KR20230084061A - Biomarker for predicting prognosis post-neoadjuvant chemotherapy of breast cancer patient and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에서는 NCT를 받기 전 유방암 환자의 혈장 단백질체 분석을 통해 NCT 후 병리학적 완전 반응(pCR) 및 환자의 생존율과 관련이 있는 MBL2, ENG, 및 P4HB의 3가지 단백질 마커를 확인하였다. 본 발명에 따르면 액체 생검을 통해 환자의 혈장으로부터 상기 3가지 단백질 마커의 수준을 측정함으로써 경제적이고 효율적으로 NCT 후 유방암 환자의 예후 또는 NCT에 대한 반응성을 예측할 수 있으며, 유방암 재발을 미리 예측할 수 있는 바, 본 발명은 유방암에 대한 새로운 치료 전략을 수립하는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다. The present invention relates to a biomarker for predicting the prognosis of breast cancer patients after prior chemotherapy and its use. In the present invention, pathological complete response (pCR) and patient Three protein markers, MBL2, ENG, and P4HB, which are associated with the survival rate of , were identified. According to the present invention, by measuring the levels of the three protein markers from the patient's plasma through liquid biopsy, it is possible to economically and efficiently predict the prognosis or responsiveness to NCT of breast cancer patients after NCT, and breast cancer recurrence can be predicted in advance. , It is expected that the present invention will be usefully used to establish a new treatment strategy for breast cancer.
Description
본 발명은 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for predicting the prognosis of a breast cancer patient after prior chemotherapy and its use.
선행 항암화학요법(NCT)은 국소적으로 진행된 유방암(BC) 환자에게 몇 가지 이점을 제공하는데, 이는 유방을 보존할 수 있는 가능성을 증가시킬 수 있고, 치료에 대한 종양의 반응을 생체 내에서 모니터링할 수 있어 병리학적 반응을 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 처리된 화학요법에 잘 반응하는 종양은 더 나은 결과를 나타내며, 병리학적 완전 반응(pCR)은 선행 항암화학요법에서 생존에 대한 인자이다.Neoadjuvant chemotherapy (NCT) offers several benefits to patients with locally advanced breast cancer (BC), which may increase the chances of preserving the breast and monitoring the tumor's response to treatment in vivo. can help predict pathological responses. Tumors that respond well to treated chemotherapy have better outcomes, and pathological complete response (pCR) is a factor for survival in neoadjuvant chemotherapy.
pCR은 HER2+ 및 삼중-음성 하위 유형에서 생존을 예측하기 위한 예후적 가치를 가진 잠재적인 마커가 될 수 있다. 이러한 하위 유형에서 pCR을 보인 환자는 pCR을 보이지 못한 환자보다 더 나은 예후를 나타낸다. 따라서 NCT 전이나 도중에 종양 반응을 예측하는 것은 환자의 예후를 평가하는데 중요하지만, 이와 관련하여 신뢰할 수 있는 마커는 아직 잘 알려진 바가 없다. pCR may be a potential marker with prognostic value for predicting survival in HER2+ and triple-negative subtypes. Patients with pCR in these subtypes have a better prognosis than those without pCR. Therefore, predicting tumor response before or during NCT is important for evaluating patient prognosis, but reliable markers for this are not yet well known.
종양 반응 평가를 위해 이용되는 방법 중 조직 생검과 비교할 때 빠르고 쉬운 '액체 생검'은 간단한 채혈을 통해 종양 반응을 덜 침습적이고 간단하게 평가할 수 있다. 혈장 암 바이오마커와 순환 종양 세포(CTC)의 수는 암 진단과 관련된 유용한 정보를 제공하는데, CTC는 치료 후 예후의 잠재적 바이오마커이다. 보고된 연구 결과에 따르면 CTC 검출이 전이성 유방암에서 잠재적인 예후 인자인 것으로 나타났지만, 비전이성 유방암 환자, 특히 NCT로 치료받은 환자의 임상적 가치와 예후 영향은 상충되는 결과로 논의되고 있다.Compared to tissue biopsy, among the methods used to evaluate tumor response, 'liquid biopsy', which is quick and easy, is less invasive and can simply evaluate tumor response through a simple blood sample. Plasma cancer biomarkers and the number of circulating tumor cells (CTCs) provide useful information related to cancer diagnosis, and CTCs are potential biomarkers of prognosis after treatment. Although reported studies have shown that CTC detection is a potential prognostic factor in metastatic breast cancer, its clinical value and prognostic impact in patients with non-metastatic breast cancer, especially those treated with NCT, are debated with conflicting results.
단백질체학 또는 프로테오믹스(Proteomics)는 CTC 분석과 유사한 분석 방법이며 액체 생검과 같은 또 다른 형태의 비침습적 분석이다. 액체 생검 샘플에서 유래된 단백질 프로필은 질병에 대한 보다 직접적인 프로필을 제공할 수 있다. 따라서 프로테오믹스는 암의 조기 진단과 항종양 치료의 효능을 평가하는데 유망한 결과를 가져올 것으로 기대된다. 현재 암 관리를 위한 임상 프로테오믹스 방법은 바이오마커 발견 및 검증에 중점을 두고 있다. 단백질은 개별적이 아닌 특정 경로를 통해 기능하기 때문에 암 발생과 관련된 특정 경로에 영향을 미치는 바이오마커를 표적으로 하여 항암 전략을 설계할 수 있다.Proteomics or Proteomics is an analytical method similar to the CTC assay and is another form of noninvasive assay, such as liquid biopsy. Protein profiles derived from liquid biopsy samples can provide a more direct profile of disease. Therefore, proteomics is expected to bring promising results in early diagnosis of cancer and evaluation of the efficacy of antitumor treatment. Current clinical proteomics methods for cancer management are focused on biomarker discovery and validation. Since proteins function through specific pathways rather than individually, it is possible to design anticancer strategies by targeting biomarkers that affect specific pathways related to cancer development.
최근의 proteomic-centric multiomics 연구는 단백질 및 인산화된 단백질 정보를 사용하여 유방암을 하위 유형으로 분류하기 위해 유방암 임상 샘플을 분석하였으며, 이는 면역학적 성분의 침윤에 의한 basal-like 및 luminal B 종양과 같은 새로운 하위 유형의 식별로 이어졌다. 차세대 DNA 및 RNA 시퀀싱 프로필과 결합된 인산화 또는 아세틸화와 같은 번역 후 변형 분석을 포함하는 질량 분석 기반 프로테오믹스는 유방 종양에 대한 보다 포괄적인 설명을 제공할 수 있다. 단백질 유전체학(Proteogenomic) 접근법은 표적화 가능한 신호 경로의 식별과 종양 이질성의 생물학적 시그니처의 보다 정확한 큐레이션을 통해 암 임상 연구를 위한 프로테오믹스의 잠재력을 강조한다. 구체적으로, 다른 유전적 배경은 번역 후 변형에 의해 표적 키나아제와 종양 억제 인자 사이의 억제 관계에 영향을 미칠 수 있다.A recent proteomic-centric multiomics study analyzed breast cancer clinical samples to classify breast cancer subtypes using protein and phosphorylated protein information, which resulted in novel findings such as basal-like and luminal B tumors with infiltrating immunological components. This led to the identification of subtypes. Mass spectrometry-based proteomics, including analysis of post-translational modifications such as phosphorylation or acetylation, combined with next-generation DNA and RNA sequencing profiles may provide a more comprehensive description of breast tumors. Proteogenomic approaches highlight the potential of proteomics for cancer clinical research through the identification of targetable signaling pathways and more accurate curation of biological signatures of tumor heterogeneity. Specifically, different genetic backgrounds can influence the inhibitory relationship between target kinases and tumor suppressors by post-translational modifications.
NCT를 받는 유방암 환자의 치료 반응 및 생존과 관련된 신뢰할 수 있는 바이오마커는 현재 부족한 실정이며, 동반이환은 화학요법 적응증 및 요법 선택에 중요하다. 단백질체(프로테옴) 분석은 치료 반응을 모니터링하고 특정 치료제를 선택하는 데 사용할 수 있는 보다 신뢰 가능하고 직접적인 정보를 제공할 수 있다. 또한 혈장 단백질체 분석은 더 빠른 처리 시간(<2일)으로 적은 양의 샘플(40 μL 혈장)을 사용하여 현재 바이오마커 및 도구의 한계를 극복할 수 있다. Reliable biomarkers related to treatment response and survival of breast cancer patients undergoing NCT are currently lacking, and comorbidities are important for chemotherapy indications and therapy selection. Proteomic (proteome) analysis can provide more reliable and direct information that can be used to monitor treatment response and select specific treatments. In addition, plasma proteomic analysis can overcome the limitations of current biomarkers and tools using smaller sample volumes (40 µL plasma) with faster turnaround times (<2 days).
이에, 본 발명자들은 NCT를 받는 유방암 환자의 혈장에 대한 전체 단백질체 분석을 실시하여, NCT 치료에 대한 반응성 및 예후를 예측하고 재발 위험을 예측하기 위한 잠재적인 바이오마커를 선별하였다.Accordingly, the present inventors performed total proteomic analysis on the plasma of breast cancer patients receiving NCT to predict responsiveness and prognosis to NCT treatment and to select potential biomarkers for predicting the risk of recurrence.
본 발명자들은 NCT를 받기 전 유방암 환자의 혈장 샘플을 이용하여 단백질체 분석을 수행하여 NCT 후 병리학적 완전 반응(pCR) 및 환자의 생존율과 관련이 있는 단백질 마커를 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors performed proteomic analysis using plasma samples of breast cancer patients before receiving NCT to identify protein markers associated with pathological complete response (pCR) and patient survival after NCT. completed.
이에, 본 발명의 목적은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법; 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측을 위한 정보제공방법; 유방암 재발 또는 전이 위험도 예측을 위한 정보제공방법; 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to detect mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta in a biological sample isolated from a subject. 4-hydroxylase beta, P4HB) an information providing method for predicting the prognosis of a breast cancer patient after prior chemotherapy, comprising measuring the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of or the mRNA expression level of the protein; information provision method for predicting responsiveness to prior chemotherapy in breast cancer patients; Methods for providing information for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis; Or to provide an information providing method for predicting survival rate after prior chemotherapy of breast cancer patients.
본 발명의 다른 목적은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 조성물 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측용 조성물; 및 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to treat mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB). A composition for predicting prognosis after prior chemotherapy in breast cancer patients, or for predicting responsiveness to prior chemotherapy in breast cancer patients, comprising as an active ingredient an agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from the group or the mRNA expression level of the protein. composition; And to provide a kit.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase in a biological sample isolated from a subject. Information for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients, including measuring the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) or the mRNA expression level of the protein Provided is a method for providing a method or a method for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As one embodiment of the present invention, the biological sample may be blood or tissue, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 혈액은 전혈, 혈장, 혈청, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the blood may be whole blood, plasma, serum, or blood mononuclear cells, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 선행 항암화학요법 전 유방암 환자의 진단 당시에 채취된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the biological sample may be collected at the time of diagnosis of a breast cancer patient before prior chemotherapy, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질 존재 수준은 질량 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 방사선면역분석법, 방사능면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역형광염색, 면역친화성정제, 방사능면역침전, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the protein present level is measured by mass spectrometry, Western blot, ELISA (enzyme linked immunoassay), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, radioimmunoassay, radioimmunoassay, radioimmunoassay , Ouchterlony immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunofluorescence staining, immunoaffinity purification, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) and protein chip It may be measured using one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the mRNA expression level of the protein is determined by polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay ), Northern blotting, and may be measured using one or more methods selected from the group consisting of DNA chips, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법은 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 측정된 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the information providing method for predicting the prognosis of the breast cancer patient after prior chemotherapy is to determine the level of protein present or the level of mRNA expression of the protein measured in a biological sample isolated from the subject from a control group. A step of comparing the level measured in the separated biological sample may be further included, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후가 좋지 않을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, when the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to the control group, breast cancer It can be predicted that the patient's prognosis will be poor after prior chemotherapy, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응(pathologic complete response, pCR)을 보이지 않을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, when the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to the control group, breast cancer It can be predicted that the patient will not show a pathologic complete response (pCR) after prior chemotherapy, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 대조군은 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응을 보이는 유방암 환자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the control group may be a breast cancer patient showing a pathological complete response after prior chemotherapy, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention is directed to mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (prolyl 4-hydroxylase beta) in a biological sample isolated from a subject. hydroxylase beta, P4HB), an information provision method for predicting responsiveness to prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising measuring the level of presence of one or more proteins selected from the group consisting of or the level of mRNA expression of the protein, or advance of breast cancer patients A method for predicting chemotherapy responsiveness is provided.
또한, 본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 재발 또는 전이 위험도 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 재발 또는 전이 위험도 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention is directed to mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (prolyl 4-hydroxylase beta) in a biological sample isolated from a subject. hydroxylase beta, P4HB), a method for providing information for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis, or a method for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis, comprising measuring the level of the presence of one or more proteins selected from the group consisting of or the mRNA expression level of the protein provides
또한, 본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2) 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a biological sample isolated from a subject from the group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2) and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) An information providing method for predicting survival rate after prior chemotherapy of breast cancer patients or a method for predicting survival rate after prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising measuring the level of presence of one or more selected proteins or the mRNA expression level of the protein to provide.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측을 위한 정보제공방법은 둘 이상의 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, 상기 MBL2의 존재 수준 또는 이의 mRNA 발현 수준이 상대적으로 높을 경우 무질병 생존율(disease-free survival rate) 또는 무원격전이 생존율(distant metastasis-free survival rate)이 상대적으로 낮을 것으로 예측하는 단계; 또는As one embodiment of the present invention, the information providing method for predicting survival rate after prior chemotherapy of the breast cancer patient is such that, in a biological sample separated from two or more subjects, the presence level of MBL2 or its mRNA expression level is relatively high. predicting that the disease-free survival rate or the distant metastasis-free survival rate will be relatively low if; or
상기 P4HB의 존재 수준 또는 이의 mRNA 발현 수준이 상대적으로 높을 경우 무질병 생존율 또는 전체 생존율(overall survival rate)이 상대적으로 낮을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.A step of predicting that the disease-free survival rate or overall survival rate will be relatively low when the level of the presence of P4HB or the level of mRNA expression thereof is relatively high may be further included, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) Provides a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising an agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein as an active ingredient.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) Provided is a composition for predicting responsiveness to prior chemotherapy in breast cancer patients, comprising an agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein as an active ingredient.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 혈액 또는 조직에서 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As one embodiment of the present invention, the presence level of the protein or the mRNA expression level of the protein may be measured in blood or tissue, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 단백질의 존재 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the agent for measuring the level of the protein present may be an antibody or an aptamer specific to the protein, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the agent for measuring the mRNA expression level of the protein may be a primer or probe that specifically binds to the mRNA, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 키트 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients or a kit for predicting responsiveness to prior chemotherapy for breast cancer patients, including the composition.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제; 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측 용도 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측 용도를 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) An agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein; Or it provides a composition containing it as an active ingredient, for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients or for predicting responsiveness to prior chemotherapy for breast cancer patients.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제; 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측을 위한 제제의 제조를 위한 용도를 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) An agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein; Or it provides a use for the preparation of a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients or prediction of responsiveness to prior chemotherapy of breast cancer patients, of a composition comprising the same as an active ingredient.
본 발명에서는 선행 항암화학요법(NCT)을 받기 전 유방암 환자의 혈장 단백질체 분석을 통해 NCT 후 병리학적 완전 반응(pCR) 및 환자의 생존율과 관련이 있는 MBL2, ENG, 및 P4HB의 3가지 단백질 마커를 확인하였다. 본 발명에 따르면 액체 생검을 통해 환자의 혈장으로부터 상기 3가지 단백질 마커의 수준을 측정함으로써 경제적이고 효율적으로 NCT 후 유방암 환자의 예후 또는 NCT에 대한 반응성을 예측할 수 있으며, 유방암 재발을 미리 예측할 수 있는 바, 본 발명은 유방암에 대한 새로운 치료 전략을 수립하는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다. In the present invention, three protein markers, MBL2, ENG, and P4HB, which are associated with pathological complete response (pCR) and patient survival after NCT, were analyzed through plasma proteomic analysis of breast cancer patients before prior chemotherapy (NCT). Confirmed. According to the present invention, by measuring the levels of the three protein markers from the patient's plasma through liquid biopsy, it is possible to economically and efficiently predict the prognosis or responsiveness to NCT of breast cancer patients after NCT, and breast cancer recurrence can be predicted in advance. , It is expected that the present invention will be usefully used to establish a new treatment strategy for breast cancer.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 유방암 환자에서 혈장 단백질체의 분석 워크플로우를 나타낸 도면으로서, 상단에는 분석 방법, 중간에는 단백질의 개수, 하단에는 각 단계의 의미를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 유방암 환자에서 혈장 단백질 풍부도를 정규화하여 박스플롯(boxplot)으로 나타낸 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 유방암 환자에서 혈장 단백질 풍부도를 정규화한 후 254개 혈장 단백질과 혈장 단백질체 데이터베이스의 혈장 농도와의 상관관계를 스캐터 플롯(scatter plot)으로 나타낸 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 유방암 환자에서 혈장 단백질체의 부분 최소 제곱-판별 분석(PLS-DA) 점수 플롯을 나타낸 도면이다.
도 2d는 도 2c의 결과로부터 선택된 상위 26개 단백질의 VIP(variable importance in projection) 점수 플롯을 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 pCR 및 non-pCR 유방암 환자 사이에서 차등적으로 풍부한 혈장 단백질(DAP)에 대한 볼케이노 플롯 결과를 나타낸 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 pCR 및 HER2 존재에 의해 나뉜 유방암 환자 그룹에서 4개의 단백질(MBL2, ENG, P4HB, 및 APOC3)의 박스플롯 결과를 나타낸 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 구현예에 따른 pCR 및 호르몬 수용체(HR) 존재에 의해 나뉜 유방암 환자 그룹에서 4개의 단백질(MBL2, ENG, P4HB, 및 APOC3)의 박스플롯 결과를 나타낸 도면이다.
도 3d는 본 발명의 일 구현예에 따른 4개의 단백질(MBL2, ENG, P4HB, 및 APOC3)의 기능적 해석을 나타낸 것으로서, WikiPathways와 단백질 간의 연관관계 및 pCR(녹색)과 non-pCR(적색) 유방암 환자 사이에서 해당 단백질의 바이올린 플롯을 나타낸 도면이다.
도 3e는 본 발명의 일 구현예에 따른 TNBC 하위 유형 유방암 환자에서 non-pCR 그룹과 비교하여 pCR 그룹의 혈장 단백질 풍부도를 볼케이노 플롯으로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 3개의 단백질(MBL2, ENG, 및 P4HB)에 대한 SVM 및 RF 분류기에서의 ROC curve 결과 및 AUC 값의 바이올린 플롯을 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 유방암 환자에서 pCR과 MBL2, ENG, 및 P4HB 단백질의 DFS(disease-free survival)(도 5a), OS(overall survival)(도 5b), 및 DMFS(distant metastasis-free survival)(도 5c)와의 상관관계를 Kaplan-Meier 플롯으로 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing a workflow for analyzing plasma proteomes in a breast cancer patient according to an embodiment of the present invention, with the analysis method at the top, the number of proteins in the middle, and the meaning of each step at the bottom.
Figure 2a is a diagram showing normalized plasma protein abundance in breast cancer patients according to one embodiment of the present invention as a box plot (boxplot).
FIG. 2B is a diagram showing the correlation between 254 plasma proteins and plasma concentrations of a plasma proteome database in a scatter plot after normalizing the plasma protein abundance in breast cancer patients according to an embodiment of the present invention.
Figure 2c is a diagram showing a partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) score plot of plasma proteomes in breast cancer patients according to one embodiment of the present invention.
FIG. 2d is a diagram showing a variable importance in projection (VIP) score plot of the top 26 proteins selected from the results of FIG. 2c.
Figure 3a is a diagram showing the results of a volcano plot for differentially abundant plasma protein (DAP) between pCR and non-pCR breast cancer patients according to an embodiment of the present invention.
3B is a diagram showing box plot results of four proteins (MBL2, ENG, P4HB, and APOC3) in breast cancer patient groups divided by the presence of pCR and HER2 according to an embodiment of the present invention.
Figure 3c is a diagram showing the boxplot results of four proteins (MBL2, ENG, P4HB, and APOC3) in breast cancer patient groups divided by the presence of pCR and hormone receptor (HR) according to an embodiment of the present invention.
Figure 3d shows the functional analysis of four proteins (MBL2, ENG, P4HB, and APOC3) according to an embodiment of the present invention, the association between WikiPathways and proteins and pCR (green) and non-pCR (red) breast cancer It is a diagram showing a violin plot of the protein in question between patients.
Figure 3e is a diagram showing the plasma protein abundance of the pCR group compared to the non-pCR group in a TNBC subtype breast cancer patient according to one embodiment of the present invention in a Volcano plot.
4 is a diagram showing a Violin plot of ROC curve results and AUC values in SVM and RF classifiers for three proteins (MBL2, ENG, and P4HB) according to an embodiment of the present invention.
5a to 5c are DFS (disease-free survival) (FIG. 5a), OS (overall survival) (FIG. 5b), and DMFS of pCR, MBL2, ENG, and P4HB proteins in breast cancer patients according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing the correlation with (distant metastasis-free survival) (FIG. 5c) as a Kaplan-Meier plot.
본 발명의 일 실험예에서는 NCT 전 유방암 환자의 혈장 샘플을 채취하여 질량 분석법을 통해 혈장 샘플의 단백질체를 분석하고 정량한 결과, NCT 후 병리학적 완전 반응(pCR)을 보이는 환자에서 3가지 단백질을 pCR 예측 마커 후보로 선정하였다(실험예 2 참조).In one experimental example of the present invention, a plasma sample of a breast cancer patient before NCT was taken, and the proteome of the plasma sample was analyzed and quantified through mass spectrometry. It was selected as a predictive marker candidate (see Experimental Example 2).
본 발명의 다른 실험예에서는 pCR 및 non-pCR 유방암 환자 사이에 차등적으로 풍부한 혈장 단백질을 확인한 결과, non-pCR 유방암 환자에서 MBL2, ENG, 및 P4HB의 3가지 단백질 수준이 유의하게 높게 나타나고, pCR 유방암 환자에서 APOC3의 단백질 수준이 낮게 나타나는 것을 확인하였다(실험예 3 참조).In another experimental example of the present invention, as a result of confirming differentially abundant plasma proteins between pCR and non-pCR breast cancer patients, the levels of three proteins of MBL2, ENG, and P4HB were significantly higher in non-pCR breast cancer patients, and pCR It was confirmed that the protein level of APOC3 was low in breast cancer patients (see Experimental Example 3).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 pCR 환자에서 유의하게 차이를 나타내는 단백질 중 MBL2, ENG, 및 P4HB에 대하여, 랜덤 포레스트(RF) 및 서포트 벡터 머신(SVM)에 기반한 머신 러닝 분류기를 사용하여 다변량 분석을 수행한 결과, SVM 및 RF의 AUC 중앙값이 각각 0.861(95 % CI: 0.845-0.873) 및 0.861(95 % CI: 0.830-0.867)로 나타나는 것을 확인하였다(실험예 4 참조).In another experimental example of the present invention, for MBL2, ENG, and P4HB among proteins showing significant differences in pCR patients, multivariate analysis was performed using a machine learning classifier based on random forest (RF) and support vector machine (SVM) As a result, it was confirmed that the median AUC values of SVM and RF were 0.861 (95% CI: 0.845-0.873) and 0.861 (95% CI: 0.830-0.867), respectively (see Experimental Example 4).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 유방암 환자의 MBL2, ENG, 및 P4HB 단백질과 DFS(disease-free survival), OS(overall survival), 및 DMFS(distant metastasis-free survival)와 같은 장기 임상 지표와의 상관관계를 확인하기 위해, 단변량 생존 분석을 수행한 결과, pCR은 DFS, OS 및 DMFS에 대해 non-pCR보다 통계적으로 더 나은 예후 인자였으며, DFS의 경우 MBL2 및 P4HB, OS의 경우 P4HB, DMFS의 경우 MBL2가 환자를 저위험 및 고위험 그룹으로 나누는데 통계적으로 유의적인 것을 확인하였다. 또한, 세 가지 단백질(MBL2, ENG, P4HB) 수준은 모두 병리학적 단계가 높아짐에 따라 유의하게 증가하는 것을 알 수 있었다(실험예 5 참조).In another experimental example of the present invention, the correlation between MBL2, ENG, and P4HB proteins of breast cancer patients and long-term clinical indicators such as DFS (disease-free survival), OS (overall survival), and DMFS (distant metastasis-free survival) To confirm the relationship, univariate survival analysis was performed, and pCR was a statistically better prognostic factor than non-pCR for DFS, OS, and DMFS, and MBL2 and P4HB for DFS, P4HB for OS, and DMFS. In this case, it was confirmed that MBL2 was statistically significant in dividing patients into low-risk and high-risk groups. In addition, it was found that the levels of all three proteins (MBL2, ENG, P4HB) increased significantly as the pathological stage increased (see Experimental Example 5).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측 방법을 제공한다.In the present invention, in a biological sample isolated from a subject, mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta . Provides a method for predicting prognosis after chemotherapy.
본 발명에 있어서, “만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2)”는 렉틴 경로의 활성제이자 선천성 면역 체계의 중요한 구성 요소이다. 염증 반응은 종양 진행에 중요하며 인간 발암을 촉진할 수 있다. 간에서 만들어져 혈액에 존재하는 MBL은 선천성 면역에 관여하는 단백질군인 collectin에 속하는 분자로서 감염성 질병을 유발하는 다양한 세균, 바이러스, 효모, 곰팡이 및 원생동물의 표면에 존재하는 특징적인 당쇄를 인식하며, MBL 결여는 감염성 질환에 대한 감수성을 증가시킨다. 본 발명에 있어서, 상기 MBL2 단백질은 NCBI Reference Sequence: NP_000233.1의 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하는 것일 수 있고, NCBI Reference Sequence: NM_000242.3의 염기서열(서열번호 2)에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, “mannose-binding lectin 2 (MBL2)” is an activator of the lectin pathway and an important component of the innate immune system. Inflammatory responses are important for tumor progression and may promote human carcinogenesis. MBL, produced in the liver and present in the blood, is a molecule belonging to collectin, a group of proteins involved in innate immunity. It recognizes the characteristic sugar chains present on the surface of various bacteria, viruses, yeasts, fungi and protozoa that cause infectious diseases Deficiency increases susceptibility to infectious diseases. In the present invention, the MBL2 protein may include the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of NCBI Reference Sequence: NP_000233.1, and may be encoded by the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of NCBI Reference Sequence: NM_000242.3 It may, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, “엔도글린(endoglin, ENG)”은 종양 혈관 및 종양 기질 성분의 세포 표면에서 높은 수준으로 발현되는 TGF-β에 대한 수용체로서, 새롭게 형성되는 혈관신생 내피에 대한 친화성을 나타내는 특징이 있다. 본 발명에 있어서, 상기 ENG 단백질은 GenBank: AAC63386.1의 아미노산 서열(서열번호 3)을 포함하는 것일 수 있고, NCBI Reference Sequence: NM_000118.4의 염기서열(서열번호 4)에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, "endoglin (ENG)" is a receptor for TGF-β expressed at a high level on the cell surface of tumor blood vessels and tumor stroma components, and exhibits affinity for newly formed angiogenic endothelium. It has a characteristic. In the present invention, the ENG protein may include the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of GenBank: AAC63386.1, and may be encoded by the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) of NCBI Reference Sequence: NM_000118.4. , but not limited thereto.
본 발명에 있어서, “프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)”는 인간에서 P4HB 유전자에 의해 암호화되는 효소로서, 다른 prolyl 4-hydroxylase 계열 단백질과 달리 다기능이며 이황화물 형성, 파괴 및 이성체화를 위한 산화환원효소로 작용한다. 본 발명에 있어서, 상기 P4HB 단백질은 GenBank: KAI4052196.1의 아미노산 서열(서열번호 5)을 포함하는 것일 수 있고, NCBI Reference Sequence: NM_000918.4의 염기서열(서열번호 6)에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, "prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB)" is an enzyme encoded by the P4HB gene in humans, and unlike other prolyl 4-hydroxylase family proteins, it is multifunctional and disulfide It acts as an oxidoreductase for formation, destruction and isomerization. In the present invention, the P4HB protein may include the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of GenBank: KAI4052196.1, and may be encoded by the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) of NCBI Reference Sequence: NM_000918.4. , but not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 존재 수준은 NCT 후 병리학적 완전 반응(pCR)을 보이는 유방암 환자와 non-pCR 유방암 환자 간에 유의적으로 차이를 보인 바, 유방암 환자의 NCT 후 예후 예측을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 있어서, 상기 3가지 마커의 예후 예측에 대한 정확도(AUC)는 0.7 내지 1.0, 0.8 내지 1.0, 0.83 내지 1.0, 0.7 내지 0.95, 0.8 내지 0.95, 0.83 내지 0.95, 0.7 내지 0.9, 0.8 내지 0.9, 0.83 내지 0.9, 0.7 내지 0.88, 0.8 내지 0.88, 또는 0.83 내지 0.88일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB is significantly different between breast cancer patients with pathological complete response (pCR) after NCT and non-pCR breast cancer patients Bar, it was confirmed that it can be used as a biomarker for predicting the prognosis of breast cancer patients after NCT, and in the present invention, the accuracy (AUC) for predicting the prognosis of the three markers ranged from 0.7 to 1.0, 0.8 to 1.0, and 0.83 to It may be 1.0, 0.7 to 0.95, 0.8 to 0.95, 0.83 to 0.95, 0.7 to 0.9, 0.8 to 0.9, 0.83 to 0.9, 0.7 to 0.88, 0.8 to 0.88, or 0.83 to 0.88, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 피검체는 비-전이성 유방암 환자로서 국소적으로 진행된 유방암을 가지며 선행 항암화학요법을 실시하고자 하는 유방암 환자를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 피검체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 유방암이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.In the present invention, the subject may refer to a breast cancer patient who has locally advanced breast cancer as a non-metastatic breast cancer patient and intends to undergo prior chemotherapy, but is not limited thereto. In the present invention, the subject may include any animal that may develop breast cancer, such as a dog, horse, cow, rat, goat, rabbit, chicken, duck, goose, as well as humans, without limitation.
본 발명에 있어서, “유방암”이란 유방에 발생하는 모든 악성 종양을 통틀어 지칭하는 것이며, “국소적으로 진행된 유방암”이란 유방에서 시작하여 근처 조직 또는 림프절로 확산된, 그러나 신체의 다른 부분까지는 확산되지 않은 암을 지칭한다. 본 발명에 있어서, “비-전이성 유방암”이란 유방으로부터 신체의 다른 부분, 예를 들어 뼈, 간, 폐, 또는 뇌로 확산되지 않은 암을 지칭한다. In the present invention, "breast cancer" refers to all malignant tumors occurring in the breast, and "locally advanced breast cancer" starts in the breast and spreads to nearby tissues or lymph nodes, but does not spread to other parts of the body. refers to cancer that is not In the present invention, "non-metastatic breast cancer" refers to cancer that has not spread from the breast to other parts of the body, such as the bone, liver, lungs, or brain.
본 발명에 있어서, “선행 항암화학요법(Neoadjuvant chemotherapy, NCT)”이란 국소적으로 암이 진행되어 절제수술이 불가능한 환자에게 수술 전에 항암치료를 함으로써 원발 종양크기와 침윤의 범위를 줄여서 완치목적의 수술 또는 방사선치료를 전제로 하여 국소치료 전에 시행하는 항암화학요법을 의미한다. 선행화학요법의 장점은 첫째, 치료 초기에 이미 존재하는 미세 원격 전이 병소를 박멸할 수 있고, 둘째, 종양의 크기를 축소시킴으로써 수술과 방사선 치료를 용이하게 하고, 셋째, 향후 항암화학요법에서의 생체 내 감수성을 알 수 있어 개별적인 치료제의 선택을 가능하게 하고, 넷째, 수술이나 방사선치료에 따른 혈관손상이 없으므로 항암제의 침투율이 높으며, 다섯째, 암을 축소시킴으로써 수술의 범위를 축소시켜 심한 조직 손상을 피할 수 있다는 점이다. 선행화학요법의 도움으로 두경부 종양, 골육종, 항문암, 유방암 등에서 수술범위를 축소시켜 주요 장기를 보존할 수 있어서 환자의 삶을 크게 향상시킬 수 있다.In the present invention, "adjuvant chemotherapy (Neoadjuvant chemotherapy, NCT)" refers to surgery for the purpose of complete cure by reducing the size of the primary tumor and the range of invasion by performing chemotherapy before surgery to a patient whose cancer has progressed locally and cannot be resected. Or, it means chemotherapy performed before local treatment on the premise of radiotherapy. The advantages of prior chemotherapy are: first, it can eradicate microscopic distant metastases that already exist in the early stages of treatment; second, it facilitates surgery and radiotherapy by reducing the size of the tumor; and third, biomaterials in future chemotherapy. Fourth, there is no blood vessel damage due to surgery or radiation treatment, so the penetration rate of anticancer drugs is high. Fifth, the scope of surgery is reduced by reducing cancer to avoid severe tissue damage. that it can. With the help of prior chemotherapy, the scope of surgery can be reduced in head and neck tumors, osteosarcoma, anal cancer, breast cancer, etc., and major organs can be preserved, which can greatly improve patients' lives.
본 발명에 있어서, 상기 선행 항암화학요법에 사용되는 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 도세탁셀(docetaxel), 안트라사이클린(anthracycline), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 트라스투주맙(trastuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the anticancer agents used in the preceding anticancer chemotherapy are doxorubicin, cyclophosphamide, docetaxel, anthracycline, paclitaxel, and trastuzumab ), but may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 조직일 수 있고, 상기 혈액은 전혈, 혈장, 혈청, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the biological sample may be blood or tissue, and the blood may be whole blood, plasma, serum, or blood monocytes, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 선행 항암화학요법 전 유방암 환자의 진단 당시에 채취된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the biological sample may be collected at the time of diagnosis of a breast cancer patient before prior chemotherapy, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, “측정”이란 목적하는 물질의 존재(발현) 여부를 검출 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 검출 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 상기 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 여부 또는 이의 mRNA 발현 여부 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. In the present invention, "measurement" means both detecting and confirming the presence (expression) of a target substance, or detecting and confirming a change in the presence (expression level) of a target substance. The measurement can be performed without limitation including both qualitative methods (analysis) and quantitative methods. The types of qualitative and quantitative methods in measuring the presence or absence of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or their mRNA expression are well known in the art, and the experimental methods described herein are suitable for this purpose. included
본 발명에 있어서, 상기 단백질 존재 수준은 질량 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 방사선면역분석법, 방사능면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역형광염색, 면역친화성정제, 방사능면역침전, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the protein abundance level is measured by mass spectrometry, Western blot, ELISA (enzyme linked immunoassay), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, radioimmunoassay, radioimmunoassay, radioimmunoassay, octerovirus In the group consisting of Outterlony immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunofluorescence staining, immunoaffinity purification, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) and protein chip It may be measured using one or more selected methods, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the mRNA expression level of the protein is determined by polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and competitive RT-PCR. PCR), quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blot It may be measured using one or more methods selected from the group consisting of Northern blotting and DNA chip, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, “예후 예측”이란 유방암 환자의 NCT 후 앞으로의 종양 반응 또는 암의 경과를 예측하는 것으로서, 암의 전이, 재발 또는 전이성 재발의 확률 등을 상기 단백질 존재 수준 또는 단백질의 mRNA 발현 수준을 통해 예측하는 것을 의미한다.In the present invention, "prediction of prognosis" is to predict the future tumor response or progress of cancer after NCT of a breast cancer patient, and the probability of cancer metastasis, recurrence or metastatic recurrence, etc. means to predict through
본 발명에 있어서, 상기 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법 또는 예후 예측 방법은 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 측정된 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the information providing method or the prognostic prediction method for predicting the prognosis of the breast cancer patient after prior anticancer chemotherapy is to measure the protein abundance level or the mRNA expression level of the protein measured in a biological sample isolated from the subject from the control group. A step of comparing the level measured in the separated biological sample may be further included, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후가 좋지 않을 것으로 예측하거나, 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응(pathologic complete response, pCR)을 보이지 않을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 대조군은 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응을 보이는 유방암 환자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, when the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to the control group, prior anticancer of breast cancer patients Poor prognosis after chemotherapy may be predicted or pathologic complete response (pCR) may be predicted after prior chemotherapy, but is not limited thereto. In this case, the control group may be a breast cancer patient showing a pathological complete response after prior chemotherapy, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention is directed to mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (prolyl 4-hydroxylase beta) in a biological sample isolated from a subject. hydroxylase beta, P4HB), an information provision method for predicting responsiveness to prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising measuring the level of presence of one or more proteins selected from the group consisting of or the level of mRNA expression of the protein, or advance of breast cancer patients A method for predicting chemotherapy responsiveness is provided.
본 발명에 있어서, 상기 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측을 위한 정보제공방법 또는 반응성 예측 방법은 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 측정된 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the information providing method or the responsiveness prediction method for predicting the responsiveness of the breast cancer patient to prior chemotherapy is to separate the protein present level or the mRNA expression level of the protein measured in a biological sample isolated from the subject from the control group. It may further include, but is not limited to, a step of comparing the level measured in the biological sample.
본 발명에 있어서, 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우 유방암 환자의 선행 항암화학요법에 대한 반응성이 좋지 않을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 대조군은 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응을 보이는 유방암 환자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, when the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to the control group, prior anticancer of breast cancer patients Poor responsiveness to chemotherapy can be predicted, but is not limited thereto. In this case, the control group may be a breast cancer patient showing a pathological complete response after prior chemotherapy, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 재발 또는 전이 위험도 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 재발 또는 전이 위험도 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention is directed to mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (prolyl 4-hydroxylase beta) in a biological sample isolated from a subject. hydroxylase beta, P4HB), a method for providing information for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis, or a method for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis, comprising measuring the level of the presence of one or more proteins selected from the group consisting of or the mRNA expression level of the protein provides
본 발명에 있어서, 상기 유방암 재발 또는 전이 위험도 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 재발 또는 전이 위험도 예측 방법은 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 측정된 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the method for providing information for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis or the method for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis measures the protein abundance level measured in a biological sample isolated from the subject or the mRNA expression level of the protein from the control group. A step of comparing the level measured in the separated biological sample may be further included, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우 유방암 환자의 암 재발 또는 전이 위험도가 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 대조군은 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응을 보이는 유방암 환자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, when the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to the control group, cancer recurrence of a breast cancer patient Or it can be predicted that the risk of metastasis is high, but is not limited thereto. In this case, the control group may be a breast cancer patient showing a pathological complete response after prior chemotherapy, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2) 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측을 위한 정보제공방법 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a biological sample isolated from a subject from the group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2) and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) An information providing method for predicting survival rate after prior chemotherapy of breast cancer patients or a method for predicting survival rate after prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising measuring the level of presence of one or more selected proteins or the mRNA expression level of the protein to provide.
본 발명에 있어서, 상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2 또는 P4HB의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응을 보이는 유방암 환자에 비해 증가된 경우 환자의 생존율이 낮을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 생존율은 선행 항암화학요법 후의 생존율로서, 선행 항암화학요법 후 외과적 절제 수술을 받는 환자의 생존율이 포함되는 의미이다.In the present invention, when the level of the MBL2 or P4HB protein or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to a breast cancer patient showing a pathological complete response after prior chemotherapy, the patient's It can be predicted that the survival rate will be low, but is not limited thereto. At this time, the survival rate is the survival rate after prior chemotherapy, and means that the survival rate of patients undergoing surgical resection after prior chemotherapy is included.
본 발명에 있어서, 상기 MBL2 또는 P4HB의 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율과 음의 상관관계를 가지는 것일 수 있다. 이에, 상기 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측을 위한 정보제공방법 또는 생존율 예측 방법은 둘 이상의 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, 상기 MBL2의 존재 수준 또는 이의 mRNA 발현 수준이 상대적으로 높을 경우 무질병 생존율(disease-free survival rate) 또는 무원격전이 생존율(distant metastasis-free survival rate)이 상대적으로 낮을 것으로 예측하는 단계; 또는In the present invention, the MBL2 or P4HB protein abundance level or the mRNA expression level of the protein may have a negative correlation with the survival rate of breast cancer patients after prior chemotherapy. Accordingly, the information providing method or the survival rate prediction method for predicting the survival rate of breast cancer patients after prior chemotherapy is nothing if the MBL2 abundance level or its mRNA expression level is relatively high in biological samples separated from two or more subjects. predicting that the disease-free survival rate or the distant metastasis-free survival rate will be relatively low; or
상기 P4HB의 존재 수준 또는 이의 mRNA 발현 수준이 상대적으로 높을 경우 무질병 생존율 또는 전체 생존율(overall survival rate)이 상대적으로 낮을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.A step of predicting that the disease-free survival rate or overall survival rate will be relatively low when the level of the presence of P4HB or the level of mRNA expression thereof is relatively high may be further included, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) Provides a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising an agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein as an active ingredient.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) Provided is a composition for predicting responsiveness to prior chemotherapy in breast cancer patients, comprising an agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein as an active ingredient.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 혈액 또는 조직에서 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the presence level of the protein or the mRNA expression level of the protein may be measured in blood or tissue, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 존재 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the agent for measuring the level of the protein present may be an antibody or an aptamer specific to the protein, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, “항체(antibody)”란 항원성 부위에 대해서 지시되어 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법, 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 등에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체의 단편은 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 낙타 등을 포함한, 상이한 유기체에서 유래될 수 있으며, 예컨대 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편, 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 또는 키메릭 항체 등일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 항체는 본 발명의 단백질을 검출할 수 있는 것이라면 특정 항체의 종류로 한정되지 않는다.In the present invention, "antibody" refers to a protein molecule that is directed to an antigenic site and specifically binds to it. Antibodies can be produced by methods commonly practiced in the art, such as fusion methods, recombinant DNA methods, or phage antibody library methods. In some embodiments, the antibody or fragment of an antibody may be from a different organism, including human, mouse, rat, hamster, rabbit, or camel, such as monoclonal or polyclonal antibodies, immunologically active fragments, antibodies heavy chains, humanized antibodies, antibody light chains, genetically engineered single-chain Fv molecules, or chimeric antibodies, and the like. In the present invention, the antibody is not limited to a specific type of antibody as long as it can detect the protein of the present invention.
본 발명에 있어서, "압타머(aptamer)"란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment)라는 방법으로 원하는 다양한 목적 물질(단백질, 당, 염색물질, DNA, 금속이온, 세포 등)에 대한 압타머를 개발할 수 있다.In the present invention, "aptamer" refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and is capable of binding to a target molecule with high affinity and specificity. and SELEX (Systematic Evolution of Ligands of Exponential Enrichment) to develop aptamers for various target substances (proteins, sugars, dyes, DNA, metal ions, cells, etc.).
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the agent for measuring the mRNA expression level of the protein may be a primer or probe that specifically binds to the mRNA, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 mRNA 또는 이의 cDNA의 염기서열을 참조하여 프라이머 쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.In the present invention, "primer" is a short single-stranded oligonucleotide that serves as a starting point for DNA synthesis. A primer specifically binds to a polynucleotide, which is a template, in an appropriate buffer and temperature conditions, and DNA polymerase adds a nucleoside triphosphate having a base complementary to the template DNA to the primer and connects the DNA. is synthesized Primers generally consist of 15 to 30 nucleotide sequences, and the melting temperature (Tm) of binding to the template strand varies depending on the nucleotide composition and length. The sequence of the primer does not have to have a sequence completely complementary to a part of the nucleotide sequence of the template, and it is sufficient to have a length and complementarity suitable for the purpose of measuring the amount of mRNA by amplifying a specific section of mRNA or cDNA through DNA synthesis. do. Therefore, in the present invention, primer pairs can be easily designed by referring to the nucleotide sequence of the mRNA or its cDNA. The primers for the amplification reaction are composed of a set (pair) that complementarily binds to the template (or sense) and the opposite side (antisense) of both ends of a specific section of the mRNA to be amplified.
본 발명에 있어서, “프로브(probe)”는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA, miRNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.In the present invention, a “probe” is an RNA having a length of several to several hundred base pairs that can specifically bind to mRNA, cDNA (complementary DNA), DNA, miRNA, etc. of a specific gene. Alternatively, it refers to a fragment of a polynucleotide such as DNA, and is labeled, so that the presence or absence of the target mRNA or cDNA to be bound and the expression level can be confirmed. Probe selection and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art. The probe may be used in a diagnostic method for detecting an allele (or allele). The diagnostic methods include detection methods based on hybridization of nucleic acids, such as Southern blotting, etc., and may be provided in a form pre-bound to a substrate of a DNA chip in a method using a DNA chip.
본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.In the present invention, the primer or probe may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods. In addition, primers or probes may be modified in various ways according to methods known in the art to the extent that hybridization with a target polynucleotide to be detected is not hindered. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc. ) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of fluorescent or enzymatic labeling materials.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 mRNA 발현을 측정할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.In the present invention, the primer or probe is not limited to a specific sequence as long as it can measure the expression of one or more mRNAs selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB.
본 발명에 있어서, 상기 MBL2, ENG, 및 P4HB 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 각각 측정하여 단독으로 바이오마커로서 사용할 수 있으며, 이들 마커의 둘 이상의 조합을 바이오마커로서 사용할 수도 있다.In the present invention, the MBL2, ENG, and P4HB protein abundance levels or mRNA expression levels of the proteins may be measured individually and used as biomarkers, or a combination of two or more of these markers may be used as biomarkers.
예컨대, MBL2; ENG; P4HB;eg MBL2; ENG; P4HB;
MBL2 및 ENG; MBL2 및 P4HB; ENG 및 P4HB; 또는MBL2 and ENG; MBL2 and P4HB; ENG and P4HB; or
MBL2, ENG, 및 P4HB의 조합을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Combinations of MBL2, ENG, and P4HB may be used, but are not limited thereto.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 키트 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients or a kit for predicting responsiveness to prior chemotherapy for breast cancer patients, including the composition.
본 발명에 있어서, “키트”는 상기 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함함으로써, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후를 예측하거나 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성을 예측할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 제제 외에도 이들의 측정 또는 검출 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 이때, 상기 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 1회 이상 횟수에 제한 없이 작용시킬 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.In the present invention, the "kit" includes an agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB, or the expression level of the mRNA of the protein, thereby providing an advance chemotherapy for breast cancer patients. It refers to a tool that can predict the prognosis or the response of breast cancer patients to prior chemotherapy. In addition to the above preparations, the kit of the present invention may include other components, compositions, solutions, devices, etc. normally required for their measurement or detection method. At this time, the material for measuring the expression level of the protein or mRNA can be applied one or more times without limitation, and there is no limitation before and after applying each material, and the application of each material may be performed simultaneously or microscopically. there is.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 및 상기 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 제제를 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있다.In the present invention, the kit is a container; directions; and an agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB, or the mRNA expression level of the protein. The container may serve to package the formulation, and may also serve to store and fix. The material of the container may take the form of, for example, a bottle, tub, sachet, envelope, tube, ampoule, etc., which may be partly or entirely made of plastic, glass, paper, or foil. , waxes, and the like. The container may be equipped with a fully or partially removable stopper, which is initially part of the container or which may be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means, and which provides access to the contents by a needle. A stopper may be installed. The kit may include an external package, and the external package may include instructions for use of the components.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제; 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측 용도 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측 용도를 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) An agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein; Or it provides a composition containing it as an active ingredient, for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients or for predicting responsiveness to prior chemotherapy for breast cancer patients.
또한, 본 발명은 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제; 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측 또는 유방암 환자의 선행 항암화학요법 반응성 예측을 위한 제제의 제조를 위한 용도를 제공한다.In addition, the present invention is a group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) An agent for measuring the presence level of one or more proteins selected from or the mRNA expression level of the protein; Or it provides a use for the preparation of a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients or prediction of responsiveness to prior chemotherapy of breast cancer patients, of a composition comprising the same as an active ingredient.
또한, 본 발명은 유방암 환자의 NCT 후 예후가 좋지 않을 것으로 의심되는 피검체 또는 NCT에 대한 반응성이 낮을 것으로 의심되는 피검체와 대조군에서 분리된 생물학적 시료에서 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 엔도글린(endoglin, ENG), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 수준을 측정한 후, 이 수준 차이가 (2배 이상으로) 증가한 경우 NCT 후 유방암 환자의 예후가 좋지 않은 피검체 또는 NCT에 대한 반응성이 낮은 피검체임을 가리키는 것으로 보는, NCT 후 유방암 환자의 예후 예측 또는 NCT에 대한 반응성 예측에 대한 감수성이 높은 피검체인지 결정/분석하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is a test subject suspected of having a poor prognosis after NCT of a breast cancer patient or a subject suspected of having a low reactivity to NCT and a biological sample isolated from a control group, mannose-binding lectin 2 (mannose-binding lectin 2) , MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) after measuring the level of one or more proteins selected from the group consisting of, the level difference Sensitivity for predicting the prognosis of breast cancer patients after NCT or predicting responsiveness to NCT, which is considered to indicate that a subject with a poor prognosis or a subject with a low response to NCT, if increased (more than 2 times) A method for providing information for determining/analyzing whether a subject is high is provided.
본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.In the present invention, when the term "comprising" is used, it means that other components may be further included without excluding other components unless otherwise stated. The term "step of (doing)" or "step of" used throughout the present invention does not mean "step for".
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments and experimental examples are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples and experimental examples are only provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 실험 참가자 및 관찰Example 1. Experiment participants and observations
본 실험에서 대상자는 NCT로 치료받은 21세 이상의 비-전이성 유방암 여성이었다. 처음에는 2014년 2월부터 2017년 4월까지 서울아산병원에서 선행 항암화학요법(Neoadjuvant chemotherapy, NCT)으로 치료받은 유방암 환자 60명이 등록되었으며, 마지막으로 이용 가능한 종양 및 치료 정보가 있는 51명의 환자가 실험에 포함되었다. 본 실험은 서울아산병원 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았으며(IRB-e no. 2013-1048), REMARK 기준에 따라 수행되었다. 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았으며, 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.Subjects in this trial were women aged 21 years or older with non-metastatic breast cancer treated with NCT. Initially, 60 breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy (NCT) at Asan Medical Center in Seoul from February 2014 to April 2017 were enrolled, and finally 51 patients with available tumor and treatment information were enrolled. included in the experiment. This experiment was approved by the Institutional Review Board (IRB) of Asan Medical Center (IRB-e no. 2013-1048) and was performed according to REMARK standards. Written informed consent was obtained from all participants, and all experiments were performed in accordance with relevant guidelines and regulations.
모든 환자는 표준 치료를 받았으며 정기적인 관찰을 수행하였다. 초기 진단 및 후속 검사에는 유방조영술, 유방 초음파 영상, 자기 공명 영상, 흉부 X-레이, 혈액 샘플링 및 임상 검사가 포함되었다. ER 및 프로게스테론 수용체 발현은 Allred 점수를 기반으로 평가되었다. HER2 상태는 면역조직화학 점수가 1+이거나, 또는 점수가 2+이고 HER2 증폭을 위한 in situ 이종 교배(hybridization)에서 형광 또는 은(silver)의 결과가 음성이면 음성으로 간주되었다. 임상 및 조직병리학적 병기설정은 미국공동암위원회(American Joint Committee on Cancer)의 암 병기설정 매뉴얼(Cancer Staging Manual) 7판을 기반으로 하였다. 임상 치료 반응은 각 치료 타임라인(기준선, 첫 번째 치료 후, 및 NCT 과정 완료 후)에서 신체 검사 및 영상 평가 모두에 의해 평가되었다. 종양 반응은 고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors)(RECIST 1.1)에 의해 평가되었다.All patients received standard treatment and regular observations were performed. Initial diagnosis and follow-up examinations included mammography, breast ultrasound imaging, magnetic resonance imaging, chest X-ray, blood sampling, and clinical examination. ER and progesterone receptor expression were evaluated based on the Allred score. HER2 status was considered negative if the immunohistochemistry score was 1+, or if the score was 2+ and fluorescence or silver results in in situ hybridization for HER2 amplification were negative. Clinical and histopathological staging was based on the Cancer Staging Manual 7th Edition of the American Joint Committee on Cancer. Clinical treatment response was assessed by both physical examination and imaging evaluation at each treatment timeline (baseline, after first treatment, and after completion of the NCT course). Tumor response was assessed by the Response Evaluation Criteria In Solid Tumors (RECIST 1.1).
실시예 2. 샘플 준비Example 2. Sample preparation
단백질 분석을 위해 LC-MS 분석을 수행하였으며, 이를 위한 51개의 임상 혈장 샘플을 준비하였다. 유방암 환자의 혈장 샘플은 NCT 치료 전 유방암 진단 시점의 혈액으로부터 채취하였다. 혈장 샘플을 Shimadzu 바이너리 HPLC 시스템(20A Prominence, Shimadzu, 일본)의 MARS14 컬럼(100 × 4.6 mm; Agilent Technology, Palo Alto, 미국)에 로드하여 14개의 매우 풍부한 단백질을 감소시키고, 결합되지 않은 분획을 콜드 트랩(CentriVap Cold Traps; Labconco, Kansas City, 미국)으로 동결건조하였다. 그런 다음, 건조된 샘플을 50 mM TEAB(pH 7.55) 중 400 μL의 5 % SDS에 재현탁하고, 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 95 ℃에서 10분 동안 20 mM의 최종 농도에 첨가하여 이황화 결합을 환원시켰다. 환원된 샘플은 어두운 곳에서 실온으로 30분 동안 40 mM 요오드아세트아미드(iodoacetamide)와 함께 배양하였다. 그리고 나서, 12 % 인산을 10배 희석하여 산성화된 샘플을 S-Trap 미니 컬럼(ProtiFi, Farmingdale, 미국; Cat. No: CO2-mini-80)에 로딩하였다. 이후 제조업체의 프로토콜에 따라 현탁액 트랩(S-트랩) 단백질 분해를 처리한 다음, 10 μg Lys-C/트립신 혼합물을 첨가하고 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기로부터 용출된 펩타이드 혼합물을 콜드 트랩을 사용하여 동결건조하고 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.LC-MS analysis was performed for protein analysis, and 51 clinical plasma samples were prepared for this purpose. Plasma samples of breast cancer patients were collected from blood at the time of breast cancer diagnosis before NCT treatment. Plasma samples were loaded onto a MARS14 column (100 × 4.6 mm; Agilent Technology, Palo Alto, USA) on a Shimadzu binary HPLC system (20A Prominence, Shimadzu, Japan) to reduce 14 highly abundant proteins, and unbound fractions were cold Lyophilization was performed using CentriVap Cold Traps (Labconco, Kansas City, USA). Then, the dried sample was resuspended in 400 μL of 5% SDS in 50 mM TEAB (pH 7.55), and dithiothreitol was added to a final concentration of 20 mM for 10 min at 95 °C to break down disulfide bonds. has been returned. Reduced samples were incubated with 40 mM iodoacetamide for 30 minutes at room temperature in the dark. The acidified sample was then loaded onto an S-Trap mini column (ProtiFi, Farmingdale, USA; Cat. No: CO2-mini-80) in 10-fold dilution of 12% phosphoric acid. Suspension Trap (S-Trap) proteolysis was then performed according to the manufacturer's protocol, followed by addition of 10 μg Lys-C/trypsin mixture and incubation at 37 °C for 16 h. The peptide mixture eluted from above was lyophilized using a cold trap and stored at -80 °C until use.
실시예 3. 나노-LC-ESI-MS/MS 분석Example 3. Nano-LC-ESI-MS/MS Analysis
LC 시스템은 Dionex UltiMate 3000 RSLCnano 시스템(Thermo Fisher Sci-entific, Waltham, 미국)을 사용하였다. 이동상 A로는 물에 녹인 0.1 % 포름산(formic acid) 및 5 % DMSO를 사용하였고, 이동상 B로는 물에 녹인 0.1 % 포름산, 5 % DMSO, 및 80 % 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하였다. As the LC system, a Dionex UltiMate 3000 RSLCnano system (Thermo Fisher Sci-entific, Waltham, USA) was used. As the mobile phase A, 0.1% formic acid and 5% DMSO dissolved in water were used, and as the mobile phase B, 0.1% formic acid, 5% DMSO, and 80% acetonitrile dissolved in water were used.
샘플은 25 μL의 이동상 A로 재구성되고, 5 μL의 전체 샘플 루프 주입으로 C18 Pepmap 트랩 컬럼(20 × 100 μm i.d., 5 μm, 100 Å; Thermo Fisher Scientific)에 주입되었으며, 50 ℃에서 200분(250 nL/분)에 걸쳐 AcclaimTM Pepmap 100 C18 컬럼(500 × 75 μm i.d., 3 μm, 100 Å, Thermo Fisher Scientific)에서 분리되었다. 컬럼은 95 % 이동상 A 및 5 % 이동상 B로 사전에 평형을 이루었다. 150분 동안 5-40 % B, 2분 동안 40-95 %, 23분 동안 95 %, 10분 동안 95-5 % B, 및 15분 동안 5 % B의 구배를 적용하였다. LC 시스템은 나노-ESI 소스가 있는 Q Exactive plus 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에 연결되었으며, 기기는 데이터 종속 모드에서 작동되었다. 하나의 스캔 주기에는 m/z 400에서 70,000의 해상도로 MS1 스캔 1회가 포함되었으며, MS1 스펙트럼에서 확인된 가장 풍부한 전구체 이온 20개를 단편화하기 위해 고에너지 충돌 해리 모드에서 MS2 스캔 20회가 포함되었다. Orbitrap의 MS1에 대한 목표 값은 100 ms의 최대 주입 시간으로 3 × 106이었다. MS2에 대한 이온 타겟 값은 m/z 400에서 50 ms의 최대 주입 시간 및 17,500의 해상도(resolution)로 1 × 106으로 설정되었다. The sample was reconstituted with 25 μL of mobile phase A and injected onto a C18 Pepmap trap column (20 × 100 μm id, 5 μm, 100 Å; Thermo Fisher Scientific) with a total sample loop injection of 5 μL and incubated at 50 °C for 200 min ( 250 nL/min) on an Acclaim ™ Pepmap 100 C18 column (500×75 μm id, 3 μm, 100 Å, Thermo Fisher Scientific). The column was pre-equilibrated with 95% mobile phase A and 5% mobile phase B. A gradient of 5-40% B for 150 minutes, 40-95% for 2 minutes, 95% for 23 minutes, 95-5% B for 10 minutes, and 5% B for 15 minutes was applied. The LC system was connected to a Q Exactive plus mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) with a nano-ESI source, and the instrument was operated in data dependent mode. One scan cycle included one MS1 scan with a resolution of 70,000 at m/
동적 제외는 다음 설정으로 작동되었다: 반복 횟수 = 1 및 제외 기간 = 20초. Dynamic exclusion was run with the following settings: number of iterations = 1 and exclusion period = 20 seconds.
모든 MS 데이터는 PXD028251 하의 PRIDE(Proteomics Identification Database) 아카이브에 보관되었다.All MS data were archived in the PRIDE (Proteomics Identification Database) archive under PXD028251.
실시예 4. 데이터베이스 검색에 의한 단백질 확인Example 4. Protein Identification by Database Search
MS 분석을 획득한 개별 raw 파일은 Proteome Discoverer(버전 2.2, Thermo Fisher Scientific)의 SEQUEST-HT를 사용하여 검토된 인간 Uniprot-SwissProt 단백질 데이터베이스(2017년 5월 공개)에 대해 검색하였다. Individual raw files obtained for MS analysis were searched against the reviewed human Uniprot-SwissProt protein database (published May 2017) using SEQUEST-HT in Proteome Discoverer (version 2.2, Thermo Fisher Scientific).
사용된 검색 매개변수는 다음과 같다: 전구체 이온 질량에 대한 허용 오차 10 ppm, 단편 이온 질량에 대한 허용 오차 0.02 Da. The search parameters used were: 10 ppm tolerance for precursor ion mass, 0.02 Da tolerance for fragment ion mass.
트립신 펩타이드는 최대 2개의 잘못된 절단을 허용한다. 시스테인의 카르바미도메틸화(carbamidomethylation)는 고정된 변형으로 설정하였고 N-말단 아세틸화 및 메티오닌 산화는 가변 변형으로 설정하였다. FDR(False Discovery Rate)은 타겟-디코이(target-decoy) 검색 전략을 사용하여 계산하였으며, FDR의 1 % 이내의 펩타이드는 SEQUEST 기반 후-처리 세미-지도 학습 도구인 Percolator를 사용하여 선택하였다. 단백질의 라벨-프리 정량화(LFQ)는 각 단백질의 고유한 razor 펩타이드 및 메티오닌 산화로 제외된 펩타이드에 대한 전구체 이온 피크 강도를 사용하여 계산하였다.Tryptic peptides tolerate up to two false cleavages. Carbamidomethylation of cysteine was set as fixed modification and N-terminal acetylation and methionine oxidation were set as variable modification. The false discovery rate (FDR) was calculated using a target-decoy search strategy, and peptides within 1% of the FDR were selected using Percolator, a SEQUEST-based post-processing semi-supervised learning tool. Label-free quantification (LFQ) of proteins was calculated using the precursor ion peak intensities for each protein's unique razor peptide and peptides excluded by methionine oxidation.
실시예 5. 정규화 및 누락 데이터 채우기를 통한 차별적 데이터 분석Example 5. Differential data analysis through normalization and filling in missing data
LFQ에서 주로 사용되는 내인성 정규화 단백질에 의한 정규화 방법을 수행하였다. 본 실험에서는 pCR 및 non-pCR 그룹 간의 차이가 가장 작기 때문에 Normfinder 소프트웨어를 통해 4개의 단백질(C6, HPX, KNG1, 및 SER-PINC1)을 선택하였다. A normalization method was performed by an endogenous normalization protein mainly used in LFQ. In this experiment, four proteins (C6, HPX, KNG1, and SER-PINC1) were selected through Normfinder software because the difference between the pCR and non-pCR groups was the smallest.
4가지 단백질의 정량적 값은 혈장 샘플의 특성에 따라 달라지므로 모든 샘플에서 해당 단백질의 중앙값을 나누어 스케일링하였다. 그 후, 각 샘플에 대한 4개의 단백질의 조정된 비율 값의 기하학적 평균을 계산하고 이를 해당 샘플에 대한 정규화 스케일링 인자(NSF)로 정의하였다. 4개 단백질을 제외한 나머지 단백질의 정규화된 정량값은 각 샘플의 raw 단백질 정량값을 NSF에 의해 나누어 도출하였다. 이러한 방법의 세부 사항은 이전 연구를 참고하였다(Cancers (Basel). 2021 May 11;13(10):2300., Int J Mol Sci. 2020 Jun; 21(12): 4236., Sci Rep. 2018; 8: 16892.).Since the quantitative values of the four proteins depend on the characteristics of plasma samples, they were scaled by dividing the median values of the proteins in all samples. Then, the geometric mean of the adjusted ratio values of the four proteins for each sample was calculated and defined as the normalized scaling factor (NSF) for that sample. The normalized quantification values of the remaining proteins except for the four proteins were derived by dividing the raw protein quantification values of each sample by NSF. Details of these methods refer to previous studies (Cancers (Basel). 2021 May 11;13(10):2300., Int J Mol Sci. 2020 Jun; 21(12): 4236., Sci Rep. 2018; 8: 16892.).
단백질은 모든 샘플에서 정량화된 단백질의 >80 %를 기준으로 선택하였고, 누락된 데이터는 raw 존재비에서 100 % 정량화된 단백질과의 상관관계를 통해 계산하는 로컬 최소 제곱 대체 방법(local least squared imputation method)으로 채웠으며, 이후 정규화를 수행하였다.Proteins were selected based on >80% of quantified proteins in all samples, and missing data were calculated by the local least squared imputation method, which is calculated through correlation with 100% quantified proteins in raw abundance. , and then normalization was performed.
실시예 6. 특징 선택에 기반한 통계적 임상 모델 제조Example 6. Manufacturing of statistical clinical models based on feature selection
4가지 단백질[아포리포단백질 C3(apolipoprotein C3, APOC3), 엔도글린(endoglin, ENG), 만노스-결합 렉틴 2(mannose-binding lectin 2, MBL2), 및 프롤릴 4-하이드록실라제 베타(prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)]에서 최적의 하위 집합을 식별하기 위해 기능 선택을 수행하여, 랜덤 포레스트(Random Forest, RF) 기반 역방향 제거 프로세스를 통해 환자를 두 가지 NCT 반응군으로 분류하였다. 상기 프로세스는 다음 두 단계로 구성된다: Four proteins [apolipoprotein C3 (APOC3), endoglin (ENG), mannose-binding lectin 2 (MBL2), and prolyl 4-hydroxylase beta (prolyl 4-hydroxylase beta, P4HB)], patients were classified into two NCT responders through a random forest (RF)-based reverse elimination process. The process consists of two steps:
ⅰ) 4개의 변수를 포함하는 10,000개의 결정 트리(decision tree)를 무작위로 생성하고 AUC(Area under the Curve) 값을 계산하였다. AUC 값은 out-of-bag 오류 추정을 사용하여 최적의 단백질 수를 결정하는데 사용하였으며, 3개의 값을 산출하였다. ⅰ) 10,000 decision trees including 4 variables were randomly generated and AUC (Area under the Curve) values were calculated. AUC values were used to determine the optimal number of proteins using out-of-bag error estimation, yielding three values.
ⅱ) 모델에 포함된 각 변수의 예측 중요도를 계산하기 위해 선택된 3개의 변수를 사용하여 50회 반복 및 3중 교차 검증을 수행하였으며, 3개의 단백질(>0.5 선택 확률)을 선택하였다. 센터링 및 스케일링을 포함한 데이터 전처리는 모델 구축 전에 수행하였다. 전체 데이터를 사용하여 트레이닝 및 검증 세트를 3분의 1로 나누었으며, 트레이닝 세트에서 비용 매개변수가 최적화된 선형 커널 서포트 벡터 머신(linear kernel support vector machine, SVM) 모델은 3중 교차 검증의 3회 반복을 통해 생성되었다. RF 모델은 10,000개의 트리 및 노드(node) 크기 = 5로 3중 교차 검증의 3회 반복을 통해 mtry 매개변수로 최적화되었다. 머신 러닝(ML) 모델 예측 값은 검증 세트(트레이닝 세트 샘플 없이)에서 얻고, ROC 분석을 수행하였다. 이러한 프로세스는 세트를 무작위로 바꿔가며 100회 진행하였다.ii) To calculate the predictive importance of each variable included in the model, 50 iterations and triple cross-validation were performed using the three selected variables, and three proteins (>0.5 selection probability) were selected. Data preprocessing including centering and scaling was performed before model construction. The training and validation sets were divided into thirds using the full data, and a linear kernel support vector machine (SVM) model with optimized cost parameters in the training set was obtained through three rounds of triple cross-validation. created through repetition. The RF model was optimized with mtry parameters through three iterations of triple cross-validation with 10,000 trees and node size = 5. Machine learning (ML) model prediction values were obtained from the validation set (without training set samples) and ROC analysis was performed. This process was performed 100 times by randomly changing the set.
실시예 7. 공용 마이크로어레이 데이터 마이닝Example 7. Public microarray data mining
마이크로어레이(microarray) 유전자 발현 데이터(series accession number: GSE22513 및 GSE22093)는 Gene Expression Omnibus 데이터베이스에서 다운로드 하였다. GEO2R 상호적 웹 도구를 사용하여 플랫폼 기록 및 발현 값에 따라 선택된 3개의 유전자와 매치되는 3개의 식별자를 추출하였다. 하나의 유전자에 대한 프로브가 두 개 이상인 경우 중앙값을 추정하였다.Microarray gene expression data (series accession numbers: GSE22513 and GSE22093) were downloaded from the Gene Expression Omnibus database. The GEO2R interactive web tool was used to extract three identifiers matching the selected three genes according to platform records and expression values. Median values were estimated when there were more than two probes for one gene.
실시예 8. 통계적 방법Example 8. Statistical methods
DFS(disease-free survival), DMFS(distant metastasis-free survival), 및 OS(overall survival)를 포함하여 생존 분석을 수행하였다. DFS는 연구에 등록한 날짜부터 모든 종류의 재발의 첫번째 날짜까지의 시간으로 정의되었다. DMFS 및 전체 생존(OS)은 각각 연구에 등록한 날짜와 원격 전이 날짜 또는 모든 원인으로 인한 사망 날짜 사이에 경과된 시간으로 정의되었다. IBM SPSS Statistics 버전 26을 사용하여 통계 분석을 수행하였으며, 일변량 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 확률을 추정하였다. 또한, 다음 임상 매개변수를 사용하여 각 단백질체(proteome)에 대해 다변량 Cox 비례 위험 회귀 분석을 수행하였다: 진단 시 환자 연령; 임상적 종양 단계; 노드(node)의 상태; 호르몬 수용체(HR) 상태; 및 HER2 상태. P-value<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.Survival analysis was performed including disease-free survival (DFS), distant metastasis-free survival (DMFS), and overall survival (OS). DFS was defined as the time from the date of study enrollment to the first date of any relapse. DMFS and overall survival (OS) were defined as the time elapsed between the date of enrollment in the study and the date of distant metastasis or all-cause death, respectively. Statistical analysis was performed using IBM SPSS Statistics version 26, and survival probabilities were estimated using the univariate Kaplan-Meier method. In addition, multivariate Cox proportional hazards regression analysis was performed for each proteome using the following clinical parameters: patient age at diagnosis; clinical tumor stage; state of the node; hormone receptor (HR) status; and HER2 status. A P-value<0.05 was considered statistically significant.
단백질체 데이터 평가는 바이올린 및 볼케이노 플롯을 표시하기 위한 ggplot2, PLA-DA를 위한 mixOmics, VIP 점수 계산을 위한 RVAideMemoire, t-테스트를 적용하기 위한 stats, 결측 데이터 대체를 위한 pcaMethods, 생존 분석을 위한 survival, 최대로 선택된 순위 통계(그룹당 관찰의 최소 비율: 20 %)로 컷오프 값을 결정하기 위한 survminer, 및 GEO 세트 다운로드를 위한 GEOquery를 포함하는 여러 가지 패키지와 함께 통계 언어 R 3.6.0 및 RStudio 1.1.456를 통해 수행하였다.Proteomic data evaluation is performed using ggplot2 for displaying Violin and Volcano plots, mixOmics for PLA-DA, RVAideMemoire for calculating VIP scores, stats for applying t-tests, pcaMethods for imputing missing data, survival for survival analysis, Statistical Language R 3.6.0 and RStudio 1.1.456, with several packages including survminer for determining cutoff values with maximally selected rank statistics (minimum proportion of observations per group: 20%), and GEOquery for downloading GEO sets. was carried out through
[실험예][Experimental example]
실험예 1. 환자 특징 분석Experimental Example 1. Analysis of patient characteristics
각 하위 그룹의 환자 특성과 환자의 NCT 요법은 하기 표 1에 요약하였다. The patient characteristics of each subgroup and the patients' NCT regimens are summarized in Table 1 below.
(n = 20)(n = 20)
(n = 5)(n = 5)
(n = 5)(n = 5)
(n = 21)(n = 21)
(AC: 아드리아마이신 및 시클로포스파미드(adriamycin and cyclophosphamide), BCS: 유방보존술(breast conserving surgery), CR: 완전 반응(complete response), D: 도세탁셀(docetaxel), FEC: 플루오로우라실(fluorouracil), 에피루비신(epirubicin), 및 시클로포스파미드, N/A: 해당없음, NCT: 선행 항암화학요법(neoadjuvant chemotherapy), pCR: 병리학적 완전 반응(pathologic complete response), PD: 진행성 질환(progressive disease), PR: 부분 반응(partial response), RECIST: 고형 종양의 반응 평가 기준(response evaluation criteria in solid tumors), SD: 안정 병변(stable disease). *시험 결과는 아직 보고되지 않았다.)(AC: adriamycin and cyclophosphamide, BCS: breast conserving surgery, CR: complete response, D: docetaxel, FEC: fluorouracil ), epirubicin, and cyclophosphamide, N/A: not applicable, NCT: neoadjuvant chemotherapy, pCR: pathologic complete response, PD: progressive disease ( progressive disease), PR: partial response, RECIST: response evaluation criteria in solid tumors, SD: stable disease. *Test results not yet reported.)
20명의 환자(47.5 %)가 HR+/HER2-, 5명의 환자(8.5 %)가 HR+/HER2+, 5명의 환자(10.2 %)가 HER2+였으며, 21명의 환자(33.9 %)가 TNBC(triple-negative breast cancer)를 가지고 있는 것을 확인하였다. 평균 연령은 59세(범위, 32~66세; 중간 연령, 46세)였으며, 38명의 환자(74.5 %)가 림프절 양성이었다. TNBC 환자는 종양 핵 등급이 상당히 높았다(등급 3, 57.1 %). 20 patients (47.5%) had HR+/HER2−, 5 patients (8.5%) had HR+/HER2+, 5 patients (10.2%) had HER2+, and 21 patients (33.9%) had triple-negative breast cancer (TNBC). cancer) was confirmed. The mean age was 59 years (range, 32 to 66 years; median age, 46 years), and 38 patients (74.5%) had positive lymph nodes. TNBC patients had a significantly higher tumor nuclear grade (
또한, 47명의 환자(92.2 %)가 안트라사이클린(anthracycline) 기반 화학 요법을 받았다. RECIST 기준(Eur J Cancer. 2009 Jan;45(2):228-47.)에 따르면, 49명의 환자(96.1 %)가 부분 또는 완전 반응(PR 또는 CR)을 보였고, 2명의 환자(3.9 %)가 진행성 질환을 보였으며, 안정 병변은 나타나지 않았다. 51명의 환자 중 26명이 유방보존술 후 방사선 치료를 받았고(100.0 %, 26/26), 25명이 유방절제술을 받았다. 25명의 환자 중 종양 병기 ≥ 3 또는 노드 단계 ≥ 2인 20명(80.0 %)의 환자가 선택적으로 방사선 치료를 받았다. 모든 HR-양성 환자는 수술 후 호르몬 치료를 받았다. 15명의 환자(29.4 %, 15/51)가 pCR에 도달하였고, pCR 비율은 HER2+ 또는 삼중음성 종양(HER2+, 40 %, 2/5; HR+/HER2+, 60 %, 3/5; 및 삼중음성, 38.1 %, 8/21)에서 HR+/HER2- 환자(10.0 %, 2/20)에 비해 유의적으로 높았으며, 이러한 결과는 이전 연구와 일치하였다(Clin Cancer Res. 2007 Apr 15;13(8):2329-34., Clin Cancer Res. 2005 Aug 15;11(16):5678-85.).Additionally, 47 patients (92.2%) received anthracycline-based chemotherapy. According to RECIST criteria (Eur J Cancer. 2009 Jan;45(2):228-47.), 49 patients (96.1%) showed a partial or complete response (PR or CR), and 2 patients (3.9%) showed progressive disease, and stable lesions were not observed. Of the 51 patients, 26 underwent radiotherapy after mastectomy (100.0%, 26/26), and 25 underwent mastectomy. Of the 25 patients, 20 (80.0%) patients with tumor stage ≥ 3 or nodal stage ≥ 2 received elective radiotherapy. All HR-positive patients received hormone therapy after surgery. Fifteen patients (29.4%, 15/51) reached pCR, and the pCR ratio was HER2+ or triple negative tumors (HER2+, 40%, 2/5; HR+/HER2+, 60%, 3/5; and triple negative, 38.1%, 8/21) compared to HR+/HER2- patients (10.0%, 2/20), and these results are consistent with previous studies (Clin Cancer Res. 2007
실험예 2. LC-MS/MS에 의한 임상 혈장 샘플의 단백질체 분석 결과Experimental Example 2. Results of proteomic analysis of clinical plasma samples by LC-MS/MS
NCT 후 pCR이 있거나 없는 유방암 환자에서 바이오마커 식별을 위한 워크플로우를 도 1에 나타낸 바와 같이 확립하였다. A workflow for biomarker identification in breast cancer patients with or without pCR after NCT was established as shown in FIG. 1 .
pCR에 대한 예후 마커 후보를 확인하기 위해, NCT 후 pCR이 있는 15명과 없는 36명을 포함하여 51명의 유방암 환자로부터 임상 혈장 샘플을 수집하였다. 51명의 실험 참가자로부터 고갈된(depleted) 혈장 샘플을 사용하여 단일 LC-MS/MS 실행을 통해 구성 단백질을 분석함으로써 594개의 단백질을 식별하였다. 그 중 548개의 단백질을 라벨-프리 정량화 방법을 사용하여 하나 이상의 샘플에서 정량화 하였다. 이 중에서 상대적으로 안정적인 4개의 풍부한 단백질(C6, HPX, KNG1 및 SERPINC1)을 사용하여 다른 후보 물질의 raw 존재비를 정규화했으며, 이는 임상 적용을 위한 샘플의 최소 80 %에서 정량화되었다. 도 2a는 51명의 유방암 환자에서 혈장 단백질 풍부도를 정규화하여 박스플롯(boxplot)으로 나타낸 결과이다. To identify candidate prognostic markers for pCR, clinical plasma samples were collected from 51 breast cancer patients, including 15 with and 36 without pCR, after NCT. 594 proteins were identified by analyzing the constituent proteins in a single LC-MS/MS run using depleted plasma samples from 51 experimental participants. Among them, 548 proteins were quantified in at least one sample using a label-free quantification method. Among these, four relatively stable and abundant proteins (C6, HPX, KNG1 and SERPINC1) were used to normalize the raw abundance of other candidates, which were quantified in at least 80% of samples for clinical application. Figure 2a is a result of normalizing plasma protein abundance in 51 breast cancer patients and showing a box plot (boxplot).
정규화 전 누락된 값을 대체하였으며, 정규화 후 305개 단백질 중 254개 공통 단백질이 공개된 혈장 단백질체 데이터베이스(Nucleic Acids Res. 2014 Jan;42(Database issue):D959-65.)의 혈장 농도와 상당한 양의 상관관계를 보이는 것을 도 2b를 통해 확인하였다(ρ=0.657; Pearson 상관 계수, 순열 p<0.001). Missing values were replaced before normalization, and after normalization, 254 common proteins out of 305 proteins were compared to plasma concentrations and significant amounts of published plasma proteomic database (Nucleic Acids Res. 2014 Jan;42(Database issue):D959-65.). It was confirmed through FIG. 2b that the correlation of (ρ=0.657; Pearson correlation coefficient, permutation p<0.001).
도 2c는 부분 최소 제곱-판별 분석(PLS-DA) 점수 플롯을 나타낸 것으로서, 도 2c에 나타낸 바와 같이 PLS-DA는 pCR 그룹과 비-pCR 그룹이 구성 요소 1(6 %)과 구성 요소 2(17 %)의 두 구성 요소로 분리되었음을 확인하였다. Figure 2c shows a partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) score plot. 17%) was confirmed to be separated into two components.
또한, 도 2d는 상기 26개 단백질의 VIP(variable importance in projection) 점수 순서 기여도를 나타낸 것으로서, 도 2d에 나타낸 바와 같이 상위 26개 단백질의 VIP 점수는 >1.5였다. In addition, FIG. 2d shows the order contribution to variable importance in projection (VIP) scores of the 26 proteins. As shown in FIG. 2d, the VIP scores of the top 26 proteins were >1.5.
통계 분석을 수행하여 pCR 예측 마커 후보를 확인하였으며, 임상 모델 구축을 위해 분자 기능 용어 및 프로세스에 의해 주석이 달린 4개의 단백질이 선택되었다. 마지막으로, 재발, 사망 및 전이 사례를 포함하는 3개의 바이오마커를 선택하여 생존 분석에 사용하였다.Statistical analysis was performed to identify pCR predictive marker candidates, and four proteins annotated by molecular functional terms and processes were selected for clinical model construction. Finally, three biomarkers including relapse, death and metastases were selected and used for survival analysis.
실험예 3. pCR 및 non-pCR 유방암 환자 사이에 차등적으로 풍부한 혈장 단백질 확인Experimental Example 3. Confirmation of differentially abundant plasma proteins between pCR and non-pCR breast cancer patients
두 그룹 사이에 차등적으로 풍부한 혈장 단백질(DAP)을 식별하기 위해 스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였으며, -log10 p-value에 대한 log2 배수 변화를 나타내기 위해 볼케이노 플롯을 그려 확인하였다. Statistical analysis was performed using the Student's t-test to identify the differentially abundant plasma protein (DAP) between the two groups, and a volcano plot was drawn to represent the log 2 fold change for the -log 10 p-value. Confirmed.
도 3a는 pCR 및 기능적 해석에 의해 변경된 DAP에 대한 볼케이노 플롯 결과를 나타낸 것으로서, 도 3a에 나타낸 바와 같이 pCR 그룹(n=15)에서 단독으로 상향 조절된 단백질 및 non-pCR 그룹(n=36)에서 3개의 단백질을 확인하였다(p<0.05 및 |fold-change| > 2). Figure 3a shows the results of the Volcano plot for DAP altered by pCR and functional analysis. As shown in Figure 3a, the protein up-regulated alone in the pCR group (n = 15) and the non-pCR group (n = 36) 3 proteins were identified (p<0.05 and |fold-change| > 2).
또한, 상기 4가지 단백질의 풍부도가 교란 변수로서 유방암 하위 유형과 관련이 있는지 조사하였다. 이를 위해 각 단백질을 pCR 상태에 따라 계층화하고 하위 유형(HER2 및 HR 양성 또는 음성)에 따른 정량적 차이를 통계적으로 분석하였다(p<0.05). 도 3b는 pCR 및 HER2 존재에 의해 나뉜 유방암 환자 그룹에서 4개의 단백질(MBL2, ENG, P4HB, 및 APOC3)의 박스플롯 결과를 나타낸 것이고, 도 3c는 pCR 및 호르몬 수용체(HR) 존재에 의해 나뉜 유방암 환자 그룹에서 상기 4개 단백질의 박스플롯 결과를 나타낸 것으로서, 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이 하위 유형이 교란 변수로 4개의 단백질에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.In addition, we investigated whether the abundance of the four proteins was related to breast cancer subtype as a confounding variable. To this end, each protein was stratified according to pCR status, and quantitative differences according to subtype (positive or negative for HER2 and HR) were statistically analyzed (p<0.05). Figure 3b shows the boxplot results of four proteins (MBL2, ENG, P4HB, and APOC3) in breast cancer patient groups divided by the presence of pCR and HER2, and Figure 3c shows the breast cancer divided by the presence of pCR and hormone receptor (HR). As shown in the box plot results of the four proteins in the patient group, as shown in Figs. 3b and 3c, it was confirmed that the subtype did not significantly affect the four proteins as a confounding variable.
단백질의 기능적 주석은 Enrichr(Nucleic Acids Res. 2016 Jul 8;44(W1):W90-7.)를 사용하여 수행하였다. WikiPathways를 사용하여 pCR 및 non-pCR 두 그룹 간의 중요한 차이점을 확인하였으며, 도 3d는 WikiPathways와 단백질 간의 연관관계, 및 pCR(녹색) 및 non-pCR(적색) 그룹 사이에서 해당 단백질의 바이올린 플롯을 나타낸 것이다(조정된 p<0.05). 도 3d에 나타낸 바와 같이, P4HB 및 ENG는 "VEGFA-VEGFR2 신호 전달 경로"에 관여했다. ENG는 또한 "전환성장인자 베타 결합" 및 "심혈관 질환의 병인에서 가정된 경로"에 관여하였다. P4HB는 "골형성 부전증에서 제I형 콜라겐 합성"과 연관이 있었다. MBL2는 "보체 시스템", "숙주에서의 에볼라 바이러스 경로" 및 "toll-like receptor 신호 경로의 조절"과 연관이 있었다. APOC3는 "PPAR 신호 경로", "지질 입자의 구성" 및 "콜레스테롤 생성의 스타틴 억제"와 관련이 있었다. Functional annotation of proteins was performed using Enrichr (Nucleic Acids Res. 2016 Jul 8;44(W1):W90-7.). Significant differences between the two groups, pCR and non-pCR, were identified using WikiPathways, and Figure 3d shows the association between WikiPathways and proteins, and a Violin plot of the corresponding proteins between the pCR (green) and non-pCR (red) groups. (adjusted p<0.05). As shown in Fig. 3d, P4HB and ENG were involved in the “VEGFA-VEGFR2 signaling pathway”. ENG has also been implicated in “transformative growth factor beta binding” and “postulated pathways in the etiology of cardiovascular disease”. P4HB has been implicated in "type I collagen synthesis in osteogenesis imperfecta". MBL2 has been implicated in the "complement system", the "Ebola virus pathway in the host" and the "regulation of the toll-like receptor signaling pathway". APOC3 was involved in “PPAR signaling pathway”, “organization of lipid particles” and “statin inhibition of cholesterol production”.
또한, 유방암 환자에서 pCR의 가장 큰 장기적 임상적 이점을 보여주는 TNBC 하위 유형에 초점을 맞췄다. TNBC 하위 유형에서만 환자를 pCR 및 non-pCR 그룹으로 나누어 상기 기재한 방법으로 통계 분석을 수행하였으며, 도 3e는 TNBC 하위 유형 유방암 환자에서 non-pCR 그룹과 비교하여 pCR 그룹의 혈장 단백질 풍부도를 볼케이노 플롯으로 나타낸 것이다. 적색 원은 non-pCR 그룹에서 유의적으로 증가를 보이는 4개의 혈장 단백질이며, 녹색 원은 non-pCR 그룹에서 유의적으로 감소를 보이는 2개의 혈장 단백질을 의미한다. 도 3e에 나타낸 바와 같이, 모든 유방암 환자의 non-pCR 그룹에서 하나의 매우 풍부한 단백질 MBL2가 확인되었고, TNBC의 non-pCR 그룹에서 세 가지 매우 풍부한 단백질 DCD, KNG1-2 및 TLN1이 확인되었다. 두 개의 매우 풍부한 단백질, ALCAM 및 MAN1A1은 pCR 그룹에서 확인되었다.In addition, we focused on the TNBC subtype that showed the greatest long-term clinical benefit of pCR in breast cancer patients. Statistical analysis was performed by the method described above by dividing patients into pCR and non-pCR groups only in the TNBC subtype. shown as a plot. Red circles indicate four plasma proteins significantly increased in the non-pCR group, and green circles indicate two plasma proteins significantly decreased in the non-pCR group. As shown in Fig. 3e, one highly abundant protein MBL2 was identified in the non-pCR group of all breast cancer patients, and three highly abundant proteins DCD, KNG1-2 and TLN1 were identified in the non-pCR group of TNBC. Two highly abundant proteins, ALCAM and MAN1A1, were identified in the pCR group.
실험예 4. pCR 결과 예측을 위한 다변량 분석Experimental Example 4. Multivariate analysis for predicting pCR results
pCR 및 non-pCR 환자를 구별하기 위한 예측 성능을 향상시키기 위해 랜덤 포레스트(RF) 및 서포트 벡터 머신(SVM)에 기반한 머신 러닝(ML) 분류기를 사용하여 다변량 분석을 수행하였다. 먼저, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 선택 확률>0.5에 따라 AUC 기반 RF 역방향 제거에 의해 4개의 유의한 단백질로 기능 선택을 수행하였으며, 표 3에 나타낸 바와 같이 입력으로 305개의 단백질을 독립적으로 수행하였다.Multivariate analysis was performed using a machine learning (ML) classifier based on a random forest (RF) and a support vector machine (SVM) to improve the predictive performance to discriminate between pCR and non-pCR patients. First, as shown in Table 2 below, functional selection was performed with 4 significant proteins by AUC-based RF reverse elimination according to selection probability>0.5, and as shown in Table 3, 305 proteins were independently performed as input. .
(*각 변수에 대한 선택 확률)(*selection probability for each variable)
(*각 변수에 대한 선택 확률)(*selection probability for each variable)
RF 및 SVM 모델은 세 가지 단백질(MBL2, ENG 및 P4HB)로 제작되었으며, 과적합을 방지하기 위해 3중 교차 검증을 3번 수행하여 RF 모델에서 10,000개의 결정 트리를 생성하였고, 선형 SVM 모델을 적용하였다. 머신 러닝 모델의 견고성을 확인하기 위해 샘플을 무작위로 100회 3분할한 다음 샘플의 2/3로 모델을 구축하고 샘플의 1/3로 검증하였다. 도 4는 상기 선택된 3가지 단백질에 대한 SVM 및 RF분류기에서의 ROC curve 결과 및 100개의 AUC 값의 바이올린 플롯을 나타낸 것으로서, 도 4에 나타낸 바와 같이 분류기의 성능 평가 결과 SVM 및 RF의 AUC 중앙값이 각각 0.861(95 % CI: 0.845-0.873) 및 0.861(95 % CI: 0.830-0.867)인 것으로 나타났다. ROC curve는 각 (1-특이도)의 값에 대한 민감도의 25번째, 50번째, 및 75번째 분위수를 플롯팅함으로써 얻었다.RF and SVM models were built with three proteins (MBL2, ENG, and P4HB), and 10,000 decision trees were generated from the RF model by performing triple cross-validation three times to prevent overfitting, and a linear SVM model was applied. did To check the robustness of the machine learning model, the sample was randomly divided into 3 parts 100 times, then the model was built with 2/3 of the sample and verified with 1/3 of the sample. Figure 4 shows the ROC curve results and violin plots of 100 AUC values in the SVM and RF classifiers for the three selected proteins. 0.861 (95% CI: 0.845-0.873) and 0.861 (95% CI: 0.830-0.867). ROC curves were obtained by plotting the 25th, 50th, and 75th quartiles of sensitivity for each (1-specificity) value.
상기 세 가지 혈장 바이오마커는 유방암 환자의 조직에서도 발현되었다. NCT 치료 이전에 미세바늘 흡인에 의해 유방암 조직으로부터 얻은 5개 단백질의 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 데이터는 공개적으로 사용 가능한 두 개의 GEO 데이터 세트(GSE22513 및 GSE22093)에서 얻었다. 머신 러닝 모델은 상기 기재한 바와 같이 구축하였다. GSE22513에서, SVM 및 RF의 AUC 중앙값은 각각 0.631(95 % CI: 0.613-0.643) 및 0.646(95 % CI: 0.633-0.669)이었다. GSE22093에서 SVM 및 RF의 AUC 중앙값은 각각 0.709(95 % CI: 0.684-0.713) 및 0.658(95 % CI: 0.645-0.666)이었다.The above three plasma biomarkers were also expressed in tissues of breast cancer patients. The mRNA expression levels of five proteins obtained from breast cancer tissues by microneedle aspiration were analyzed prior to NCT treatment. Data were obtained from two publicly available GEO data sets (GSE22513 and GSE22093). A machine learning model was built as described above. In GSE22513, the median AUCs of SVM and RF were 0.631 (95% CI: 0.613–0.643) and 0.646 (95% CI: 0.633–0.669), respectively. In GSE22093, the median AUCs of SVM and RF were 0.709 (95% CI: 0.684–0.713) and 0.658 (95% CI: 0.645–0.666), respectively.
실험예 5. 생존 분석Experimental Example 5. Survival analysis
유방암 환자의 NCT 후 외과적 절제 수술 후에 52.0개월의 중앙값 추적 기간 동안, 15건의 재발(29.4 %)과 8건의 사망(15.7 %)이 관찰되었다. 단일 혈장 단백질과 DFS(disease-free survival), OS(overall survival), 및 DMFS(distant metastasis-free survival)와 같은 장기 임상 지표와의 상관관계를 확인하기 위해, 모델의 3가지 단백질(MBL2, ENG, 및 P4HB)에 대해 단변량 생존 분석을 수행했으며 나머지 302개 단백질을 정량화 하였다. Kaplan-Meier 방법은 최대로 선택된 순위 통계를 기반으로 컷오프 값을 선택하는데 사용되었다. During a median follow-up of 52.0 months after surgical excision after NCT in breast cancer patients, 15 recurrences (29.4%) and 8 deaths (15.7%) were observed. To confirm the correlation between a single plasma protein and long-term clinical indicators such as disease-free survival (DFS), overall survival (OS), and distant metastasis-free survival (DMFS), three proteins (MBL2, ENG) of the model , and P4HB) and quantified the remaining 302 proteins. The Kaplan-Meier method was used to select a cutoff value based on the maximally selected rank statistic.
도 5a 내지 5c는 pCR과 MBL2, ENG, 및 P4HB 단백질의 Kaplan-Meier 플롯 결과를 나타낸 것으로서, 도 5a는 DFS, 도 5b는 OS, 도 5c는 DMFS와의 상관관계를 각각 확인한 결과이다. 도 5a 내지 5c에 나타낸 바와 같이 처음에 pCR은 DFS, OS 및 DMFS에 대해 non-pCR보다 통계적으로 더 나은 예후 인자였으며(log-rank 테스트 p<0.05), DFS의 경우 MBL2 및 P4HB, OS의 경우 P4HB, DMFS의 경우 MBL2가 환자를 저위험 및 고위험 그룹으로 나누는데 통계적으로 유의적이었다(log-rank 테스트 p<0.05, 볼드체로 표시). 5a to 5c show the Kaplan-Meier plot results of pCR and MBL2, ENG, and P4HB proteins, and FIG. 5a shows the results of confirming the correlation with DFS, FIG. 5b with OS, and FIG. 5c with DMFS. As shown in Figures 5a to 5c, pCR was initially a statistically better prognostic factor than non-pCR for DFS, OS, and DMFS (log-rank test p<0.05), MBL2 and P4HB for DFS, and OS for OS. For P4HB and DMFS, MBL2 was statistically significant in dividing patients into low- and high-risk groups (log-rank test p<0.05, indicated in bold).
정량화된 나머지 302개의 단백질 중에서 두 환자 그룹의 3개의 생존 결과에 대한 예후는 단백질 정량값의 임계값으로 분리되었다: DFS에 대하여 84개의 단백질, OS에 대하여 46개의 단백질, DMFS에 대하여 96개의 단백질이 고위험 및 저위험 그룹으로 환자를 분류하는데 통계적으로 유의적이었다(log-rank 테스트 p<0.05). Of the remaining 302 proteins quantified, the prognosis for the three survival outcomes in the two patient groups was separated by a threshold of protein quantification: 84 proteins for DFS, 46 proteins for OS, and 96 proteins for DMFS. The classification of patients into high-risk and low-risk groups was statistically significant (log-rank test p<0.05).
다음과 같은 인자를 가진 다변량 Cox 생존 분석에서는, 어떤 인자도 유의적인 상관관계를 나타내지 않았다: 진단 시 환자 연령; 임상 종양 단계; 노드 상태; 호르몬 수용체(HR) 상태; 및 HER2 상태. 그러나, 단백질을 사용한 DMFS 분석에서, 표 4에 나타낸 바와 같이 MBL2가 유일한 일관된 위험 인자로 확인되었다(HR: 9.65, 95 % CI: 2.10-44.31, p=0.004). In multivariate Cox survival analysis with the following factors, none of the factors showed significant correlation: patient's age at diagnosis; clinical tumor stage; node status; hormone receptor (HR) status; and HER2 status. However, in DMFS analysis using protein, MBL2 was identified as the only consistent risk factor as shown in Table 4 (HR: 9.65, 95% CI: 2.10-44.31, p=0.004).
(환자는 MBL2 풍부도에 따라 두 가지 위험 그룹으로 분류되었다: 낮은 풍부도 그룹(n=34, 17.6 %) 및 높은 풍부도 그룹(n=17, 52.9 %); *노드 음성 그룹에는 이벤트가 없다.)(Patients were classified into two risk groups according to MBL2 abundance: low abundance group (n=34, 17.6%) and high abundance group (n=17, 52.9%); *Node negative group has no events .)
DFS 및 OS를 포함한 다른 생존 분석에서, 단백질 중 어느 것도 유의미한 상관관계를 나타내지 않았으며, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 세 가지 단백질(MBL2, ENG, P4HB) 수준은 모두 병리학적 단계가 높아짐에 따라 유의하게 증가하는 것을 알 수 있었다.In other survival analyses, including DFS and OS, none of the proteins showed a significant correlation, and as shown in Table 5 below, the levels of all three proteins (MBL2, ENG, P4HB) were significant with increasing pathological stage. was found to increase.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
Claims (21)
Mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) in biological samples isolated from subjects A method for providing information for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising measuring the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of or the mRNA expression level of the protein.
상기 생물학적 시료는 혈액 또는 조직인 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 1,
The biological sample is characterized in that blood or tissue, information providing method for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients.
상기 혈액은 전혈, 혈장, 혈청, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 2,
The blood is characterized in that whole blood, plasma, serum, or blood monocytes, information providing method for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients.
상기 생물학적 시료는 선행 항암화학요법 전 유방암 환자의 진단 당시에 채취된 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 1,
The biological sample is a method for providing information for predicting prognosis after prior chemotherapy of a breast cancer patient, characterized in that collected at the time of diagnosis of a breast cancer patient before prior chemotherapy.
상기 단백질 존재 수준은 질량 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunoassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 방사선면역분석법, 방사능면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역형광염색, 면역친화성정제, 방사능면역침전, 면역침전분석, 보체고정분석, 유세포 분석법(FACS), 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 1,
The protein abundance level can be determined by mass spectrometry, Western blot, enzyme linked immunoassay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, radioimmunoassay, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Ouchterlony immunoassay. At least one selected from the group consisting of diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunofluorescence staining, immunoaffinity purification, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (FACS), and protein chip Method for providing information for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients, characterized in that measured using the method.
상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 1,
The mRNA expression level of the protein is determined by polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, quantitative real-time Reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase protection assay (RPA; Northern blotting) Characterized in that the measurement is performed using one or more methods selected from the group consisting of, and a DNA chip, an information providing method for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients.
상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 측정된 단백질 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 1,
Comparing the protein abundance level or the mRNA expression level of the protein measured in the biological sample isolated from the subject with the level measured in the biological sample isolated from the control group, characterized in that it further comprises, prior anti-cancer of breast cancer patients Information provision method for predicting prognosis after chemotherapy.
상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 7,
Prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients when the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to the control group A method for providing information for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients, characterized in that it predicts that it will not be good.
상기 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 MBL2, ENG, 및 P4HB로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응(pathologic complete response, pCR)을 보이지 않을 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 8,
When the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of MBL2, ENG, and P4HB or the mRNA expression level of the protein in the biological sample isolated from the subject is increased compared to the control group, pathological after prior chemotherapy of breast cancer patients A method for providing information for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients, characterized in that predicting that a complete response (pathologic complete response, pCR) will not be shown.
상기 대조군은 선행 항암화학요법 후 병리학적 완전 반응을 보이는 유방암 환자인 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 7,
The control group is a breast cancer patient showing a pathological complete response after prior chemotherapy, a method for providing information for predicting prognosis after prior chemotherapy for breast cancer patients.
Mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) in biological samples isolated from subjects A method for providing information for predicting responsiveness to prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising the step of measuring the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of or the mRNA expression level of the protein.
Mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) in biological samples isolated from subjects A method for providing information for predicting the risk of breast cancer recurrence or metastasis, comprising measuring the presence level of one or more proteins selected from the group consisting of or the mRNA expression level of the protein.
In a biological sample isolated from a subject, at least one protein selected from the group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2) and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) An information providing method for predicting survival after prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising measuring the presence level or mRNA expression level of the protein.
상기 방법은 둘 이상의 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, 상기 MBL2의 존재 수준 또는 이의 mRNA 발현 수준이 상대적으로 높을 경우 무질병 생존율(disease-free survival rate) 또는 무원격전이 생존율(distant metastasis-free survival rate)이 상대적으로 낮을 것으로 예측하는 단계; 또는
상기 P4HB의 존재 수준 또는 이의 mRNA 발현 수준이 상대적으로 높을 경우 무질병 생존율 또는 전체 생존율(overall survival rate)이 상대적으로 낮을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 생존율 예측을 위한 정보제공방법.
According to claim 13,
The method is a disease-free survival rate or a distant metastasis-free survival rate when the presence level of MBL2 or its mRNA expression level is relatively high in biological samples isolated from two or more subjects. rate) predicting that it will be relatively low; or
Predicting that the disease-free survival rate or overall survival rate will be relatively low when the P4HB presence level or its mRNA expression level is relatively high, characterized in that it further comprises, prior chemotherapy for breast cancer patients Information provision method for prediction of post-survival rate.
At least one protein selected from the group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) A composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising an agent for measuring the presence level or mRNA expression level of the protein as an active ingredient.
상기 단백질의 존재 수준 또는 상기 단백질의 mRNA 발현 수준은 혈액 또는 조직에서 측정되는 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 조성물.
According to claim 15,
The presence level of the protein or the mRNA expression level of the protein is characterized in that measured in blood or tissue, a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients.
상기 혈액은 전혈, 혈장, 혈청, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 조성물.
According to claim 16,
The blood is characterized in that whole blood, plasma, serum, or blood monocytes, a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients.
상기 단백질의 존재 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 조성물.
According to claim 15,
The agent for measuring the level of the protein is characterized in that the antibody or aptamer specific to the protein, a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients.
상기 단백질의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 유방암 환자의 선행 항암화학요법 후 예후 예측용 조성물.
According to claim 15,
The agent for measuring the mRNA expression level of the protein is a composition for predicting prognosis after prior chemotherapy of breast cancer patients, characterized in that the primer or probe specifically binds to the mRNA.
At least one protein selected from the group consisting of mannose-binding lectin 2 (MBL2), endoglin (ENG), and prolyl 4-hydroxylase beta (P4HB) A composition for predicting responsiveness to prior chemotherapy of breast cancer patients, comprising an agent for measuring the presence level or mRNA expression level of the protein as an active ingredient.
A kit for predicting the prognosis of a breast cancer patient after prior chemotherapy, comprising the composition of any one of claims 15 to 19.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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2022
- 2022-11-30 KR KR1020220165013A patent/KR20230084061A/en not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Meta-analysis of the association of breast cancer subtype and pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy. European journal of cancer 2012, 48, 3342-3354. |
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