KR20230065527A

KR20230065527A - 전기방사를 이용한 인공혈관 스텐트 그라프트 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20230065527A
Application number: KR1020210151192A
Authority: KR
Inventors: 강성권; 이봉수; 김형태; 문창기; 강서희; 이구현; 천다애; 이상근
Original assignee: 주식회사 에스앤지바이오텍
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2023-05-12

Abstract

본 발명은 전기방사를 이용한 합성고분자-천연고분자 인공혈관 스텐트 그라프트 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 합성고분자, 천연고분자 및 용매로 구성된 혼합 고분자 용액을 전기방사 기법을 이용하여 금속 스텐트에 결합시켜 제작된 인장강도 및 유연성이 뛰어나고, 신생 내막의 형성 가능성이 적으며 생체 적합성 및 혈액 적합성이 뛰어난 인공혈관 스텐트 그라프트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 인공혈관 스텐트 그라프트는 혈액 투석용(hemodialysis), 소아 심장 수술용(palliative pediatric cardiac procedures), 말초 혈관 시술용, 대동맥 시술용 (박리증, 대동맥류 혈관질환), 정맥 시술용, 모세혈관 시술용, 식도, 담관, 기도 및 요관 등의 비혈관 스텐트의 커버용, 및 혈관, 체강 등 인체 조직의 폐색을 복원할 목적으로 사용되는 기구 및 혈관용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

전기방사를 이용한 인공혈관 스텐트 그라프트 및 이의 제조 방법{Artificial vascular stent graft using electrospinning and manufacturing method thereof}

본 발명은 전기방사를 이용한 합성고분자-천연고분자 인공혈관 스텐트 그라프트 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 합성고분자, 천연고분자 및 용매로 구성된 혼합 고분자 용액을 전기방사 기법을 이용하여 금속 스텐트에 결합시켜 제작된 인장강도 및 유연성이 뛰어나고, 신생 내막의 형성 가능성이 적으며 생체 적합성 및 혈액 적합성이 뛰어난 인공혈관 스텐트 그라프트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

혈관은 혈액을 심장과 인체 각 장기 및 조직 사이를 순환시키는 통로로서, 심장에서 나오는 혈액을 온몸으로 운반하고, 순환한 혈액을 심장으로 되돌려 보내는 통로이다. 따라서 혈액에 포함된 영양분, 호르몬 또는 산소를 공급하고 노폐물을 기관으로 이송하는 작용을 하기 때문에 혈관에 이상이 생기면 동맥경화, 뇌혈관 질환, 혈관염, 정맥류 또는 정맥혈전증이 발생할 수 있다.

종래부터 대동맥류의 치료는 e-PTFE제나 PET제 인공 혈관을 이용한 인공 혈관 치환술이 행해져 왔는데, 이 방식에서는 개흉 혹은 개복 수술 등 대규모의 외과적 수술을 동반하기 때문에 신체적 부담이 크고, 고령자나 병존증을 갖는 환자에 대한 적용에 한계가 있음과 동시에, 장기간의 입원 치료를 요하기 때문에 환자나 의료 시설측의 경제적 부담이 크다는 문제가 있다.

그러나, 스텐트 그라프트를 이용한 경(經)카테터적 혈관 내 치료는, 개흉, 개복 수술을 동반하지 않기 때문에 외과적 이식에 더 편리함이 있고, 상기 신체적, 경제적 부담이 저감되는 점에서 최근 그 적응이 급속히 확대되고 있다.

상기 스텐트 그라프트는 일반적인 금속의 지지틀로 되어 있는 스텐트와 다르게, 스텐트와 그라프트로 구성되어 있으며, 금속의 지지틀인 스텐트에 그라프트를 부착하고, 봉합실을 이용하여 스텐트와 그라프트를 결합한 것이다.

이때, 금속의 지지틀인 스텐트는 내구성 강화를 위해 스테인레스 스틸(Stainless steel), 니티놀(Nitinol), 코발트-크롬(Cobalt chromium) 등의 금속으로 형성되는데, 이로 인하여 스텐트 삽입시 또는 스텐트 팽창시에 혈관 찢어짐을 유발하여 출혈이 발생하거나 혈관 내벽의 혈전들이 떨어져 나와 혈류를 타고 이동하여 다른 부위에 혈전이 쌓이게 되는 등의 문제가 발생하고 있다.

상기 금속의 지지틀인 스텐트에 그라프트를 부착하는 방법으로는 스텐트를 액체 실리콘 등에 딥핑(Dipping)하는 방식으로 제조하거나, 실리콘 또는 폴리우레탄 재질의 필름을 별도로 제조한 후 스텐트의 외주면을 감싸도록 씌워 필름의 양측 종단을 봉합사를 이용하여 스텐트에 고정시키는 방법이 일반적으로 사용된다.

하지만, 이러한 공정 중 딥핑 공정을 이용하는 경우에는 실리콘이 스텐트의 전 면적에 도포되므로 소화기계통 등과 같이 굴곡진 부분에 적용되는 경우에는 초기 상태로 복귀하려는 복원력이 강하게 작용한다. 즉, 스텐트의 유연성이 떨어져 병변에 마찰을 가져와 염증이 발생할 수 있는 문제점이 있다. 또한 필름을 이용한 방법은 봉합사를 이용하여 필름을 스텐트에 결합 및 고정시 봉합사가 통과한 부분이 찢어지거나 봉합사 부분으로 혈액이나 체액의 누출이 발생할 수 있으며, 그 부분으로 병변이 자라나거나 혈전이 쌓이게 되는 등의 문제점이 있다.

따라서, 스텐트 그라프트를 적용하였을 때 병변에 마찰을 주거나 혈액 누출이 되지 않도록 봉합사의 유지 강도가 좋으며, 인장 강도, 유연성이 뛰어나고, 순응도, 생체 적합성, 혈액 적합성이 뛰어나며, 신생 내막 형성 가능성이 적은 스텐트 그라프트의 개발이 요구되고 있다.

미국등록특허 제10-9474833호 일본공개특허 제2003-250880호 미국등록특허 제6482227호

본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 발명된 것으로, 인장강도 및 유연성이 뛰어나고, 신생 내막의 형성 가능성이 적으며 생체 적합성 및 혈액 적합성이 향상된 전기방사를 이용한 합성고분자-천연고분자 인공혈관 스텐트 그라프트 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 합성고분자-천연고분자 인공혈관 스텐트 그라프트를 제공한다.

상기 인공혈관 스텐트 그라프트는

1 ~ 5 중량%의 합성고분자 및 10 ~ 25 중량%의 천연고분자 및 용매로 구성된 혼합 고분자 용액을 전기방사하여 제작된 인공 피막; 및

금속 스켈레톤;을 포함하고,

상기 금속 스켈레톤의 한쪽 말단에 상기 인공 피막이 봉합(suture)되어 결합되어 있다.

상기 합성 고분자는 폴리우레탄(Polyurethane, PU), 실리콘(Silicone), 폴리에틸렌 테레프타레이트(Polyethylene terephthalate, PET), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE), 확장형 폴리테트라플루오로에틸렌(Expanded Polytetrafluoroethylene, ePTFE), 폴리디옥사논폴리디옥사논(Polydioxanone, PDO), 폴리-L-락트산(poly(L-lacide), PLLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 및 폴리-ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone), PCL)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 상기 천연 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브린, 키틴, 키토산, 히알루론산, 헤파린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

상기 금속 스켈레톤의 소재는 니티놀(Nitinol), 백금-이리듐 합금(Platinum-iridium, PtIr), 티타늄(Titanium, Ti), 코발트-크롬 합금(Cobalt-chromin, CoCr), 니켈-크롬(Nickel-chromin, NiCr), 탄탈륨(Tantalum, Ta), 알루미늄(Aluminium, Al), 지르코늄(Zirconium, Zr), 크롬(Chrom, Cr), 니켈(Nickel, Ni) 및 스테인레스 스틸(Stainless Steel)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

상기 금속 스켈레톤은 두께 0.90 내지 0.55mm의 와이어로 구성된 스텐트 구조를 가지는 것이 바람직하다.

상기 용매는 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-isopropanol, HFIP), 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide, DMF), 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF), 다이클로로메테인(Dichloromethane, DCM), 클로로포름(Chloroform) 및 아세톤(Acetone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

상기 봉합(suture)을 위한 봉합사는 폴리프로필렌(Polypropylene, PP), 나일론(Nylone), 폴리에틸렌(Polyethylene, PE), 폴리디옥사논폴리디옥사논(Polydioxanone, PDO), 폴리-L-락트산(poly(L-lacide), PLLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 및 폴리-ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone), PCL)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은

전기방사장치 내 컬렉터(Collector)에 금속 스켈레톤(Skeleton)을 설치하는 제1 단계;(S1)

상기 제1 단계에서 설치된 금속 스켈레톤(Skeleton)에 1 ~ 5 중량%의 합성고분자 및 10 ~ 25 중량%의 천연고분자 및 용매로 구성된 혼합 고분자 용액을 전기방사하여 인공피막을 제작하는 제2 단계;(S2)

상기 제2 단계의 전기방사된 스켈레톤(Skeleton)의 한 쪽 말단을 봉합(suture)하여 스켈레톤과 인공 피막을 결합시키는 제3 단계;(S3)을 포함하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법을 제공한다.

상기 전기방사의 조건은 전압 10 내지 20kV, 팁과 컬렉터의 거리(TCD, Tip to collector distance)가 10 내지 20cm 및 방사 속도 0.5 내지 3ml/h인 것이 바람직하다.

본 발명의 전기방사를 이용한 합성고분자-천연고분자 인공혈관 스텐트 그라프트는 합성고분자, 천연고분자 및 용매로 구성된 혼합 고분자 용액을 전기방사 기법을 이용하여 금속 스텐트에 결합시켜 제작된 인장강도 및 유연성이 뛰어나다.

또한, 인체에 적용함에 있어서 신생 내막의 형성 가능성이 적으며, 순응도가 높고, 생체 적합성, 혈액 적합성이 뛰어나고 혈액 세포에 대한 비침투성이 향상되고, 시각적 관찰이 용이하며, 외과적 이식에 더 편리하다.

도 1은 본 발명의 인공혈관 스텐트 그라프트 제조방법의 공정도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 나이티놀 스켈레톤 위에 전기방사 장치를 이용하여 전기방사를 하는 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 스켈레톤의 구조에 대한 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 스텐트 그라프트의 사진이다.
도 5는 본 발명의 평가예 1의 시험 회수 1의 인장 하중 그래프이다.
도 6은 본 발명의 평가예 1의 시험 회수 2의 인장 하중 그래프이다.
도 7은 본 발명의 평가예 1의 시험 회수 3의 인장 하중 그래프이다.
도 8은 본 발명의 평가예 2의 세포독성시험의 판독 기준에 대한 사진이다.
도 9는 본 발명의 평가예 3의 공시험액을 고려한 % 용혈도 산출 공식에 대한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 상세한 설명은 생략할 수 있다.

본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적 의미로 한정되어 해석되지 아니하며, 본 발명의 기술적 사항에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예이며, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것이 아니므로, 본 출원 시점에서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있다.

본 발명은 합성고분자-천연고분자 인공혈관 스텐트 그라프트를 제공한다.

상기 인공혈관 스텐트 그라프트는

금속 스켈레톤;을 포함하고,

상기 합성 고분자의 중량% 범위를 초과할 경우 고분자 방사 용액이 담긴 시린지의 니들 끝에 형성된 반구형의 고분자 방울의 중력에 영향으로 집진기(Collector)에 일부 낙하하여 원하는 형태의 나노 섬유를 얻지 못하는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달 할 경우 고분자 용액의 낮은 점도로 인해 반구형의 구슬상이 필라 형태의 나노 섬유로 변화되지 못하는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 천연 고분자의 중량% 범위를 초과할 경우 고분자의 양이 상대적으로 적어 고분자 방사 용액에서의 합성 고분자의 비율이 낮아 충분한 기계적 강도를 지닌 나노 섬유 형성이 힘들다는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달할 경우 생체적합성을 가진 고분자 멤브레인의 형성이 힘들 수 있다는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 금속 스켈레톤은 두께 0.09 내지 0.55mm의 와이어로 구성된 스텐트 구조를 가지는 것이 바람직하다.

상기 와이어(Wire)의 두께가 상기 범위를 초과할 경우 스텐트의 굽힘력(Beding force)이 너무 강하여 혈관 확장을 위해 삽입될 때 혈관에 손상을 가할 수 있다는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달할 경우 협착된 혈관 등의 부위를 확장시키거나 확장 후 개통 유지가 힘들다는 문제점이 발생할 수 있다.

또한, 본 발명은

상기 제2 단계에서 합성 고분자의 중량% 범위를 초과할 경우 고분자 방사 용액이 담긴 시린지의 니들 끝에 형성된 반구형의 고분자 방울의 중력에 영향으로 집진기(Collector)에 일부 낙하하여 원하는 형태의 나노 섬유를 얻지 못하는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달 할 경우 고분자 용액의 낮은 점도로 인해 반구형의 구슬상이 필라 형태의 나노 섬유로 변화되지 못하는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 제2 단계에서 천연 고분자의 중량% 범위를 초과할 경우 고분자의 양이 상대적으로 적어 고분자 방사 용액에서의 합성 고분자의 비율이 낮아 충분한 기계적 강도를 지닌 나노 섬유 형성이 힘들다는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달할 경우 생체적합성을 가진 고분자 멤브레인의 형성이 힘들 수 있다는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 전기방사의 전압이 상기 범위를 초과할 경우 너무 미세한 나노 섬유가 형성되어 인공혈관에 사용되는 그라프트로써 가져야 하는 유연성 및 인장력 등의 물리적 강도가 약할 수 있다는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달할 경우 고분자 방사 용액의 표면장력을 이겨내지 못하여 구슬상의 모양으로 컬렉터(집진기)에 떨어져 기다란 나노 섬유 형태가 제조되지 힘들다는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 팁과 컬렉터의 거리가 상기 범위를 초과할 경우 고분자 용액으로 형성된 반구형 방울이 회전 컬렉터(Collector, 집전기)를 향해 진행하는데, 중력에 의해 방향이 바뀔 수 있어 원하는 위치에 나노 섬유가 형성되기 힘들다는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달할 경우 고분자 방사 용액의 반구형 방울상이 길쭉한 나노 섬유 형태로 형성될 수 있는 시간이 부족한 채로 컬렉터(집진기)에 닿게 되어 원하는 나노 섬유상을 재현하지 못한다는 같은 문제점이 발생할 수 있다.

상기 방사 속도가 상기 범위를 초과할 경우 길쭉한 형태의 나노 섬유가 빠르게 컬렉터(집진기)에 쌓일 수 있지만 고밀도의 나노섬유 그라프트가 형성되기 힘들다는 문제점이 발생할 수 있으며, 상기 범위를 미달할 경우 큰 문제점은 없으나 컬렉터(집진기)에 고분자 나노 섬유가 적층되는 속도가 늦어진다는 단점이 발생할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

실시예 1 혼합 고분자 용액의 제조

폴리우레탄 0.3g에 5mL의 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-isopropanol, HFIP) 용매를 유리 비커와 같은 용기에 섞은 뒤 상온에서 12시간 이상 혼합하여 1차 용액을 제조하였다. 이후 0.045g 젤라틴에 5mL의 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-isopropanol, HFIP) 용매를 유리 비커와 같은 용기에 섞은 뒤 상온에서 12시간 이상 혼합하여 2차 용액을 제조하였다.

상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하여 상온에서 12시간 이상 혼합하여 혼합 고분자 용액을 제조하였다.

실시예 2 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조

나이티놀 스켈레톤과 회전 컬렉터(Collector)를 준비한 후, 회전 컬렉터(Collector)에 나이티놀 스켈레톤을 결합시킨 후 전기방사 장치에 장착하였다. 이때 사용된 나이티놀 스켈레톤의 직경과 길이는 각각 24mm 및 120mm의 치수를 가진다.

상기 실시예 1로 제조된 혼합 고분자 용액을 전기방사 장치를 이용하여 전기방사하여 나이티놀 스켈레톤에 전기방사하였다. 이때 전기방사 시간은 1시간 이상 수행하였으며, 전압은 15kV, 노즐 팁과 컬렉터의 거리는 15cm, 방사 속도는 1.5mL/h이다.

전기방사가 종료된 후 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-isopropanol, HFIP) 용매를 제거하기 위해 상온에서 건조를 실시하였다. 이후 건조가 완료된 폴리우레탄 커버 나이티놀 스켈레톤의 한 쪽 끝단을 폴리프로필렌(PP)의 실을 이용하여 바느질 처리함으로써 봉합 처리하여 인공혈관 스텐트 그라프트를 제조하였다.

비교예 1 폴리우레탄 그라프트 용액 제조

젤라틴을 포함하지 않는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 폴리우레탄 그라프트 용액을 제조하였다.

비교예 2 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조

비교예 1의 폴리우레탄 그라프트 용액을 사용하는 것을 제외하고 실시예 2와 동일한 방법으로 인공혈관 스텐트 그라프트를 제조하였다.

평가예 1 인장강도 실험

실시예 2 및 비교예 2로 제조된 인공혈관 스텐트 그라프트의 인장강도를 확인하기 위해 실시예 2 및 비교예 2로 제조된 인공혈관 스텐트 그라프트의 전기방사로 제조된 그라프트 시료를 이용해 인장강도 실험을 진행하였다. 이때 그라프트 시료의 두께는 0.015mm이다.

실험은 AMETEK Inc. 사의 LLOYD INSTRUMETN LR5K plus 인장강도 시험기를 이용하였고, 50N의 Load Cell을 인장강도 시험기에 장착한 후 인장강도 시험기 상하부 지그(Jig)에 5cm로 자른 실시예 2 및 비교예 2의 그라프트 시료를 양쪽 1cm씩 고정하고, 인장강도 시험기의 속도를 50mmm/min으로 설정하여 각각 1회, 2회, 3회 시험을 실시하여 실의 파단 강도를 측정하였다.

	그라프트 시편의 종류
시험 회수	실시예 2(폴리우레탄-젤라틴)	비교예 2(폴리우레탄)
1	3.22	0.79
2	8.07	0.85
3	4.94	0.61
평균 하중	5.41	0.75

상기 표 1은 그라프트 인장 하중 측정값(단위: N)에 관한 것이다. 상기 표 1을 참고하면, 실시예 2에 대한 1회의 인장강도 실험을 실시하였을 때의 인장 하중은 3.22N이고(도 5참조), 2회의 인장강도 실험을 실시하였을 때의 인장 하중은 8.07N이며(도 6 참조), 3회의 인장강도 실험을 실시하였을 때의 인장 하중은 4.94N(도 7 참조)으로 평균 하중이 5.41N인 것을 확인할 수 있다.

반면에, 비교예 2에 대한 1회의 인장강도 실험을 실시하였을 때의 인장 하중은 0.79N, 2회의 인장강도 실험을 실시하였을 때의 인장 하중은 0.85N, 3회의 인장강도 실험을 실시하였을 때의 인장 하중은 0.61N으로 평균 하중이 0.75N인 것을 보아 실시예 2로 제조된 인공혈관 스텐트 그라프트의 그라프트 시료의 평균 인장 하중이 비교예 2 보다 7.21배 높은 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 실시예 2에 따른 폴리우레탄-젤라틴 그라프트의 인장 하중이 기존의 폴리우레탄으로만 구성된 커버류 또는 그라프트류에 비해 인장 하중이 매우 높음을 확인할 수 있었다.

평가예 2 생체 적합성 확인

실시예 2로 제조된 인공혈관 스텐트 그라프트의 생체 적합성을 확인하기 위해 세포독성 실험을 진행하였다.

단층 배양된 세포에 트립신(Trypsin/EDTA, gibco)을 처리하여 세포 농도가 1mL당 10⁵개가 되도록 조정하고, 약 10cm²의 well (6-well tissue culture plate, Φ 35mm/well)에 2mL 씩 접종하였다. (37±1)℃, (5±1)% CO₂ 배양기에서 24시간 이상 배양하여 단층 배양이 된 well을 선택하고, 각각의 시험물질 처리군 및 대조군으로 표기한 다음 배지를 제거하였다. 시험물질 처리군, 용매대조군 (Reagent control), 음성대조군 (Negative control) 및 양성대조군 (Positive control)을 3개의 선택된 well에 2mL씩 분주하고 (37±1)℃, (5±1)% CO₂ 배양기에서 (48±1)시간 동안 배양하였다. 배양 후, 현미경 상으로 (100x) 세포의 용해나 형태를 관찰하였다.

아래 표 3은 용매 대조 물질에 관한 것이고, 표 4는 음성 대조 물질에 관한 것이며, 표 5는 양성 대조 물질에 관한 것이다.

명칭	제조원	Lot No.	보관 조건
Minimum Essential Medium with Horse serum 10% (v/v), Penicillin Streptomycin 1% (v/v)	gibco	MEM ^a (2192541) HS ^b (2208948) PS ^c (2199829)	냉장 [(2 ~ 8)℃]

명칭	제조원	Lot No.	보관 조건
High Density Polyethylene Film	Hatano Research Institute (Food and Drug Satety Center)	C-191	실온 [(1 ~ 30)℃]

명칭	제조원	Lot No.	보관 조건
ZDEC Polyurethane Film	Hatano Research Institue (Food and Drug Safety Center)	A-191K	실온 [(1 ~ 30)℃]

세포의 용해나 형태를 관찰한 후, 트립신(Trypsin/EDTA)을 처리하여 세포를 플레이트에서 떼어낸 후 각 시험군에서의 생세포를 계수하였다.

세포의 균일한 단층(Confluent monolyaer)이 존재하는 경우에는 (+), 존재하지 않는 경우에는 (-)로 표현하였으며, 배양된 각 well의 세포 용해도와 세포의 형태적 변화 정도를 기록하였다. 또한 음성대조군과 시험군의 배지의 색도 비교하여 관찰하였다. 배지의 색이 노란색으로 변하는 경우 배지가 용출물에 의해 산성으로 변하였다고 판단하고, 심홍색이나 보라색으로 변하는 경우 배지가 염기성으로 변하였다고 판단하였다. 세포독성시험의 최종적 결과 판독은 다음의 ISO 10993-5, 8.5 Determination of cytotoxicity(도 8 참조)에 따라 실시하였다.

실험의 유효성 입증을 위해, 용매대조군(Reagent control)과 음성대조군(Negative control)은 세포독성을 나타내지 않아야 하고(Grade 0), 양성대조군 (Positive control)은 중간 이상의 세포독성을 나타내어야 한다.(>Grade 2). 각 대조군이 예상했던 결과를 나타내지 않거나 3개의 시험물질 처리군에서 서로 다른 결과가 관찰되었을 때에는 재시험을 실시하였다.

실험에 있어서 반응 부위의 상태와 용해의 정도는 표 7에 나타내었다. 시험물질의 용출물이 처리된 세포에서 배양 후 균일한 단층은 유지되었으나 약 40%의 증식저해가 관찰되었다. 따라서 시험물질의 용출물은 배양세포에 대해 미약한 반응성이 있다고 볼 수 있다.

Well	Confluent monolayer	% Growth inhibition	% Cells without intracellular granulation	% Rounding	% Lysis	Reactivity	Grade
Test(1)	(+)	40	0	0	0	Mild	2
Test(2)	(+)	40	0	0	0	Mild	2
Test(3)	(+)	40	0	0	0	Mild	2
Negative control(1)	(+)	0	0	0	0	None	0
Negative control(2)	(+)	0	0	0	0	None	0
Negative control(1)	(+)	0	0	0	0	None	0
Reagent control(1)	(+)	0	0	0	0	None	0
Reagent control(1)	(+)	0	0	0	0	None	0
Reagent control(1)	(+)	0	0	0	0	None	0
Positive control(1)	(-)	100	N/A	N/A	100	Severe	4
Positive control(1)	(-)	100	N/A	N/A	100	Severe	4
Positive control(1)	(-)	100	N/A	N/A	100	Severe	4

또한 생세포의 계수를 통해 정량 분석을 실시해 본 결과, 표 8을 참고하면 시험물질의 용출물이 살아있는 세포수에 미약하게 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 용매대조군 및 음성대조군은 배양세포에 대해 독성을 나타내지 않았으며, 양성대조군은 전체 세포의 75% 이상에서 세포독성을 야기하였다.

Group Line	Result of cell counting(cells/mL)
Group Line	Test group	Reagent control	Negative control	Positive control
1	5.5X10⁵	8.0X10⁵	7.8X10⁵	0
2	4.6X10⁵	8.1X10⁵	8.3X10⁵	0
3	5.1X10⁵	8.4X10⁵	7.6X10⁵	0
Average	5.1X10⁵	8.2X10⁵	7.9X10⁵	0
RCC(%)	62.2	100.0	97.8	0.0

따라서 상기 실험의 결과, 본 실험의 시험조건하에서 시험물질의 용출물은 배양배지의 산성도를 변화시키지 않는 것으로 판단하여 마우스 섬유아세포에 미약한 증식저해를 나타내는 것으로 보인다. 따라서 본 시험에 사용된 시험물질의 용출은 미약한 세포독성이 있는 것으로 사료되고, ISO 10993-5의 세포독성 판단 기준에 따라 Grade 2(Mild)로 판단되며, Grade 2(Mild) 이하이어야 하는 일반적 의료기기의 세포독성 시험기준에 부합한다. 또한, 용매대조군, 음성대조군 및 양성대조군의 시험결과는 본 시험 결과의 유효성을 입증하고 있다.

평가예 3 혈액 적합성 확인

실시예 2로 제조된 인공혈관 스텐트 그라프트의 혈액 적합성을 확인하기 위해, 용혈성 평가를 실시하였다.

명칭	제조원	Lot No.	보관 조건
Hemoglobin human	Sigma-Aldrich Co.	SLBX7566	냉장 [(2 ~ 8)℃]

1. 표준헤모글로빈 용액의 조제

먼저 표준 헤모글로빈을 칭량한 후 튜브에 넣고, PBS(Phosphate buffered saline, (Ca- and Mg-free))를 가하여 각 농도의 최종 액량의 표선까지 맞추고, vortex mixer로 진탕하여 균일하게 혼합하였다.

2. Drabkin's 용액의 조제

1000 mL의 증류수에 Drabkin’s Reagent 1 vial과 30% Brij L23 Solution (non-ionic detergent) 0.5mL을 넣고 충분히 용해시켜 조제한 후, 이를 차광 및 실온 보관하며, 보존 기한은 조제 후 6개월로 하여 Drabkin's 용액을 제조하였다.

3. 헤모글로빈 결정

표준 헤모글로빈 용액에 Drabkin’s 용액을 가하여 6개의 각기 다른 농도의 표준헤모글로빈 희석용액을 준비하였다. 단, 헤모글로빈 농도 범위는 (0.035 ~ 0.7)mg/mL 로 하였다. 15분 반응시킨 후, 540nm에서 각 표준헤모글로빈 희석용액의 흡광도를 측정(UV-1800, SHIMADZU, Japan)하였다. 이때 Drabkin’용액을 zero blank로 사용하였다. 흡광도 측정결과를 토대로 Y축에는 헤모글로빈 농도, X축에는 흡광도 측정값을 대입한 Standard curve를 산출하였다.

4. 유리 헤모글로빈 양 측정

토끼혈액을 (700 ~ 800)g로 15분 원심분리하였다. 이후 상층액(혈장)과 Drabkin’s 용액을 1:1 비율로 섞어 준 후 15분 반응시켰다. 15분 반응 후에 540nm에서 흡광도를 측정하고 다음 식에 따라 희석배수 2를 곱하여 유리 헤모글로빈의 양을 구하였다.(PFH(Plasma Free Hemoglobin) = A^PFH (흡광도) x F (기울기) x 2(희석 배수))

측정 결과, 유리 헤모글로빈의 양은 0.483mg/mL로 기준 값인 2mg/mL 보다 낮아 본 실험에 사용하였다.

5. 전체 혈액 헤모글로빈 양 측정

토끼혈액 20μ를 Drabkin’s 용액 5mL에 넣고 15분 반응시켰다. 15분 반응 후에 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기의 과정을 2회 실시한 후, 헤모글로빈 표준곡선을 이용하여 다음 식에 따라 전체 혈액의 헤모글로빈의 양을 구하였다.(TBH(Total Blood Hemoglobin Concentration) = A^TBH (흡광도) x F (기울기) x 251 (희석 배수))

2회 측정 결과, 전체 혈액의 헤모글로빈의 양은 142.22, 139.31mg/mL 였다.

6. 희석혈액의 헤모글로빈의 양 측정

PBS(Ca- and Mg- free)를 이용하여 헤모글로빈 양을 (10±1)mg/mL 농도로 희석하였다. 희석혈액 300μL를 Drabkin's 용액 4.5mL에 넣고 15분 반응시켰다. 15분 반응 후에 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 과정을 3회 실시한 후, 다음 식에 따라 희석혈액의 헤모글로빈 양을 구하였다.(T (희석혈액의 헤모글로빈 농도) = A^T (흡광도) x F (기울기) x 16 (희석배수))

측정결과, 희석혈액의 헤모글로빈의 양은 (10.68 ~ 10.86)mg/mL였다.

7. 용혈성 실험

시험 물질 용출물, 음성대조물질 용출물, 용매대조물질 용출물 및 양성대조물질 용출물 7mL에 희석혈액 1mL을 넣고 37℃에서 3시간 이상 반응시켰다. 처리는 각 군당 3회씩 실시하였다. 반응 종료 후, (700 ~ 800)g로 15분간 원심분리 하였다. 상층액 1mL를 Drabkin’s 용액 1mL 에 넣고 15분간 반응시켰다. 15분 반응 후에 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 아래의 식에 따라 시험물질 및 대조군의 헤모글로빈 양을 산출하였다.(S(헤모글로빈 양) = AS (흡광도) x F (기울기) x 2)

또한, 아래의 식에 따라 Hemolytic Grade 판정을 위한 Hemolytic index 값을 계산하였다.(sample 용혈도 - NC 용혈도)

산출된 Hemolytic index 값을 이용하여 아래의 표 10에 따라 결과를 판정하였다.

Hemolytic Index above the negative control	Hemolytic Grade
0 - 2	Non-Hemolytic
2 - 5	Slightly Hemolytic
> 5	Hemolytic

용혈성 시험 결과, 시험물질 처리군은 -0.19% 의 평균 용혈도를 나타내었으며, Hemolytic index 는 -0.29로 판정되었다(표 11 참조).

Sample	Abs.(1)	Abs.(2)	Abs.(3)	Abs. (Avg.)	Mean blank corrected % hemolysis	Hemolytic index
Test Sample	0.006	0.006	0.005	0.006	-0.19	-0.29
Negative control	0.006	0.006	0.008	0.007	0.10	N/A
Reagent control	0.007	0.006	0.006	0.006	N/A	N/A
Positive control	0.326	0.325	0.328	0.326	93.84	93.74
Diluted blood	0.345	0.351	0.346	0.347	N/A	N/A

시험 물질의 처리군의 Hemolytic index 값이 0 이하로 확인되어 용혈성이 존재하지 않는 것으로 판단하였고, Hemolytic Grade 판정을 위하여 Hemolytic index를 0.0 표기하였다. 음성대조군과 양성대조군은 각각 0.10%, 93.84%의 평균 용혈도를 나타내었으며, 양성대조군의 Hemolytic index는 93.74로 판정되어 분명한 음성, 양성 값을 나타내었다. 참고로 용혈 반응(hemolysis, haemolysis)은 적혈구가 파괴되어 내용물(세포질)이 주변액체(예: 혈장)안으로 용해되는 것을 말한다. 용혈 반응이 없다는 것은 적혈구 파괴가 없음을 의미한다.

따라서, 시험물질의 용출물의 Hemolytic grade는 Non-Hemolytic으로 확인되었다. 용매대조군, 음성대조군, 양성대조군의 시험 결과는 본 시험 결과의 유효성을 입증하고 있다. 따라서 시험물질의 용출물은 본 시험조건에서 용혈성이 존재하지 않는 것으로 판단된다.

Claims

1 ~ 5 중량%의 합성고분자 및 10 ~ 25 중량%의 천연고분자 및 용매로 구성된 혼합 고분자 용액을 전기방사하여 제작된 인공 피막; 및
금속 스켈레톤;을 포함하고,
상기 금속 스켈레톤의 한쪽 말단에 상기 인공 피막이 봉합(suture)되어 결합되어 있는 것을 특징으로 하는,
인공혈관 스텐트 그라프트.

청구항 1에 있어서,
상기 합성 고분자는 폴리우레탄(Polyurethane, PU), 실리콘(Silicone), 폴리에틸렌 테레프타레이트(Polyethylene terephthalate, PET), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE), 확장형 폴리테트라플루오로에틸렌(Expanded Polytetrafluoroethylene, ePTFE), 폴리디옥사논폴리디옥사논(Polydioxanone, PDO), 폴리-L-락트산(poly(L-lacide), PLLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 및 폴리-ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone), PCL)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 상기 천연 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브린, 키틴, 키토산, 히알루론산, 헤파린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트.

청구항 1에 있어서,
상기 금속 스켈레톤의 소재는 니티놀(Nitinol), 백금-이리듐 합금(Platinum-iridium, PtIr), 티타늄(Titanium, Ti), 코발트-크롬 합금(Cobalt-chromin, CoCr), 니켈-크롬(Nickel-chromin, NiCr), 탄탈륨(Tantalum, Ta), 알루미늄(Aluminium, Al), 지르코늄(Zirconium, Zr), 크롬(Chrom, Cr), 니켈(Nickel, Ni) 및 스테인레스 스틸(Stainless Steel)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트.

청구항 1에 있어서,
상기 금속 스켈레톤은 두께 0.09 내지 0.55mm의 와이어로 구성된 스텐트 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트.

청구항 1에 있어서,
상기 용매는 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-isopropanol, HFIP), 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide, DMF), 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF), 다이클로로메테인(Dichloromethane, DCM), 클로로포름(Chloroform) 및 아세톤(Acetone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트.

청구항 1에 있어서,
상기 봉합(suture)을 위한 봉합사는 폴리프로필렌(Polypropylene, PP), 나일론(Nylone), 폴리에틸렌(Polyethylene, PE), 폴리디옥사논폴리디옥사논(Polydioxanone, PDO), 폴리-L-락트산(poly(L-lacide), PLLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 및 폴리-ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone), PCL)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트.

전기방사장치 내 컬렉터(Collector)에 금속 스켈레톤(Skeleton)을 설치하는 제1 단계;(S1)
상기 제1 단계에서 설치된 금속 스켈레톤(Skeleton)에 1 ~ 5 중량%의 합성고분자 및 10 ~ 25 중량%의 천연고분자 및 용매로 구성된 혼합 고분자 용액을 전기방사하여 인공피막을 제작하는 제2 단계;(S2)
상기 제2 단계의 전기방사된 스켈레톤(Skeleton)의 한 쪽 말단을 봉합(suture)하여 스켈레톤과 인공 피막을 결합시키는 제3 단계;(S3)을 포함하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법.

청구항 7에 있어서,
상기 합성 고분자는 폴리우레탄(Polyurethane, PU), 실리콘(Silicone), 폴리에틸렌 테레프타레이트(Polyethylene terephthalate, PET), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE), 확장형 폴리테트라플루오로에틸렌(Expanded Polytetrafluoroethylene, ePTFE), 폴리디옥사논폴리디옥사논(Polydioxanone, PDO), 폴리-L-락트산(poly(L-lacide), PLLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 및 폴리-ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone), PCL)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 상기 천연 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브린, 키틴, 키토산, 히알루론산, 헤파린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법.

청구항 7에 있어서,
상기 금속 스켈레톤의 소재는 니티놀(Nitinol), 백금-이리듐 합금(Platinum-iridium, PtIr), 티타늄(Titanium, Ti), 코발트-크롬 합금(Cobalt-chromin, CoCr), 니켈-크롬(Nickel-chromin, NiCr), 탄탈륨(Tantalum, Ta), 알루미늄(Aluminium, Al), 지르코늄(Zirconium, Zr), 크롬(Chrom, Cr), 니켈(Nickel, Ni) 및 스테인레스 스틸(Stainless Steel)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법.

청구항 7에 있어서,
상기 금속 스켈레톤은 두께 0.09 내지 0.55mm의 와이어로 구성된 스텐트 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법.

청구항 7에 있어서,
상기 용매는 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-isopropanol, HFIP), 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide, DMF), 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF), 다이클로로메테인(Dichloromethane, DCM), 클로로포름(Chloroform) 및 아세톤(Acetone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법.

청구항 7에 있어서,
상기 봉합(suture)을 위한 봉합사는 폴리프로필렌(Polypropylene, PP), 나일론(Nylone), 폴리에틸렌(Polyethylene, PE), 폴리디옥사논폴리디옥사논(Polydioxanone, PDO), 폴리-L-락트산(poly(L-lacide), PLLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 및 폴리-ε-카프로락톤(Poly(ε-caprolactone), PCL)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법.

청구항 7에 있어서,
상기 전기방사의 조건은 전압 10 내지 20kV, 팁과 컬렉터의 거리(TCD, Tip to collector distance)가 10 내지 20cm 및 방사 속도 0.5 내지 3ml/h인 것을 특징으로 하는 인공혈관 스텐트 그라프트의 제조 방법.