KR20230075137A - Manufacturing method of chitosan oligosaccharide composition having antibacterial lasting effect and the composition manufactured thereby - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 키토산을 올리고당으로 분해하는 방법 및 항균 지속성 효과를 높일 수 있는 추가 성분을 탐색하여, 항균 지속성 효과를 갖는 키토올리고당 혼합 조성물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 키토올리고당 혼합 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, (1) 바실러스속 균주를 이용하여 키토올리고당 용액을 제조하는 단계; (2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 및 상기 (2)에서 제조된 칼슘 이온을 함유하는 용액을 혼합하고, 상기 (1) 키토올리고당 용액을 제조하는 단계는, 아세트산 수용액 100중량부에 키토산 2 내지 5중량부를 첨가하여 교반하는 단계; 바실러스 속 균주 0.5~5중량부를 추가로 첨가하여 24~48시간 동안 반응시키는 단계; 및 30~40도에서 24~48시간 동안 방치하는 단계;를 포함하며, 상기 (2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계는, 패각을 세척하여 준비하는 단계; 1000 내지 1200도의 소성로에서 패각을 30~60분 동안 소성하는 단계; 실온에서 냉각하는 단계; 소성된 패각을 파쇄하여 분말화하는 단계; 분말화된 패각에 탈이온수를 첨가하고, 효모 처리하여 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계를 포함하는, 키토올리고당을 포함하는 혼합 조성물의 제조 방법을 제공한다.The present invention provides a method of decomposing chitosan into oligosaccharide and a method for preparing a chitooligosaccharide mixture composition having an antimicrobial persistence effect and a chitooligosaccharide mixture composition prepared thereby by searching for an additional component capable of increasing the antimicrobial persistence effect. The purpose. The present invention comprises the steps of (1) preparing a chitooligosaccharide solution using a strain of the genus Bacillus; (2) preparing a solution containing calcium ions; And (3) mixing the chitooligosaccharide solution prepared in (1) and the solution containing calcium ions prepared in (2), and preparing the chitooligosaccharide solution in (1), 100 parts by weight of an acetic acid aqueous solution Adding 2 to 5 parts by weight of chitosan and stirring; Reacting for 24 to 48 hours by additionally adding 0.5 to 5 parts by weight of a strain of the genus Bacillus; and leaving at 30 to 40 degrees for 24 to 48 hours. In the (2) preparing a solution containing calcium ions, the step of preparing the shell is washed; Baking the shells in a firing furnace at 1000 to 1200 degrees for 30 to 60 minutes; cooling to room temperature; Crushing and pulverizing the calcined shells; A method for preparing a mixed composition containing chitooligosaccharide is provided, which includes adding deionized water to powdered shells and treating yeast to prepare a solution containing calcium ions.
Description
본 발명은, 항균 지속성 효과를 갖는 키토올리고당 혼합 조성물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a chitooligosaccharide mixed composition having an antibacterial and long-lasting effect and a composition prepared thereby.
항생제란 통상적으로 항미생물제를 총칭하는 것으로, 특히 세균에 대한 항균작용을 하는 물질, 상세하게는 세균이 세포벽이나 단백질 등을 합성하는 시스템을 저해시킴으로써 뛰어난 항균작용을 하는 물질 또는 이러한 물질로부터 제조된 것을 의미한다. 항생제의 성분은 주로 곰팡이로부터 추출된 것이 주를 이루었으며, 오늘날 세균 감염에 의한 질병 등을 치료하기 위해 많이 사용되고 있다. 가장 대표적인 항생제로는 영국인 의사 알렉산더 플레밍이 1928년에 제조한 페니실린이다. 페니실린 이후에 개발된 대표적인 항생제로는 페니실린 보다 효과가 탁월한 것으로 인정되는 메티실린(methicillin)이 있다. 메티실린은 페니실린의 화학구조를 일부 변경하여 제조한 것이다.Antibiotics generally refer to antimicrobial agents, in particular, substances that have antibacterial action against bacteria, specifically substances that have excellent antibacterial action by inhibiting the system in which bacteria synthesize cell walls or proteins, or substances manufactured from such substances. it means. Components of antibiotics were mainly extracted from fungi, and are widely used today to treat diseases caused by bacterial infections. The most representative antibiotic is penicillin, which was manufactured in 1928 by Alexander Fleming, an English physician. Representative antibiotics developed after penicillin include methicillin, which is recognized to be more effective than penicillin. Methicillin is produced by partially altering the chemical structure of penicillin.
항생제내성세균이란 특정 항생제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말한다. 예를 들어, 상기한 페니실린 의 약효가 전혀 듣지 않는 페니실린 내성 황색포도상구균이 이에 해당된다. 이 외에도, 1961년 최초로 학계에 보고되었으며, 그 후로 전세계적으로 주요 병원내 감염균이 되고 있는 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)이 있다. MRSA는 페니실린이나 메티실린의 항생제에도 내성을 나타낼 수 있는 독특한 유전자를 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. MRSA는 주로 건강한 사람에게는 감염이 되지 않고, 주로 면역력이 약한 환자나 수술을 마친 환자에게 감염이 되며, 감염이 되는 경우에는 패혈증이나 폐렴을 일으켜 사망케 하는 것으로 보고되어 있다.Antibiotic-resistant bacteria are bacteria that are resistant to certain antibiotics and do not work. For example, penicillin-resistant Staphylococcus aureus, which does not respond to the drug effect of penicillin at all, corresponds to this category. In addition, there is methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which was first reported to the academic world in 1961 and has since become a major nosocomial infection worldwide. MRSA has been found to have a unique gene that can show resistance to antibiotics such as penicillin or methicillin. It is reported that MRSA does not infect healthy people, mainly infects patients with weak immunity or patients who have undergone surgery, and in case of infection, it causes sepsis or pneumonia and causes death.
이와 같은 기존 화학물질 유래 항생제에 대한 내성을 가진 병원성 미생물로 인한 감염이 증가함에 따라, 최근에는 기존 화학물질 유래 항균제의 경우 부작용과 내성이 문제되어, 천연물 유래 항균 물질에 대한 개발의 요구가 증대되면서, 천연물을 이용한 여러 약품 또는 항생제를 개발하려는 시도가 활발하게 진행되고 있다.As infections caused by pathogenic microorganisms resistant to antibiotics derived from existing chemicals increase, in recent years, in the case of antimicrobial agents derived from existing chemicals, side effects and resistance have become a problem, and the demand for development of antimicrobial substances derived from natural products has increased. However, attempts to develop various drugs or antibiotics using natural products are being actively pursued.
이와 같은 천연물 유래 항균 물질로서, 키토산을 포함하는 조성물이 개발되고 있다. 키토산(Chitosan)은 게, 새우 및 가재와 같은 갑각류 껍질의 주요 성분인 키틴[폴리β-(1→4)-N-아세틸-D-글루코사민]을 탈아세틸화하여 얻어지는 천연 무독성 바이오폴리머이다. 키틴은 자연계에서 유일하게 분포하는 염기성 플리머이며, 갑각류의 외골격을 구성하는 주요 물질이다. 지난 수십 년간 키토산은 항미생물성, 항종양성, 항산화성 및 혈중콜레스테롤 저하 작용과 같은 다양한 생물학적 활성으로 인해 많은 주목을 받아 왔다. 키토산은 또한 수분과 지방 흡수, 유화작용 및 색소 결합 등의 특성을 지닌 것으로 보고되고 있다.As such a natural product-derived antibacterial material, a composition containing chitosan has been developed. Chitosan is a natural non-toxic biopolymer obtained by deacetylating chitin [polyβ-(1→4)-N-acetyl-D-glucosamine], which is a major component of the shells of crustaceans such as crabs, shrimps and crayfish. Chitin is the only basic polymer distributed in nature and is the main material constituting the exoskeleton of crustaceans. In the past decades, chitosan has attracted much attention due to its various biological activities such as antimicrobial, antitumor, antioxidant and blood cholesterol lowering activities. Chitosan is also reported to have properties such as water and fat absorption, emulsification and pigment binding.
이와 같은 키토산은 고분자 상태에서 다른 유효 성분들과의 혼합이 매우 어렵기 때문에 분자량이 낮은 형태로 분해되어야 한다. 또한, 키토산은 체내 흡수성이 매우 열악하기 때문에, 의약품으로서의 응용을 위해서는 체내 흡수를 위해 키토올리고당(Chitosan oligosaccharide, CSO)으로 분해되어야 한다. 키토올리고당(chitosan oligosaccharide, CSO)은 키토산을 저분자화한 물질로서 생리학적 pH에서 낮은 용해도를 갖는 키토산에 비하여 용해성이 높기 때문에 보다 다양한 분야에 이용될 수 있다. 키토산이 키토올리고당으로 분해됨에 따라 분자량이 감소되면, 용해도 및 체내 흡수율이 크게 증가하게 된다. 키토산이 키토올리고당으로 가수분해가 되면, 분자량이 낮아져 체내 흡수성이 높아지고, 항균 활성이 높아진다.Since such chitosan is very difficult to mix with other active ingredients in a polymer state, it must be decomposed into a low molecular weight form. In addition, since chitosan has very poor absorption in the body, it must be decomposed into chitooligosaccharide (CSO) for absorption in the body for application as a medicine. Chitosan oligosaccharide (CSO) is a low-molecular-weight material of chitosan, and can be used in more diverse fields because it has higher solubility than chitosan, which has a low solubility at physiological pH. When the molecular weight of chitosan is decomposed into chitooligosaccharides, the solubility and absorption rate in the body are greatly increased. When chitosan is hydrolyzed into chitooligosaccharide, the molecular weight is lowered, so absorption in the body is increased, and antibacterial activity is increased.
따라서, 키토산을 올리고당으로 분해하고, 추가로 항균 지속성을 높일 수 있는 방안에 대한 연구가 필요하다.Therefore, it is necessary to study a method for decomposing chitosan into oligosaccharides and further increasing antibacterial durability.
등록특허공보 제10-1120161호(공고일: 2012.03.23.)Registered Patent Publication No. 10-1120161 (Announcement date: 2012.03.23.)
본 발명은, 상기 실정을 감안하여, 키토산을 올리고당으로 분해하는 방법 및 항균 지속성 효과를 높일 수 있는 추가 성분을 탐색하여, 항균 지속성 효과를 갖는 키토올리고당 혼합 조성물의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 키토올리고당 혼합 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In view of the above circumstances, the present invention searches for a method for decomposing chitosan into oligosaccharide and an additional component capable of increasing the antimicrobial persistence effect, and a method for preparing a chitooligosaccharide mixed composition having an antimicrobial persistence effect and a chitooligosaccharide prepared thereby. It is an object to provide a mixed composition.
본 발명의 일 실시예는, (1) 키토올리고당 용액을 제조하는 단계; (2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 및 상기 (2)에서 제조된 칼슘 이온을 함유하는 용액을 혼합하고, 상기 (1) 키토올리고당 용액을 제조하는 단계는, 아세트산 수용액 100중량부에 키토산 2 내지 5중량부를 첨가하여 교반하는 단계; 바실러스 속 균주 0.5~5중량부를 추가로 첨가하여 24~48시간 동안 반응시키는 단계; 및 30~40도에서 24~48시간 동안 방치하는 단계;를 포함하며, 상기 (2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계는, 패각을 세척하여 준비하는 단계; 1000 내지 1200도의 소성로에서 패각을 30~60분 동안 소성하는 단계; 실온에서 냉각하는 단계; 소성된 패각을 파쇄하여 분말화하는 단계; 분말화된 패각에 탈이온수를 첨가하고, 효모 처리하여 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계를 포함하는, 키토올리고당을 포함하는 혼합 조성물의 제조 방법을 제공할 수 있다.One embodiment of the present invention, (1) preparing a chitooligosaccharide solution; (2) preparing a solution containing calcium ions; And (3) mixing the chitooligosaccharide solution prepared in (1) and the solution containing calcium ions prepared in (2), and preparing the chitooligosaccharide solution in (1), 100 parts by weight of an acetic acid aqueous solution Adding 2 to 5 parts by weight of chitosan and stirring; Reacting for 24 to 48 hours by additionally adding 0.5 to 5 parts by weight of a strain of the genus Bacillus; and leaving at 30 to 40 degrees for 24 to 48 hours. In the (2) preparing a solution containing calcium ions, the step of preparing the shell is washed; Baking the shells in a firing furnace at 1000 to 1200 degrees for 30 to 60 minutes; cooling to room temperature; Crushing and pulverizing the calcined shells; It is possible to provide a method for preparing a mixed composition containing chitooligosaccharide, comprising adding deionized water to powdered shells and treating yeast to prepare a solution containing calcium ions.
상기 (1) 단계의 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus) 및 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다.The Bacillus genus strain in step (1) is selected from the group consisting of Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus and Bacillus sonorensis. There may be more than one species.
상기 (2) 단계에서, 상기 탈이온수는 패각 100중량부에 대해 1000~2000중량부로 첨가되고, 효모는 패각 100중량부에 대해 0.5~2중량부로 첨가될 수 있다.In the step (2), the deionized water may be added in an amount of 1000 to 2000 parts by weight based on 100 parts by weight of the shell, and the yeast may be added in an amount of 0.5 to 2 parts by weight based on 100 parts by weight of the shell.
상기 (3) 단계는 상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 40 내지 60중량부 및 상기 (2)에서 제조된 칼슘 이온을 함유하는 용액 60 내지 40중량부를 혼합하는 단계일 수 있다.Step (3) may be a step of mixing 40 to 60 parts by weight of the chitooligosaccharide solution prepared in (1) and 60 to 40 parts by weight of the solution containing calcium ions prepared in (2) above.
본 발명의 다른 실시에는, 상기 제조 방법에 의해 제조된 키토올리고당을 포함하는 혼합 조성물을 제공할 수 있다.In another embodiment of the present invention, a mixed composition containing chitooligosaccharide prepared by the above preparation method may be provided.
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 키토올리고당을 포함하는 혼합 조성물은 항균 효과가 우수하다.The mixed composition containing chitooligosaccharide prepared by the production method of the present invention has an excellent antibacterial effect.
도 1a는 본 발명의 일 실시예의 대조군 및 시험군 조성물의 MRSA에 대한 10분간 항균시험 결과이며, 도 1b는 일 실시예의 대조군 및 시험군 조성물의 MRSA에 대한 24시간 항균시험 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예의 대조군 및 시험군 조성물의 VRSA에 대한 10분간 항균시험 결과이며, 도 2b는 일 실시예의 대조군 및 시험군 조성물의 VRSA에 대한 24시간 항균시험 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예의 대조군 및 시험군 조성물의 E.Coli에 대한 10분간 항균시험 결과이며, 도 3b는 일 실시예의 대조군 및 시험군 조성물의 E.Coli에 대한 24시간 항균시험 결과이다.1a is a 10-minute antibacterial test result for MRSA of the control and test group compositions of an embodiment of the present invention, and FIG. 1b is a 24-hour antibacterial test result for MRSA of the control and test group compositions of one embodiment.
Figure 2a is a 10-minute antibacterial test result for VRSA of the control and test group compositions of one embodiment of the present invention, Figure 2b is a 24-hour antibacterial test result for VRSA of the control and test group compositions of one embodiment.
3a is a 10-minute antibacterial test result for E.Coli of the control and test group compositions of an embodiment of the present invention, and FIG. 3b is a 24-hour antibacterial test result for E.Coli of the control and test group compositions of one embodiment of the present invention. .
본 발명의 일 실시예는, (1) 바실러스속 균주를 이용하여 키토올리고당 용액을 제조하는 단계; (2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 및 상기 (2)에서 제조된 칼슘 이온을 함유하는 용액을 혼합하는 키토올리고당 혼합 조성물의 제조 방법을 제공한다.One embodiment of the present invention, (1) preparing a chitooligosaccharide solution using a strain of the genus Bacillus; (2) preparing a solution containing calcium ions; and (3) a method for preparing a chitooligosaccharide mixture composition in which the chitooligosaccharide solution prepared in (1) and the solution containing calcium ions prepared in (2) are mixed.
상기 상기 (1) 키토올리고당 용액을 제조하는 단계는, 아세트산 수용액 100중량부에 키토산 2 내지 5중량부를 첨가하여 교반하는 단계; 바실러스 속 균주 0.5~5중량부를 추가로 첨가하여 24~48시간 동안 반응시키는 단계; 및 30~40도에서 24~48시간 동안 방치하는 단계;를 포함한다.The (1) preparing the chitooligosaccharide solution may include adding 2 to 5 parts by weight of chitosan to 100 parts by weight of an acetic acid aqueous solution and stirring; Reacting for 24 to 48 hours by additionally adding 0.5 to 5 parts by weight of a strain of the genus Bacillus; and leaving at 30 to 40 degrees for 24 to 48 hours.
상기 아세트산 수용액은 아세트산(Acetic acid)을 포함하는 용액을 의미하며, 아세트산의 농도는 4~10 ％ (w/v) 인 것이 바람직하다. The aqueous acetic acid solution means a solution containing acetic acid, and the concentration of acetic acid is preferably 4 to 10% (w/v).
상기 바실러스속 균주는 자연계에 널리 통성 혐기성 간균으로서 탈질, 철 환원, 망간산화 등에 관여하는 균으로서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus) 및 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.The strains of the genus Bacillus are facultative anaerobic bacilli widely in nature, and are involved in denitrification, iron reduction, manganese oxidation, etc., Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus ) and at least one selected from the group consisting of Bacillus sonorensis, but is not limited thereto.
바실러스 속 균주를 아세트산 수용액 및 키토산의 혼합물에 첨가하여 반응시킴으로써, 키토산이 키토올리고당으로 분해된다. By adding a Bacillus genus strain to a mixture of an aqueous acetic acid solution and chitosan for reaction, chitosan is decomposed into chitooligosaccharides.
상기 (2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계는, 패각을 세척하여 준비하는 단계; 1000 내지 1200도의 소성로에서 패각을 30~60분 동안 소성하는 단계; 실온에서 냉각하는 단계; 소성된 패각을 파쇄하여 분말화하는 단계; 분말화된 패각에 탈이온수를 첨가하고, 효모 처리하여 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계를 포함한다.The (2) step of preparing a solution containing calcium ions may include washing and preparing shells; Baking the shells in a firing furnace at 1000 to 1200 degrees for 30 to 60 minutes; cooling at room temperature; Crushing and pulverizing the calcined shells; adding deionized water to the powdered shells and treating them with yeast to prepare a solution containing calcium ions.
상기 패각은 어패류의 패육을 채취하고 남은 껍데기를 의미하고, 굴, 조개, 바지락, 소라 등의 패각을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 굴의 패각을 사용한다. 상기 패각을 1000 내지 1200도의 소성로에서 소성한다. 이와 같이 고온으로 패각을 소성시킴에 따라 소성과정에서 유기물이 탄화되어 제거되고, 공극이 많이 형성된 다공률이 높은 소성물, 즉, 소성 패각을 얻을 수 있다.The shell refers to the shell remaining after harvesting the shell of fish and shellfish, and shells such as oysters, clams, clams, and conch may be used, and preferably, oyster shells are used. The shell is fired in a firing furnace at 1000 to 1200 degrees. As the shell is fired at a high temperature in this way, organic matter is carbonized and removed during the firing process, and a fired product having a high porosity in which many pores are formed, that is, a fired shell can be obtained.
상기 분말화된 패각에 탈이온수를 첨가하고, 효모 처리함으로써 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조할 수 있다. 상기 탈이온수는 패각 100중량부에 대해 1000~2000중량부로 첨가한다. 이 때 사용하는 효모의 양은 패각 100중량부에 대해 0.5~2중량부이다.A solution containing calcium ions can be prepared by adding deionized water to the powdered shell and treating it with yeast. The deionized water is added in an amount of 1000 to 2000 parts by weight based on 100 parts by weight of the shell. The amount of yeast used at this time is 0.5 to 2 parts by weight based on 100 parts by weight of the shell.
상기 칼슘 이온은 패각으로부터 얻어지며, 칼슘 이온의 첨가에 의해 항균 지속성 효과가 우수해진다. The calcium ion is obtained from the shell, and the antibacterial durability effect is excellent by the addition of calcium ion.
상기 (3) 단계는 상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 40 내지 60중량부 및 상기 (2)에서 제조된 칼슘 이온을 함유하는 용액 60 내지 40중량부를 혼합한다. In step (3), 40 to 60 parts by weight of the chitooligosaccharide solution prepared in (1) and 60 to 40 parts by weight of the solution containing calcium ions prepared in (2) are mixed.
이하에서는, 본 발명을 실시예에 따라 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는, 본 발명을 설명하기 위한 것이므로, 통상의 기술자에게 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되지 않는 것은 자명하다.Hereinafter, the present invention will be specifically described according to examples. Since the following examples are for explaining the present invention, it is apparent to those skilled in the art that the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example
(1) 바실러스속 균주를 이용하여 키토올리고당 용액의 제조(One) Preparation of chitooligosaccharide solution using Bacillus strains
6%의 아세트산 수용액(삼전순약공업(주))을 1L 준비한다. 아세트산 수용액 1L에 대해 30ml의 키토산(속초물산)을 첨가하고, 6시간 동안 교반한다. 교반 후 바실러스 속 균주로서 바실러스 서브틸리스(국립농업과학원) 1g를 첨가하여 24시간동안 실온에서 반응시킨다. 이후 35도에서 24시간 휴지기를 통해, 방치함으로써, 키토산이 충분히 키토올리고당으로 분해되도록 한다.Prepare 1L of 6% acetic acid aqueous solution (Samchun Pure Chemical Co., Ltd.). 30 ml of chitosan (Sokcho Mulsan) was added to 1 L of aqueous acetic acid solution, and the mixture was stirred for 6 hours. After stirring, 1 g of Bacillus subtilis (National Institute of Agricultural Sciences) as a strain of the genus Bacillus was added and reacted at room temperature for 24 hours. Then, by leaving it at 35 degrees for 24 hours, chitosan is sufficiently decomposed into chitooligosaccharides.
(2) 칼슘 이온을 함유하는 용액의 제조(2) Preparation of a solution containing calcium ions
충분한 양의 굴 패각(드림라인(주))을 세척하여 준비한다. 소성로의 온도를 1000 내지 1200도로 가열하고, 소성로에서 패각을 30~60분 정도 유지하여 소성한다. 소성된 패각을 실온에서 냉각하고, 파쇄하여 분말화한다. 이 때 분말의 입도는 400~800nm가 되도록 한다. 분말화된 패각 100중량부에 대해 1000중량부의 탈이온수를 첨가하고, 효모를 분말화된 패각 100중량부에 대해 1중량부 첨가하여 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조한다.Prepare a sufficient amount of oyster shells (Dreamline Co., Ltd.) by washing them. The temperature of the firing furnace is heated to 1000 to 1200 degrees, and the shell is maintained in the firing furnace for about 30 to 60 minutes to be fired. The fired shells are cooled at room temperature, crushed and powdered. At this time, the particle size of the powder is 400 ~ 800nm. 1000 parts by weight of deionized water is added to 100 parts by weight of powdered shells, and 1 part by weight of yeast is added to 100 parts by weight of powdered shells to prepare a solution containing calcium ions.
(3) 키토올리고당 용액과 칼슘 이온을 함유하는 용액의 혼합(3) Mixing of the chitooligosaccharide solution and the solution containing calcium ions
상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 55중량부와 칼슘 이온을 함유하는 용액 45중량부를 혼합한다. 이와 같은 방법에 의해 키토올리고당을 포함하는 혼합 조성물을 제조한다. 55 parts by weight of the chitooligosaccharide solution prepared in (1) and 45 parts by weight of the solution containing calcium ions are mixed. A mixed composition containing chitooligosaccharide is prepared by the above method.
시험예test example
1. 시험방법1. Test method
1.1. 시험균의 전배양1.1. Pre-culture of test bacteria
시험대상 균주로서 MRSA(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), VRSA(Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus), E. coli(Antibiotics Resistant Strain)를 각각 멸균된 LB 배지에 접종하여 18~24시간 동안 배양하였다. As strains to be tested, MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), VRSA (Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus), and E. coli (Antibiotics Resistant Strain) were each inoculated into a sterile LB medium and cultured for 18 to 24 hours.
1.2. 시험균액의 조제1.2. Preparation of test bacterial solution
전배양액을 600nm에서 흡광도를 측정하여 균의 배양정도를 확인한다. 시험대상 균주의 초기 배양액을 생균수가 1×105CFU/ml가 되도록 LB 배지로 희석하여 시험균액으로 사용하였다. 균액(1×105CFU/ml) 1ml를 새로운 튜브에 넣고 원심분리(13,500rpm, 1분)한 후 상등액을 제거하였다.The absorbance of the pre-culture solution is measured at 600 nm to confirm the degree of culture of the bacteria. The initial culture of the strain to be tested was diluted with LB medium so that the viable cell count was 1×10 5 CFU/ml, and used as the test strain. 1 ml of bacterial solution (1×10 5 CFU/ml) was put into a new tube, centrifuged (13,500 rpm, 1 minute), and the supernatant was removed.
1.3. 액상시료 조제1.3. liquid sample preparation
상기 실시예 1의 조성물을 포함하는 원액(이하, 액상시료 1), 원액에 식염수를 첨가하여 1/5 농도로 희석한 1/5 희석액(이하, 액상시료 2) 및 원액에 식염수를 첨가하여 1/10 농도로 희석한 1/10 희석액(이하, 액상시료 3)을 액상시료로서 준비하였다.A stock solution containing the composition of Example 1 (hereinafter, liquid sample 1), a 1/5 diluted solution diluted to 1/5 concentration by adding saline to the stock solution (hereinafter, liquid sample 2), and a saline solution added to the stock solution to obtain 1
1.4. 시험 절차1.4. test procedure
본 시험은 외용소독제 효능평가 시험 가이드(식품의약품안전평가원, 2014)에 따라 액상시료에 대한 항균효과를 평가하기 위하여 실시하였다. 시험군은 상등액을 제거한 시험균액에 액상시료 1ml를 넣고 잘 현탁한 후 실온에서 10분, 24시간 방치하였다. 대조군은 상등액을 제거한 시험균액에 PBS 1ml를 넣고 잘 현탁한 후 실온에서 10분, 24시간 방치하였다.This test was conducted to evaluate the antibacterial effect on liquid samples according to the external disinfectant efficacy evaluation test guide (Food and Drug Safety Evaluation Institute, 2014). For the test group, 1 ml of the liquid sample was added to the test bacterial solution from which the supernatant was removed, and after well-suspended, it was allowed to stand at room temperature for 10 minutes and 24 hours. For the control group, 1 ml of PBS was added to the test bacterial solution from which the supernatant was removed, and the mixture was well suspended and left at room temperature for 10 minutes and 24 hours.
10분, 24시간 방치된 시험군 및 대조군 각각을 원심분리(13,500rpm, 1분)한 후 상등액을 제거하고, 다시 배지 또는 PBS 1ml를 넣어 침전물을 잘 현탁하였다. 같은 조건으로 다시 원심분리를 한 후 상등액을 제거하는 세척 과정을 2회 반복한 다음 최종으로 침전물에 배지 또는 PBS 1ml를 넣어 잘 현탁하였다. After centrifugation (13,500 rpm, 1 minute) of each of the test group and the control group left for 10 minutes and 24 hours, the supernatant was removed, and the precipitate was well suspended by adding 1 ml of medium or PBS. After centrifugation again under the same conditions, the washing process of removing the supernatant was repeated twice, and finally, 1 ml of medium or PBS was added to the precipitate to suspend it well.
현탁한 시험군 및 대조군 액을 원액, 1/100 희석액, 1/1000 희석액으로 희석한 뒤 각각 0.1ml씩을 LB Agar 배지에 도말한 후, 37℃에서 24시간 배양하였다. After diluting the suspended test group and control solution with stock solution, 1/100 dilution, and 1/1000 dilution, 0.1 ml each was spread on LB Agar medium, and cultured at 37 ° C for 24 hours.
1.5. 결과 관찰1.5. Observe results
배양 후, 생균수가 관찰되는 경우 집락(Colony) 수를 계수하였다. 배지상의 균수에 10을 곱하여 CFU/ml을 산출하였다. 배지에서 균이 증식하지 않은 경우 『10 미만(< 10)』으로 표기하였다. 생균수는 [식1]에 따라 측정하였고, 저해율(%)는 [식2]에 따라 측정하였고, Log reduction은 [식3]에 따라 결정하였다. 단, 저해율과 Log reduction 값은 10분 대조군과 10분 시험군, 24시간 대조군과 24시간 시험군과 각각 비교하여 표기하였다.After culturing, the number of colonies was counted when the number of viable cells was observed. The number of bacteria on the medium was multiplied by 10 to calculate CFU/ml. If the bacteria did not proliferate in the medium, it was marked as 『less than 10 (< 10)』. The viable cell count was measured according to [Equation 1], the inhibition rate (%) was determined according to [Equation 2], and the log reduction was determined according to [Equation 3]. However, the inhibition rate and log reduction value were compared with the 10-minute control group and the 10-minute test group, and the 24-hour control group and the 24-hour test group respectively.
2.결과 계산2. Calculation of results
2.1. 생균수 계산 [식1]2.1. Calculation of viable cell count [Equation 1]
N = C × DN = C × D
N : 생균수N: number of viable cells
C : 집락수 (Colony 수)C: number of colonies (number of colonies)
D : 희석배수 (상수로 '10')D: dilution factor ('10' as constant)
2.2. 저해율(%) 계산 [식2]2.2. Inhibition rate (%) calculation [Equation 2]
저해율(%)=[대조군 균수(CFU)-시험군 균수(CFU)]/대조군 균수(CFU)x100Inhibition rate (%) = [number of bacteria in the control group (CFU) - number of bacteria in the test group (CFU)] / number of bacteria in the control group (CFU) x 100
2.3. Log reduction (LR) 계산 [식3]2.3. Log reduction (LR) calculation [Equation 3]
LR = mean log (microbial population) - mean log (surviving test population)LR = mean log (microbial population) - mean log (surviving test population)
단, Log 값은 소수점 다섯째 자리까지 표기하며 - 값이 도출되는 경우에는 0.0으로 표기한다.However, the log value is marked up to 5 decimal places, and when a - value is derived, it is marked as 0.0.
3. 결과 (Result)3. Results
3.1. MRSA에 대한 항균시험3.1. Antibacterial test for MRSA
아래 표 1에 실온에서 10분간 방치했을 때 시험 결과를 나타내며, 아래 표 2에 실온에서 24시간 방치했을 때 시험 결과를 나타낸다. MRSA에 대한 항균시험 결과를 도 1a 및 도 1b에 또한 나타낸다.Table 1 below shows the test results when left at room temperature for 10 minutes, and Table 2 below shows the test results when left at room temperature for 24 hours. Antibacterial test results for MRSA are also shown in FIGS. 1A and 1B.
아래 표 1 및 2에서 대조군은 PBS, 시험군 I은 액상시료 1, 시험군 II는 액상시료 2, 시험군 III은 액상시료 3을 의미한다.In Tables 1 and 2 below, the control group means PBS, test group I means
3.2. VRSA에 대한 항균시험3.2. Antibacterial test for VRSA
아래 표 3에 실온에서 10분간 방치했을 때 시험 결과를 나타내며, 아래 표 4에 실온에서 24시간 방치했을 때 시험 결과를 나타낸다. VRSA에 대한 항균시험 결과를 도 2a 및 도 2b에 또한 나타낸다.Table 3 below shows the test results when left at room temperature for 10 minutes, and Table 4 below shows the test results when left at room temperature for 24 hours. Antibacterial test results for VRSA are also shown in Figures 2a and 2b.
아래 표 3 및 4에서 대조군은 PBS, 시험군 I은 액상시료 1, 시험군 II는 액상시료 2, 시험군 III은 액상시료 3을 의미한다.In Tables 3 and 4 below, the control group means PBS, test group I means
3.3. E.Coli에 대한 항균시험3.3. Antibacterial test for E.Coli
아래 표 5에 실온에서 10분간 방치했을 때 시험 결과를 나타내며, 아래 표 6에 실온에서 24시간 방치했을 때 시험 결과를 나타낸다. E.Coli에 대한 항균시험 결과를 도 3a 및 도 3b에 또한 나타낸다.Table 5 below shows the test results when left at room temperature for 10 minutes, and Table 6 below shows the test results when left at room temperature for 24 hours. Antibacterial test results for E. Coli are also shown in FIGS. 3A and 3B.
아래 표 5 및 6에서 대조군은 PBS, 시험군 I은 액상시료 1, 시험군 II는 액상시료 2, 시험군 III은 액상시료 3을 의미한다.In Tables 5 and 6 below, the control group means PBS, test group I means
4. 결론4. Conclusion
상기 시험 결과의 0분, 24시간 후의 log reduction 값은 각 균주에 대하여 아래와 같이 나타났다. 아래 표 7에는 10분 방치했을 때 항균시험 결과의 종합을 나타내며, 표 8에는 24시간 방치했을 때 항균시험 결과의 종합을 나타낸다. 표 7 및 8에서 LR은 log reduction을 의미하고, 다음 식에 의해 계산된다.The log reduction values after 0 minutes and 24 hours of the test results were shown below for each strain. Table 7 below shows the synthesis of antibacterial test results when left for 10 minutes, and Table 8 shows the synthesis of antibacterial test results when left for 24 hours. In Tables 7 and 8, LR means log reduction and is calculated by the following equation.
LR = mean log (microbial population) - mean log (surviving test population) LR = mean log (microbial population) - mean log (surviving test population)
상기 표의 결과의 해석을 아래 표 9에 나타낸다.The interpretation of the results of the above table is shown in Table 9 below.
본 시험 조건하에서 액상시료 각 농도(원액, 1/5희석액, 1/10희석액)에 대한 10분 후의 log reduction 값과 저해율(%)은 MRSA에 대하여 각각 >3.53(99.9% 이상), >2.02(99% 이상), >1.61(90% 이상)로 나타났다. 24시간 후의 log reduction 값과 저해율(%)은 MRSA에 대하여 각각 >4.82(99.99% 이상), >4.82(99.99% 이상), >4.82(99.99% 이상)으로 나타났다.Under these test conditions, the log reduction value and inhibition rate (%) after 10 minutes for each concentration of the liquid sample (undiluted solution, 1/5 dilution, 1/10 dilution) were >3.53 (more than 99.9%) and >2.02 ( respectively) for MRSA. 99% or more), >1.61 (90% or more). The log reduction value and inhibition rate (%) after 24 hours were >4.82 (more than 99.99%), >4.82 (more than 99.99%), and >4.82 (more than 99.99%) for MRSA, respectively.
본 시험 조건하에서 액상시료 각 농도(원액, 1/5희석액, 1/10희석액)에 대한 10분 후의 log reduction 값과 저해율(%)은 VRSA에 대하여 각각 >4.76(99.99% 이상), >4.76(99.99% 이상), >3.28(99.9% 이상)으로 나타났다. 24시간 후의 log reduction 값과 저해율(%)은 VRSA에 대하여 각각 >3.54(99.9% 이상), >3.24(99.9% 이상), >4.54(99.99% 이상)로 나타났다. Under these test conditions, the log reduction value and inhibition rate (%) after 10 minutes for each concentration of the liquid sample (undiluted solution, 1/5 diluted solution, 1/10 diluted solution) were >4.76 (more than 99.99%) and >4.76 (99.99% or more) for VRSA, respectively. 99.99% or more), >3.28 (99.9% or more). The log reduction value and inhibition rate (%) after 24 hours were >3.54 (99.9% or more), >3.24 (99.9% or more), and >4.54 (99.99% or more), respectively, for VRSA.
본 시험 조건하에서 액상시료 각 농도(원액, 1/5희석액, 1/10희석액)에 대한 10분 후의 log reduction 값과 저해율(%)은 E. coli에 대하여 각각 >4.57(99.99% 이상), >1.98(90% 이상), >1.30(90% 이상)으로 나타났다. 24시간 후의 log reduction 값과 저해율(%)은 E. coli에 대하여 각각 >4.72(99.99% 이상), >4.72(99.99% 이상), >4.72(99.99% 이상)로 나타났다. Under these test conditions, the log reduction value and inhibition rate (%) after 10 minutes for each concentration of the liquid sample (undiluted solution, 1/5 dilution, 1/10 dilution) were >4.57 (more than 99.99%) for E. coli, > 1.98 (more than 90%) and >1.30 (more than 90%). The log reduction value and inhibition rate (%) after 24 hours were >4.72 (more than 99.99%), >4.72 (more than 99.99%), and >4.72 (more than 99.99%) for E. coli, respectively.
일반적으로 항균력이라 표현할 때는 보편적으로 일시적인 항균력을 표현하고 있고, 바로 항균력 저하 뒤에는 재차 감염되는 사항이 일어나고 있는 것이 현실이다. 항균력 환경을 지속적으로 일정시간 유지하기가 어려웠다. 본 발명의 조성물은 MRSA, VRSA, E-Coli에 대한 지속적인(24시간) 항균력을 유지하고 있고, 이에 응용하여 의약, 의료기기, 건강식품, 농축산 및 어업 등에 활용하는 것이 가능해졌다.In general, when expressing antibacterial activity, temporary antibacterial activity is generally expressed, and it is a reality that re-infection occurs immediately after the antibacterial activity decreases. It was difficult to maintain the antibacterial environment continuously for a certain period of time. The composition of the present invention maintains continuous (24 hours) antibacterial activity against MRSA, VRSA, and E-Coli, and can be applied to medicines, medical devices, health foods, agricultural and livestock farming, and fisheries.
Claims (5)
(2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 및 상기 (2)에서 제조된 칼슘 이온을 함유하는 용액을 혼합하고,
상기 (1) 키토올리고당 용액을 제조하는 단계는,
아세트산 수용액 100중량부에 키토산 2 내지 5중량부를 첨가하여 교반하는 단계; 바실러스 속 균주 0.5~5중량부를 추가로 첨가하여 24~48시간 동안 반응시키는 단계; 및 30~40도에서 24~48시간 동안 방치하는 단계;를 포함하며,
상기 (2) 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계는,
패각을 세척하여 준비하는 단계; 1000 내지 1200도의 소성로에서 패각을 30~60분 동안 소성하는 단계; 실온에서 냉각하는 단계; 소성된 패각을 파쇄하여 분말화하는 단계; 분말화된 패각에 탈이온수를 첨가하고, 효모 처리하여 칼슘 이온을 함유하는 용액을 제조하는 단계를 포함하는, 키토올리고당을 포함하는 혼합 조성물의 제조 방법.(1) preparing a chitooligosaccharide solution using a strain of the genus Bacillus;
(2) preparing a solution containing calcium ions; and
(3) mixing the chitooligosaccharide solution prepared in (1) above and the solution containing calcium ions prepared in (2) above;
The (1) step of preparing the chitooligosaccharide solution,
Adding 2 to 5 parts by weight of chitosan to 100 parts by weight of an aqueous acetic acid solution and stirring; Reacting for 24 to 48 hours by additionally adding 0.5 to 5 parts by weight of a strain of the genus Bacillus; And leaving for 24 to 48 hours at 30 to 40 degrees; includes,
The (2) step of preparing a solution containing calcium ions,
Washing and preparing shells; Baking the shells in a firing furnace at 1000 to 1200 degrees for 30 to 60 minutes; cooling to room temperature; Crushing and pulverizing the calcined shells; A method for preparing a mixed composition containing chitooligosaccharide, comprising adding deionized water to powdered shells and treating yeast to prepare a solution containing calcium ions.
상기 (1) 단계의 바실러스 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸미루스(Bacillus pumilus) 및 바실러스 소노렌시스(Bacillus sonorensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인, 혼합 조성물의 제조 방법.According to claim 1,
The Bacillus genus strain in step (1) is selected from the group consisting of Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus and Bacillus sonorensis. A method for producing one or more mixed compositions.
상기 (2) 단계에서, 상기 탈이온수는 패각 100중량부에 대해 1000~2000중량부로 첨가되고, 효모는 패각 100중량부에 대해 0.5~2중량부로 첨가되는 혼합 조성물의 제조 방법.According to claim 1 or 2,
In the step (2), the deionized water is added in an amount of 1000 to 2000 parts by weight based on 100 parts by weight of the shell, and the yeast is added in an amount of 0.5 to 2 parts by weight based on 100 parts by weight of the shell.
상기 (3) 단계는 상기 (1)에서 제조된 키토올리고당 용액 40 내지 60중량부 및 상기 (2)에서 제조된 칼슘 이온을 함유하는 용액 60 내지 40중량부를 혼합하는 단계인, 혼합 조성물의 제조 방법.According to claim 1 or 2,
Step (3) is a step of mixing 40 to 60 parts by weight of the chitooligosaccharide solution prepared in (1) and 60 to 40 parts by weight of the solution containing calcium ions prepared in (2) above. .
A mixed composition comprising chitooligosaccharide prepared by the method of claim 1 or 2.
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