KR20230078690A - 가스트린 방출 펩타이드 수용체 길항제를 포함하는 접합체 또는 이의 염 및 이의 용도 - Google Patents

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타니아 스탈론스
에이미 웡
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Abstract

본 발명은 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이며, 접합체는 다음 화학식의 접합체이다: C-L-A, (여기서 C는 킬레이터이고, L은 킬레이터에 공유 결합된 링커이고, A는 링커에 공유 결합된 가스트린 방출 펩타이드 수용체 길항제임), 다음을 특징으로 함:
- 킬레이터는 다음 화학식의 킬레이터이고:
Figure pct00025

여기서 점선은 링커에 대한 공유 결합을 나타내고;
- 링커는 다음 식의 링커이고: -β-Ala-β-Ala-;
- 가스트린 방출 펩타이드 수용체 길항제는 다음 아미노산 서열을 갖는다: -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2.
본 발명은 또한 접합체 또는 이의 염의 용도에 관한 것이다.

Description

가스트린 방출 펩타이드 수용체 길항제를 포함하는 접합체 또는 이의 염 및 이의 용도
본 발명은 방사성의약품 분야에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 가스트린 방출 펩타이드 수용체(GRPR) 길항제를 포함하고, 방사성의약품 제조를 위해, 또는 방사성핵종으로 표지되면, 방사성의약품으로서 사용될 수 있는 접합체 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
본 발명은 또한 조성물, 방사성의약품 및 접합체 또는 이의 염을 포함하는 부품 키트(kit-of-parts)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 방사성의약품을 제조하기 위한 비표지 접합체 또는 이의 염 및 부품 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GRPR이 과발현되는 암, 더욱 구체적으로 전립선암, 유방암 및 폐암의 생체내 영상화 또는 치료에 사용하기 위한 방사성의약품에 관한 것이다.
전립선암은 피부암을 제외하고 남성에게 가장 흔한 암이며 미국 남성의 암 사망 원인 중 두 번째이다.
현재 전립선암 환자에게 암세포의 유형 그리고 암의 진행 단계, 환자의 연령 및 전반적인 건강 상태에 따라, 능동 감시, 수술, 외부 방사성 요법, 냉동 요법, 호르몬 요법, 고강도 집중 초음하 및 화학 요법과 같은 여러 치료 옵션이 제안된다.
그럼에도 불구하고, 개선된 요법에 대한 강한 요구가 있다.
전립선암에 대한 개선된 요법의 한 가지 유망한 방법은 표적 방사성의약품, 즉 방사성핵종으로 표지되고, 정상적인 건강한 조직을 피하면서 암세포에 독성 수준의 방사선을 전달할 수 있도록 암세포를 표적화하는 약물의 사용이다.
전형적으로, 전립선암에 대해 설계된 방사성의약품은 전립선암 세포에 대해 높은 친화도를 갖는 벡터 분자를 포함하고, 가능하게는 링커(또는 스페이서)를 통해, 방사성핵종이 킬레이트화에 의해 보유되는 킬레이터에 연결된 접합체이다.
봄베신(BBN) 수용체 아형 II로도 알려진 GRPR은 전립선 종양뿐만 아니라 유방 및 폐 종양을 포함한 여러 인간 종양에서 과발현되는 것으로 나타났다. GRPR의 과발현은 원발성 전립선암의 63 %-100 % 및 림프 및 뼈 전이의 50 % 이상에서 발견되었다. GRPR 밀도는 전립선 비대증보다 전립선 암종에서 26 배 더 높은 것으로 보고되었다.
따라서, GRPR-양성 종양, 특히 전립선암을 표적화하기 위한 다양한 접합체가 제안되었다.
최근의 보고는 GRPR 길항제가 접합체 GRPR 작용제보다 우수한 특성을 가지고 있어, 생리학적 GRPR-양성 비표적 조직에서 더 높은 종양 흡수 및 더 낮은 축적을 제공함을 보여주었다. 더욱이, GRPR 작용제는 그들의 생리학적 활성에 의해 매개되는 부작용을 환자에게 유발하는 것으로 나타났다.
따라서, 벡터 분자로서 GRPR 작용제가 아닌 GRPR 길항제를 포함하는 접합체의 개발이 각별한 관심이 끌고 있다.
이러한 접합체의 예는 예를 들어 유럽 특허 출원 번호 2 252 628에 개시된다.
그러나, 이 참고문헌의 교시가 생각하도록 유도할 수 있는 것과 대조적으로, GRPR 길항제 기반 접합체의 약동학적 및 종양 표적화 특성이 킬레이터의 선택, 링커의 선택 및 GRPR 길항제의 선택에 누적적으로 의존하기 때문에, GRPR 양성 종양을 치료하기 위한 표적화된 방사성의약품으로서 실제로 사용될 수 있는 GRPR 길항제 기반 접합체의 설계가 주요 도전 과제이다.
발명의 요약
본 발명은 비표적 기관에서의 낮은 흡수 및 신속한 제거와 조합하여 전립선 종양과 같은 GRPR 양성 종양에서 예상하지 못한 높은 지속적 흡수를 야기하는 접합체 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 정확하게 제안하도록 제시된다.
접합체는 다음 화학식을 충족한다: C-L-A, 여기서 C는 킬레이터이고, L은 킬레이터에 공유 결합된 링커이고, A는 링커에 공유 결합된 GRPR 길항제이고, 다음을 특징으로 한다:
- 킬레이터는 DOTAM (1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸)으로 알려진 킬레이터에 대항하며 다음 화학식의 킬레이터이다:
Figure pct00001
여기서 점선은 링커에 대한 공유 결합을 나타내고;
- 링커는 다음 식의 링커이고: -β-Ala-β-Ala-;
- GRPR 길항제는 다음 아미노산 서열의, JMV 594로 알려진 펩타이드이다: -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 1).
다시 말해서, 접합체는 다음 화학식에 응답한다:
Figure pct00002
이전의 내용과 이후의 내용에서:
- β-Ala는 3-아미노프로판산으로도 알려진 베타-알라닌을 지칭하고;
- DPhe, Gln, Trp, Ala, Val, Gly, His 및 Leu는 각각 α-아미노산 페닐알라닌, 글루타민, 트립토판, 알라닌, 발린, 글리신, 히스티딘 및 류신을 지칭하고, 페닐알라닌은 D-형인 한편 글루타민, 트립토판, 알라닌, 발린, 히스티딘 및 류신은 L-형이고; 반면
- Sta는 (3S,4S)-4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산으로도 알려진 다음 화학식의 γ-아미노산 스타틴을 지칭한다:
Figure pct00003
.
또한, 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적 적용에서 유용성을 제공하는 범위 내에서 독성 프로파일을 보유하는 염을 지칭한다.
적합한 약제학적으로 허용되는 것은 특히 유리 산 또는 유리 염기의 부가염일 수 있다.
산 부가염은 무기산 또는 유기산으로부터 제조될 수 있다. 적절한 무기산은 염산, 브롬화수소산, 아이오딘화수소산, 질산, 탄산, 황산 및 인산을 포함하는 반면, 적절한 유기산은 지방족, 지환족, 방향족, 방향지방족, 헤테로환, 카르복실산 및 설폰 유기산으로부터 선택될 수 있고, 이의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 석신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 푸마르산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 4-하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산(파모산), 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 판토텐산, 트리플루오로메탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 설파닐산, 사이클로헥실아미노설폰산, 스테아르산, 알긴산, β-하이드록시부티르산, 살리실산, 갈락타르산 및 갈락투론산을 포함한다.
염기 부가염은 예를 들어 예를 들어 칼슘, 마그네슘, 포타슘, 소듐 및 아연 염과 같은 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 전이 금속 염을 포함하는 금속 염 또는 예를 들어 N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민(N-메틸글루카민) 및 프로카인과 같은 염기성 아민으로부터 제조된 유기 염이다.
방사성의약품으로서 사용하기 위해, 접합체 또는 이의 염은 킬레이터에 의해 킬레이트화된 방사성핵종을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 식염수, 금속이 없는 물, 아스코르브산, 에탄올, 폴리소르베이트 80(즉 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트, 상표명 Tween™ 80으로 판매됨), 암모늄 아세테이트 완충액과 같은 완충액 또는 이들의 혼합물과 같은 약제학적으로 허용되는 매질에 비표지 형태의(즉 어떠한 방사성핵종도 없는) 접합체 또는 이의 염을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 아스코르브산 및 에탄올은 산화방지제로서 유리하게 작용하는 한편 폴리소르베이트 80은 유리하게 끈적임을 감소시킨다.
본 발명은 또한 위에 언급한 것과 같은 약제학적으로 허용되는 매질에 비표지 형태의(즉 킬레이터에 의해 킬레이트화된 방사성핵종을 포함하는) 접합체 또는 이의 염을 포함하는, 사용하기 위해 준비된 방사성의약품에 관한 것이다.
본 발명은 또한 방사성의약품 제조에 사용될 수 있고 적어도 다음을 포함하는 부품 키트에 관한 것이다:
- 비표지 형태의 접합체 또는 이의 염이 들어 있는 제1 용기; 및
- 전형적으로 염(클로라이드, 아세테이트, …) 형태의 방사성핵종이 들어 있는 제2 용기.
부품 키트에서, 접합체 또는 이의 염 및 방사성핵종은 임의의 적절한 형태, 예컨대 건조 형태(예를 들어 분말), 액체 형태, 즉 위에 언급한 것과 같은 약제학적으로 허용되는 매질 중의 용액 또는 동결 형태일 수 있다.
그 자체로 알려진 바와 같이, 키트는 다음을 추가로 포함할 수 있다:
- 하나 이상의 시약 및/또는 하나 이상의 용매 또는 희석제, 예컨대 식염수, 금속이 없는 물, 생물학적 완충액 등, 및/또는
- 방사성 의약품 제조 및/또는 사용 지침이 있는 소책자.
본 발명은 또한 방사성의약품 제조를 위한 비표지 접합체, 이의 염 또는 부품 키트의 용도에 관한 것이고, 이 용도는 접합체 또는 이의 염의 킬레이터에 의한 방사성핵종의 킬레이트화를 포함한다.
선행하는 것에서, 방사성핵종은 바람직하게는 납 방사성핵종, 특히 방사성의약품이 생체내 영상화 목적을 위해 사용하도록 의도되는 경우 203Pb 또는 방사성의약품이 치료 목적을 위해 사용하도록 의도되는 경우 212Pb이다.
본 발명은 또한 예를 들어 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)에 의한 생체내 영상화 또는 가스트린 방출 펩타이드 수용체가 과발현되는 암의 치료에서 사용하기 위한 방사성의약품에 관한 것이다.
이러한 용도는 적절한 용량의 방사성의약품을 영상화되거나 치료될 환자에게, 전형적으로 정맥내로 투여하고, 생체내 영상화의 경우에는, 환자에게 영상화를 적용하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 암은 전이가 있거나 없는 전립선암, 유방암 또는 폐암, 특히 전립선암이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음 설명에 대한 보충을 읽으면 더 분명해질 것이다.
명백히, 설명에 대한 이러한 보충은 단지 본 발명의 목적을 설명하기 위해 제공되며 어떠한 경우에도 상기 목적의 제한을 구성하지 않는다.
도 1은 PC-3 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 14 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 본 발명의 접합체로 이루어진 생체분포 연구의 결과를 도시하고; 결과는 마우스에서 212Pb-접합체 용량의 주사 후 1 시간, 4 시간 및 24 시간에 마우스의 장기에서 발견되는 바와 같은, %ID/g로 표시된 장기 그램당 주입된 용량 퍼센트로 표현된다.
도 2A 내지 2F는 종양이 없는 면역적격 마우스에서 28 ng당 10 μCi의 비방사능에서 203Pb로 표지된 본 발명의 접합체로 이루어진 생체분포 연구의 결과를 도시하고; 결과는 마우스에서 203Pb-접합체 용량의 주사 후 5 분(도 2A), 30 분(도 2B), 1 시간(도 2C), 4 시간(도 2D), 24 시간(도 2E) 및 48 시간(도 2F)에 마우스의 장기에서 발견되는 바와 같은, %ID/g로 표시된 장기 그램당 주입된 용량 퍼센트로 표현된다.
도 2G는 t로 표시되고 시간으로 표현된, 마우스에서 203Pb-접합체 용량의 주사 후의 시간의 함수로서, 종양이 없는 면역적격 마우스에서 %ID로 표시된 주사된 용량 퍼센트로 표현된 203Pb로 표지된 본 발명의 접합체의 소변, 대변 및 총 배설물을 도시한다.
도 3A 내지 3C는 피하 PC-3 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 상이한 비방사능에서 212Pb로 표지된 본 발명의 접합체로 이루어진 생체분포 연구의 결과를 도시한다; 도 3A는 28 ng당 10 μCi와 동일한 비방사능의 1 회 212Pb-접합체 용량을 투여받은 그룹 A로 표시된 마우스의 첫 번째 그룹에 해당하고; 도 3B는 140 ng당 10 μCi와 동일한 비방사능의 1 회 212Pb-접합체 용량을 투여받은 그룹 B로 표시된 마우스의 두 번째 그룹에 해당하는 한편 도 3C는 280 ng당 10 μCi와 동일한 비방사능의 1 회 212Pb-접합체 용량을 투여받은 그룹 C로 표시된 마우스의 세 번째 그룹에 해당하고; 각 도면에서, 결과는 마우스에서 212Pb-접합체 용량의 주사 후 1 시간 및 4 시간에 마우스의 장기에서 발견되는 바와 같은, %ID/g로 표시된 장기 그램당 주입된 용량 퍼센트로 표현된다.
도 4A는 피하 PC-3 종양을 보유하고 14 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 본 발명의 접합체의 단지 1 회 용량(1 사이클), 또는 14 일 간격으로 동일한 접합체의 3 회 용량(3 사이클), 또는 멸균 식염수(대조군)을 투여받은 무흉선 누드 마우스의 %로 표현된 생존율을, t로 표시되고 주로 표현된 마우스에서 암세포의 주사 후 시간의 함수로 도시한다.
도 4B는 피하 PC-3 종양을 보유하고 14 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 본 발명의 접합체의 단지 1 회 용량(1 사이클), 또는 14 일 간격으로 동일한 접합체의 3 회 용량(3 사이클), 또는 멸균 식염수(대조군)을 투여받은 무흉선 누드 마우스에 의해 제시된 V로 표시되고 mm3로 표현된 평균 종양 부피를, t로 표시되고 주로 표현된 마우스에서 암세포의 주사 후 시간의 함수로 도시한다.
도 5는 PC-3 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 280 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 본 발명의 접합체의 생체분포를, 킬레이터로서 DOTA를 포함하는 점에서만 본 발명의 접합체와 상이한, 동일한 비방사능에서 212Pb로 또한 표지된 접합체와 비교하는 것을 목표로 하는 비교 연구의 결과를 도시하고; 결과는 마우스에서 212Pb-접합체 용량의 주사 후 1 시간, 4 시간 및 24 시간에 마우스의 장기에서 발견되는 바와 같은, %ID/g로 표시된 장기 그램당 주입된 용량 퍼센트로 표현되고; 이 도면에서, 본 발명의 접합체는 212Pb-DOTAM-접합체로 표시되는 한편 비교 접합체는 212Pb-DOTA-접합체로 표시된다.
도 6은 피하 PC-3 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 3 글루탐산 잔기의 사슬로 구성된 링커를 포함하는 점에서만 본 발명의 접합체와 상이한, 10 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 접합체의 생체분포를 평가하는 것을 목표로 한 비교 연구의 결과를 도시하고; 결과는 마우스에서 접합체 용량의 주사 후 4 시간에 마우스의 장기에서 발견되는 바와 같은, %ID/g로 표시된 장기 그램당 주입된 용량 퍼센트로 표현된다.
도 7은 종양이 없는 면역적격 마우스에서 4-아미노-(1-카르복시메틸)피페디닐 기로 구성된 링커를 포함한다는 점에서만 본 발명의 접합체와 상이한, 4.1 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 접합체의 생체분포를 평가하는 것을 목표로 한 비교 연구의 결과를 도시하고; 결과는 마우스에서 접합체 용량의 주사 후 4 시간에 마우스의 장기에서 발견되는 바와 같은, %ID/g로 표시된 장기 그램당 주입된 용량 퍼센트로 표현된다.
발명의 상세한 설명
I - 본 발명의 비표지 접합체의 제조 :
I.1 - 펩타이드 서열 β-Ala-β-Ala-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH 2 (SEQ ID NO: 2)의 제조:
0.1 mmol 규모로 펩타이드 서열: β-Ala-β-Ala-DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)의 합성을 위해 자동 마이크로웨이브 펩타이드 합성기(Biotage™Initiator + Alstra™ - BIOTAGE™)를 사용했다.
표준 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 화학을 활성화제로서 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플우로로포스페이트(HBTU) 및 N-하이드록실벤조트리아졸(HOBt)과 함께 사용했다.
아미드화된 C-말단을 제공하기 위해 링크 아미드 수지를 사용했다.
아미노산 류신, 발린 및 β-알라닌은 이중 커플링되었다. 이중 커플링된 것 이외에도, 두 개의 β-알라닌은 이중 탈보호되었다.
히스티딘의 라세미화 및 스타틴의O-아실화를 피하기 위해 48 ℃에서 커플링된 히스티딘과 스타틴을 제외하고 모든 아미노산이 75 ℃에서 커플링되었다.
I.2 - 펩타이드 서열에 대한 DOTAM의 접합 :
DOTAM은 다음 화학식의 DOTAM 일산을 사용하여 수지에 결합된 펩타이드 서열에 접합되었다:
Figure pct00004
이를 수행하기 위해, 둥근 바닥 플라스크에서, 2.25 당량의 DOTAM 일산(0.225 mmol; 90.5 mg), 2.25 당량의 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5,-b]피리디늄3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU; 0.225 mmol; 85.5 mg) 및 6.75 당량의 디이소프로필에틸아민(DIEA; 0.675 mmol; 120 μL)를 3 mL의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시키고 혼합물을 30 분 동안 교반하여 DOTAM 일산을 먼저 예비활성화했다.
이후, 수지에 결합된 펩타이드 서열을 혼합물에 첨가하고 반응물을 밤새 회전시켰다.
접합의 완료 후, 반응 매질을 프릿 깔때기로 여과하여 과잉 시약을 제거하고 잔류물을 DMF로 세 번, 메탄올로 세 번, DCM으로 세 번 세척했다.
I.3 - 수지로부터 접합체의 절단 :
접합체는 95 % (v/v) 트리플루오로아세트산(TFA), 2.5 % (v/v) 트리이소프로필실란(TIPS) 및 2.5 % (v/v) H2O로 구성된 칵테일에 3 mL의 최종 부피까지 현탁시켜 수지로부터 절단되었다.
반응물을 둥근 바닥 플라스크에서 3 시간 동안 회전시킨 후 반응 매질을 프릿 깔대기로 여과했다. 질소 가스를 사용하여 TFA를 증발시키고 차가운 에틸 에테르를 사용하여 접합체를 침전시켰다. 이후 플라스크를 4500 rpm에서 10 분 동안 원심분리하고 에틸 에테르 상청액을 제거했다. 이후 펠렛을 밤새 동결 건조하여 과잉 에틸 에테르를 제거했다.
I.4 - 접합체의 정제 :
구배로서 다음을 갖는 PHENOMENEX™Luna™ 10 μm C18(2) 분취용 컬럼(250 x 50 mm)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 접합체를 정제했다:
- t = 0-5 분: 1 % 용리액 B(아세토니트릴(ACN) 중의 0.1 % TFA)를 포함하는 용리액 A(물 중의 0.1 % TFA);
- t = 5-45 분: 용리액 A에서 1 %로부터 75 %로 선형으로 상승하는 용리액 B.
순수한 접합체는
Figure pct00005
24 분의 체류 시간을 가졌다. 수집된 피크를 회전 증발에 보내어 유기 용매를 제거하고 동결 건조했다.
따라서 구배로서 다음을 사용하는 RESTREK™ Ultra IBD 3 μm 분석 컬럼(150 x 2.1 mm)을 사용하는 AGILENT™ 1100 Series LC-MS로 결정하여 순도 > 95 %를 갖는 13 mg의 접합체를 얻었다:
- t = 0-2 분: 용리액 B(100 % H2O);
- t = 2-17 분: 용리액 A(ACN 중의 0.1 % TFA)에서 100 %로부터 0 %로 선형으로 감소하는 용리액 B.
순수한 펩타이드의 질량은 HEWLETT PACKARD™ 1100 Series MSD와 결합된 AGILENT™1100 Series LC-MS로 확인되었다: 예상 1638.91; 관찰 1638.7.
접합체는 이후의 납 표지를 위해 -80 ℃에서 보관되었다.
II - 본 발명의 접합체의 방사선표지 :
마우스에서의 생체내 분포 및 효능 연구를 위해, 이하 각각 "212Pb-접합체" 및 "203Pb-접합체"로 표시된 212Pb 또는 203Pb로 표지된 접합체는 접합 시점의 비방사능에 기초하여 주사 시점에 필요한 특정 활성을 위해 희석하여 마우스에게 주사하는 날에 제조되었다.
이를 위해, 위의 항목 I에서 얻은 접합체를 해동하고 물이 없는 물에 희석했다. 이후, 가능하게는 적절한 부피의 0.4 M 암모늄 아세테이트, 아스코르브산, 에탄올 및 트윈 용액이 들어 있는 극저온 바이알에 적절한 부피의 이렇게 얻은 접합체 용액을 첨가했다. 이어서 NaOH/0.4M 암모늄 아세테이트 용액으로 pH 조정되었을 수 있는 적절한 부피의 212Pb-아세테이트 용액(ORANO MED) 또는 203Pb-염화물 용액(LANTHEUS)이 뒤따랐다.
샘플을 50℃에서 10 분 동안 인큐베이션하고, 즉석 박층 크로마토그래피(iTLC)를 사용하여 샘플에 유리되어 남아 있는 212Pb 또는 203Pb를 측정하여 접합체에 의한 212Pb 또는 203Pb의 킬레이트화를 확인했다.
III - 본 발명의 납 표지된 접합체를 사용한 생체내 연구 :
다음에서:
* 사용된 무흉선 누드 마우스는 ENVIGO™의 Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu 마우스이고;
* 사용된 면역적격 마우스는 ENVIGO™의 Hsd:ICR (CD-1™)마우스이고;
* 사용된 PC-3 인간 전립선암 세포는 ATCC™의 ATCC™CRL-1435™ 세포이고;
* 사용된 자동 감마 카운터는 PERKIN ELMER™ Wizard2™ 카운터이고;
* "완충액 1"은 식염수, 23 mM 아스코르브산, 0.08 % (v/v) Tween™ 20 및 5 % (v/v) 에탄올의 혼합물을 지칭한다.
* "완충액 2"는 식염수, 20 mM 아스코르브산, 0.02 % (v/v) Tween™ 80 및 5 % (v/v) 에탄올의 혼합물을 지칭한다.
III.1 - 이종이식 보유 마우스에서의 212 Pb-접합체 생체분포 연구 :
본 연구는 인간 전립선암 세포 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 14 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 접합체의 생체분포를 평가하는 것을 목표로 했다.
* 접합체 14 ng당 10 μCi에서 접합체의 212 Pb-표지 :
용액 부피 유리 212 Pb
접합체 (17 ng/μL) 88.2 μL < 5%
212Pb (1.99 μCi/μL) 753.8 μL
*
Figure pct00006
10 μCi/100 μL의 212 Pb-접합체 용량의 제조 :
용액 부피
212Pb-접합체 (0.507 μCi/μL) 811.4 μL
완충액 1 2 788.6 μL
각각
Figure pct00007
10 μCi/ 100 μL의 1 회 212Pb-접합체 용량에 해당하고 혼합물 212Pb-접합체/완충액 1로부터 생성된 용액 100 μL를 포함하는 인슐린 주사기를 마우스에게 주사하기 위해 준비했다.
* 연구 설계 :
연구 시작 시 체중이 27.74 ± 1.87 g인 7-8 주령의 15 마리의 수컷 무흉선 누드 마우스에게 100 μL의 RPMI-1640 배지/Matrigel™(v/v: 1/1) 중의 106 PC-3 인간 전립선암 세포를 우측 옆구리에 피하 주사했다. 종양은 200-300 mm3(공식: 부피 = 0.5 × 길이 × 너비2에 의해 결정됨)에 도달할 때까지 성장하도록 방치되었다.
이후 각 마우스는 (꼬리 정백으로) 1 회 212Pb-접합체 용량을 정맥으로 투여받았다.
그 후, 마우스를 5 마리씩, 각각 "그룹 A", "그룹 B" 및 "그룹 C"로 표시된 3 개의 그룹으로 나누었다.
그룹 A의 마우스를 주사 투여 후 1 시간에 희생시켰고; 그룹 B의 마우스를 주사 투여 후 4 시간에 희생시킨 한편 그룹 C의 마우스를 주사 투여 후 24 시간에 희생시켰다.
혈액, 생식 기관, 소장, 결장과 맹장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴골, 복부 지방, 골격근, 꼬리(주사 부위) 및 PC-3 종양을 수집하고, 칭량하고, 자동 감마 카운터용 개별 튜브로 옮겼다.
튜브를 2 분 동안 계수했다. 마우스에 주입된 5 μL의 용액으로 구성된 표준을 또한 각 마우스 그룹에 대해 계수했다. 계수로부터 배경을 자동으로 차감했다. 이 표준은 붕괴 보정에도 사용되었다.
%ID/g로 표시되는 그램당 주입된 용량 퍼센트는 수집된 각 장기에 대해 계산되었다 (평균 ± 표준 편차).
* 결과 :
결과는 도 1에 도시된다.
이 도면에 나타난 바와 같이, 주사 투여 후 1 시간에, 212Pb-접합체의 최고 흡수(
Figure pct00008
12 %ID/g)가 아마도 췌장에서 공지된 GRPR 발현으로 인해 췌장에서 관찰된다. 그러나, 종양에서 212Pb-접합체의 흡수가 또한 높고(
Figure pct00009
6 %ID/g) 주사 투여 후 4 시간 및 24 시간에 약간 감소한다.
212Pb-접합체는 높은 종양/혈액 비율을 야기하는 빠른 청소율을 가졌다.
III.2 - 종양이 없는 면역적격 마우스에서의 203 Pb-접합체 생체분포 연구 :
본 연구는 종양이 없는 면역적격 마우스에서 28 ng당 10 μCi의 비방사능에서 203Pb로 표지된 접합체의 생체분포를 평가하는 것을 목표로 했다.
* 접합체 28 ng당 10 μCi에서 접합체의 203 Pb-표지 :
용액 부피 유리 203 Pb
접합체 (1 mg/mL) 8.4 μL < 5%
203Pb (108.3 μCi/μL) 24.6 μL
암모늄 아세테이트 (0.4 M) 475.4 μL
아스코르브산 (500 mM) 33.3 μL
NaOH (1 M) 2 μL
*
Figure pct00010
10 μCi/100 μL의 203 Pb-접합체 용량의 제조 :
용액 부피
203Pb-접합체 (2.78 μCi/μL) 356.7 μL
완충액 1 8 643.3 μL
각각
Figure pct00011
10 μCi/ 100 μL의 1 회 203Pb-접합체 용량에 해당하고 혼합물 203Pb-접합체/완충액 1로부터 생성된 용액 중 하나의 100 μL를 포함하는 인슐린 주사기를 마우스에게 주사하기 위해 준비했다.
* 연구 설계 :
연구 시작 시 체중이 27.75 ± 2.52 g인 30 마리 수컷 및 체중이 25.91 ± 2.75 g인 30 마리 암컷 7-8 주령 면역적격 CD1 마우스가 1 회 203Pb-접합체 용량을 정맥으로 투여받았다.
그 후, 마우스를 10 마리씩 각각 그룹 A, B, C, D, E 및 F로 표시된 6 개의 그룹으로 나누었고, 각 그룹은 5 마리 수컷 및 5 마리 암컷을 포함했다.
그룹 A의 마우스를 주사 투여 후 5 분에 희생시켰고; 그룹 B의 마우스를 주사 투여 후 30 분에 희생시켰고; 그룹 C의 마우스를 주사 투여 후 1 시간에 희생시켰고; 그룹 D의 마우스를 주사 투여 후 4 시간에 희생시킨 한편 그룹 E의 마우스를 주사 투여 후 24 시간에 희생시켰다.
그룹 F의 마우스를 대사 케이지에 넣고 주사 투여 후 4 시간, 24 시간 및 48 시간에 이들의 소변 및 배설물을 수집했다; 이들을 주사 투여 후 48 시간에 희생시켰다.
각 희생된 마우스로부터 혈액, 방광, 생식 기관, 소장, 결장과 맹장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴골, 복부 지방, 골격근, 침샘 및 꼬리를 수집하고, 칭량하고, 자동 감마 카운터용 개별 튜브로 옮겼다.
튜브를 2 분 동안 계수했다. 마우스에 주입된 5 μL의 용액으로 구성된 표준을 또한 각 마우스 그룹에 대해 계수했다. 계수로부터 배경을 자동으로 차감했다. 이 표준은 붕괴 보정에도 사용되었다.
그룹 F의 마우스의 배설물을 또한 계수했다.
%ID/g로 표시되는 그램당 주입된 용량 퍼센트가 수집된 각 장기에 대해 계산되었고 (평균 ± 표준 편차) %ID로 표시되는 주입된 용량 퍼센트가 그룹 F의 마우스의 배설물에 대해 계산되었다 (평균 ± 표준 편차).
* 결과 :
결과는 도 2A 내지 2G에 도시된다.
도 2A 내지 2F에 의해 나타난 바와 같이, 203Pb-접합체는 수컷 및 암컷 마우스 모두에서 안전한 생체분포 프로파일을 갖는다.
실제로, 췌장에서 203Pb-접합체의 높은 초기 흡수(주사 투여 후 5 분에 > 30 %ID/g)가 있지만 %ID/g는 단지 주사 투여 후 4 시간에 모든 장기에서 10보다 훨씬 낮다.
아마도 암컷 마우스가 수컷 마우스보다 더 작은 신장을 가져 장기 그램당 더 높은 %ID를 유발하기 때문일 것인 암컷 마우스에서의 5 분 시점에 더 높은 신장 흡수를 제외하고, 수컷과 암컷 마우스 사이에 유의한 %ID/g 차이는관찰되지 않았다.
또한, 도 2G는 203Pb-접합체가 주로 신장 배설에 의해 제거됨을 보여준다.
III.3 - 상이한 비방사능에서 이종이식 보유 마우스에서의 212 Pb-접합체 생체분포 연구 :
본 연구는 인간 전립선암 세포 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 28 ng당 10 μCi 내지 280 ng당 10 μCi의 다양한 비방사능에서 212Pb로 표지된 접합체의 생체분포를 평가하는 것을 목표로 했다.
* 접합체 28 ng당 10 μCi에서 접합체의 212 Pb-표지 :
용액 부피 유리 212 Pb
접합체 (17 ng/μL) 82.4 μL < 5%
212Pb (2.04 μCi/μL) 245 μL
아스코르브산 (500 mM) 16.3 μL
* 접합체 140 ng당 10 μCi에서 접합체의 212 Pb-표지 :
용액 부피 유리 212 Pb
접합체 (1 mg/mL) 7 μL < 5%
212Pb (2.04 μCi/μL) 245 μL
아스코르브산 (500 mM) 16.3 μL
* 접합체 280 ng당 10 μCi에서 접합체의 212 Pb-표지 :
용액 부피 유리 212 Pb
접합체 (1 mg/mL) 14 μL < 5%
212Pb (2.04 μCi/μL) 245 μL
아스코르브산 (500 mM) 16.3 μL
*
Figure pct00012
10 μCi/100 μL의 212 Pb-접합체 용량의 제조 :
비방사능 용액 부피
28 ng당 10 μCi 212Pb-접합체 (1.32 μCi/μL) 134.9 μL
완충액 1 1 365.1 μL
140 ng당 10 μCi 212Pb-접합체 (1.56 μCi/μL) 114.2 μL
완충액 1 1 385.8 μL
280 ng당 10 μCi 212Pb-접합체 (1.65 μCi/μL) 107.9 μL
완충액 1 1 392.1 μL
각각
Figure pct00013
10 μCi/100 μL의 1 회 212Pb-접합체 용량에 해당하고 혼합물 212Pb-접합체/완충액 1로부터 생성된 용액 중 하나의 100 μL를 포함하는 인슐린 주사기를 마우스에게 주사하기 위해 준비했다.
* 연구 설계 :
연구 시작 시 체중이 27.89 ± 2.27 g인 7-8 주령의 30 마리의 수컷 무흉선 누드 마우스에게 100 μL의 RPMI-1640 배지/Matrigel™(v/v: 1/1) 중의 106 PC-3 인간 전립선암 세포를 우측 옆구리에 피하 주사했다. 종양은 200-300 mm3에 도달할 때까지 성장하도록 방치되었다.
마우스를 10 마리씩 각각 그룹 A, B 및 C로 표시된 3 개의 그룹으로 나누었다.
그룹 A의 각 마우스는 28 ng당 10 μCi와 동일한 비방사능의 1 회 212Pb-접합체 용량을 정맥내로 투여받고; 그룹 B의 각 마우스는 140 ng당 10 μCi와 동일한 비방사능의 1 회 212Pb-접합체 용량을 정맥내로 투여받는 한편 그룹 C의 각 마우스는 280 ng당 10 μCi와 동일한 비방사능의 1 회 212Pb-접합체 용량을 정맥내로 투여받았다.
그룹 A, B 및 C 각각의 5 마리의 마우스를 주사 투여 후 1 시간에 희생시킨 한편 그룹 A, B 및 C 각각의 5 마리의 마우스를 주사 투여 후 4 시간에 희생시켰다.
각 희생된 마우스로부터 혈액, 생식 기관, 소장, 결장과 맹장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴골, 복부 지방, 골격근, 꼬리 및 PC-3 종양을 수집하고, 칭량하고, 자동 감마 카운터용 개별 튜브로 옮겼다.
튜브를 2 분 동안 계수했다. 마우스에 주입된 5 μL의 용액으로 구성된 표준을 또한 계수했다. 계수로부터 배경을 자동으로 차감했다. 이 표준은 붕괴 보정에도 사용되었다.
%ID/g로 표시되는 그램당 주입된 용량 퍼센트는 수집된 각 장기에 대해 계산되었다 (평균 ± 표준 편차).
* 결과 :
결과는 도 3A 내지 3C에 도시된다.
이들 도면에 의해 나타난 바와 같이, 212Pb-접합체의 비방사능이 낮을수록, 종양 흡수에 영향을 미치지 않으면서 건강한 기관 흡수가 낮아진다.
III.4 - 이종이식 보유 마우스에서의 212 Pb-접합체 효능 연구 :
본 연구는 인간 전립선암 세포 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 14 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지된 본 발명의 접합체를 사용하여 1 회 처리 사이클(사이클 1) 또는 3 회 처리 사이클(사이클 1, 2 및 3)의 효능을 평가하는 것을 목표로 했다.
* 접합체 14 ng당 10 μCi에서 접합체의 212 Pb-표지 :
사이클 용액 부피 유리 212 Pb
사이클 1 접합체 (17 ng/μL) 44.12 μL < 5%
212Pb (2.42 μCi/μL) 310 μL
아스코르브산 (500 mM) 20.67 μL
사이클 2 접합체 (17 ng/μL) 29.4 μL < 5%
212Pb (2.77 μCi/μL) 734.2 μL
아스코르브산 (500 mM) 48.95 μL
사이클 3 접합체 (17 ng/μL) 58.8 μL < 5%
212Pb (4.9 μCi/μL) 204.1 μL
아스코르브산 (500 mM) 13.6 μL
*
Figure pct00014
10 μCi/100 μL의 212 Pb-접합체 용량의 제조 :
사이클 용액 부피
사이클 1 212Pb-접합체 (1.36 μCi/μL) 334.6 μL
식염수 3 415.4 μL
사이클 2 212Pb-접합체 (0.354 μCi/μL) 930.7 μL
식염수 499.3 μL
사이클 3 212Pb-접합체 (2.35 μCi/μL) 1 426.3 μL
식염수 73.7 μL
각각
Figure pct00015
10 μCi/100 μL의 1 회 212Pb-접합체 용량에 해당하고 혼합물 212Pb-접합체/식염수로부터 생성된 용액 중 하나의 100 μL를 포함하는 인슐린 주사기를 마우스에게 주사하기 위해 준비했다.
* 연구 설계 :
연구 시작 시 체중이 28.58 ± 1.97 g인 7-8 주령의 40 마리의 수컷 무흉선 누드 마우스에게 100 μL의 RPMI-1640 배지/Matrigel™(v/v: 1/1) 중의 106 PC-3 인간 전립선암 세포를 우측 옆구리에 피하 주사했다. 종양은 200-300 mm3에 도달할 때까지 성장하도록 방치되었다.
20 마리의 마우스가 암세포 주사 후 10 일째에 사이클 1의 1 회 용량을 정맥으로 투여받은 한편 10 마리의 마우스는 1 회 용량의 100 μL의 멸균 식염수(대조군)를 정맥으로 투여받았다.
사이클 1의 용량을 투여받은 20 마리 마우스 중 10 마리가 암세포 주사 후 24 일에 사이클 2의 1 회 용량 및 암세포 주사 후 38 일에 사이클 3의 1 회 용량을 추가로 투여받았다.
연구 동안, 종양 부피가 2,000 mm3에 도달한 마우스를 즉시 안락사시켰다. 또한, 마우스는 종양 부담, 주사 부작용, 또는 다음 종료 기준 중 둘 이상의 조합으로 인한 참을 수 없는 고통 또는 통증의 징후를 나타낼 때 예정된 종점 이전에 안락사되었다: 급성 체중 감소(예를 들어 2일 연속 15 % 체중 감소); 불량한 종양 상태(예를 들어 궤양, 치아 자국 또는 열린 상처); 5 일 동안 지저분함/털손질 없음; 3 일 동안 무기력 또는 감소된 운동성; 5 일 동안 쇠약/균형 문제; 곱사등 외관; 설사; 마비; 심한 빈혈 및 저체온증).
* 결과 :
결과는 도 4A 및 4B에 도시된다.
도 4A에 의해 나타나는 바와 같이, 본 발명의 접합체를 사용하는 하나 또는 셋의 처리 사이클이 7.9 주(대조군)로부터 13.9 주(3 사이클)까지 증가된 평균 생존 시간을 유발했다.
1 회와 3 회 치료 사이클 사이에 큰 차이는 없다. 3 회 처리 사이클에서 2 회 연속 투여 사이의 시간 간격이 차선일 가능성이 있으며 2 회 연속 투여 사이의 시간 간격을 최적화하여 다회 투여가 있는 처리의 효능이 증가할 수 있다.
IV - 비교 연구 :
IV.1 - 이종이식 보유 마우스의 생체분포에 대한 킬레이터 변화의 영향 :
본 연구는 인간 전립선암 세포 종양을 보유한 무흉선 누드 마우스에서 212Pb로 표지된 본 발명의 접합체의 생체분포를 또한 212Pb로 표지되고 킬레이터가 DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)에 해당하고 다음 화학식의 것이라는 점에서만 본 발명의 접합체와 상이한 접합체와 비교하는 것을 목표로 했다:
Figure pct00016
여기서 점선은 링커에 대한 공유 결합을 나타낸다.
명료함을 위해, 본 발명의 접합체는 이하 "DOTAM-접합체"로 표시되는 한편 비교 접합체는 이하 "DOTA-접합체"로 표시된다.
* 비표지 DOTA-접합체의 제조 :
비표지 DOTA 접합체는 펩타이드 서열에 대한 킬레이터의 접합 단계에서 DOTAM을 DOTA로 대체한 것을 제외하고 위의 항목 I에 기재된 것과 동일한 프로토콜에 따라 제조되었다.
* 280 ng당 10 μCi에서 DOTAM-접합체 및 DOTA-접합체의 212 Pb-표지 :
접합체 용액 부피 유리 212 Pb
DOTAM-접합체 접합체 (1 mg/μL) 16.8 μL < 5%
아스코르브산 (500 mM) 8 μL
무수 에탄올 10 μL
Tween™80 0.04 μL
금속이 없는 물 28.8 μL
212Pb (4.4 μCi/μL) 136.4 μL
DOTA-접합체 접합체 (1 mg/μL) 16.8 μL < 5%
아스코르브산 (500 mM) 8 μL
무수 에탄올 10 μL
Tween™80 0.04 μL
금속이 없는 물 28.8 μL
212Pb (4.4 μCi/μL) 136.4 μL
*
Figure pct00017
10 μCi/100 μL의 212 Pb-DOTAM-접합체 및 212 Pb-DOTA-접합체 용량의 제조 :
접합체 용액 부피
212Pb-DOTAM-접합체 212Pb-DOTAM-접합체 (2.73 μCi/μL) 86.7 μL
완충액 2 1863.3 μL
212Pb-DOTA-접합체 212Pb-DOTA-접합체 (3.14 μCi/μL) 75.4 μL
완충액 2 1874.6 μL
각각
Figure pct00018
10 μCi/100 μL의 1 회 용량에 해당하고 혼합물 212Pb-DOTAM-접합체/완충액 2 및 212Pb-DOTA-접합체/완충액 2로부터 생성된 용액 중 하나의 100 μL를 포함하는 인슐린 주사기를 마우스에게 주사하기 위해 준비했다.
* 연구 설계 :
연구 시작 시 체중이 27.90 ± 1.9 g인 7-8 주령의 30 마리의 수컷 무흉선 누드 마우스에게 100 μL의 RPMI-1640 배지/Matrigel™(v/v: 1/1) 중의 106 PC-3 인간 전립선암 세포를 우측 옆구리에 피하 주사했다. 종양은 200-300 mm3에 도달할 때까지 성장하도록 방치되었다.
마우스를 5 마리씩 각각 그룹 A, B, C, D, E 및 F로 표시된 6 개의 그룹으로 나누었다.
그룹 A, B 및 C의 각 마우스는 1 회 212Pb-DOTAM-접합체 용량을 정맥으로 투여받은 반면 그룹 E, F 및 F의 각 마우스는 1 회 212Pb-DOTA-접합체 용량을 정맥으로 투여받았다.
그룹 A 및 D의 마우스를 주사 투여 후 1 시간에 희생시켰고; 그룹 B 및 E의 마우스를 주사 투여 후 4 시간에 희생시킨 한편 그룹 C 및 F의 마우스를 주사 투여 후 24 시간에 희생시켰다.
혈액, 생식 기관, 소장, 결장과 맹장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴골, 복부 지방, 골격근, 꼬리, 침샘 및 PC-3 종양을 수집하고, 칭량하고, 자동 감마 카운터용 개별 튜브로 옮겼다.
튜브를 2 분 동안 계수했다. 마우스에 주입된 5 μL의 용액으로 구성된 표준을 또한 계수했다. 계수로부터 배경을 자동으로 차감했다. 이 표준은 붕괴 보정에도 사용되었다.
%ID/g로 표시되는 그램당 주입된 용량 퍼센트는 수집된 각 장기에 대해 계산되었다 (평균 ± 표준 편차).
* 결과 :
결과는 도 5에 도시된다.
이 도면에 나타나는 바와 같이, 212Pb-DOTAM-접합체는 212Pb-DOTA-접합체보다 더 우수한 생체분포 프로파일을 가지며, 처음 24 시간에 걸쳐 종양 체류가 더 높다.
212Pb-DOTAM-접합체에 대해 주사 투여 후 1 시간에 췌장에서 더 높은 초기 흡수가 관찰된다.
이전에 언급한 바와 같이, GRPR은 췌장에서 발현되는 것으로 알려져 있으며 이러한 초기의 더 높은 흡수는 GRPR 발현 세포에 대한 212Pb-DOTA-접합체에 비해 212Pb-DOTAM-접합체의 더 높은 결합 친화성의 번역일 가능성이 있다.
IV.2 - 마우스의 생체분포에 대한 링커 변화의 영향 :
이종이식 보유 마우스에서의 연구 :
본 연구는 인간 전립선암 세포 종양를 보유하는 무흉선 누드 마우스에서 10 ng당 10 μCi의 비방사능에서 212Pb로 표지되고 세 개의 글루탐산 잔기의 사슬로 구성된 링커를 포함하는 점에서만 본 발명의 접합체와 상이한 접합체의 생체분포를 평가하는 것을 목표로 했다.
이 접합체는 이하 "212Pb-3Glu-접합체"로 표시된다.
* 비표지 3Glu-접합체의 제조 :
비표지 3Glu-접합체는 펩타이드 서열의 제조 단계에서 두 개의 β알라닌 잔기가 세 개의 글루탐산 잔기로 대체된 것을 제외하고 상기 항목 I에 기재된 것과 동일한 프로토콜에 따라 제조되었다.
* 접합체 10 μCi에서 3Glu-접합체의 212 Pb-표지 :
용액 부피 유리 212 Pb
3Glu-접합체 (17 ng/μL) 14.7 μL < 5%
212Pb (0.586 μCi/μL) 427 μL
*
Figure pct00019
10 μCi/100 μL의 212 Pb-3Glu-접합체 용량의 제조 :
용액 부피
212Pb-3Glu-접합체 (0.415 μCi/μL) 203.6 μL
식염수 546.4 μL
각각
Figure pct00020
10 μCi/100 μL의 1 회 212Pb-3Glu-접합체 용량에 해당하고 혼합물 212Pb-3Glu-접합체/식염수로부터 생성된 용액의 100 μL를 포함하는 인슐린 주사기를 마우스에게 주사하기 위해 준비했다.
* 연구 설계 :
연구 시작 시 체중이 21.25 ± 0.9 g인 7-8 주령의 5 마리의 수컷 무흉선 누드 마우스에게 100 μL의 RPMI-1640 배지/Matrigel™(v/v: 1/1) 중의 106 PC-3 인간 전립선암 세포를 우측 옆구리에 피하 주사했다. 종양은 200-300 mm3에 도달할 때까지 성장하도록 방치되었다.
각 마우스는 1 회 212Pb-3Glu-접합체 용량을 정맥내로 투여받았다.
주사 투여 후 4 시간에 마우스를 희생시켰다.
각 희생된 마우스로부터 혈액, 방광, 생식 기관, 소장, 결장과 맹장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴골, 복부 지방, 골격근, 꼬리 및 PC-3 종양을 수집하고, 칭량하고, 자동 감마 카운터용 개별 튜브로 옮겼다.
튜브를 2 분 동안 계수했다. 마우스에 주입된 5 μL의 용액으로 구성된 표준을 또한 계수했다. 계수로부터 배경을 자동으로 차감했다. 이 표준은 붕괴 보정에도 사용되었다.
%ID/g로 표시되는 그램당 주입된 용량 퍼센트는 수집된 각 장기에 대해 계산되었다 (평균 ± 표준 편차).
* 결과 :
결과는 도 6에 도시된다.
이 도면에 나타난 바와 같이, -β-Ala-β-Ala- 링커를 -Glu-Glu-Glu- 링커로 단순히 대체하는 것은, 췌장에서의 유의한 초기 흡수 및 유의한 종양 흡수가 212Pb-3Glu-접합체에 대해 관찰되지 않기 때문에, 완전히 상이한 생체분포를 야기한다.
종양이 없는 면역적격 마우스에서의 연구 :
연구는 4.1 ng당 10 mCi의 비방사능에서 212Pb로 표지되고 다음 화학식의 4-아미노-(1-카르복시메틸)피페리디닐 기로 구성된 링커를 포함한다는 점에서만 본 발명의 접합체와 상이한 접합체의 생체분포를 평가하는 것을 목표로 했다:
Figure pct00021
여기서 점선은 종양 없는 면역적격 마우스에서 DOTAM 및 GRPR 길항제 각각에 대한 공유 결합을 나타낸다.
이 접합체는 이하 "212Pb-ACMP-접합체"로 표시된다.
* 비표지 ACMP-접합체의 제조 :
DPhe와 4-아미노-(1카르복시메틸)피페리딘의 커플링 후 펩타이드 합성이 중단된 것을 제외하고는 위의 항목 I에 기재된 것과 동일한 프로토콜에 따라 비표지 ACMP-접합체가 DOTAM을 접합하기 전에 펩타이드 서열에 접합되었다.
* 접합체 4.1 ng당 10 μCi에서 ACMP-접합체의 212 Pb-표지 :
용액 부피 유리 212 Pb
ACMP-접합체 (17 ng/μL) 12.05 μL < 5 %*
212Pb (1.07 μCi/μL) 467 μL
* 킬레이트화는 30 분이 소요된다
*
Figure pct00022
10 μCi/100 μL의 212 Pb-ACMP-접합체 용량의 제조 :
용액 부피
212Pb-ACMP-접합체 (0.49 μCi/μL) 177.6 μL
식염수 572.4 μL
각각
Figure pct00023
10 μCi/100 μL의 1 회 212Pb-ACMP-접합체 용량에 해당하고 혼합물 212Pb-ACMP-접합체/식염수로부터 생성된 용액의 100 μL를 포함하는 인슐린 주사기를 마우스에게 주사하기 위해 준비했다.
* 연구 설계 :
5 마리의 7-8 주령 면역적격 CD1 암컷 마우스에게 1 회 212Pb-ACMP-접합체 용량을 정맥 주사했다.
주사 투여 후 4 시간에 마우스를 희생시켰다.
각 희생된 마우스로부터 혈액, 방광, 생식 기관, 소장, 결장과 맹장, 비장, 췌장, 신장, 위, 간, 폐, 심장, 뇌, 대퇴골, 복부 지방, 골격근을 수집하고, 칭량하고, 자동 감마 카운터용 개별 튜브로 옮겼다.
튜브를 2 분 동안 계수했다. 마우스에 주입된 5 μL의 용액으로 구성된 표준을 또한 계수했다. 계수로부터 배경을 자동으로 차감했다. 이 표준은 붕괴 보정에도 사용되었다.
%ID/g로 표시되는 그램당 주입된 용량 퍼센트는 수집된 각 장기에 대해 계산되었다 (평균 ± 표준 편차).
* 결과 :
결과는 도 7에 도시된다.
이 도면에 나타난 바와 같이, -β-Ala-β-Ala- 링커를 4-아미노-(1-카르복시메틸)피페리디닐 링커로 단순히 대체하는 것은 5 배 더 높은 신장에서의 흡수와 함께 현저하게 더 낮은 안정성 프로파일을 야기한다.
인용된 참조문헌
EP-A-2 252 628

Claims (12)

  1. 접합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 접합체는 다음 화학식의 접합체이고: C-L-A, (여기서 C는 킬레이터이고, L은 킬레이터에 공유 결합된 링커이고, A는 링커에 공유 결합된 가스트린 방출 펩타이드 수용체 길항제임), 다음을 특징으로 함:
    - 킬레이터는 다음 화학식의 킬레이터이고:
    Figure pct00024

    여기서 점선은 링커에 대한 공유 결합을 나타내고;
    - 링커는 다음 식의 링커이고: -β-Ala-β-Ala-;
    - 가스트린 방출 펩타이드 수용체 길항제는 다음 아미노산 서열을 가짐: -DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 1).
  2. 제1항에 있어서, 킬레이터에 의해 킬레이트화된 방사성핵종을 추가로 포함하는 접합체 또는 염.
  3. 제2항에 있어서, 방사성핵종은 납 방사성핵종, 바람직하게는 203Pb 또는 212Pb인 접합체 또는 염.
  4. 조성물로서, 제1항에 따른 접합체 또는 염을 약제학적으로 허용되는 매질에 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 방사성의약품으로서, 제2항 또는 제3항에 따른 접합체 또는 염을 약제학적으로 허용되는 매질에 포함하는 것을 특징으로 하는 방사성의약품.
  6. 부품 키트로서, 적어도 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 부품 키트:
    - 제1항에 따른 접합체 또는 염이 들어 있는 제1 용기; 및
    - 방사성핵종이 들어 있는 제2 용기.
  7. 제6항에 있어서, 방사성핵종은 납 방사성핵종, 바람직하게는 203Pb 또는 212Pb인 부품 키트.
  8. 접합체 또는 이의 염의 킬레이터에 의한 방사성핵종의 킬레이트화를 포함하는, 방사성의약품 제조를 위한 제1항에 따른 접합체 또는 염의 용도.
  9. 접합체 또는 이의 염의 킬레이터에 의한 방사성핵종의 킬레이트화를 포함하는, 방사성의약품 제조를 위한 제6항 또는 제7항에 따른 부품 키트의 용도.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 방사성핵종은 납 방사성핵종, 바람직하게는 203Pb 또는 212Pb인 용도.
  11. 제5항에 있어서, 가스트린 방출 펩타이드 수용체가 과발현되는 암의 생체내 영상화 또는 치료에 사용하기 위한 방사성의약품.
  12. 제11항에 있어서, 암은 전립선암, 유방암 또는 폐암, 바람직하게는 전립선암인, 사용을 위한 방사성의약품.
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