KR20230082613A - Cns 또는 근육 전달을 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기준 캡시드를 갖는 rAAV에 비해, 원하는 특성, 특히 CNS 또는 근육 세포에 증가된 형질도입을 부여하고/하거나 향상시키는 아미노산 서열 및/또는 아미노산 치환을 포함하도록 조작된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)에 관한 것이다.
Description
본 발명은 조직 향성(tropism)을 비롯하여 원하는 특성을 부여하고/하거나 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 펩타이드 삽입이 있는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 조직 유형에 대한 AAV 혈청형의 향성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입을 포함하는 조작된 캡시드 단백질, 뿐만 아니라 조작되지 않고 rAAV에 근육 또는 CNS 향성을 부여하는 것으로 발견된 캡시드를 제공한다. 특히, AAV 캡시드에서 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입은 심장 및/또는 근육 조직 또는 중추 신경계에서 형질도입, 게놈 통합 및/또는 전이유전자(transgene) 발현을 개선시키는 한편, 간 및/또는 후근신경절 및/또는 말초 신경 세포에 대한 향성을 저하시킨다. 본 명세서에 개시된 캡시드 단백질을 갖는 rAAV는 CNS 또는 근육 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자를 전달하는데 유용하다.
유전자 전달 벡터로서 아데노-연관 바이러스(AAV)의 사용은 충족되지 않은 많은 환자의 요구를 치료하기 위한 유망한 방안이다. 자연적으로 발생하는 수십 개의 AAV 캡시드가 보고되었으며, 영장류 조직에서 AAV 서열의 자연적 다양성은 분기군으로 분포되는 100개의 변이체 상에서 식별되었다. AAV는 파르보바이러스 과에 속하며 상대적으로 작은 게놈과 간단한 유전자 성분을 가진 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 헬퍼 바이러스 없이 AAV는 잠복 감염을 확립한다. AAV 게놈은 일반적으로 벡터 생산을 위한 복제 및 패키징 신호로서 역할을 하는 역말단 반복체(ITR)의 측면에 있는 Rep 유전자 및 Cap 유전자를 갖고 있다. 캡시드 단백질은 게놈 DNA를 운반하는 캡시드를 형성하고 DNA를 표적 세포로 전달하도록 조직 향성을 결정할 수 있다.
낮은 병원성 및 장기간 표적 유전자 발현의 가능성으로 인해, 재조합 AAV(rAAV)는 유전자 전달 벡터로 사용되고 있으며, 여기서 치료 서열은 다양한 캡시드에 패키징된다. 이러한 벡터는 전임상 유전자 치료 연구에 사용되고 있으며 20개 이상의 유전자 치료 제품이 현재 임상 개발 중에 있다. 재조합 AAV9 입자와 같은 재조합 AAV는 바람직한 향신경성 특성을 입증했으며 CNS 질환의 치료를 위해 재조합 AAV9를 사용한 임상 시험이 진행 중이다. 근육 및/또는 심장 조직으로의 전달도 바람직하다. 독성을 저하시키기 위해서는 간 및/또는 후근 신경절 세포의 형질도입을 저하시키는 것이 바람직할 수도 있다. 그러나, 인간 대상체에서 rAAV의 향신경성 또는 근육/심장 향성 특성을 향상시키기 위한 시도는 제한적인 성공을 거두었다.
예를 들어, 중추 신경계와 연관된 장애를 치료하는데 또는 심장 및/또는 근육에서의 발현이 바람직한 경우에 사용하기 위해, 향상된 향신경성 또는 근육 및/또는 심장 특성에 대한 향성을 가지면서, 부작용을 최소화하기 위해 간 및/또는 후근 신경절 세포 및/또는 말초 신경 세포에 최소의 형질도입을 갖는, rAAV 벡터가 여전히 필요한 상태이다. 또한, 치료제를 전달하기 위해 향상된 조직-특이적 표적화 및/또는 향상된 조직-특이적 형질도입을 갖는 rAAV 벡터가 필요하다.
CNS 및/또는 근육 조직에서 기준 캡시드, 예를 들어, 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9 캡시드에 비해, rAAV 게놈의 조직 표적화, 형질도입 및/또는 통합을 향상시키는 반면, 독성을 저하시키기 위해 특정 조직, 예컨대 간 및 후근 신경절 세포에서의 생체분포를 CNS 및/또는 근육에서의 분포 및/또는 부모 캡시드 또는 기준 캡시드, 예컨대 AAV8 또는 AAV9 캡시드에 비해 저하시키는 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 펩타이드 삽입을 갖도록 조작된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)가 제공된다. 마우스 및 비-인간 영장류에서의 생체분포 연구는 조작된 캡시드를 비롯한 캡시드에 대한 조직 유형별 상대적 형질도입 및 전이유전자 전사 및 발현을 평가할 수 있게 한다(하기 실시예 13 내지 18 참조). 따라서, 본 명세서에는 CNS 조직(예를 들어, 전두엽 피질, 해마, 소뇌, 중뇌)에서 기준 캡시드(예를 들어, 미조작된, 변형된 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9)에 비해 형질도입, 게놈 통합, 전이유전자 전사 및 발현을 비롯하여 향상된 또는 증가된 생체분포를 갖고 CNS 조직에서의 생체분포와 비교하여 그리고/또는 기준 캡시드, 예컨대, 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9를 갖는 AAV에 비해 간 및/또는 후근 신경절 세포(경추, 흉부 및/또는 요추)에서의 형질도입, 게놈 통합, 전이유전자 전사 및 발현을 포함하는 분포가 저하된 rAAV가 제공된다. 이러한 rAAV는 CNS 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 전달하는데 유용할 수 있다. 또한, 본 명세서에는 골격근 및/또는 심근 조직에서 기준 캡시드(예를 들어, 미조작된, 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9)에 비해 형질도입, 게놈 통합, 전이유전자 전사 및 발현을 포함하는 향상 또는 증가된 생체분포를 갖고, 근육 조직에서의 생체분포와 비교하여 그리고/또는 기준 캡시드, 예컨대, 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9를 갖는 AAV에 비해 간 및/또는 후근 신경절 세포(경추, 흉부 및/또는 요추)에서의 형질도입, 게놈 통합, 전이유전자 전사 및 발현을 포함하는 분포가 저하된 rAAV가 제공된다. 이러한 rAAV는 근육 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 전달하는데 유용할 수 있다.
특히, AAV9 캡시드 단백질 또는 AAV8 캡시드 단백질(각각 서열번호 67 또는 66, 도 7에 넘버링되어 있음) 또는 CNS의 세포(표적)를 우선적으로(특히, 야생형 AAV8 또는 AAV9 캡시드를 갖는 rAAV보다 더 큰 수준으로) 형질도입시키고, 특정 실시형태에서는 야생형 AAV8 또는 AAV9 캡시드를 갖는 rAAV와 비교하여 간 및/또는 후근 신경절 및/또는 말초 신경 세포를 표적화 또는 형질도입하지 않거나 또는 형질도입을 저하시키는 하나 이상의 아미노산 치환(2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함함)을 갖는 것이 제공된다. 다른 실시형태에서, 심장 및/또는 골격 근육의 세포(표적)를 우선적으로(특히, 야생형 AAV9 캡시드를 갖는 rAAV보다 더 큰 수준으로) 형질도입시키고, 특정 실시형태에서는 야생형 AAV8 또는 AAV9 캡시드를 갖는 rAAV와 비교하여 간 및/또는 후근 신경절 및/또는 말초 신경 세포를 표적화 또는 형질도입하지 않거나, 또는 형질도입을 저하시키는 하나 이상의 아미노산 치환(2개, 3개, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함함)을 갖는 AAV9 캡시드 단백질 또는 AAV8 캡시드 단백질(각각 서열번호 67 또는 66, 도 7에 넘버링되어 있음)이 제공된다. 이러한 아미노산 변형으로는 AAV9의 S263F/S269T/A273T 및 다른 AAV 유형 캡시드의 상응하는 치환(예를 들어, 도 7의 정렬에 따름), AAV9의 W530R, Q474A, N272A, 또는 G266A, 및 다른 AAV 유형 캡시드의 상응하는 치환 또는 AAV8의 A269S 및 다른 AAV 캡시드의 상응하는 치환(예를 들어, 도 7의 정렬에 따름)을 포함한다. 또한, 캡시드, 특히 AAV9 캡시드에 펩타이드 TLAAPFK(서열번호 1)가 Q588과 A589 사이(본 명세서에서 PHP.hDYN) 또는 대안적으로 S268과 S269 사이 또는 S454와 G455 사이에 삽입되거나 또는 다른 AAV 캡시드에 상응하는 위치(예를 들어, 도 7 참조)에 삽입된 것이 제공된다. 또는, 대안적으로, 캡시드는 AAV9 PHP.eB 캡시드(A587D 및 Q588G 변형 및 G588과 A589 사이에 펩타이드 TLAVPFK(서열번호 20)의 삽입 및 위치 138과 139 사이, 또는 상응하는 위치에 펩타이드 TILSRSTQTG(서열번호 15)의 삽입을 가짐)이다. 추가 캡시드는 캡시드에, 예를 들어, AAV9의 S454와 G455 사이, 또는 대안적으로 S268과 S269 사이, 또는 Q588과 A589 사이, 또는 다른 캡시드의 상응하는 위치에 삽입된 신장1 펩타이드 LPVAS를 갖는다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 AAV rh64R1의 R697W 치환을 포함할 수 있다. 이들 아미노산 치환 및 삽입을 갖는 캡시드는 추가로 AAV9 캡시드의 496 내지 498에서, 또는 AAV8 캡시드의 위치 498 내지 500에서 NNN(아스파라긴)이 AAA(알라닌)로 치환된 것을 갖거나, 또는 다른 AAV 유형 캡시드의 상응하는 치환을 가질 수 있다. 조작된 캡시드는 AAV8.BB.LD(AAV8의 아미노산 서열에서 A269S, 498-NNN/AAA-500 치환, 서열번호 66), AAV9.BB.LD(AAV9의 아미노산 서열 중 S263G/S269T/A273T, 496-NNN/AAA-498 치환, 서열번호 67), AAV9.496-NNN/AAA-498(서열번호 31), AAV9.496-NNN/AAA-498.W503R(서열번호 32), AAV9.W503R(서열번호 33), 또는 AAV9.Q474A(서열번호 34)를 포함한다. 다른 예에서, 캡시드는 AAV9.N272A.496-NNN-498(서열번호 91) 또는 AAV9.G266A.496-NNN-498(서열번호 92)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 캡시드는 조작된 캡시드가 아니라, AAVrh.10 캡시드(서열번호 69), AAVrh.46 캡시드(서열번호 93), AAVrh.64.R1 캡시드(서열번호 90) 또는 AAVrh.73 캡시드(서열번호 88)이다. 특정 실시형태에서, 형질도입은 전이유전자의 검출, 예컨대 GFP 형광에 의해 측정된다.
조작되는 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질일 수 있으나, 임의의 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV 혈청형 1(서열번호 59); AAV 혈청형 2(서열번호 60); AAV 혈청형 3(서열번호 61), AAV 혈청형 3B, AAV 혈청형 4(서열번호 62); AAV 혈청형 5(서열번호 63); AAV 혈청형 6(서열번호 64); AAV7 캡시드의 451 내지 461(서열번호 65); AAV8 캡시드의 451 내지 461(서열번호 66); AAV 혈청형 9(서열번호 67); AAV 혈청형 9e(서열번호 68); AAV 혈청형 rh10(서열번호 69); AAV 혈청형 rh20 (서열번호 70); 및 AAV 혈청형 hu.37(서열번호 71), AAV 혈청형 rh39(서열번호 73), 및 AAV 혈청형 rh74(서열번호 72 또는 서열번호 80), AAV 혈청형 rh.34, AAV 혈청형 hu.60, AAV 혈청형 rh.21, AAV 혈청형 rh.15, AAV 혈청형 rh.24, AAV 혈청형 hu.5, AAV 혈청형 hu.10(서열번호 69), AAV 혈청형 rh64R1(서열번호 90), AAV 혈청형 rh46(서열번호 93), 및 AAV 혈청형 rh73(서열번호 88)일 수 있다(특정 서열의 정렬에 대해서는 도 7 참조) 및 서열에 대해서는 표 17. 일부 실시형태에서, 이들 벡터의 캡시드는 미조작된다. 예를 들어, 미변형된 AAV 혈청형 rh64R1(서열번호 90) AAV 혈청형 rh.10((서열번호 69) AAV 혈청형 rh46(서열번호 93), 및 AAV 혈청형 rh73(서열번호 88)은 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 캡시드를 혼입시킨 rAAV, 예를 들어, 치료적 관심이 있는 전이유전자, 예컨대, 근육, 심장 또는 CNS 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 rAAV가 제공된다. 본 명세서에 기술된 rAAV를 생성하기 위한 패키징 세포가 제공된다. 또한, 본 명세서에 기술된 조작된 rAAV의 전달에 의한 치료 방법, 및 본 명세서에 기술된 조작된 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 또한, 본 명세서에 기술된 조작된 캡시드를 이용한 rAAV를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명은 아미노산 치환에 의해 조작된 rAAV9 캡시드의 작제 및 비-인간 영장류에 투여했을 때 조직 분포의 검정을 기술하는 이하 실시예에 의해 예시된다.
3.1. 실시형태
1. 야생형 또는 미조작된 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 AAV 캡시드 단백질로서, 상기 rAAV 캡시드 단백질은 S263G/S269R/A273T 치환, G266A 치환, N272A 치환, W503R 치환, Q474A 치환, 496-NNN/AAA-498 치환을 갖는 AAV9 캡시드 단백질(서열번호 67)이거나, Q588과 A589, S268과 S269, 또는 S454와 G455 사이에 펩타이드 TLAAPFK(서열번호 1)의 삽입을 갖거나, 또는 A269S 치환 또는 498-NNN/AAA-500 치환을 갖는 AAV8 캡시드(서열번호 6)이거나, 또는 또 다른 AAV 유형 캡시드의 캡시드 단백질에 상응하는 치환 또는 펩타이드 삽입을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
2. 실시형태 1에 있어서, AAV8 캡시드 단백질(서열번호 66)에 대해 498-NNN/AAA-500 아미노산 치환 또는 AAV9 캡시드 단백질(서열번호 67)에 대해 496-NNN/AAA-498 아미노산 치환, 또는 또 다른 AAV 유형 캡시드의 캡시드 단백질에 상응하는 치환을 추가로 포함하는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, AAV8.BBB.LD 캡시드(서열번호 27), AAV9.BBB.LD 캡시드(서열번호 29), AAV9.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 31), AAV9.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 32), AAV9.W503R 캡시드(서열번호 33), AAV9.Q474A 캡시드(서열번호 34), AAV9.N272A.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 91) 또는 AAV9.N266A.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 92)인, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 치환 또는 삽입이 AAVPHP.eB 캡시드, 단백질을 포함하는 AAV9 캡시드에 있거나, 또는 AAV8 캡시드에 있는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
5. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 AAV 유형 캡시드는 AAV rh.34, AAV4, AAV5, AAV hu.26, AAV rh.31, AAV hu.13, AAV hu.26, AAV hu.56, AAV hu.53, AAV7, AAV rh.10, AAV rh.64.R1, AAV rh.46 또는 AAV rh.73인 재조합 AAV 캡시드 단백질.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 야생형 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, CNS 세포로의 증가된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
7. 실시형태 6에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 야생형 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 간 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
8. 실시형태 6 또는 7에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 후근 신경절 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
9. 실시형태 6 내지 8 중 어느 하나에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 말초 신경 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
10. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 골격 및/또는 심장 근육 세포로의 증가된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
11. 실시형태 10에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 간 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
12. 실시형태 10 또는 11에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해 CNS 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
13. 실시형태 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 후근 신경절 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 rAAV 캡시드 단백질을 암호화하거나, 이와 적어도 80% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 암호화하고 상기 캡시드의 생물학적 활성을 유지하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
15. 실시형태 14에 있어서, 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 rAAV 캡시드 단백질을 암호화하는, 핵산.
16. 실시형태 14 또는 15의 핵산을 발현하여 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터를 생성할 수 있는, 패키징 세포.
17. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 캡시드 단백질을 포함하는, rAAV 벡터.
18. 실시형태 17에 있어서, 상기 근육 및/또는 CNS 세포에서 발현을 위해 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
19. 실시형태 17 또는 18의 rAAV 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
20. 세포로 전이유전자를 전달하는 방법으로서, 실시형태 17 또는 18의 rAAV 벡터와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 전이유전자는 상기 세포로 전달되는, 방법.
21. 실시형태 20에 있어서, 상기 세포는 CNS 세포, 심근 세포 또는 골격근 세포인, 방법.
22. 필요로 하는 대상체의 표적 조직으로 전이유전자를 전달하는 방법으로서, 상기 대상체에게 실시형태 17 또는 18의 rAAV 벡터를 단계를 포함하되, 상기 전이유전자는 상기 표적 조직으로 전달되는 것인, 방법.
23. 실시형태 22에 있어서, 상기 전이유전자는 근육 질환 또는 심장 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 심근 또는 골격근인, 방법.
24. 실시형태 23에 있어서, 상기 rAAV는 정맥내 또는 근육내를 포함하는 전신으로 투여되는, 방법.
25. 실시형태 22에 있어서, 상기 전이유전자는 CNS 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 CNS인, 방법.
26. 실시형태 25에 있어서, 상기 rAAV는 척수강내 또는 뇌실내로 투여되는, 방법.
27. 세포로 전이유전자를 전달하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 실시형태 17 또는 18의 rAAV 벡터를 포함하고, 상기 전이유전자는 상기 세포로 전달되는, 약제학적 조성물.
28. 필요로 하는 대상체의 표적 조직으로 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자를 전달하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 실시형태 17 또는 18의 rAAV 벡터를 포함하고, 상기 전이유전자는 상기 표적 조직으로 전달되는, 약제학적 조성물.
29. 실시형태 27 또는 28에 있어서, 상기 치료용 단백질은 근육 질환 치료제 또는 심장 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 심근 또는 골격근인, 약제학적 조성물.
30. 실시형태 27 내지 29에 있어서, 상기 rAAV는 기준 AAV 캡시드에 비해 심근 또는 골격근 세포에서 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 큰 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
31. 실시형태 27 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 간에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
32. 실시형태 27 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 후근 신경절 세포에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
33. 실시형태 27, 28 또는 제32항 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료용 단백질은 CNS 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 CNS인, 약제학적 조성물.
34. 실시형태 27, 28, 32 또는 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV는 기준 AAV 캡시드와 비교하여 CNS 세포에서 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 큰 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
35. 실시형태 27, 28, 33 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 간에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
36. 실시형태 27, 28, 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 후근 신경절 세포에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
37. 실시형태 27 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 AAV 기준 캡시드는 AAV8 또는 AAV9인, 약제학적 조성물.
38. 치료를 필요로 하는 대상체의 CNS 장애를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 실시형태 27, 28, 32 내지 37 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
39. 치료를 필요로 하는 대상체의 근육 장애를 치료하는 방법으로서, 실시형태 27 내지 31 및 37 중 어느 하나의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
도 1은 잔기 L447부터 R476까지(잔기 451 내지 459는 괄호로 묶여있음)의 아데노-연관 바이러스 9형의 VR-IV 루프(AAV9 VR-IV)를 포함하는 캡시드 아미노산 서열을 다른 AAV의 영역에 상응하는 서열과 서열 비교한 것이다. 도면은 각각 출현 순서대로 서열번호 49 내지 54, 50 및 55 내지 58을 개시한다. 상단 서열은 콘센서스 서열, 서열번호 48이다.
도 2는 캡시드 가변 영역 VR-IV, VR-V 및 VR-VIII을 보여주는 AAV 캡시드 구조의 단백질 모델을 도시한다. 박스는 모델에서 나타나는 바와 같이 표면-노출된 아미노산을 제공하는 VR-IV의 루프 영역을 강조한 것이다.
도 3은 야생형 AAV9 및 여덟(8)개의 후보 변형된 rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097)의 mL당 게놈 카피(GC/mL)에 의거한 높은 패키징 효율(역가)을 도시한 것이고, 여기서 후보 벡터는 각각 잔기 I451에서부터 Q458까지, AAV9 VR-IV 내의 상이한 부위 바로 뒤에 FLAG 삽입체를 각각 함유한다. 모든 벡터는 10mL 배양액에서 루시퍼라제 전이유전자와 함께 패키징되었다; 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 4는 항-FLAG 수지에 결합하여 패키징된 벡터의 면역침전에 의해 확인된, 여덟(8)개의 후보 변형된 rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097) 각각에서 1 VR-IV 루프 FLAG 삽입체의 표면 노출을 입증한다.
도 5A 내지 도 5B는 야생형 AAV9(9-luc) 또는 여덟(8)개의 후보 변형된(FLAG 펩타이드 삽입됨) rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097)에 패키징된, 루시퍼라제 유전자(전이유전자로서)를 운반하는 캡시드 벡터에 의해 형질도입된 Lec2 세포의 형질도입 효율을 도시한다; 형질도입 활성은 9-luc의 활성을 100%로 간주하여 루시퍼라제 활성 퍼센트(도 5A) 또는 단백질 마이크로그램당 상대적 광 단위(RLU)(도 5B)로서 표현된다.
도 6A 내지 도 6E. 도 6A는 다양한 펩타이드 길이 및 조성에 의한 AAV9의 S454 직후의 삽입은 패키징 세포에서 AAV 입자의 생산 효율에 영향을 미칠 수 있음을 예시하는 막대 그래프를 도시한다. 다양한 조성과 길이의 10개 펩타이드는 AAV9 VR-IV 내에서 S454 다음에 삽입되었다. 형질감염 5일 후 형질감염된 현탁액 HEK293 세포의 수확된 상청액에 대해 qPCR을 수행했다. 막대 그래프에 도시된 결과는 삽입의 본질이 HEK293 세포에 의해 생성 및 분비되는 AAV 입자의 능력에 영향을 미친다는 것을 입증하며, 총 수율(역가)로 나타냈다(오차 막대는 Y축에 괄호 안에 표기되어 있는 펩타이드의 평균 길이의 표준 오차를 나타냄). 도 6B 내지 도 6E는 다음 세포주의 형질도입된 세포 배양물의 형광 이미지를 도시한다: (6B) Lec2 세포주 (6C) HT-22 세포주, (6D) hCMEC/D3 세포주, 및 (6E) C2C12 세포주. GFP 전이유전자를 함유하는 AAV9 야생형 및 S454 삽입 귀소(homing) 펩타이드 캡시드를 사용하여 표기된 세포주를 형질도입시켰다. P1 벡터는 형질도입 효율이 극히 낮아 이미지에 포함되지 않았고, P8 벡터는 역가가 낮아 이미지에 포함되지 않았다. AAV9.S454.FLAG는 테스트된 모든 세포 유형에서 낮은 형질도입 수준을 보였다.
도 7은 이종 펩타이드에 대한 삽입 부위가 VP2의 개시 코돈 이후, 그리고 가변 영역 1(VR-I), 가변 영역 4(VR-IV) 및 가변 영역 8(VR-VIII) 내부 또는 부근에 있고 모두 회색으로 강조 표시된, AAV 1-9e, 3B, rh10, rh20, rh39, rh73, rh74 버전 1 및 버전 2, hu12, hu21, hu26, hu37, hu51 및 hu53 캡시드 서열의 정렬을 도시하며; 각 캡시드 단백질의 가변 영역 8(VR-VIII) 내의 특정한 삽입 부위는 기호 "#"로 표시되어 있다(AAV9의 아미노산 넘버링에 따른 아미노산 잔기 588 다음).
도 8은 AAV 벡터: AAV9; 본 명세서에서 AAV9e로도 지칭되는 AAV.PHP.eB(위치 588과 589 사이에 삽입된 펩타이드 TLAVPFK(서열번호 20) 및 변형 A587D/A588G를 갖는 AAV9); AAV.hDyn(588과 589 사이에 TLAAPFK(서열번호 1)를 갖는 AAV9); AAV.PHP.S(위치 588과 589 사이에 삽입된 펩타이드 QAVRTSL(서열번호 16)을 갖는 AAV9); 및 AAV.PHP.SH(위치 588과 589 사이에 삽입된 펩타이드 QAVRTSH(서열번호 17)를 갖는 AAV9)의 투여 후 마우스 뇌 세포 중 GFP(녹색 형광 단백질) 전이유전자의 카피를 도시한 것이다.
도 9A 내지 도 9C는 Q588과 A589 사이(도 9A), VR-III의 S268과 S269 사이(도 9B) 및 VR-IV의 S454와 G455 사이(도 9C)에 TLAAPFK(서열번호 1)의 펩타이드 삽입을 포함하는 재조합 AAV9 벡터에 대한 아미노산 서열을 도시한 것으로, 각각 TLAAPFK(서열번호 1) 삽입체는 볼드체로 표시되어 있다.
도 10A 내지 도 10B는 혈액 뇌 장벽(BBB) 세포층을 횡단하는 AAV 벡터에 대한 시험관내 트랜스웰 검정을 도시하고(도 10A), AAV.hDyn(역삼각형으로 표시됨)이 AAV9(사각형)보다 빠르고, 뿐만 아니라 AAV2(원)보다 더 빠르고 더 큰 정도로 검정의 BBB 세포층을 횡단한다는 것을 보여주는 결과를 도시한다(도 10B).
도 11은 조작된 캡시드 및 천연 캡시드의 풀(pool)이 정맥내로 투여된 마우스로부터의 뇌 gDNA의 차세대 시퀀싱(NGS) 분석 결과를 도시한 것으로, 풀 내의 상이한 캡시드의 마우스 조직내 상대적 풍부도를 드러낸다. 3개의 상이한 풀을 마우스에 주사했다. 점선은 함께 수집된 벡터를 나타낸다. 부모 AAV9는 대조군으로서 각 풀에 포함되었다(풀 1: BC01, 풀 2: BC31, 풀 3: BC01). 풀의 각 캡시드에 대한 바코드는 표 6a 내지 표 6c에 나열된다.
도 12A 내지 도 12H는 미경험 마우스, 또는 뇌(도 12A), 간(도 12B), 심장(도 12C), 폐(도 12D), 신장(도 12E), 골격근(도 12F), 좌골 신경(도 12G) 및 난소(도 12H)에서의 AAV9 또는 AAV.hDyn 주사된 마우스의 카피수/gDNA 마이크로그램을 보여주는, 암컷 C57Bl/6 마우스 중 AAV.hDyn의 생체내 형질도입 프로필을 도시한 것이며, 여기서 AAV.hDyn은 AAV9에 비해 증가된 뇌 생체분포를 나타낸다.
도 13A 내지 도 13C는 뇌 전반에 걸친 AAV.hDyn으로부터의 GFP 분포를 도시한 것으로, 여기서 선조체(도 13A), 해마(도 13B) 및 피질(도 13C)로부터의 뇌 단면의 면역조직화학적 염색의 이미지는 변형된 벡터에 의한 뇌의 포괄적인 형질도입을 드러냈다.
도 14는 아미노산 454 바로 뒤에 귀소 펩타이드의 삽입을 함유하는 유전자 조작된 AAV9 벡터의 생체내 신장 대 간 형질도입 효율의 비율을 도시한 것이다. 이 연구에서 사용된 펩타이드에 대한 세부사항은 표 6에 개략되어 있다.
도 15는 사이노몰구스 원숭이 모델의 전두엽 피질에 있는 바이러스 게놈의 상대적 풍부도(RA)(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 16 및 도 17은 각각 사이노몰구스 원숭이 모델의 해마 및 소뇌에 있는 바이러스 게놈의 상대적 풍부도(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다. AAV.rh34의 RA는 그래프 왼쪽에 음영 칼럼으로 표시되고 AAV9 기준물의 RA는 그래프 중간에 음영 칼럼으로 표시된다. 도 16 및 도 17은 AAV.rh34가 정맥내 투여 풀에서 최고 성능의 캡시드임을 보여준다.
도 18은 FC에서 상위 45개 수행자(AAV9에 대한 최고 RA), 및 경추, 흉부 및 요추 DRG에서 하위 45개 수행자(AAV9에 대한 최저 RA)의 벤다이어그램을 도시한 것이고, AAVrh34 캡시드는 캡시드 풀 중에서 45개의 각 그룹에 존재하는 유일한 캡시드로서 표시된다.
도 19는 사이노몰구스 원숭이 모델의 전두엽 피질에서 바이러스 게놈의 RA(투입량 및 AAV9 대조군에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 20은 사이노몰구스 원숭이 모델의 해마에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 21은 사이노몰구스 원숭이 모델의 중뇌에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 22는 사이노몰구스 원숭이 모델의 소뇌에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 23은 사이노몰구스 원숭이 모델의 경부 DRG에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 24는 사이노몰구스 원숭이 모델의 요추 DRG에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 25는 ICV 투여 후 전두엽 피질, 해마, 중뇌 및 소뇌를 형질도입시키는 최고 성능의 15개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이, AAV6, AAV8.BBB, AAV.rh.46 및 AAV1은 각각의 최고 성능 그룹에 표시된 유일한 AAV였다.
도 26은 해마-표적화 DRG 친화적 캡시드를 식별하기 위한, 해마를 형질도입시키는 최고 성능의 45개 캡시드 및 DRG에 대한 최저 형질도입 값을 갖는 45개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이 AAV.hu.60, AAV.rh.21, AAV.PHP.hB, AAV.rh.15, AAV.rh.24, AAV9.W503R, hu.5, AAV9.Q474A 및 AAV.hu.10은 각 그룹에서 표시되는 유일한 AAV였다.
도 27은 간에 대한 표적화가 감소된 근육-표적화 캡시드를 식별하기 위한, 심장, 이두근 및 비복근을 형질도입하는 최고 성능의 40개 캡시드 및 간에 대해 가장 낮은 형질도입 값을 갖는 40개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이, AAV.PHPeB.VP2Herp는 각 그룹에 표시된 유일한 AAV였다.
도 28은 심장, 이두근 및 비복근 근육을 형질도입하는 최고 성능의 15개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다.
도 29A 및 도 29B는 각각 사이노몰구스 원숭이 모델의 비복근 및 간에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 30A 및 도 30B는 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP의 간에서 검출된 바와 같은 선택된 "간-탈표적화"(LD) 벡터의 DNA(A) 또는 RNA(B)의 게놈 카피 수를 도시한 것이다.
도 31은 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP에서 다양한 조직 중 선택된 "간-탈표적화"(LD) 벡터의 생체분포를 그들의 부모 AAV9 캡시드와 비교하여 도시한 것이다.
도 32는 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP에서 다양한 조직 중 선택된 LD 벡터의 생체분포를 그들의 부모 AAV8 캡시드와 비교하여 도시한 것이다.
도 33A 및 도 33B. 도 33A는 AAV9와 비교하여 AAV9 형질도입(또는 간 형질도입)에 영향을 미치는 점 돌연변이에 대한 상대적 풍부도의 변화를 도시한 것이다. 이 연구에서 도시된 4개의 돌연변이체는 야생형 AAV9와 비교하여 혈액 내 체류를 입증한다. 도 33B는 부모 캡시드(각각 AAV8 또는 AAV9)와 비교하여 수송 모티프 BBB와 NNN/AAA 돌연변이를 조합한 AAV8 및 AAV9 돌연변이체(AAV8 중 A269S; AAV9 중 S263G/S269T/A273T)의 상대적 풍부도의 변화를 보여준다.
도 34A 및 도 34B. 도 34A는 AAV9에 비해 3 내지 24시간 혈액 체류의 증가를 보여준다. 도 34B는 부모 AAV에 비해 3 내지 24시간 혈액 체류의 증가를 보여준다.
도 35는 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 야생형 B6 마우스에서 대뇌, 간 및 췌장뿐만 아니라 심장 근육을 포함하는 근육 조직에서 선택된 AAV 벡터의 생체분포를 도시한 것이다.
도 36A 내지 도 36H는 mdx 마우스 조직과 비교하여 야생형 B6 마우스 중 다양한 캡시드의 생체분포를 도시한 것이다.
도 2는 캡시드 가변 영역 VR-IV, VR-V 및 VR-VIII을 보여주는 AAV 캡시드 구조의 단백질 모델을 도시한다. 박스는 모델에서 나타나는 바와 같이 표면-노출된 아미노산을 제공하는 VR-IV의 루프 영역을 강조한 것이다.
도 3은 야생형 AAV9 및 여덟(8)개의 후보 변형된 rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097)의 mL당 게놈 카피(GC/mL)에 의거한 높은 패키징 효율(역가)을 도시한 것이고, 여기서 후보 벡터는 각각 잔기 I451에서부터 Q458까지, AAV9 VR-IV 내의 상이한 부위 바로 뒤에 FLAG 삽입체를 각각 함유한다. 모든 벡터는 10mL 배양액에서 루시퍼라제 전이유전자와 함께 패키징되었다; 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 4는 항-FLAG 수지에 결합하여 패키징된 벡터의 면역침전에 의해 확인된, 여덟(8)개의 후보 변형된 rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097) 각각에서 1 VR-IV 루프 FLAG 삽입체의 표면 노출을 입증한다.
도 5A 내지 도 5B는 야생형 AAV9(9-luc) 또는 여덟(8)개의 후보 변형된(FLAG 펩타이드 삽입됨) rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097)에 패키징된, 루시퍼라제 유전자(전이유전자로서)를 운반하는 캡시드 벡터에 의해 형질도입된 Lec2 세포의 형질도입 효율을 도시한다; 형질도입 활성은 9-luc의 활성을 100%로 간주하여 루시퍼라제 활성 퍼센트(도 5A) 또는 단백질 마이크로그램당 상대적 광 단위(RLU)(도 5B)로서 표현된다.
도 6A 내지 도 6E. 도 6A는 다양한 펩타이드 길이 및 조성에 의한 AAV9의 S454 직후의 삽입은 패키징 세포에서 AAV 입자의 생산 효율에 영향을 미칠 수 있음을 예시하는 막대 그래프를 도시한다. 다양한 조성과 길이의 10개 펩타이드는 AAV9 VR-IV 내에서 S454 다음에 삽입되었다. 형질감염 5일 후 형질감염된 현탁액 HEK293 세포의 수확된 상청액에 대해 qPCR을 수행했다. 막대 그래프에 도시된 결과는 삽입의 본질이 HEK293 세포에 의해 생성 및 분비되는 AAV 입자의 능력에 영향을 미친다는 것을 입증하며, 총 수율(역가)로 나타냈다(오차 막대는 Y축에 괄호 안에 표기되어 있는 펩타이드의 평균 길이의 표준 오차를 나타냄). 도 6B 내지 도 6E는 다음 세포주의 형질도입된 세포 배양물의 형광 이미지를 도시한다: (6B) Lec2 세포주 (6C) HT-22 세포주, (6D) hCMEC/D3 세포주, 및 (6E) C2C12 세포주. GFP 전이유전자를 함유하는 AAV9 야생형 및 S454 삽입 귀소(homing) 펩타이드 캡시드를 사용하여 표기된 세포주를 형질도입시켰다. P1 벡터는 형질도입 효율이 극히 낮아 이미지에 포함되지 않았고, P8 벡터는 역가가 낮아 이미지에 포함되지 않았다. AAV9.S454.FLAG는 테스트된 모든 세포 유형에서 낮은 형질도입 수준을 보였다.
도 7은 이종 펩타이드에 대한 삽입 부위가 VP2의 개시 코돈 이후, 그리고 가변 영역 1(VR-I), 가변 영역 4(VR-IV) 및 가변 영역 8(VR-VIII) 내부 또는 부근에 있고 모두 회색으로 강조 표시된, AAV 1-9e, 3B, rh10, rh20, rh39, rh73, rh74 버전 1 및 버전 2, hu12, hu21, hu26, hu37, hu51 및 hu53 캡시드 서열의 정렬을 도시하며; 각 캡시드 단백질의 가변 영역 8(VR-VIII) 내의 특정한 삽입 부위는 기호 "#"로 표시되어 있다(AAV9의 아미노산 넘버링에 따른 아미노산 잔기 588 다음).
도 8은 AAV 벡터: AAV9; 본 명세서에서 AAV9e로도 지칭되는 AAV.PHP.eB(위치 588과 589 사이에 삽입된 펩타이드 TLAVPFK(서열번호 20) 및 변형 A587D/A588G를 갖는 AAV9); AAV.hDyn(588과 589 사이에 TLAAPFK(서열번호 1)를 갖는 AAV9); AAV.PHP.S(위치 588과 589 사이에 삽입된 펩타이드 QAVRTSL(서열번호 16)을 갖는 AAV9); 및 AAV.PHP.SH(위치 588과 589 사이에 삽입된 펩타이드 QAVRTSH(서열번호 17)를 갖는 AAV9)의 투여 후 마우스 뇌 세포 중 GFP(녹색 형광 단백질) 전이유전자의 카피를 도시한 것이다.
도 9A 내지 도 9C는 Q588과 A589 사이(도 9A), VR-III의 S268과 S269 사이(도 9B) 및 VR-IV의 S454와 G455 사이(도 9C)에 TLAAPFK(서열번호 1)의 펩타이드 삽입을 포함하는 재조합 AAV9 벡터에 대한 아미노산 서열을 도시한 것으로, 각각 TLAAPFK(서열번호 1) 삽입체는 볼드체로 표시되어 있다.
도 10A 내지 도 10B는 혈액 뇌 장벽(BBB) 세포층을 횡단하는 AAV 벡터에 대한 시험관내 트랜스웰 검정을 도시하고(도 10A), AAV.hDyn(역삼각형으로 표시됨)이 AAV9(사각형)보다 빠르고, 뿐만 아니라 AAV2(원)보다 더 빠르고 더 큰 정도로 검정의 BBB 세포층을 횡단한다는 것을 보여주는 결과를 도시한다(도 10B).
도 11은 조작된 캡시드 및 천연 캡시드의 풀(pool)이 정맥내로 투여된 마우스로부터의 뇌 gDNA의 차세대 시퀀싱(NGS) 분석 결과를 도시한 것으로, 풀 내의 상이한 캡시드의 마우스 조직내 상대적 풍부도를 드러낸다. 3개의 상이한 풀을 마우스에 주사했다. 점선은 함께 수집된 벡터를 나타낸다. 부모 AAV9는 대조군으로서 각 풀에 포함되었다(풀 1: BC01, 풀 2: BC31, 풀 3: BC01). 풀의 각 캡시드에 대한 바코드는 표 6a 내지 표 6c에 나열된다.
도 12A 내지 도 12H는 미경험 마우스, 또는 뇌(도 12A), 간(도 12B), 심장(도 12C), 폐(도 12D), 신장(도 12E), 골격근(도 12F), 좌골 신경(도 12G) 및 난소(도 12H)에서의 AAV9 또는 AAV.hDyn 주사된 마우스의 카피수/gDNA 마이크로그램을 보여주는, 암컷 C57Bl/6 마우스 중 AAV.hDyn의 생체내 형질도입 프로필을 도시한 것이며, 여기서 AAV.hDyn은 AAV9에 비해 증가된 뇌 생체분포를 나타낸다.
도 13A 내지 도 13C는 뇌 전반에 걸친 AAV.hDyn으로부터의 GFP 분포를 도시한 것으로, 여기서 선조체(도 13A), 해마(도 13B) 및 피질(도 13C)로부터의 뇌 단면의 면역조직화학적 염색의 이미지는 변형된 벡터에 의한 뇌의 포괄적인 형질도입을 드러냈다.
도 14는 아미노산 454 바로 뒤에 귀소 펩타이드의 삽입을 함유하는 유전자 조작된 AAV9 벡터의 생체내 신장 대 간 형질도입 효율의 비율을 도시한 것이다. 이 연구에서 사용된 펩타이드에 대한 세부사항은 표 6에 개략되어 있다.
도 15는 사이노몰구스 원숭이 모델의 전두엽 피질에 있는 바이러스 게놈의 상대적 풍부도(RA)(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 16 및 도 17은 각각 사이노몰구스 원숭이 모델의 해마 및 소뇌에 있는 바이러스 게놈의 상대적 풍부도(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다. AAV.rh34의 RA는 그래프 왼쪽에 음영 칼럼으로 표시되고 AAV9 기준물의 RA는 그래프 중간에 음영 칼럼으로 표시된다. 도 16 및 도 17은 AAV.rh34가 정맥내 투여 풀에서 최고 성능의 캡시드임을 보여준다.
도 18은 FC에서 상위 45개 수행자(AAV9에 대한 최고 RA), 및 경추, 흉부 및 요추 DRG에서 하위 45개 수행자(AAV9에 대한 최저 RA)의 벤다이어그램을 도시한 것이고, AAVrh34 캡시드는 캡시드 풀 중에서 45개의 각 그룹에 존재하는 유일한 캡시드로서 표시된다.
도 19는 사이노몰구스 원숭이 모델의 전두엽 피질에서 바이러스 게놈의 RA(투입량 및 AAV9 대조군에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 20은 사이노몰구스 원숭이 모델의 해마에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 21은 사이노몰구스 원숭이 모델의 중뇌에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 22는 사이노몰구스 원숭이 모델의 소뇌에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 23은 사이노몰구스 원숭이 모델의 경부 DRG에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 24는 사이노몰구스 원숭이 모델의 요추 DRG에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 25는 ICV 투여 후 전두엽 피질, 해마, 중뇌 및 소뇌를 형질도입시키는 최고 성능의 15개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이, AAV6, AAV8.BBB, AAV.rh.46 및 AAV1은 각각의 최고 성능 그룹에 표시된 유일한 AAV였다.
도 26은 해마-표적화 DRG 친화적 캡시드를 식별하기 위한, 해마를 형질도입시키는 최고 성능의 45개 캡시드 및 DRG에 대한 최저 형질도입 값을 갖는 45개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이 AAV.hu.60, AAV.rh.21, AAV.PHP.hB, AAV.rh.15, AAV.rh.24, AAV9.W503R, hu.5, AAV9.Q474A 및 AAV.hu.10은 각 그룹에서 표시되는 유일한 AAV였다.
도 27은 간에 대한 표적화가 감소된 근육-표적화 캡시드를 식별하기 위한, 심장, 이두근 및 비복근을 형질도입하는 최고 성능의 40개 캡시드 및 간에 대해 가장 낮은 형질도입 값을 갖는 40개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이, AAV.PHPeB.VP2Herp는 각 그룹에 표시된 유일한 AAV였다.
도 28은 심장, 이두근 및 비복근 근육을 형질도입하는 최고 성능의 15개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다.
도 29A 및 도 29B는 각각 사이노몰구스 원숭이 모델의 비복근 및 간에 있는 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
도 30A 및 도 30B는 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP의 간에서 검출된 바와 같은 선택된 "간-탈표적화"(LD) 벡터의 DNA(A) 또는 RNA(B)의 게놈 카피 수를 도시한 것이다.
도 31은 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP에서 다양한 조직 중 선택된 "간-탈표적화"(LD) 벡터의 생체분포를 그들의 부모 AAV9 캡시드와 비교하여 도시한 것이다.
도 32는 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP에서 다양한 조직 중 선택된 LD 벡터의 생체분포를 그들의 부모 AAV8 캡시드와 비교하여 도시한 것이다.
도 33A 및 도 33B. 도 33A는 AAV9와 비교하여 AAV9 형질도입(또는 간 형질도입)에 영향을 미치는 점 돌연변이에 대한 상대적 풍부도의 변화를 도시한 것이다. 이 연구에서 도시된 4개의 돌연변이체는 야생형 AAV9와 비교하여 혈액 내 체류를 입증한다. 도 33B는 부모 캡시드(각각 AAV8 또는 AAV9)와 비교하여 수송 모티프 BBB와 NNN/AAA 돌연변이를 조합한 AAV8 및 AAV9 돌연변이체(AAV8 중 A269S; AAV9 중 S263G/S269T/A273T)의 상대적 풍부도의 변화를 보여준다.
도 34A 및 도 34B. 도 34A는 AAV9에 비해 3 내지 24시간 혈액 체류의 증가를 보여준다. 도 34B는 부모 AAV에 비해 3 내지 24시간 혈액 체류의 증가를 보여준다.
도 35는 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 야생형 B6 마우스에서 대뇌, 간 및 췌장뿐만 아니라 심장 근육을 포함하는 근육 조직에서 선택된 AAV 벡터의 생체분포를 도시한 것이다.
도 36A 내지 도 36H는 mdx 마우스 조직과 비교하여 야생형 B6 마우스 중 다양한 캡시드의 생체분포를 도시한 것이다.
rAAV가, CNS로 또는 심장 및/또는 골격 근육 조직으로, 기준 캡시드 단백질(예를 들어, 미조작 또는 야생형 캡시드)에 비해, 특히, 우선적으로, 형질도입, 게놈 통합 및 전이유전자 발현을 포함하는, 증가된 조직 표적화와 같은 목적하는 특성을 향상시키도록, 기준 캡시드 단백질에 비해 조작된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)가 제공된다. 실시형태에서, 조작된 캡시드는 AAV 유전자 치료법의 독성을 저하시키기 위해 간, 후근 신경절 및/또는 말초 신경 조직에 대해 기준 캡시드에 비해 저하된 향성(즉, 조직 표적화, 형질도입 및 rAAV 게놈의 통합)을 갖는다. 변형은 본 명세서에 기술된 바와 같은 아미노산 치환(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환 포함) 및/또는 펩타이드 삽입(4개 내지 20개 또는 7개의 연속 아미노산, 및 실시형태에서는 이종 단백질 유래의 12개 이하의 인접 아미노산)을 포함한다. 조작되는 AAV 캡시드 단백질은 특정 실시형태에서 AAV9 캡시드 단백질 또는 AAV8 캡시드 단백질이다. 다른 실시형태에서, 조작되는 AAV 캡시드는 AAV rh.34, AAV4, AAV5, AAV hu.26, AAV rh.31, AAV hu.13, AAV hu.56, AAV hu.53, AAV7, AAV rh64R1, AAV rh46 또는 AAV rh73 캡시드 단백질이다. (서열에 대해서는 도 7 및 표 17 참조)
따라서, 형질도입 및/또는 조직 향성을 촉진하는, 특히 심장 및/또는 골격 근육에 대한 표적화가 미조작된 캡시드에 비해 향상되고, 실시양태에서 간, 후근 신경절, 및/또는 말초 신경 조직에 대한 표적화가 미조작된 캡시드에 비해 저하된, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 조작된 캡시드가 제공된다. 실시양태에서, 아미노산 치환은 AAV9의 S263F/S269T/A273T, 및 다른 AAV 유형 캡시드에서의 상응하는 치환(예를 들어, 도 7의 정렬에 따름), 또는 AAV9의 W530R, Q474A, N272A, 또는 G266A, 및 다른 AAV 유형 캡시드에서의 상응하는 치환 또는 AAV8의 A269S 및 다른 AAV 캡시드에서의 상응하는 치환(예를 들어, 도 7의 정렬에 따름)이다. 또한, 캡시드, 특히 펩타이드 TLAAPFK(서열번호 1)가 Q588과 A589 사이(여기서는 PHP.hDYN) 또는 대안적으로 S268과 S269 사이 또는 S454와 G455 사이에 삽입된 AAV9 캡시드, 또는 다른 AAV 캡시드의 상응하는 위치에 삽입된 것이 제공된다(예를 들어, 도 7 참조). 또는 대안적으로, 캡시드는 AAV9 PHP.eB 캡시드(변형 A587D 및 Q588G를 갖고, G588과 A589 사이에 펩타이드 TLAVPFK(서열번호 20)의 삽입 및 위치 138과 139 사이에 펩타이드 TILSRSTQTG(서열번호 15)의 삽입, 또는 상응하는 것을 가짐)이다. 추가적인 캡시드는 예를 들어 AAV9의 S454와 G455 사이, 또는 대안적으로 S268과 S269 사이 또는 Q588과 A589 사이, 또는 상이한 캡시드의 상응하는 위치에서 캡시드에 삽입된 신장1 펩타이드 LPVAS를 갖는다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 AAV rh64R1의 R697W 치환을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 치환 및 삽입을 갖는 캡시드는 AAV9 캡시드의 AAA(알라닌)에 의한 496 내지 498에 NNN(아스파라긴)의 치환, 또는 AAV8 캡시드의 위치 498 내지 500에서의 치환, 또는 다른 AAV 유형 캡시드에서 상응하는 치환을 추가로 가질 수 있다. 조작된 캡시드로는 AAV8.BB.LD(AAV8의 아미노산 서열에 A269S, 498-NNN/AAA-500 치환, 서열번호 66), AAV9.BB.LD(AAV9의 아미노산 서열에 S263G/S269T/A273T, 496-NNN/AAA-498 치환, 서열번호 67), AAV9.496-NNN/AAA-498(서열번호 31), AAV9.496-NNN/AAA-498.W503R(서열번호 32), AAV9.W503R(서열번호 33), 또는 AAV9.Q474A(서열번호 34)를 포함한다. 다른 예에서, 캡시드는 AAV9.N272A.496-NNN-498(서열번호 91) 또는 AAV9.G266A.496-NNN-498(서열번호 92)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 캡시드는 조작된 캡시드가 아니라, AAVrh.10 캡시드(서열번호 69), AAVrh.46 캡시드(서열번호 93), AAVrh.64.R1 캡시드(서열번호 90) 또는 AAVrh.73 캡시드(서열번호 88)이다. 특정 실시형태에서, 형질도입은 GFP 형광과 같은 전이유전자의 검출에 의해 측정된다. 이러한 아미노산 치환 및 삽입을 갖는 캡시드는 AAV9 캡시드의 AAA(알라닌)에 의한 496 내지 498의 NNN(아스파라긴)의 치환, 또는 다른 AAV 유형 캡시드에서 상응하는 치환을 가질 수 있다. 이러한 조작된 캡시드는 심장 및/또는 골격근에 대한 우선적인 표적화, 및 간 및/또는 후근 신경절 세포 및/또는 말초 신경계 조직에 대한 (미조작된 캡시드를 보유하는 AAV와 비교하여) 저하된 표적화를 나타낼 수 있고, 특히 근육 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자의 전달에 유용할 수 있다.
다른 실시형태에서, 조작된 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 캡시드 단백질, 및 펩타이드 TLAVPFK(서열번호 20)가 AAV9의 G588과 A589 사이에 삽입된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV가 제공되고, 특히 캡시드 단백질은 또한 아미노산 치환 A587D/Q588G(PHP.eB)도 가지며, 추가로 AAV9의 위치 138 다음에 삽입된 펩타이드 TILSRSTQTG(서열번호 15)를 갖거나(종합적으로, AAVPHPeB.VP2Herp; 표 17 참조), 또는 다른 AAV의 상응하는 위치에 갖는다. 추가적인 캡시드는 이 캡시드에 삽입된, 예를 들어, AAV9의 S454와 G455 사이(표 17 참조), 또는 대안적으로 S268과 S269 사이 또는 Q588과 A589 사이에 삽입되거나, 또는 다른 캡시드의 상응하는 위치에 삽입된 신장1 펩타이드 LPVAS(서열번호 6)(또는 대안적으로 CLPVASC(서열번호 5))를 갖는다. 이러한 조작된 캡시드는 심장 및 골격근에 대해 우선적인 표적화, 및 간 및/또는 후근 신경절 세포에 대해 (미조작된 캡시드를 갖는 AAV와 비교하여) 저하된 표적화를 나타낼 수 있고, 특히 근육 질환(예컨대, 비제한적으로 근이영양증)을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자의 전달에 유용할 수 있다.
실시양태에서, 조작된 rAAV는 AAV9 캡시드 또는 AAV8 캡시드, 또는 부모 캡시드를 비롯한 기준 AAV 캡시드와 비교하여, 심근 및/또는 골격근 세포에서 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 큰 형질도입을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 근육은 비복근, 이두근, 삼두근 및/또는 심근이다. 추가 실시형태에서, 조작된 rAAV는 AAV9 캡시드 또는 AAV8 캡시드, 또는 부모 캡시드를 포함하는 기준 AAV 캡시드와 비교하여, 기준 AAV 캡시드에 비해 간에서 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타낸다. 추가 실시형태에서, rAAV는 기준 AAV 캡시드와 비교하여, 후근 신경절 세포(경추, 흉부 또는 요추 DRG 세포 포함)에서 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타낸다. 향상된 및/또는 저하된 형질도입은 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 임의 유형의 전신 투여, 척수강내 투여 또는 ICV 투여에 의한 임의의 투여 방식으로 이루어질 수 있다.
또한, 특히 미조작된 캡시드에 비해 CNS에 대한 표적화가 향상되고, 실시양태에서, 미조작된 캡시드에 비해 간, 후근 신경절, 및/또는 말초 신경 조직에 대한 표적화가 저하된, 형질도입 및/또는 조직 향성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 조작된 캡시드가 제공된다. 실시형태에서, 아미노산 치환은 AAV8의 A269S(또는 상이한 AAV 혈청형 캡시드 내의 상응하는 위치), AAV9의 S263G/S269T/A273T(또는 상이한 AAV 혈청형 캡시드 내의 상응하는 위치), AAV9의 N272A 또는 N266A(또는 상이한 AAV 혈청형 캡시드 내의 상응하는 위치), AAV9의 Q474A(또는 상이한 AAV 혈청형 캡시드 내의 상응하는 위치), 또는 AAV9의 W503R(또는 상이한 AAV 혈청형 캡시드 내의 상응하는 위치), 또는 rh64R1의 R697W(또는 상이한 AAV 혈청형 캡시드 내의 상응하는 위치)이다. 이러한 아미노산 치환 및 삽입을 갖는 캡시드는 AAV9 캡시드(서열번호 67)의 AAA(알라닌)에 의한 496 내지 498의 NNN(아스파라긴)의 치환을 추가로 가질 수 있거나, 또는 대안적으로 갖고, 또는 AAV8 캡시드(서열번호 66)의 AAA(알라닌)에 의한 498 내지 4500의 NNN(아스파라긴)의 치환, 또는 다른 AAV 유형 캡시드에서의 상응하는 치환을 가질 수 있다. 이러한 조작된 캡시드는 CNS에 대한 우선적인 표적화, 및 간 및/또는 후근 신경절 세포 및/또는 말초 신경계 조직에 대한 (미조작된 캡시드를 보유하는 AAV와 비교하여) 저하된 표적화를 나타낼 수 있고, CNS 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자의 전달에 특히 유용할 수 있다.
또한, CNS 조직에서 rAAV 세포 흡수, 형질도입 및/또는 게놈 통합을 표적화 및/또는 촉진하고, 실시형태에서 미조작된 캡시드에 비해 간, 후근 신경절, 및/또는 말초 신경 조직에 대한 표적화를 저하시키는 삽입된 펩타이드, 예를 들어, 펩타이드 TILSRSTQTG(서열번호 15); TLAVPFK(서열번호 20); 또는 TLAAPFK(서열번호 1)를 갖는 재조합 캡시드 단백질, 및 이를 포함하는 rAAV가 제공된다. 특정 실시양태에서, 펩타이드 TLAAPFK(서열번호 1)는 AAV9의 Q588과 A589 사이에 삽입되고(AAV9.hDyn; 표 17 참조), 또는 다른 AAV의 상응하는 위치에 삽입된다(도 7 참조). 대안적으로, 캡시드는 rh.34, rh.10, rh.46, rh.73 또는 rh64.R1(서열에 대해서는 도 7 또는 표 17) 또는 rh.34, rh.10, rh.46, rh.73 또는 rh64.R1의 조작된 형태이다. 이러한 조작된 캡시드는 CNS에 대한 우선적인 표적화 및 간 및/또는 후근 신경절 세포 및/또는 말초 신경계 조직에 대해 (미조작된 캡시드를 보유하는 AAV와 비교하여) 저하된 표적화를 나타낼 수 있고, 특히 CNS 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자의 전달에 유용할 수 있다.
실시형태에서 조작된 rAAV는 CNS 조직에서 기준 AAV 캡시드, 예컨대, 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9와 비교하여 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 큰 형질도입을 나타낸다. CNS 조직은 전두엽 피질, 해마, 소뇌, 중뇌 및/또는 후뇌 중 하나 이상일 수 있다. 추가 실시형태에서, 조작된 rAAV는 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9와 같은 기준 AAV 캡시드와 비교하여 간에서 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타낸다. 추가 실시형태에서, rAAV는 부모 캡시드 또는 AAV8 또는 AAV9와 같은 기준 AAV 캡시드와 비교하여 후근 신경절 세포(경추, 흉부 또는 요추 DRG 세포 포함)에서 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타낸다. 향상된 및/또는 저하된 형질도입은 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 임의 유형의 전신 투여, 척수강내 투여 또는 ICV 투여에 의한 임의의 투여 방식으로 이루어질 수 있다.
캡시드 단백질을 포함하는 재조합 벡터는 또한 이의 약제학적 조성물, 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산, 및 표적 전달, 개선된 형질도입 및/또는 표적 조직과 연관된 장애의 치료를 위한 캡시드 단백질 및 조작된 캡시드를 갖는 rAAV 벡터를 제조 및 사용하는 방법과 함께 제공된다.
전체적으로 사용된 바와 같이, AAV "혈청형"은 면역학적으로 별개의 캡시드, 천연 발생의 캡시드 또는 조작된 캡시드를 갖는 AAV를 지칭한다.
5.1. 정의
용어 "AAV" 또는 "아데노-연관 바이러스"는 파르보비리대(Parvoviridae) 속 바이러스 내의 디펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus)를 지칭한다. AAV는 천연 발생의 "야생형" 바이러스로부터 유래된 AAV, 천연 발생의 cap 유전자에 의해 암호화된 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 내로 패키징된 rAAV 게놈 유래의 AAV 및/또는 비-천연 발생의 캡시드 cap 유전자에 의해 암호화된 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드 내로 패키징된 rAAV 게놈 유래의 AAV일 수 있다. 후자의 예는 천연 발생의 캡시드의 아미노산 서열 내로 펩타이드 삽입을 포함하는 캡시드 단백질을 갖는 rAAV를 포함한다.
용어 "rAAV"는 "재조합 AAV"를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 rep 및 cap 유전자의 일부 또는 전부가 이종 서열로 대체된 AAV 게놈을 갖는다.
용어 "rep-cap 헬퍼 플라스미드"는 바이러스 rep 및 cap 유전자 기능을 제공하고 기능성 rep 및/또는 cap 유전자 서열이 결여된 rAAV 게놈으로부터 AAV의 생성을 돕는 플라스미드를 지칭한다.
용어 "cap 유전자"는 바이러스의 캡시드 코트를 형성하거나 형성을 돕는 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. AAV의 경우 캡시드 단백질은 VP1, VP2 또는 VP3일 수 있다.
용어 "rep 유전자"는 바이러스의 복제 및 생성에 필요한 비-구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), DNA 및 RNA 분자의 조합 또는 혼성 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 이러한 유사체는, 예를 들어, 이노신 또는 트리틸화된 염기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 유사체는 또한 예를 들어, 뉴클레아제 내성 또는 세포막을 횡단하는 증가된 능력과 같은 유익한 속성을 분자에 부여하는 변형된 백본을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열은 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있고, 단일 가닥 및 이중 가닥 부분 둘 모두를 함유할 수 있고, 삼중 가닥 부분을 함유할 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체", "숙주" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 대상체는 포유동물, 예컨대, 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)이거나, 특정 실시형태에서, 인간이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 질환 또는 장애와 연관된 증상을 치료, 처치 또는 호전시키는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제(agent)를 지칭하며, 여기서 질환 또는 장애는 전이유전자에 의해 제공되는 기능과 연관이 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량"은 표적 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에게 투여될 때 표적 질환 또는 장애의 치료 또는 처치에 적어도 하나의 치료적 이점을 제공하는 작용제의 양(예를 들어, 전이유전자에 의해 발현되는 생성물의 양)을 지칭한다. 또한, 본 발명의 작용제에 대한 치료적 유효량은 작용제 단독으로 또는 다른 치료제와 조합일 때 질환 또는 장애의 치료 또는 처치에 적어도 하나의 치료적 이점을 제공하는 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "예방제"는 질환 또는 장애의 진행을 예방, 지연 또는 늦추는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 지칭하며, 여기서 질환 또는 장애는 전이유전자에 의해 제공되는 기능과 연관이 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "예방적 유효량"은 표적 질환 또는 장애에 대한 소인이 있는 대상체에게 투여된 경우, 표적 질환 또는 장애의 예방 또는 지연에 적어도 하나의 예방적 이점을 제공하는 예방제의 양(예를 들어, 전이유전자에 의해 발현되는 생성물의 양)을 지칭한다. 예방적 유효량은 또한 표적 질환 또는 장애의 발생을 예방하거나 지연시키거나; 또는 표적 질환 또는 장애의 진행을 늦추는데 충분한 작용제의 양; 또는 표적 질환 또는 장애의 개시를 지연시키거나 최소화하기에 충분한 양; 또는 이의 재발 또는 확산을 방지하거나 지연시키기에 충분한 양을 지칭할 수 있다. 예방적 유효량은 또한 표적 질환 또는 장애의 증상의 악화를 예방하거나 지연시키기에 충분한 작용제의 양을 지칭할 수 있다. 또한, 본 발명의 예방제에 대한 예방적 유효량은 질환 또는 장애의 예방 또는 지연에서 적어도 하나의 예방적 이점을 제공하는 예방제 단독의 양 또는 다른 작용제와 조합된 양을 의미한다.
본 발명의 예방제는 표적 질환 또는 장애에 "소인이 있는" 대상체에게 투여될 수 있다. 질환 또는 장애에 "소인이 있는" 대상체는 질환 또는 장애의 발달과 연관된 증상을 나타내거나, 또는 그러한 질환 또는 장애에 대한 유전자 구성, 환경 노출 또는 다른 위험 인자를 갖지만, 증상이 아직 질환 또는 장애로서 진단될 수준이 아닌 자이다. 예를 들어, 누락 유전자(전이유전자에 의해 제공되는 것)와 연관된 질환의 가족력이 있는 환자는 그에 대한 소인이 있는 자로서 자격이 있을 수 있다. 또한, 원발성 종양을 제거한 후에도 지속되는 휴면 종양을 가진 환자는 종양 재발의 소인이 있는 환자로서 자격이 있을 수 있다.
본 명세서에 사용된 "중추신경계"("CNS")는 혈액-뇌 장벽을 횡단한 후 순환 작용제에 의해 도달하는 신경 조직을 지칭하며, 예를 들어 뇌, 시신경, 뇌신경 및 척수를 포함한다. CNS는 또한 뇌의 심실뿐만 아니라 척수의 중심관을 채우는 뇌척수액을 포함한다.
5.2. 재조합 AAV 캡시드 및 벡터
rAAV가 특히, 우선적으로 기준 캡시드 단백질(예를 들어, 미조작된 또는 야생형 캡시드)에 비해 CNS 또는 심근 및/또는 골격근 조직에 대한 형질도입, 게놈 통합 및 전이유전자 발현을 포함하는 조직 표적화 증가와 같은 향상된 원하는 특성을 갖도록, 기준 캡시드 단백질에 비해 조작된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)가 제공된다. 실시형태에서, 조작된 캡시드는 AAV 유전자 치료법의 독성을 저하시키기 위해, 간, 후근 신경절 및/또는 말초 신경 조직에 대해 기준 캡시드에 비해 저하된 향성(즉, rAAV 게놈의 조직 표적화, 형질도입 및 통합)을 갖는다. 변형은 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 치환(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함함) 및/또는 펩타이드 삽입(4개 내지 20개 또는 7개 근접 아미노산, 실시형태에서 이종 단백질 유래의 12개 이하의 근접 아미노산)을 포함한다.
5.2.1 아미노산 치환을 갖는 조작된 캡시드
일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 CNS 또는 심근 또는 골격근으로의 효과적인 유전자 전달을 증가시키고, 독성을 저하시키기 위해 간 및/또는 후근 신경절을 탈표적화하고, 그리고/또는 중화 항체의 면역 반응을 저하시키는, 선택된 단일 내지 다수의 아미노산 치환을 도입시킴으로써 변형되었다.
특정 실시형태에서, 캡시드는 AAV9에 W503R 치환, Q474 치환, N272A 또는 N266A 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 다른 AAV 혈청형 중의 상응하는 치환, 또는 AAV8에 A269S 치환 또는 다른 AAV 혈청형 중의 상응하는 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. Q474A 치환이 있는 캡시드를 갖는 rAAV는 골격 및/또는 심장 근육 또는 CNS 조직으로의 전달에 특히 유용할 수 있고, W503R 치환이 있는 캡시드를 갖는 rAAV는 특히 기준 캡시드 함유 rAAV에 비해, 간 및/또는 DRG에 형질도입을 저하시키면서, CNS 조직으로의 전달에 특히 유용할 수 있다. 다른 치환으로는 AAV9에 S263G/S269R/A273T 치환 또는 AAV9에 A587D/Q588G 또는 다른 AAV 혈청형에 상응하는 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 캡시드는 R697W 치환을 가질 수 있다. 이들 아미노산 치환 및 삽입을 갖는 캡시드는 추가로 AAV9 캡시드의 AAA(알라닌)에 의한 496 내지 498의 NNN(아스파라긴)의 치환, 또는 AAV8 캡시드의 AAA(알라닌)에 의한 498 내지 500의 NNN(아스파라긴)의 치환, 또는 다른 AAV 유형 캡시드에 상응하는 치환을 가질 수 있다. 아미노산 치환에 사용될 수 있고 기준 캡시드일 수 있는 다른 AAV 혈청형으로는 AAV8, AAVrh.34, AAV4, AAV5, AAV hu.26, AAV rh.31, AAV hu.13, AAV hu.26, AAV hu.56, AAV hu.53, AAV7, rh64R1, rh46 또는 rh73을 포함한다. CNS 전달을 위한 특정 실시형태에서, 캡시드는 변형되지 않거나 본 명세서에 상세히 설명된 바와 같이 변형될 부모 캡시드로서 역할을 하는 rh34이다.
정맥내로 투여된 rAAV 벡터에 의한 CNS로의 효과적인 유전자 전달은 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 것을 필요로 한다. 최근 마우스에서 뇌 혈관구조에 걸친 수송 및 광범위한 신경원 형질도입을 가능하게 하는 AAVrh.10 캡시드 상의 핵심 잔기 클러스터가 보고되었다. 구체적으로, AAVrh.10-유래 아미노산 N262, G263, T264, S265, G267, S268, T269 및 T273은 BBB 횡단을 촉진하는 핵심 잔기로서 식별되었다(Albright et al, 2018, Mapping the Structural Determinants Required for AAVrh.10 Transport across the Blood-Brain Barrier). 혈액 뇌 장벽의 rAAV 횡단, 형질도입, 간의 탈표적화 및/또는 면역 반응의 저하를 촉진하는 AAV8 및 AAV9 캡시드와 같은 캡시드의 아미노산 치환이 식별되었다.
일부 실시형태에서, 변형된 캡시드를 갖는 rAAV의 형질도입 및/또는 조직 향성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 캡시드가 제공된다. 특정 실시형태에서, 알라닌을 세린(A269S)으로 대체하는 AAV8 캡시드의 아미노산 269에서의 단일 돌연변이(표 5a 내지 표 5c 참조, 본 명세서에서 AAV8.BBB로 지칭됨) 및 다른 AAV 유형에서 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 갖는 캡시드가 제공된다. 일부 실시형태에서, AAV9 캡시드의 아미노산 263, 269 및 273에서 다음 치환을 초래하는 다중 치환을 갖는 캡시드가 제공된다: S263G, S269T 및 A273T(본 명세서에서 AAV9.BBB로 지칭됨) 또는 다른 AAV 유형에서 이들 위치에 상응하는 치환.
AAV 캡시드에 대한 노출은 중화 항체의 면역 반응을 생성할 수 있다. 이 반응을 극복하기 위한 1가지 접근법은 AAV-특이적 중화 에피토프를 매핑하고 중화를 피할 수 있는 AAV 캡시드를 합리적으로 설계하는 것이다. 중화 역가가 높은 온전한 AAV9 캡시드에 특이적인 단클론 항체가 최근 기술되었다(Giles et al, 2018, Mapping an Adeno-associated Virus 9-Specific Neutralizing Epitope To Develop Next-Generation Gene Delivery Vectors). 에피토프는 캡시드 상의 삼중 대칭축, 구체적으로 AAV9(서열번호 8)의 잔기 496-NNN-498 및 588-QAQAQT-592에 매핑되었다. 캡시드 돌연변이유발은 이 에피토프 내의 단일 아미노산 치환이 결합 및 중화를 현저히 저하시킴을 입증했다. 또한, 생체내 연구는 에피토프의 돌연변이가 돌연변이 벡터에 "간-탈표적화" 표현형을 부여한다는 것을 보여주었고, 이는 동일한 잔기가 AAV9 향성에도 책임이 있음을 시사한다. 간 탈표적화는 또한 트립토판을 아르기닌으로 대체하는 아미노산 503의 치환과도 연관이 있다. AAV9 캡시드에 W503R 돌연변이의 존재는 낮은 글리칸 결합 결합력과 연관이 있었다(Shen et al, 2012, Glycan Binding Avidity Determines the Systemic Fate of Adeno-Associated Virus Type 9).
일부 실시형태에서, AAV8.BBB 및 AAV9.BBB 캡시드가 AAV8(본 명세서에서 AAV8.BBB.LD라고 지칭됨)의 아미노산 위치 498, 499 및 500, 또는 AAV9(본 명세서에서 AAV9.BBB.LD라고 지칭됨)의 496, 497 및 498에 있는 아스파라긴을 알라닌으로 치환함으로써 추가로 변형된 캡시드가 제공된다. 일부 실시형태에서, AAVrh10 캡시드는 아미노산 위치 498, 499 및 500에 있는 3개의 아스파라긴을 알라닌으로 치환하여 변형시켰다(AAVrh10.LD)(표 5a 내지 표 5c).
일부 실시형태에서, AAV9 캡시드의 아미노산 위치 496, 497 및 498에 있는 3개의 아스파라긴이 알라닌으로 대체되고, AAV9 캡시드의 아미노산 503에 있는 트립토판도 아르기닌으로 대체된 캡시드, 또는 다른 AAV 유형에서 이들 위치에 상응하는 치환을 갖는 캡시드가 제공된다. 일부 실시형태에서, AAV9 캡시드의 아미노산 위치 474에 있는 글루타민이 알라닌으로 치환된 캡시드 또는 다른 AAV 유형에서 이 위치에 상응하는 치환을 갖는 캡시드가 제공된다.
일부 실시형태에서, 캡시드는 AAV8.BB.LD 캡시드(AAV8의 아미노산 서열에서 A269S,498-NNN/AAA-500 치환, 서열번호 66), AAV9.BBB.LD 캡시드(AAV9의 아미노산 서열에서 S263G/S269T/A273T, 496-NNN/AAA-498 치환, 서열번호 67), AAV9.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 31), AAV9.496-NNN/AAA-498.W503R 캡시드(서열번호 32), AAV9.W503R 캡시드(서열번호 33) 또는 AAV9.Q474A 캡시드(서열번호 34)이다. 다른 예에서, 캡시드는 AAV9.N272A.496-NNN-498 캡시드(서열번호 91) 또는 AAV9.G266A.496-NNN-498 캡시드(서열번호 92)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 rAAV는 아미노산 치환을 포함하지 않는 rAAV와 비교하여, 대상체(인간, 비인간 영장류, 또는 마우스 대상체) 또는 세포 배양물에서, 조직 특이적(예컨대, 비제한적으로, CNS 또는 골격 및/또는 심장 근육) 세포 형질도입을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 조직 특이적 세포 형질도입의 증가는 변형이 없는 것보다 적어도 2, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100배 더 많다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형 없이 동일 AAV 유형에 의한 형질도입과 비교하여 조직 특이적 세포 형질도입의 50 내지 80배 증가가 있다. 형질도입의 증가는 본 명세서의 실시예에 기술되고 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 rAAV는 펩타이드 삽입을 포함하지 않는 rAAV에 비해 대상체(인간, 비-인간 영장류 또는 마우스 대상체) 또는 세포 배양물에서 세포 또는 조직 유형으로 rAAV 게놈의 혼입을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 통합의 증가는 변형 없는 캡시드(즉, 부모 캡시드)를 갖는 AAV보다 적어도 2, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100배 더 크다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형 없는 동일 AAV 유형에 의한 게놈 통합에 비해 게놈 통합의 50 내지 80배 증가가 있다.
5.2.2 펩타이드 삽입을 갖는 rAAV 벡터
펩타이드 삽입이 CNS 또는 심장 또는 골격 근육에 대한 효과적인 유전자 전달을 증가시키고, 부모 캡시드 단백질에 비해 독성을 저하시키기 위해 간 및/또는 후근 신경절을 탈표적화하는 하나 이상(일반적으로 1개 또는 2개)의 펩타이드 삽입이 있는 캡시드 단백질을 갖는 rAAV가 제공된다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 TLAVPFK, TLAAPFK 또는 TILSRSTQTG(또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7개 아미노산 부분)를 포함한다. 펩타이드는 AAV9 캡시드에, 예를 들어, AAV9 cap의 위치 138; 262 내지 273; 452 내지 461; 585 내지 593 다음에, 특히 AAV9의 위치 138, 454 또는 588 다음에, 또는 본 명세서에 상세히 설명된 바와 같이 다른 AAV의 상응하는 위치에 삽입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 캡시드는 AAV9의 G588과 A589 사이에 삽입된 펩타이드 TLAVPFK(서열번호 20)를 갖고, 특히 캡시드 단백질은 또한 아미노산 치환 A587D/Q588G(PHP.eB)를 가지며, AAV9의 위치 138 다음에 삽입된 펩타이드 TILSRSTQTG(서열번호 15)(종합적으로, AAVPHPeB.VP2Herp; 표 17 참조)를 추가로 가지며, 또는 다른 AAV의 상응하는 위치에 가질 수도 있다. 추가적인 캡시드는, 예를 들어, AAV9의 454와 455 사이(표 17 참조), 또는 대안적으로 또는 대안적으로 AAV9의 S268과 S269 사이 또는 Q588과 A589 사이, 또는 다른 AAV 혈청형의 상응하는 위치에서 캡시드에 삽입된 신장1 펩타이드 LPVAS를 갖는다. 이러한 조작된 캡시드는 심장 및 골격근에 대한 우선적인 표적화 및 간 및/또는 후근 신경절 세포에 대한 (미조작된 캡시드를 갖는 AAV와 비교하여) 저하된 표적화를 나타낼 수 있고, 근육 질환(예컨대, 비제한적으로, 근이영양증)을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자의 전달에 특히 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 서열 TILSRSTQTG(서열번호 15)의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 10개 전부의 연속 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 TQT 또는 STQT(서열번호 9) 모티프를 함유한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 서열 TILSRSTQTG(서열번호 15)의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 10개 전부의 연속 아미노산으로 이루어지고, 바람직하게는 TQT 또는 STQT(서열번호 9) 모티프를 함유한다.
특정 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 신장 조직을 표적으로 하는 도메인으로부터의 연속 아미노산의 서열, 또는 상기 도메인의 3차원 구조를 모방하도록 설계된 형태 유사체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 신장-귀소 도메인은 서열 CLPVASC(서열번호 5)를 포함한다(예를 들어, 미국 제5,622,699호 참조). 일부 실시형태에서, 상기 신장-귀소 도메인으로부터의 펩타이드 삽입은 서열 CLPVASC(서열번호 5)로부터의 적어도 4, 5, 6개 또는 7개 전부의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 서열 CLPVASC(서열번호 5)를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
특정 귀소 펩타이드의 시스테인 잔기 둘 모두는 펩타이드의 기관 귀소 활성에 유의미한 영향을 미침이 없이 결실될 수 있음이 발견되었다. 예를 들어, 서열 LPVAS(서열번호 6)를 갖는 펩타이드는 또한 신장 귀소(kidney-homing) 펩타이드일 수 있다. 펩타이드의 기관 귀소 활성을 위한 시스테인 잔기 또는 시스테인 잔기의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기의 필요성을 결정하는 방법은 일상적이며 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 서열 LPVAS(서열번호 6)로부터 적어도 4개 또는 5개 전부의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 서열 LPVAS(서열번호 6)를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 펩타이드 TLAAPFK(서열번호 1)가 AAV9의 Q588과 A589 사이(AAV9.hDyn; 표 17 참조), 또는 다른 AAV의 상응하는 위치(예를 들어, 도 7 참조)에 삽입된 캡시드를 갖는 rAAV가 제공된다. 이러한 조작된 캡시드는 CNS 조직에 대한 우선적인 표적화 및 간 및/또는 후근 신경절 세포에 대한 (미조작된 캡시드를 갖는 AAV와 비교하여) 저하된 표적화를 나타낼 수 있고, CNS 질환을 치료하기 위한 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자의 전달에 특히 유용할 수 있다.
AAV9 캡시드 VR-IV 루프(도 2 참조) 내 및 부근에서 펩타이드 삽입에 순응성인 위치 및 다른 AAV 유형의 VR-IV 루프 상의 상응하는 영역에 펩타이드 삽입을 갖는 캡시드가 제공된다. 이전 연구에서 다양한 AAV의 잠재적인 위치가 분석되었지만, 이 목적에 순응성인 것으로서 AAV9 VR-IV가 식별된 적은 없다(예를 들어, 문헌[Wu et al, 2000, "Mutational Analysis of the Adeno-Associated Virus Type 2 (AAV2) Capsid Gene and Construction of AAV2 Vectors with Altered Tropism," J of Virology 74(18):8635-8647; Lochrie et al, 2006, "Adeno-associated virus (AAV) capsid genes isolated from rat and mouse liver genomic DNA define two new AAV species distantly related to AAV-5," Virology 353:68-82; Shi and Bartlett, 2003, "RGD Inclusion in VP3 Provides Adeno-Associated Virus Type 2 (AAV2)-Based Vectors with a Heparan Sulfate-Independent Cell Entry Mechanism," Molecular Therapy 7(4):515525-; Nicklin et al., 2001, "Efficient and Selective AAV2-Mediated Gene Transfer Directed to Human Vascular Endothelial Cells" Molecular Therapy 4(2):174-181; Grifman et al., 2001, "Incorporation of Tumor-Targeting Peptides into Recombinant Adeno-associated Virus Capsids," Molecular Therapy 3(6):964-975; Girod et al. 1999, "Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2," Nature Medicine 3(9):1052-1056; Douar et al., 2003, "Deleterious effect of peptide insertions in a permissive site of the AAV2 capsid, "Virology 309:203-208; 및 Ponnazhagan, et al. 2001, J. of Virology 75(19):9493-9501] 참조).
따라서, 이들 지점에서, 특히 캡시트 코트 내의 표면-노출된 가변 영역 내에서, 특히 캡시드 단백질의 가변 영역 IV 내 또는 부근에서 펩타이드 삽입을 운반하는 rAAV 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, rAAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 451 내지 461 중 하나에 상응하는 아미노산 잔기 바로 다음(즉, 펩타이드 결합에 의해 C-말단에 연결됨)에 펩타이드 삽입을 포함하고(아미노산 서열 서열번호 67 및 AAV9 캡시드의 아미노산 서열과 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 아미노산 서열의 정렬에 대해서는 도 7 및 다른 캡시드 서열에 대해서는 표 17을 참조함), 여기서 상기 펩타이드 삽입은 캡시드 단백질이 AAV 입자로서 패키징될 때 표면 노출된다. 펩타이드 삽입은 AAV 캡시드 단백질의 임의의 잔기를 결실시키지 않아야 한다. 일반적으로, 펩타이드 삽입은 다른 혈청형과 비교하여 캡시드 단백질의 가변(보존성이 좋지 않은) 영역에서, 그리고 표면 노출된 루프에서 일어난다.
주어진 부위"에서" 삽입된 것으로서 기술된 펩타이드 삽입은 야생형 바이러스의 해당 부위에서 정상적으로 발견되는 잔기 바로 다음에서의 삽입, 즉, 잔기의 카복시 말단에 펩타이드 결합을 갖는 삽입을 지칭한다. 예를 들어, AAV9의 Q588에서의 삽입은 펩타이드 삽입이 AAV9 야생형 캡시드 단백질 서열(서열번호 67) 중 Q588과 연속 아미노산(A589) 사이에서 나타난다는 것을 의미한다. 실시형태에서, 삽입 지점에서 또는 그 부근(5개, 10개, 15개 잔기 내 또는 삽입 부위인 구조 루프 내)에서 아미노산 잔기의 결실은 없다.
특정 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이고 삽입은 아미노산 잔기 451 내지 461 중 적어도 하나 바로 다음에서 일어난다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 AAV9 캡시드(아미노산 서열 서열번호 67)의 아미노산 I451, N452, G453, S454, G455, Q456, N457, Q458, Q459, T460 또는 L461 직후에 일어난다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 AAV9 캡시드 단백질의 잔기 S454와 G455 사이 또는 AAV9 캡시드 단백질(아미노산 서열 서열번호 67) 이외의 다른 AAV 캡시드 단백질의 S454와 G455에 해당하는 잔기 사이에 삽입된다.
다른 실시형태에서, AAV 벡터에 혼입될 때 이종 펩타이드가 표면 노출되도록 AAV 캡시드 단백질에 삽입되는 캡시드 단백질에 이종성인 표적화 펩타이드를 포함하는 조작된 캡시드 단백질이 제공된다.
다른 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 3(AAV3), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh74(AAVrh74, 버전 1 및 2), 혈청형 rh34(AAVrh34), 혈청형 hu26(AAVhu26), 혈청형 rh31(AAVrh31), 혈청형 hu56(AAVhu56), 혈청형 hu53(AAVhu53), 혈청형 rh64R1(AAVrh64R1), 혈청형 rh46(AAVrh46) 및 혈청형 rh73(AAVrh73)으로부터 선택되는 적어도 하나의 AAV 유형에서 유래되고(도 7 또는 표 17 참조), 삽입은 아미노산 잔기 451 내지 461 중 적어도 하나에 상응하는 아미노산 잔기 직후에서 일어난다. 이들 상이한 AAV 혈청형의 정렬은 도 7에 도시된 바와 같이, 기준 서열의 잔기와 정렬 시 동일한 위치에서 "상응하는" 아미노산 잔기가 정렬되도록 하는 상이한 캡시드 아미노산 서열의 "상응하는" 아미노산 잔기를 나타낸다. 일부 특정 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 도 7에 도시된 서열에서, AAV1 캡시드(서열번호 59)의 450 내지 459; AAV2 캡시드(서열번호 60)의 449 내지 458; AAV3 캡시드(서열번호 61)의 449 내지 459; AAV4 캡시드(서열번호 62)의 443 내지 453; AAV5 캡시드(서열번호 63)의 442 내지 445; AAV6 캡시드(서열번호 64)의 450 내지 459; AAV7 캡시드(서열번호 65)의 451 내지 461; AAV8 캡시드(서열번호 66)의 451 내지 461; AAV9 캡시드(서열번호 67)의 451 내지 461; AAV9e 캡시드(서열번호 68)의 452 내지 461; AAVrh10 캡시드(서열번호 69)의 452 내지 461; AAVrh20 캡시드(서열번호 70)의 452 내지 461; AAVhu.37(서열번호 71)의 452 내지 461; AAVrh74(서열번호 72 또는 서열번호 80)의 452 내지 461; 또는 AAVrh39(서열번호 73)의 452 내지 461 내의 아미노산 잔기 중 하나의 잔기 직후에 일어난다. 특정 실시형태에서, rAAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질(서열번호 67의 아미노산 서열을 가짐, 도 7 참조)의 아미노산 588 바로 뒤에(즉, C-말단에) 펩타이드 삽입을 포함하고, 여기서 상기 펩타이드 삽입은 캡시드 단백질이 AAV 입자로서 패키징될 때 표면 노출된다. 다른 실시형태에서, rAAV 캡시드 단백질은 AAV9의 아미노산 588 바로 뒤가 아닌, 또는 AAV9의 아미노산 588에 상응하는 것 바로 뒤가 아닌 펩타이드 삽입을 갖는다.
특정 실시형태에서, 펩타이드는 AAV1 캡시드(서열번호 59)의 138; 262 내지 272; 450 내지 459; 또는 585 내지 593; AAV2 캡시드(서열번호 60)의 138; 262 내지 272; 449 내지 458; 또는 584 내지 592; AAV3 캡시드(서열번호 61)의 138; 262 내지 272; 449 내지 459; 또는 585 내지 593; AAV4 캡시드(서열번호 62)의 137; 256 내지 262; 443 내지 453; 또는 583 내지 591; AAV5 캡시드(서열번호 63)의 137; 252 내지 262; 442 내지 445; 또는 574 내지 582; AAV6 캡시드(서열번호 64)의 138; 262 내지 272; 450 내지 459; 585 내지 593; AAV7 캡시드(서열번호 65)의 138; 263 내지 273; 451 내지 461; 586 내지 594; AAV8 캡시드(서열번호 66)의 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; AAV9 캡시드(서열번호 67)의 138; 262 내지 273; 452 내지 461; 585 내지 593; AAV9e 캡시드(서열번호 68)의 138; 262 내지 273; 452 내지 461; 585 내지 593; AAVrh10 캡시드(서열번호 69)의 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; AAVrh20 캡시드(서열번호 70)의 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; AAVrh74 캡시드(서열번호 72 또는 서열번호 80)의 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; AAVhu37 캡시드(서열번호 71)의 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; 또는 AAVrh39 캡시드(서열번호 73)의 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595 뒤에 삽입된다(도 7에 넘버링됨).
일반적으로, 펩타이드 삽입은 이종 단백질 또는 이의 도메인으로부터의 근접 아미노산의 서열이다. 삽입되는 펩타이드는 전형적으로 이것이 유래되는 단백질 또는 도메인의 특정 생물학적 기능, 특성, 또는 특징을 유지하기에 충분히 길다. 삽입되는 펩타이드는 전형적으로 삽입이 없는 천연 캡시드 단백질과 유사하거나 실질적으로 유사하게 캡시드 단백질이 코트를 형성할 수 있을 정도로 충분히 짧다. 바람직한 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 약 4 내지 약 30개 아미노산 잔기, 약 4개 내지 약 20개, 약 4개 내지 약 15개, 약 5개 내지 약 10개, 또는 약 7개 아미노산 길이이다. 삽입을 위한 펩타이드 서열은 적어도 4개 아미노산 길이이고, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 서열은 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산 길이이다. 실시형태에서, 펩타이드의 길이는 7개 아미노산, 10개 아미노산 또는 12개 아미노산 이하이다.
AAV 캡시드 단백질에서 "이종 단백질로부터의 펩타이드 삽입"은 캡시드 단백질에 도입되었고 임의의 AAV 혈청형 캡시드에 천연적이지 않은 아미노산 서열을 지칭한다. 비제한적인 예는 AAV 캡시드 단백질 중 인간 단백질의 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 rAAV는 아미노산 치환을 포함하지 않는 rAAV와 비교하여, 대상체(인간, 비인간 영장류, 또는 마우스 대상체) 또는 세포 배양물에서, 조직 특이적(예컨대, 비제한적으로, CNS 또는 골격 및/또는 심장 근육) 세포 형질도입을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 조직 특이적 세포 형질도입의 증가는 펩타이드 삽입이 없는 것보다 적어도 2배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 더 크다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형 없이 동일 AAV 유형을 사용한 형질도입에 비해 조직 특이적 세포 형질도입이 50-80배 증가한다. 형질도입의 증가는 본 명세서의 실시예에 기술되고 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 rAAV는 펩타이드 삽입을 포함하지 않는 rAAV에 비해, 대상체(인간, 비인간 영장류 또는 마우스 대상체) 또는 세포 배양물에서 세포 또는 조직 유형, 특히 CNS 또는 심장 및/또는 골격 근육 내로 rAAV 게놈의 혼입을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 게놈 통합의 증가는 펩타이드 삽입이 없는 캡시드를 갖는 AAV보다 적어도 2배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배 더 크다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 펩타이드 삽입체가 없는 동일 AAV 유형에 의한 게놈 통합과 비교하여 게놈 통합이 50-80배 증가한다.
또 다른 양상에서, 이종 펩타이드 삽입 라이브러리를 포함하는 캡시드의 라이브러리 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 캡시드의 라이브러리가 제공된다. 이종 펩타이드 삽입 라이브러리는 바이러스 캡시드의 다른 삽입 부위, 예를 들어 캡시드의 주어진 가변 영역 내의 다른 위치에 동일한 펩타이드 삽입을 운반하거나 또는 상이한 변이체 펩타이드 또는 심지어 하나 이상의 아미노산 치환을 운반하는 rAAV 벡터의 집합을 지칭한다. CNS 또는 심장 및/또는 골격 근육 조직에서의 향상된 형질도입 및 간 및/또는 DRG 세포에서의 저하된 형질도입을 포함하는 조직 향성과 같은 개선된 특성을 향상시키기 위해 라이브러리로부터의 캡시드를 갖는 rAAV를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 사용된 캡시드 단백질은 정상적으로 복제할 수 있는 조건(아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스와 함께 포유동물 세포의 동시감염)에서 바이러스의 복제를 방지하기 위해 변형된 rep 및 cap 서열을 함유하는 AAV 게놈을 포함한다. 그 다음, 펩타이드 삽입 라이브러리의 구성원은 rAAV 표면에서 펩타이드의 기능적 표시, 조직 표적화 및/또는 유전자 형질도입에 대해 검정될 수 있다.
5.2.3 추가 AAV 캡시드 삽입 부위
다음은 하기 제시된 바와 같은 AAV 캡시드의 아미노산 잔기 바로 뒤에 본 명세서에 기술된 펩타이드에 대한 삽입 부위를 요약한 것이다(또한, 도 7 참조):
AAV1: 138; 262 내지 272; 450 내지 459; 595 내지 593; 및 특정 실시형태에서, 453 내지 454 사이(서열번호 59).
AAV2: 138; 262 내지 272; 449 내지 458; 584 내지 592; 및 특정 실시형태에서, 452 내지 453 사이(서열번호 60).
AAV3: 138; 262 내지 272; 449 내지 459; 585 내지 593; 및 특정 실시형태에서, 452 내지 453 사이(서열번호 61).
AAV4: 137; 256 내지 262; 443 내지 453; 583 내지 591; 및 특정 실시형태에서, 446-447 사이(서열번호 62).
AAV5: 137; 252 내지 262; 442 내지 445; 574 내지 582; 및 특정 실시형태에서, 445 내지 446 사이(서열번호 63).
AAV6: 138; 262 내지 272; 450 내지 459; 585 내지 593; 및 특정 실시형태에서, 452 내지 453 사이(서열번호 64).
AAV7: 138; 263 내지 273; 451 내지 461; 586 내지 594; 및 특정 실시형태에서, 453 내지 454 사이(서열번호 65).
AAV8: 138; 263 내지 274; 451 내지 461; 587 내지 595; 및 특정 실시형태에서, 453 내지 454 사이(서열번호 66).
AAV9: 138; 262 내지 273; 452 내지 461; 585 내지 593; 및 특정 실시형태에서, 454 내지 455 사이(서열번호 67).
AAV9e: 138; 262 내지 273; 452 내지 461; 585 내지 593; 및 특정 실시형태에서, 454 내지 455 사이(서열번호 68).
AAVrh10: 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; 및 특정 실시형태에서, 454 내지 455 사이(서열번호 69).
AAVrh20: 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; 및 특정 실시형태에서, 454 내지 455 사이(서열번호 70).
AAVrh39: 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; 및 특정 실시형태에서, 454 내지 455 사이(서열번호 73).
AAVrh74: 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; 및 특정 실시형태에서, 454 내지 455 사이(서열번호 72 또는 서열번호 80).
AAVhu.37: 138; 263 내지 274; 452 내지 461; 587 내지 595; 및 특정 실시형태에서, 454 내지 455 사이(서열번호 71)
특정 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 AAV9 캡시드의 아미노산 잔기 588 내지 589 사이, 또는 아미노산 서열 정렬에 의해 결정된 바와 같이 다른 AAV 유형 캡시드의 상응하는 잔기 사이에서 일어난다(예를 들어, 도 7 참조). 특정 실시형태에서, 펩타이드 삽입은 AAV9 캡시드 서열의 아미노산 잔기 I451 내지 L461, S268 및 Q588 바로 뒤, 또는 다른 AAV 캡시드 서열의 상응하는 잔기 바로 뒤에서 일어난다(도 7).
일부 실시형태에서, 하나 이상의 펩타이드 삽입은 단일 시스템에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 대상체에 있는 기존 항체를 회피하는 것과 같이, 대상체의 면역계에 의한 AAV 입자의 인식을 저하시키기 위해 선택 및/또는 추가로 변형된다. 일부 실시형태에서. 일부 실시형태에서, 캡시드는 원하는 향성/표적화를 향상시키기 위해 선택 및/또는 추가로 변형된다.
5.2.4 AAV 벡터
또한, 조작된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 비복제성이고 rep 또는 cap 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(이들은 rAAV 벡터의 제조에서 패키징 세포에 의해 공급됨)을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, AAV-기반 벡터는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, AAV.HSC16, AAVrh34, AAVhu26, AAVrh31, AAVhu56, AAVhu53, AAVrh64R1, AAVrh46 및 AAVrh73 중 하나 이상, 또는 다른 rAAV 입자, 또는 이들 중 2 이상의 조합으로부터의 캡시드 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAVrh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16, AAVrh34, AAVhu26, AAVrh31, AAVhu56, AAVhu53, AAVrh64R1, AAVrh46 및 AAVrh73 중 하나 이상 또는 다른 rAAV 입자, 또는 이들 중 2개 이상의 혈청형의 조합으로부터의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV. RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16, AAVrh34, AAVhu26, AAVrh31, AAVhu56, AAVhu53, AAVrh64R1, AAVrh46, 및 AAVrh73, 또는 이들의 유도체, 변형, 또는 위형(pseudotype)으로부터 선택되는 AAV 캡시드 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다. 이러한 조작된 AAV 벡터는 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 재조합 AAV는 Anc80 또는 Anc80L65이다(예를 들어, Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068 참조, 본 명세서에 전체가 참고로 포함됨). 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 재조합 AAV는 AAV.7m8(이의 변이체 포함)이다(예를 들어, US 9,193,956; US 9,458,517; US 9,587,282; US 2016/0376323, 및 WO 2018/075798 참조, 이들 각각은 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함됨). 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 AAV는 US 9,585,971에 개시된 임의의 AAV, 예컨대 AAV-PHP.B이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 AAV는 AAV8 및 혈청형 cy5, rh20 또는 rh39로부터 유래된 혼성 캡시드 서열을 갖는 AAV2/Rec2 또는 AAV2/Rec3 벡터이다(예를 들어, 이들 벡터에 대해 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Issa et al., 2013, PLoS One 8(4): e60361] 참조). 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 AAV는 다음 중 임의의 것에 개시된 AAV이며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다: US 7,282,199; US 7,906,111; US 8,524,446; US 8,999,678; US 8,628,966; US 8,927,514; US 8,734,809; US9,284,357; US 9,409,953; US 9,169,299; US 9,193,956; US 9,458,517; US 9,587,282; US 2015/0374803; US 2015/0126588; US 2017/0067908; US 2013/0224836; US 2016/0215024; US 2017/0051257; PCT/US2015/034799; 및 PCT/EP2015/053335. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된, 다음 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 또는 그 이상 동일한, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다: 미국 특허 번호 7,282,199; 7,906,111; 8,524,446; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9,458,517; 및 9,587,282; 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908호; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제9,840,719호 및 WO 2015/013313에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대 AAV.Rh74 및 RHM4-1을 포함하며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 WO 2014/172669에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예를 들어 AAV rh.74를 포함하며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 문헌[Georgiadis et al., 2016, Gene Therapy 23: 857-862 및 Georgiadis et al., 2018, Gene Therapy 25: 450]에 기술된 바와 같은 AAV2/5의 캡시드를 포함하며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV2tYF와 같은 WO 2017/070491에 개시된 임의의 AAV 캡시드를 포함하며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 문헌 [Puzzo et al., 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418]에 기술된 바와 같은 AAVLK03, 또는 AAV3B의 캡시드를 포함하고, 이 문헌은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제8,628,966호; US 제8,927,514호; US 제9,923,120호 및 WO 2016/049230에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, HSC1, HSC2, HSC3, HSC4, HSC5, HSC6, HSC7, HSC8, HSC9, HSC10, HSC11, HSC12, HSC13, HSC14, HSC15, 또는 HSC16을 포함하고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 번호 WO 2003/052051(예를 들어, '051 공보의 서열번호 2 참조), WO 2005/033321(예를 들어, '321 공보의 서열번호 123 및 88 참조), WO 03/042397(예를 들어, '397 공보의 서열번호 2, 81, 85 및 97 참조), WO 2006/068888(예를 들어, '888 공보의 서열번호 1 및 3-6 참조), WO 2006/110689(예를 들어, '689 공보의 서열번호 5-38 참조) WO2009/104964(예를 들어, '964 공보의 서열번호 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참조), WO 2010/127097(예를 들어, '097 공보의 서열번호 5-38 참조), 및 WO 2015/191508(예를 들어, '508 공보의 서열번호 80-294 참조), 및 미국 출원 공개 제20150023924호(예를 들어, '924 공보의 서열번호 1, 5-10 참조)에 개시된 캡시드 단백질을 갖고, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 번호 WO 2003/052051(예를 들어, '051 공보의 서열번호 2 참조), WO 2005/033321(예를 들어, '321 공보의 서열번호 123 및 88 참조), WO 03/042397(예를 들어, '397 공보의 서열번호 2, 81, 85 및 97 참조), WO 2006/068888(예를 들어, '888 공보의 서열번호 1 및 3-6 참조), WO 2006/110689, (예를 들어, '689 공보의 서열번호 5-38 참조) WO2009/104964(예를 들어, 964 공보의 서열번호 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참조), WO 2010/127097(예를 들어, '097 공보의 서열번호 5 내지 38 참조), 및 WO 2015/191508(예를 들어, '508 공보의 서열번호 80 내지 294 참조), 및 미국 출원 공개 제20150023924호(예를 들어, '924 공보의 서열번호 1, 5 내지 10 참조)에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형화된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형화된 AAV 캡시드는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 위형화된 AAV 캡시드이다. 위형화된 rAAV 입자를 생성하고 사용하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001)] 참조).
특정 실시형태에서, 단일 가닥 AAV(ssAAV)가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 자기-상보적 벡터, 예를 들어, scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82; McCarty et al, 2001, Gene Therapy, 8(16):1248-1254]; US 6,596,535; US 7,125,717; 및 US 7,456,683 참조, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
5.3. rAAV 입자를 제조하는 방법
본 발명의 또 다른 양상은 본 명세서에 개시된 캡시드를 갖는 rAAV 입자를 제조하는 것을 수반한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 본 명세서에 기술된 임의의 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드를 제공하고; 패키징 세포 시스템을 사용하여 캡시드 단백질로 구성된 캡시드 코트를 갖는 상응하는 rAAV 입자를 제조함으로써 만들어진다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 본 명세서에 기술된 캡시드 단백질 분자의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 서열을 암호화하고, 캡시드 단백질의 생물학적 기능을 유지(또는 실질적으로 유지)한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 본 명세서에 기술된 캡시드 단백질 중 하나의 서열, 예를 들어, 표 17의 서열, 또는 본 명세서에 달리 기술된 것(또한 도 7 참조)과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일성을 가지면서, 캡시드 단백질의 생물학적 기능을 유지(또는 실질적으로 유지)하는 서열을 암호화한다.
캡시드 단백질, 코트 및 rAAV 입자는 본 기술분야에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 벡터로의 패키징을 가능하게 하는 적어도 하나의 역말단 반복체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 게놈은 cap 유전자 및/또는 cap 유전자의 발현 및 스플라이싱을 위한 rep 유전자를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, cap 및 rep 유전자는 패키징 세포에 의해 제공되며 바이러스 게놈에는 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 조작된 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산은 기존 캡시드 유전자 대신 AAV Rep-Cap 헬퍼 플라스미드 내로 클로닝된다. 숙주 세포에 함께 도입되면 이 플라스미드는 rAAV 게놈을 캡시드 코트로서 조작된 캡시드 단백질 내로 패키징하는 데 도움을 준다. 패키징 세포는 AAV 게놈 복제, 캡시드 어셈블리 및 패키징을 촉진하는 데 필요한 유전자를 소유하는 임의의 세포 유형일 수 있다. 비제한적 예로는 293 세포 또는 이의 유도체, HELA 세포 또는 곤충 세포를 포함한다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공법, 리포펙션)에는 표준 기술이 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 본 기술분야에서 일반적으로 달성되거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 본 기술분야에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 참조문헌 및 보다 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적에 대해 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]을 참조한다. 특정 정의가 제공되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약제 화학과 관련하여 활용된 명명법 및 실험실 절차 및 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약제 제조, 제형화, 및 전달, 및 환자 치료에 사용될 수 있다. AAV-기반 바이러스 벡터의 핵산 서열, 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드를 제조하는 방법은, 예를 들어, US 7,282,199; US 7,790,449; US 8,318,480; US 8,962,332; 및 PCT/EP2014/076466에 교시되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, rAAV는 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이 치료 및 예방 적용예에 사용될 수 있는 전이유전자 전달 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 또한 대상체의 표적 세포 내에서 핵산(전이유전자)에 의해 암호화된 RNA 및/또는 단백질 산물의 발현에 영향을 미치는 것으로 본 기술분야의 기술자에게 공지된 조절 제어 요소를 포함한다. 조절 제어 요소는 조직-특이적, 즉, 표적 세포/조직에서만 활성(또는 실질적으로 더 활성이거나 유의미하게 더 활성)일 수 있다. 특정 실시형태에서, AAV 벡터는 표적 조직에서의 발현을 가능하게 하는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 서열, 예컨대 프로모터를 포함한다. 프로모터는 구성적 프로모터, 예를 들어, CB7 프로모터일 수 있다. 추가적인 프로모터로는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터, 옵신 프로모터, TBG(티록신-결합 글로불린) 프로모터, APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터 또는 MIR122 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 특히 전이유전자 발현을 중지시키는 것이 바람직할 수 있는 경우, 유도성 프로모터, 예를 들어, 저산소증-유도성 또는 라파마이신-유도성 프로모터가 사용된다.
특정 실시형태에서, 조절 요소의 제어 하에, ITR이 측면에 있는 전이유전자의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 바이러스 게놈을 포함하는 AAV 벡터 및 본 명세서에 기술된 바와 같거나, 또는 본 명세서에 기술된 캡시드 단백질의 아미노산 서열(예를 들어, 표 17 참조)과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9% 동일하면서, 조작된 캡시드의 생물학적 기능을 유지하는 조작된 바이러스 캡시드가 제공된다. 특정 실시형태에서, 암호화된 조작된 캡시드는 AAV8.BBB.LD 캡시드(서열번호 27), AAV9.BBB.LD 캡시드(서열번호 29), AAV9.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 31), AAV9.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 32), AAV9.W503R 캡시드(서열번호 33), AAV9.Q474A 캡시드(서열번호 34), AAV9.N272A.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 91) 또는 AAV9.N266A.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 92)의 서열을 갖는다. 또한, 본 명세서에 기술된 아미노산 치환 및/또는 펩타이드 삽입체 및 해당 AAV 유형에 대한 야생형 또는 미조작된 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 포함하고 이의 생물학적 기능을 유지하는, AAV9 벡터외에 다른 조작된 AAV 벡터, 예컨대, 조작된 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9e, AAVrh10, AAVrh20, AAVhu.37, AAVrh39, AAVrh74, AAVrh34, AAVhu26, AAVrh31, AAVhu56, AAVhu53, AAVrh.46, AAVrh.64.R1, AAV.rh.73 벡터가 제공된다,
재조합 아데노바이러스는 E1 결실을 갖고, E3 결실을 갖거나 갖지 않고, 어느 하나 결실 영역에 발현 카세트가 삽입되어 있는 1세대 벡터일 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E2 및 E4 영역의 전체 또는 부분 결실을 함유하는 2세대 벡터일 수 있다. 헬퍼-의존성 아데노바이러스는 아데노바이러스 역말단 반복체 및 패키징 신호(파이)만을 유지한다. 전이유전자는 일반적으로 패키징 신호와 3'ITR 사이에 삽입되고, 약 36kb의 야생형 크기와 가깝게 게놈을 유지하기 위해 스터퍼(stuffer) 서열이 함께 하거나, 함께 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌[Alba et al., 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy," Gene Therapy 12:S18-S27]에서 찾을 수 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
전이유전자를 표적 조직, 세포 또는 기관으로 전달하기 위한 rAAV 벡터는 해당 특정 표적 조직, 세포 또는 기관에 대한 향성을 갖는다. 또한, 조직-특이적 프로모터도 사용될 수 있다. 작제물은 벡터에 의해 구동되는 전이유전자의 발현을 향상시키는 발현 제어 요소를 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 닭 β-액틴 인트론, 마우스의 미세 바이러스(MVM) 인트론, 인간 IX 인자 인트론(예를 들어, FIX 절두된 인트론 1), β-글로빈 스플라이스 공여체/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수용체 인트론, 아데노바이러스 스플라이스 공여체/면역글로불린 스플라이스 수용체 인트론, SV40 후기 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체(19S/16S) 인트론 및 혼성 아데노바이러스 스플라이스 공여체/IgG 스플라이스 수용체 인트론 및 폴리A 신호, 예컨대, 토끼 β-글로빈 폴리A 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리A 신호, SV40 후기 폴리A 신호, 합성 폴리A(SPA) 신호, 및 소 성장 호르몬(bGH) 폴리A 신호. 예를 들어, 문헌[Powell and Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산 서열은 예를 들어 본 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 코돈-최적화 기술을 통해 코돈-최적화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Quax et al., 2015, Mol Cell 59:149-161]에 의한 검토 참조).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 작제물은 다음 구성요소를 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 역말단 반복체; (2) a) CNS 및/또는 근육 세포에서 전이유전자의 발현을 촉진하기 위한 프로모터 및 선택적으로 인핸서 요소, b) 선택적으로 인트론 서열, 예컨대, 닭 β-액틴 인트론, 및 c) 폴리아데닐화 서열, 예컨대, SV40 폴리A 또는 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호; 및 (3) 관심 핵산 또는 단백질 산물을 제공(예를 들어, 암호)하는 전이유전자.
본 명세서에 제공된 바이러스 벡터는 숙주 세포, 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터로부터의 숙주 세포를 포함하는 포유동물 숙주 세포를 사용하여 제조할 수 있다. 비제한적 예로는 A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 1차 섬유아세포, 간세포 및 근모세포를 포함한다. 전형적으로, 숙주 세포는 전이유전자 및 연관 요소(즉, 벡터 게놈), 및 복제 및 캡시드 유전자(예를 들어, AAV의 rep 및 cap 유전자)와 같이 숙주 세포에서 바이러스를 생성하기 위한 유전자 구성요소를 암호화하는 서열에 의해 안정적으로 형질전환된다. AAV8 캡시드를 갖는 재조합 AAV 벡터를 생성하는 방법에 대해서는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제7,282,199 B2호의 상세한 설명의 섹션 IV를 참조한다. 상기 벡터의 게놈 카피 역가는, 예를 들어, TAQMAN® 분석에 의해 결정될 수 있다. 비리온은, 예를 들어, CsCl2 침강에 의해 회수될 수 있다. 대안적으로, 곤충 세포의 바큘로바이러스 발현 시스템은 AAV 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 검토용으로, 제조 기술에 대해 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Aponte-Ubillus et al., 2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:1045-1054]을 참조한다.
시험관내 검정, 예를 들어, 세포 배양 검정은 본 명세서에 기술된 벡터로부터 전이유전자 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있고, 이로써 예를 들어 벡터의 효능을 나타낸다. 예를 들어, 인간 배아 망막 세포 유래의 세포주인 PER.C6® Cell Line(Lonza), 또는 망막 색소 상피 세포, 예를 들어 망막 색소 상피 세포주 hTERT RPE-1(ATCC®에서 입수가능)은 전이유전자 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 간 또는 다른 세포 유형으로부터 유래된 세포주가 사용될 수 있으며, 예를 들어, HuH-7, HEK293, 섬유육종 HT-1080, HKB-11 및 CAP 세포가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일단 발현되면, 본 기술분야에 공지된 검정법을 사용하여 글리코실화 및 티로신 황산화 패턴의 결정을 포함한 발현된 산물(즉, 전이유전자 산물)의 특성을 결정할 수 있다.
5.4. 치료 및 예방 용도
또 다른 양상은 질환 또는 장애를 지연, 예방, 치료 및/또는 처치하고/하거나, 이와 연관된 하나 이상의 증상을 호전시키기 위해, 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 rAAV 벡터를 통해 전이유전자를 투여하는 것을 수반하는 치료법에 관한 것이다. 필요로 하는 대상체는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체, 또는 이에 대한 소인이 있는 대상체, 예를 들어, 질환 또는 장애의 발병 또는 재발의 위험이 있는 대상체를 포함한다. 일반적으로, 특정 전이유전자를 운반하는 rAAV는 전이유전자에 상응하는 대상체의 천연 유전자가 정확한 유전자 산물 또는 유전자 산물의 정확한 양을 제공하는 데 있어서 결함이 있는 대상체의 주어진 질환 또는 장애와 관련하여 사용될 것이다. 그 다음, 전이유전자는 대상체에서 결함이 있는 유전자의 카피를 제공할 수 있다.
일반적으로, 전이유전자는 상응하는 천연 유전자에 유전자 돌연변이(들)를 갖는 대상체에게 단백질 기능을 복원시키는 cDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, cDNA는 상동성 재조합을 통한 게놈 편집과 같은 게놈 조작을 수행하기 위한 연관된 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 shRNA, 인공 miRNA 또는 스플라이싱에 영향을 미치는 요소와 같은 치료용 RNA를 암호화한다.
하기 표 1A 내지 1B는 전이유전자가 연관이 있고 표 1A 내지 1B에도 나열되는, 질환을 치료 또는 예방하기 위해 본 명세서에 기술된 임의의 rAAV 벡터, 특히 본 명세서에 기술된 신규 삽입 부위에 사용될 수 있는 전이유전자의 목록을 제공한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, AAV 벡터는 치료 또는 예방 용도를 달성하기 위해 전이유전자의 전달에 적절한 조직을 표적화하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같이 조작될 수 있다. 적절한 AAV 혈청형은 벡터의 조직 향성 및 형질도입을 최적화하도록 조작하기 위해 선택될 수 있다.
[표 1A]
[표 1B]
예를 들어, 신경아교 유래 성장 인자(GDGF)를 암호화하는 전이유전자를 포함하는 rAAV 벡터는 파킨슨병을 치료/예방/처치하는 데 사용된다. 일반적으로, rAAV 벡터는 전신 투여된다. 예를 들어, rAAV 벡터는 정맥내, 척수강내, 비강내 및/또는 복강내 투여에 의해 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 전이유전자는 마이크로디스트로핀(예를 들어, WO WO2021/108755, WO2002/029056, WO2016/115543, WO2015/197232, WO2016/177911, US7892824B2, US9624282B2 및 WO2017221145에 개시된 바와 같음, 이 문헌들은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)을 암호화하며, 근이영양증과 같은 이영양증의 치료에 유용하다. 본 명세서의 실시예 18은 mdx 마우스(근이영양증에 대한 동물 모델)와 비교하여 야생형 마우스에 정맥내 투여 후 캡시드 AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.10, AAVrh.46, AAVrh.64.R1 및 AAVrh.73의 상대적 풍부도를 보여준다. 이들 캡시드를 갖거나, 이의 조작된 형태를 갖는 rAAV 입자는 뒤센 근이영양증과 같은 근이영양증을 치료하기 위해, 간 세포로 저하된 전달을 갖는 한편, 마이크로디스트로핀 또는 다른 디스트로핀병증 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자를 골격 및/또는 심장 근육을 포함하는 근육 세포로 전달하는데 유용할 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명의 rAAV는 치료/예방될 장애 또는 질환과 연관된 표적 세포 유형과 연관된 세포 기질을 포함하는 표적 조직, 또는 표적 세포 유형으로 전달하는 데 사용된다. 특정 조직 또는 세포 유형과 연관된 질환 또는 장애는 신체의 다른 조직 또는 세포 유형과 비교하여, 특정 조직 또는 세포 유형에 주로 영향을 미치는 것, 또는 장애의 영향 또는 증상이 특정 조직 또는 세포 유형에서 나타나는 것이다. 필요로 하는 대상체의 표적 조직으로 전이유전자를 전달하는 방법은 펩타이드 삽입이 귀소 펩타이드인 rAAV를 대상체에 투여하는 것을 수반한다. 파킨슨병의 경우, 예를 들어, rAAV를 신경 조직으로 유도하는 펩타이드 삽입을 포함하는 rAAV 벡터는, 특히, 이 펩타이드 삽입이 CNS로 혈액뇌장벽을 횡단하는 데 있어서 rAAV를 용이하게 하는 경우에 사용될 수 있다.
신경 조직과 연관된 질환 또는 장애의 경우, rAAV 벡터는 본 명세서에 기술된 임의의 것과 같은 신경 조직-귀소 도메인으로부터의 펩타이드 삽입을 포함하는 것이 사용될 수 있다. 신경 조직과 연관된 질환/장애는 알츠하이머병, 근위축성 측삭경화증(ALS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 바텐병, 바텐 청소년 NCL 형태, 카나반병, 만성 통증, 프리드리히 운동실조증, 다형성 교모세포종, 헌팅턴병, 후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증(LINCL), 리소좀 축적 장애, 레베르 선천성 흑암시, 다발성 경화증, 파킨슨병, 폼페병, 레트 증후군, 척수 손상, 척수 근위축증(SMA), 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상을 포함한다. 벡터는 추가로 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병 위험이 있는 대상체에게 치료적/예방적 이점을 위한 전이유전자를 함유할 수 있다(표 1A 내지 표 1B 참조).
본 발명의 rAAV 벡터는 또한 표적 세포 또는 조직으로 올리고뉴클레오타이드, 약물, 이미지화제, 무기 나노입자, 리포좀, 항체의 전달, 특히 표적화된 전달을 용이하게 할 수 있다. 또한, rAAV 벡터는 표적 조직으로 비-암호성 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오타이드의 전달, 특히 표적화된 전달을 용이하게 할 수 있다.
작용제는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 조성물로서 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 rAAV 분자는 단독으로 또는 다른 예방적 및/또는 치료적 작용제와 조합으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 투여량 및 투여 빈도는 용어 치료적으로 효과적인 및 예방적으로 효과적인에 의해 포괄된다. 투여량 및 빈도는 전형적으로 투여되는 특정 치료제 또는 예방제에 의존적인 각 환자에게 특이적인 인자, 질환의 중증도 및 유형, 투여 경로, 뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 반응, 및 과거 병력에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 적당한 요법은 이러한 인자를 고려하여, 그리고 예를 들어, 문헌에 보고되고 Physician's Desk Reference(56판, 2002)에서 권장하는 투여량에 따라 선택할 수 있다. 예방제 및/또는 치료제는 반복적으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제를 투여하는 시간적 요법, 및 이러한 작용제가 별도로 또는 혼합물로서 투여되는지 여부와 같은 절차의 여러 양상은 변동될 수 있다.
효과적일 본 발명의 작용제의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 작용제의 경우, 치료적 유효 용량은 처음에는 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대 저해의 절반을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
예방제 및/또는 치료제, 뿐만 아니라 이들의 조합은 인간에 사용하기 전에 적합한 동물 모델 시스템에서 테스트될 수 있다. 이러한 동물 모델 시스템으로는 래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 돼지, 개, 토끼 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 기술분야에 공지된 임의의 동물 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 모델 시스템은 널리 사용되며 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CNS 상태에 대한 동물 모델 시스템은 래트, 마우스, 또는 영장류 이외의 다른 작은 포유동물을 기반으로 하는 것이 사용된다.
본 발명의 예방제 및/또는 치료제가 동물 모델에서 테스트되었다면, 이들은 효능을 확립하기 위해 임상 시험에서 테스트될 수 있다. 임상 시험을 확립하는 것은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 일반적인 방법론에 따라 수행될 것이며, 본 발명의 작용제의 최적 투여량 및 투여 경로뿐만 아니라 독성 프로필이 확립될 수 있다. 예를 들어, 임상 시험은 인간 환자에서 효능 및 독성에 대해 본 발명의 rAAV 분자를 테스트하기 위해 설계될 수 있다.
본 발명의 예방제 및/또는 치료제의 독성 및 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 예방제 및/또는 치료제가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 예방 및/또는 치료제가 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 줄이기 위해, 상기 작용제를 이환된 조직 부위로 표적화하는 전달 시스템을 설계하도록 주의를 기울여야 한다.
본 발명의 rAAV 분자는 일반적으로 원하는 치료적 및/또는 예방적 이점을 수득하기에 효과적인 시간 및 양으로 투여될 것이다. 세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득되는 데이터는 인간에게 사용하기 위한 예방제 및/또는 치료제의 투여량 범위 및/또는 일정을 공식화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 작용제의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여량 형태 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변동될 수 있다.
환자에 대한 rAAV 벡터의 치료 유효 투여량은 일반적으로 약 1×109 내지 약 1×1016 게놈 rAAV 벡터, 또는 약 1×1010 내지 약 1×1015, 약 1×1012 내지 약 1×1016, 또는 약 1×1014 내지 약 1×1016 AAV 게놈의 농도를 함유하는 용액 약 0.1 ml 내지 약 100 ml이다. 전이유전자의 발현 수준은 투여량, 빈도, 일정 등을 결정/조정하기 위해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 작용제의 치료적 또는 예방적 유효량에 의한 대상체의 치료는 단독 치료를 포함할 수 있거나 일련의 치료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작용제를 포함하는 약제학적 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 또는 2, 3 또는 4회 또는 그 이상 일련의 횟수로, 예를 들어, 매주, 매월 또는 2개월, 3개월, 6개월 또는 1년마다 일련의 용량이 투여될 때까지 투여될 수 있다.
본 발명의 rAAV 분자는 단독으로 또는 다른 예방제 및/또는 치료제와 조합으로 투여될 수 있다. 각각의 예방제 또는 치료제는 동시에 또는 상이한 시점에서 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다; 하지만, 동시에 투여하지 않는다면 원하는 치료 또는 예방 효과를 제공하도록 충분히 가까운 시간에 투여되어야 한다. 각각의 치료제는 임의의 적합한 형태 및 임의의 적합한 경로에 의해 별도로 투여될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 상이한 예방제 및/또는 치료제는 1시간 미만의 간격, 약 1시간 간격, 약 1시간 내지 약 2시간 간격, 약 2시간 내지 약 3시간 간격, 약 3시간 내지 약 4시간 간격, 약 4시간 내지 약 5시간 간격, 약 5시간 내지 약 6시간 간격, 약 6시간 내지 약 7시간 간격, 약 7시간 내지 약 8시간 간격, 약 8시간 내지 약 9시간 간격, 약 9시간 내지 약 10시간 간격, 약 10시간 내지 약 11시간 간격, 약 11시간 내지 약 12시간 간격, 24시간 이하의 간격, 또는 48시간 이하의 간격으로 투여된다. 특정 실시형태에서, 동일 환자 방문 내에 2개 이상의 작용제가 투여된다.
본 발명의 작용제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 주입 또는 볼러스 주사를 포함하는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외, 및 상피 또는 점막피부 또는 점막 내층(예를 들어, 비강, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의한 투여를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 전이유전자가 CNS에서 발현되도록 의도되는 경우와 같은 특정 실시형태에서, 벡터는 요추 천자를 통해 또는 대수조를 통해 투여된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 작용제는 정맥내로 투여되고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 작용제는 지속 방출 제형으로 전달될 수 있으며, 예를 들어 여기서 제형은 연장된 방출을 제공하고, 이에 따라 투여된 작용제의 연장된 반감기를 제공한다. 사용하기에 적합한 제어 방출 시스템으로는 확산 제어, 용매 제어 및 화학적 제어 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 확산 제어 시스템은, 예를 들어, 저장소 장치를 포함하며, 여기서 본 발명의 분자는 분자의 방출이 확산 장벽을 통한 침투에 의해 제어되도록 장치 내에 둘러싸여 있다. 일반적인 저장소 장치로는, 예를 들어, 막, 캡슐, 마이크로캡슐, 리포좀 및 중공 섬유를 포함한다. 모놀리식(매트릭스) 장치는 이중 항원-결합 분자가 속도 제어 매트릭스(예를 들어, 중합체 매트릭스)에 분산되거나 용해되는 확산 제어 시스템의 제2형이다. 본 발명의 작용제는 속도 제어 매트릭스 전체에 균질하게 분산될 수 있으며 방출 속도는 매트릭스를 통한 확산에 의해 제어된다. 모놀리식 매트릭스 장치에 사용하기에 적합한 중합체는 천연 발생 중합체, 합성 중합체 및 합성 변형된 천연 중합체, 뿐만 아니라 중합체 유도체를 포함한다.
본 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 기술은 본 명세서에 기술된 하나 이상의 작용제를 포함하는 지속 방출 제형을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,526,938호; PCT 공개 WO 91/05548; PCT 공개 WO 96/20698; 문헌[Ning et al., "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology, 39:179 189, 1996; Song et al., "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, 50:372 397, 1995; Cleek et al., "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24:853 854, 1997; 및 Lam et al., "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 24:759 760, 1997]을 참조하고, 이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 한 실시형태에서, 펌프는 제어 방출 시스템에 사용될 수 있다(문헌[Langer, 상기 문헌; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery, 88:507, 1980; 및 Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574, 1989] 참조). 다른 실시형태에서, 중합체 물질은 이중 항원-결합 분자, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 작용제의 제어 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, N.Y. (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61, 1983] 참조; 또한, 문헌[Levy et al., Science, 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol., 25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg., 7 1:105, 1989] 참조); 미국 특허 제5,679,377호; 미국 특허 제5,916,597호; 미국 특허 제5,912,015호; 미국 특허 제5,989,463호; 미국 특허 제5,128,326호; PCT 공개 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개 번호 WO 99/20253). 또 다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적(예를 들어, 이환된 관절) 근접에 배치되어, 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115 138 (1984)] 참조). 다른 제어 방출 시스템은 문헌[Langer, Science, 249:1527 1533, 1990]에 의한 보고서에서 논의되어 있다.
또한, rAAV는 광유전학, miRNA를 사용한 유전자 녹다운, 조건부 유전자 결실을 위한 재조합효소 전달, CRISPR을 사용한 유전자 편집 등과 같은 과학적 연구를 위한 전이유전자의 생체내 전달에 사용될 수 있다.
5.5. 약제학적 조성물 및 키트
본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 본 발명의 작용제를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공하며, 상기 작용제는 본 발명의 rAAV 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 rAAV를 포함한다. 한 실시형태에서, "약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 동물용으로, 보다 특히 인간용으로 등재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 작용제와 함께 투여되는 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 완전 및 불완전 보조제), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체일 수 있고, 예컨대, 물 및 오일, 예를 들어, 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함할 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 일반적인 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 안정화제의 추가 예로는 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 산화방지제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민 및 젤라틴과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 본 기술분야에 공지된 PLURONICS™과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제를 포함할 수도 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 치료적 및/또는 예방적 유효량의 본 발명의 작용제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 작용제는 실질적으로 정제된다(즉, 그 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 생성하는 물질이 실질적으로 없음). 특정 실시형태에서, 숙주 또는 대상체는 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 예컨대, 사이노몰구스 원숭이, 및 인간)이다. 특정 실시형태에서, 숙주는 인간이다.
본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 추가 키트를 제공한다. 한 실시형태에서, 키트는 예를 들어 하나 이상의 용기에, 본 발명의 하나 이상의 작용제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 용기에, 상태의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 작용제 또는 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 향낭과 같은 밀봉형 용기에 포장된 본 발명의 작용제를 제공한다. 한 실시형태에서, 작용제는 밀봉형 용기에 건조 멸균 동결건조 분말 또는 무수 농축액으로서 공급되고, 예를 들어, 물 또는 식염수에 의해, 대상체에게 투여하기에 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 전형적으로, 작용제는 적어도 5 mg, 보다 종종 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 또는 적어도 75 mg의 단위 투여량으로 밀봉형 용기에 건조 멸균 동결건조 분말로서 공급된다. 동결건조 작용제는 원래의 용기에서 2 내지 8℃ 사이에서 보관되어야 하고, 작용제는 재구성된 후 12시간 이내, 보통 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내 또는 1시간 이내에 투여되어야 한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명의 작용제는 작용제 또는 활성제의 양 및 농도를 나타내는 밀봉형 용기에 액체 형태로 공급된다. 전형적으로, 작용제의 액체 형태는 적어도 1 mg/ml, 적어도 2.5 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 8 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/kg, 또는 적어도 25 mg/ml로 밀봉형 용기에 공급된다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물(예를 들어, 불순한 또는 비멸균 조성물) 뿐만 아니라 약제학적 조성물(즉, 대상체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)을 포함한다. 벌크 약물 조성물은, 예를 들어, 예방적 또는 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 작용제 또는 이들 작용제의 조합 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 단위 투여 형태의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 작용제 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 표적 질환 또는 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제가 또한 약제학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 이러한 용기(들)에는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형식의 게시가 연관되어 있을 수 있으며, 이 게시는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다.
일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은 단위 투여 형태로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급되며, 예를 들어, 작용제 또는 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 향낭과 같은 밀봉형 용기에 무수 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 약제 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병에 의해 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
6. 실시예
하기 실시예는 삽입 돌연변이유발을 통해 캡시드 조작하기 위한 후보를 식별하기 위해 AAV9 캡시드 상의 표면-노출된 루프에 대한 분석을 보고한다. 본 발명은 인간 축삭 다이네인(dynein) 중쇄 꼬리에 기초하여 설계된 7량체 펩타이드를 함유하도록 조작된 rAAV9 캡시드의 작제를 설명하는 실시예에 의해 예시된다. 간단히 말해서, 짧은 펩타이드 삽입에 순응적일 수 있는 표면 루프를 선택하기 위해 3가지 기준이 사용되었다: 1) 인접 루프와의 최소 측쇄 상호작용; 2) 혈청형 사이의 가변 서열 및 구조(보존된 서열의 결여); 및 3) 일반적으로 표적화된 중화 항체 에피토프를 방해하는 잠재성. 펩타이드 삽입 돌연변이체의 패널을 작제하고, 생존가능한 캡시드 조립, 펩타이드 표면 노출 및 효능에 대해 개별 돌연변이체를 스크리닝했다. 그런 다음 상위 후보를 귀소 펩타이드의 삽입을 위한 주형으로 사용하여 이러한 펩타이드 삽입 지점이 rAAV 벡터를 관심 조직으로 재표적화하는 데 사용할 수 있는지 테스트했다. 추가 실시예는 본 명세서에 기재된 특정 변형된 AAV 캡시드에 대한 증가된 형질도입 및 조직 향성을 입증한다.
6.1.
실시예 1
- AAV9 캡시드의 분석
도 1 및 도 2는 다른 AAV VR-IV(도 1)와의 아미노산 서열 비교 및 단백질 모델(도 2)에 의한 아데노-연관 바이러스 9형의 가변 영역 4(AAV9 VR-IV)의 분석을 도시한다. 도시된 바와 같이, AAV9 VR-IV는 3겹 스파이크의 끝 또는 외측 표면이 표면 상에 노출된다. 추가 분석에 따르면, VR-IV와 VR-V 사이에는 측쇄 상호작용이 거의 없고 VR-IV의 서열과 구조는 AAV 혈청형 중에서 가변적이며 일반적으로 표적화된 중화 항체 에피토프를 방해할 잠재성이 있어, 변형된 캡시드의 면역원성을 저하시키는 것으로 나타났다.
6.2.
실시예 2
- AAV9 돌연변이체의 작제
8개의 AAV9 돌연변이체를 각각 VR-IV 루프의 상이한 삽입 지점에 이종 펩타이드를 포함하도록 작제했다. 이종 펩타이드는 표 2에 나타낸 바와 같이 pRGNX1090-1097로서 식별된 벡터에서 다음 잔기 바로 뒤에 삽입된 FLAG 태그였다.
6.3.
실시예 3
- 패키징 효율의 분석
도 3은 야생형 AAV9 및 여덟(8)개의 후보 rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097)의 mL당 게놈 카피(GC/mL)에 의거한 높은 패키징 효율을 도시한 것으로, 여기서 후보 벡터는 각각 AAV9의 VR-IV 내의 상이한 부위에 FLAG 삽입체를 함유한다. 모든 벡터는 10mL 배양물에서 루시퍼라제 전이유전자와 함께 패키징되어 삽입 지점이 캡시드 패키징을 방해하지 않았다는 결정을 용이하게 했고; 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도시된 바와 같이, 모든 후보는 고효율로 패키징된다.
6.4.
실시예 4
- 표면 FLAG 노출 분석
도 4는 여덟(8)개의 후보 rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097) 각각에서 FLAG 삽입체의 표면 노출을 도시한 것이며, 이는 항-FLAG 수지에 대한 결합에 의해 형질도입된 벡터를 면역침전시켜 확인했다. 항-FLAG에 대한 결합은 표면에 펩타이드 삽입을 표시하는 캡시드의 형성을 허용하는 삽입 지점을 나타낸다.
형질도입된 세포를 용해하여 원심분리했다. 500 μL의 세포 배양물 상청액을 20 μL 아가로스-FLAG 비드에 로딩하고, 또한 겔에 직접 로딩된 SDS-PAGE 로딩 완충액으로 용출시켰다. 음성 대조군에는 FLAG 삽입체를 함유하지 않는 293-ssc 상청액을 사용했다.
도시된 바와 같이, 1090은 후보 벡터 중 역가가 가장 낮았고, 이는 풀다운된 단백질이 가장 적음을 나타낸다. 또한, 양성 대조군에 의해서도 매우 낮은 역가가 나타났다. 이는 SDS-PAGE에서 가시화에 충분한 양의 양성 대조군이 로딩되지 않았을 가능성이 있다.
6.5.
실시예 5
- 형질도입 효율의 분석
도 5A 내지 도 5B는 야생형 AAV9(9-luc) 또는 여덟(8)개의 후보 rAAV9 벡터(1090, 1091, 1092, 1093, 1094, 1095, 1096 및 1097) 각각에 패키징된 전이유전자로서 루시퍼라제 유전자를 운반하는 캡시드 벡터에 의해 형질도입된 Lec2 세포에서의 형질도입 효율을 도시한 것이다; 활성은 9-luc의 활성을 100%로 하여 루시퍼라제 활성 퍼센트(도 5A)로서, 또는 단백질 마이크로그램당 상대적 광단위(RLU)(도 5B)로서 표현된다.
CHO-유래 Lec2 세포는 αMEM 및 10% FBS에서 성장시켰다. Lec2 세포는 약 2×108 GC 벡터의 MOI(약 10,000의 MOI)로 형질도입시켰고 ViraDuctin 시약으로 처리했다(약 10,000 GC/세포의 MOI에서 Lec2 세포를 형질도입시키지만 40 μg/mL 염화 아연(ZnCl2)으로 처리 시, 유사한 결과가 관찰되었다; 결과는 표시되지 않음). Lec2 세포는 CHO 유래의 프롤린 영양요구체이다.
도시된 바와 같이, 시험관내 형질도입 효율은 야생형 AAV9(9-luc)를 사용하여 수득한 것보다 낮다. 그럼에도 불구하고 이전 연구에서는 귀소 펩타이드의 도입이 비표적 세포(예컨대, 293, Lec2 또는 HeLa)에서 시험관내 유전자 전달을 감소시킬 수 있는 반면, 표적 세포에서 시험관내 유전자 전달을 유의미하게 증가시킬 수 있음을 보여주었다(예를 들어, 문헌[Nicklin et al. 2001; 및 Grifman et al. 2001] 참조).
6.6.
실시예 6
- 삽입 펩타이드 조성 및 길이의 인자로서 패키징 효율 분석
도 6A는 AAV9 캡시드(서열번호 67)의 S454 바로 뒤에 다양한 펩타이드 길이 및 조성의 삽입이 패키징 세포주에서 AAV 입자의 생산 효율에 영향을 미칠 수 있음을 예시하는 막대 그래프를 도시한 것이다. AAV9 VR-IV 내의 S454(잔기 454와 455 사이) 뒤에 다양한 조성과 길이의 10가지 펩타이드가 삽입되었다. 형질감염 5일 후 형질감염된 현탁액 HEK293 세포의 수확된 상청액에서 qPCR을 수행했다. 막대 그래프로 도시된 결과는 삽입의 본성 및 길이가 높은 역가로 생산되고 293 세포에서 패키징되는 AAV 입자의 능력을 영향을 미칠 수 있음을 입증한다. (오차 막대는 Y축에 괄호 안에 표기된 펩타이드 평균 길이의 표준 오차를 나타낸다.)
S454 삽입 부위에서 하기 펩타이드 서열(표 3)의 귀소 펩타이드를 함유하는 캡시드 단백질을 갖는 AAV9 벡터를 연구하였다. 현탁액-적응된 HEK293 세포를 10mL 배지에서 형질도입하기 1일 전에 1×106 세포/mL로 파종했다. 삼중 플라스미드 DNA 형질감염은 1:1.75의 DNA:PEI 비율로 PEIpro®(Polypus 형질감염)를 이용하여 수행했다. 세포를 원심분리하고, 형질감염 5일 후 상청액을 수확하여 -80℃에 보관했다.
형질감염 5일 후 형질감염된 현탁액 HEK293 세포의 수확된 상청액에서 qPCR을 수행했다. 샘플을 DNase I 처리를 받게 하여 잔류 플라스미드 또는 세포 DNA를 제거한 다음, 열 처리하여 DNase I을 불활성화시키고 캡시드를 변성시켰다. 샘플은 TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpEraseUNG(ThermoFisherScientific) 및 전이유전자 작제물에 패키징된 폴리A 서열에 대한 프라이머/프로브를 사용하여 qPCR을 통해 적정했다. RGX-501 벡터 BDS를 사용하여 표준 곡선을 확립시켰다.
길이가 5 내지 10개 아미노산 범위인, S454 직후의 펩타이드 삽입은 적절한 역가를 갖는 AAV 입자를 생성한 반면, 12개 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 삽입에 대해 유의미한 패키징 결함이 관찰되어 상한 크기를 제한하는 것이 가능하다.
6.7.
실시예 7
- 귀소 펩타이드는 S454 뒤에 삽입되었을 때 시험관내에서 AAV9의 형질도입 특성을 변경시킨다.
도 6B 내지 도 6E는 (도 6B) Lec2 세포주(시알산-결핍 상피 세포주), (도 6C) HT-22 세포주(신경원 세포주), (도 6D) hCMEC/D3 세포주(뇌 내피 세포주) 및 (도 6E) C2C12 세포주(근육 세포주)의 세포 배양물에 대한 형광 이미지를 도시한 것이다. AAV9 야생형, 및 GFP 전이유전자를 함유하는 표 3의 S454 삽입 귀소 펩타이드 캡시드를 사용하여 표기된 세포주를 형질도입시켰다.
형질도입 24시간 전에 세포주는 96-웰에서 5-20×103개 세포/웰(세포주에 따라 다름)로 플레이팅했다. 세포를 1×1010 입자/웰의 AAV9-GFP 벡터(삽입 유무에 관계없이)로 형질도입하고 각 세포주에서 발현율의 차이에 따라 형질도입 48 내지 96시간 후에 Cytation5(BioTek)를 통해 분석했다. Lec2 세포는 실시예 5에서와 같이 배양했고, 혈액뇌장벽 hCMEC/D3(EMD Millipore) 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 배양했으며, HT-22 및 HUH7 세포는 DMEM 및 10% FBS에서 배양했고, C2C12 근모세포는 DMEM 및 10% FBS에서 플레이팅하고, 2% 말 혈청 및 0.1% 인슐린이 보충된 DMEM에서 형질감염 전 3일 동안 분화시켰다. AAV9.S454.FLAG는 테스트된 모든 세포 유형에서 낮은 형질도입 수준을 보였다.
이미지는 미변형된 AAV9 캡시드와 비교하여 귀소 펩타이드가 AAV9 캡시드 단백질에서 S454 이후에 삽입될 때 시험관내에서 AAV9의 형질도입 특성을 변경할 수 있음을 보여준다. 모든 세포주에서 P7(TfR1 펩타이드, HAIYPRH(서열번호 10))이 가장 높은 형질도입율을 보이며, 그 다음이 P9(TfR3 펩타이드, RTIGPSV(서열번호 12))이다. P4(신장1 펩타이드, LPVAS(서열번호 6))는 모든 세포 유형에서 AAV9 야생형보다 약간 더 높은 형질도입률을 보였다. Lec2 및 HT-22 세포주 배양과 비교하여 뇌 내피 hCMEC/D3 세포주 및 C2C12 근육 세포주 배양물에서는 P6(근육1 펩타이드, ASSLNIA(서열번호 7))에 대해 더 높은 형질도입율이 관찰되었다. P1 벡터는 형질도입 효율이 극히 낮아 이미지에 포함되지 않았고, P8 벡터는 역가가 낮아 포함되지 않았다.
6.8.
실시예 8
- 펩타이드 삽입 지점에 대한 AAV 캡시드의 분석
도 7은 회색으로 강조 표시된 VP2의 개시 코돈, 가변 영역 1(VR-I), 가변 영역 4(VR-IV), 및 가변 영역 8(VR-VIII)의 내부 또는 그 부근에 인간 펩타이드에 대한 삽입 부위 내에서 캡시드 서열에 대한 삽입 부위 내의 AAV 1-9e, rh10, rh20, rh39, rh74, hu12, hu21, hu26, hu37, hu51 및 hu53 캡시드 서열의 정렬을 도시한 것이고; 각 캡시드 단백질의 가변 영역 8(VR-VIII) 내의 특정 삽입 부위는 기호 "#"(AAV9의 아미노산 넘버링에 따른 아미노산 잔기 588 다음에)로 표시된다.
6.9.
실시예 9
- AAV 게놈 카피/다양한 벡터의 게놈 DNA μg의 비교
도 8은 AAV 벡터: AAV9; AAV.PHP.eB; AAV.hDyn(캡시드 서열에 대한 다른 아미노산 변형 없이 588 내지 589 사이에 TLAAPFK(서열번호 1)을 갖는 AAV9); AAV.PHP.S; 및 AAV.PHP.SH(표 17 참조)의 투여 후, 마우스 뇌 세포에서 발현된 GFP(녹색 형광 단백질) 전이유전자의 카피를 도시한 것이다.
AAV.PHP.B는 캡시드 서열에 대한 다른 아미노산 변형 없이 AAV9 캡시드에 TLAVPFK(서열번호 20) 삽입을 갖는 캡시드이다. AAV.PHP.eB는 PHP.B 삽입의 상류에 캡시드 서열의 2개의 아미노산 변형이 있는, AAV9 캡시드에 TLAVPFK(서열번호 20) 삽입을 갖는 캡시드이다(또한 표 17 참조). 표 4A는 연구에 활용된 캡시드를 요약한 것이다.
[표 4A]
재료 및 방법
GFP 전이유전자를 암호화하는 AAV9, AAV.PHPeB, AAV.hDyn, AAV.PHP.S 및 AAV.PHP.SH의 작제물을 제조하고 1xPBS + 0.001% Pluronic에서 제형화했다. 암컷 C57BL/6 마우스를 1일 체중에 기초하여 처리군으로 무작위 배정했다. 5개 그룹의 암컷 C57BL/6 마우스에게 하기 표 4B에 따라 각각 AAV9.GFP, AAV.PHPeB.GFP, AAV.hDyn.GFP, AAV.PHP.S.GFP 또는 AAV.PHP.SH.GFP를 정맥내 투여했다. 투약 부피는 10 mL/kg(0.200 mL/20g 마우스)였다. 마우스는 시작일에 8 내지 12주령이었다. 투여 후 15일째에, 동물을 안락사시키고, 뇌 조직, 간, 앞다리 이두근, 심장, 신장, 폐, 난소 및 좌골 신경을 비롯한 말초 조직을 수집했다.
[표 4B]
정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 뇌 게놈 DNA μg당 벡터 게놈의 수를 결정했다. 주사 맞은 마우스의 뇌 샘플을 처리하고 Qiagen의 혈액 및 조직 게놈 DNA 키트를 사용하여 게놈 DNA를 단리했다. 표준 곡선 방법에 따라 eGFP에 특이적인 프라이머-프로브 조합을 사용하여 QuantStudio 5 기기(Life Technologies Inc)에서 qPCR 검정을 실행했다.
뇌 게놈 DNA μg당 AAV 벡터 게놈 카피는 모든 다른 AAV 혈청형: AAV9, AAV.PHPeB, PHP.S 및 PHP.SH와 비교하여 AAV.hDyn이 투여된 마우스에서 최소 로그만큼 더 높았다(도 8 참조). 이 연구에서 볼 수 있듯이, GC/μg 게놈 DNA는 AAV9 캡시드의 잔기 588 내지 589 사이에 "TLAAPFK"(서열번호 1) 펩타이드 삽입체(인간 축삭 다이네인의 펩타이드)를 함유하는 AAV9 캡시드인 AAV.hDyn에서 가장 높다. 이 연구는 eGFP를 운반하는 AAV.hDyn을 전신으로 투여한 5마리의 마우스에서 평균 1E04 GC/μg 전이유전자 초과에서 마우스 뇌에 형질도입을 입증했다. 그러나, "TLAVPFK"(서열번호 20) 서열(마우스 다이네인으로부터의 펩타이드)을 함유하는 벡터 AAV.PHPeB를 포함하는 다른 변형된 AAV9 캡시드는 전신 처리 시 1E03 GC/μg 전이유전자 미만에서 마우스 뇌에 형질도입을 입증했다.
6.10.
실시예 10
- TLAAPFK(서열번호 2)를 함유하는 rAAV 캡시드의 작제
도 9A는 VR-IIIV의 Q588과 A589 사이에 아미노산 서열 TLAAPFK(서열번호 1)의 펩타이드 삽입을 포함하는 재조합 AAV9 벡터 캡시드에 대한 아미노산 서열을 도시한다. 삽입 펩타이드는 볼드체임.
도 9B는 VR-III의 S268과 S269 사이에 아미노산 서열 TLAAPFK(서열번호 1)의 펩타이드 삽입을 포함하는 재조합 AAV9 벡터 캡시드에 대한 아미노산 서열을 도시한다. 삽입 펩타이드는 볼드체임.
도 9C는 VR-IV의 S454와 G455 사이에 아미노산 서열 TLAAPFK(서열번호 1)의 펩타이드 삽입을 포함하는 재조합 AAV9 벡터 캡시드에 대한 아미노산 서열을 도시한다. 삽입 펩타이드는 볼드체임.
6.11. 실시예 11: 시험관내 및 생체내에서 변형된 캡시드의 평가
AAV 캡시드 서열은 펩타이드 삽입 또는 유도된 돌연변이유발에 의해 변형되었고 풀링되어 GFP 발현 카세트와 함께 패키징된 바-코드화된 라이브러리를 제공했다. 그런 다음 변형된 벡터를 차세대 시퀀싱(NGS) 및 정량적 PCR을 사용하여 마우스의 생체내 생체분포 뿐만 아니라 시험관내 검정에서 평가했다. AAV.hDyn은 이 풀에서 높은 뇌 형질도입 벡터로서 식별되었고, 이의 형질도입 프로필을 특성화하기 위해 마우스에서 개별 전달 연구로 추가로 평가했다. 또한, 이 벡터의 세포 향성을 이해하기 위해 뇌 절편의 면역조직화학 분석을 수행했다.
6.11.1
실시예 11A
- 혈액 뇌 장벽을 횡단하기 위한 형질도입의 시험관내 테스트
혈액 뇌 장벽을 횡단하는 변형된 캡시드의 능력은 hCMEC/D3 BBB 세포(SCC066, Millipore-Sigma)를 사용하는 시험관내 트랜스웰 검정에서 테스트했다(도 10A 내지 도 10B 참조). 보다 구체적으로, 검정은 본질적으로 문헌[Sade, H. et al. (2014 PLoS ONE 9(4): e96340) A human Blood-Brain Barrier transcytosis assay reveals Antibody Transcytosis influenced by pH-dependent Receptor Binding, April 2014, Vol. 9, Issue 4; 및 Zhang, X., Blood-brain barrier shuttle peptides enhance AAV transduction in the brain after systemic administration, 2018 Biomaterials 176: 71-83]으로부터 본질적으로 개조되었다. 간략하게 말하면, 5×104 hCMEC/D3 세포/cm2를 12-웰 플레이트의 콜라겐 코팅된 트랜스웰 인서트에 파종했다. 각 인서트는 500μL 배지를 함유했고 하단 챔버는 1mL 배지를 함유했다. 배지는 2일마다 교체했다. 상청액은 파종 후 10일(영(0) 시점)에 제거했다. 이 0 시점에서, 상부 인서트 챔버 배지에 1×109 GC의 벡터를 첨가하여 세포를 형질도입시켰다. 형질도입 후 0.5, 3, 6 및 23시간 간격으로 테스트하기 위해 10μL 하부 챔버 상청액 샘플을 제거했다. 각 조건(벡터)을 이반복으로 테스트하고 qPCR을 통해 폴리A에 대한 역가를 3반복으로 측정했다.
도 10A 내지 도 10B는 혈액 뇌 장벽(BBB) 세포층을 횡단하는 AAV.hDyn(아미노산 잔기 588 내지 589 사이에 TLAAPFK(서열번호 1)를 갖는 AAV9)에 대한 시험관내 트랜스웰 검정을 도시한 것이고(도 10A), 결과는 AAV.hDyn(도면에서 역삼각형으로 표시됨)이 AAV9(사각형)보다 빠르게, 뿐만 아니라 AAV2(원형)보다 더 빠르게 더 큰 정도로 검정의 BBB 세포층을 횡단한다는 것을 보여준다(도 10B). 개발된 시험관내 검정은 향상된 BBB 횡단-트래피킹을 예측했으며, 따라서 다른 기관에 대한 표적화를 예측하는 데에도 유사한 검정을 사용할 수 있다.
6.11.2
실시예 11B
- 변형된 캡시드의 형질도입 및 생체분포
6.11.2.1 재료 및 방법
펩시드 변형은 AAV8, AAV9 및 AAVrh.10을 비롯한 광범위하게 사용되는 AAV 캡시드에 대해 VR-IV의 위치 S454 뒤에(표 5a 내지 표 5c) 또는 AAV 캡시드의 VR-VIII 표면 노출된 루프의 위치 Q588 뒤에 다양한 펩타이드 서열을 삽입하고, 뿐만 아니라 아미노산 137(AAV4, AAV4-4 및 AAV5) 또는 아미노산 138(AAV1, AAV2, AAV3, AAV3-3, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9e,rh.10, rh.20, rh.39, rh.74 및 hu.37)(도 7)에서 시작하는 VP2의 개시 코돈 뒤의 삽입에 의해 캡시드 변형을 수행했다(또한, 특정 캡시드 서열에 대해 표 17 참조). 선택된 단일 내지 다중 아미노산 돌연변이도 캡시드의 변형에 사용되었다. 또한, 문헌[Yost et al., Structure-guided engineering of surface exposed loops on AAV Capsids. 2019. ASGCT Annual Meeting; 및 Wu et al., 2000 J. Virology (상기 문헌)]을 참조한다. 이러한 소규모의 임의의 캡시드 변형 후 패키징 효율은 부정적인 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.
특정 변형된 캡시드를 갖는 rAAV는 실시예 5에서 위에서 기술된 바와 같이 Lec2 세포에서 시험관내 형질도입에 대해 테스트했다. AAV9와 비교하여 다음과 같은 변형된 AAV를 Lec2 세포에서의 형질도입에 대해 테스트했다: eB 588 Ad, eB 588 Hep, eB 588 p79, eB 588 Rab, AAV9 588 Ad, AAV9 588 Hep, AAV9 588 p79, AAV9 588 Rab, eB VP2 Ad, eB VP2 Hep, eB VP2 p79, eB VP2 Rab, AAV9 VP2 Ad, AAV9 VP2 Hep, AAV9 VP2 p79, AAV9 VP2 Rab. AAV 캡시드의 정체는 이하 표 5B를 참조한다.
생체분포를 테스트하기 위해, 변형된 AAV를 각각의 개별 캡시드에 상응하는 특정 바코드를 함유하는 eGFP 전이유전자 카세트와 함께 패키징했다. 스크리닝 효율을 증가시키기 위해 새로운 바코드화된 벡터를 풀링하여 마우스에 주입했다.
유전자 변경된 AAV 벡터의 생체분포를 분석하기 위해, GFP를 암호화하는 다양한 벡터를 제조하고 1xPBS + 0.0001% 플루론산(Pluronic acid)에 제형화했다. 모든 벡터는 차세대 시퀀싱(NGS) 라이브러리(풀) 제조를 가능하게 하기 위해 십(10)bp 바코드를 함유하는 시스 플라스미드로 제조했다. 세(3)개의 벡터 풀(연구 1, 연구 2 및 연구 3 벡터)을 표 5A 내지 표 5C에 따라 5마리 암컷 C57Bl/6 마우스의 코호트에 정맥내 주사했다. 투약 부피는 각각 10 mL/kg(0.2 mL/20g 마우스)이었다.
마우스를 1일째 체중에 기초하여 치료군으로 무작위로 나누고, 시작일에 연령은 8 내지 12주였다. 투여 후 15일째에, 동물을 안락사시키고 뇌, 신장, 간, 좌골 신경, 폐, 심장 및 근육 조직을 포함하는 말초 조직을 수집했다. 풀에서 선택된 캡시드를 개별적으로 주사한 연구에서 동일한 프로토콜을 따랐다.
Qiagen의 DNeasy Blood and Tissue 키트(69506)를 사용하여 조직 샘플에서 게놈 DNA(gDNA)를 단리했다. 각 벡터의 바코드 영역은 제조업체(Illumina)에서 권장하는 바와 같이, NGS 및 고유 이중 인덱싱(UDI) 및 다중 시퀀싱 전략을 위해 중첩을 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 시약 나노 및 마이크로 키트 v2(MS-103-1001/1002)를 사용하는 Illumina MiSeq를 사용하여 마우스에서 수집한 샘플당 각각 바코드화된 AAV 벡터의 상대적 풍부도를 결정했다. 따라서, 이하 표 5A 내지 표 5C의 각 벡터 샘플은 최종 데이터 분석 전에 각 판독이 식별되고 분류될 수 있도록 상기에 언급한 바와 같이 바코드화했다. 데이터는 원래 주입된 풀의 AAV 조성을 기준으로 정규화했고, 바코드화된 샘플에 특이적인 프라이머-프로브 조합을 사용하여 qPCR 분석으로부터 수득한 총 게놈 카피 수를 사용하여 정량했다.
[표 5A]
[표 5B]
[표 5C]
풀에서 선택된 캡시드가 개별적으로 주사된 연구에서 qPCR을 사용하여 조직 게놈 DNA μg당 벡터 게놈의 수를 결정했다. 표준 곡선 방법에 따라 eGFP에 특이적인 프라이머-프로브 조합을 사용하여 QuantStudio 5(Life Technologies, Inc.)에서 qPCR을 수행했다(도 12).
특성화를 위해 개별 벡터를 마우스에 주사한 연구에서, 포르말린 고정된 마우스 뇌를 진동 블레이드 마이크로톰(VT1000S, Leica)에서 40μm 두께로 절편화하고 부동 절편을 GFP에 대한 항체로 탐침하여 전달된 벡터의 세포 분포를 관찰했다.
보다 구체적으로, AAV.hDyn을 주사한 마우스의 고정된 뇌는 Vibratome(Leica, VT-1000)을 사용하여 절편화하고 GFP 발현은 항-GFP 항체(AB3080, Millipore Sigma), Vectastain ABC 키트(PK-6100, Vector Labs) 및 DAB 과산화효소 키트(SK-4100, Vector Labs)를 사용하여 평가했다. GFP 발현 세포의 광범위한 분포는 뇌의 피질, 선조체 및 해마에서의 분포를 포함하여 AAV.hDyn을 주사한 마우스에서 뇌 전체에 걸쳐 존재했다. 도 13A 내지 도 13C는 이들 영역으로부터의 이미지를 보여주며 스케일 바는 400um이다(이하에서 논의됨).
6.11.2.2 결과
결과는 도 11, 도 12A 내지 도 12H, 및 도 13A 내지 도 13C에 도시된다.
Lec2 세포 형질도입 검정에 대한 데이터는 제시되지 않는다. AAV9 588 Hep(위치 588 뒤에 삽입된 펩타이드 TILSRSTQTG(서열번호 15) 5를 갖는 AAV9)는 야생형 AAV9보다 상당히 큰 형질도입(4배)을 나타냈고, AAV9 VP2 Ad(위치 138 뒤에 삽입된 펩타이드 SITLVKSTQTV(서열번호 14)를 갖는 AAV9), AAV9 VP2 Hep(위치 138 뒤에 삽입된 펩타이드 TILSRSTQTG(서열번호 15)를 갖는 AAV9), 및 AAV9 VP2 Rab(위치 138 뒤에 삽입된 펩타이드 RSSEEDKSTQTT(서열번호 19)를 갖는 AAV9)는 AAV9에 비해 Lec2 세포의 약간 더 큰 형질도입을 나타냈다. 검정된 다른 AAV는 AAV9보다 낮은 수준의 형질도입을 나타냈다.
도 11은 정맥내 주사 후 마우스 뇌로 전달된 캡시드 풀의 상대적인 풍부도(조성 퍼센트)를 드러내는, 뇌 gDNA의 차세대 시퀀싱(NGS) 분석 결과를 도시한 것이다. 데이터는 주사된 원래 풀의 AAV 조성에 기초하여 정규화했고, eGFP 서열에 특이적인 프라이머-프로브 조합을 사용하여 qPCR 분석으로부터 수득한 총 게놈 카피 수를 사용하여 정량했다. 제시된 데이터는 3가지 다른 실험의 것이다. 점선은 함께 풀링된 벡터를 나타낸다. 부모 AAV9는 표준으로서 사용했고, 각 풀에 포함되었다. "BC" 식별자는 상기 표 5A, 5B 및 5C에 나타낸 바와 같다.
도 12A 내지 도 12H는 암컷 C57Bl/6 마우스에서 AAV.hDyn의 생체내 형질도입 프로필을 도시한 것이고, 이는 미경험 마우스, 또는 뇌(도 12A), 간(도 12B), 심장(도 12C), 폐(도 12D), 신장(도 12E), 골격근(도 12F), 좌골 신경(도 12G) 및 난소(도 12H)에 AAV9 또는 AAV.hDyn이 주사된 마우스에서의 카피 수/gDNA 마이크로그램을 보여주며, 여기서 AAV.hDyn은 AAV9에 비해 증가된 뇌 생체분포를 보여준다. 뇌 게놈 DNA의 μg당 AAV 벡터 게놈 카피는 부모 AAV9 벡터와 비교하여 AAV.hDyn이 투여된 마우스에서 적어도 로그만큼 더 높았다.
도 13A 내지 도 13C는 상기 기술된 면역조직화학 분석에서 분석된 영역에 대한 이미지를 보여준다; 축척 막대는 400μm이다. 도 13A 내지 도 13C는 뇌 전체에 걸친 AAV.hDyn으로부터의 GFP의 분포를 도시한 것이며, 여기서 선조체(도 13A), 해마(도 13B) 및 피질(도 13C)로부터의 뇌 절편에 대한 면역조직화학 염색의 이미지는 변형된 벡터에 의한 뇌의 전체적인 형질도입을 드러냈다.
6.11.2.3 결론
VR-IV 및 VR-VIII의 표면 노출 루프에 삽입에 의해 또는 특정 아미노산 돌연변이에 의해 수행된 AAV 캡시드 변형은 이들의 패키징 효율에 영향을 미치지 않았고 본 명세서에 기술된 생산 시스템에서 유사한 역가를 생성할 수 있었다.
마우스에 대한 AAV.hDyn의 정맥내 투여는 테스트된 다른 변형된 AAV 벡터 및 AAV9보다 바이러스 게놈의 더 높은 상대적 풍부도 및 더 큰 뇌 세포 형질도입을 초래했다.
표면 노출 루프 VR-IV에 상이한 귀소 펩타이드의 삽입에 의해 수행된 AAV 캡시드 변형은 이들의 패키징 효율에 영향을 미치지 않았고 본 명세서에 기술된 생산 시스템에서 유사한 역가를 생성할 수 있었다.
마우스에 대한 AAV9 S454 신장1 및 AAV9 S454 신장1C의 정맥내 투여는 테스트된 다른 변형된 AAV9 벡터 및 부모 AAV9 벡터보다 바이러스 게놈의 더 높은 상대적 풍부도 및 더 큰 신장 세포 형질도입을 초래했다. 마우스에 AAV9 S454 신장1 또는 AAV9 S454 근육1 벡터의 정맥내 투여는 또한 더 낮은 간 세포 형질도입을 초래했다.
6.12.
실시예 12
- TLAVPFK(서열번호 20)를 함유하는 rAAV 캡시드의 작제
도 25는 VR-IV의 S454와 G455 사이에 아미노산 서열 TLAVPFK(서열번호 20)의 펩타이드 삽입을 포함하는 재조합 AAV9 벡터 캡시드에 대한 아미노산 서열을 도시한 것이다.
6.13.
실시예 13
- 사이노몰구스 원숭이에서 rAAV 벡터 풀의 생체분포
조작된 캡시드 및 GFP 전이유전자를 갖는 재조합 AAV 풀의 투여, 생체내 및 사후 관찰, 및 생체분포는 사이노몰구스 원숭이에서 단일 정맥내, 뇌실내 또는 유리체내 주사 후에 평가될 것이다(표 7). 풀은 사이노몰구스 원숭이에게 투여한 후 차세대 시퀀싱(NGS) 분석을 사용한 식별을 허용하는 고유 바코드 식별을 각각 함유하는 다수의 캡시드를 함유한다. 사이노몰구스 원숭이는 큰 동물 종에서 AAV 생체분포 연구 및 인간에 대한 추가 해석을 위한 모델로서 그의 확립된 유용성과 허용성으로 인해 테스트 시스템으로서 선택된다. 이 연구에서 모든 동물은 이전 치료에 대해 미경험인 것이다. 풀은 적어도 표 7에 열거된 조작된 캡시드를 갖는 하기 재조합 AAV를 포함할 수 있다.
6.13.1. 연구 설계
9마리의 암컷 사이노몰구스 동물이 사용될 것이다. 임상 징후 데이터 및 사전스크리닝 항체 역가에 기초한 실험에 적합한 것으로 판단된 동물이 컴퓨터-생성 무작위 수를 사용하여 체중별로 연구 그룹에 배치될 것이다. 3가지 다른 투여 경로가 사용될 것이고 다른 경로와 연관된 생체분포(NGS 및 PCR로 측정)를 평가하기 위해 관련 조직을 수집했다. 3마리의 동물에는 뇌실내(ICV) 용량 투여를 위해 좌측 뇌실에 카테터가 이식될 것이고(그룹 1), 3마리의 동물은 단일 정맥내 주입을 받을 것이며(그룹 2), 3마리의 동물은 단일 유리체강내 주사를 받을 것이다(그룹 3). 2마리의 동물은 대체 동물로서 역할을 할 것이고 필요한 경우 이식될 것이다. 그룹 1의 동물은 적절한 ICV 카테터 배치를 위한 좌표를 결정하기 위해 MRI 스캔을 받을 것이다.
IV 주입은 3 mL/min의 속도로 투여될 것이고, 이어서 IV 카테터로부터 용량을 플러싱하기 위해 0.2 mL의 비히클이 투여될 것이다. 3마리의 정맥내 주사 동물은 풀링된 재조합 AAV의 단일 용량을 4 mL/kg의 부피로 받을 것이다. 총 용량(vg) 및 용량 부피(mL/kg)는 원시 데이터에 기록될 것이다. 문헌 검토 및 비인간 영장류에서의 이전 연구에 기초하여, 1×1013 GC/체중 kg의 IV 용량은 골격근을 비롯한 말초 조직뿐만 아니라 전신 전달로부터 CNS에 원하는 분포를 갖는 데 필요한 것으로 결정되었다.
ICV 이식된 동물은 1mL의 AAV-NAV-GFPbc(느린 주입에 의해, 대략 0.1 mL/분)의 부피로 단일 볼러스 용량을 투여받은 후, 카테터 시스템으로부터 용량을 플러싱하기 위해 0.1mL의 비히클을 투여받을 것이다. ICV 용량은 현재 임상 프로그램을 지원하는 이전의 비인간 영장류 연구의 분포 데이터를 기반으로 한다.
유리체강내(IVT) 주사는 50μL 용량 부피의 볼러스 주사로서 양측에 투여될 것이다.
6.13.2. 관찰 및 검사
임상 징후는 투약 개시 대략 2주 전에 시작하여 연구 기간 내내 계속 적어도 하루에 한 번 기록될 것이다. 임상 효과, 병 및/또는 사망의 징후에 대해 동물을 관찰할 것이다. 연구 책임자 및/또는 기술자의 재량에 따라 동물의 상태에 기초하여 추가 관찰이 기록될 수 있다.
안과 검사는 그룹 3 동물에 대해 용량 투여 전, 그리고 2, 8, 15 및 22일에 수행될 것이다. 모든 동물은 1일 후에 수행되는 안과 검사를 위해 케타민 염산염 IM으로 진정될 것이다. 1일째 검사를 위해, 동물은 주사용 마취로 진정될 것이다(섹션 15.3.3 참조). 눈은 검사 전에 1% 트로피카미드로 확장될 것이다. 검사에는 세극등 생체현미경 검사 및 간접 검안경 검사가 포함될 것이다. 추가로, 투약 전, 용량 투여 직후(약 10 내지 15분) 및 2일 및 22일에 그룹 3 동물에 대해 압평 안압측정이 수행될 것이다.
용량 투여 대략 2주 내지 3주 전에 중화 항체 분석을 위해 말초 정맥으로부터 혈액 샘플(약 3mL)이 수집될 것이다.
6.13.3. 생체분석 샘플 수집
전체 혈액 샘플(약 0.5mL)은 그룹 2(IV)의 동물에서만 용량 투여 전, 용량 투여 후 3시간(±10분), 6시간(±10분) 및 24시간(±0.5시간) 전에 생체분석적 분석(AAV 캡시드 제거)을 위해 말초 정맥으로부터 수집될 것이다. 샘플은 주사기와 바늘을 사용하여 수집하고 2개의 K2 EDTA 튜브로 옮기고 시간을 기록했다.
혈액 샘플(약 5mL)은 금식한 동물로부터 용량 투여전(1일), 8일 및 15일째 및 부검 전(22일)에 PBMC 분석을 위해 말초 정맥으로부터 수집될 것이다. 샘플은 리튬 헤파린 튜브를 사용하여 수득될 것이고 시간을 기록했다.
혈액 샘플은 용량 투여 전(1일, 2mL) 및 부검(22일, 5mL) 전에 생체분석적 분석을 위해 말초 정맥으로부터 수집될 것이다. 샘플은 응혈관에 수집하고 시간을 기록했다. 관은 완전히 응혈될 때까지 실온에서 유지된 다음, 실온에서 약 2400rpm으로 15분 동안 원심분리된다. 혈청이 수확될 것이고, 표지된 바이알(부검 샘플은 1mL 분취량으로 분할됨)에 넣고 액체 질소에서 동결되고 -60℃ 이하에서 보관된다.
CSF(약 1.5mL)는 그룹 1의 동물에서만 대수조 척수 천자로부터 용량 투여 전에 수집될 것이다. CSF(약 2mL)는 모든 동물(그룹 1 내지 3)로부터 대수조 척수 천자로부터 부검 직전에 수집될 것이다. CSF를 수집하기 위한 시도가 이루어질 것이지만, 척수 천자의 실패로 인해 동물(들)로부터 모든 간격마다 샘플이 수집되지 않을 수 있다. 수집 시, 샘플은 처리될 때까지 얼음에 보관될 것이다.
6.13.4. 부검
육안 부검은 사망한 것으로 발견되거나 빈사 상태로 희생된 임의의 동물에서, 그리고 적어도 치료 21일 후(22일)에 예정된 부검에서 수행될 것이다. 사망한 동물을 제외한 모든 동물은 8 mg/kg의 케타민 HCl IM으로 진정되고 이소플루란/산소 혼합물로 유지되며 200 IU/kg의 헤파린 나트륨의 정맥내 볼러스를 제공받을 것이다. 동물은 염수 중 0.001% 아질산나트륨으로 좌심실을 통해 관류될 것이다. 사망한 것으로 발견된 동물은 부검을 받지만 관류되지는 않을 것이다.
다음 조직은 모든 동물(사망한 것으로 발견된 동물 포함)에서 구할 것이다: 골수, 뇌, 맹장, 결장, 후측 신경근 및 신경절, 십이지장, 식도, 시신경이 있는 눈, 육안적 병변, 심장, 회장, 공장, 신장, 무릎 관절, 간, 기관지가 있는 폐, 림프절, 난소, 췌장, 좌골 신경, 골격근, 척수, 비장, 갑상선, 기관 및 미주 신경.
6.13.5. 생체분석적 분석
그룹 2(IV)의 동물로부터 수집된 전체 혈액은 qPCR 및 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 평가될 것이다.
모든 동물로부터 수집된 PBMC 샘플은 필요한 경우 유세포 분석 및 효소-결합 면역 흡수 스폿(ELISpot)에 의해 평가될 것이다.
혈청 및/또는 CSF에서 순환성 중화 항체 및 유리 벡터의 존재는 필요에 따라 ELISA 및 세포 기반 검정에 의해 평가될 것이다.
벡터 카피수 및 조직내 전사체의 수는 정량적 PCR 및 NGS 방법에 의해 조사될 것이다.
6.14. 실시예 14 - 정맥내 투여에 의한 CNS 생체분포 연구
사이노몰구스 원숭이 모델에 정맥내 투여된 rAAV 캡시드 풀의 생체분포를 연구하기 위해 실시예 13에 기술된 것과 같은 절차를 사용하였다. 몇몇 캡시드, 특히 AAV4, AAV5, rh 34, hu 26, rh31 및 hu13은 대부분의 뇌 영역에서 (RA, AAV9 기준 캡시드와 비교하여) 높은 상대적 풍부도로 CNS에서 양호한 확산을 나타냈다. CNS-향성을 나타내는 유리한 캡시드는 후근 신경절(DRG)을 제외한 적어도 하나의 CNS 영역에서 DNA 값의 1.1배 초과 증가를 초래한다.
도 15는 사이노몰구스 원숭이 모델의 전두엽 피질에서 바이러스 게놈의 상대적 풍부도(RA)(투입량에 대해 정규화됨)를 도시하고, 표 8은 도 15에 도시된 가장 높은 RA를 갖는 캡시드에 대한 RA 값을 나열한 것이다.
도 16 및 도 17은 각각 사이노몰구스 원숭이 모델의 해마 및 소뇌에서 바이러스 게놈(투입량에 대해 정규화됨)의 RA를 도시한 것이다. AAV.rh34의 RA는 그래프 왼쪽의 음영 칼럼으로 보여주고 AAV9 기준의 RA는 그래프 중간의 음영 칼럼으로 보여준다. 도 16 및 도 17은 AAV.rh34가 정맥내 투여 풀에서 최고 성능의 캡시드임을 보여준다.
AAV.rh34는 또한 CNS 독성과 관련하여 유리한 프로필을 표시했다. rh34 캡시드는 후근 신경절(DRG)에서 감소된 형질도입을 표시하는 반면, 높은 전두엽 피질 향성(형질도입 효율)을 나타냈다. AAVrh34는 다음과 같이 CNS 영역에서 AAV9에 대한 증가된 RA를 나타낸다: 해마에서 1.8배, 전두엽 피질에서 7.4배, 편도체에서 1.9배, 수질에서 6.0배, 중뇌에서 3.1배, 시상하부에서 1.2배, 시상에서 8.8배, 담창구에서 13배, SNc에서 5.7배, 배측 솔기에서 3.5배, 전장에서 2.0배, 경막에서 13배, 후두엽 피질에서 9배, 및 소뇌에서 9.6배. 또한, AAVrh34는 다음에서 감소된 RA를 나타낸다: DRG: 90 내지 99.5%, 간: 약 99%, 이두근: 약 30%, 좌골 신경: 83% 및 시신경: 17%.
도 18은 FC에서 상위 45개 수행자(AAV9에 대한 최고 RA), 및 경추, 흉부 및 요추 DRG에서 하위 45개 수행자(AAV9에 대한 최저 RA)의 벤다이어그램을 도시하며, AAVrh34 캡시드는 캡시드 풀 중 45개의 각 그룹에 존재하는 유일한 캡시드로서 나타난다. 이들 언급된 특성의 조합을 갖는 AAV 캡시드는 DRG에서 이들의 낮은 형질도입율이 AAV 캡시드를 투여받은 대상체에서 최소한의 신경독성 및/또는 저하된 또는 무시할 수 있는 축삭병증 증상을 갖게 할 정도로 "DRG-친화적" 캡시드로 간주된다.
6.15.
실시예 15
: 뇌실내(ICV) 투여에 의한 CNS 생체분포 연구
ICV 투여와 함께 실시예 13에 기술된 것과 같은 절차를 사용하여 사이노몰구스 원숭이 모델에 대한 rAAV 캡시드 풀의 생체분포를 연구하였다. 몇몇 캡시드는 대부분의 뇌 영역, 특히 AAV4, AAV5, rh 34, hu 26, rh31 및 hu13에서 (RA, AAV9 기준 캡시드와 비교하여) 높은 상대적 풍부도로 CNS에서 양호한 확산을 나타냈다. CNS-향성을 나타내는 유리한 캡시드는 후근 신경절(DRG)을 제외한, 적어도 하나의 CNS 영역에서 DNA 값의 1.1배 초과 증가를 초래하는 DNA 상대적 풍부도 값을 갖는다.
도 19는 사이노몰구스 원숭이 모델의 전두엽 피질에서 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이고, 표 9는 도 19에 나타낸 가장 높은 RA를 갖는 캡시드에 대한 RA 값을 나열한 것이다.
도 20은 사이노몰구스 원숭이 모델의 해마에서 바이러스 게놈의 상대적 풍부도(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이고, 표 10은 도 20에 나타낸 가장 높은 RA를 갖는 캡시드에 대한 RA 값을 나열한 것이다.
도 21은 사이노몰구스 원숭이 모델의 중뇌에서 바이러스 게놈의 상대적 풍부도(RA)(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이고, 표 11은 도 21에 나타낸 가장 높은 RA를 갖는 캡시드에 대한 RA 값을 나열한 것이다.
도 22는 사이노몰구스 원숭이 모델의 소뇌에서 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이고, 표 12는 도 22에 나타낸 가장 높은 RA를 갖는 캡시드에 대한 RA 값을 나열한 것이다.
도 23은 사이노몰구스 원숭이 모델의 경부 DRG에서 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이고, 표 13은 도 23에 나타낸 가장 높은 RA를 갖는 캡시드에 대한 RA 값을 나열한 것이다.
도 24는 사이노몰구스 원숭이 모델의 요추 DRG에서 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이고, 표 14는 도 24에 나타낸 가장 높은 RA를 갖는 캡시드에 대한 RA 값을 나열한 것이다.
도 25는 ICV 투여 후 전두엽 피질, 해마, 중뇌 및 소뇌를 형질도입시키는 최고 성능의 15개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이, AAV6, AAV8.BBB, AAV.rh.46 및 AAV1은 각각 최고 성능 그룹에서 나타나는 유일한 AAV였다.
도 26은 해마-표적화 DRG 친화적 캡시드를 식별하기 위해 해마를 형질도입하는 최고 성능의 45개 캡시드 및 DRG에 대한 최저 형질도입 값을 갖는 45개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이 AAV.hu.60, AAV.rh.21, AAV.PHP.hB, AAV.rh.15, AAV.rh.24, AAV9.W503R, hu.5, AAV9.Q474A 및 AAV.hu.10은 각 그룹에서 나타나는 유일한 AAV였다.
6.16. 실시예 16 - 정맥내(IV) 투여에 의한 근육 및 간 생체분포 연구
IV 투여와 함께 실시예 13에 기술된 것과 같은 절차를 사용하여 사이노몰구스 원숭이 모델에 대한 rAAV 캡시드 풀의 근육 및 간 생체분포를 연구했다.
도 27은 근육 표적화 간-친화적 캡시드를 식별하기 위해, 심장, 이두근 및 비복근을 형질도입하는 최고 성능의 40개 캡시드 및 간에 대해 가장 낮은 형질도입 값을 갖는 40개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이다. 다이어그램에 표시된 바와 같이, AAV.PHPeB.VP2Herp는 각 그룹에서 나타나는 유일한 AAV였다.
도 28은 심장, 이두근 및 비복근을 형질도입하는 최고 성능의 15개 캡시드의 벤다이어그램을 도시한 것이고, 표 15는 다이어그램의 3개의 상이한 세포에서 최고 성능의 캡시드에 대한 목록을 제공한다.
도 29A 및 도 29B는 각각 사이노몰구스 원숭이 모델의 비복근 및 간에서 바이러스 게놈의 RA(투입량에 대해 정규화됨)를 도시한 것이다.
표 16은 사이노몰구스 원숭이 모델 및 MDX 마우스 모델에 대한 RA 값에 의한 각 캡시드의 순위를 제공한다. 캡시드는 동물간 가변성을 감소시키기 위해 각 동물에서 서로 상대적으로 순위를 매겼다. 비복근, TA, 심장, 이두근 및 삼두근은 MDX 마우스 모델의 순위에 70%를 기여했으며 비복근, 심장 및 이두근은 사이노몰구스 원숭이 모델의 순위에 70%를 기여했다. 간 RA는 각 동물의 순위에 30%를 기여했다. 전체 순위는 각 동물의 순위에 50% 가중치를 부여하여 결정했다.
6.17.
실시예 17
: 캡시드 라이브러리의 정맥내 투여 후 간 탈표적화 생체분포 연구
풀링된 바코드화된 벡터를 IV 주사에 의해 NHP로 투여했다. 풀링된 혼합물은 범용 CAG 프로모터로부터의 GFP 리포터 유전자를 발현하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 천연 분리물 및 조작된 AAV를 포함하는 118개의 상이한 AAV 캡시드로 이루어진다. 정맥내 연구는 하기 실시예 13 및 14에 기술된 프로토콜을 따랐다. 몇몇 캡시드는 간을 "탈표적화"하는 향성을 나타냈으며, 이와 같이 돌연변이된 캡시드는 부모 캡시드(AAV9)보다 간 조직에서 더 낮은 풍부도를 나타냈다, 예를 들어, AAV8.BBB.LD(A269S, 498-NNN/AAA-500), AAV9.BBB.LD(S263G/S269T/A273T, 496-NNN/AAA-498), AAV9.496-NNN-498, AAV9.496-NNN-498.W503R, AAV9.W503R 및 AAV9.Q474A. NNN/AAA 돌연변이를 갖는 AAV8 캡시드는 전반적으로 대략 간에서 형질도입의 11배 저하, 및 간에서 전사체 발현의 42배 저하를 나타낸다. NNN/AAA 및 W503R 돌연변이를 갖는 AAV9 캡시드는 간에서 형질도입의 대략 400배 저하를 나타내고, 간에서 전사체의 발현 제로를 초래한다. 일부 경우에는 이러한 변형된 벡터의 뇌 분포도 약화되었다. AAV8.BBB.LD는 추가로 비복근에서 높은 수준의 형질도입을 나타낸다.
도 31은 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP에서, 다양한 조직에서의 부모 AAV9 캡시드와 비교하여 선택된 "간-탈표적화"(LD) 벡터의 생체분포를 도시한 것이다. 도 32는 캡시드 라이브러리의 IV 투여 후 NHP에서, 다양한 조직에서의 부모 AAV8 캡시드와 비교하여 선택된 LD 벡터의 생체분포를 도시한 것이다.
연구는 또한 IV 캡시드 라이브러리 투여 3시간 후 및 24시간 후 각 바코드(및 이에 따라 캡시드)의 풍부도 사이의 상대적 풍부도(투입량에 대해 조정됨, 1로 정규화됨)의 변화를 보여준다(3시간째의 RA/24시간째의 RA). 개별 동물은 상이한 모양의 데이터 점(3마리 동물 합계)으로 표시된다(도 33A 및 도 33B).
배수 변화 >1는 캡시드가 투약 후 3시간째에 비해 24시간째에 혈액에 존재하는 총 캡시드 "풀"의 더 낮은 백분율을 구성한다는 것을 나타낸다(즉, 더 빠른 혈액 제거). 배수 변화 <1은 캡시드가 투약 후 3시간째에 비해 24시간째에 혈액에 존재하는 총 캡시드 "풀"의 더 큰 백분율을 구성한다는 것을 나타낸다(즉, 더 느린 제거). 역사적으로, 더 느린 제거는 더 낮은 간 형질도입/간 탈표적화와 상관성이 있다.
혈액 체류의 증가에 의해 표시되는 바와 같이, 주어진 동물에서 주어진 캡시드에 대한 풍부도 변화의 도시를 플로팅했다. AAV9의 기준선 체류에 대한 혈액 체류의 배수 증가를 계산함으로써, 예를 들어, 표시(도 34A 및 도 34B)는 선택 캡시드의 풍부도 값의 변화를 부모 캡시드의 풍부도의 변화(부모 캡시드를 1로 설정)와 비교한다. 따라서, AAV9 캡시드에 대한 다양한 돌연변이는 순환 중의 체류를 3 내지 5배 증가시킨다(예를 들어, 도 34A 참조).
6.18
실시예 18
-
mdx
마우스에 대한 캡시드 풀의 정맥내(IV) 투여에 의한 근육, 간 및 뇌 생체분포의 연구
풀링된 바코드화된 벡터를 IV(꼬리 정맥) 주사에 의해 mdx 마우스에 투여했다. 풀링된 혼합물은 범용 CAG 프로모터로부터 GFP 리포터 유전자를 발현하는, 본 명세서에 기술된 바와 같은, 천연 분리물 및 조작된 AAV를 포함하는 118개의 상이한 AAV 캡시드로 이루어진다. IV 연구에 이어, 하기 실시예 12 및 16에 기술된 것과 유사한 프로토콜을 따랐다.
3주차에 희생 시, 조직을 수거하고 샘플을 RNAlater가 있는 튜브에 수집하고(제조업체의 지침에 따라), DNA 및 RNA 분석(풀에서 각 벡터의 생체분포)이 NGS에 의해 수행될 때까지 -80℃에서 급속 동결했다(도 36A 내지 도 36H 참조).
6.19 캡시드 아미노산 서열
표 17은 본 명세서에 기술된 연구에서 기술 및/또는 사용된 특정 조작된 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 제공한다. 이종 펩타이드 및 아미노산 치환은 회색 음영으로 표시된다.
7. 등가물
본 발명은 특정 실시형태를 참조하여 상세히 설명되지만, 기능적으로 동등한 변형이 본 발명의 범위 내에 있음을 이해할 것이다. 실제로, 본 명세서에 제시되고 기술된 것 외에 본 발명의 다양한 수정은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 기술분야의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 수정은 첨부된 청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 기술분야의 기술자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서의 논의는 해당 기술이 직면한 문제의 본질에 대한 더 나은 이해를 제공하며 어떤 식으로든 선행 기술에 대한 인정으로 해석되거나, 본 명세서에 모든 참고문헌의 인용이 이러한 참고문헌이 본 출원에 대한 "선행 기술"을 구성한다는 인정으로서 해석되지 않아야 한다.
본 명세서에 인용된 특허 출원 및 간행물을 포함하는 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 모든 목적에 대해 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 본 발명의 많은 수정 및 변형은 본 기술분야의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기술된 특정 실시형태는 단지 예로서 제공되며, 본 발명은 이러한 청구범위가 표제화된 등가물의 전체 범위와 함께, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENXBIO INC.
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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<213> Artificial Sequence
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35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 52
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35
<210> 53
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 53
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 54
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 55
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<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 56
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20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 57
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1 5 10 15
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 58
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 59
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<211> 738
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 80
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1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
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65 70 75 80
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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
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115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145 150 155 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165 170 175
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180 185 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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1 5
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
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<210> 84
<211> 644
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (434)..(434)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 84
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<211> 735
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
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275 280 285
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct; capsid sequence
<400> 86
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
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Asn Leu
Claims (42)
- 야생형 또는 미조작된 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 AAV 캡시드 단백질로서, 상기 rAAV 캡시드 단백질은 S263G/S269R/A273T 치환, G266A 치환, N272A 치환, W503R 치환, Q474A 치환, 496-NNN/AAA-498 치환을 갖는 AAV9 캡시드 단백질(서열번호 67)이거나, Q588과 A589, S268과 S269, 또는 S454와 G455 사이에 펩타이드 TLAAPFK(서열번호 1)의 삽입을 갖거나, 또는 A269S 치환 또는 498-NNN/AAA-500 치환을 갖는 AAV8 캡시드(서열번호 6)이거나, 또는 또 다른 AAV 유형 캡시드의 캡시드 단백질에 상응하는 치환 또는 펩타이드 삽입을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제1항에 있어서, AAV8 캡시드 단백질(서열번호 66)에 대해 498-NNN/AAA-500 아미노산 치환 또는 AAV9 캡시드 단백질(서열번호 67)에 대해 496-NNN/AAA-498 아미노산 치환, 또는 또 다른 AAV 유형 캡시드의 캡시드 단백질에 상응하는 치환을 추가로 포함하는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, AAV8.BBB.LD 캡시드(서열번호 27), AAV9.BBB.LD 캡시드(서열번호 29), AAV9.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 31), AAV9.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 32), AAV9.W503R 캡시드(서열번호 33), AAV9.Q474A 캡시드(서열번호 34), AAV9.N272A.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 91) 또는 AAV9.N266A.496-NNN/AAA-498 캡시드(서열번호 92)인, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 또는 삽입이 AAVPHP.eB 캡시드, 단백질을 포함하는 AAV9 캡시드에 있거나, 또는 AAV8 캡시드에 있는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 AAV 유형 캡시드는 AAV rh.34, AAV4, AAV5, AAV hu.26, AAV rh.31, AAV hu.13, AAV hu.26, AAV hu.56, AAV hu.53, AAV7, AAV rh.10, AAV rh.64.R1, AAV rh.46 또는 AAV rh.73인 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 야생형 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, CNS 세포로의 증가된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제6항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 야생형 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 간 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 후근 신경절 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 말초 신경 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 골격 및/또는 심장 근육 세포로의 증가된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 AAV 캡시드 단백질.
- 제10항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 간 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환 또는 펩타이드 삽입이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해 CNS 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터에 혼입된 경우, 상기 rAAV 벡터는 상기 아미노산 치환이 없는 상응하는 캡시드 단백질을 혼입시킨 rAAV 벡터에 비해, 후근 신경절 세포로의 감소된 표적화, 형질도입 또는 게놈 통합을 갖는, 재조합 캡시드 단백질.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 rAAV 캡시드 단백질을 암호화하거나, 이와 적어도 80% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 암호화하고 상기 캡시드의 생물학적 활성을 유지하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
- 제14항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 rAAV 캡시드 단백질을 암호화하는, 핵산.
- 제14항 또는 제15항의 핵산을 발현하여 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터를 생성할 수 있는, 패키징 세포.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 캡시드 단백질을 포함하는, rAAV 벡터.
- 제17항에 있어서, 상기 근육 및/또는 CNS 세포에서 발현을 위해 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자(transgene)를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
- 제17항 또는 제18항의 rAAV 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 세포로 전이유전자를 전달하는 방법으로서, 제17항 또는 제18항의 rAAV 벡터와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 전이유전자는 상기 세포로 전달되는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 세포는 CNS 세포, 심근 세포 또는 골격근 세포인, 방법.
- 필요로 하는 대상체의 표적 조직으로 전이유전자를 전달하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제17항 또는 제18항의 rAAV 벡터를 단계를 포함하되, 상기 전이유전자는 상기 표적 조직으로 전달되는 것인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 전이유전자는 근육 질환 또는 심장 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 심근 또는 골격근인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 rAAV는 정맥내 또는 근육내를 포함하는 전신으로 투여되는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 전이유전자는 CNS 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 CNS인, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 rAAV는 척수강내 또는 뇌실내로 투여되는, 방법.
- 세포로 전이유전자를 전달하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 제17항 또는 제18항의 rAAV 벡터를 포함하고, 상기 전이유전자는 상기 세포로 전달되는, 약제학적 조성물.
- 필요로 하는 대상체의 표적 조직으로 치료용 단백질을 암호화하는 전이유전자를 전달하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 제17항 또는 제18항의 rAAV 벡터를 포함하고, 상기 전이유전자는 상기 표적 조직으로 전달되는, 약제학적 조성물.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 치료용 단백질은 근육 질환 치료제 또는 심장 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 심근 또는 골격근인, 약제학적 조성물.
- 제27항 내지 제29항에 있어서, 상기 rAAV는 기준 AAV 캡시드에 비해 심근 또는 골격근 세포에서 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 큰 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
- 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 간에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
- 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 후근 신경절 세포에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
- 제27항, 제28항 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료용 단백질은 CNS 질환 치료제이고 상기 표적 조직은 CNS인, 약제학적 조성물.
- 제27항, 제28항, 제32항 또는 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 기준 AAV 캡시드와 비교하여 CNS 세포에서 적어도 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 큰 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
- 제27항, 제28항, 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 간에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
- 제27항, 제28항, 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 상기 기준 AAV 캡시드와 비교하여 후근 신경절 세포에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 더 적은 형질도입을 나타내는, 약제학적 조성물.
- 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 기준 캡시드는 AAV8 또는 AAV9인, 약제학적 조성물.
- 치료를 필요로 하는 대상체의 CNS 장애를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 제27항, 제28항, 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 치료를 필요로 하는 대상체의 근육 장애를 치료하는 방법으로서, 제27항 내지 제31항 및 제37항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 전이유전자는 표 1A 또는 표 1B로부터 선택되는, rAAV 벡터.
- 제20항 또는 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 표 1A 또는 표 1B로부터 선택되는, 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 전이유전자는 표 1A 또는 표 1B로부터 선택되는, 전이유전자를 전달하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
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