KR20230083197A - Oligonucleotides for synthesizing 5'-capped RNA - Google Patents

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KR20230083197A
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Abstract

The present invention relates to novel oligonucleotide primers used in the synthesis of 5'-capped RNA. The novel oligonucleotide primers for RNA capping provided by the chemical formula 1 in the present invention can be usefully used in the field of nucleic acid therapeutic agents or vaccines.

Description

5'-캡핑된 RNA 합성용 올리고뉴클레오티드 {Oligonucleotides for synthesizing 5'-capped RNA}Oligonucleotides for synthesizing 5'-capped RNA {Oligonucleotides for synthesizing 5'-capped RNA}

본 발명은 5'-캡핑된 RNA의 합성에 사용되는 신규 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.The present invention relates to novel oligonucleotides used for the synthesis of 5'-capped RNA.

RNA의 5'-캡핑이란 진핵세포 내에서 pre-mRNA 가공 과정의 첫번째 단계로, 전사된 RNA의 5' 말단에 캡(cap)이 씌워지는 과정이다. 진핵생물에서 mRNA 분자의 5' 말단에는 7-메틸구아노신(m7G)이 5' 트리포스페이트 결합을 통해 연결된 5' 캡(cap-0)이 생성되며, 이는 생체 내에서 메틸트랜스퍼라제 효소에 의해 매개된다. 진핵생물의 mRNA에는 5' 말단의 첫번째 리보오스 당의 2' 히드록시기의 메틸화(cap-1) 및 두번째 리보오스 당의 2' 히드록시기의 메틸화(cap-2)를 포함하는 추가적 변형이 존재할 수 있다. 이러한 mRNA의 5' 캡핑 과정을 통해 mRNA가 핵에서 세포질로 빠져나갈 때 5' 엑소뉴클레아제 등의 분해효소에 대한 저항성을 획득한다.RNA 5'-capping is the first step in the pre-mRNA processing process in eukaryotic cells, and is a process in which a cap is placed on the 5' end of the transcribed RNA. In eukaryotes, at the 5' end of the mRNA molecule, a 5' cap (cap-0) is formed in which 7-methylguanosine (m 7 G) is linked through a 5' triphosphate bond, which is in vivo in the methyltransferase enzyme. mediated by Eukaryotic mRNAs may have additional modifications, including methylation of the 2' hydroxy group of the first ribose sugar at the 5' end (cap-1) and methylation of the 2' hydroxy group of the second ribose sugar (cap-2). Through this 5' capping process of mRNA, when mRNA escapes from the nucleus to the cytoplasm, resistance to degrading enzymes such as 5' exonuclease is acquired.

의학적 또는 연구적 목적을 위해, 특정 유전자를 코딩하는 캡핑된 mRNA를 진핵 생물에 트랜스펙션하거나 세포 또는 배아로 미세주입함으로써 상기 유전자를 인위적으로 발현시킬 수 있다. 그러나, 이 과정에서 캡핑되지 않은 RNA가 사용될 경우, RNA는 빠르게 분해될 뿐만 아니라 면역원성을 가지며 단백질 번역 효율이 급격히 감소된다. 따라서, in vitro에서 mRNA를 합성하기 위해 5' 캡핑이 적절히 수행되는 것은 매우 중요하다.For medical or research purposes, capped mRNA encoding a particular gene can be artificially expressed by transfecting eukaryotes or microinjecting into cells or embryos. However, when uncapped RNA is used in this process, the RNA is not only rapidly degraded, but also immunogenic, and protein translation efficiency is drastically reduced. Therefore, it is very important that 5' capping is performed properly to synthesize mRNA in vitro.

mRNA 합성을 위해, 5'-트리포스페이트기를 갖는 RNA를 먼저 in vitro에서 전사시킨 다음, 캡핑 효소를 사용하여 5' 캡핑을 수행하는 과정은 비용이 많이 들 뿐만 아니라 비효율적이라는 점이 판명되었다. 이에 따라, 5'-캡핑 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하고 이를 프라이머로 사용하여 in vitro 전사를 개시하는 합성 방법이 개발되었다. 예컨대, 국제공개공보 WO2008/016473 및 국제공개공보 WO2013/059475는 5'-캡핑된 RNA를 합성하기 위한 디뉴클레오티드 mRNA 캡 유사체를 개시하고, 국제공개공보 WO2017/053297은 5'-캡핑된 RNA를 합성하기 위한 트리뉴클레오티드 mRNA 캡 유사체를 개시한다.For mRNA synthesis, it has been found that the process of first transcribing RNA having a 5'-triphosphate group in vitro and then performing 5' capping using a capping enzyme is expensive and inefficient. Accordingly, a synthetic method for initiating in vitro transcription by preparing an oligonucleotide having a 5'-capped structure and using it as a primer has been developed. For example, International Publication WO2008/016473 and International Publication WO2013/059475 disclose dinucleotide mRNA cap analogs for synthesizing 5'-capped RNA, and International Publication WO2017/053297 synthesizes 5'-capped RNA. Disclosed are trinucleotide mRNA cap analogs for

캡핑된 RNA 전사체는 핵산 치료제, 백신 분야와 같이 단백질 합성을 필요로 하는 치료 및/또는 예방 분야에 적용될 수 있으므로, 이를 효율적으로 제조하기 위한 5'-캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 개발이 필요하다. 예컨대, 종래 방법보다 제조 공정이 간편하고 비용 효율적이거나, 원하는 전사 반응을 효율적으로 진행시키거나, RNA 생성 수율을 향상시키거나, 원하지 않는 이종 생성물의 생성을 감소시키거나, 추가적인 효소 반응을 필요로 하지 않거나, RNA의 대규모 합성을 가능하게 하는 RNA 캡 유사체의 개발이 절실한 실정이다. 나아가, 실제 RNA 치료제 또는 백신으로 적용될 때 생체 내에서 mRNA 안정성을 유지하거나 번역 효율을 개선하거나 면역원성 등의 부작용을 감소시킬 수 있는 캡 구조를 제공한다면, RNA 치료제 또는 백신 분야에서 범용적인 유용성이 달성될 수 있을 것이다.Since capped RNA transcripts can be applied to therapeutic and/or preventive fields requiring protein synthesis, such as nucleic acid therapeutics and vaccines, it is necessary to develop 5'-capping oligonucleotide primers to efficiently prepare them. For example, the manufacturing process is simpler and more cost-effective than conventional methods, efficiently proceeds with a desired transcription reaction, improves RNA production yield, reduces the production of unwanted heterogeneous products, or does not require additional enzymatic reactions. However, there is an urgent need to develop RNA cap analogs that enable large-scale synthesis of RNA. Furthermore, if a cap structure capable of maintaining mRNA stability in vivo, improving translation efficiency, or reducing side effects such as immunogenicity when applied as an actual RNA therapeutic agent or vaccine is provided, universal utility in the field of RNA therapeutic agent or vaccine is achieved. It could be.

국제공개공보 WO2008/016473International Publication WO2008/016473 국제공개공보 WO2013/059475International Publication WO2013/059475 국제공개공보 WO2017/053297International Publication WO2017/053297

본 발명의 목적은 신규 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이의 제조방법 및 용도를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a novel oligonucleotide primer for capping RNA, a method for preparing the same, and a use thereof.

본 발명의 다른 목적은 상기 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 제조되는 RNA 분자 및 이의 용도를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an RNA molecule prepared using the RNA capping oligonucleotide primer and a use thereof.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 신규 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이의 제조방법 및 이의 사용방법을 제공한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 개시내용 전반에 걸쳐 언급된 모든 특허문헌 및 비특허문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.To achieve the above object, the present inventors provide a novel oligonucleotide primer for capping RNA, a method for preparing the same, and a method for using the same. Unless defined otherwise, all terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. All patent and non-patent documents mentioned throughout the disclosure herein are incorporated by reference in their entirety.

신규 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머Oligonucleotide primers for novel RNA capping

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염을 제공한다:The present invention provides a compound represented by Formula 1, a stereoisomer thereof, or a salt thereof:

[화학식 1][Formula 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

상기 화학식에서, In the above formula,

B는 천연, 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기이고;B is a natural, unnatural or modified nucleoside base;

X는 -할로이고;X is -halo;

Y1은 -OH, -O(C1-4알킬), -O(C1-4알킬)O(C1-4알킬), -CH2O(C1-4알킬), 또는 -할로이고;Y 1 is -OH, -O(C 1-4 alkyl), -O(C 1-4 alkyl)O(C 1-4 alkyl), -CH 2 O(C 1-4 alkyl), or -halo; ;

Y2는 -H 또는 Y1과 결합하여 LNA 고리를 형성하는 것이고 {여기서, 상기 LNA 고리의 하나 이상의 H는 -(C1-4알킬), -OH, 또는 -O(C1-4알킬)로 치환될 수 있음};Y 2 is combined with -H or Y 1 to form an LNA ring {wherein one or more H of the LNA ring is -(C 1-4 alkyl), -OH, or -O(C 1-4 alkyl) may be substituted with };

n은 0 또는 1이고;n is 0 or 1;

R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 -(C1-4알킬)이고;R 1 and R 2 are each independently -H or -(C 1-4 alkyl);

R3는 -(C1-4알킬)이다.R 3 is -(C 1-4 alkyl).

본 발명에 있어서, 상기 뉴클레오시드 염기는 천연 뉴클레오시드 염기뿐만 아니라 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기도 사용가능하다. In the present invention, as the nucleoside base, natural nucleoside bases as well as non-natural or modified nucleoside bases may be used.

본 발명에 있어서, 천연적으로 발생하는 뉴클레오시드에서 가장 흔히 발견되는 염기 고리는 퓨린 및 피리미딘 고리이다. 천연적으로 발생하는 퓨린 고리는, 예를 들어, 아데닌(

Figure pat00002
), 구아닌(
Figure pat00003
), 및 N6-메틸아데닌(
Figure pat00004
)을 포함한다. 천연적으로 발생하는 피리미딘 고리는, 예를 들어, 시토신(
Figure pat00005
), 티민(
Figure pat00006
), 5-메틸시토신(
Figure pat00007
), 우라실(
Figure pat00008
)을 포함한다. In the present invention, the base rings most commonly found in naturally occurring nucleosides are purine and pyrimidine rings. A naturally occurring purine ring is, for example, adenine (
Figure pat00002
), guanine (
Figure pat00003
), and N 6 -methyladenine (
Figure pat00004
). Naturally occurring pyrimidine rings are, for example, cytosine (
Figure pat00005
), thymine (
Figure pat00006
), 5-methylcytosine (
Figure pat00007
), uracil (
Figure pat00008
).

본 발명의 구체예에 따르면, 상기 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기는 상기 천연 뉴클레오시드 염기의 이성질체이거나 상기 천연 뉴클레오시드 염기의 하나 이상의 -H가 -(C1-4알킬), -O(C1-4알킬) 또는 -할로로 치환, 하나 이상의 =CH-가 =N-으로 치환, 및 하나 이상의 =O가 =S로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로 치환된 것일 수 있다. According to an embodiment of the invention, said unnatural or modified nucleoside base is an isomer of said natural nucleoside base or one or more -H of said natural nucleoside base is -(C 1-4 alkyl), - It may be substituted with one or more selected from the group consisting of O(C 1-4 alkyl) or -halo substitution, one or more ═CH- substitution with ═N-, and one or more ═O substitution with ═S.

또한 본 발명에 있어서, 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기는 천연 NTP(예를 들어, ATP, UTP, CTP 및 GTP) 중 하나 또는 다른 특이적 NTP에 대한 대체물로서 RNA 폴리머라제에 의해 인식가능한 인공 염기를 수반한 뉴클레오시드 유사체에서 유래된 염기일 수 있다(문헌 [Loakes, D., Nucleic Acids Res., 29:2437-2447 (2001); Crey-Desbiolles, C., et al., Nucleic Acids Res., 33:1532-1543 (2005); Kincaid, K., et al., Nucleic Acids Res., 33:2620-2628 (2005); Preparata, FP, Oliver, JS, J. Comput. Biol. 753-765 (2004); 및 Hill, F., et al., Proc Natl Acad. Sci. U S A, 95:4258-4263 (1998)] 등). Also in the present invention, unnatural or modified nucleoside bases are artificial NTPs recognizable by RNA polymerase as substitutes for one or other specific NTPs (e.g., ATP, UTP, CTP and GTP). It can be a base derived from a nucleoside analog carrying a base (Loakes, D., Nucleic Acids Res., 29:2437-2447 (2001); Crey-Desbiolles, C., et al., Nucleic Acids Res., 33:1532-1543 (2005); Kincaid, K., et al., Nucleic Acids Res., 33:2620-2628 (2005); Preparata, FP, Oliver, JS, J. Comput. Biol. 753 -765 (2004); and Hill, F., et al., Proc Natl Acad. Sci. USA, 95:4258-4263 (1998)] et al.).

또한 본 발명에 있어서, 상기 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기는 할로겐-치환된 퓨린(예를 들어, 6-플루오로퓨린), 할로겐-치환된 피리미딘, N6-에틸아데닌, N4-(알킬)-시토신, 5-에틸시토신 등에서 유래한 염기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, in the present invention, the unnatural or modified nucleoside base is a halogen-substituted purine (eg, 6-fluoropurine), a halogen-substituted pyrimidine, N 6 -ethyladenine, N 4 - It may be a base derived from (alkyl)-cytosine, 5-ethylcytosine, etc., but is not limited thereto.

또한 본 발명에 있어서, 상기 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기의 또다른 일례로 8-아자구아노신, 수도유리딘(ψ), 5-메틸-시티딘(m5C), 1-메틸-수도유리딘(m1ψ), 1-메틸-수도유리딘(m1ψ) 및 5-메틸-시티딘(m5C), 2-싸이오유리딘(s2U), 2-싸이오유리딘(s2U) 및 5-메틸-시티딘(m5C), 5-메톡시-유리딘(mo5U), 5-메톡시-유리딘(mo5U) 및 5-메틸-시티딘(m5C), 2'-O-메틸 유리딘, 2'-O-메틸 유리딘 및 5-메틸-시티딘(m5C), N6-메틸-아데노신(m6A) 또는 N6-메틸-아데노신(m6A) 및 5-메틸-시티딘(m5C)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In addition, in the present invention, another example of the non-natural or modified nucleoside base is 8-azaguanosine, capital uridine (ψ), 5-methyl-cytidine (m 5 C), 1-methyl- Pseudouridine (m 1 ψ), 1-methyl-pudouridine (m 1 ψ) and 5-methyl-cytidine (m 5 C), 2-thiouridine (s 2 U), 2-thiouridine (s 2 U) and 5-methyl-cytidine (m 5 C), 5-methoxy-uridine (mo 5 U), 5-methoxy-uridine (mo 5 U) and 5-methyl-cytidine (m 5 C), 2'-O-methyl uridine, 2'-O-methyl uridine and 5-methyl-cytidine (m 5 C), N 6 -methyl-adenosine (m 6 A) or N 6 -methyl-adenosine (m 6 A) and 5-methyl-cytidine (m 5 C), but are not limited thereto.

이외에도 본 발명에 사용될 수 있는 천연, 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기의 예는 국제공개공보 WO2018/144775 또는 국제공개공보 WO2018/144082 등에 기재된 사항을 참고할 수 있다.In addition, examples of natural, non-natural or modified nucleoside bases that can be used in the present invention may refer to International Publication WO2018/144775 or International Publication WO2018/144082.

본 발명의 구체예에 따르면, B1 및 B2는 각각 독립적으로

Figure pat00009
,
Figure pat00010
,
Figure pat00011
,
Figure pat00012
,
Figure pat00013
,
Figure pat00014
, 또는
Figure pat00015
일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, B 1 and B 2 are each independently
Figure pat00009
,
Figure pat00010
,
Figure pat00011
,
Figure pat00012
,
Figure pat00013
,
Figure pat00014
, or
Figure pat00015
can be

또한, 본 발명의 구체예에 따르면, X는 -F일 수 있다.Also, according to an embodiment of the present invention, X may be -F.

또한, 본 발명의 구체예에 따르면, In addition, according to an embodiment of the present invention,

Z1은 -OH 또는 -O(C1-4알킬)이고;Z 1 is -OH or -O(C 1-4 alkyl);

Z2는 -H일 수 있다.Z 2 may be -H.

또한, 본 발명의 구체예에 따르면, n은 1일 수 있다.Also, according to an embodiment of the present invention, n may be 1.

또한, 본 발명의 구체예에 따르면,In addition, according to an embodiment of the present invention,

R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H이고;R 1 and R 2 are each independently -H;

R3는 -(C1-4알킬)일 수 있다.R 3 may be -(C 1-4 alkyl).

구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다:Specifically, the compound represented by Formula 1 may be any one selected from the group consisting of the following compounds:

(1)

Figure pat00016
;(One)
Figure pat00016
;

(2)

Figure pat00017
;(2)
Figure pat00017
;

(3)

Figure pat00018
;(3)
Figure pat00018
;

(4)

Figure pat00019
;(4)
Figure pat00019
;

(5)

Figure pat00020
;(5)
Figure pat00020
;

(6)

Figure pat00021
; 및(6)
Figure pat00021
; and

(7)

Figure pat00022
.(7)
Figure pat00022
.

본 발명의 구체예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the compound represented by Formula 1 may be an oligonucleotide primer for RNA capping.

본 발명에 있어서, 용어 "입체이성질체(stereoisomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 각각의 입체이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 또한 다른 설명이 없는 한, 비대칭 탄소 원자와 연결되는 실선 결합 (-)은 입체 중심의 절대적 배열을 나타내는 쐐기형

Figure pat00023
또는 쐐기형 점선 결합
Figure pat00024
을 포함할 수 있다.In the present invention, the term "stereoisomer" means a compound of the present invention or a salt thereof having the same chemical formula or molecular formula but sterically different. Each of these stereoisomers and mixtures thereof are also included within the scope of the present invention. Also, unless otherwise specified, a solid bond (-) connecting an asymmetric carbon atom is a wedge shape indicating the absolute arrangement of stereogenic centers.
Figure pat00023
or Wedge Dotted Combination
Figure pat00024
can include

본 발명에 있어서, 용어 "염(salt)"은 의약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미한다. 구체적으로, 염기(base) 부가염일 수 있다. 예를 들어 칼슘, 포타슘, 소듐 또는 마그네슘 등으로 제조된 무기 이온염; 아르기닌, 라이신, 히스티딘 등으로 제조된 아미노산염; 및 트리메틸아민, 트리에틸아민, 암모니아, 피리딘, 피콜린 등으로 제조된 아민염 등이 있으나, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the term "salt" means a salt commonly used in the pharmaceutical industry. Specifically, it may be a base addition salt. inorganic ion salts made of, for example, calcium, potassium, sodium or magnesium; amino acid salts prepared with arginine, lysine, histidine, and the like; and amine salts prepared with trimethylamine, triethylamine, ammonia, pyridine, picoline, etc., but the types of salts meant in the present invention are not limited by these listed salts.

신규 올리고뉴클레오티드 프라이머로 캡핑된 RNARNA capped with novel oligonucleotide primers

상술한 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 이를 포함하는 RNA 분자를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RNA 분자를 제공한다.The oligonucleotide primer for RNA capping described above can be used to prepare an RNA molecule containing the oligonucleotide primer. Accordingly, the present invention provides an RNA molecule comprising an oligonucleotide primer for RNA capping represented by Formula 1.

본 발명에 따른 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3'-말단 상으로의 NTP의 혼입을 통하여 RNA 폴리머라제에 의해 연장될 수 있다. DNA 주형(예를 들어 DNA 플라스미드), RNA 폴리머라제, 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 및 적절한 완충제와 같은 필수 구성요소를 함유하는 전사 시스템에서 프로모터의 제어 하에 시험관내 전사를 개시할 수 있다. 여기서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 개시 부위에서 DNA 주형에 대해 상보적이다.The oligonucleotide primer for RNA capping according to the present invention can be extended by RNA polymerase through incorporation of NTP onto the 3'-end. In vitro transcription can be initiated under the control of a promoter in a transcription system containing essential components such as a DNA template (eg DNA plasmid), RNA polymerase, nucleoside 5'-triphosphate and appropriate buffers. Here, the oligonucleotide primer is complementary to the DNA template at the initiation site.

본 발명에 있어서, 프로모터는 특정한 DNA 서열(예를 들어 유전자)의 전사의 개시를 유도 및 제어하는 dsDNA 주형의 특정 영역을 지칭한다. 프로모터는 DNA 상의 동일한 가닥 및 상류(센스 가닥의 5' 영역을 향함)에 위치한다. 프로모터는 전형적으로, 전사될 DNA 서열에 바로 인접하거나 또는 부분적으로 이러한 서열과 중복된다. 프로모터 내의 뉴클레오티드 위치는 DNA의 전사가 시작되는 전사 출발 부위를 기준으로 하여 설계된다(위치 +1). 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프로모터 서열의 개시 부위(이는 특정 실시양태에서, 위치 +1 및 +2에 있고, 개시 사량체의 경우에는, 위치 +1, +2 및 +3에 있음)에 대해 상보적이다.In the present invention, a promoter refers to a specific region of a dsDNA template that induces and controls the initiation of transcription of a specific DNA sequence (eg gene). The promoter is located on the same strand and upstream (toward the 5' region of the sense strand) on the DNA. A promoter is typically immediately adjacent to or partially overlaps the DNA sequence to be transcribed. Nucleotide positions within the promoter are designed relative to the transcriptional start site where transcription of DNA begins (position +1). The initiation oligonucleotide primer is complementary to the initiation site of the promoter sequence, which in certain embodiments is at positions +1 and +2, and in the case of an initiation tetramer, at positions +1, +2 and +3 .

일 실시양태에서, 상기 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-캡핑된 RNA를 형성하기 위해 RNA 분자의 5' 상단에 부착된다. 이렇게 형성된 RNA 분자는 mRNA, 작은 핵 RNA(snRNA), 작은 핵소체 RNA(snoRNA), 작은 카잘체-특이적 RNA(scaRNA)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. In one embodiment, the oligonucleotide primer for RNA capping is attached to the 5' top of the RNA molecule to form a 5'-capped RNA. RNA molecules so formed include, but are not limited to, mRNA, small nuclear RNA (snRNA), small nucleolar RNA (snoRNA), and small cajal body-specific RNA (scaRNA).

일 실시양태에서, 상기 RNA 분자는 mRNA이고, 1개 이상의 코딩 서열(coding sequence; CDS)을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상기 RNA 분자는 폴리A 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리A 서열은 전적으로 또는 대부분 아데닌 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체 또는 유도체로 구성될 수 있다. 폴리A 서열은 핵산의 3' 미번역된 영역에 인접하여 위치한 꼬리일 수 있다.In one embodiment, the RNA molecule is mRNA and may include one or more coding sequences (CDS). Additionally, the RNA molecule may include a polyA sequence and/or a polyadenylation signal. A polyA sequence may consist entirely or predominantly of adenine nucleotides or analogs or derivatives thereof. A polyA sequence can be a tail located adjacent to the 3' untranslated region of a nucleic acid.

본 발명은 또한, (S-1) DNA 주형, 상술한 화학식 1로 표시되는 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 혼합하는 단계; 및 (S-2) 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 폴리뉴클레오티드 주형의 전사를 수행하는 단계를 포함하는 5'-캡핑된 RNA 분자의 합성 방법을 제공한다.The present invention also includes (S-1) mixing a DNA template, an oligonucleotide primer for RNA capping represented by Formula 1 described above, and RNA polymerase; and (S-2) incubating the mixture to transfer the polynucleotide template.

한편, 올리고뉴클레오티드 프라이머, RNA 폴리머라제 및 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트 (NTP)를 사용하여 RNA의 DNA-주형화된 및 프로모터 제어된 합성 방법은 본 발명이 속한 기술 분야에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명에서 제공된 화학식 1로 표시되는 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머를 활용하여 이를 포함하는 RNA 분자를 합성할 수 있다.On the other hand, methods for DNA-templated and promoter controlled synthesis of RNA using oligonucleotide primers, RNA polymerase and nucleoside 5'-triphosphate (NTP) are known in the art. Therefore, an RNA molecule including the RNA capping oligonucleotide primer represented by Chemical Formula 1 provided in the present invention can be synthesized.

본 발명의 구체예에 따르면, DNA 주형은 이중 가닥 선형 DNA, 부분적 이중 가닥 선형 DNA, 환형 이중 가닥 DNA, DNA 플라스미드, PCR 앰플리콘일 수 있고, 그 외에도 RNA 폴리머라제와 적절히 반응할 수 있는 변형된 핵산일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the DNA template may be a double-stranded linear DNA, a partially double-stranded linear DNA, a circular double-stranded DNA, a DNA plasmid, a PCR amplicon, or a modified DNA that can properly react with RNA polymerase. It may be a nucleic acid.

본 발명의 구체예에 따르면, 상기 RNA 분자의 합성은 in vitro에서 수행된다. in vitro에서 대규모 전사를 수행하기 위해, T7, T3, SP6, K1-5, K1E, K1F 또는 K11 박테리오파지로부터 유래된 단일 서브유닛 파지 폴리머라제가 사용될 수 있다. 이러한 계열의 폴리머라제는 보조 단백질을 필요로 하지 않고 개시 뉴클레오티드 서열의 최소 제약 조건을 갖는 ~17개 뉴클레오티드의 단순한 최소 프로모터 서열을 갖는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 RNA 폴리머라제의 일례로 T7 RNA 폴리머라제(T7 RNAP)를 들 수 있으나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 다른 RNA 폴리머라제를 이용해서도 실시될 수 있었다는 것을 이해할 것이다. DNA 폴리머라제와는 달리, T7 RNAP는 프라이머 부재에 RNA 합성을 개시한다. 개시에 있어서의 첫 번째 단계는 새로운 RNA 합성으로 불리며, 여기서는 RNA 폴리머라제가 DNA 주형 상의 특이적 서열을 인식하고, 위치 +1 및 +2에서의 주형 잔기에 대해 상보적인 뉴클레오티드 트리포스페이트의 제1 쌍을 선택하며, 포스포디에스테르 결합의 형성을 촉매하여 디뉴클레오티드를 형성한다.According to an embodiment of the present invention, the synthesis of the RNA molecule is performed in vitro. To perform large-scale transcription in vitro, single subunit phage polymerases derived from T7, T3, SP6, K1-5, K1E, K1F or K11 bacteriophages can be used. This family of polymerases does not require an auxiliary protein and has a simple minimal promoter sequence of ˜17 nucleotides with minimal constraints on the starting nucleotide sequence. One example of an RNA polymerase that can be used in the present invention is T7 RNA polymerase (T7 RNAP), although one skilled in the art will appreciate that the present invention could also be practiced using other RNA polymerases. will be. Unlike DNA polymerase, T7 RNAP initiates RNA synthesis in the absence of a primer. The first step in initiation is called de novo RNA synthesis, in which RNA polymerase recognizes a specific sequence on the DNA template and produces a first pair of nucleotide triphosphates complementary to the template residues at positions +1 and +2. and catalyzes the formation of a phosphodiester bond to form a dinucleotide.

캡핑된 RNA의 의약적 용도Medical Uses of Capped RNA

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 5'-캡핑된 RNA 분자는 의약적 목적을 위해 유용하게 활용될 수 있다. As described above, the 5'-capped RNA molecule according to the present invention can be usefully utilized for medicinal purposes.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명에 따라 제조된 5'-캡핑된 RNA 분자는 핵산 치료제 또는 백신으로 활용될 수 있다. 예컨대, 상기 핵산 치료제 또는 백신은 RNA 백신(암 또는 감염성 질환 예방용 백신)으로 사용될 수 있다. 상기 핵산 치료제 또는 백신은 대상체에 투여되어 목적하는 펩티드를 생산하기 위해 생체 내에서 번역될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the 5'-capped RNA molecule prepared according to the present invention can be used as a nucleic acid therapeutic or vaccine. For example, the nucleic acid therapeutic agent or vaccine may be used as an RNA vaccine (vaccine for preventing cancer or infectious diseases). The nucleic acid therapeutic or vaccine can be administered to a subject and translated in vivo to produce the desired peptide.

본 발명의 구체예에 따르면, 상기 5'-캡핑된 RNA 분자는 세포 내로 도입되어 세포의 의학적 병태를 치료하거나 세포에 대하여 치료적 영향을 미칠 수 있는 단백질을 생성시킬 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the 5'-capped RNA molecule can be introduced into a cell to treat a medical condition of the cell or produce a protein that can have a therapeutic effect on the cell.

본 발명의 구체예에 따르면, 상기 핵산 치료제 또는 백신은 RNA 분자와 함께, 상기 RNA 분자를 표적 세포로 도입할 수 있는 전달체를 더 포함할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the nucleic acid therapeutic agent or vaccine may further include a carrier capable of introducing the RNA molecule into a target cell together with the RNA molecule.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명은 상술한 5'-캡핑된 RNA 분자로부터 번역된 펩티드를 제공한다.According to an embodiment of the present invention, the present invention provides a peptide translated from the 5'-capped RNA molecule described above.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명은 상술한 5'-캡핑된 RNA 분자가 도입된 세포를 제공한다. 상기 세포는 대상체의 체세포일 수 있고, 체외에서 배양가능한 세포주일 수도 있다. According to an embodiment of the present invention, the present invention provides a cell into which the aforementioned 5'-capped RNA molecule has been introduced. The cells may be somatic cells of a subject, or may be cell lines that can be cultured in vitro.

또한 본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명은 5'-캡핑된 RNA 분자가 도입된 세포에서 생산된 펩티드를 제공한다.Also according to an embodiment of the present invention, the present invention provides a peptide produced in a cell into which a 5'-capped RNA molecule has been introduced.

본 발명에 있어서, RNA 치료제 또는 백신을 위한 제약 조성물은 주사에 의한 투여, 또는 특정한 병태를 치료하기 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 적절한 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여하기 위한 주사가능한 조성물은 전형적으로, 적합한 용액 및/또는 제약 담체, 예컨대 멸균성 생리학적 식염수 중의 활성 화합물을 함유한다. 상기 조성물은 또한, 지질 또는 인지질 중의 현탁제, 리포솜 현탁제, 또는 수성 에멀션으로서 제형화될 수 있다.In the present invention, pharmaceutical compositions for RNA therapeutics or vaccines may be formulated for administration by injection, or by other suitable routes known to those skilled in the art to treat a particular condition. Injectable compositions for parenteral administration typically contain the active compounds in a suitable solution and/or pharmaceutical carrier such as sterile physiological saline. The compositions may also be formulated as suspensions in lipids or phospholipids, liposomal suspensions, or aqueous emulsions.

RNA 치료제 또는 백신을 위한 조성물 및/또는 제형을 제조하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (19th　Ed., Williams & Wilkins, 1995)] 참조). 투여될 조성물은 표적 세포 또는 조직에서의 목적 단백질의 발현을 증가시키기 위해 제약상 안전하고 유효한 양으로 선택된 화합물의 특정 양을 함유할 것이다.Methods of preparing compositions and/or formulations for RNA therapeutics or vaccines are known to those skilled in the art (see Remington's Pharmaceutical Sciences (19 th Ed., Williams & Wilkins, 1995)). The composition to be administered will contain a specific amount of the selected compound in a pharmaceutically safe and effective amount to increase the expression of the protein of interest in a target cell or tissue.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 기재된 바와 같은 화합물을 적어도 0.1% (w/v) 함유하고, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 상기 화합물을 0.1% 초과 함유하며, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 10% 이하 함유하고, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 5% 이하 함유하며, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1% (w/v) 이하 함유한다. 적합한 농도의 선택은 활성 작용제의 목적하는 용량, 빈도 및 전달 방법과 같은 요인에 좌우된다.In some embodiments, the pharmaceutical composition contains at least 0.1% (w/v) of a compound as described above, in some embodiments, the pharmaceutical composition contains greater than 0.1% of said compound, in some embodiments, the pharmaceutical composition comprises about 10% or less, in some embodiments, the pharmaceutical composition contains about 5% or less, and in some embodiments, the pharmaceutical composition contains about 1% (w/v) or less. Selection of a suitable concentration depends on factors such as the desired dose, frequency and method of delivery of the active agent.

대상체, 예컨대 포유류 또는 인간을 치료하는 경우, 그 투여량은 대상체의 체중 및 전반적인 건강, 치료받는 병태, 증상의 중증도 등과 같은 요인에 근거하여 결정된다. 바람직하지 못한 어떠한 부작용도 피하면서, 목적하는 혜택을 가져다 주는 투여량과 농도를 결정한다. 대상 화합물의 전형적인 투여량은 인간 환자의 경우 약 0.0005 to 500 mg/일의 범위 내이고, 일부 실시양태에서 약 1 내지 100 mg/일의 범위 내이다. 예를 들어, 더 높은 용량 요법은, 예를 들어 50 내지 100, 75 내지 100, 또는 50 내지 75 mg/일을 포함하고, 더 낮은 용량 요법은, 예를 들어 1 내지 50, 25 내지 50, 또는 1 내지 25 mg/일을 포함할 수 있다.When treating a subject, such as a mammal or a human, the dosage is determined based on factors such as the subject's body weight and overall health, the condition being treated, the severity of symptoms, and the like. Determine the dosage and concentration that will produce the desired benefit while avoiding any undesirable side effects. Typical dosages of a subject compound are in the range of about 0.0005 to 500 mg/day, and in some embodiments about 1 to 100 mg/day for human patients. For example, higher dose regimens include, for example, 50 to 100, 75 to 100, or 50 to 75 mg/day, and lower dose regimens include, for example, 1 to 50, 25 to 50, or 1 to 25 mg/day.

본 발명에 따른 신규 올리고뉴클레오티드는 5'-캡핑된 RNA의 합성에 활용되어 RNA 생산 공정(예컨대, 합성 수율, 합성 규모, 순도 등)을 개선할 뿐 아니라 이를 활용한 핵산 치료제 또는 백신의 효능(예컨대, RNA의 안정성 및/또는 단백질 발현 효율) 개선 및 부작용 감소(예컨대, 면역원성 감소) 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명은 핵산 치료제 또는 백신 분야에 유용하게 활용될 수 있다.The novel oligonucleotide according to the present invention is used for the synthesis of 5'-capped RNA to improve the RNA production process (eg, synthesis yield, synthesis scale, purity, etc.), as well as the efficacy of nucleic acid therapeutics or vaccines using it (eg, synthesis yield, synthesis scale, purity, etc.) , RNA stability and/or protein expression efficiency) improvement and side effect reduction (eg, immunogenicity reduction) can be exerted. Therefore, the present invention can be usefully utilized in the field of nucleic acid therapeutics or vaccines.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail through examples and experimental examples. These Examples and Experimental Examples are only for exemplifying the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these Examples and Experimental Examples.

제조예 1: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(((히드록시((히드록시(1H-이미다졸-1-일)포스포릴)옥시)포스포릴)옥시)메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.나트륨염의 제조Preparation Example 1: 2-amino-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(((hydroxy((hydroxy(1H-imidazol-1-yl) Preparation of phosphoryl)oxy)phosphoryl)oxy)methyl)tetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium.sodium salt

단계 1. 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(((히드록시(포스포노옥시)포스포릴)옥시)메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.트리에틸아민염의 제조Step 1. 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(((hydroxy(phosphonooxy)phosphoryl)oxy)methyl)tetrahydrofuran Preparation of -2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purine-7-ium.triethylamine salt

((2R,3S,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-9-일)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메틸 트리히드로젠 디포스페이트.2트리에틸아민염(5 g, 7.74 mmol)을 정제수(155 mL)에 녹이고 초산으로 용액의 pH를 4.5로 조절하였다. 디메틸 설페이트(5.18 mL, 54.2 mmol)를 1 분간 천천히 첨가 후, 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이 때 용액의 pH를 5N 수산화나트륨 수용액을 이용하여 4 ~ 4.5로 조절하였다. 반응 종료 후 반응액을 디클로로메탄(200 mL x 3회)으로 세척하고, 수층을 1 M TEAB를 이용하여 pH 5.5 ~ 6으로 조절하였다. DEAE 세파덱스 레진으로 정제하여 흰색 고체의 표제 화합물(3.03 g)을 수득하였다.((2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2 -yl) methyl trihydrogen diphosphate. 2 triethylamine salt (5 g, 7.74 mmol) was dissolved in purified water (155 mL) and the pH of the solution was adjusted to 4.5 with acetic acid. After slowly adding dimethyl sulfate (5.18 mL, 54.2 mmol) for 1 minute, the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. At this time, the pH of the solution was adjusted to 4-4.5 using 5N sodium hydroxide aqueous solution. After completion of the reaction, the reaction solution was washed with dichloromethane (200 mL x 3 times), and the aqueous layer was adjusted to pH 5.5-6 using 1 M TEAB. Purification with DEAE Sephadex resin gave the title compound as a white solid (3.03 g).

LC-MS (ESI, m/z) = 456.0 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 456.0 (M-2H + ).

단계 2. 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(((히드록시((히드록시(1H-이미다졸-1-일)포스포릴)옥시)포스포릴)옥시)메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.나트륨염의 제조Step 2. 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(((hydroxy((hydroxy(1H-imidazol-1-yl)phos Phosphoryl) oxy) phosphoryl) oxy) methyl) tetrahydrofuran-2-yl) -7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium. Preparation of sodium salt

상기 단계 1에서 수득한 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(((히드록시(포스포노옥시)포스포릴)옥시)메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.트리에틸아민염(3.03 g, 5.42 mmol)과 이미다졸(3.69 g, 54.2 mmol)을 디메틸포름아미드(38.7 mL)에 녹였다. 2,2'-디티오디피리딘(5.97 g, 27.1 mmol)과 트리페닐포스핀(7.1 g, 27.1 mmol)을 첨가하고 상온에서 10 시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후 반응액을 -10 ~ -20 ℃로 냉각하고, 0.1 M 소듐 퍼클로레이트/아세톤(108 mL, 10.83 mmol)을 적가하였다. 생성된 고체를 필터한 후 건조하여 흰색 고체의 표제 화합물(2.33 g)을 수득하였다.2-amino-9-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(((hydroxy(phosphonooxy)phosphoryl)oxy)methyl obtained in step 1 above Tetrahydrofuran-2-yl) -7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium triethylamine salt (3.03 g, 5.42 mmol) and imidazole (3.69 g, 54.2 mmol) was dissolved in dimethylformamide (38.7 mL). After adding 2,2'-dithiodipyridine (5.97 g, 27.1 mmol) and triphenylphosphine (7.1 g, 27.1 mmol), the mixture was stirred at room temperature for 10 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was cooled to -10 to -20 °C, and 0.1 M sodium perchlorate/acetone (108 mL, 10.83 mmol) was added dropwise. The resulting solid was filtered and dried to obtain the title compound (2.33 g) as a white solid.

LC-MS (ESI, m/z) = 505.8 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 505.8 (M-2H + ).

제조예 2: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-3-히드록시-5-(((히드록시((히드록시(1H-이미다졸-1-일)포스포릴)옥시)포스포릴)옥시)메틸)-4-메톡시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.나트륨염의 제조Preparation Example 2: 2-amino-9-((2R,3R,4S,5R)-3-hydroxy-5-(((hydroxy((hydroxy(1H-imidazol-1-yl)phosphoryl) Preparation of oxy) phosphoryl) oxy) methyl) -4-methoxytetrahydrofuran-2-yl) -7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium.sodium salt

((2R,3S,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-9-일)-4-히드록시-3-메톡시테트라히드로퓨란-2-일)메틸 트리히드로젠 디포스페이트.2트리에틸아민염(410 mg, 0.621 mmol)을 사용하여 상기 제조예 1과 유사한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(159 mg)을 수득하였다.((2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-4-hydroxy-3-methoxytetrahydrofuran -2-yl) methyl trihydrogen diphosphate. 2-triethylamine salt (410 mg, 0.621 mmol) was reacted in the same manner as in Preparation Example 1 to obtain the title compound (159 mg) as a white solid.

LC-MS (ESI, m/z) = 520.0 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 520.0 (M-2H + ).

실시예 1: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.3트리에틸아민염 (올리고뉴클레오티드 1)의 제조Example 1: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-amino-9H -Purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy) Phosphoryl)oxy)methyl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium.3triethyl Preparation of amine salt (oligonucleotide 1)

단계 1. ((2R,3R,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메틸 디히드로젠 포스페이트의 제조Step 1. ((2R,3R,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl dihydro Preparation of Rosen Phosphate

(2R,3R,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-2-(히드록시메틸)테트라히드로퓨란-3-올(0.5 g, 1.86 mmol)에 트리메틸포스페이트(9.24 mL, 80 mmol)를 넣고 상온에서 30분간 교반하였다. 반응액을 0 ~ 5 ℃로 냉각한 후 염화인산(0.225 mL, 2.414 mmol)을 적가하고 2 ~ 5 ℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 종료된 후 1 M TEAB로 반응액을 중화하고 수층을 디클로로메탄으로 씻었다. 수층을 DEAE 세파덱스 레진으로 정제하여 흰색 고체의 표제 화합물(604 mg)을 수득하였다.(2R,3R,4R,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-2-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-3-ol (0.5 g, 1.86 mmol) into trimethylphosphate (9.24 mL, 80 mmol) and stirred at room temperature for 30 minutes. After cooling the reaction solution to 0 ~ 5 ℃, chlorophosphoric acid (0.225 mL, 2.414 mmol) was added dropwise and stirred at 2 ~ 5 ℃ for 2 hours. After the reaction was completed, the reaction solution was neutralized with 1 M TEAB, and the aqueous layer was washed with dichloromethane. The aqueous layer was purified with DEAE Sephadex resin to give the title compound as a white solid (604 mg).

LC-MS (ESI, m/z) = 348.0 (M-H+).LC-MS (ESI, m/z) = 348.0 (MH + ).

단계 2. 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.3트리에틸아민염의 제조Step 2. 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-amino-9H- Purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phos Foryl) oxy) methyl) -3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl) -7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium.3triethylamine salt preparation

상기 단계 1에서 수득한 화합물(50 mg, 0.143 mmol)과 제조예 1에서 수득한 화합물(99 mg, 0.186 mmol)을 DMSO(1.43 mL)에 녹이고 MgCl2(17.7 mg, 0.186 mmol)를 첨가한 후 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 종료된 후 25 mM EDTA 2나트륨염 수용액(aq) 7 mL에 희석하였다. 완전히 용해된 것을 확인한 후, 정제수 3 mL를 첨가하였다. DEAE 세파덱스 레진으로 정제하여 흰색 고체의 표제 화합물(62 mg)을 수득하였다.The compound (50 mg, 0.143 mmol) obtained in Step 1 and the compound (99 mg, 0.186 mmol) obtained in Preparation Example 1 were dissolved in DMSO (1.43 mL), and MgCl 2 (17.7 mg, 0.186 mmol) was added thereto. It was stirred for 2 hours at room temperature. After the reaction was completed, it was diluted in 7 mL of 25 mM EDTA disodium salt aqueous solution (aq). After confirming complete dissolution, 3 mL of purified water was added. Purification with DEAE Sephadex resin gave the title compound (62 mg) as a white solid.

LC-MS (ESI, m/z) = 786.9 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 786.9 (M-2H + ).

실시예 2: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3-히드록시-4-메톡시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.3트리에틸아민염 (올리고뉴클레오티드 2)의 제조Example 2: 2-amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-amino-9H -Purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy) Phosphoryl)oxy)methyl)-3-hydroxy-4-methoxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium.3 Preparation of triethylamine salt (oligonucleotide 2)

상기 실시예 1의 단계 1에서 수득한 화합물(13 mg, 0.037 mmol)과 제조예 2에서 수득한 화합물(26.3 mg, 0.048 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(24 mg)을 수득하였다.The compound (13 mg, 0.037 mmol) obtained in Step 1 of Example 1 and the compound (26.3 mg, 0.048 mmol) obtained in Preparation Example 2 were reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to obtain a white solid. The title compound (24 mg) was obtained.

LC-MS (ESI, m/z) = 801.0 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 801.0 (M-2H + ).

실시예 3: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.2트리에틸아민염 (올리고뉴클레오티드 3)의 제조Example 3: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6 -oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy) oxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro- Preparation of 1H-purin-7-ium.2triethylamine salt (oligonucleotide 3)

단계 1: ((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메틸 디히드로젠 포스페이트.트리에틸아민염의 제조Step 1: ((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxy Preparation of tetrahydrofuran-2-yl)methyl dihydrogen phosphate.triethylamine salt

2-아미노-9-((2R,3R,4R,5R)-3-플루오로-4-히드록시-5-(히드록시메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-1,9-디히드로-6H-퓨린-6-온(0.5 g, 1.753 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 1과 유사한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(283 mg)을 수득하였다. 2-Amino-9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1,9-dihydro- 6H-purin-6-one (0.5 g, 1.753 mmol) was reacted in a similar manner to step 1 of Example 1 to obtain the title compound (283 mg) as a white solid.

LC-MS (ESI, m/z) = 364.0 (M-H+).LC-MS (ESI, m/z) = 364.0 (MH + ).

단계 2: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.2트리에틸아민염의 제조 Step 2: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6- oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy )phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H -Preparation of purine-7-ium.2triethylamine salt

상기 단계 1에서 수득한 화합물(50 mg, 0.137 mmol)과 제조예 1에서 수득한 화합물(94 mg, 0.178 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(45.8 mg)을 수득하였다.The compound (50 mg, 0.137 mmol) obtained in Step 1 and the compound (94 mg, 0.178 mmol) obtained in Preparation Example 1 were reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to form the title compound (45.8 mmol) as a white solid. mg) was obtained.

LC-MS (ESI, m/z) = 803.2 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 803.2 (M-2H + ).

실시예 4: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3-히드록시-4-메톡시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.3트리에틸아민염 (올리고뉴클레오티드 4)의 제조Example 4: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6 -oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy) oxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3-hydroxy-4-methoxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-di Preparation of hydro-1H-purin-7-ium.3triethylamine salt (oligonucleotide 4)

상기 실시예 3의 단계 1에서 수득한 화합물(13 mg, 0.036 mmol)과 상기 제조예 2에서 수득한 화합물(25.2 mg, 0.046 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(13.8 mg)을 수득하였다.The compound (13 mg, 0.036 mmol) obtained in Step 1 of Example 3 and the compound (25.2 mg, 0.046 mmol) obtained in Preparation Example 2 were reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to form a white solid. of the title compound (13.8 mg).

LC-MS (ESI, m/z) = 817.1 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 817.1 (M-2H + ).

실시예 5: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.2트리에틸아민염 (올리고뉴클레오티드 5)의 제조Example 5: 2-amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-di oxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy) oxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro- Preparation of 1H-purine-7-ium.2triethylamine salt (oligonucleotide 5)

단계 1: ((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메틸 디히드로젠 포스페이트.나트륨염의 제조Step 1: ((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-fluoro-3-hydroxy Preparation of tetrahydrofuran-2-yl)methyl dihydrogen phosphate sodium salt

1-((2R,3R,4R,5R)-3-플루오로-4-히드록시-5-(히드록시메틸)테트라히드로퓨란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온(0.5 g, 2.031 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 1과 유사한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(150 mg)을 수득하였다. 1-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)pyrimidine-2,4(1H,3H)- Dione (0.5 g, 2.031 mmol) was reacted in a similar manner to step 1 of Example 1 to obtain the title compound (150 mg) as a white solid.

LC-MS (ESI, m/z) = 325.0 (M-H+).LC-MS (ESI, m/z) = 325.0 (MH + ).

단계 2: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.2트리에틸아민염의 제조 Step 2: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo -3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy )phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H -Preparation of purine-7-ium.2triethylamine salt

상기 단계 1에서 수득한 화합물(38 mg, 0.089 mmol)과 제조예 1에서 수득한 화합물(61.4 mg, 0.116 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(4 mg)을 수득하였다.The compound (38 mg, 0.089 mmol) obtained in Step 1 and the compound (61.4 mg, 0.116 mmol) obtained in Preparation Example 1 were reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to form the title compound (4 mg) was obtained.

LC-MS (ESI, m/z) = 764.0 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 764.0 (M-2H + ).

실시예 6: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3-히드록시-4-메톡시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.2트리에틸아민염 (올리고뉴클레오티드 6)의 제조Example 6: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-di oxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy) oxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3-hydroxy-4-methoxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6-oxo-6,9-di Preparation of hydro-1H-purin-7-ium.2triethylamine salt (oligonucleotide 6)

상기 실시예 5의 단계 1에서 수득한 화합물(38 mg, 0.089 mmol)과 제조예 2에서 수득한 화합물(63 mg, 0.116 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(10 mg)을 수득하였다.The compound (38 mg, 0.089 mmol) obtained in Step 1 of Example 5 and the compound (63 mg, 0.116 mmol) obtained in Preparation Example 2 were reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to obtain a white solid. The title compound (10 mg) was obtained.

LC-MS (ESI, m/z) = 778.0 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 778.0 (M-2H + ).

실시예 7: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-7-메틸-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-7-이움-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3-히드록시-4-메톡시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.트리에틸아민염 (올리고뉴클레오티드 7)의 제조Example 7: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-7 -methyl-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-7-ium-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl) methoxy) (hydroxy )phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3-hydroxy-4-methoxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6 Preparation of -Oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium.triethylamine salt (oligonucleotide 7)

단계 1: 2-아미노-9-((2R,3R,4R,5R)-3-플루오로-4-히드록시-5-((포스포노옥시)메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.트리에틸아민염의 제조 Step 1: 2-Amino-9-((2R,3R,4R,5R)-3-fluoro-4-hydroxy-5-((phosphonooxy)methyl)tetrahydrofuran-2-yl)-7 -Methyl-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-7-ium. Preparation of triethylamine salt

상기 실시예 3의 단계 1에서 수득한 화합물(220 mg, 0.472 mmol)을 상기 제조예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(321.5 mg)을 수득하였다.The compound (220 mg, 0.472 mmol) obtained in Step 1 of Example 3 was reacted in the same manner as in Step 1 of Preparation Example 1 to obtain the title compound (321.5 mg) as a white solid.

LC-MS (ESI, m/z) = 378.0 (M-2H+).LC-MS (ESI, m/z) = 378.0 (M-2H + ).

단계 2: 2-아미노-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-아미노-7-메틸-6-옥소-1,6-디히드로-9H-퓨린-7-이움-9-일)-4-플루오로-3-히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메톡시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)(히드록시)포스포릴)옥시)메틸)-3-히드록시-4-메톡시테트라히드로퓨란-2-일)-7-메틸-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-7-이움.트리에틸아민염의 제조 Step 2: 2-Amino-9-((2R,3R,4S,5R)-5-((((((((((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-7- Methyl-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-7-ium-9-yl)-4-fluoro-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl) methoxy) (hydroxy) Phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)(hydroxy)phosphoryl)oxy)methyl)-3-hydroxy-4-methoxytetrahydrofuran-2-yl)-7-methyl-6- Preparation of oxo-6,9-dihydro-1H-purine-7-ium.triethylamine salt

상기 단계 1에서 수득한 화합물(50 mg, 0.131 mmol)과 제조예 2에서 수득한 화합물(35.8 mg, 0.066 mmol)을 상기 실시예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 반응하여 흰색 고체의 표제 화합물(20 mg)을 수득하였다.The compound (50 mg, 0.131 mmol) obtained in Step 1 and the compound (35.8 mg, 0.066 mmol) obtained in Preparation Example 2 were reacted in the same manner as in Step 2 of Example 1 to form the title compound (20 mg) as a white solid. mg) was obtained.

LC-MS (ESI, m/z) = 833.0 (M-H+).LC-MS (ESI, m/z) = 833.0 (MH + ).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예 및 실험예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific parts of the present invention in detail above, for those skilled in the art, these specific descriptions are only preferred examples and experimental examples, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be clear. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (21)

하기 화학식 1로 표시되는 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염:
[화학식 1]
Figure pat00025

상기 화학식에서,
B는 천연, 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기이고;
X는 -할로이고;
Y1은 -OH, -O(C1-4알킬), -O(C1-4알킬)O(C1-4알킬), -CH2O(C1-4알킬), 또는 -할로이고;
Y2는 -H 또는 Y1과 결합하여 LNA 고리를 형성하는 것이고 {여기서, 상기 LNA 고리의 하나 이상의 H는 -(C1-4알킬), -OH, 또는 -O(C1-4알킬)로 치환될 수 있음};
n은 0 또는 1이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 -(C1-4알킬)이고;
R3는 -(C1-4알킬)이다.An oligonucleotide primer compound for capping RNA represented by Formula 1 below, a stereoisomer thereof, or a salt thereof:
[Formula 1]
Figure pat00025

In the above formula,
B is a natural, unnatural or modified nucleoside base;
X is -halo;
Y 1 is -OH, -O(C 1-4 alkyl), -O(C 1-4 alkyl)O(C 1-4 alkyl), -CH 2 O(C 1-4 alkyl), or -halo; ;
Y 2 is combined with -H or Y 1 to form an LNA ring {wherein one or more H of the LNA ring is -(C 1-4 alkyl), -OH, or -O(C 1-4 alkyl) may be substituted with };
n is 0 or 1;
R 1 and R 2 are each independently -H or -(C 1-4 alkyl);
R 3 is -(C 1-4 alkyl). 제 1 항에 있어서,
상기 비천연 또는 변형된 뉴클레오시드 염기는 상기 천연 뉴클레오시드 염기의 이성질체이거나 상기 천연 뉴클레오시드 염기의 하나 이상의 -H가 -(C1-4알킬), -O(C1-4알킬) 또는 -할로로 치환, 하나 이상의 =CH-가 =N-으로 치환, 및 하나 이상의 =O가 =S로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로 치환된 것인;
RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염.According to claim 1,
The unnatural or modified nucleoside base is an isomer of the natural nucleoside base or one or more -H of the natural nucleoside base is -(C 1-4 alkyl), -O(C 1-4 alkyl) or -halo substitution, one or more ═CH- substitution with ═N-, and one or more ═O substitution with ═S substitution with one or more selected from the group consisting of;
An oligonucleotide primer compound for RNA capping, a stereoisomer thereof, or a salt thereof. 제 1 항에 있어서,
B1 및 B2는 각각 독립적으로
Figure pat00026
,
Figure pat00027
,
Figure pat00028
,
Figure pat00029
,
Figure pat00030
,
Figure pat00031
, 또는
Figure pat00032
인;
RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염.According to claim 1,
B 1 and B 2 are each independently
Figure pat00026
,
Figure pat00027
,
Figure pat00028
,
Figure pat00029
,
Figure pat00030
,
Figure pat00031
, or
Figure pat00032
person;
An oligonucleotide primer compound for RNA capping, a stereoisomer thereof, or a salt thereof. 제 1 항에 있어서,
X는 -F인;
RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염.According to claim 1,
X is -F;
An oligonucleotide primer compound for RNA capping, a stereoisomer thereof, or a salt thereof. 제 1 항에 있어서,
Z1은 -OH 또는 -O(C1-4알킬)이고;
Z2는 -H인;
RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염.According to claim 1,
Z 1 is -OH or -O(C 1-4 alkyl);
Z 2 is -H;
An oligonucleotide primer compound for RNA capping, a stereoisomer thereof, or a salt thereof. 제 1 항에 있어서,
n은 1인;
RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염.According to claim 1,
n is 1;
An oligonucleotide primer compound for RNA capping, a stereoisomer thereof, or a salt thereof. 제 1 항에 있어서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H이고;
R3는 -(C1-4알킬)인;
RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염.According to claim 1,
R 1 and R 2 are each independently -H;
R 3 is -(C 1-4 alkyl);
An oligonucleotide primer compound for RNA capping, a stereoisomer thereof, or a salt thereof. 제 1 항에 있어서,
하기 화합물들로 구성된 군에서 선택된 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 염:
(1)
Figure pat00033
;
(2)
Figure pat00034
;
(3)
Figure pat00035
;
(4)
Figure pat00036
;
(5)
Figure pat00037
;
(6)
Figure pat00038
; 및
(7)
Figure pat00039
.According to claim 1,
An oligonucleotide primer compound for capping RNA selected from the group consisting of the following compounds, a stereoisomer thereof, or a salt thereof:
(One)
Figure pat00033
;
(2)
Figure pat00034
;
(3)
Figure pat00035
;
(4)
Figure pat00036
;
(5)
Figure pat00037
;
(6)
Figure pat00038
; and
(7)
Figure pat00039
. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 RNA 분자.An RNA molecule comprising the oligonucleotide primer for RNA capping according to any one of claims 1 to 8. 제 9 항에 있어서,
RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머는 RNA 분자의 5' 상단에 부착된 것인 RNA 분자.According to claim 9,
An RNA molecule wherein an oligonucleotide primer for RNA capping is attached to the 5' end of the RNA molecule. 제 9 항에 있어서,
RNA 분자는 1개 이상의 코딩 서열(coding sequence; CDS)을 포함하는 mRNA인 RNA 분자.According to claim 9,
An RNA molecule is an RNA molecule that is an mRNA comprising one or more coding sequences (CDS). (S-1) DNA 주형, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 RNA 캡핑용 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 혼합하는 단계; 및
(S-2) 상기 혼합물을 인큐베이션하여 상기 폴리뉴클레오티드 주형의 전사를 수행하는 단계;
를 포함하는 제 9 항에 따른 RNA 분자의 합성 방법.(S-1) mixing a DNA template, an RNA capping oligonucleotide primer according to any one of claims 1 to 8, and RNA polymerase; and
(S-2) performing transcription of the polynucleotide template by incubating the mixture;
A method for synthesizing an RNA molecule according to claim 9 comprising a. 제 12 항에 있어서,
RNA 분자의 합성은 in vitro에서 수행되는 것인 합성 방법.According to claim 12,
A synthetic method wherein the synthesis of RNA molecules is performed in vitro. 제 9 항에 따른 RNA 분자로부터 번역된 펩티드.A peptide translated from an RNA molecule according to claim 9. 제 9 항에 따른 RNA 분자가 도입된 체외 세포.An in vitro cell into which the RNA molecule according to claim 9 has been introduced. 제 15 항에 따른 체외 세포로부터 생산된 펩티드.A peptide produced from an ex vivo cell according to claim 15 . 제 9 항에 따른 RNA 분자를 포함하는 핵산 치료제.A nucleic acid therapeutic comprising the RNA molecule according to claim 9. 제 15 항에 있어서,
RNA 분자를 표적 세포로 도입할 수 있는 전달체를 포함하는 핵산 치료제.According to claim 15,
A nucleic acid therapeutic comprising a delivery vehicle capable of introducing an RNA molecule into a target cell. 제 9 항에 따른 RNA 분자를 포함하는 백신.A vaccine comprising an RNA molecule according to claim 9 . 제 19 항에 있어서,
RNA 분자를 표적 세포로 도입할 수 있는 전달체를 포함하는 백신.According to claim 19,
A vaccine comprising a delivery vehicle capable of introducing an RNA molecule into a target cell. 제 19 항에 있어서,
암 또는 감염성 질환을 예방하기 위한 백신.
According to claim 19,
Vaccine to prevent cancer or infectious disease.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2013059475A1 (en) 2011-10-18 2013-04-25 Life Technologies Corporation Alkynyl-derivatized cap analogs, preparation and uses thereof
WO2017053297A1 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Trilink Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for synthesizing 5'-capped rnas

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