KR20230077347A - 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법 - Google Patents

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나성순
박명규
서흥식
남예지
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재단법인 한국화학융합시험연구원
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Abstract

본 발명은 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법에 관한 것으로, 챔버 내부에 배치된 세포 배양기에 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포를 배양하고, 배양 상태를 확인하는 단계(S10); 나노 입자와 공기를 상기 챔버에 설치된 에어로졸 발생 장치로 공급하여 에어로졸을 발생시키는 단계(S20); 상기 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치의 분사 노즐을 통해 챔버 내부로 분사하는 동작과, 상기 챔버에 설치된 배출구를 통해 챔버 내부의 유체 또는 에어로졸을 배출하는 동작을 교대 반복 수행하는 단계(S30); 및 상기 S30 단계 이후의 배양 상태를 확인하여 상기 S10 단계의 배양 상태와 비교 분석하는 단계(S40)를 포함하는 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법{METHOD FOR IN VITRO SCREENING INHALATION TOXICITY OF NANO PARTICLE}
본 발명은 나노 입자 흡입 독성 체외(in vitro) 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 별도의 인큐베이션 챔버을 통해 챔버 내부에 공기 및 금속 산화물 등의 나노 입자를 공급함으로써, 실제 실험 동물을 이용하지 않고 폐 및 기관지 등의 세포의 상태 변화를 파악하는 간접적인 방식으로 나노 입자에 대한 흡입 독성 시험을 간단하고 편리하게 수행할 수 있고, 이에 따라 일반적인 나노 입자 흡입 독성 시험 장치를 대체할 수 있으며, 실험 동물을 이용하지 않고도 흡입 독성 시험의 정확도를 향상시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 입자의 크기가 작을수록 비표면적비는 넓어지고, 이와 같이 비표면적비가 넓어진 작은 입자는 생체 조직과 반응 시 독성이 증가하게 되는데, 그 일 예로서 산화티타늄 및 산화아연 등의 금속 산화물 나노 입자는 크기가 줄어들수록 염증을 유발하는 등 독성이 강해질 수 있고, 초미세 나노 입자는 기도나 점막에 걸러지지 않고 폐포 깊숙이 침투하거나 뇌로 이동할 수도 있으며, 더욱이 최근 여러 연구에 의하면 나노 입자가 체내에 축적될 경우 질병이나 중추 신경 장애를 일으킬 수 있다. 다만, 흡입 경로를 통한 화학 물질 등의 노출이 호흡기계에 질환을 유발하거나 기존의 호흡기계 질환을 악화시키는 것은 분명하나 이의 병리기전을 명확히 규명하여 이를 근거로 규제 및 관리하는 것이 필요하다.
이에, 흡입 독성 유발 물질에 대한 호흡기계 독성 기전 연구로서 염증 반응 기전을 중심으로, 주로 내독소, 미세 나노 입자 등 대표적인 흡입 독성 물질에 대한 연구가 이루어져 왔다.
그러나, 최근 활발한 연구가 진행되고 있는 금속 산화물 등의 나노 입자의 호흡기계 노출에 의한 독성 기전에 관한 연구는 실험 단계에서 경피독성에 비해 기관지 세포 및 폐포 세포 종류가 40 종 이상에 달하며, 이에 영향을 미칠 수 있는 복잡한 구조와 작용 기전을 갖고 있고, 높은 비용으로 인하여 충분한 연구가 진행되지 않고 있다.
상기 흡입 독성 시험의 하나의 종류로서, 체내(in vivo) 흡입 독성 시험이 있다. 상기 체내 흡입 독성 시험은 일반적으로 나노 입자를 에어로졸 상태로 발생시켜 일정 크기의 노출 챔버에 공급하고, 이러한 노출 챔버에 실험 동물을 투입시켜 나노 입자에 노출시킨 후 실험 동물의 다양한 변화 상태를 측정하는 방식으로 진행되고 있다. 즉, 나노 입자를 실험 동물에 노출시켜 실험 동물의 폐 깊숙한 곳까지 흡입되도록 하고, 나노 입자가 폐 깊숙한 곳까지 흡입되어 부착됨에 따라 실험 동물의 건강 변화 상태를 측정하는 방식으로 진행되고 있다. 이 경우 적은 비용으로 짧은 시간 내에 재현 가능한 결과를 얻을 수 있으며 기전 연구가 용이하다는 장점을 가지고 있으나, 전신 및 비부 노출 챔버를 추가적으로 확보하여야 하며, 동물 사용에 따른 윤리적 문제 및 많은 비용 소모 등의 문제를 갖고 있어 빠르게 증가하는 흡입 노출 화학 물질 및 나노 입자 물질 유해성 평가 수요에 발맞추어 독성 및 위해성 평가가 이루어지기 어려운 실정이다.
한편, 화학 물질의 국내외 규제 강화에 따라 금속 산화물 등의 나노 입자 유해성 평가 수요 증가가 예상되는 시점에서 흡입 독성 시험 수행의 우선 순위 결정을 위해 금속 산화물의 위해성을 예측할 수 있는 자료가 필요하다.
이에, 신속하면서 체내에서의 흡입 독성 평가 결과와 유의적인 상관성을 갖는 체외 시험법은 화학 물질의 위해성을 예측할 수 있는 자료를 제공할 수 있다는 점에서 필요성이 증대되었다.
상기 체외 시험법은 나노 입자를 이루는 화합 물질의 종류에 따른 물리화학적 특성, 노출 경로, 역학 자료 등을 수집하고 나노 입자의 호흡기계 노출 부위를 명확히 하여 해당 부위별로 세포와 배양 방법을 선정하며, 적합한 배양액과 배양법을 확인하고 종말점을 선정한다.
상기 호흡기계는 위치상 구강, 비강 및 인두로 이루어진 상기도(Upper Respiratory Tract), 후두와 기관 및 기관지로 이루어진 하기도(Lower Respiratory Tract), 세기관지와 폐포로 이루어진 원위기도(Distal Respiratory Tract)로 구분되며, 역할에 따라 비강에서 기관지까지를 공기의 통로가 되는 전도영역(Conducting Zone), 가스 교환이 일어나는 세기관지 및 폐포를 호흡 영역(Respiratory Tract)으로 구분할 수 있다.
상기 호흡기계 기도벽은 상피 세포 연속층으로 구성되어 있으며, 상기 하기도 및 원위기도의 점액은 고블렛 세포(Goblet Cell), 클라라 세포(Clara Cell), 폐상피 세포(Alveolar Type Ⅱ)에서 분비된다.
흡입 독성의 경우 공기 중에 혼합되어 있는 물질이 폐를 통해 체내로 들어와 발생하는 독성에 초점을 맞추고 있으며, 호흡을 통해 체내로 흡입되는 물질들의 독성을 일으키는 상황을 조성하여 평가하는 것이 중요하다.
일반적으로, 세포 배양액에 시험 물질을 일정 농도로 섞어 배양 후 독성을 평가하는 침지(Submerged) 노출법의 경우 시험 물질이 직접 세포 배양액에 닿으면 배양액 성분이 시험 물질 표면을 덮는 보호 효과로 생물학적 특성 평가에 문제를 일으킬 수 있다.
따라서, 흡입 독성 연구에서는 화학 물질 등 나노 입자 물질의 흡입 시의 상황을 체내 상에서 유사하게 재현하는 기액 인터페이스(Air-Liquid Interface, ALI) 노출법을 체내 모델에 적용하고 있는 추세이다.
기액 인터페이스(ALI) 노출법은 노출을 위한 시스템이 필요하지만, 흡입시의 상황과 가장 유사한 상태로 시험 물질을 유지하여 실제 흡입 시 노출되는 시험 물질의 특성과 농도로 노출할 수 있다는 이점을 가지고 있다.
호흡기를 통해 흡입된 나노 입자는 호흡기의 해부학적 구조, 공기 흡입 패턴 및 공기 역학적 입자를 포함한 세 가지 요인 등에 의해서 인체 내부 기관에 이송되거나 침착된다.
여기서, 입경 분포(Particle Size Distribution)는 입자의 공기 중 거동을 판단하는데 가장 중요한 특성 중의 하나이다. 예를 들어 입자의 크기가 매우 작은 나노 입자의 경우 브라운 운동(Brownian motion)에 의해서 공기 유로를 이탈하여 폐포(alveolar)에 침착될 확률이 높다. 특히, 흡기 및 호기 중간 단계 사이의 짧은 정지 동안에는 브라운 운동의 영향을 크게 받아 더 많은 양의 입자들이 폐포에 침착된다. 상기 폐포에 침착된 나노 입자들은 폐포에 염증을 일으키거나 심박수의 변화 및 심장의 재분극 현상(Cardic Repolarization)을 유발할 수 있다. 또한, 혈관계에서는 혈전증(Thrombosis)을 유발시키기도 한다.
나노 입자는 일반적으로 공기 중에 에어로졸 상태로 존재하고, 나노 입자에 대한 시험은 에어로졸 상태로 존재하는 서브 마이크론 대의 입경을 갖는 입자에 대해서도 동일하게 적용될 수 있으며, 현재 다양한 에어로졸 발생 장치가 개발되어 흡입 독성 연구(Inhalation Toxicity Study)에 사용되고 있다.
그러나 최근 문제가 제기되고 있는 화학 물질의 호흡기계 노출에 의한 독성 기전에 관한 연구들은 호흡기 도관을 이루는 세포의 생물학적 특성과 입자의 공기 중 거동에 대한 공학적 측면의 해석이 충분히 반영되지 않은 측면을 갖고 있으며, 흡입 독성 체외 시험법의 방법, 조건 및 변수 제어를 통해 정확도를 향상시킬 필요성이 있다.
국내 등록특허공보 제10-1221106호
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는, 상기 발명의 배경이 되는 기술에서 언급한 문제들을 해결하기 위하여, 체내 흡입 독성을 예측할 수 있는 체외 흡입 독성 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 보다 상세하게는, 실제 실험 동물을 이용하지 않고도 폐 및 기관지의 배양 세포의 상태 변화를 파악하는 스크리닝 방식으로 흡입 독성 체외 시험을 간단하고 편리하게 수행할 수 있으며, 정확도가 높은 체외 흡입 독성 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 따른 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법은, 챔버 내부에 배치된 세포 배양기에 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포를 배양하고, 배양 상태를 확인하는 단계(S10); 나노 입자와 공기를 상기 챔버에 설치된 에어로졸 발생 장치로 공급하여 에어로졸을 발생시키는 단계(S20); 상기 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치의 분사 노즐을 통해 챔버 내부로 분사하는 동작과, 상기 챔버에 설치된 배출구를 통해 챔버 내부의 유체 또는 에어로졸을 배출하는 동작을 교대 반복 수행하는 단계(S30); 및 상기 S30 단계 이후의 배양 상태를 확인하여 상기 S10 단계의 배양 상태와 비교 분석하는 단계(S40)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노 입자는 산화티타늄, 산화아연, 산화텅스텐 및 산화니오븀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 금속 산화물일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노 입자는 직경이 1 nm 내지 300 nm이고, 제타 전위가 -50 mV 내지 0 mV일 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 S10 단계에서 상기 세포 배양기의 배양 농도는 1.1 x 105 cells/mL 내지 1.9 x 105 cells/mL일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 챔버의 내부 온도는 상기 챔버의 하부에 구비된 온도 조절 장치를 통해 제어될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 챔버에 설치된 배출구로부터 에어로졸 발생 장치로 연결되는 순환배관을 더 포함할 수 있고, 상기 배출구를 통해 배출된 유체 또는 에어로졸은 상기 에어로졸 발생 장치로 순환될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 순환배관은 필터, 냉각기, 펌프, 유량계 및 습도 조절기 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 습도 조절기는 상기 순환배관을 통해 순환하는 유체 또는 에어로졸의 습도를 제어하여 상기 에어로졸을 챔버 내부로 현탁액 분사시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 분사 노즐은 상기 에어로졸 발생 장치로부터 세포 배양기 방향으로 이어지는 ㄱ자 형태로 형성된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 S20 단계에서 상기 발생된 에어로졸에 대해서 나노 입자의 제타 전위, 응집, 확산 및 침강 특성을 계산하고, 계산 값을 통해 에어로졸의 분사 조건을 제어할 수 있다.
본 발명에 따른 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법에 따르면, 실제 실험 동물을 이용하지 않고도 폐 또는 기관지 배양 세포의 상태 변화를 파악하는 스크리닝 방식으로 나노 입자에 대한 흡입 독성 체외 시험을 간단하고 편리하게 수행할 수 있고, 이에 따라 일반적인 나노 입자 흡입 독성 시험 장치를 대체할 수 있다.
또한, 폐 또는 기관지의 세포배양기가 배치된 챔버 내부에 에어로졸 발생 장치를 이용하여 공기 및 나노 입자를 포함하는 에어로졸을 공급하며, 이 때, 나노 입자의 특성, 챔버 내부로 유입되는 에어로졸의 흐름 방향 및 세포 배양기의 배치 등을 최적화하여 결과의 정확도를 향상시킬 수 있는 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법을 구현하기 위한 장치의 외형을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포 배양 방법을 나타낸 대한 사진이다.
도 3은 나노 입자에 적용되는 입자 직경과 효율에 대한 전기적 힘, 확산, 침강에 대한 이론값을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 에어로졸 발생 장치에 구비되는 분사 노즐을 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명에서 배양 농도에 따른 예비시험 결과 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 나노 입자의 TEM 사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 나노 입자의 제타 전위 분석 결과 및 SEM 사진이다.
도 8은 본 발명에서 나노 입자의 부착 전 후의 배양 상태를 촬영한 A549 세포주 적용 DMEM (Gibco), 10 % FBS, 1 % Antibiotic -Antimycotic (100 x) 적응 전후 사진이다.
도 9는 본 발명에 따른 세포 생존률 평가 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명에서 A549 세포의 cilia 분화 유도 결과 사진이다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
더 나아가서, 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소의 "내부에 존재하거나, 연결되어 설치된다"라고 기재한 경우에는, 이 구성 요소가 다른 구성 요소와 직접적으로 연결되어 있거나 접촉하여 설치되어 있을 수 있고, 일정한 거리를 두고 이격되어 설치되어 있을 수도 있으며, 일정한 거리를 두고 이격되어 설치되어 있는 경우에 대해서는 해당 구성 요소를 다른 구성 요소에 고정 내지 연결하기 위한 제 3의 구성 요소 또는 수단이 존재할 수 있으며, 이 제 3의 구성 요소 또는 수단에 대한 설명은 생략될 수도 있음을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에서 "상", "하", "좌", "우" 등의 위치와 관련된 용어는, 사용된다면, 해당 구성 요소에 대해서 해당 도면에서의 상대적인 위치를 나타내고 있는 것으로 이해하여야 하며, 이들의 위치에 대해서 절대적인 위치를 특정하지 않는 이상은, 이들 위치 관련 용어가 절대적인 위치를 언급하고 있는 것으로 이해하여서는 아니된다.
또한, 본 명세서에서는 각 도면의 각 구성 요소에 대해서 그 도면 부호를 명기함에 있어서, 동일한 구성 요소에 대해서는 이 구성 요소가 비록 다른 도면에 표시되더라도 동일한 도면 부호를 가지고 있도록, 즉 명세서 전체에 걸쳐 동일한 참조 부호는 동일한 구성 요소를 지시하고 있다.
본 명세서에 첨부된 도면에서 본 발명을 구성하는 각 구성 요소의 크기, 위치, 결합 관계 등은 본 발명의 사상을 충분히 명확하게 전달할 수 있도록 하기 위해서 또는 설명의 편의를 위해서 일부 과장 또는 축소되거나 생략되어 기술되어 있을 수 있고, 따라서 그 비례나 축척은 엄밀하지 않을 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지 기술에 대해 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 도 1 내지 도 10을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에 따르면, 나노 입자의 체내 흡입 시 독성을 예측할 수 있는 나노 입자 체외 흡입 독성 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 상기 나노 입자 체외 흡입 독성 스크리닝 방법은, 챔버(110) 내부에 배치된 세포 배양기(120)에 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포(122)를 배양하고, 배양 상태를 확인하는 단계(S10); 나노 입자와 공기를 상기 챔버(110)에 설치된 에어로졸 발생 장치(200)로 공급하여 에어로졸을 발생시키는 단계(S20); 상기 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치(200)의 분사 노즐을 통해 챔버(110) 내부로 분사하는 동작과, 상기 챔버(110)에 설치된 배출구를 통해 챔버(110) 내부의 유체 또는 에어로졸을 배출하는 동작을 교대 반복 수행하는 단계(S30); 및 상기 S30 단계 이후의 배양 상태를 확인하여 상기 S10 단계의 배양 상태와 비교 분석하는 단계(S40)를 포함할 수 있다.
상기 S10 단계에서, 챔버(110)는 내부에 수용 공간이 형성되는 형태로 일반적인 박스 형상으로 형성될 수 있으며, 상기 챔버(110) 내부에 배치된 세포 배양기(120)에서 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포(122)를 배양하기 위한 조건을 제공하기 위한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포(122) 배양을 위하여 내부를 밀폐하고, 온도를 유지할 수 있다.
상기 챔버(110)의 내부에는 후술하는 에어로졸 발생 장치(200)에 의한 공기 흐름이 발생하므로, 공기 흐름이 원활하게 이루어지도록 내부 공간이 원통 형상을 이루도록 형성되거나 또는 사각 기둥과 같은 다각형 기둥 형태로 형성될 수 있는 등 다양하게 변경 가능하다.
상기 챔버(110)의 하부에 구비된 온도 조절 장치(130)를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 온도 조절 장치(130)는 상기 챔버(110)의 하부에 구비되어 상기 챔버(110)의 하단과 접하도록 설치될 수 있다. 상기 온도 조절 장치(130)를 통해 상기 챔버(110)의 내부 온도가 제어될 수 있으며, 특히, 상기 챔버(110) 내부에 배치된 세포(122) 배양을 위한 최적 온도로 제어하는 것이 용이할 수 있다.
상기 챔버(110) 내부에는 세포 배양기(120)를 배치할 수 있고, 상기 세포 배양기(120)에는 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포(122)를 배양할 수 있다. 상기 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포(122)로서, 기관지 및 폐포의 상피 세포주를 사용할 수 있다. 상기 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포는 예를 들어, A549, Calu-3, THP-1 또는 HMC-1을 포함할 수 있다.
대부분의 체외(in vitro) 연구들은 호흡기계 각 부위의 상피 세포에 초점을 맞추고 있으므로 해당 세포주들은 단독으로 배양(mono-culture)되거나, 다른 기능을 갖는 세포와 동시 배양(co-culture)되어 호흡기계 체외 독성 시험에 사용한다. 폐포 모델은 만성폐쇄성폐질환, 대기오염물질, 공기 중 나노 입자 등의 다양한 연구 분야에서 활용되고 있는데, 폐포 상피 세포의 염증 반응을 중요한 반응으로 간주하고 있다. 기타 폐세포주들로 약물 대사 연구에서 많이 활용하고 있는 BEAS-2B 세포 등이 있으며, 또한 호흡기계 연구를 위하여 THP-1와 같은 대사 세포주도 이용될 수 있다. 이들 세포주들은 호흡기계 흡수율, 약물 수송기전 혹은 독성에 의한 상피 손상 등의 다양한 연구에 활용하고 있다.
상기 S10 단계에서, 상기 세포 배양기(120)에 배치되는 세포(122)는 사람 또는 동물의 세포일 수 있다. 또한, 상기 챔버(110) 내에 배치되는 세포 배양기(120)는 하나 이상일 수 있다. 이 때, 상기 챔버(110) 내에 각각의 세포 배양기(120)는 세포(122)들이 균일하게 배양되도록 배치를 적절히 조절할 수 있다.
또한, 상기 챔버(110) 내에 세포 배양기(120)는 후술하는 S30 단계에서 챔버(110) 내로 에어로졸이 유입되는 흐름 방향에 따라 위치하도록 배치함으로써 흡입 독성 시험의 정확도를 향상시킬 수 있다.
상기 챔버(110)에는 유입구와 배출구가 구비될 수 있다. 구체적으로, 상기 챔버(110)의 유입구에는 에어로졸 발생 장치(200)의 일부가 삽입되어 설치될 수 있으며, 배출구에는 상기 챔버(110) 내의 유체 또는 에어로졸을 배출하기 위한 배관이 설치될 수 있다.
상기 챔버(110), 세포 배양기(120), 온도 조절 장치(130) 및 에어로졸 발생 장치(200)는 별도의 인큐베이션 챔버 내에 위치할 수 있다.
또한, 상기 S10 단계에서, 상기 세포(122)의 배양 방법은, 하기 도 2의 (a)와 같이 인서트 멤브레인(insert membrane)에 세포(122)를 시딩(seeding)하는 단계; 및 하기 도 2의 (b)와 같이 인서트 멤브레인의 경계 격막까지 배양액을 주입하여 공기-액체 계면(Air-Liquid Interface, ALI) 배양 조건을 설정하는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우, 인체 호흡기계와 유사한 체외 세포 모델을 구현할 수 있다.
또한, 상기 세포(122)의 배양은 계대 배양 방식으로 수행될 수 있으며, 세포의 유지 관리 및 세포의 유전적 특성의 변화를 최소화하기 위해 표준화된 방법으로 수행할 수 있다.
상기 세포 배양기(120)의 배양 농도는 1.1 x 105 cells/mL 내지 1.9 x 105 cells/mL, 1.2 x 105 cells/mL 내지 1.8 x 105 cells/mL 또는 1.3 x 105 cells/mL 내지 1.7 x 105 cells/mL일 수 있다. 상기 범위 내로 세포 배양 농도를 조절함으로써 인서트 멤브레인에 적절한 농도로 세포를 배양하여 인체 호흡기계와 유사한 체외 세포 모델을 구현함으로써 실험의 정확도를 높일 수 있다.
또한, 상기 S10 단계에서, 후술하는 흡기 및 호기와 대응되는 시험 단계를 거친 후의 상태와 비교하기 위하여 상기 세포 배양기(120) 내 배양 상태를 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포 배양기(120)에 있어서, 세포 배양액(121) 상부에 부착된 세포의 특성을 분석함으로써 배양 상태를 확인할 수 있다.
상기 S20 단계에서, 나노 입자는 흡입 독성 시험을 하고자 하는 대상 물질일 수 있고, 예를 들어, 상기 나노 입자는 산화티타늄, 산화아연, 산화텅스텐 및 산화니오븀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 금속 산화물일 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 나노 입자는 산화티타늄일 수 있다.
상기 나노 입자의 직경은 1 nm 내지 300 nm, 1 nm 내지 250 nm 또는 1 nm 내지 200 nm일 수 있다. 이와 같이, 나노 입자의 직경을 제어하는 경우, 인체에 유해한 나노 사이즈의 금속 산화물을 제조할 수 있고, 후술하는 에어로졸 발생 및 분사를 통해 나노 입자의 거동을 인체의 호흡 시와 유사하도록 조절하는 것이 용이할 수 있다.
상기 나노 입자의 제타 전위는 -50 mV 내지 0 mV, -45 mV 내지 -5 mV 또는 -40 mV 내지 -10 mV일 수 있다. 상기 제타 전위는 나노 입자의 응집에 영향을 주며, 이와 같은 제타 전위를 갖는 나노 입자를 사용함으로써 후술하는 에어로졸 발생 및 분사를 통해 나노 입자의 거동을 인체의 호흡 시와 유사하도록 조절하는 것이 용이할 수 있다.
상기 나노 입자의 제조 방법은, 상기 나노 입자의 특성을 구현할 수 있다면 특별히 제한되지 않으며 통상의 제조 방법을 통해 제조할 수 있다. 다만, 상기 산화티타늄 나노 입자의 제조 시, 응집제로서 TiCl4를 사용할 수 있으며, 이 때, 상기 응집제의 농도를 15 질량%(wt%) 내지 30 질량%에서 제조할 수 있다. 이 경우, 상기 나노 입자를 제조할 때 응집 효율이 떨어지는 것을 방지하고, 기존의 철염 응집제 사용 시와 비교하여 금속염의 농도가 유사하여 현장 적용이 용이한 장점이 있다.
상기 나노 입자와 공기는 상기 챔버(110)에 설치된 에어로졸 발생 장치(200)로 공급할 수 있다. 구체적으로, 상기 에어로졸 발생 장치(200)는 일부가 상기 챔버(110)의 유입구에 삽입되는 형태로 설치될 수 있다.
상기 에어로졸 발생 장치(200)에 관한 내용으로 노즐 유형, 시험 물질의 적재량, 에어로졸 발생을 위한 공기 유량, 에어로졸의 이송 및 분산을 위한 공기 유량의 변화에 따른 에어로졸 발생 양상의 변화를 확인하는 방안 등이 요구된다.
상기 에어로졸 발생 장치(200)는 사용되는 시험 물질의 상(Phase) 또는 에어로졸의 발생 원리에 따라 건식(Dry Dissemination), 습식(Wet Dissemination), 상 변화식(Phase Change), 화학 반응식(Chemical Reaction), 액상 여과/분산식(Liquid Phase Filtration/Dispersion)으로 분류할 수 있다.
상기 시험 물질로서 본 발명의 나노 입자에 적용될 수 있는 건식 에어로졸 발생 장치(200)는 예를 들어, 건조된 분말(Dried Powder) 상태의 나노 입자를 시린지 펌프(syringe pump)를 이용하여 공기 중으로 공입(Feeding)시키는 방법으로 에어로졸을 발생시킬 수 있다. 이 때, 나노 입자의 공입량이 변화함에 따라 수 ㎎/㎥에서 100 ㎎/㎥ 이상까지 발생되는 에어로졸의 농도가 변한다.
이에, 본 발명에서는 유해 미립자가 존재하는 공기를 인체가 호흡하는 상태와 유사하게 구현하기 위하여 상기 에어로졸 발생 장치(200)에서 발생된 에어로졸에 대해서 나노 입자의 제타 전위, 응집, 확산 및 침강 특성 등을 계산하고, 계산 값을 고려하고, 여러 분사 조건 실험을 통해 에어로졸의 적정 범위 분사 조건을 제어할 수 있다.
상기 나노 입자는 직경이 작은 미립자로 기체 또는 액체 중에 응집하거나 침전하지 않고 분산된 안정한 상태로 존재하는 것은 입자표면에 서로 같은 종류의 전기를 띄고있어, 입자간의 정전기적 반발력에 의하여 서로 밀어내는 힘(zeta potential)과 서로 잡아당기는 힘(van der Waals force) 및 입자의 중력이 서로 평형을 이루어 입자들이 상호 응집되지 못하고 서로 반발하기 때문이다. 따라서, 이러한 미립자 들을 침전 제거시키는 일반적인 방법으로서 미립자가 띄고 있는 전하와 반대되는 전하물질을 투여하거나 제타 전위(Zeta potential)를 감소시켜 미립자들이 서로 응집되도록 하는 방법을 적용한다.
하기 수학식 1로 나타낼 수 있는 제타 전위는 같은 성질의 전하(-)와 공기 중 수화 작용에 의해 나노 입자가 안정하게 분산된 상태를 유지하는 것을 말한다.
[수학식 1]
Figure pat00001
상기 수학식 1에서, ξ는 제타 전위, q는 단위 면적당 전하, d는 전단 표면(shear surface) 계면 층(layer)의 두께, D는 액체의 쌍전상수(dielectric constant)이다.
정전기력은 에어로졸을 안정한 상태로 유지시켜주는 주요 힘이며, 대부분의 에어로졸은 전기적으로 하전되어 있으며, 이는 에어로졸의 특성에 따라 달라진다. 금속 산화물은 일반적으로 (+), 비금속산화물 및 금속황화물은 (-) 전하를 띄고 있다. 제타 전위(zeta potential)는 에어로졸 전단면에서 전위를 말하며, 공기 중 입자의 응집을 촉진시키기 위해서는 제타 전위가 0 부근(등전점, 즉 제타 전위 0) 좋으며, 이 값이 (+) 또는 (-)로서 크면 입자 상호간의 전기적 반발력이 크게 작용한다. ± 10 mV 정도의 범위, 예를 들어, -10 mV 내지 +10 mV가 되도록 전하를 중화하면 반데르발스의 힘에 의해 결합 가능하며, 최적 응집 범위는 -3 mV 내지 +3 mV일 수 있다.
나노 입자가 응집하는 속도는 나노 입자 농도 C의 제곱에 비례한다. 여기서, KB는 브라운 운동에 의한 응집계수이며 단위는 cm2/sec이다. 분말상의 구상 입자의 경우 균일하게 분산된 에어로졸에 대한 응집계수(KB) 값은 하기 수학식 2와 같이 산정할 수 있다.
[수학식 2]
Figure pat00002
상기 수학식 2에서, K는 볼쯔만 상수, T는 기체의 절대온도(K), μ는 기체의 점도(g/cm·sec), λ는 기체분자의 평균자유행로(cm), dp는 고체입자의 직경(cm)이다. 공기 중 입자가 균일하지 않고 분산된 에어로졸에 대해서는 응집계수 KB는 균일하게 분산된 에어로졸의 KB값 보다 25% 내지 50% 높게 나타난다.
또한, 나노 입자의 응집은 제조, 분리, 처리 및 보존 과정에서 상호 작용으로 형성된 비교적 큰 입자 응집 현상을 가리킬 수 있다. 이러한, 나노 입자의 응집이 발생하는 원인 중 하나는 나노 입자의 제조 공정에서 입자의 표면에 대량의 정전하 또는 부전하가 누적되어 대전된 입자가 쿨롱의 힘 법칙(Coulomb force law)에 의해서 응집이 발생하게 되는 것이다.
전기적인 힘은 입자 전하 e값과 전기장 힘 E값의 곱이며 에어로졸 입자의 전기적 하전은 구형 캐패시터의 용량 Ca의 하기 수학식 3으로 계산할 수 있다.
[수학식 3]
Figure pat00003
상기 수학식 3에서, ε0는 진공상태 쌍전상수값(dielectric constant)이며, 2πε0 = 5.55×10-11A s/(V m)이고, d는 평균 하전입자 거리이다.
공기 중 나노 입자에 적용되는 확산 현상에 대한 확산 계수는 하기 수학식 4와 같이 적용할 수 있다.
[수학식 4]
Figure pat00004
상기 수학식 4에서, B는 상수이고, k 값은 볼쯔만 상수 10-23 J/K 이고, T는 300K이다.
상기 나노 입자의 침강 현상은 에어로졸 내 나노 입자의 이동도와 무게에 의해 결정된다. 물체가 유체 내에서 운동하거나 흐르는 유체 내에 물체가 정지해 있을 때 유체에 의해서 운동에 방해되는 힘을 받는데 이를 항력이라고 하고, 입자의 투영면적과 동압력의 곱으로 나타낼 수 있으며, 유체에 대한 물체의 상대속도의 반대방향으로 항력이 작용하며 이를 스토크스의 법칙(Stokes' law)이라 한다. 상기 항력은 하기 수학식 5로 나타낼 수 있다.
[수학식 5]
Figure pat00005
상기 수학식 5에서, CD는 항력계수, Cf는 커닝험 계수, dp는 입자의 직경(m), ρ는 유체의 밀도(kg/m3), υ는 유체의 속도(m/sec)에 해당한다.
이와 같은 수학식들을 이용하고 여러 분사 조건 실험을 통해, 하기 도 3과 같이, 전기적 힘, 확산 및 침강 특성을 고려한 입자 직경에 따른 침전 효율(deposition efficientcy)을 산정할 수 있다. 이 때, 상기 침전 효율은 세포 배양기(120)에 침전되는 나노 입자의 균일 분포를 나타낼 수 있다.
상기 S30 단계에서, 상기 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치(200)의 분사 노즐을 통해 챔버(110) 내부로 분사하는 동작과, 상기 챔버(110)에 설치된 배출구를 통해 챔버(110) 내부의 유체 또는 에어로졸을 배출하는 동작을 교대 반복 수행하게 되는데, 이는 인체의 평균적인 흡기와 호기 주기로 수행될 수 있다. 또한, 상기 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치(200)의 분사 노즐을 통해 챔버(110) 내부로 분사하는 동작과 상기 챔버(110)에 설치된 배출구를 통해 챔버(110) 내부의 유체 또는 에어로졸을 배출하는 동작 사이에 시간차를 둘 수 있다. 이 경우, 인체의 호흡과 보다 유사한 패턴으로 챔버(110)를 운전하여 실험 결과의 정확도를 더욱 높일 수 있다.
상기 에어로졸 발생 장치(200)의 분사 노즐은 상기 에어로졸 발생 장치(200)에서 발생된 에어로졸을 상기 챔버(110) 내부로 분사하기 위한 것으로서, 나노 입자의 분사 시 기존의 실리콘 분사로는 중간 지점에서 굴곡이 발생하여 일부 분사로에 분사가 균일하게 진행되지 않는다는 점을 고려하여, 굴곡이 없는 수직 분사 방식을 적용하였다. 구체적으로, 하기 도 4의 (a)를 참조하면, 상기 분사 노즐은 상기 에어로졸 발생 장치(200)로부터 세포 배양기(120) 방향으로 이어지는 ㄱ자 형태로 형성될 수 있다. 또한, 도 4의 (b)를 통해 상기 ㄱ자 형태의 분사 노즐이 에어로졸 발생 장치(200)에 결합된 형태를 확인할 수 있다. 이 경우, 상기 분사 노즐을 통해 분사되는 에어로졸의 흐름이 세포 배양기(120)가 배치된 방향으로 유도되어 실험 결과의 정확도를 향상시킬 수 있다.
상기 챔버(110)에 설치된 배출구에는 상기 배출구로부터 에어로졸 발생 장치(200)로 연결되는 순환배관(300)을 더 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 배출구를 통해 챔버(110) 내부의 유체 또는 에어로졸을 배출하는 동작을 할 때, 상기 배출구로 배출되는 유체 또는 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치(200)로 순환시켜 재사용할 수 있다.
상기 순환배관(300)은 필터, 냉각기, 펌프, 유량계 및 습도 조절기 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 필터, 냉각기, 펌프, 유량계 및 습도 조절기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적인 예로서, 상기 순환배관(300)에 있어서 상기 배출구에서 에어로졸 발생 장치(200) 방향으로 필터(310), 냉각기(320), 펌프(330), 유량계(340), 습도 조절기(350) 및 필터(360)가 순차적으로 설치될 수 있다.
상기 필터(310, 360)는 상기 챔버(110)로부터 배출되는 유체 또는 에어로졸 내 나노 입자를 분리하기 위한 것으로서, 1개 이상 설치될 수 있다. 이와 같이 챔버(110)로부터 배출되는 유체 또는 에어로졸 내 나노 입자를 분리한 공기를 에어로졸 발생 장치(200)로 순환시킴으로써 상기 에어로졸 발생 장치(200)에서 원하는 조건으로 에어로졸을 발생시키는 것이 용이할 수 있다.
상기 냉각기(320)는 상기 챔버(110)로부터 배출된 유체 또는 에어로졸을 냉각시킬 수 있고, 펌프(330)는 상기 유체 또는 에어로졸을 이동시키기 위한 것이고, 상기 유량계(340)는 상기 에어로졸 발생 장치(200)로 이송되는 유체 또는 에어로졸의 유량을 제어하기 위한 것일 수 있다.
상기 습도 조절기(350)는 상기 챔버(110)로부터 배출된 유체 또는 에어로졸의 습도를 조절할 수 있다. 구체적으로, 소수성(hydrophobic)의 물질의 경우 에어로졸을 발생시키는데 문제가 발생할 수 있으며, 나노 입자는 기계 에너지 및 열에너지를 흡수하면 입자의 표면에는 높은 표면에너지가 축적된다. 이 때, 나노 입자는 표면에너지를 낮추고 안정 상태에 도달하기 위해 상호 응집되므로 이에 따라 습도 조절기(350)를 이용하여 상기 에어로졸을 챔버(110) 내부로 현탁액(suspension) 분사시켜 이러한 어려움이 없도록 하였다.
상기 S40 단계에는 본 발명에 따른 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 결과를 확인하기 위하여, 상기 S30 단계 이후의 배양 상태를 확인하여 상기 S10 단계의 배양 상태와 비교 분석할 수 있다. 구체적으로, 상기 분석 방법으로서, 전자현미경을 이용한 확인 및 세포 생존률 평가 등이 있다.
이상, 본 발명에 따른 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법을 기재 및 도면에 도시하였으나, 상기의 기재 및 도면의 도시는 본 발명을 이해하기 위한 핵심적인 구성만을 기재 및 도시한 것으로, 상기 기재 및 도면에 도시한 공정 및 장치 이외에, 별도로 기재 및 도시하지 않은 공정 및 장치는 본 발명에 따른 나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법을 실시하기 위해 적절히 응용되어 이용될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이들 만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
(1) S10 단계
챔버(110) 내부에 배치된 세포 배양기(120)에 세포(122)를 배양하였다.
mono-culture에 대한 배양 조건 확립 및 조건 확인을 위한 배양을 진행하며, 배양 용품은 T-75 Flask, T-25 Flask, 100 mm dish, 12 mm transwell insert membrane 등을 준비하였다.
계면 활성제를 생산하는 능력을 지닌 사람의 기관지 세포에 상응하는 A549 세포주를 배양액에 시딩(seeding)하였다.
상기 A549 세포주는 DMEM(Gibco), 10 % FBS, 1 % Antibiotic -Antimycotic (100 x)를 배합하여 시험을 진행하였다.
시딩 조건을 확립하고, Transwell insert membrane well 당 seeding cell 수 조건을 확립하기 위한 예비시험을 수행하였다. 그 결과, 1.3 x 105 cells/mL, 1.5 x 105 cells/mL 및 1.7 x 105 cells/mL의 배양 농도가 적절한 것을 확인하였으며, 이는 하기 도 5를 통해 확인할 수 있다.
Cell Bank 확보를 위한 세포 적응 기간 및 계대 배양을 진행하여 1 vial: 5.0 x 105cells/mL stock을 확보하였다.
(2) S20 단계
응집제로서 TiCl4를 사용하여 나노 입자로서 이산화티탄(TiO2)을 제조하였다. 구체적으로, 응집제가 10 질량% 이하인 저농도 상태에서는 결정이 만들어져 응집 효율이 떨어졌으며, 응집제의 농도를 20 질량%로 설정하여 기초 실험을 진행하였으며, 그 결과, 금속염의 농도가 기존의 철염 응집제의 농도와 유사하여 현장 적용이 용이한 이점이 있었다.
제조된 이산화티탄의 함량은 90 질량% 이상으로 확인하였으며, 상당량의 인고 카본이 포함된 것을 확인하였다. 또한, 전체적인 성분에서 중금속의 함량은 거의 없었으며, 광촉매 활성에 영향을 줄만한 인자들도 존재하지 않는 것으로 확인하였다. 따라서, 이 공정에 티탄염을 적용하고 산화티탄을 생산하는 경우 높은 효율의 광촉매 제조가 가능하다는 것을 확인하였다.
전자현미경을 이용하여 제조된 이산화 티타늄의 특성 평가를 실시하였다. 구체적으로, 전자현미경을 이용하여 이산화 티타늄 나노 입자의 크기, 형태, 응집 및 구성 성분 등을 확인하였다.
또한, EDS를 이용하여 입자의 정성 분석을 실시하였다. EDS 분석의 경우 정량 분석은 불가하나, 나노 입자에 정성 분석에는 매우 유용한 분석 방법이며 이를 통하여 필터에 포집된 나노 입자의 성분을 알 수 있고, 본 연구에서는 TiO2와 다른 입자를 구분하는데 사용하고, 일반적으로는 ICP-MS 분석시 참고용으로 사용이 가능하여, 상호 보완적 분석방법이 될 수 있다.
상기 이산화티탄의 TEM 사진을 촬영하여 하기 도 6에 나타내었다. 상기 TEM 사진을 보면 이산화티탄 입자들이 수 nm에서 수십 nm까지 분포하는 것을 볼 수 있으며, 600 ℃에서도 소결된 부분이 확인되는데 이러한 부분은 유기물의 발화에 의하여 온도가 설정 온도 이상으로 높아져서 생성된 것으로 판단된다. TiCl4 응집제를 이용하여 제조한 이산화티탄(GST)(pale yellow powder)에 대하여 결정구조를 X-ray diffraction(XRD) 및 제타 전위(zeta potential)을 분석하여 확인하였다. 상기 XRD 및 제타 전위 분석 결과는 하기 도 7의 (a)에 나타내었고, 도 7의 (b)에는 SEM 촬영 결과를 나타내었다.
또한, A549 세포주 분사 조건 확립을 위한 예비시험 수행하였으며, 예비시험 진행 후 실제 나노입자 분말인 이산화티탄(GST)에 대한 저농도(G2), 고농도(G3)군 분사를 진행하였다.
상기 제조된 이산화티탄과 공기를 상기 에어로졸 발생 장치(200)로 공급하고, 에어로졸을 발생시켰다. 구체적으로, 노출 유량은 노출 시간 동안 clean air(5% CO2 포함)를 유량 별로 노출한 뒤, 세포 생존도를 확인하였으며, A549 세포에서는 4 mL/min으로 30 분으로 진행하였으며, Clean air와 이산화티탄 저농도(G2, GST 25 μg/cm2) 및 고농도(G3, GST 50 μg/cm2)로 구분하여 설정하였다.
(3) S30 단계
상기 에어로졸 발생 장치(200)에서 발생된 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치(200)의 ㄱ자 분사 노즐을 통해 세포 배양기(120) 방향으로 분사하는 동작과, 상기 챔버(110)의 배출구로 상기 챔버(110) 내부의 유체를 배출하는 동작을 교대 반복 수행하였다.
상기 챔버(110)의 배출구로 배출되는 유체 또는 에어로졸은 순환배관(300)을 통해 필터(310), 냉각기(320), 펌프(330), 유량계(340), 습도 조절기(350) 및 필터(360)를 순차적으로 거쳐 에어로졸 발생 장치(200)로 순환시켰다.
(4) S40 단계
상기 S10 단계에서의 배양 상태와 S30 단계 이후에 나노 입자의 부착된 배양 상태를 확인하였으며, 그 결과는 하기 도 8에 나타내었다. 구체적으로, 나노 입자의 부착 전은 도 8의 (a)에 나타내었고, 부착 후는 도 8의 (b)에 나타내었다. 그 결과, 실제 배양된 세포에 입자가 잘 부착된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 세포 생존률 평가를 진행하였다. 구체적으로, 상기 세포 생존률 평가로서 WST-1 assay를 실시하였으며, 15분, 30분 및 60분 단위로 결과를 관찰하였다.
양성 대조 물질은 아래와 같은 물질 정보 및 발생 조건을 근거로 설정하였다.
(물질 정보)
발생 물질: 벤잘코늄클로라이드
물질 농도: 10 질량%
(발생 조건)
실린지 펌프 속도: 1 mL/min
발생기 유량: 1 L/min
실린지 용량: 60 mL
노출 시간: 30 min or 60 min
Particle deposition: 26.6 μg/cm2
상기 A549 세포주 분사 예비시험에 대한 세포 생존률 평가는 S30 단계 수행 24 시간 후, 세포 생존률 평가를 진행하였다. 그 결과는 하기 도 9에 나타내었다. 도 9를 참조하면, 이산화티탄과 대조군을 비교하는 세포 생존률 평가(WST-1 assay) 실시 모습으로서, 이산화티탄 용량 25 μg/cm2 및 50 μg/cm2과 대조군과의 세포 생존률 평가 과정을 확인할 수 있었다.
실시예 2
상기 실시예 1에서, 상기 세포 배양기(120)에 배양하기 위한 세포(122)로서, A549 대신에 사람의 단핵 세포 백혈병 세포주인 THP-1을 배양액에 시딩하였고, 상기 THP-1 세포주는 RPMI 1640 (Gibco), 10 % FBS, 1 % Antibiotic -Antimycotic(100 x)을 배합하여 시험을 진행하였으며, Cell Bank 확보를 위한 세포 적응 기간 및 계대 배양을 진행하여 1 vial: 5.0 x 105 cells/mL stock을 확보한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 3
상기 실시예 1에서, 상기 세포 배양기(120)에 배양하기 위한 세포(122)로서, A549 대신에 Calu-3 세포주를 배양액에 시딩하였고, 상기 Calu-3 세포주는 DMEM (Gibco), 10 % FBS, 1 % Antibiotic -Antimycotic(100 x)을 배합하여 시험을 진행하였으며, Cell Bank 확보를 위한 세포 적응 기간 및 계대 배양을 진행하여 1 vial: 5.0 x 105 cells/mL stock을 확보한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 4
상기 실시예 1에서, 상기 세포 배양기(120)에 배양하기 위한 세포(122)로서, A549 대신에 HMC-1 세포주를 배양액에 시딩하였고, 상기 HMC-1 세포주는 IMDM + GlutaMAXTM-1 (Gibco), 10 % FBS, 1 % Antibiotic -Antimycotic(100 x)을 배합하여 시험을 진행하였으며, Cell Bank 확보를 위한 세포 적응 기간 및 계대 배양을 진행하여 1 vial: 5.0 x 105 cells/mL stock을 확보한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 5
상기 실시예 1에서 진행한 체외 흡입 독성 시험의 타당성 검증(validation)을 위한 A549 세포주 분화를 시도하는 방안으로서, Transwell plate에 세포를 시딩하고, 24 시간 후 transwell plate의 baso-lateral 배양액을 asperator로 제거하였다.
그리고, pipette aid를 이용하여 transwell insert membrane의 경계면까지 배양액을 채워준 후 Transwell plate를 48 시간 동안 배양하였다.
50 mL tube에 배양액 1 mL당 4 μM dexamethason이 되도록 배양액을 조제하고, transwell plate의 baso-lateral 배양액을 asperator로 제거한 후 4 uM dexamethason이 들어있는 배양액으로 교체하였다.
그런 다음, 2 일차, 4 일차, 6 일차, 8 일차에 배양액을 교체하였다.
A549 세포의 cilia 분화 유도를 확인하였으며, 그 결과는 하기 도 10에 나타내었다. 도 10을 보면, 1 일차, 2 일차, 3 일차, 4 일차, 5 일차, 6 일차, 7 일차, 8 일차 및 9 일차에 대해서 촬영한 A549 세포 cilia 분화 유도 사진을 확인할 수 있고, 이를 통해 적정한 분화 유도 결과를 확인할 수 있었다.
100: 인큐베이션 챔버
110: 챔버
120: 세포 배양기
121: 세포 배양액
122: 세포
130: 온도 조절 장치
200: 에어로졸 발생 장치
300: 순환배관
310, 360: 필터
320: 냉각기
330: 펌프
340: 유량계
350: 습도 조절기

Claims (10)

  1. 챔버 내부에 배치된 세포 배양기에 폐 및 기관지 중 어느 하나 이상의 세포를 배양하고, 배양 상태를 확인하는 단계(S10);
    나노 입자와 공기를 상기 챔버에 설치된 에어로졸 발생 장치로 공급하여 에어로졸을 발생시키는 단계(S20);
    상기 에어로졸을 상기 에어로졸 발생 장치의 분사 노즐을 통해 챔버 내부로 분사하는 동작과, 상기 챔버에 설치된 배출구를 통해 챔버 내부의 유체 또는 에어로졸을 배출하는 동작을 교대 반복 수행하는 단계(S30); 및
    상기 S30 단계 이후의 배양 상태를 확인하여 상기 S10 단계의 배양 상태와 비교 분석하는 단계(S40)를 포함하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자는 산화티타늄, 산화아연, 산화텅스텐 및 산화니오븀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 금속 산화물인 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자는 직경이 1 nm 내지 300 nm이고, 제타 전위가 -50 mV 내지 0 mV인 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 S10 단계에서, 상기 세포 배양기의 배양 농도는 1.1 x 105 cells/mL 내지 1.9 x 105 cells/mL인 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 챔버의 하부에 구비된 온도 조절 장치를 이용하여 상기 챔버 내부의 온도를 제어하는 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배출구로부터 에어로졸 발생 장치로 연결되는 순환배관을 더 포함하고, 상기 배출구를 통해 배출된 유체 또는 에어로졸은 상기 에어로졸 발생 장치로 순환되는 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 순환배관은 필터, 냉각기, 펌프, 유량계 및 습도 조절기 중 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 습도 조절기는 상기 순환배관을 통해 순환하는 유체 또는 에어로졸의 습도를 제어하여 상기 에어로졸을 챔버 내부로 현탁액 분사시키는 것을 특징으로 하는,
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  9. 제1항에 있어서,
    상기 분사 노즐은 상기 에어로졸 발생 장치로부터 세포 배양기 방향으로 이어지는 ㄱ자 형태로 형성된 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 S20 단계에서, 상기 발생된 에어로졸에 대해서 나노 입자의 제타 전위, 응집, 확산 및 침강 특성을 계산하고, 계산 값을 통해 에어로졸의 분사 조건을 제어하는 것을 특징으로 하는,
    나노 입자 흡입 독성 체외 스크리닝 방법.
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