렌 블루(Methylene Blue), PPCy-C8 및 Cypate-C18로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 나노입자는 플라즈몬 나노입자, 양자점, 나노다이아몬드, 폴리피롤 나노입자, 구리 설파이드 나노입자, 그래핀 나노시트, 산화철-금 코어-쉘 나노입자, Gd2O3 나노입자, 단일-벽 탄소 나노튜브, 염료-로딩된 퍼플루오로카본 나노입자, 및 초상자성 산화철 나노입자로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 보고 모이어티는 라만-활성 보고 분자이고, 라만-활성 보고 분자는 단일-벽 탄소 나노튜브(SWNT) 및 표면-향상된 라만 산란(SERS) 제제로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, SERS 제제는 라만-활성 리포터 분자로 표지된 금속 나노입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 라만-활성 리포터 분자는 형광 염료를 포함한다. 일부 구현예에서, 형광 염료는 Cy3, Cy5, 로다민, 및 칼코게노피릴륨 염료로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학식 (I)의 영상화제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
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일부 구현예에서, 영상화제는 시험관내, 생체내, 및/또는 생체외에서 PD-L1을 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 영상화제는 생체내에서 PD-L1을 검출할 수 있다. PD-L1은 다양한 종양에 의해 발현되고, 이의 과발현은 종양 침윤 세포독성 T-세포에 반응하여 적응 메커니즘으로서 종양 세포에서 유도된다. 당업자는 PD-L1이 변형 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있고, 본원에 개시된 영상화제에 의해 여전히 검출될 수 있는 한, 본원에 개시된 방법에 여전히 적용될 수 있음을 인지할 것이다.
일부 구현예에서, PD-L1과 이의 리간드 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)의 상호작용을 억제하기 위해 본원에 개시된 영상화제의 IC50은 약 100 nM 내지 약 1 pM의 범위를 갖는다. 일부 구현예에서, IC50은 100 nM 미만, 다른 구현예에서, 10 nM 미만, 다른 구현예에서, 8 nM 미만, 다른 구현예에서, 5 nm 미만, 다른 구현예에서, 4 nm 미만, 및 다른 구현예에서, 3 nM 미만이다.
용어 "결합 친화성"은 2개 이상의 화합물이 비공유 관계로 서로 얼마나 강하게 회합하는지를 설명하는 특성이다. 결합 친화성은 정성적으로(예를 들어, "강한", "약한", "높은", 또는 "낮은") 또는 정량적으로(예를 들어, Kd 측정됨) 특성규명될 수 있다.
B. 영상화제를 이용한 검출 방법
일부 구현예에서, 본원에 개시된 주제는 PD-L1과 같은 면역 체크포인트 단백질을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 주제는 PD-L1의 과발현을 초래하는 질병, 장애, 또는 질환, 예를 들어, 암, 염증, 감염 등을 검출하기 위한 방법을 제공한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 영상화 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 유효량의 화학식 (I)의 영상화제를 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화제와 접촉시키는 단계; 및 (c) PD-L1을 검출하기 위한 이미지를 만드는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "영상화" 또는 "이미지 만듦"은 화합물에 의해 방출되는 에너지를 측정함으로써 검출 가능한 화합물을 시각화하기 위한 임의의 영상화 기술의 사용을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "영상화"는 투여 후 화합물의 국소화 후 화합물에 의해 방출되는 에너지를 측정함으로써 대상체에 투여 후 검출 가능한 화합물을 시각화하기 위한 임의의 영상화 기술의 사용을 지칭한다. 일부 구현예에서, 영상화 기술은 대상체의 외부에서 검출될 수 있는 화합물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이미지는 대상체의 다양한 위치에 축적되는 영상화제의 공간 분포의 차이로 인해 생성된다. 일부 구현예에서, 영상화제를 투여하는 것은 주사에 의해 일어난다.
용어 "영상화제"는, 예를 들어, 양전자 방출 단층촬영(PET)에 의해 영상화될 수 있는 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 "양전자 방출 단층촬영 영상화" 또는 "PET"는 양전자 방출 단층촬영 영상화 시스템 또는 등가물 및 양전자 방출 단층촬영 영상화가 가능한 모든 장치를 포함한다. 본원에 개시된 주제의 방법은 임의의 이러한 장치, 또는 PET 장치 또는 등가물의 변형을 사용하여, 또는 임의의 공지된 PET 방법과 함께 실시될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,151,377호; 6,072,177호; 5,900,636호; 5,608,221호; 5,532,489호; 5,272,343호; 5,103,098호를 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다. 동물 영상화 양식은, 예를 들어, 마이크로-PET(Corcorde Microsystems, Inc.)를 포함한다.
보고 모이어티에 따라, 본원에 개시된 영상화제는 PET, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 근적외선(형광), 광음향, 및 라만 영상화에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 영상화는 검출 시스템을 사용하여 전체 대상체 또는 환자, 또는 대상체 또는 환자의 특정 영역을 스캐닝하고, 신호를 검출하는 것을 포함한다. 검출된 신호는 이후 이미지로 변환된다. 생성된 이미지는, 예를 들어, 의사와 같은 숙련된 관찰자에 의해 판독되어야 한다. 일반적으로, 영상화는 영상화제의 투여 약 1분 내지 약 48시간 후에 수행된다. 영상화의 정확한 타이밍은 당업자에게 용이하게 명백할 바와 같이, 투여되는 화합물의 제거율과 같은 요인에 의존할 것이다. 영상화 시간 프레임은 사용되는 방사성뉴클레오티드에 따라 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, 영상화는 투여 후 약 1분 내지 약 4시간, 예를 들어, 15분 내지 30분, 30분 내지 45분, 45분 내지 60분, 60분 내지 90분, 및 60분 내지 120분에 수행된다. 일부 구현예에서, PD-L1의 검출은 대상체에 영상화제를 투여한지 약 60분 후에 발생한다. 일부 구현예에서, 영상화는 Zr-89로 표지된 펩티드로 주사 24시간 후에 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 영상화는 I-124로 표지된 펩티드로 주사 24시간 후에 일어날 수 있다.
이미지가 획득되면, 당업자는 화합물의 위치를 결정할 수 있다. 이 정보를 이용하여, 당업자는, 예를 들어, 감염, 염증 또는 암과 같은 질환이 존재하는지의 여부, 질환의 정도, 또는 대상체가 겪고 있는 치료의 효능을 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 또는 조직을 영상화제와 접촉시키는 것은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 수행된다. "접촉시키는"은 본원에 개시된 주제의 적어도 하나의 영상화제가 적어도 하나의 세포 또는 조직을 물리적으로 접촉하게 하는 임의의 작용을 의미한다. 따라서, 이는 적어도 하나의 영상화제를 적어도 하나의 세포 또는 조직과 접촉시키기에 충분한 양으로 세포(들) 또는 조직(들)을 영상화제에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 배양 접시 또는 튜브와 같은 제어된 환경에서 영상화제 및 세포 또는 조직을 도입하고, 바람직하게는 혼합함으로써 시험관내 또는 생체외에서 실시될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체내에서 실시될 수 있고, 이 경우 접촉은 대상체에서 적어도 하나의 세포 또는 조직을 본원에 개시된 주제의 적어도 하나의 영상화제에 노출시키고, 예를 들어, 임의의 적합한 경로를 통해 영상화제를 대상체에 투여하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조직을 영상화제와 접촉시키는 것은 대상체에서 수행된다.
용어 영상화제의 "유효량"은 본원에 설명된 기술, 예를 들어, 양전자 방출 단층촬영(PET)을 사용하여 영상화될 때 판독 가능한 신호를 제공하는데 필요하거나 충분한 양이다. 유효량은 대상체의 크기 및 체중, 질병의 유형, 또는 특정 화합물과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 화합물의 선택은 "유효량"을 구성하는 것에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 본원에 함유된 요인을 연구하고 과도한 실험 없이 화합물의 유효량에 관해 결정할 수 있을 것이다.
다수의 구현예에서 본원에 개시된 방법에 의해 진단되거나 치료되는 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이지만, 본원에 설명된 방법은 용어 "대상체"에 포함되는 것으로 의도되는 모든 척추동물 종에 대해 효과적인 것으로 이해되어야 한다. 따라서, "대상체"는 의학적 목적, 예를 들어, 기존의 질병, 장애, 질환의 진단 또는 치료를 위한 인간 대상체 또는 의학적, 수의학적 목적, 또는 발달 목적을 위한 동물 대상체를 포함할 수 있다. 적합한 동물 대상체는 영장류, 예를 들어, 인간, 원숭이, 유인원, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 마카크(macaque) 등; 소과, 예를 들어, 소, 황소 등; 양과, 예를 들어, 양 등; 염소과, 예를 들어, 염소 등; 돼지과, 예를 들어, 돼지, 호그 등; 말과, 예를 들어, 말, 당나귀, 얼룩말 등; 야생 및 집고양이를 포함하는 고양이과; 개를 포함하는 개과; 토끼, 산토끼 등을 포함하는 토끼과; 및 마우스, 래트, 기니피그 등을 포함하는 설치류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물을 포함한다. 동물은 트랜스제닉 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년, 및 성인 대상체를 포함하나 이에 제한되지 않는 인간이다. 추가로, "대상체"는 질병, 장애 또는 질환을 앓거나 앓는 것으로 의심되는 환자를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 또한 동물 질병 모델(예를 들어, 실험에 사용된 래트 또는 마우스 등)을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간, 래트, 마우스, 고양이, 개, 말, 양, 소, 원숭이, 조류, 또는 양서류이다.
일반적으로, 본원에 개시된 영상화제는 경구, 비강, 경점막, 안구, 직장, 질내, 또는 정맥내, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 골수내 주사, 뿐만 아니라 척수강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 관절내, 흉골내, 활액내, 간내, 병변내, 두개내, 복강내, 비강내, 또는 안내 주사, 수조내, 국소, 분말, 연고 또는 점적(점안제 포함)에 의함, 예를 들어, 협측 및 설하, 경피, 흡입 스프레이를 통함, 또는 당 분야에 공지된 다른 전달 방식을 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한 질병, 장애 또는 질환의 검출을 위해 대상체에 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "전신 투여", "전신 투여됨", "말초 투여" 및 "말초 투여됨"은 이들이 대상체 또는 환자의 시스템에 들어가고, 따라서 대사 및 다른 유사한 과정을 거치도록 하는 조성물의 투여, 예를 들어, 피하 또는 정맥내 투여를 의미한다.
본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여됨"은 일반적으로 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 안구내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 영상화제는 적어도 3:1의 표적 대 비-표적 비율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 용어 "표적"은 PD-L1 단백질의 과발현을 나타내는 세포 또는 조직을 지칭하고, 용어 "비-표적"은 PD-L1 단백질의 과발현을 나타내지 않는 세포 또는 조직을 지칭한다.
일부 구현예에서, 영상화 방법은 암을 검출하는데 사용된다. 대상체 또는 환자에서 "암"은 암-유발 세포의 전형적인 특징, 예를 들어, 제어되지 않은 증식, 특수 기능의 상실, 불사, 유의한 전이 잠재성, 항-아폽토시스 활성의 유의한 증가, 빠른 성장 및 증식 속도, 및 특정한 특징적인 형태 및 세포 마커를 보유한 세포의 존재를 지칭한다. 일부 상황에서, 암 세포는 종양의 형태일 것이며; 이러한 세포는 동물 내에 국소적으로 존재할 수 있거나, 독립적인 세포, 예를 들어, 백혈병 세포로서 혈류에서 순환할 수 있다. 본원에서 사용되는 암은 모세포종, 암종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 및 육종을 포함하나 이에 제한되지 않는 새로 진단된 또는 재발성 암을 포함한다. 본원에서 사용되는 암은 두부암, 경부암, 두경부암, 폐암, 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암, 전립선암, 결장직장암, 식도암, 위암, 백혈병/림프종, 자궁암, 피부암, 내분비암, 비뇨기암, 췌장암, 위장암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 뇌암, 및 선종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 암은 0기 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 I기 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 II기 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 III기 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 IV기 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 불응성 및/또는 전이성이다.
본원에서 사용되는 "종양"은 악성이든 양성이든 간에 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "고형 종양"은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적 조직 덩어리이다. 고형 종양은 비제한적인 예로서 뇌, 결장, 유방, 전립선, 간, 신장, 폐, 식도, 두경부, 난소, 자궁경부, 위, 결장, 직장, 방광, 자궁, 고환, 및 췌장에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 영상화 방법은 고형 종양을 검출하는데 사용된다. 또 다른 구현예에서, 영상화 방법은 전이성 암을 검출하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 영상화 방법은 감염을 검출하는데 사용된다. 임의의 진균 또는 박테리아에 의한 감염과 같은 감염성 질환은 본원에 개시된 주제를 사용하여 검출하기 위해 고려된다. 본원에서 사용되는 용어 "감염"은 질병-유발 유기체에 의한 숙주 유기체의 신체 조직의 침입, 이들의 증식, 및 이러한 유기체 및 이들이 생산하는 독소에 대한 숙주 조직의 반응을 지칭한다. 감염은 병원내 감염, 외과적 감염, 및 복막염, 췌장염, 담낭 농흉 및 흉막 농흉과 같은 중증 복부 감염, 및 골수염과 같은 골 감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 균혈증, 패혈증 및 패혈성 쇼크, 면역억제제 약물, 암 화학요법, 방사선의 사용으로 인한 또는 사용 후의 감염, 오염된 i.v. 체액, 출혈성 쇼크, 허혈, 외상, 암, 면역-결핍, 바이러스 감염, 및 당뇨병의 검출도 또한 고려된다. 박테리아 및/또는 진균 감염과 같은 미생물 감염의 예는 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), E. 콜라이(E. coli), 클렙시엘라 종(Klebsiella sp.), 엔테로박터 종(Enterobacter sp.), 프로테우스 종(Proteus sp.), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 스태필로코커스 종(Staphylococcus spp.), 예를 들어, S. 아우레우스(S. aureus) 및 응고효소 음성 스태필로코커스(coag.-negative Staphylococcus), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 박테로이데스 종(Bacteroides spp.), 아시네토박터 종(Acinetobacter spp.), 헬리코박터 종(Helicobacter spp.), 칸디다 종(Candida sp.) 등으로 인한 감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 내성 미생물, 예를 들어, 메티실린-내성 스태필로코커스 아우레우스(MRSA) 및 반코마이신-내성 엔테로코커스 파에칼리스(VRE)로 인한 감염이 포함된다. 일부 구현예에서, 감염은 박테리아 감염이다. 일부 구현예에서, 감염은 만성 박테리아 감염이다. 일부 구현예에서, 박테리아 감염은 결핵이다. 일부 구현예에서, 감염은 파종성 결핵이다. 일부 구현예에서, 감염은 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 및/또는 인간 면역결핍 바이러스일 수 있다.
일부 구현예에서, 영상화 방법은 염증을 검출하는데 사용된다. 염증과 관련된 장애의 예는 천식, 자가면역 질환, 자가염증성 질환, 체강 질환, 게실염, 사구체신염, 화농성 한선염, 과민증, 염증성 장 질환, 간질성 방광염, 중이염, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 이식 거부, 전신 홍반 루푸스를 포함하는 루푸스, 및 혈관염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 염증은 류마티스 관절염 또는 전신 홍반 루푸스에 의해 유발된다.
PD-L1은 활성화된 T 세포, B 세포, 및 골수 세포에서 발견되는 이의 수용체 PD-1에 결합하여 활성화 또는 억제를 조절한다. PD-L1은 또한 대식세포를 포함하는 여러 면역 세포에서 발현된다. 따라서, PD-L1 발현을 검출하는 본원에 개시된 영상화제는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, B 세포, 및 골수 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 영상화제는 종양에서 면역 세포를 검출한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 영상화제는 대상체에서 전신적으로 면역 세포의 분포를 검출한다. 일부 구현예에서, 영상화 방법은 감염성 세포에서 면역 세포 반응을 검출하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 영상화 방법은 염증 세포에서 면역 세포 반응을 검출하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 영상화 방법은 PD-L1 발현의 치료-유발 변화와 같은 PD-L1 발현의 변화를 검출 및/또는 측정한다. 이러한 방법은 특정 치료 방법의 효능을 확인하기 위해 및/또는 효과적인 치료 투여량 범위를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
C. 영상화제를 포함하는 키트
일부 구현예에서, 본원에 개시된 주제는 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 상기 설명된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 영상화제를 포함한다.
전형적으로, 본원에 개시된 주제의 키트는 본원에 개시된 영상화제 및 적어도 하나의 본원에 개시된 방법을 수행하는 방법에 대한 설명서를 포함한다. 영상화제는 일반적으로 적어도 1명의 대상체 또는 환자에서 적어도 1회 PD-L1을 검출하기에 충분한 양으로 키트에 공급된다. 키트는 또한 본원에 개시된 방법의 적어도 하나의 구현예를 수행하는데 필요한 다른 시약 및 공급물의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
가장 간단한 형태에서, 본원에 개시된 주제에 따른 키트는 본원에 개시된 주제에 따른 적어도 하나의 유형의 영상화제를 함유하는 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 다수의 용기를 포함하고, 이들 각각은 적어도 하나의 영상화제 또는 본원에 개시된 방법의 하나 이상의 구현예를 수행하는데 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.
용기는 본원에 개시된 조성물 또는 본원에 개시된 방법을 수행하는데 유용한 또 다른 물질을 함유하기에 적합한 임의의 물질일 수 있다. 따라서, 용기는 바이알 또는 앰풀일 수 있다. 이는 유리, 플라스틱, 금속, 또는 종이 또는 종이 제품과 같은 임의의 적합한 물질로부터 제조될 수 있다. 구현예에서, 이는, 예를 들어, 스토퍼, 스토퍼 및 크림프 밀봉, 또는 플라스틱 또는 금속 캡에 의해 밀봉될 수 있는 유리 또는 플라스틱 앰풀 또는 바이알이다. 용기에 함유된 영상화제의 양은 본원에 개시된 주제에 따라 관련된 수많은 파라미터에 기초하여 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
구현예에서, 용기는 전형적으로 패키징 물질을 포함하는 더 큰 유닛의 성분으로서 제공된다(이하에서 간략화 목적을 위해 키트로 지칭됨). 본원에 개시된 키트는 적합한 패키징 및 조성물의 사용과 관련된 설명서 및/또는 다른 정보를 포함할 수 있다. 전형적으로, 키트는 판지 및 플라스틱과 같은 견고한 물질로 제조되고, 그 위에 직접 인쇄된 설명서 또는 다른 정보를 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 조성물을 함유하는 다수의 용기를 포함할 수 있다. 이러한 키트에서, 각각의 용기는 각각의 다른 용기와 동일한 크기일 수 있고, 동일한 양의 조성물을 함유할 수 있거나, 상이한 용기는 상이한 크기일 수 있고/있거나 상이한 양의 조성물 또는 상이한 구성요소를 갖는 조성물을 함유할 수 있다. 당업자는 용기 크기 및 내용물의 다수의 상이한 구성이 본 발명에 의해 구상되고, 따라서 모든 순열이 본원에 구체적으로 언급될 필요는 없다는 것을 즉시 이해할 것이다.
특정 용어가 본원에서 사용되지만, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로 사용되며 제한의 목적이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본원에 설명된 주제가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
오랜 특허법 관례에 따라, 단수 용어는 청구범위를 포함하여 본 출원에서 사용될 때 "하나 이상"을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "대상체"에 대한 언급은 문맥이 명백히 상반되지 않는 한 복수의 대상체(예를 들어, 복수의 대상체) 등을 포함한다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "-들을 포함하다", "-을 포함하다", 및 "포함하는"은 문맥에서 달리 요구하는 경우를 제외하고는 비-배타적인 의미로 사용된다. 마찬가지로, 용어 "포함하다" 및 이의 문법적 변형은 비-제한적인 것으로 의도되어, 목록에서 항목의 언급은 나열된 항목에 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "약"은 값, 양 또는 범위와 함께 명시적으로 나타나지 않을 수 있지만 명세서 및 청구범위에서 사용되는 양, 크기, 치수, 비율, 모양, 제형, 파라미터, 백분율, 파라미터, 양, 특성, 및 다른 수치 값을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 정확하지 않으며 정확할 필요는 없으며, 허용 오차, 변환 인자, 반올림, 측정 오차 등, 및 본원에 개시된 주제에 의해 획득하고자 하는 요망되는 특성에 따라 당업자에게 공지된 다른 인자를 반영하여 근사치이고/이거나 요망되는 바에 따라 더 크거나 작을 수 있다. 예를 들어, 용어 "약"은 값을 언급할 때 특정된 양으로부터 일부 구현예에서 ± 100%, 일부 구현예에서 ± 50%, 일부 구현예에서 ± 20%, 일부 구현예에서 ± 10%, 일부 구현예에서 ± 5%, 일부 구현예에서 ±1%, 일부 구현예에서 ± 0.5%, 및 일부 구현예에서 ± 0.1%의 변화를 포함하는 것을 의미할 수 있는데, 이는 이러한 변화가 개시된 방법을 수행하거나 개시된 조성물을 사용하기에 적절하기 때문이다.
또한, 용어 "약"은 하나 이상의 숫자 또는 숫자 범위와 관련하여 사용될 때, 범위 내의 모든 숫자를 포함하는 모든 이러한 숫자를 지칭하고 기재된 숫자 값의 위 및 아래의 경계를 확장함으로써 그 범위를 변형시키는 것으로 이해되어야 한다. 종점에 의한 숫자 범위의 언급은 모든 숫자, 예를 들어, 그 범위 내에 포함되는 이의 분율을 포함하는 전체 정수(예를 들어, 1 내지 5의 언급은 1, 2, 3, 4 및 5 뿐만 아니라 이의 분율, 예를 들어, 1.5, 2.25, 3.75, 4.1 등을 포함함) 및 상기 범위 내의 임의의 범위를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 주제의 대표적인 구현예를 실시하기 위해 당업자에게 지침을 제공하기 위해 포함되었다. 본 발명의 개시 및 당업자의 일반적인 수준에 비추어, 당업자는 하기 실시예가 단지 예시적인 것으로 의도되고, 본원에 개시된 주제의 범위를 벗어나지 않으면서 다수의 변화, 변형 및 변경이 이용될 수 있음을 이해할 수 있다. 하기 합성 설명 및 특정 실시예는 단지 예시의 목적으로 의도된 것이며, 다른 방법에 의해 본 발명의 개시의 화합물을 제조하는 것을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
1.1 결과
1.1.1 친수성 PD-L1-특이적 PET 영상화제의 합성 및 시험관내 평가. IHC를 사용한 PD-L1 검출은 PD-1:PD-L1 요법을 위한 안내 도구이다(McLaughlin et al., 2016). 그러나, 모든 병변에서 총 PD-L1 수준을 비-침습적으로 정량화하는 도구는 최근에야 등장했으며 초기 임상 평가에 있다(Bensch et al., 2018; Niemeijer et al., 2018). 그러나, PD-L1 역학을 정량화하는 것은 표준 임상 워크플로우 내에서 고 대비 이미지를 제공하는 PET 영상화제의 필요성으로 인해 다른 과제를 제시한다.
이러한 요구를 해결하기 위해, PD-L1-특이적 펩티드-기반 영상화제 [64Cu]WL12가 이전에 개발되었고, 종양 PD-L1 수준을 검출하는 이의 잠재성이 입증되었다(Kumar et al., 2019). 그러나, [64Cu]WL12는 친지성이며 간을 포함하는 여러 조직에서 높은 비-특이적 축적을 나타낸다(Kumar et al., 2019; Chatterjee et al., 2017). 영상화 특성을 개선하기 위해, 임상 번역을 용이하게 하기 위해 알루미늄 플루오라이드 방법을 사용하여 새로운 친수성 펩티드를 확인하고 방사성불소화된 유사체를 생성하였다.
DK221은 3개의 카르복실레이트 기 및 유리 리신 아민을 갖는 14개 아미노산의 인간 PD-L1-특이적 사이클릭 펩티드이다(Miller et al., 2016). DK221의 구조는 *로 주석이 달린 유리 리신 아민과 함께 본원 바로 아래에 제시된다:
Figure pct00027
방사성표지화를 위해 DK221을 변형시키기 위해, 이작용성 킬레이터, 예를 들어, NCS-MP-NODA를 유리 리신 아민에 컨쥬게이션시켜 DK222를 생성시켰다. NODA 킬레이터를 방사성플루오르화에 사용하여 [18F]DK222 뿐만 아니라 비-방사성 유사체 [19F]DK222를 생성시켰다(도 1A, 도 10 및 도 11). 경쟁적 PD-1:PD-L1 억제 검정을 수행하여 PD-L1에 대한 펩티드 유사체의 결합 친화성을 특성규명하였다. 펩티드 유사체는 DK221, DK222, 및 [19F]DK222에 대해 각각 24, 28, 및 25 nM의 IC50 값으로 PD-1에 대한 PD-L1 결합을 용량-의존적으로 억제하는 것으로 관찰되었다(도 1B). 알루미늄 플루오라이드(AlF) 방법에 의한 펩티드 및 소분자의 [18F]플루오라이드-방사선표지화는 합성의 용이성 및 결합 모이어티의 친수성을 유지할 잠재성으로 인해 주목을 받고 있다(McBride et al., 2010; Kumar et al., 2018). 방사성표지된 유사체 [18F]DK222는 AlF 방법에 의해 우수한 방사선화학 수율(34.85±1.7%, n=62), 시험관내 안정성, 및 284±56 mCi/μmol(10.51±2.07 GBq/μmol, n=25)의 중간 비활성으로 합성되었다. 제형화된 [18F]DK222는 제조된 방사능 농도에서 4시간 동안 안정한 것으로 밝혀졌다(도 12, 도 13 및 도 14).
PD-L1에 대한 [18F]DK222의 특이성을 평가하기 위해 세포 결합 검정을 수행하였다. 항시적 인간 PD-L1 발현을 갖는 CHO 세포(hPD-L1) 및 삼중 음성 유방암(TNBC)(MDAMB231, SUM149) 및 흑색종(LOX-IMVI, MeWo 및 A375) 기원의 다중 암 세포주를 선택하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 [18F]DK222와 함께 인큐베이션하고, 완전히 세척하고, 세포-결합 활성을 측정하였다. [18F]DK222의 흡수는 hPD-L1>LOX-IMVI>MDAMB231>Sum149의 순서로 흐름세포측정법에 의해 관찰된 표면 PD-L1 발현의 다양한 수준을 반영하였다(도 1C 및 도 1D). 낮은 PD-L1 수준을 발현한 A375, CHO, 및 MeWo 세포는 최소 [18F]DK222 결합을 나타내었다.
1 μM 과량의 모 DK221 펩티드의 존재 하에 결합 연구를 수행하여 PD-L1에 대한 [18F]DK222의 특이성을 검증하였다. PD-L1-양성 세포에서 방사능 흡수의 90% 초과 감소가 관찰되었다(P<0.0001). 종합하면, 이러한 시험관내 결과는 [18F]DK222 결합이 PD-L1에 특이적이라는 증거를 제공하였다.
1.1.2 TNBC의 마우스 모델에서 [ 18 F]DK222 생체분포의 평가. [18F]DK222의 PK 및 생체분포에 대한 통찰력을 얻기 위해, PD-L1-양성 MDAMB231 이종이식편을 보유하는 면역손상된 NSG 마우스에서 PET 영상화 연구를 수행하였다. [18F]DK222 주사 후 15, 60 및 120분에 획득된 PET 이미지는 15분만큼 일찍 종양에서 높은 방사성추적자 축적을 나타내었다(도 2A). 종양 이외에, 신장은 조사된 모든 시점에서 가장 높은 방사능 흡수를 나타내었다. 정상 조직으로부터의 빠른 제거와 조합된 종양에서의 [18F]DK222의 상기 높고 선택적인 흡수는 [18F]DK222 주사 후 60-120분에 고 대비 이미지를 제공하였다. 낮은 PD-L1 수준을 발현하는 SUM149 종양에서, 및 차단 용량(50 mg/kg)의 모 DK221 펩티드를 수용한 마우스에서 방사성추적자의 감소된 흡수가 관찰되었다.
방사선추적자 주사 후 5, 30, 60, 120, 240, 및 360분에 생체외 측정을 수행하여 영상화 연구를 검증하고 정상 조직에서 [18F]DK222 생체분포를 정량화하였다(표 1).
표 1. MDAMB231 이종이식편을 보유하는 NSG 마우스에서의 [18F]DK222 생체외 생체분포 연구.
Figure pct00028
[18F]DK222 흡수는 주사 후 4시간까지 종양에서 일관되게 높게 유지되었다(도 2B). 생체분포 데이터로부터 플롯팅된 시간 활성 곡선(도 2C)(조직의 그램 당 주사된 용량의 백분율로 표현됨[%ID/g])은 MDAMB231 종양에서 [18F]DK222의 높은 축적 및 보유를 나타내었다. [18F]DK222 흡수의 꾸준한 증가는 120분까지 종양에서 관찰되었고, 이어서 120분 내지 360분 사이에 느린 세척이 관찰되었다. PET 영상화와 일치하게, [18F]DK222의 흡수는 종양 및 신장에서 일관되게 더 높았다. 작은 펩티드는 종종 신장 제거를 나타내고, 관찰된 높은 신장 흡수는 [18F]DK222의 신장 제거를 나타낸다. 혈액, 근육, 및 높은 이미지 대비에 기여한 다른 모든 조직에서 시간이 지남에 따라 방사능의 꾸준한 감소가 관찰되었다. 60분에 종양-대-혈액 및 종양-대-근육 비는 각각 4.5±0.2 및 30.0±1.3이었다. 흉선, 폐, 간 및 뼈를 포함하는 초기 시점에 여러 조직에서 관찰된 높은 [18F]DK222 흡수는 60분 이내에 빠르게 제거되었다. SUM149 종양에서 [18F]DK222 흡수는 60분에 MDAMB231 종양에서 관찰된 것보다 88%(P<0.0001) 적었다. 또한, 차단 용량을 수용한 마우스는 [18F]DK222 흡수에서 79% 감소(P<0.0001)를 나타내었다. 또한, 다양한 비-방사성 용량의 투여는 용량-의존적 방식으로 MDAMB231 종양에서 흡수를 감소시켰지만, SUM149 종양 또는 다른 조직에서는 그렇지 않았다(도 15A-도 15C). 이러한 관찰은 각각 MDAMB231 및 SUM149 종양에서 관찰된 PD-L1에 대한 강한 면역반응성 및 약한 면역반응성에 의해 확인되었다(도 2D). 관찰된 높은 종양 흡수 및 높은 종양-대-혈액(및 근육) 비에 기초하여, 다른 종양 모델에서 모든 영상화 및 생체분포 연구는 하기 본원에 제공된 바와 같이 60분에 수행되었다.
1.1.3. 흑색종 이종이식편 모델에서 [ 18 F]DK222 특이성의 생체내 검증. 다음으로, 흑색종 모델에서 [18F]DK222의 PD-L1 특이성을 검증하였다. 높은 PD-L1 발현 LOX-IMVI 또는 낮은 PD-L1 발현 MeWo 흑색종 이종이식편을 보유하고 [18F]DK222가 주사된 NSG 마우스는 LOX-IMVI 종양에서 높은 방사능 축적을 나타내었다. [18F]DK222 흡수는 MeWo 종양 및 차단 용량의 비-방사성 펩티드를 수용한 마우스에서 낮았다(도 3A 및 도 3B, 도 16). PET 영상화 결과를 뒷받침하여, 60분에 수행된 생체외 측정 연구는 MeWo 종양에서 [18F]DK222 흡수가 LOX-IMVI 종양에 비해 95% 적은 것으로 나타났다(P<0.0001). 조직학적 분석은 LOX-IMVI 종양(상부 패널)에서 강한 PD-L1 면역반응성이 관찰되었지만 MeWo 종양(하부 패널)에서는 관찰되지 않은 PET 영상화 결과를 뒷받침하였다(도 3C).
유사한 결과가 또한 폐 및 방광암 모델에서 관찰되었다(도 8 및 도 9). 전반적으로, TNBC 및 흑색종 모델에서 생체내 영상화 및 생체외 측정은 PD-L1에 대한 [18F]DK222의 특이성 및 상이한 종양 유형에 걸쳐 가변적인 PD-L1 수준을 정량화하는 이의 잠재성에 대한 추가 증거를 제공하였다.
1.1.4. [ 18 F]DK222를 사용한 종양에서의 aPD-1 mAb의 약력학적 효과의 정량화. PD-1/PD-L1 경로는 조합 면역 체크포인트 차단 요법의 초석을 나타낸다(Topalian et al., 2015). 이러한 조합 요법의 다수는 PD-L1 수준과 불가분하게 연결된 IFNγ의 생산에 수렴된다(Minn and Wherry, 2016). PD-L1의 활성화는 TME에 의해 억제되거나 PD-1을 표적화하는 치료제에 의해 방출되는 강력한 세포용해 활성을 나타낸다(Topalian et al., 2015; Minn and Wherry, 2016). 고갈된 T 세포의 소생은 PD-1 치료제를 수용한 환자에서 빠르면 3주에 혈액에서 검출될 수 있다. 대조적으로, 종양에서의 이들의 활성은 잘 이해되지 않고 있다(Huang et al., 2019). 종양에서의 면역 소생은 종종 면역 세포의 세포용해 활성, IFNγ 분비, 및 종양 층에서 PD-L1 수준의 유도를 포함한다(Taube et al., 2012). 따라서, 임의의 하나의 특정 이론에 구속되기를 원하지 않고, 종양 PD-L1 수준은 PD-1 치료제의 약역학적 효과를 측정하기 위한 근위 바이오마커일 것으로 생각되었다. 따라서, 상이한 PD-1 치료제에 의해 유도된 종양 PD-L1 수준의 변화를 PD-L1 PET를 사용하여 정량화하고 이러한 측정을 면역학적 반응으로 확인하고자 하였다.
먼저, IFNγ 처리에 의해 유도된 PD-L1 수준의 변화를 평가함으로써 흑색종 세포에서 PD-L1 발현에 대한 적응 면역 반응의 효과를 조사하였다. IFNγ로 처리된 LOX-IMVI, A375, 및 MeWO 흑색종 세포를 PD-L1 수준의 변화에 대해 분석하였다. 흐름세포측정법 분석은 LOX-IMVI 및 A375 세포에서 각각 IFNγ 처리에 반응하여 PD-L1 수준의 2배 및 4배 증가를 나타내었다(도 17). MeWo 세포에서는 차이가 관찰되지 않았다.
인간화된 마우스 모델을 사용하여 상이한 aPD-1 mAb로의 치료에 대한 적응 면역 반응의 척도로서 종양 PD-L1 수준의 차이를 정량화하였다. A375 흑색종 이종이식편을 보유한 PBMC로 인간화된 NSG 마우스(huPBMC)를 단일 용량의 aPD-1 mAb(12 mg/kg)로 처리하였다. 처리 1주일 후, 종양 PD-L1 수준을 [18F]DK222-PET에 의해 및 24시간 후에 생체외 카운팅에 의해 측정하였다(도 4A). 대조군으로서, 식염수로 처리된 종양-보유 huPBMC 마우스 및 펨브롤리주맙 및 니볼루맙으로 처리된 NSG 마우스를 포함시켰다.
먼저, 인간화 및 비-인간화 마우스 사이의 종양에서 PD-L1 수준의 임의의 차이가 있는지 여부를 평가하였다. 모든 huPBMC 마우스에서 A375 종양은 면역 세포 활성을 나타내는 상승된 [18F]DK222 흡수를 나타내었다. 대조적으로, [18F]DK222 흡수는 huPBMC가 없는 NSG 마우스에서 낮았다(%ID/g 8.5 대 3.9; P=0.0002). 종양 섹션의 분석은 NSG에 비해 huPBMC 마우스에서 PD-L1 및 CD3에 대한 증가된 면역반응성을 나타내어, PET 연구 결과를 검증하였다. huPBMC 마우스의 신장 및 비장에서 증가된 [18F]DK222 흡수가 또한 NSG 마우스의 것과 비교하여 관찰되었다(도 18). 대조적으로, [18F]DK222 흡수의 유의한 차이는 근육과 같은 비특이적 조직에서 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 낮은 PD-L1 수준을 갖는 종양, 및 아마도 또한 면역 세포 배제를 갖는 종양을 구별하는 [18F]DK222의 잠재성을 나타내었다.
다음으로, 종양에서 상이한 aPD-1 치료제의 약역학적 효과를 평가하였다. 먼저, huPBMC 마우스에서 처리 그룹 사이의 종양 PD-L1 수준의 차이를 조사하였다. 특히, 비히클로 처리된 6마리의 huPBMC 마우스 중 3마리는 높은 [18F]DK222 흡수를 나타내었다. 대조적으로, aPD-1 mAb로 처리된 상당한 수의 마우스는 종양에서 약간의 가변성과 함께 높은 [18F]DK222 흡수를 나타내었다(도 4A 및 도 4B). PET 영상화 데이터를 검증하고 TME에서 요법 유도된 PD-L1 수준의 차이를 밝히는 경우, 생체분포 연구는 NSG 마우스에 비해 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 식염수로 처리된 마우스에서 각각 중간 [18F]DK222 흡수의 148, 85 및 76% 증가를 나타내었다(도 4C). aPD-1 mAb-처리된 마우스로부터의 종양 섹션의 분석은 관찰된 [18F]DK222를 반영하는 PD-L1 및 CD3에 대한 증가된 면역반응성을 나타내었다. 이러한 결과는 상이한 PD-1 치료제가 종양 PD-L1 수준의 변화로서 측정될 수 있는 종양에서 상이한 PD 효과를 발휘함을 나타낸다.
마우스로부터 종양을 추출하고, PD-L1 수준을 정량화하기 위해 흐름세포측정법 분석을 수행하여 관찰된 [18F]DK222 흡수가 실제로 PD-L1-특이적임을 검증하였다. 증가된 [18F]DK222 흡수 및 총 PD-L1 수준이 PD-1 치료 그룹에서 관찰되었으며, 이는 종양에서 CD45+CD8+ 면역 세포의 증가된 축적에 의해 뒷받침된다(도 4D, 도 4E 및 도 4F). 종양에서 [18F]DK222 흡수 및 총 PD-L1 수준(R2=0.80; P<0.0001, 도 4G) 및 종양 세포-특이적 PD-L1 수준(R2=0.71; P<0.0001) 사이의 강한 상관관계가 관찰되었다. 대조적으로, [18F]DK222 흡수와 면역 세포-특이적 PD-L1 수준 사이의 상관관계는 낮았는데, 이는 아마도 이 모델에서 TME에서 총 PD-L1 수준에 대한 면역 세포 PD-L1 수준의 작은 기여 때문일 것이다(R2=0.57; P<0.0001). 또한, 처리 그룹에서 종양에서 CD45+CD8+ 세포 축적이 증가한다. 비장에서의 [18F]DK222 흡수는 PD-L1 수준과 상관관계가 없었다. 이러한 데이터는 [18F]DK222 PET가 aPD-1 처리에 의해 유도된 PD-L1 역학을 정량화하는데 사용될 수 있음을 확립한다.
다음으로, [18F]DK222 흡수가 종양 층에서 aPD-1 mAb의 차등 효과를 정량화하는데 사용될 수 있다는 가설을 시험하기 위해, 통계적 분석을 위한 고정 효과 모델을 사용하여 종양 층에서 유도된 PD-L1 수준의 이질성을 정량화하였다. 고정 효과 모델에서, 둘 모두의 고정 aPD-1 mAb는 서로 비교될 특정 선택으로 생각된다. 니볼루맙 및 펨브롤리주맙 중 하나가 제공된 용량에서 시간 경과에 따라 PD-L1을 더 효과적으로 유도하는지 조사하였다. 각각의 aPD-1 mAb를 식염수와 비교하고, 차이를 표로 작성하였다. 동일한 용량으로 제공될 때, 니볼루맙 처리와 니볼루맙과 함께 펨브롤리주맙 처리 사이에 유도된 PD-L1 수준의 미묘하지만 통계적으로 유의하지 않은 차이가 이 모델 시스템에서 더 큰 PD-L1 발현을 초래하는 것으로 관찰되었다. 종합하면, 이러한 데이터는 종양 층에서 측정된 [18F]DK222가 처리 동안 초기에 상이한 aPD-1 mAb의 약역학적 효과를 비교하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
1.1.5. aPD-L1 처리 동안 접근 가능한 종양 PD-L1 수준의 정량화. [18F]DK222를 사용하여 접근 가능한 PD-L1 수준을 정량화하기 위해, 먼저, PD-L1 단백질과 펩티드 유사체 및 aPD-L1 mAb의 상호작용을 생물층 간섭계를 사용하여 연구하였다. PD-L1:펩티드 해리 상수는 aPD-L1 mAb의 것보다 적어도 100배 더 약한 것으로 밝혀졌다. 이러한 관찰은 사용된 추적자 농도(낮은 nM)에서, [18F]DK222가 항-PD-L1 요법을 방해하지 않을 것임을 시사한다. 세포-기반 시스템에서 이러한 관찰을 재현하기 위해, MDAMB231 및 LOX-IMVI 세포를 30분 동안 4℃에서 60 nM PD-L1 mAb의 존재 또는 부재하에 [18F]DK222와 함께 인큐베이션하고, 결합된 방사능을 측정하였다. 두 세포 유형 모두에서 mAb의 존재 하에 [18F]DK222 흡수에서 65% 초과의 감소가 관찰되었으며(P<0.0001), 이는 세포막 PD-L1 수준이 mAb에 의해 점유됨을 나타낸다(도 5A). 이러한 데이터는 [18F]DK222가 생체내에서 접근 가능한 PD-L1 수준을 정량화할 잠재성이 있고 처리 동안 접근 가능한 PD-L1 수준의 정량을 가능하게 할 수 있음을 나타낸다.
생체내 시험관내 관찰을 확인하기 위해, LOX-IMVI 종양을 보유하는 NSG 마우스를 [18F]DK222 주사 24시간 전에 볼루스로서 정맥내 투여되는 0.3 또는 20 mg/kg의 단일 용량의 아테졸리주맙으로 처리하였다(도 5B, 도 5C 및 도 5D). [18F]DK222 주사 60분 후에 획득된 PET 이미지는 비히클-처리된 대조군에서 종양에서 상당한 방사능 축적을 나타내었다. 대조적으로, 종양에서의 신호 강도는 20 mg/kg의 mAb를 수용한 마우스에서 유의하게 감소하였다(도 5C 및 도 5D). 중요하게는, 낮은 0.3 mg/kg 용량의 아테졸리주맙이 사용될 때 신호 강도의 적당한 감소가 있었다. 생체외 연구는 비히클-처리된 마우스와 비교하여 20 및 0.3 mg/kg의 아테졸리주맙으로 처리된 마우스에서 종양에서 각각 [18F]DK222 흡수의 89%(P<0.0001) 및 32%(P<0.01) 감소를 나타내었으며, 이는 종양에서 상이한 접근 가능한 PD-L1 수준을 나타낸다(도 5D, 도 19). 종합하면, 이러한 시험관내 및 생체내 결과는 접근 가능한 종양 PD-L1 수준을 측정하고 약물 치료에 의해 포화되지 않은 병변을 확인하기 위한 [18F]DK222 PET의 잠재성을 입증한다.
1.1.6. 접근 가능한 종양 PD-L1 수준은 종양 층에서 aPD-L1 mAb의 PK 및 PD 효과에 대한 통찰력을 제공한다.
TME에서 PD-L1을 표적화하는 상이한 mAb의 효과는 특성규명되지 않은 채로 남아 있는 상이한 PK 및 PD로 인해 이질적일 수 있다. [18F]DK222는 접근 가능한 PD-L1에 결합할 수 있으므로, [18F]DK222 PET 신호는 PD-L1이 접근 불가능한 상태로 유지되는 정도를 나타낼 수 있고: 신호가 낮을수록 PD-L1 mAb 표적화 효율이 더 우수하다. 면역요법의 시험 라운드 동안 mAb의 PK 및 PD에 대해 얻은 통찰력은 치료를 위한 특정 mAb의 선택을 추가로 안내할 수 있다.
이 실험의 목적은 상이한 mAb의 결합에서 이질성을 검출하기 위한 [18F]DK222의 잠재성을 평가하여, 원칙적으로 이것이 치료에 이용 가능한 다수의 mAb 사이의 선택을 안내하는데 사용될 수 있음을 입증하는 것이었다. 이 실험을 위해, 3개의 mAb가 선택되었고(아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙)(Yu et al., 2019), 니볼루맙은 선험적 음성 대조군으로 사용되었다. 별도의 동물 그룹에 단일 1 mg/kg 용량의 이러한 mAb 중 (단지) 하나를 주사하고, 24시간 또는 96시간 후, 각 그룹에 [18F]DK222를 주사하고, 영상화하거나 희생시키고, [18F] DK222 신호를 정량하였다(도 6A). 임의의 PD-L1 mAb 대 니볼루맙 사이의 24시간에 더 낮은 [18F]DK222 신호의 차이는 PD-L1 mAb의 포화 결합을 구성한다. 반면에, 96시간에서의 더 높은 [18F]DK222 신호 대 24시간에서의 신호는 이의 결합 부위로부터 mAb의 손실을 나타내며, 이는 더 많은 PD-L1이 [18F]DK222에 접근 가능하게 한다. 실험을 2개의 상이한 종양 모델: LOXIMVI 및 MDAMB231에서 반복하였다.
LOX-IMVI 종양-보유 마우스의 PET 이미지는 24시간 동안 aPD-L1 mAb로 처리된 모든 그룹에서 [18F]DK222의 유의한 감소를 나타내었다. 대조적으로, 니볼루맙-처리된 동물에서 [18F]DK222 흡수는 비히클 처리의 흡수와 유사하였다. [18F]DK222 흡수의 유의한 증가는 아테졸리주맙 및 아벨루맙으로 처리된 마우스의 종양에서 96시간에 관찰되었지만, 두르발루맙으로 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다(도 6B). 24 및 96시간에 니볼루맙-처리된 마우스에서 [18F]DK222 흡수는 유의하지 않았으며, 이는 흡수가 aPD-L1 mAb 처리에 특이적임을 시사한다. 이러한 관찰을 검증하기 위해 추가 분석을 수행하였다.
치료 mAb 결합의 이질성을 정량화하기 위한 2개의 상이한 통계적 분석 전략을 사용하여 [18F]DK222 흡수가 aPD-L1 mAb의 차등 효과를 정량화하는데 사용될 수 있다는 가설을 시험하였다. 먼저, 무작위 효과 모델에서, 선택된 3개의 mAb는 이용 가능한 다양한 mAb의 무작위 샘플링으로 간주되었다. 이 실험은 다음 질문에 답하기 위해 설계되었다: "[18F]DK222 신호에서 얼마나 많은 분산이 (a) 상이한 mAb가 존재한다는 사실, 또는 (b) 이들 mAb가 각각 활성 치료로서 이들 모두를 함께 덩어리화하는 것과 대조적으로 24 내지 96시간에서 상이한 동역학을 가질 수 있음에 의해 설명될 수 있는가?" 이 질문에 답하기 위해, 3개의 aPD-L1 mAb를 무작위 효과로서 선택하고, PD-L1 mAb 대 불활성 mAb, 시점, 및 시점 사이의 활성 치료의 전체 차이를 고정 효과로 선택하였다. 무작위 및 고정 효과는 혼합 선형 회귀 모델에서 공동으로 추정되고, 이질성의 척도는 "클래스내 상관 계수(intraclass correlation coefficient; ICC)"에 의해 정의된다.
ICC는 상이한 활성 mAb로 인한 총 분산의 분율(또는 백분율)을 정량화한다. ICC는 0 내지 1(0 내지 100%)의 범위일 수 있고, ICC가 클수록 다양한 aPD-L1 mAb 사이에서 예상되는 PD 및 PK의 변동이 더 크다. LOX-IMVI 종양에서 무작위 PD-단독 효과 모델의 ICC는 0.23(대 무작위 효과 없음 p-값 = 8.9 × 10-5)이며, 이는 [18F]DK222 신호에서 23%의 분산(%ID/g)이 PD-L1 점유율의 차이에서 비롯됨을 나타낸다. 무작위 PD-PK 효과 모델의 ICC는 0.36(대 무작위 효과 없음 p-값 = 3 × 10-6; 대 무작위 PD 모델 p-값 = 0.0014)이며, 이는 [18F]DK222에서 36%의 분산(%ID/g)이 종양 층에서 상이한 mAb의 상이한 PD 및 PK에서 비롯됨을 나타낸다. 유사하게, MDAMB231 종양 모델에서, 무작위 PD-단독 효과 모델의 ICC는 0.54(대 무작위 효과 없음 p-값 = 0)이다. 무작위 PD-PK 효과 모델의 ICC는 0.77(대 무작위 효과 없음 p-값 = 0; 대 무작위 PD 모델 p-값 = 0)이며, 이는 MDAMB231에서 77%의 분산(%ID/g)이 종양 층에서 상이한 mAb의 상이한 PD 및 PK에서 비롯됨을 나타낸다(도 20).
둘째로, 고정 효과 모델에서, 3개의 고정 PD-L1 mAb 각각은 서로에 대해 비교될 특정 선택으로 생각된다. 질문: "아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 두르발루맙 중 어느 것이 시간 경과에 따라 PD-L1에 특이적으로 더 효과적으로 맞물림되는가?"를 조사하였다. 이러한 실용적인 질문에 답하기 위해, 각 PD-L1 mAb(특이적 포화 PD), 각 시점(전체 PK, 24 및 96시간), 및 각각의 mAb*시간 조합(mAb-특이적 PK)은 고정 효과로 간주되었고, 일반적인 선형 회귀 모델에서 함께 추정되었다. 이 분석의 결과는 (a) 니볼루맙에 비해 24시간에 PD-L1 mAb 각각에 대한 접근 가능한 PD-L1 수준의 차이(%ID/g), 및 (b) 니볼루맙에서의 96-대-24시간 차이에 비한 특정 mAb에 대한 96시간 대 24시간에서의 접근 가능한 PD-L1 수준에서의 차이로 제공된다.
상이한 mAb 및 시점으로 처리된 마우스의 LOX-IMVI 종양 및 조직에서의 [18F]DK222 흡수는 도 6C에 제시되어 있다. 24시간에서의 평균 LOX-IMVI 종양 %ID/g은 니볼루맙 대조군에서 높았고(대략 20% ID/g), 24시간 대 96시간 사이에 변화가 매우 적었다(도 6C). 대조적으로, 24시간에, 모든 PD-L1 mAb는 니볼루맙보다 유의하게 더 낮은 평균 종양 %ID/g을 가졌다. 96시간에서의 접근 가능한 PD-L1 수준은 처리 24시간에서 관찰된 것보다 아테졸리주맙 및 아벨루맙 그룹에서 60 내지 80% 더 높았다(P<0.001). 그러나, 두르발루맙에 대한 접근 가능한 PD-L1 수준은 70% 이상 감소하였고, 96시간 대 24시간에서 유사하였으며, 이는 두르발루맙에 의한 PD-L1의 장기간 맞물림을 시사한다. 이러한 관찰은 MDAMB231 이종이식편 모델에서 검증되었다(도 6D).
요약하면, 무작위 및 고정 효과 모델은 PD-L1 mAb가 시간 경과에 따라 접근 가능한 PD-L1 수준에 영향을 미치는 차별적인 PK 및 PD를 종양 층에서 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 종양 부위에서 mAb의 약리학적 활성에 대한 통찰력을 얻기 위해 접근 가능한 표적 수준을 정량화하는 PET의 잠재성을 분명히 입증한다.
1.2 논의
방사성핵종과 컨쥬게이션된 mAb는 이들의 생체분포 및 표적 발현에 대한 통찰력을 얻기 위해 일상적으로 사용된다. 거의 26개의 이러한 제제가 임상 시험 중이다(De Vries et al., 2019). PD-L1 발현을 검출하기 위해 다양한 mAb, mAb-컨쥬게이트, 및 작은 단백질이 개발되었다(Josefsson et al., 2015; Maute et al., 2015; Chatterjee et al., 2016; Truillet et al., 2017; De Silva et al., 2018; Jagoda et al., 2019; Vento et al., 2019; Wissler et al., 2019; Hettich et al., 2016; Donnelly et al., 2018).
최근에, Zr-89-표지된 아테졸리주맙을 이용한 연구는 PD-L1 발현에서 종양내 및 종양간 이질성을 정량화하기 위한 PET의 잠재성을 강조하였다(Bensch et al., 2018). 이러한 발전에도 불구하고, 고 대비 이미지를 제공하고 표준 임상 워크플로우와 양립 가능한 영상화제가 필요하다. 이러한 고-대비 이미지는 종종 펩티드 및 저분자량 PET 제제에서 관찰된다.
본원에 개시된 주제는 [18F]DK222 펩티드가 보고된 PD-L1 영상화제와 상이한 PK 및 생체분포 특징을 나타낸다는 것을 부분적으로 입증한다(Bensch et al., 2018; Maute et al., 2015; Chatterjee et al., 2016; Truillet et al., 2017; De Silva et al., 2018; Jagoda et al., 2019; Donnelly et al., 2018; Lesniak et al., 2019; Heskamp et al., 2019; Ehlerding et al., 2019; Kikuchi et al., 2017; Chatterjee et al., 2017; Broos et al., 2017; Josefsson et al., 2016; Natarajan et al., 2015; Heskamp et al., 2015).
또한, [18F]DK222는 일상적인 임상 사용에 필요한 모든 두드러진 특징을 갖는다: 1) PD-L1 수준의 동적 변화를 정량화하기 위한 높은 친화성 및 특이성; 2) 보고된 단백질-기반 영상화제와 비교하여 다루기 쉬운 PK 및 많은 종양 유형에 걸쳐 이의 사용을 가능하게 하는 정상 조직에서의 낮은 비-특이적 축적; 3) 표준 임상 워크플로우 내에 맞추기 위해, 방사선추적자 투여 60분 이내에 적합한 이미지 대비; 및 4) 전립선-특이적 막 항원 및 케모카인 수용체 4를 검출하는데 사용되는 것과 같은 다른 현저한 PET 영상화제와 유사한 인간 선량측정 추정치(Szabo et al., 2015; Herrmann et al., 2015).
종양에서 방사성표지된 mAb 축적은 요법에 대한 종양 반응을 나타낼 수 있다. 여러 날의 방사성추적자 주사 후 획득된 종양에서 [89Zr]아테졸리주맙 신호는 IHC 및 RNA 시퀀싱-기반 예측 바이오마커보다 아테졸리주맙 요법에 대한 종양 반응의 더 나은 예측인자인 것으로 밝혀졌다(Bensch et al., 2018). 그러나, 계속 확장되는 PD-1/PD-L1 치료 개발 분야에서, mAb 치료제 간의 일대일 비교를 위한 또는 종양에서의 이들의 분포 및 활성의 차이에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위한 [89Zr]mAb 영상화는 임상 번역에는 비실용적이다(Yu et al., 2019).
[18F]DK222와 같은 고친화성 및 더 빠른 약동학을 갖는 방사성의약품이 기준선 PD-L1 수준 정량화를 넘어 요법 안내에 유용할 수 있음이 본원에서 입증된다. 상이한 aPD-L1 mAb의 동일 반응계 약리학적 활성을 평가하기 위한 이러한 측정의 잠재성은 사용된 전임상 모델에서 다른 aPD-L1 mAb와 비교하여 두르발루맙에 의한 연장된 표적 맞물림을 발견함으로써 나타난다. 중요하게는, 이러한 PD 측정은 PD-L1 수준 및 전환, 종양에서 이러한 mAb의 복잡한 혈청 및 종양 동역학(또는 운명), 및 mAb 침투 및 축적을 방해하는 높은 간질압 및 불량한 혈관과 같은 종양-내재 파라미터를 포함하는 항체 농도에 영향을 미치는 다수의 인자를 캡슐화한다. 또한, 이들 3개의 mAb는 별개의 PK[아테졸리주맙(아이소타입 IgG1κ; K D , 0.4 nM; t 1/2 , 27일), 아벨루맙(IgG1λ, 0.7 nM, 6.1일), 및 두르발루맙(IgG1κ, 0.022 nM, 18일)]을 나타내고, 이들 mAb의 종양 체류 동역학은 순환 반감기 프로파일을 반영하지 않지만 PD-L1에 대한 mAb 친화성을 반영한다(Tan et al., 2017).
본 연구의 접근법 및 발견은 또한 치료 요법을 개선하고 약물 개발 및 평가에 잠재적인 의미를 갖는다. 예측 컴퓨터 모델은 mAb의 임상 개발 및 투여에 일상적으로 사용된다(Agoram, 2007; Agoram, 2009). 그러나, 이러한 기계론적 모델에 기반한 개인화된 암 치료는 사용된 전임상 정보 및 전임상 실험과 환자 사이의 번역 가능성의 부족으로 인해 편향될 수 있다. 여기에 제시된 비-침습적 측정은 그 다리를 형성할 수 있다. 또한, 다양한 차세대 mAb 치료제, 예를 들어, TME에서 특이적으로 활성화되는 프로바디(probodies)(Giesen et al., 2019), 및 다중 표적에 대한 동시 결합을 촉진함으로써 더 높은-결합력 결합을 가능하게 하는 다중-특이적 mAb 컨쥬게이트(Lan et al., 2018)의 출현은 전통적인 인 실리코(in silico) 모델과 상이한 PK를 나타낼 가능성이 있으며, 종양에서 이들의 약리학적 활성을 고려하는 종양에서 약역학적 효과를 측정하는 것과 같은 새로운 접근법을 필요로 할 것이다.
DK222는 보다 친수성인 펩티드이고 WL12를 포함하는 다른 보고된 펩티드와 생체내 분포에서 유의하게 다르다는 것을 주목하는 것이 중요하다. WL12는 친지성으로 인해 여러 조직에서 높은 간, 신장 및 비특이적 축적을 나타낸다. 방사성추적자 주사 120분 후에 MDAMB231 종양에 대한 [64Cu]WL12에 대한 종양-대-혈액 및 종양-대-근육 비는 각각 12.9+2.1 및 2.72+0.45였다. 대조적으로, [18F]DK222에 대한 종양-대-혈액 및 종양-대-근육 비는 각각 35.69+3.89 및 9.45+0.51이다(비활성: 250 mCi/μmole). 종양 이외에, 높은 방사능 흡수는 [18F]DK222의 제거와 관련된 기관인 신장에서만 관찰된다. 이러한 높은 종양 흡수 및 낮은 배경 조직 흡수는 고 이미지 대비 PD-L1 특이적 이미지를 초래한다.
또한, 본원에 개시된 DK222는 또한 이전에 보고된 펩티드 유사체와 상이하게 방사성 표지된다(즉, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2017년 11월 23일에 공개된 PET-IMAGING IMMUNOMODULATORS, Donnelly et al.의 국제 PCT 특허 출원 공개 번호 WO/2017/201111호(PCT/US2017/033004호)). DK221의 리신 ε-아민은 NHS 에스테르 방법을 사용하여 이작용성 킬레이터 컨쥬게이션에 사용되며, 펩티드 합성 동안 글리신을 혼입하거나 컨쥬게이션을 위한 가혹한 조건을 사용하는 것을 필요로 하는 아미노아세트아미드 말단에 대한 모든 컨쥬게이션을 수행하는 이전에 사용된 방법보다 온화한 조건을 필요로 한다.
[18F]AlF-기반 방사성표지화의 사용은 특별한 장비를 필요로 하지 않고 60분 이내에 달성될 수 있는 1-단계 방사성표지화 절차를 용이하게 한다. AlF 방사성표지화 전략은 또한 관찰된 고 대비 이미지에 필요한 분자의 친수성을 온전하게 유지한다. AlF 방사성표지화가 NOTA 또는 NODAGA 유사체로 이전에 보고되었지만, 본 발명자는 PD-L1 영상화제의 개발에 적용된 기존 방사성표지화 전략에 비해 이점을 추가로 제공하는 설명된 NODA 유사체에 의한 더욱 강력하고 일관된 방사성플루오르화를 관찰하였다.
AlF를 Pyl 방사성표지화 전략([18F]DK221-Py)으로 대체하면 분자의 PK가 변화하고, 설명된 영상화제의 개발을 위한 최적의 선택으로서 알루미늄 플루오라이드 방사성표지된 NODA 컨쥬게이션된 DK221의 중요성을 강조하는 불량한 이미지 대비가 초래된다. 원하는 대비를 달성하기 위해 PEG 또는 다른 링커의 첨가에 의해 [18F]DK221-Py의 생체내 약동학 및 생체분포를 추가로 조절할 수 있다.
1.3 재료 및 방법
1.3.1 화학 물질. DK221은 >95% 순도로 CPC Scientific(Sunnyvale, CA)에 의해 맞춤 합성되었다. (2,2'-(7-(4-이소티오시아네이토벤질)-1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산)(NCS-MP-NODA)은 CheMatech Macrocycle Design Technologies(카탈로그 # C110; Dijon, France)에서 구입하였다. 다른 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich 또는 Fisher Scientific에서 구입하였다.
1.3.2. 세포 배양 시약 및 항체. 모든 세포 배양 시약은 Invitrogen(Grand Island, NY)에서 구입하였다. aPD-L1 mAb(아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 두르발루맙) 및 aPD-1 mAb(니볼루맙 및 펨브롤리주맙)는 Johns Hopkins School of Medicine Pharmacy에서 구입하였다.
1.3.3 DK222의 합성. DK221은 서열 사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(카르복시메틸)-NMeNle-NMeNle-Lys-Cys-)-Gly-NH2를 갖는 14개 아미노산 사이클릭 펩티드이다. 이는 이전에 펩티드 6297로 보고되었다(Miller et al., 2016). DK221의 NODA 컨쥬게이션된 유사체 (사이클로-(-Ac-Tyr-NMeAla-Asn-Pro-His-Glu-Hyp-Trp-Ser-Trp(카르복시메틸)-NMeNle-NMeNle-Lys(NODA_NCS[18F]AlF)-Cys-)-Gly-NH2)를 하기와 같이 제조하였다. 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK221(4.0 mg, 2.04 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 NCS-MP-NODA(1.6 mg, 4.07 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 30분 내에 50-90% 메탄올(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)이었다. 요망되는 DK222를 15.5분에 수집하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 탈이온수에서 재구성하고, 65% 수율로 분말로 동결건조시켰다. 정제된 DK222는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)으로 특성규명하였다. 계산된 [M+H]+: 2348.68, 관측치: 2349.06(도 10 및 도 11).
1.3.4 [ 19 F]DK222의 합성. 2 mL NaF(1M, 0.5M NaOAc 중, pH 4) 및 2 mL AlCl3(0.2M, 0.5M NaOAc 중, pH 4)의 용액을 20 mL 바이알에서 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이 바이알에, DK222의 제조된 용액(5 mg, 2.12 μmoles, 200 μL의 아세토니트릴 및 100 μL의 0.5M NaOAc 중, pH 4)을 첨가하고 110℃에서 35분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 총 부피의 절반으로 증발시켰다. 반응 혼합물을 3개 시리즈(three-in-series)의 사전-활성화된 Sep-Pak plus C18 Cartridges에 로딩하고, 후속하여 5mL 물(x5)로 세척하였다. 요망되는 [19F]DK222를 물 중 50% 아세토니트릴(5 mL x 5)로 용리시켰다. 수집된 분획을 조합하고, 회전증발 하에 농축시키고, 물 중 20% 아세토니트릴에서 재구성하고, 동결건조시켜 80% 수율로 회백색 분말을 형성하였다. 생성된 순수한 생성물을 MALDI-TOF로 특성규명하였다. 계산된 [M=H]+: 2392.65, 관측치: 2393.03. 순수한 [19F]DK222 복합체는 이후, 방사성표지화, 및 PD-L1 및 PD-1 경쟁 결합 검정을 위한 표준으로서 RP-HPLC 조건을 최적화하는데 사용되었다. [19F]DK222의 HPLC 크로마토그램 및 질량 분광분석은 도 10 및 도 11에 나타나 있다.
Figure pct00029
반응식 1. [19F]DK222의 비-방사성 합성.
1.3.5. MALDI-TOF 분석. DK222의 MALDI-TOF 스펙트럼 및 이의 전구체는 Johns Hopkins University Mass Spectrometry 코어 시설에서 이용 가능한 Voyager DE-STR MALDI-TOF에서 획득하였다. 간략하게, 샘플을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 유닛(카탈로그 UFC901008)을 사용하여 0.1% TFA를 갖는 물에서 평형화시켰다. 샘플을 40% 아세토니트릴 및 0.1% TFA에 용해된 10 mg/ml 시나핀산(3,5-디메톡시-4-하이드록시신남산) 매트릭스와 혼합하였다(1:2 희석). 1 μL의 이러한 샘플을 MALDI 플레이트(Applied Biosystems)에서 4중으로 스포팅하고 공기 건조시킨 후 최적화된 기기 설정을 사용하여 스펙트럼을 획득하였다. Applied Biosystems Data Explorer 소프트웨어 버전 4.8을 사용하여 데이터를 분석하였다.
1.3.6 [ 18 F]DK222 방사성약제학적 제조물. JHU PET Center 사이클로트론으로부터 받은 [18F] 플루오라이드(비-담체 첨가됨)를 사전컨디셔닝된 Chromafix 30-PS-HCO3 카트리지에 포획하였다. 이후, 카트리지를 금속-비함유 물(5 mL)로 세척하였다. 18F를 100 μL의 0.4 M KHCO3로 카트리지로부터 용리시켰다. 용액의 pH를 10 μL의 금속-비함유 빙초산으로 대략 4로 조정한 다음, 20 μL의 0.1M 소듐 아세테이트 완충액(pH 4) 중 2mM AlCl3.6H2O를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2-4분 동안 인큐베이션하여 Al18F 복합체를 형성하였다. 전구체 DK222(대략 100 마이크로그램, 42 nmoles)를 300 μL의 아세토니트릴 및 NaOAc의 2:1 용액(0.1M, pH 4)에 용해시킨 다음, Al18F를 함유하는 바이알에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 110℃에서 15분 동안 가열하였다. 이후, 반응 바이알을 실온으로 냉각시키고 400 μL DI 물로 희석하였다. 방사성표지된 생성물을 함유하는 획득된 수용액을 Agilent Technology 1260 Infinity 포토다이오드 어레이 검출기(Agilent Technologies, Wilmington, DE)를 갖는 RP-HPLC 시스템(Varian ProStar)에서 정제하였다. 반-분취용 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 50% 메탄올(0.1% TFA)로 출발하고 공용매로서 물(0.1% TFA)과 함께 5 mL/분의 유량에서 30분 내에 90%의 메탄올에 도달하는 구배 용리와 함께 사용하였다. 대략 16.2분의 체류 시간에서 용리된 방사성표지된 생성물 [18F]DK222를 수집하고, 고진공 하에 증발시키고, 10% EtOH를 함유하는 식염수로 제형화하고, 멸균 여과하고, 시험관내 및 생체내 평가에 사용하였다. 방사선화학적 순도, 화학적 동일성, 및 시험관내 안정성 HPLC 크로마토그램은 도 11A-도 11C에 제시되어 있다.
Figure pct00030
반응식 2. [18F]DK222의 방사선합성.
1.3.7 세포 배양. 시험관내 및 생체내 평가를 위해 7개의 세포주를 사용하였다: MDAMB231 및 SUM149(삼중 음성 유방암), LOX-IMVI, MeWo 및 A375(흑색종), CHO, 및 PD-L1을 항시적으로 발현하는 CHO 세포(hPD-L1). MDAMB231, MeWo, A375, 및 CHO 세포를 American Type Culture Collection에서 구입하고 권장된 대로 배양하였다. PD-L1(hPD-L1)을 항시적으로 발현하는 CHO 세포를 본 발명자의 실험실에서 생성하고 전술한 바와 같이 배양하였다(Chatterjee et al., 2016). SUM149 세포주는 Dr. Stephen Ethier로부터 획득하였고, LOX-IMVI 세포주는 NCI 발달 치료 프로그램으로부터 획득하였다. 모든 세포주는 Johns Hopkins 유전 자원 시설에서 STR 프로파일링에 의해 인증되었다. SUM149 세포를 5% FBS, 1% P/S 및 5 μg/mL 인슐린, 및 0.5 μg/mL 하이드로코르티손을 갖는 Ham's F-12 배지에서 유지시켰다. 모든 세포주를 5% CO2를 함유하는 대기에서 37℃의 인큐베이터에서 권장 배지에서 배양하였다. 단백질 발현에 사용된 인간 배아 신장(HEK) 293F 세포(Thermo Life Technologies)를 5% 주위 CO2와 함께 37℃에서 0.01% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 FreeStyle 293 발현 배지(Thermo Life Technologies)에서 현탁액으로 유지하였다.
1.3.8 흐름세포측정법에 의한 PD-L1 발현의 검출. 세포를 4℃에서 30분 동안 Cy5-아테졸리주맙을 갖는 100 μL PBS에서 2x105 세포의 직접 염색에 의해 PD-L1 표면 발현에 대해 평가하였다. Cy5-아테졸리주맙을 전술한 바와 같이 제조하였다(Kumar et al., 2019). 이후, 세포를 세척하고 흐름세포측정법에 의해 평균 형광 강도(MFI)에 대해 분석하였다. 부착성 세포를 효소-비함유 세포 해리 완충액(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 분리하였다.
1.3.9 [18F]DK222를 이용한 시험관내 결합 검정. hPD-L1 MDAMB231, MeWo, A375, Sum149, 및 CHO 세포에 대한 [18F]DK222의 시험관내 결합은 4℃에서 30분 동안 1 μM의 DK222 또는 60 nM mAb의 존재 또는 부재 하에서 대략 0.1 μCi의 [18F]DK222와 함께 1×106개 세포를 인큐베이션함으로써 결정되었다. 인큐베이션 후, 세포를 0.1% Tween20을 함유하는 빙냉 PBS로 3회 세척하고, 자동화 감마 계수기(1282 Compugamma CS, Pharmacia/LKBNuclear, Inc., Gaithersburg, MD)에서 계수하였다. [18F]DK222의 PD-L1-특이적 결합을 입증하기 위해, 1 μM의 비변형 펩티드 DK221로 차단을 수행하였다. 모든 세포 방사능 흡수 연구를 각 세포주에 대해 4중으로 수행하고 3회 반복하였다.
1.3.10. 생체내 연구. 모든 마우스 연구는 Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee(ACUC) 승인 프로토콜을 통해 수행되었다. Johns Hopkins University Immune Compromised Animal Core로부터 획득된 5 내지 6주령의 수컷 또는 암컷, 비-비만, 당뇨병, 중증-결합 면역결핍 감마(NSG) 마우스에서 이종이식편을 확립하였다. huPBMC 마우스를 Jackson(JAX) 연구소에서 구입하여 그대로 실험에 사용하였다.
1.3.11 이종이식편 모델. 마우스에 입 끝에 MDAMB231(2x106, 동소), SUM149(5x106, 동소), LOX-IMVI(5x106, 피내), MeWo(5x106, 피내), 또는 A375(2 ×106, 피내) 세포를 이식하였다. 2개의 세포주가 마우스의 우측에서 높은 PD-L1을 발현하는 세포주와 함께 사용되는 경우 세포를 반대쪽 옆구리에 접종하였다. 200-400 mm3의 종양 부피를 갖는 마우스를 치료, 영상화, 또는 생체분포 실험에 사용하였다.
1.3.12 마우스 이종이식편의 PET-CT 영상화. [18F]DK222의 생체내 분포 및 약동학을 결정하기 위해, 여러 시점에서 PET 이미지를 획득하였다. MDAMB231 종양을 갖는 마우스에 200 μL의 식염수 중 약 200 μCi(7.4 mBq)의 [18F]DK222를 정맥내 주사하고(n = 3), 스캐너에 놓기 전에 3% 이소플루오란 하에 마취시켰다. 설명된 바와 같이 ARGUS 작은-동물 PET/CT 스캐너(Sedecal, Madrid, Spain)에서 5분/층에서 2개의 층 위치에서 방사성추적자 주사 후 15, 60 및 120분에 PET 이미지를 획득하였다(Lesniak et al., 2016). CT 스캔(512개 투영)은 해부학적 공동-등록을 위해 각각의 PET 스캔의 끝에 수행되었다. PET 데이터를 2차원 정렬된 서브셋-기대 최대화 알고리즘(2D-OSEM)을 사용하여 재구성하고 데드 타임 및 방사성 붕괴에 대해 보정하였다. cc 당 %ID 값은 공지된 방사성 양으로부터 획득된 보정 인자에 기초하여 계산되었다. 이미지 융합, 시각화, 및 3D 렌더링은 Amira 6.1®(FEI, Hillsboro, OR)을 사용하여 달성되었다. 다른 모든 종양 모델에서 방사성추적자 주사 후 60분(1개 또는 2개의 층, 5분/층)에 PET 또는 PET/CT 이미지를 획득하였다.
본원에 보고된 다른 모든 PET 영상화 연구의 경우, 마우스는 200 μL의 식염수 중 대략 200 μCi(7.4 mBq)의 [18F]DK222를 정맥내 투여하고, PET 또는 PET/CT 이미지를 ARGUS 작은-동물 PET/CT 스캐너에서 5분/층에서 주사 후 60분에 획득하였다.
1.3.13 생체외 생체분포. 영상화 연구를 검증하기 위해, 설명된 바와 같이 인간 종양 이종이식편(MDAMB231, Sum149, LOX-IMVI, 및 MeWo)을 보유하는 마우스에서 생체외 생체분포 연구를 수행하였다(Lesniak et al., 2016). MDAMB231 종양을 보유하는 마우스에 50 μCi(1.85 MBq)의 [18F]DK222)을 정맥내 주사하고, 주사 후 5, 30, 60, 120, 240 또는 360분에 조직을 수확하였다. 다른 모든 종양 모델에서 [18F]DK222 주사 60분 후에 생체분포 연구를 수행하였다. 차단 연구를 위해, 2 mg/kg(50 μg)의 비변형 펩티드를 방사성추적자와 공동주사하였다. 방사선 선량측정 계산을 용이하게 하기 위해, 수확된 조직은 종양, 혈액, 흉선, 심장, 폐, 간, 위, 췌장, 비장, 부신, 신장, 소장 및 대장, 난소, 자궁, 근육, 대퇴골, 뇌, 및 방광을 포함하였다. 수확된 조직을 칭량하고 자동화 감마 계수기(Perkin Elmer - 2480 Automatic Gamma counter - Wizard2 3" Wallac, Waltham, MA)에서 계수하고, 조직 그램 당 주사된 용량의 백분율(%ID/g) 값을 신호 감쇠 보정 및 삼중으로 측정된 외부 [18F] 표준에 대한 표준화에 기초하여 계산하였다. 제시된 생체분포 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)이다.
본원에 보고된 다른 모든 생체분포 연구의 경우, 마우스는 200 μL의 식염수 중 약 50 μCi(1.85 mBq)의 [18F]DK222를 정맥내로 투여하고, 생체분포 연구를 [18F]DK222 주사 60분 후에 수행하였다. 선택된 조직(종양, 혈액, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 소장, 및 근육)을 수집하고, 칭량하고, 계수하고, 이들의 %ID/g 값을 계산하였다.
1.3.14 aPD-1 mAb 투여 연구. JAX 실험실로부터 획득된 huPBMC 마우스에 입쪽 말단에 2x106 A375 세포를 피하 이식하였다. 세포 접종 7일 후에(평균 종양 부피 = 80±15 mm3), 마우스를 무작위화하고 정맥내 주사되는 단일 12 mg/kg 용량의 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙으로 처리하였다(n=9/그룹). 식염수로 처리된 huPBMC 마우스(n=4-5/그룹) 또는 12 mg/kg 용량의 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙으로 처리된 NSG 마우스를 대조군으로 사용하였다. 처리 7일 후에, 그룹 당 적어도 3-5마리의 마우스에서 [18F]DK222 PET 스캔을 획득하였다. 마우스를 처리 8일 후 및 PET 영상화 24시간 후에 생체분포 연구에 사용하고, 데이터를 설명된 바와 같이 처리하였다. 수확된 종양을 반으로 절단하고, 흐름세포측정법 분석 또는 PD-L1 및 CD3에 대한 IHC 분석에 사용하였다.
1.3.15 흐름세포측정법 분석. 생체외 생체분포 분석 후, 종양 및 비장을 4℃에서 밤새 MACS 조직 저장 용액(Miltenyi Biotec #130-100-008)에 저장하였다. 종양 및 비장은 다음 날 제조업체의 설명서에 따라 해리시켰다(Miltenyi Biotec 130-095-929). 간략하게, 각각의 이종이식편 및 비장을 3-4 mm의 작은 조각으로 절단하였다. 각각의 종양에 대해, 절단 조각을 100 μL 효소 H, 50 μL 효소 R, 및 12.5 μL 효소 A를 함유하는 2.5 mL RPMI-1640 배지에 현탁시켰다. 각각의 비장에 대해, 절단 조각을 50 μL 효소 D 및 15 μL 효소 A를 함유하는 2.5 mL FACS 완충액에 현탁시켰다. 권장된 프로그램은 종양 및 비장에 대해 히터가 있는 gentleMACS™ Octo Dissociator(Miltenyi Biotec #130-096-427)에서 실행되었다. 짧은 원심분리 단계를 수행하여 튜브의 바닥에서 샘플 물질을 수집하였다. 샘플을 재현탁시키고, 스트레이너(종양의 경우 70 μm 및 비장의 경우 30 μm)에 통과시키고, 7분 동안 300xg로 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포를 2.5 mL FACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 1x106개 세포를 96 웰 플레이트에서 100 μL Live/Dead 수용액(ThermoFisher #L34965, 2 mL PBS로 재구성된 2 μL)에 재현탁시켰다. 세포를 15분 동안 인큐베이션하고(어두운 곳, RT), 150 μL PBS로 세척하였다. Fc 차단을 Biolegend Tru Stain(#422301 Fc Block(100 μL FACS 완충액 중 1 μL))으로 수행하고, 샘플을 10분 동안 인큐베이션하였다(어두운 곳, 4℃). 150 μL의 저온 FACS 완충액으로 세척한 후, 샘플을 100 μL FACS 완충액에서 다음 희석액에서 관심 마커를 표적화하는 항체로 염색하였다:
Figure pct00031
이들을 15분 동안 인큐베이션하고(어두운 곳, RT), 200 μL FACS 완충액으로 세척하고, 200 μL Fix/Perm으로 고정하였다(eBio Foxp3 염색 키트 # 00-5523-00: 3 vols 희석제를 갖는 1 vol Fix-Perm 농축물). 샘플을 다음날 LSR II에서 500 μL FACS 완충액에 재현탁시켰다. 모든 데이터는 FlowJo v10.4.1에서 분석하였다.
1.3.16 면역조직화학 분석. PD-L1에 대한 면역화학적 분석은 클론 (E1L3N®) XP® 토끼 항-인간 PD-L1(Cell Signaling, 13684, 희석: 1:250)을 사용하여 전술한 바와 같이 수행되었다(Gniadek et al., 2017). CD3에 대한 면역조직화학 염색은 클론을 사용하여 NDBio Inc.(Baltimore)에 의해 폴리클로날 토끼 항-인간 CD3(Dako/Agilent, A0452, 희석: 1:100)을 사용하여 수행되었다.
1.3.17 aPD-L1 mAb 투여 연구. 종양에서 접근 가능한 PD-L1 수준에 대한 항체 용량의 효과를 결정하기 위해, LOX-IMVI 종양-보유 마우스를 단일 정맥내 볼루스 용량의 아테졸리주맙(0.3 또는 20 mg/Kg)으로 처리하고 24시간 후에 마우스를 영상화(n = 3-4) 및 생체분포(n = 6-8) 연구에 사용하였다.
PD-L1 치료제로의 치료 후 종양에서 접근 가능한 PD-L1 수준의 시간적 변화를 결정하기 위해, LOX-IMVI 종양-보유 마우스를 단일 정맥내 볼루스 용량의 아테졸루주맙, 아벨루맙 또는 두르발루맙(1 mg/kg)으로 처리하고, 영상화(n= 3) 및 생체분포 연구(n=8-18)를 항체 처리 24시간 및 96시간 후에 수행하였다. 항 PD-1 항체 니볼루맙(1 mg/kg) 및 염수를 대조군으로 사용하였다. 치료 mAb 또는 대조군으로서 식염수로 24시간 동안 처리된 마우스에 200 μL의 식염수 중 200 μCi의 [18F]DK222를 정맥내 주사하고, PET 이미지를 방사성추적자 주사 1시간 후에 획득하였다. 관련된 많은 수의 그룹 및 마우스로 인해, 식염수 및 니볼루맙-처리된 대조군이 모든 실험에 포함되었고, 다수의 실험으로부터의 데이터가 푸울링되었다. 연구는 단지 생체분포 측정으로 MDAMB231 종양-보유 마우스에서 반복되었다.
1.3.18 데이터 분석. Prism 8 Software(GraphPad Software, La Jolla, CA)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 짝지어지지 않은 스튜던트 t-검정, 일방향 또는 양방향 ANOVA를 각각 컬럼, 다중 컬럼, 및 그룹화된 분석에 이용하였다. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. P-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
1.4 합성
1.4.1 DK221 유사체
1.4.1.1 DK222 (DK221-NODA)
Figure pct00032
1.4.1.1.A 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK221(4.0 mg, 2.04 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 NCS-MP-NODA(1.6 mg, 4.07 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 30분 내에 50-90% 메탄올(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK222를 15.5분에 수집하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 탈이온수에서 재구성하고, 65% 수율로 분말로 동결건조시켰다. 정제된 DK222는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)으로 특성규명하였다. 계산된 [M+H]+: 2348.68, 관측치: 2349.06. DK222의 MALDI-TOF MS는 도 21에 제시되어 있다.
1.4.1.2 DK331 (DK221-비오틴)
Figure pct00033
1.4.1.2.A 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK221(5.0 mg, 2.55 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 비오틴-NHS-에스테르(2.0 mg, 5.85 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3-4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 20-60% 아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK331을 57% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 ESI MS에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M-H]-: 2182.50, 관측치: 2181.1. DK331의 ESI-MS는 도 22에 제시되어 있다. DK331의 MALDI-MS는 도 23에 제시되어 있다.
1.4.1.3. DK225 (DK221-NODAGA)
Figure pct00034
1.4.1.3.A 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK221(4.0 mg, 2.04 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 NODAGA-NHS-에스테르(2.0 mg, 2.73 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3-4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 20-60% 아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK225를 62% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 ESI MS에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M+H]+: 2313.57; 관측치: 2314.0. DK225의 ESI-MS는 도 24에 제시되어 있다.
1.4.1.4. DK223 (DK221-DOTA)
Figure pct00035
1.4.1.4.A. 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK221(5.0 mg, 2.55 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 DOTA-NHS-에스테르(2.0 mg, 2.62 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 20-60% 아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK223을 72% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M+H]+: 2342.62, 관측치: 2343.09. DK223의 MALDI-MS는 도 25에 제시되어 있다.
1.4.1.5. DK385 (DK221-DOTAGA)
Figure pct00036
1.4.1.5.A. 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK221(5.0 mg, 2.55 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 DOTA-GA-무수물(3.1 mg, 6.27 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 20-60% 아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK385를 61% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M+H]+: 2400.65, 관측치: 2401.09. DK385의 MALDI-MS는 도 26에 제시되어 있다.
1.4.1.6. DK365 (DK221-PEG12-NOTA)
Figure pct00037
1.4.1.6.A. 단계-1: DK254의 합성
1.4.1.6.A.i DK254의 구조
Figure pct00038
1.4.1.6.A.ii 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK221(5.0 mg, 2.55 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 Fmoc-N-아미도-dPE12-NHS 에스테르(2.0 mg, 2.13 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3-4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 20-60% 아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK254를 53% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 ESI MS에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M+Na+2H]2+: 1400.5, 관측치: 1400.4. DK254의 ESI MS는 도 27에 제시되어 있다.
1.4.1.6.B. 단계-2: DK265의 합성
1.4.1.6.B.i DK265의 구조
Figure pct00039
1.4.1.6.B.ii 절차: 디메틸포름아미드:피페리딘(1:1)(1.0 mL) 중 20 mL 바이알에서 DK254(5 mg)의 용액을 실온에서 2h 동안 교반하였다. 미정제 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 사용하였다. 미정제 DK265를 정량적으로 획득하였고, 이는 ESI MS에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M+2H]2+: 1277.7, 관측치: 1277.5. DK265의 ESI-MS는 도 28에 제시되어 있다.
1.4.1.6.C. 단계-3: DK365의 합성
1.4.1.6.C.i. 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK265(5.0 mg, 2.0 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 pSCN-Bn-NOTA(2.0 mg, 3.57 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3-4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 20-60% 아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK365를 45% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 ESI MS에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M+2H]2+: 1502.2, 관측치: 1502.4. DK365의 ESI-MS는 도 29에 제시되어 있다.
1.4.1.7. DK360 (DK221-PEG12-NODA)
Figure pct00040
1.4.1.7.i. 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK265(5.0 mg, 2.0 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 NCS-MP-NODA(1.2 mg, 3.0 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2-3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 20-60% 아세토니트릴(0.1% 트리플루오로아세트산) 및 H2O(0.1% 트리플루오로아세트산)였다. 요망되는 DK360을 47% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 ESI MS에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M+2H]2+: 1473.0, 관측치: 1472.7. DK360의 ESI-MS는 도 30에 제시되어 있다.
1.4.1.8. DK388 (DK221-PEG4-알킨)
Figure pct00041
1.4.1.8.i. 절차: 디메틸포름아미드(1.0 mL) 중 20 mL 바이알 중의 DK265(5.0 mg, 2.0 μmoles)의 교반된 용액에 디이소프로필에틸아민(5.0 μL)에 이어서 NCS-MP-NODA(1.2 mg, 3.0 μmoles)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2-3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 반-분취 C-18 Luna 컬럼(5 mm, 10 x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 시스템에서 정제하였다. 정제를 위한 HPLC 조건은 5 mL/분의 유량으로 25분 내에 30-60% 아세토니트릴(0.1% 포름산) 및 H2O(0.1% 포름산)였다. 요망되는 DK388을 58% 수율로 분말 형태로 동결건조하였고, 이는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)에 의해 특성규명되었다. 계산된 [M]+: 2198.48, 관측치: 2198.91. DK388의 ESI-MS는 도 31에 제시되어 있다.
1.4.1.9. [ 18 F]DK221Py의 합성
Figure pct00042
반응식 3. [18F]DK221Py의 합성.
미정제 [18F]PyTFP의 RP-HPLC는 도 32에 제시되어 있다. 미정제 [18F]DK221Py의 RP-HPLC는 도 33에 제시되어 있다. 순수한 [18F]DK221Py의 RP-HPLC는 도 34에 제시되어 있다.
또한, hPD-L1/CHO 이종이식편에서 [18F]DK221Py의 생체내 평가는 도 35에 제시되어 있다.
참고문헌
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 본원에 개시된 주제가 속하는 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌(예를 들어, 웹사이트, 데이터베이스 등)은 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조문헌이 구체적이고 개별적으로 참조로서 포함되는 것을 나타낸 것과 동일한 정도로 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 다수의 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌이 본원에서 언급되지만, 이러한 참고문헌은 이들 문헌 중 임의의 것이 당 분야의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서와 임의의 포함된 참고문헌 사이에 충돌이 있는 경우, 본 명세서(포함된 참고문헌에 기반할 수 있는 이의 임의의 개정물 포함)가 우선한다. 달리 지시되지 않는 한, 용어의 표준 기술 분야에서 허용되는 의미가 본원에서 사용된다. 다양한 용어에 대한 표준 약어가 본원에서 사용된다.
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
전술한 주제는 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세히 설명되었지만, 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 범위 내에서 실시될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

Claims (41)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 영상화제:
    Figure pct00048
    ;
    상기 식에서,
    L은 존재하거나 부재할 수 있는 링커이고, 존재하는 경우 하기 일반식을 가지며;
    Figure pct00049
    ;
    상기 식에서,
    X는 S 또는 O이고;
    a, e, f, g, i 및 j는 각각 독립적으로 0 및 1로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
    b, d, h 및 k는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
    c는 0 내지 40의 범위를 갖는 정수이고;
    각각의 R1은 H 또는 -COOR2이고, 여기서 R2는 H 또는 C1-C4 알킬이고; Ar은 치환되거나 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    A는 킬레이트제, 방사성표지된 기질, 형광 염료, 광음향 보고 분자, 및 라만-활성 보고 분자로 구성된 군으로부터 선택된 보고 모이어티이거나 -NR3R4 또는 C≡N으로 구성된 군으로부터 선택된 말단 기이고, 여기서 R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 및 C1-C4 알킬로 구성된 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 링커가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제:
    (a)
    Figure pct00050
    , 상기 식에서, p는 0, 1, 2, 3 및 4로부터 선택된 정수이고;
    (b)
    Figure pct00051
    , 상기 식에서, q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
    (c)
    Figure pct00052
    , 상기 식에서, r은 0, 1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7 및 8로 구성된 군으로부터 선택된 정수이고;
    (d)
    Figure pct00053
    , 상기 식에서, s는 1 내지 40의 범위를 갖는 정수이고, t는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
    (e)
    Figure pct00054
    , 상기 식에서, s는 1 내지 40의 범위를 갖는 정수이고, t는 0 또는 1로부터 선택된 정수이고;
    (f)
    Figure pct00055
    , 상기 식에서, s는 1 내지 40의 범위를 갖는 정수이고, t는 0 또는 1로부터 선택된 정수이다.
  3. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 킬레이트제이고, 킬레이트제가 DOTAGA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸,1-(글루타르산)-4,7,10-트리아세트산), DOTA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTA-트리스(t-부틸)에스테르, DOTAGA-(t-부틸)4, DOTA-디(t-부틸)에스테르, DOTASA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-(2-숙신산)-4,7,10-트리아세트산), CB-DO2A (10-비스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자바이사이클로[5.5.2]테트라데칸), DEPA (7-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-4,10-비스-카르복시메틸-1,4,7,10-테트라아자-사이클로도데크-1-일-아세트산)), 3p-C-DEPA (2-[(카르복시메틸)][5-(4-니트로페닐-1-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일]펜탄-2-일)아미노]아세트산)), TCMC (2-(4-이소티오시아노토벤질)-1,4,7,10-테트라아자-1,4,7,10-테트라-(2-카르바모닐 메틸)-사이클로도데칸), 옥소-DO3A (1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸-5-S-(4-이소티오시아네이토벤질)-4,7,10-트리아세트산), DO3A-(t-부틸), DO3AM (2,2',2"-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트아미드), p-NH2-Bn-옥소-DO3A (1-옥사-4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-5-S-(4-아미노벤질)-4,7,10-트리아세트산), TE2A ((1,8-N,N'-비스-(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸), MM-TE2A, DM-TE2A, CB-TE2A (4,11-비스(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]헥사데칸), CB-TE1A1P (4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1-(메탄포스폰산)-8-(메탄카르복실산), CB-TE2P (1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,8-비스(메탄포스폰산), TETA (1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산), NOTA (1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산), NOTA(t-부틸)2, NO2A (1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-비스(아세트산)-7-(아세트아미드), NODA (1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세테이트); NODAGA (1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산), NODAGA(t-부틸)3, NOTAGA (1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산), DFO (데스페록사민), DTPA (2-[비스[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]아미노]아세트산), DTPA-테트라(t-부틸)에스테르 (디에틸렌트리아민-N,N,N",N"-테트라-tert-부틸 아세테이트-N'-아세트산), NETA ([4-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-7-카르복시메틸-[1,4,7]트리아조난-1-일}-아세트산), TACN-TM (N,N',N", 트리스(2-메르캅토에틸)-1,4,7-트리아자사이클로노난), Diamsar (1,8-디아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로(6,6,6)에이코산, 3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]에이코산-1,8-디아민), Sarar (1-N-(4-아미노벤질)-3, 6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6] 에이코산-1,8-디아민), AmBaSar (4-((8-아미노-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로 [6.6.6] 이코산-1-일아미노)메틸)벤조산), BaBaSar, 트리스(하이드록시피리디논)(THP), THP(벤질)3, NOPO (3-(((4,7-비스((하이드록시(하이드록시메틸)포스포릴)-메틸)-1,4,7-트리아조난-1-일)메틸)(하이드록시)포스포릴)프로판산), TRAP (3,3',3"-(((1,4,7-트리아조난-1,4,7-트리일)트리스(메틸렌))트리스(하이드록시포스포릴))-트리프로판산), p-NH2-Bn-PCTA (3,6,9,15-테트라아자바이사이클로[9.3.1] 펜타데카-1(15),11,13-트리엔-4-S-(4-아미노벤질)-3,6,9-트리아세트산), 및 비오틴 (5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 영상화제.
  4. 제3항에 있어서, 킬레이트제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제:
    Figure pct00056
    .
  5. 제3항에 있어서, 킬레이트제가 DOTA (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), NOTA (1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산), NODA (1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세테이트); NODAGA (1,4,7-트리아자사이클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산), 및 비오틴 (5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제.
  6. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 킬레이트제이고, 킬레이트제가 94mTc, 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 177Lu, 186Re, 188Re, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 55Co, 57Co, 44Sc, 47Sc, 225Ac, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 153Sm, 166Ho, 152Gd, 82Rb, 89Zr, 166Dy 및 Al18F로 구성된 군으로부터 선택된 방사성금속을 추가로 포함하는, 영상화제.
  7. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 방사성표지된 기질이고, 방사성표지된 기질이 11C, 13N, 15O, 123I, 124I, 125I, 126I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br, 80Br, 80mBr, 82Br, 83Br, 19F, 18F 및 211At로 구성된 군으로부터 선택된 방사성동위원소를 포함하는, 영상화제.
  8. 제7항에 있어서, 방사성표지된 기질이 18F-표지된 기질 또는 18F-표지된 기질을 포함하는 영상화제.
  9. 제8항에 있어서, 19F-표지된 기질 또는 18F-표지된 기질이 2-플루오로-PABA, 3-플루오로-PABA, 2-플루오로-만니톨, N-숙신이미딜-4-플루오로벤조에이트, 및 2-피리딜로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제.
  10. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 형광 염료이고, 형광 염료가 카르보시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 투이카르보시아닌, 메로시아닌, 폴리메틴, 쿠마린, 아미노메틸쿠마린 아세테이트(AMCA), 로다민, 테트라메틸로다민(TRITC), 잔텐, 플루오레세인, FITC, 붕소-디피로메탄(BODIPY) 염료, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, VivoTag-680, VivoTag-S680, VivoTag-S750, AlexaFluor350, AlexaFluor405, AlexaFluor488, AlexaFluor546, AlexaFluor555, AlexaFluor594, AlexaFluor633, AlexaFluor647, AlexaFluor660, AlexaFluor680, AlexaFluor700, AlexaFluor750, AlexaFluor790, Dy677, Dy676, Dy682, Dy752, Dy780, DyLight350, DyLight405, DyLight488, DyLight547, DyLight550, DyLight594, DyLight633, DyLight647, DyLight650, DyLight680, DyLight755, DyLight800, HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 680, HiLyte Fluor 750, IR Dye 800, IRDye 800CW, IRDye 800RS, IRDye 700DX, ADS780WS, ADS830WS, ADS832WS, 캐스케이드 블루(Cascade Blue) 및 텍사스 레드(Texas Red)로 구성된 군으로부터 선택되는, 영상화제.
  11. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 광음향 보고 분자이고, 광음향 보고 분자가 염료 또는 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는, 영상화제.
  12. 제11항에 있어서, 염료가 형광 염료를 포함하는 영상화제.
  13. 제12항에 있어서, 형광 염료가 인도시아닌-그린(indocyanine-green; ICG), Alexa Fluor 750, 에반스 블루(Evans Blue), BHQ3, QXL680, IRDye880CW, MMPSense 680, 메틸렌 블루(Methylene Blue), PPCy-C8 및 Cypate-C18로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제.
  14. 제11항에 있어서, 나노입자가 플라즈몬 나노입자, 양자점, 나노다이아몬드, 폴리피롤 나노입자, 구리 설파이드 나노입자, 그래핀 나노시트, 산화철-금 코어-쉘 나노입자, Gd2O3 나노입자, 단일-벽 탄소 나노튜브, 염료-로딩된 퍼플루오로카본 나노입자, 및 초상자성 산화철 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제.
  15. 제1항에 있어서, 보고 모이어티가 라만-활성 보고 분자이고, 라만-활성 보고 분자가 단일-벽 탄소 나노튜브(SWNT) 및 표면-향상된 라만 산란(SERS) 제제로 구성된 군으로부터 선택되는, 영상화제.
  16. 제15항에 있어서, SERS 제제가 라만-활성 리포터 분자로 표지된 금속 나노입자를 포함하는 영상화제.
  17. 제16항에 있어서, 라만-활성 리포터 분자가 형광 염료를 포함하는 영상화제.
  18. 제17항에 있어서, 형광 염료가 Cy3, Cy5, 로다민, 및 칼코게노피릴륨 염료로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제.
  19. 제1항에 있어서, 영상화제가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제:
    Figure pct00057
    ;
    Figure pct00058
    ;
    Figure pct00059
    ;
    Figure pct00060
    ;
    Figure pct00061
    ;
    Figure pct00062
    ;
    Figure pct00063
    ;
    Figure pct00064
    ;
    Figure pct00065
    ;
    Figure pct00066
    ; 및
    Figure pct00067
    .
  20. 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 영상화 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 영상화제를 제공하는 단계;
    (b) 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화제와 접촉시키는 단계; 및
    (c) PD-L1을 검출하기 위한 이미지를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화제와 접촉시키는 것이 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 수행되는 영상화 방법.
  22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 세포 또는 조직을 영상화제와 접촉시키는 것이 대상체에서 수행되는 영상화 방법.
  23. 제22항에 있어서, 대상체가 인간, 래트, 마우스, 고양이, 개, 말, 양, 소, 원숭이, 조류, 또는 양서류인 영상화 방법.
  24. 제20항에 있어서, PD-L1의 검출이 대상체에 영상화제의 투여 후 약 60-120분 또는 그 미만에 발생하는 영상화 방법.
  25. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 암을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  26. 제25항에 있어서, 암이 모세포종, 암종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 두부암, 경부암, 두경부암, 폐암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 전립선암, 결장직장암, 식도암, 위암, 백혈병/림프종, 자궁암, 피부암, 내분비암, 비뇨기암, 췌장암, 위장관암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 방광암, 뇌암, 선종, 및 전이성 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화제.
  27. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 고형 종양을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  28. 제27항에 있어서, 고형 종양이 뇌, 결장, 유방, 전립선, 간, 신장, 폐, 식도, 두경부, 난소, 자궁경부, 위, 직장, 방광, 자궁, 고환 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택된 기관에 존재하는 영상화 방법.
  29. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 감염을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  30. 제29항에 있어서, 감염이 미생물 감염인 영상화 방법.
  31. 제30항에 있어서, 미생물 감염이 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), E. 콜라이(E. coli), 클렙시엘라 종(Klebsiella sp.), 엔테로박터 종(Enterobacter sp.), 프로테우스 종(Proteus sp.), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 스태필로코커스 종(Staphylococcus spp.), 예를 들어, S. 아우레우스(S. aureus) 및 응고효소 음성 스태필로코커스(coag.-negative Staphylococcus), 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.), 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 박테로이데스 종(Bacteroides spp.), 아시네토박터 종(Acinetobacter spp.), 헬리코박터 종(Helicobacter spp.), 칸디다 종(Candida sp.), 메티실린-내성 스태필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA) 및 반코마이신-내성 엔테로코커스 파에칼리스(vancomycin-resistant Enterococcus faecalis; VRE)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 미생물로 인한 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 영상화 방법.
  32. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 염증을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  33. 제32항에 있어서, 염증이 천식, 자가면역 질환, 자가염증성 질환, 체강 질환, 게실염, 사구체신염, 화농한선염, 과민증, 염증성 장 질환, 간질성 방광염, 중이염, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 이식 거부, 루푸스, 전신 홍반 루푸스 및 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택된 장애와 관련된 영상화제.
  34. 제33항에 있어서, 염증이 류마티스 관절염 또는 전신 홍반 루푸스에 의해 유발되는 영상화 방법.
  35. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 종양에서 하나 이상의 면역 세포를 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  36. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 종양 또는 대상체에서 면역 세포의 전신 분포를 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  37. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 감염성 질환에 대한 면역 세포 반응을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  38. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 염증성 질환에 대한 종양 또는 정상 조직 반응에서 면역 세포 반응을 검출하는데 사용되는 영상화 방법.
  39. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 대상체에서 PD-L1 발현 수준을 검출하는 영상화 방법.
  40. 제20항에 있어서, 영상화 방법이 대상체의 종양 부위 또는 정상 조직에서 PD-L1의 점유율을 측정하는 영상화 방법.
  41. 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 검출하기 위한 키트로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 영상화제를 포함하는, 키트.
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