KR20230064373A - 고농도 혈액에서 액화할 수 있는 신규한 바실러스 속 균주 및 그 균주의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈액 덩어리를 액화할 수 있는 미생물균주 바실러스 데킬리엔시스(Bacillus tequilensis HCB 균주(기탁번호: KCTC18926P)에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 데킬리엔시스 HCB 균주 및 를 이용한 산업용 미생물 배지 제조방법은 고농도 고형혈액을 액화하여 만들고 액화액을 건조하거나 혹은 희석하여 사용하며 산업적으로 대표적인 농업용 미생물인 고초균이나 유산균은 배양하는데 기존의 배지와 동등한 수준의 미생물 성장을 지지할 수 있다.
Description
본 발명은 고농도 혈액에서 액화할 수 있는 신규한 바실러스 속 균주 및 그 균주의 응용에 관한 것으로 더욱 상세하게는 고농도(20-50%)의 혈액에서 생육하면서 반고형화된 혈액덩어리를 액화하는 바실러스 속 균주와 본 균주 배양을 통하여 형성된 액화 혈액을 건조하거나 액상상태에서 미생물배양의 배지로 활용하는 방법에 관한 것이다.
동물혈액은 고부가가치 자원으로 미국, 유럽 등 선진국에서는 동물혈액을 활용한 사료첨가제, 식품첨가제, 향신료, 의약품 원료 등을 생산하고 있으나 우리나라는 동물혈액 일부만 선지 해장국 및 순대용으로 사람이 식용하고, 일부는 전혈분 형태로 동물용 사료원으로 사용되고, 일부는 비료로 가공되는 실정이나 총 사용량은 미미하여 대부분의 양은 폐기되고 있다.
국내 도축장은 대부분 중소기업으로 혈액 폐기처리 비용에 대한 부담이 매우 큰 상황이고 도축장당 연간 평균 처리비용은 84.3백만원 수준(돼지 1두당 2.5리터 방혈, 톤당 처리비 17만원 기준)이다.
폐기물처리단가는 최저가 기준을 고시하고, 실처리단가는 배출자와 처리자 상호 계약에 의해 결정되는 상황이며 도축장별 동물혈액 폐기처리 단가는 톤당 15~23만원 수준이며, 처리단가는 계속 증가되는 추세이다.
또한, 1992년 가입한 런던협약에 의해 2016년부터 모든 육상폐기물의 해양투기가 금지되어 폐기되는 동물혈액의 효율적 처리방안이 필요하고 동물혈액은 단백질 함유가 풍부한 자원으로 사료제품으로 활용 가능하며, 국내에서도 동물혈액 제품의 수요가 지속적으로 증가되는 상황이다.
현재 도축혈액은 농축산 분야 액비 또는 단순 혈분 사료 제조 수준이고 사료첨가제화와 병행하여 첨단 고부가가치 바이오제품 소재 개발 필요성 절실하다.
동물 혈액을 이용하는 선행기술로는 동물 혈액을 이용한 액비의 제조방법이 대한민국 등록특허 제10-1264876호에 개시된 바 있고 도축 동물의 폐혈액 처리 시스템 및 도축 동물의 폐혈액을 이용하여 고품질의 아미노산 용액을 생산하는 방법이 대한민국 등록특허 제10-0935020호에 개시된 바 있다. 또한, 동물 폐혈액을 이용한 고농도 아미노산 조성물 및 그 제조방법이 대한민국 등록특허 제10-1390516호에 개시된 바 있다.
[선행 특허 문헌]
(특허문헌 0001) 대한민국 등록특허 제10-1264876호
(특허문헌 0002) 대한민국 등록특허 제10-0935020호
(특허문헌 0003) 대한민국 등록특허 제10-1390516호
본 발명의 목적은 고농도의 혈액에서 액화할 수 있는 신규한 미생물 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 미생물 균주의 응용 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈액 덩어리를 액화할 수 있는 미생물균주 바실러스 데킬리엔시스(Bacillus tequilensis HCB 균주(기탁번호: KCTC18926P)를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 10-50%의 혈액에서 배양하여 해당 혈액를 액화하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 미생물 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속 또는 유산균인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물이 유산균인 경우에는 상기 조성물은 포도당을 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명의 상기 본 발명의 배지 조성물을 미생물 균주 배양에 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속 또는 유산균인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다..
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명은 고농도 혈액분말에서 집적하여 분리한 고농도 혈액에서 액화할 수 있는 미생물균주 바실러스 데킬리엔시스 HCB 균주를 제공한다.
상기 균주는 고농도의 고형혈액을 액화하여 산업적으로 유용한 미생물을 배양할 수 있는 배지를 제공한다.
상기 균주는 혈액분말 고형분을 발효식품으로부터 분리되는 것이 바람직하고, 장류로부터 분리되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 청국장으로부터 고농도(10-60%) 혈액건조물을 액화할 수 있게 집적한 배지에서 고농도(10-60%) 혈액건조고형분을 액화할 수 있는 균주를 단일균주로 분리하였다.
본 발명자들은 상기 분리된 단일 균주의 16S rRNA의 전체 염기서열을 결정하여 퍼센트 유사도와 계통수를 분석한 결과, 바실러스 데킬렌시스 (Bacillus tequilensis) 균주와 99.8%가 유사한 것을 확인하였다(도 1 및 서열번호 1 참조). 따라서 상기 균주를 바실러스 데킬렌시스 HCB균주 (Bacillus tequilensis HCB )이라고 명명하였고, 2021년 9월 14일자로 국제기탁기관인 대한민국 한국생명공학연구원 내 생물자원 센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC18926P).
본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 균주가 고농도(30-60%)의 혈액건조분말만을 함유하는 배지에서 혈액 덩어리를 액화할 수 있는지 알아보기 위하여, 상기 균주를 전배양한 배양액을 50%의 혈액분말 과 50%의 물 만으로 구성하여 살균한 배지에 접종하여 배양 후 액화 되는지를 조사하였다. 그 결과 2일 배양 후 액상화되는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
또한, 일 실시예에서 본 발명은
a) 분리된 바실러스 속 균주를 전배양하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 전배양된 배양액을 혈액분말 60%와 물 40%를 포함하는 배지에 접종한 후 배양하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)에서 배양된 배지를 건조하는 단계를 포함하는 미생물 배양을 위한 배지 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 a)의 전배양은 30 내지 40℃에서 1 내지 2일간 배양하는 것이 바람직하고, 37℃에서 2-4일간 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 c)에서 제조된 배지에 탄소원은 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 알코올류 및 유기산으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 이용하는 것이 바람직하고, 포도당을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 탄소원은 전체 배지에 대해 1.0 내지 3.0%의 농도로 포함되는 것이 바람직하고, 1.0%의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본원 출원인은 동물혈액을 분말화하여 보존하다가 사용하거나 생혈형태의 원료를 가수분해하는 방법을 모색하여 가수분해물을 고부가가치의 바이오소재로 활용하고자 다양한 기술을 개발하였다(대한민국 특허 등록번호 제10-221110700000호).
현재까지 개발된 것은 전혈을 효소나 미생물 기계적 가수분해를 하는 것이지만 건조한 혈액을 원료로 하여 고농도로 가수분해하는 기술을 개발하면 취급용량의 감소 및 건조시 효율향상 등을 기대할 수 있어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 신규한 바실러스 속 균주 및 이를 이용한 고농도 혈액가수분해물 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈액덩어리에서 2개월간 집적농축배양을 통하여 분리한 바실러스균주는 가열에 의해 응고된 혈액 덩어리를 가수분해하여 액체화 할 수 있으며 30% 고형분으로 구성된 혈액덩어리에 배양하여 액화할 수 있다.
본 발명의 바실러스 데킬리엔시스 HCB 균주를 이용한 산업용 미생물 배지 제조방법은 고농도 고형혈액을 액화하여 만들고 액화액을 건조하거나 혹은 희석하여 사용하며 산업적으로 대표적인 농업용 미생물인 고초균이나 유산균은 배양하는데 기존의 배지인 엘비배지나 엘알에스배지와 동등한 수준의 미생물 성장을 지지할 수 있다.
도 1은 분리 균주의 16s RNA 염기서열 비교 그림,
도 2는 본 발명의 분리 균주에 의한 고농도 혈액고형분의 액화를 나타낸 그림,
도 3은 발효처리 전 혈액으로 만든 배지와 발효처리된 혈액배지의 멸균전후의 성상을 나타낸 그림,
도 4는 액화 후 혈액배지에 락토바실러스 플란다룸 균주의 엠알에스배지와의 성장 비교를 나타낸 그림.
도 2는 본 발명의 분리 균주에 의한 고농도 혈액고형분의 액화를 나타낸 그림,
도 3은 발효처리 전 혈액으로 만든 배지와 발효처리된 혈액배지의 멸균전후의 성상을 나타낸 그림,
도 4는 액화 후 혈액배지에 락토바실러스 플란다룸 균주의 엠알에스배지와의 성장 비교를 나타낸 그림.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해서 한정되지는 않는다.
실시예 1: 고농도 혈액액화 균주의 분리 및 동정
본 발명자들은 혈액 분말 50그램을 청국장 5그램과 혼합하여 수분이 50%되게 하기 위하여 물 50ml을 첨가하여 37℃에서 72시간 배양하여 이중에서 혈액분말 액화가 나타난 배양시료에서 균주를 분리하였다. 250 ml 삼각 플라스크에 50% 혈액분말과 물 50미리리터와 함께 첨가하여 멸균한 배지에서 분리한 균주를 접종하여 최종적으로 액화를 확인하였다.
상기 분리된 단일 균주의 16S rRNA의 전체 염기서열을 결정하여(Juke TH, Cantor CR : Evolution of proteinmolecules. In mammalian protein metabolism, Edited by HN, Munro p21, Academic Press. New York, 1969)
퍼센트 유사도와 계통수를 분석한 결과, 바실러스 데킬렌시스 HCB 균주 99.8%가 유사하였으며, 도 1에서 보는 바와 같은 계통도로 나타낼 수 있었다(도 1). 따라서 상기 균주를 바실러스 속이라고 명명하였고, 2021년 9월 14일자로 국제기탁기관인 대한민국 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 18926P).
실시예 2: 고농도 혈액분말(50% 이상)함유배지에서 혈액분말의 액화
250 ml 삼각플라스크에 혈액분말 1g 과 물 50cc를 첨가하여 121℃에서 15분간 멸균한 후, 상기 실시예 1에서 분리한 바실러스 데킬렌시스 HCB균주를 접종하고 37℃ 배양기에서 하룻밤 전배양하였다.
상기 전배양 용액을 10 ml을 250 ml 삼각플라스크에 혈액분말 25g 과 물 25cc를 첨가하여 121℃에서 15분간 멸균한 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 진탕정치 배양하였다.
배양 전 상태는 반건조 고형상태이나 배양 후에는 엿 형태의 액상으로 변화하였다(도 2).
실시예 3: 액화 전후 혈액시료를 이용한 배지의 제조
팔콘튜브에 액화전 시료 100mg을 넣고 물 10cc를 넣어서 교반후에 시료가 녹지 않고 거품이 많이 발생하는 것으로 나타났으나 액화후의 시료는 200mg을 넣고 물 10cc를 넣었을 때 교반하여 주면 잘 녹고 거품이 발생하지 않았다. 이렇게 만든 시료를 섭씨121도에서 15분간 고압멸균기에서 살균하면 액화 전 시료는 덩어리를 형성하였으나 액화 후 시료는 덩어리는 형성하지 않고 잘 용해되는 것으로 나타났다(도 3).
실시예 4: 액화 시료를 이용한 농업용 유용 바실러스의 배양
250 ml 삼각 플라스크에 50ml에 수도수를 첨가후 실시예2에서 제조된 혈액분말 액화액을 2% 첨가하여 섭씨121도에서 15분간 멸균 후 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로 농업에 유용한 바실러스 B-100균주를 전배양한 액을 1% 되게 접종하여 섭씨 37도에서 하루 배양한 후 배양액과 일반시판 엘비배지와 비교하기 위하여 동일한 전배양액 1ml을 접종한 엘비배지에서 24시간 배양후의 배양액의 총균수를 10배 희석 도말법으로 균수를 확인한 바 유사한 균수를 가지고 있어 실시예2의 고농도 혈액 가수분해물이 엘비배지와 유사한 바실러스의 생육을 지지하는 것으로 나타났다(표 1).
| 배지 | 균수/1ml |
| 엘비배지 | 5.0 x 109 |
| 액화후 배지 | 5.2 x 109 |
표 1은 액화 후 혈액배지에 바실러스 B-100균주의 엘비배지와의 성장비교
실시예 5:액화 후 혈액배지에 락토바실러스 플란다룸 균주의 엠알에스배지와의 성장비교
실시예 2의 고농도 혈액 분해액을 2%되게 물에 희석하여 실시예 3의 방법으로 멸균한 후 유산균의 일종인 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)균주를 접종하여 하루배양한 후 균수를 일반적으로 유산균 배양에 많이 사용하는 엠알에스배지(디프코사 제)에 하루배양한 후 균수를 표 2에 나타낸 바와 같이 유산균의 생육을 엠알에스 만큼 유지하지 못한 것으로 나타났다.
| 배지 | 균수/1ml |
| 엠알에스배지 | 8.9 x 109 |
| 액화후 배지 | 5.2 x 107 |
표 2는 액화 후 혈액배지에 락토바실러스 플란다룸 균주의 엠알에스배지와의 성장비교
또한 상기 실시예 4에서 유산균의 생육을 엠알에스배지 만큼 유지하기 위하여 탄소원에 주목하고 탄소원으로 포도당을 1% 첨가한 배지와 비교하여 본 결과 1% 포도당을 첨가한 실시예 2의 고농도혈액 발효가수분해물이 유산균 생육을 엠알에스와 동등한 생육을 유지하였다(도 4).
[수탁 기관]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18926P
수탁일자 : 20210914
Claims (7)
- 혈액 덩어리를 액화할 수 있는 미생물균주 바실러스 데킬리엔시스(Bacillus tequilensis HCB 균주(기탁번호: KCTC18926P).
- 제 1항의 균주를 10-50%의 혈액에서 배양하여 해당 혈액를 액화하는 방법.
- 제2항의 방법에 의하여 얻어진 미생물 배양용 배지 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속 또는 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 미생물이 유산균인 경우에는 상기 조성물은 포도당을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항의 조성물을 미생물 균주 배양에 이용하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속 또는 유산균인 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210149888A KR20230064373A (ko) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | 고농도 혈액에서 액화할 수 있는 신규한 바실러스 속 균주 및 그 균주의 응용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210149888A KR20230064373A (ko) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | 고농도 혈액에서 액화할 수 있는 신규한 바실러스 속 균주 및 그 균주의 응용 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230064373A true KR20230064373A (ko) | 2023-05-10 |
Family
ID=86386539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210149888A KR20230064373A (ko) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | 고농도 혈액에서 액화할 수 있는 신규한 바실러스 속 균주 및 그 균주의 응용 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230064373A (ko) |
-
2021
- 2021-11-03 KR KR1020210149888A patent/KR20230064373A/ko unknown
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