KR20230062435A - A method of selecting immune suppressive gene set and a method of determining immune suppressive activity using the same - Google Patents

A method of selecting immune suppressive gene set and a method of determining immune suppressive activity using the same Download PDF

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KR20230062435A KR1020220141482A KR20220141482A KR20230062435A KR 20230062435 A KR20230062435 A KR 20230062435A KR 1020220141482 A KR1020220141482 A KR 1020220141482A KR 20220141482 A KR20220141482 A KR 20220141482A KR 20230062435 A KR20230062435 A KR 20230062435A
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Abstract

본 발명은 면역억제물질 예측용 유전자 집단 선별방법 및 이를 이용한 시험물질의 면역억제능 예측 방법에 관한 것으로서, 면역억제제가 처리된 선천성 면역세포가 보이는 유전체 변화를 기반으로 시험물질의 면역억제능을 예측할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 선천성 면역세포에 면역억제제를 처리한 후 유전체 분석을 수행하여 다양한 범위의 면역억제제들이 공통적으로 변화시키는 유전자 집단, 즉, 면역억제물질 예측용 유전자 집단을 선별하였으며, 이를 기반으로 시험물질의 면역억제능을 점수화하여 시험물질의 면역억제 여부를 평가할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명은 종합적인 유전체 반응으로 물질의 면역억제능을 정확히 평가할 수 있을 뿐만 아니라, in vitro 유전체 분석을 통해 간단하고 효율적으로 물질의 면역독성을 평가할 수 있으므로 기존의 동물실험을 대체할 수 있다. 따라서 본 발명은 물질의 안정성 평가를 위한 대체시험법으로서 제약산업, 화장품산업, 생활용품산업, 독성평가시험연구소 등 다양한 분야에서 활용될 것으로 기대된다.The present invention relates to a gene group selection method for predicting an immunosuppressive substance and a method for predicting the immunosuppressive ability of a test substance using the same. It is completed by checking the . Specifically, the present inventors treated innate immune cells with an immunosuppressant and then performed genome analysis to select a gene group that is commonly changed by a wide range of immunosuppressants, that is, a gene group for predicting immunosuppressive substances. It was confirmed that immunosuppression of the test substance could be evaluated by scoring the immunosuppressive ability of the test substance. In other words, the present invention can accurately evaluate the immunosuppressive ability of a substance through a comprehensive genomic response, and can also evaluate the immunotoxicity of a substance simply and efficiently through in vitro genome analysis, so it can replace existing animal tests. Therefore, the present invention is expected to be used in various fields such as the pharmaceutical industry, cosmetics industry, household goods industry, and toxicity evaluation test laboratory as an alternative test method for evaluating the stability of substances.

Description

면역억제물질 예측용 유전자 집단의 선별방법 및 이를 이용한 면역억제능 평가방법 {A method of selecting immune suppressive gene set and a method of determining immune suppressive activity using the same}A method of selecting immune suppressive gene set and a method of determining immune suppressive activity using the same}

본 발명은 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 선별방법 및 이를 이용한 시험물질의 면역억제능 평가방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a method for selecting a gene group for prediction of an immunosuppressive substance and a method for evaluating the immunosuppressive ability of a test substance using the same.

물질의 독성은 노출 경로에 따라 크게 급성 독성, 발암성, 생식독성, 표적장기 독성 등을 일으킬 수 있으며, 이 중 표적장기 독성의 하위 종류로서 면역계 (비장, 임파절)에 대한 독성을 면역독성이라고 한다. 면역독성은 다시 면역 활성, 면역 억제, 감작으로 나눌 수 있으며, 면역기능을 저해하는 물질을 면역억제성 물질이라고 지칭한다. 면역체계 중 태어날 때부터 지니는 면역을 선천성 면역, 후천척으로 얻어지는 것을 획득면역이라고 하는데, 선천성 면역은 면역 효과가 장기간 지속되지는 않으나, 병원체에 대해 즉각적으로 반응하여 염증, 대식세포 작용 등의 포괄적인 방법으로 병원체를 공격하는 신체의 중요한 방어 수단이다. 따라서 선천성 면역기능을 저해하는 독성물질은 면역체계의 중대한 위협이 될 수 있으므로, 제약산업, 화장품산업, 생활용품산업 등의 분야에서 물질의 면역억제능을 평가하는 것은 필수적인 단계이다.Depending on the route of exposure, the toxicity of a substance can cause acute toxicity, carcinogenicity, reproductive toxicity, and target organ toxicity, among which, as a subtype of target organ toxicity, toxicity to the immune system (spleen and lymph nodes) is called immunotoxicity. . Immunotoxicity can be further divided into immune activation, immunosuppression, and sensitization, and substances that inhibit immune function are referred to as immunosuppressive substances. Among the immune system, immunity that is present from birth is called innate immunity, and acquired immunity is called acquired immunity. Innate immunity does not have long-term immune effects, but responds immediately to pathogens, resulting in comprehensive effects such as inflammation and macrophage action. It is an important defense mechanism of the body against attacking pathogens. Therefore, since toxic substances that inhibit innate immune function can be a serious threat to the immune system, it is an essential step to evaluate the immunosuppressive ability of substances in the pharmaceutical industry, cosmetics industry, and household goods industry.

현재 물질의 면역억제능 평가 방법은 대부분 동물 실험을 통해 이루어지고 있다. 그러나, 한국 생명공학정책연구센터가 2016년에 발간한 [동물실험관련 국내외 규제동향]에 따르면 OECD 가이드라인 시험법 중 안전성 평가에 대한 동물대체시험법 수요가 증가할 것으로 전망되고 있고, 유럽은 화장품 개발과정에서의 안전성 평가에 대해 동물실험을 금지하였으며 2016년부터 동물대체시험법 개발을 위한 독성위험 프로젝트에 착수하고 있다. 대한민국 역시 최근 대체시험법 개발 필요성이 인지되어 2015년 내지 2018년 동안 1,260억원의 정부연구비가 투자된 바 있다. 그러나 아직까지 공인된 대체시험법은 피부감작성, 피부부식성, 광독성, 안점막 자극성으로 한정되어 있으며, 면역억제능 평가 방법에 있어서는 동물실험을 대체하기에 적절한 대체시험법은 부족하다. Currently, methods for evaluating the immunosuppressive ability of substances are mostly performed through animal experiments. However, according to [Regulation Trends Related to Animal Testing] published by the Korea Center for Biotechnology Policy Research in 2016, demand for animal alternative test methods for safety evaluation among OECD guideline test methods is expected to increase, and Europe is expected to increase Animal testing has been banned for safety evaluation in the development process, and since 2016, a toxicity risk project for the development of alternative animal test methods has been initiated. The Republic of Korea also recently recognized the need to develop an alternative test method, and government research funds of 126 billion won were invested from 2015 to 2018. However, the approved alternative test methods are limited to skin sensitization, skin corrosion, phototoxicity, and ocular mucosal irritation, and there is a lack of suitable alternative test methods to replace animal tests in the immunosuppression evaluation method.

최근 면역조절 물질 평가 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 이들 대부분은 물질의 알레르기 유발 가능성을 판별하는 것을 목적으로 하며 물질의 면역억제능, 특히 선천면역억제능을 예측하는 것과는 차이가 있다. 물질의 면역억제능을 평가하는 방법도 일부 알려져 있기는 하나, 현재까지 알려진 방법은 특정 유전자의 발현 수준을 비교하는 것에 그치므로 정확도가 떨어지는 문제가 있다. 따라서 100여개 이상의 유전자 집단을 종합적으로 비교함으로써 물질의 선천면역억제능을 정확히 예측할 수 있는 대체시험법의 발굴이 필요한 실정이다.Recently, studies on immunomodulatory substance evaluation methods have been conducted, but most of them are aimed at determining the allergenic potential of a substance, and there is a difference from predicting the immunosuppressive ability of a substance, especially the innate immunosuppressive ability. Some methods for evaluating the immunosuppressive ability of substances are also known, but the methods known so far are limited to comparing the expression level of a specific gene, so there is a problem with low accuracy. Therefore, it is necessary to find an alternative test method that can accurately predict the innate immune suppression ability of a substance by comprehensively comparing more than 100 gene groups.

유럽 특허공개공보 제EP2762572A1호European Patent Publication No. EP2762572A1

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 면역억제제가 처리된 선천성 면역세포가 보이는 유전자 발현 변화의 분석을 통해 물질의 면역억제능을 예측할 수 있는 유전자 리스트를 발굴하고, 이들을 바탕으로 한 면역억제물질 예측용 알고리즘을 확립하여 완성된 것이다.The present invention has been made to solve the above problems, and discovers a list of genes that can predict the immunosuppressive ability of a substance through analysis of gene expression changes seen in innate immune cells treated with immunosuppressive agents, and immunosuppression based on them It was completed by establishing an algorithm for material prediction.

따라서, 본 발명의 목적은 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (Immune suppressive gene set, ISG set)을 선별하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for selecting an immunosuppressive gene set (ISG set) for predicting immunosuppressive substances.

본 발명의 다른 목적은 시험물질의 면역억제능 예측 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for predicting the immunosuppressive ability of a test substance.

본 발명의 또 다른 목적은 시험물질의 면역억제능 예측용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for predicting the immunosuppressive ability of a test substance.

본 발명의 또 다른 목적은 시험물질의 면역억제능 예측용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for predicting the immunosuppressive ability of a test substance.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.

본 발명은 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (Immune suppressive gene set, ISG set)을 선별하는 방법으로서,The present invention is a method for selecting an immunosuppressive gene set (ISG set) for predicting immunosuppressive substances,

(S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 3종 이상의 면역억제제를 각각 단독으로 처리하는 단계;(S1) treating the separated human monocyte-derived cell line with three or more immunosuppressive agents alone;

(S2) 상기 면역억제제가 처리된 인간 단핵구 유래 세포 및 대조군에 대해 유전체 분석을 수행하는 단계로서, 상기 대조군은 상기 면역억제제가 처리되지 않은 인간 단핵구 유래 세포주인, 단계; 및(S2) performing genome analysis on the human monocyte-derived cells treated with the immunosuppressant and a control, wherein the control is a human monocyte-derived cell line not treated with the immunosuppressant; and

(S3) 상기 대조군과 비교하여 적어도 3종 이상의 면역억제제에 의해 발현이 증가한 유전자를 면역억제물질 예측용 유전자 집단으로 선별하는 단계를 포함하는, 면역억제물질 예측용 유전자 집단을 선별하는 방법을 제공한다.(S3) It provides a method for selecting a gene group for predicting an immunosuppressant, comprising the step of selecting a gene whose expression is increased by at least three or more immunosuppressants compared to the control group as a gene group for predicting an immunosuppressant. .

본 발명의 일 구현예에서, 상기 면역억제제는 덱사메타손, 타크로리무스, 토파시티닙, 프레드니솔론, 로릴 황산 나트륨, 벤조산, 염화수은, 및 아시클로버로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the immunosuppressive agent may be selected from the group consisting of dexamethasone, tacrolimus, tofacitinib, prednisolone, sodium lauryl sulfate, benzoic acid, mercuric chloride, and acyclovir, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 (S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of (S1) treating the test substance to the isolated human monocyte-derived cell line; and

(S2) 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군에서 상기 ISG set 선별방법에 의해 선별된 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법을 제공한다.(S2) It provides a method for predicting the immunosuppressive ability of a test substance, including the step of measuring the expression level of the immunosuppressive substance prediction gene group selected by the ISG set selection method in the cells treated with the test substance and the control group. .

본 발명의 일 구현예에서, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 하기로 이루어진 군에서 선택된 2 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:In one embodiment of the present invention, the gene group for predicting the immunosuppressive substance may be two or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto:

PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, 및 RHOV.PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, and RHOV.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군의 S-score를 산출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 이 때 상기 S-score는 하기 중 어느 하나로 표현될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다:In another embodiment of the present invention, the method may further include calculating the S-score of the test substance-treated cells and the control group, wherein the S-score may be expressed as one of the following , but is not limited to:

a) 상기 면역억제물질 예측용 유전자의 발현 수준의 중앙값; 또는a) the median value of the expression level of the gene for predicting the immunosuppressive substance; or

b) Σβi*RNAib) Σβi*RNAi

(여기서, βi, 면역억제물질 예측용 유전자의 회귀계수; RNAi, 면역억제물질 예측용 유전자의 RNA 발현 수준).(Where, βi, the regression coefficient of a gene for predicting an immunosuppressant; RNAi, the RNA expression level of a gene for predicting an immunosuppressant).

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대조군 대비 상기 시험물질이 처리된 세포의 S-score가 증가되어 있는 경우 상기 시험물질을 면역억제성 물질로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the method may further include predicting the test substance as an immunosuppressive substance when the S-score of cells treated with the test substance is increased compared to the control group. Not limited.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 대조군은 면역억제제가 처리된 인간 단핵구 유래 세포주일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the control group may be a human monocyte-derived cell line treated with an immunosuppressive agent, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 발현 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, 전유전체 염기서열 분석법 (WGS, Whole Genome Sequencing), 마이크로어레이 (microarray), 타켓 시퀀싱 (target sequencing), 생어 시퀀싱 (Sanger sequencing), 차세대염기서열분석법 (NGS), RNA 시퀀싱 (RNA sequencing), 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법 (Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the expression level is measured by PCR, RNase protection assay, northern blotting, southern blotting, in situ hybridization, whole genome sequencing (WGS, Whole Genome Sequencing) Sequencing), microarray, target sequencing, Sanger sequencing, next-generation sequencing (NGS), RNA sequencing, western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay , Ouchterony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, mass spectrometry, FACS, and protein chip. It may be measured by the above method, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 면역억제능은 선천성 면역에 대한 억제능일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the immunosuppressive ability may be the ability to suppress innate immunity, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 인간 단핵구 유래 세포주는 THP-1 세포주일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the human monocyte-derived cell line may be a THP-1 cell line, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역억제물질 예측용 유전자를 선별하는 방법에 의해 선별된 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 키트를 제공한다.In addition, the present invention relates to a test substance comprising, as an active ingredient, an agent for measuring the mRNA or protein level of a gene group for predicting an immunosuppressant selected by the method for selecting a gene for predicting an immunosuppressant according to the present invention. A kit for predicting inhibitory activity is provided.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 하기로 이루어진 군에서 선택된 2 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:In one embodiment of the present invention, the gene group for predicting the immunosuppressive substance may be two or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto:

PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, 및 RHOV.PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, and RHOV.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 키트는 하기 단계를 포함하는 시험물질의 면역억제능 예측 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다: In another embodiment of the present invention, the kit may further include instructions describing a method for predicting immunosuppressive ability of a test substance including the following steps, but is not limited thereto:

(S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및(S1) treating the test substance to the isolated human monocyte-derived cell line; and

(S2) 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군에서 상기 ISG set 선별방법에 의해 선별된 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 RNA 발현 수준을 측정하는 단계.(S2) measuring the RNA expression level of the immunosuppressive substance prediction gene group selected by the ISG set selection method in the test substance-treated cells and control group.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브이고, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the agent for measuring the level of the mRNA is a primer set or probe that specifically binds to the mRNA, and the agent for measuring the level of the protein is an antibody or aptamer specific for the protein may, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 마이크로어레이 키트, 유전자 증폭 키트, 및 RNA 시퀀싱 키트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the kit may be any one selected from the group consisting of a microarray kit, a gene amplification kit, and an RNA sequencing kit, but is not limited thereto.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제의 시험물질의 면역억제능 예측 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use for predicting the immunosuppressive ability of a test substance of a preparation for measuring the mRNA or protein level of the gene group for predicting the immunosuppressive substance.

뿐만 아니라, 본 발명은 시험물질의 면역억제능 예측용 제제의 제조를 위한, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides the use of a preparation for measuring the mRNA or protein level of a gene group for predicting the immunosuppressive substance for the preparation of a preparation for predicting the immunosuppressive ability of a test substance.

본 발명은 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 선별방법 및 이를 이용한 시험물질의 면역억제능 평가방법 등에 관한 것으로서, 면역억제제가 처리된 선천성 면역세포가 보이는 유전체 변화를 기반으로 시험물질의 면역억제능을 예측할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 선천성 면역세포에 면역억제제를 처리한 후 유전체 분석을 수행하여 다양한 범위의 면역억제제들이 공통적으로 변화시키는 유전자 집단, 즉, 면역억제물질 예측용 유전자 집단을 선별하였으며, 이를 기반으로 시험물질의 면역억제능을 점수화하여 시험물질의 면역억제 여부를 평가할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명은 종합적인 유전체 반응으로 물질의 면역억제능을 정확히 평가할 수 있을 뿐만 아니라, in vitro 유전체 분석을 통해 간단하고 효율적으로 물질의 면역독성을 평가할 수 있으므로 기존의 동물실험을 대체할 수 있다. 따라서 본 발명은 물질의 안정성 평가를 위한 대체시험법으로서 제약산업, 화장품산업, 생활용품산업, 독성평가시험연구소 등 다양한 분야에서 활용될 것으로 기대된다.The present invention relates to a method for selecting a gene group for prediction of an immunosuppressive substance and a method for evaluating the immunosuppressive ability of a test substance using the same. It is completed by confirming that it exists. Specifically, the present inventors treated innate immune cells with an immunosuppressant and then performed genome analysis to select a gene group that is commonly changed by a wide range of immunosuppressants, that is, a gene group for predicting immunosuppressive substances. It was confirmed that immunosuppression of the test substance could be evaluated by scoring the immunosuppressive ability of the test substance. In other words, the present invention can accurately evaluate the immunosuppressive ability of a substance through a comprehensive genomic response, and can also evaluate the immunotoxicity of a substance simply and efficiently through in vitro genome analysis, so it can replace existing animal tests. Therefore, the present invention is expected to be used in various fields such as the pharmaceutical industry, cosmetics industry, household goods industry, and toxicity evaluation test laboratory as an alternative test method for evaluating the stability of substances.

도 1은 본 발명에 따른 시험물질의 면역억제능 예측 과정을 간략히 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 시험물질의 면역억제능 예측 방법을 통해 사이클로스포린 및 아시클로버의 S-score를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 시험물질의 면역억제능 예측 방법을 통해 다양한 면역억제제 및 면역활성화제의 S-score를 측정한 결과를 나타낸다 (대조군: 미처리 대조군).1 is a schematic diagram of a process for predicting the immunosuppressive ability of a test substance according to the present invention.
2 shows the results of measuring the S-scores of cyclosporine and acyclovir through the method for predicting the immunosuppressive ability of test substances according to the present invention.
Figure 3 shows the results of measuring the S-score of various immunosuppressive agents and immunoactivators through the method for predicting immunosuppressive ability of test substances according to the present invention (control group: untreated control group).

본 발명은 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 선별방법 및 이를 이용한 시험물질의 면역억제능 평가방법 등에 관한 것으로서, 면역억제제가 처리된 선천성 면역세포가 보이는 유전체 변화를 기반으로 시험물질의 면역억제능을 예측할 수 있음을 확인하여 완성된 것이다. The present invention relates to a method for selecting a gene group for prediction of an immunosuppressive substance and a method for evaluating the immunosuppressive ability of a test substance using the same. It is completed by confirming that it exists.

구체적으로, 본 발명자들은 선천성 면역세포인 인간 단핵구 유래 세포주에 잘 알려진 면역억제제 5종을 각각 처리한 후 유전체 분석을 수행함으로써 면역억제제가 공통적으로 발현을 증가시킨 유전자 집단, 즉, 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (Immune suppressive gene set, ISG set)을 선별하였으며, 상기 유전자 집단의 발현 수준을 기반으로 한 면역예측용 알고리즘인 Signature score (S-score)를 확립하여 시험물질의 면역억제능을 정확히 평가할 수 있음을 확인하였다. Specifically, the present inventors treated human monocyte-derived cell lines, which are innate immune cells, with 5 well-known immunosuppressants, respectively, and then performed genome analysis to find a gene group in which immunosuppressants commonly increased expression, that is, for predicting immunosuppressive substances. The immunosuppressive gene set (ISG set) was selected, and the signature score (S-score), an algorithm for immunoprediction based on the expression level of the gene group, was established to accurately evaluate the immunosuppressive ability of the test substance. confirmed.

따라서, 본 발명은 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (Immune suppressive gene set, ISG set)을 선별하는 방법으로서,Therefore, the present invention is a method for selecting an immunosuppressive gene set (ISG set) for predicting immunosuppressive substances,

(S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 3종 이상의 면역억제제를 각각 단독으로 처리하는 단계;(S1) treating the separated human monocyte-derived cell line with three or more immunosuppressive agents alone;

(S2) 상기 면역억제제가 처리된 인간 단핵구 유래 세포 및 대조군에 대해 유전체 분석을 수행하는 단계로서, 상기 대조군은 상기 면역억제제가 처리되지 않은 인간 단핵구 유래 세포주인, 단계; 및(S2) performing genome analysis on the human monocyte-derived cells treated with the immunosuppressant and a control, wherein the control is a human monocyte-derived cell line not treated with the immunosuppressant; and

(S3) 상기 대조군과 비교하여 적어도 3종 이상의 면역억제제에 의해 발현이 증가한 유전자를 면역억제물질 예측용 유전자 집단으로 선별하는 단계를 포함하는, 면역억제물질 예측용 유전자 집단을 선별하는 방법을 제공한다.(S3) It provides a method for selecting a gene group for predicting an immunosuppressant, comprising the step of selecting a gene whose expression is increased by at least three or more immunosuppressants compared to the control group as a gene group for predicting an immunosuppressant. .

본 발명에 있어서, “면역억제물질”이란 개체의 면역기능의 수준 또는 활성을 감소, 약화, 억제, 또는 상실시키는 물질을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서 면역은 선천성 면역 (innate immunity)을 의미한다. 선천성 면역은 비특이적 면역, 1차 방어작용, 내재 면역 등으로도 불리며, 특정 병원체를 기억하지 않고 외부 침입에 대해 즉각적으로 반응하는 면역 체계를 의미한다. 후천 면역과 달리 면역력이 장기간 지속되지 않으며, 물리적 장벽 (땀, 위산, 담즙산, 소화 효소, 점액 등), 생리학적 방어 체계 (pH, 온도 등), 포식 작용 (phagocytosis), 염증 반응 등 포괄적이고 비특이적인 방어기작으로 병원체를 공격한다. In the present invention, "immunosuppressive substance" means a substance that reduces, weakens, suppresses, or loses the level or activity of an individual's immune function. Preferably, in the present invention, immunity means innate immunity. Innate immunity is also called non-specific immunity, primary defense, innate immunity, etc., and means an immune system that responds immediately to external invasion without remembering a specific pathogen. Unlike acquired immunity, immunity does not last for a long time, and it is comprehensive and non-specific, including physical barriers (sweat, stomach acid, bile acid, digestive enzymes, mucus, etc.), physiological defense system (pH, temperature, etc.), phagocytosis, and inflammatory response. It attacks pathogens as a defense mechanism.

본 발명에 있어서, “면역억제제”란 면역억제능이 있는 것으로 알려진 물질을 의미하며, 용어 “면역억제성 물질”과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 면역억제제의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 구체적인 예로는 덱사메타손 (dexamethasone), 타크로리무스 (tacrolimus), 프레드니솔론 (prednisolone), 로릴 황산 나트륨 (sodium lauryl sulphate), 토파시티닙 (tofacitinib), 프레드니솔론 (prednisolone), 사이클로스포린 (cyclosporine), 마이코페노릭산 (mycophenolic acid), 아자티오프린 (azathioprine), 시로리무스 (sirolimus), 벤조산 (benzoic acid), 염화수은 (mercuric chloride), 및 아시클로버 (acyclovir) 등을 들 수 있다. 그러나 상술한 바와 같이 면역억제제의 종류는 상기 예시에 의해 한정되는 것이 아니며, 현재는 물론 장래에 면역억제제로 판정되는 물질이 이에 포함될 수 있다. In the present invention, "immunosuppressive agent" refers to a substance known to have immunosuppressive activity, and may be used interchangeably with the term "immunosuppressive substance". Specific types of the immunosuppressant are not limited, but specific examples include dexamethasone, tacrolimus, prednisolone, sodium lauryl sulphate, tofacitinib, prednisolone, and cyclosporine, mycophenolic acid, azathioprine, sirolimus, benzoic acid, mercuric chloride, and acyclovir. However, as described above, the type of immunosuppressive agent is not limited by the above examples, and substances determined to be immunosuppressive agents now and in the future may be included therein.

본 발명에 있어서, “면역억제물질 예측용 유전자 집단 (Immune suppressive gene set, ISG set)”이란 시험물질의 면역억제능을 평가하기 위한 기준이 되는 유전자를 의미한다. 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 'Immune suppressive gene set for determining immune suppressive agents'으로도 호칭될 수 있다. 본 발명은 3가지 이상의 면역억제제를 인간 단핵구 유래 세포주에 각각 단독으로 처리한 뒤, 대조군 (면역억제제를 처리하지 않은 세포)과 비교하였을 때 보다 다양한 범위 (즉, 더 많은 종류)의 면역억제제에 의해 공통적으로 발현이 증가한 유전자들을 ISG로 선별하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 ISG는 상기 (S1) 단계에서 인간 단핵구 유래 세포주에 처리한 면역억제제 중 최소 3종, 4종, 5종, 또는 6종 이상의 면역억제제에 의해 발현이 증가한 유전자 집단이다. 본 발명에 있어서, “발현 (expression)”은 mRNA와 같은 RNA 발현 및 단백질 발현을 모두 포함하는 개념이다.In the present invention, "Immune suppressive gene set (ISG set)" means a gene that is a standard for evaluating the immunosuppressive ability of a test substance. The gene group for predicting immunosuppressive substances may also be referred to as 'Immune suppressive gene set for determining immune suppressive agents'. In the present invention, three or more immunosuppressive agents are treated alone in human monocyte-derived cell lines, and then a more diverse range (i.e., more types) of immunosuppressants are obtained when compared to the control group (cells not treated with immunosuppressant). It is characterized by selecting genes with increased expression in common as ISG. For example, the ISG according to the present invention is a gene group whose expression is increased by at least 3, 4, 5, or 6 or more immunosuppressive agents among the immunosuppressive agents treated in the human monocyte-derived cell line in step (S1). . In the present invention, "expression" is a concept that includes both RNA expression and protein expression, such as mRNA.

본 발명에 있어서 “단핵구 (monocyte) 유래 세포주”란 인간으로부터 분리된 단핵구는 물론, 상기 단핵구로부터 유래한 세포를 모두 포함할 수 있다. 즉, 상기 단핵구 유래 세포주는 인간으로부터 분리된 일차 세포는 물론, 일차 세포로부터 배양된 세포를 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 분리된 (단리된) 세포일 수 있다. 단핵구 (monocyte)란 백혈구의 한 유형으로, 골수의 조혈줄기세포로부터 유래되는 세포이다. 단핵구는 골수에서 성숙된 이후 혈관에서 순환하다가 조직으로 이동하여 대식세포 또는 골수의 수지상세포로 분화하며, 식세포작용, 염증 반응 등 선천성 면역기능을 수행한다. 본 발명에 있어서, 단핵구 유래 세포주의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 THP-1 세포이다. In the present invention, the term “monocyte-derived cell line” may include monocytes isolated from humans as well as cells derived from the monocytes. That is, the monocyte-derived cell line includes primary cells isolated from humans as well as cells cultured from primary cells. The cells may preferably be isolated (isolated) cells. A monocyte is a type of white blood cell, and is a cell derived from bone marrow hematopoietic stem cells. After maturation in the bone marrow, monocytes circulate in blood vessels, migrate to tissues, differentiate into macrophages or bone marrow dendritic cells, and perform innate immune functions such as phagocytosis and inflammatory response. In the present invention, the specific type of monocyte-derived cell line is not limited, but is preferably THP-1 cell.

ISG set를 선별하는 방법에 있어서, “대조군”은 면역억제제가 처리되지 않은 인간 단핵구 유래 세포주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 대조군은 면역억제제 대신 동일한 부피의 초순수 또는 DMSO가 처리된 인간 단핵구 유래 세포주일 수 있다. In the method for selecting the ISG set, the “control group” may refer to a human monocyte-derived cell line that is not treated with an immunosuppressive agent. For example, the control group may be a human monocyte-derived cell line treated with the same volume of ultrapure water or DMSO instead of the immunosuppressive agent.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (S1) 단계에서 각 면역억제제는 CV90 (Cell viability of 90%)의 농도로 처리될 수 있다. 본 발명에 있어서 CV90이란 세포의 활성도를 10% 이내로 억제하는 농도를 의미한다. 즉, 본 발명에 있어서 CV90이란 세포의 정상적인 기작 (세포분열, 활성 등)에는 10% 이내로 작은 영향만 미치면서 면역억제기전을 판별하기에는 충분한 농도를 의미한다. In one embodiment of the present invention, in step (S1), each immunosuppressive agent may be treated at a concentration of CV90 (Cell viability of 90%). In the present invention, CV90 means a concentration that suppresses cell activity to within 10%. That is, in the present invention, CV90 means a concentration sufficient to determine the mechanism of immunosuppression while having only a small effect within 10% on the normal mechanism of cells (cell division, activity, etc.).

본 발명에 따른 ISG set는 유전체 분석을 통해 선별되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 전사체 (transcriptome) 분석을 통해 선별될 수 있다. 본 발명에 있어서 유전체 분석 방법에는 제한이 없으나, 전유전체 염기서열 분석법 (WGS, Whole Genome Sequencing), 마이크로어레이 (microarray), 타켓 시퀀싱 (target sequencing), 생어 시퀀싱 (Sanger sequencing), 전기영동법 (electrophoresis), RNA 시퀀싱 (RNA sequencing), 및 차세대염기서열분석법 (NGS)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전체 분석 방법은 마이크로어레이 또는 RNA 시퀀싱으로 수행될 수 있다. 본 발명은 상기 유전체 분석을 통해 보다 다양한 범위의 면역억제제, 즉 더 많은 종류의 면역억제제에 의해 공통적으로 발현이 증가한 유전자들을 ISG로 선별하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 어느 특정 유전자가 아닌, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 또는 100여개 이상의 유전자 집단으로 이루어질 수 있다. The ISG set according to the present invention is characterized in that it is selected through genome analysis, and preferably can be selected through transcriptome analysis. In the present invention, the genome analysis method is not limited, but whole genome sequencing (WGS), microarray, target sequencing, Sanger sequencing, electrophoresis , RNA sequencing, and next-generation sequencing (NGS). Preferably, the genome analysis method may be performed by microarray or RNA sequencing. The present invention is characterized by selecting, as ISGs, genes whose expression is commonly increased by a wider range of immunosuppressants, that is, more types of immunosuppressants, through the genome analysis. That is, the gene group for predicting immunosuppressive substances according to the present invention is not a specific gene, but 2 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, 50 or more, 60 or more. It may consist of more than 70, or more than 100 gene groups.

또한, 본 발명은 (S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (S2) 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군에서 본 발명에 따른 ISG set 선별방법에 의해 선별된 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법을 제공한다. 여기서, 상기 발현 수준은 mRNA의 발현 수준 및 단백질 수준을 모두 포함한다.In addition, the present invention comprises the steps of (S1) treating the test substance to the isolated human monocyte-derived cell line; and (S2) measuring the expression level of the immunosuppressive substance prediction gene group selected by the ISG set selection method according to the present invention in the cells treated with the test substance and in the control group, predicting the immunosuppressive ability of the test substance. provides a way Here, the expression level includes both mRNA expression level and protein level.

즉, 본 발명은 시험물질이 처리된 인간 단핵구 유래 세포주의 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 발현 수준을 측정하고 이를 대조군의 수준과 비교하여 시험물질의 면역억제능을 예측하는 것을 특징으로 한다. 상기 ISG set은 면역억제제에 의해 발현이 증가한 유전자들로부터 선별된 것인 바, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 시험물질의 처리에 의해 인간 단핵구 유래 세포주에서 ISG set의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 시험물질은 면역억제능이 있는 것으로 예측될 수 있다. 구체적으로, 상기 시험물질은 ISG set에 해당하는 모든 유전자의 발현이 증가한 경우에 면역억제능이 있는 것으로 판단될 수도 있으나, ISG set 유전자 중 2개 이상, 3개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 또는 100여개 이상의 유전자의 발현 수준이 증가한 경우에 면역억제능이 있는 것으로 판단될 수도 있다. 혹은, ISG set 유전자 중 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 발현이 증가한 경우에 면역억제능이 있는 것으로 판단될 수 있다. That is, the present invention is characterized in that the immunosuppressive ability of the test substance is predicted by measuring the expression level of a gene group for predicting an immunosuppressive substance in a human monocyte-derived cell line treated with a test substance and comparing it with the level of a control group. Since the ISG set is selected from genes whose expression is increased by an immunosuppressive agent, in one embodiment of the present invention, the expression level of the ISG set in the human monocyte-derived cell line is increased compared to the control group by treatment with the test substance. If it is, the test substance can be predicted to have immunosuppressive activity. Specifically, the test substance may be judged to have immunosuppressive activity when the expression of all genes corresponding to the ISG set is increased, but two or more, three or more, eight or more, ten or more, Immunosuppressive activity may be determined when the expression level of 15 or more, 20 or more, 30 or more, 40 or more, 50 or more, 60 or more, 70 or more, or 100 or more genes is increased. Alternatively, if the expression of ISG set genes is increased by 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more It can be judged to have immunosuppressive ability.

본 명세서에 있어서, “수준이 증가되어 있다”는 것은, 검출되지 않던 것이 검출된 것, 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 검출량이 많아지는 것을 의미한다. 예를 들어, 수준이 “증가”되어 있다는 것은, 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다. 구체적으로는, 대조군의 그것에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대 의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.In the present specification, "the level is increased" means that the undetected is detected, or the detected amount is relatively higher than the normal level. For example, a level "increased" means that the level in the experimental group is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% or more, such as 5%, compared to that in the control group. , 10%, 20%, 30%, 40%, or 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or higher, and/or 0.5x, 1.1x, 1.2x, 1.4x, 1.6x , 1.8 times higher or higher. Specifically, compared to that of the control group, 1 to 1.5 times, 1.5 to 2 times, 2 to 2.5 times, 2.5 to 3 times, 3 to 3.5 times, 3.5 to 4 times, 4 to 4.5 times, 4.5 to 5 times, 5 to 5 times. 5.5 times, 5.5 to 6 times, 6 to 6.5 times, 6.5 to 7 times, 7 to 7.5 times, 7.5 to 8 times, 8 to 8.5 times, 8.5 to 9 times, 9 to 9.5 times, 9.5 to 10 times, or 10 times It may mean an increase of more than double, but is not limited thereto. The meaning of the opposite term can be understood as having the opposite meaning according to the above definition by those skilled in the art.

본 발명에 있어서, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 본 명세서에 개시된 면역억제물질 예측용 유전자를 제한 없이 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 또는 5종 이상 면역억제제에 의해 공통적으로 발현이 증가한 ISG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, 및 RHOV.In the present invention, the gene group for predicting immunosuppressive substances may include without limitation the genes for predicting immunosuppressive substances disclosed herein. For example, the gene group for predicting immunosuppressive substances may include one or more selected from the group consisting of ISGs whose expression is commonly increased by 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more immunosuppressants. Preferably, the gene group for predicting immunosuppressive substances may be one or more genes selected from the group consisting of, but not limited to: PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C , F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2 , YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF4 25 , HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, and RHOV.

본 발명에 있어서, “시험물질”은 면역억제능의 유무 또는 정도를 평가하고자 하는 대상 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 재조합 플라스미드(recombinant plasmid), 나노입자(nanoparticle), 단백질, 올리고펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물, 또는 화학물질 (화합물)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, "test substance" means a target substance to be evaluated for the presence or degree of immunosuppressive activity. The test substance is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), antisense oligonucleotide, recombinant plasmid, nano It includes, but is not limited to, nanoparticles, proteins, oligopeptides, antibodies, aptamers, natural extracts, or chemicals (compounds).

본 발명의 일 구현예에서, 상기 시험물질의 면역억제능 예측 방법은 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군의 S-score를 산출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 S-score는 하기 중 어느 하나로 표현될 수 있다:In one embodiment of the present invention, the method for predicting the immunosuppressive ability of the test substance may further include calculating the S-score of the cells treated with the test substance and the control group. In the present invention, the S-score may be expressed as one of the following:

a) 상기 면역억제물질 예측용 유전자의 발현 수준의 중앙값; 또는a) the median value of the expression level of the gene for predicting the immunosuppressive substance; or

b) Σβi*RNAib) Σβi*RNAi

(여기서, βi, 면역억제물질 예측용 유전자의 회귀계수; RNAi, 면역억제물질 예측용 유전자의 RNA 발현 수준).(Where, βi, the regression coefficient of a gene for predicting an immunosuppressant; RNAi, the RNA expression level of a gene for predicting an immunosuppressant).

본 발명에 있어서, “S-score”는 면역억제능 signature score를 의미한다. 상기 S-score는 시험물질의 면역억제능을 점수화한 것으로서, 본 발명에 따른 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (ISG set)에 속하는 각 유전자의 발현값을 기초로 산출될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 시험물질의 면역억제능 예측 방법은 시험물질이 처리된 세포와 대조군 각각의 S-score를 산출한 후 이를 비교하여 이루어지는 것으로서, 면역억제제 처리 세포에 비해 시험물질 처리 세포의 S-score가 유의하게 증가한 경우 시험물질을 면역억제능이 높은 것 (즉, 면역억제성 물질)으로 예측할 수 있다. 즉, 상기 방법은 대조군 대비 상기 시험물질이 처리된 세포의 S-score가 증가되어 있는 경우 상기 시험물질을 면역억제성 물질로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.In the present invention, "S-score" means the immunosuppressive ability signature score. The S-score scores the immunosuppressive ability of a test substance and can be calculated based on the expression value of each gene belonging to the immunosuppressive substance prediction gene group (ISG set) according to the present invention. That is, the method for predicting the immunosuppressive ability of a test substance according to the present invention is made by calculating the S-score of each of the test substance-treated cells and the control group and then comparing them, compared to immunosuppressant-treated cells. If the score is significantly increased, the test substance can be predicted to have high immunosuppressive activity (i.e., immunosuppressive substance). That is, the method may further include predicting the test substance as an immunosuppressive substance when the S-score of the cells treated with the test substance is increased compared to the control group.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 상기 a) 및 b)로 표현되는 S-score 모두 시험물질의 면역억제능을 판별할 수 있음을 확인하였다.The present inventors confirmed through specific examples that both the S-scores expressed in a) and b) can discriminate the immunosuppressive ability of the test substance.

상기 “a) 상기 면역억제물질 예측용 유전자의 발현 수준의 중앙값”에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질 발현 수준일 수 있으나, 바람직하게는 mRNA 발현 수준일 수 있다. 구체적으로, 상기 a)로 표시되는 S-score는 시험물질이 처리된 세포에서 모든 면역억제물질 예측용 유전자의 각 발현 수준을 확인한 후 이를 크기 순서대로 정렬하였을 때 가장 중앙에 위치하는 값으로 산출된다. 본 발명의 일 구현예에서, 발현 수준이 측정된 ISG가 1종인 경우, a)에 따른 S-score는 해당 유전자의 발현 수준과 동일하다. 본 발명의 다른 구현예에서, 발현 수준이 측정된 ISG가 2종인 경우, a)에 따른 S-score는 2종 유전자 각각의 발현 수준 중 어느 하나와 동일하거나, 2종 유전자 각각의 발현 수준의 평균값일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 발현 수준이 측정된 ISG가 짝수개인 경우, 중앙값은 2개 (중앙의 2개 값)로 나타날 수 있으며, 이 때 a)에 따른 S-score는 상기 2개 값 중 어느 하나와 동일하거나, 상기 2개 값의 평균일 수 있다. In the “a) median expression level of the gene for predicting the immunosuppressive substance”, the expression level of the gene may be mRNA or protein expression level, but preferably may be mRNA expression level. Specifically, the S-score represented by a) above is calculated as the value located at the center when the test substance-treated cells check the expression levels of all genes for predicting immunosuppressive substances and then arrange them in order of size. . In one embodiment of the present invention, when the ISG whose expression level is measured is one type, the S-score according to a) is equal to the expression level of the corresponding gene. In another embodiment of the present invention, when there are two ISGs whose expression levels are measured, the S-score according to a) is equal to either of the expression levels of each of the two genes, or the average value of the expression levels of each of the two genes. can be In another embodiment of the present invention, when the number of ISGs whose expression level is measured is an even number, the median value may appear as two (central two values), and in this case, the S-score according to a) is the two values It may be equal to any one of the above, or may be an average of the above two values.

상기 “b) Σβi*RNAi”는 시험물질이 처리된 세포의 각 ISG의 발현 값으로 다변량 회귀분석을 수행하여 각각 유전자의 회귀계수 (βi)를 산출한 후, 이를 해당 유전자의 RNA 발현 수준 (RNAi)과 곱한 값의 총합을 의미한다. 상기 면역억제물질 예측용 유전자의 회귀계수 (βi)는 다변량 회귀분석, 바람직하게는 Multivariate elastic net logistic regression 모델에서 산출되는 회귀계수일 수 있다. 본 발명에 있어서 단변량 또는 다변량 회귀분석은 R 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 회귀분석은 당업계에 공지된 회귀분석 프로그램, 예컨대, Prism, SPSS, MpLUS, Stata, 및 Python 등을 제한 없이 사용하여 수행될 수 있다.The above “b) Σβi*RNAi” calculates the regression coefficient (βi) of each gene by performing multivariate regression analysis with the expression value of each ISG in the cells treated with the test substance, and then calculates the RNA expression level (RNAi) of the gene ) and the sum of the values multiplied by The regression coefficient (βi) of the gene for predicting the immunosuppressive substance may be a regression coefficient calculated by multivariate regression analysis, preferably a multivariate elastic net logistic regression model. In the present invention, univariate or multivariate regression analysis can be performed using an R program. In addition, the regression analysis may be performed using a regression analysis program known in the art, such as Prism, SPSS, MpLUS, Stata, and Python, without limitation.

본 발명에 있어서, ISG의 발현 수준은 단백질 또는 RNA 발현 수준일 수 있으며, 당업계에서 단백질 수준 또는 RNA 수준 측정시 통상적으로 사용되는 대조군 유전자의 발현 수준에 대한 상대값으로 계산될 수 있다 (즉, 대조군 유전자의 발현 수준에 대해 정규화하여 나타낼 수 있음). 예를 들어, 상기 ISG의 발현 수준은 하우스키핑 유전자의 발현 수준에 대한 상대값으로 계산될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 beta-actin, GAPDH, beta-tubulin, vinculin, PCNA, histone 등의 유전자의 발현 수준에 대한 상대값으로 계산될 수 있다.In the present invention, the expression level of ISG may be a protein or RNA expression level, and may be calculated as a relative value to the expression level of a control gene commonly used in measuring protein or RNA levels in the art (i.e., can be expressed normalized to the expression level of the control gene). For example, the expression level of the ISG can be calculated as a relative value to the expression level of housekeeping genes, and more specifically, expression of genes such as beta-actin, GAPDH, beta-tubulin, vinculin, PCNA, and histone It can be calculated relative to the level.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 대조군은 물, 증류수, 초순수, DMSO, 또는 면역억제제가 처리된 인간 단핵구 유래 세포주일 수 있다. 바람직하게는, 상기 대조군은 면역억제제가 처리된 인간 단핵구 유래 세포주일 수 있다. 상기 면역억제제는 면역억제능이 있는 것으로 알려진 물질이라면 제한 없이 포함될 수 있고, 본 발명을 통해 면역억제능이 있는 것으로 판별된 물질 또한 포함될 수 있다. 혹은, 상기 면역억제제는 본 발명의 ISG 선별 방법에서 사용된 면역억제제 중 어느 하나 이상일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the control group may be water, distilled water, ultrapure water, DMSO, or a human monocyte-derived cell line treated with an immunosuppressive agent. Preferably, the control group may be a human monocyte-derived cell line treated with an immunosuppressive agent. The immunosuppressive agent may be included without limitation as long as it is known to have immunosuppressive activity, and substances determined to have immunosuppressive activity through the present invention may also be included. Alternatively, the immunosuppressive agent may be any one or more of the immunosuppressive agents used in the ISG screening method of the present invention.

상기 발현 수준은 mRNA 및 단백질 발현 수준을 모두 포함할 수 있으며, PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, 전유전체 염기서열 분석법 (WGS, Whole Genome Sequencing), 마이크로어레이 (microarray), 타켓 시퀀싱 (target sequencing), 생어 시퀀싱 (Sanger sequencing), 차세대염기서열분석법 (NGS), RNA 시퀀싱 (RNA sequencing), 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법 (Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 발현 수준은 mRNA의 발현 수준으로서, 당업계에 공지된 RNA 수준을 측정하는 방법을 제한 없이 사용하여 측정될 수 있다. The expression level may include both mRNA and protein expression levels, PCR, RNase protection assay, northern blotting, southern blotting, in situ hybridization, whole genome sequencing (WGS , Whole Genome Sequencing), microarray, target sequencing, Sanger sequencing, next-generation sequencing (NGS), RNA sequencing, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, The group consisting of radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, mass spectrometry, FACS, and protein chip It can be measured by one or more methods selected from. Preferably, the expression level is the expression level of mRNA, and can be measured using methods for measuring RNA levels known in the art without limitation.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 ISG set 선별방법에 의해 선별된 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 조성물 또는 키트를 제공한다.In addition, the present invention is a composition or kit for predicting immunosuppressive ability of a test substance, comprising as an active ingredient an agent for measuring the mRNA or protein level of a gene group for predicting immunosuppressive substances selected by the ISG set selection method according to the present invention provides

상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 본 명세서에 개시된 면역억제물질 예측용 유전자를 제한 없이 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 또는 5종 이상 면역억제제에 의해 공통적으로 발현이 증가한 ISG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, 및 RHOV.The gene group for predicting immunosuppressive substances may include without limitation the genes for predicting immunosuppressive substances disclosed herein. For example, the gene group for predicting immunosuppressive substances may include one or more selected from the group consisting of ISGs whose expression is commonly increased by 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more immunosuppressants. Preferably, the gene group for predicting immunosuppressive substances may be one or more genes selected from the group consisting of, but not limited to: PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C , F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2 , YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF4 25 , HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, and RHOV.

본 발명에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다. In the present invention, the agent for measuring the mRNA level may be a primer set or a probe that specifically binds to the mRNA.

본 명세서에서 사용된 용어, “프라이머”는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.As used herein, the term “primer” refers to a nucleic acid sequence having a short free 3-terminal hydroxyl group, which can form base pairs with a complementary template and serves as a starting point for template strand copying. . A primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and different four nucleoside triphosphates in an appropriate buffer and temperature.

본 명세서에서 사용된 용어, “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.As used herein, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to several bases to several hundred bases as short as possible to achieve specific binding with mRNA, and is labeled, so that a specific mRNA existence can be checked. The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.

상기 “프라이머” 또는 “프로브”는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.The “primer” or “probe” may be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support synthesis method or other well-known methods, and include all functional equivalents. In addition, primers or probes may be variously modified according to methods known in the art to the extent that hybridization with mRNA is not hindered. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of one or more homologs of the natural nucleotide, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc. ) or charged linkages (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of fluorescent or enzymatic labeling materials.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있다.In the present invention, the agent for measuring the protein level may be an antibody or an aptamer that specifically binds to the protein.

본 명세서에서 사용된 용어, “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.As used herein, the term “antibody” refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody means an antibody that specifically binds to a marker protein, and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. In addition, as long as they have antigen-antibody binding properties, a part of the entire antibody is also included in the antibody of the present invention, and all types of immunoglobulin antibodies that specifically bind to the protein of the present invention are included. For example, complete antibodies with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of antibody molecules, i.e. Fab, F(ab'), F(ab') with antigen-binding function 2 and Fv; Furthermore, antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies and chimeric antibodies and recombinant antibodies as long as they can specifically bind to the protein of the present invention.

본 명세서에서 사용된 용어, “앱타머 (aptamer)”는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term “aptamer” refers to a substance that can specifically bind to an analyte to be detected in a sample, and is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure in itself. nucleic acid), it is possible to specifically confirm the presence of a target protein in a sample. The aptamer is synthesized by determining the sequence of an oligonucleotide that is selective for the target protein to be identified and has high binding ability according to the general aptamer preparation method, and then the 5' or 3' end of the oligonucleotide is applied. It can be made by modification with -SH, -COOH, -OH or NH 2 so that it can bind to the functional group of the timer chip, but is not limited thereto.

본 명세서에서 사용된 용어, “측정”은 목적하는 물질 (본 발명의 경우 ISG 유전자의 mRNA 또는 단백질)의 존재 (발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 것은 상기 유전자의 발현 여부를 측정하는 것 (즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법 (분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 mRNA 또는 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 유전자의 mRNA 또는 단백질 검출은, 본 발명에 있어서는 ISG 유전자의 mRNA 또는 단백질 존재 여부의 검출, 또는 상기 mRNA 또는 단백질 수준의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.As used herein, the term “measurement” refers to measuring and confirming the presence (expression) of a substance of interest (mRNA or protein of the ISG gene in the case of the present invention), or the level of existence (expression level) of the substance of interest. It means to include both measuring and confirming changes in That is, measuring the mRNA or protein level of the gene means measuring whether the gene is expressed (ie, measuring the presence or absence of expression), or measuring the level of qualitative or quantitative change in mRNA or protein of the gene. it means. The measurement can be performed without limitation including both qualitative methods (assays) and quantitative methods. Types of qualitative and quantitative methods for measuring mRNA or protein levels of genes are well known in the art, and include the experimental methods described herein. Specific mRNA or protein level comparison methods for each method are well known in the art. Therefore, detecting the mRNA or protein of the target gene, in the present invention, includes detecting the presence or absence of the mRNA or protein of the ISG gene, or confirming the increase (up-regulation) or decrease (down-regulation) of the mRNA or protein level It means.

본 발명에 있어서 “키트 (kit)”는 물질의 면역억제능을 평가할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 즉, 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 ISG의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성, 조성물, 용액, 또는 장치 등이 제한 없이 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 키트는 본 발명에 따른 시험물질의 면역억제능 예측 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다. In the present invention, the “kit” is not limited as long as it can evaluate the immunosuppressive ability of a substance. That is, the kit according to the present invention may include not only an agent for measuring the mRNA or protein level of ISG according to the present invention, but also one or more other components, compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method without limitation. . For example, the kit may further include instructions describing a method for predicting the immunosuppressive ability of a test substance according to the present invention.

바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 마이크로어레이 키트 (마이크로어레이 칩), 유전자 증폭 키트, 및 RNA 시퀀싱 키트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. Preferably, the kit according to the present invention may be any one selected from the group consisting of a microarray kit (microarray chip), a gene amplification kit, and an RNA sequencing kit.

본 발명의 마이크로어레이 칩은 상기 유전자들의 DNA, cDNA, RNA 및 이들의 상보가닥 분자들을 프로브 (probe)로 사용할 수 있으며, 상기 프로브는 유전자 서열의 전부 또는 일부를 모두 포함하는 것으로 본다.The microarray chip of the present invention can use DNA, cDNA, RNA, and complementary strand molecules thereof of the genes as probes, and the probes are considered to include all or part of the gene sequences.

상기 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 일예로 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 유전자를 프로브로 이용하여 마이크로어레이 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭 (piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅 (micropipetting)법 또는 핀 (pin) 형태의 스폿터 (spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란 (amino-silane), 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine) 및 알데히드 (aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글라스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The microarray chip can be manufactured by a method known to those skilled in the art. For example, a method of manufacturing the microarray chip is as follows. A micropipetting method using a piezoelectric method or a method using a pin-type spotter to immobilize the gene on the substrate of a microarray chip by using the gene as a probe It can be used, but is not limited thereto. The substrate of the microarray chip is preferably coated with one active group selected from the group consisting of amino-silane, poly-L-lysine, and aldehyde. Not limited. In addition, the substrate may be selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon film, and nitrocellulose film, but is not limited thereto.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

[실시예] [Example]

실시예 1. 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (Immune suppressive gene set, ISG set)의 선별Example 1. Selection of immune suppressive gene set (ISG set) for predicting immunosuppressive substances

1-1. 세포 배양 및 준비1-1. Cell culture and preparation

액체질소에서 동결보존하던 인간 단핵구 유래 세포, THP-1 세포를 융해시킨 후 5% CO2 및 37℃ 조건에서 두 차례의 계대배양으로 안정화과정을 거치고, 24-웰 플레이트에 웰당 5×105개 세포의 밀도로 씨딩 (seeding)하였다. 배지는 10% Fetal bovine serum 및 1% penicillin-streptomycin를 함유한 RPMI 배지 (complete media)를 사용하였으며, 웰당 500 μl의 부피로 넣어주었다. Human monocyte-derived cells, THP-1 cells, which were cryopreserved in liquid nitrogen, were thawed, and then stabilized by subculture twice under 5% CO 2 and 37 ° C conditions, and 5 × 10 5 per well in a 24-well plate. Seeding was done at the density of cells. As the medium, RPMI medium (complete media) containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin was used, and was added in a volume of 500 μl per well.

1-2. 면역억제제의 처리1-2. Treatment of immunosuppressive agents

면역억제성 물질 처리에 의해 유의미한 발현 변화를 나타내는 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (ISG)를 선별하기 위해, 다음의 대표적인 면역억제제 5종을 각각 THP-1 세포에 처리하였다: 덱사메타손 (dexamethasone), 타크로리무스 (tacrolimus), 프레드니솔론 (prednisolone), 로릴 황산 나트륨 (sodium lauryl sulphate), 및 토파시티닙 (tofacitinib). In order to select the immunosuppressive substance predictive gene group (ISG) showing significant expression changes by immunosuppressive treatment, THP-1 cells were treated with the following 5 representative immunosuppressive agents: dexamethasone and tacrolimus. (tacrolimus), prednisolone, sodium lauryl sulphate, and tofacitinib.

면역억제제를 용해하는 용매는 해당 면역억제제의 지용성 또는 수용성 여부에 따라 초순수 (ultra pure water) 또는 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide, DMSO)를 사용하였다. 면역억제제의 처리 농도는 각 약물이 세포의 활성도를 10% 이내로 억제하는 농도인 cell viability of 90% (CV90)으로 설정하였다. CV90은 세포분열이나 활성 등과 같은 정상적인 생리학적 기전에는 큰 영향을 미치지 않으면서 해당 물질에 의한 면역억제 기전의 변화를 판단할 수 있는 농도이다. CV90은 CCD-8 분석법으로 산출하였으며, 물질을 1M, 0.1M, 0.01M, 0.001M, 또는 0.0001M의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 CCK-8에 의한 상대적인 OD 값을 측정하여 산출하였다. As a solvent for dissolving the immunosuppressant, ultra pure water or dimethylsulfoxide (DMSO) was used depending on whether the immunosuppressant was fat-soluble or water-soluble. The treatment concentration of the immunosuppressant was set to cell viability of 90% (CV90), which is a concentration at which each drug suppresses cell activity to within 10%. CV90 is a concentration at which changes in the immunosuppressive mechanism by the substance can be judged without significantly affecting normal physiological mechanisms such as cell division or activity. CV90 was calculated by the CCD-8 assay, and after incubation for 24 hours by treating the material at a concentration of 1M, 0.1M, 0.01M, 0.001M, or 0.0001M, compared to a control group not treated with the material, CCK-8 It was calculated by measuring the relative OD value by

실시예 1-1에 따라 세포를 24-웰 플레이트에 씨딩한 후, 두 시간이 경과한 후에 각 면역억제제를 CV90의 농도로 처리하였다. 모든 실험은 3회 반복 (triplet)으로 수행하였다. 면역억제제 처리 후 12시간 동안 5% CO2 및 37℃ 조건에서 추가배양 하였다. After seeding the cells in a 24-well plate according to Example 1-1, after two hours had elapsed, each immunosuppressive agent was treated at a concentration of CV90. All experiments were performed in triplets. After treatment with immunosuppressive agents, the cells were additionally cultured at 5% CO 2 and 37° C. for 12 hours.

1-3. 유전체 분석 및 ISG 선별1-3. Genomic analysis and ISG screening

면역억제제 처리 후 배양을 마친 THP-1 세포 및 대조군 세포를 각각 수거하여, 다음의 과정을 통해 총 RNA (total RNA)를 추출하였다: THP-1세포를 1.5 ㎖ e-tube에 수거 후 2,400 rpm, 4℃ 조건에 5분간 원심분리 했다. 원심분리로 분리된 상층액을 버리고, 인산완충용액 (phosphate buffer saline, PBS)으로 1회 세척 후, 500 ㎕ 트라이졸 (Trizol, Invitrogen)을 넣고 강한 진동 (vortexing)으로 세포를 파괴했다. 다음 클로로폼 (chloroform)을 넣고 13,000 rpm, 4℃조건에서 15분간 원심분리 하여 RNA, DNA, 단백질/지질 층을 분리했다. 위쪽의 수상층 (RNA층)을 200 ㎕씩 조심히 분리하여 새 1.5㎖ e-tube에 옮기고 같은 양의 이소프로필알코올 (2-propanol)을 200 ㎕ 넣고 조심히 뒤집으며 섞은 후 -20℃ 냉동고에서 1시간동안 RNA의 탈수반응을 거쳐 침전시켰다. 13,000rpm, 4℃조건에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버려 고형화된 RNA를 얻었다. 75% DEPC (diethyl phosphorocyanidated)-에탄올 (EtOH)을 각 튜브에 1 ㎖씩 넣어 RNA 세척 (RNA washing)을 2회 실시한 후 펠렛을 건조시켰으며, DEPC treated water 20 ㎕에 elution하여 RNA를 준비하였다. After treatment with an immunosuppressant, the cultured THP-1 cells and control cells were collected, respectively, and total RNA was extracted through the following process: THP-1 cells were collected in a 1.5 ml e-tube at 2,400 rpm, It was centrifuged for 5 minutes at 4°C. The supernatant separated by centrifugation was discarded, and after washing once with phosphate buffer saline (PBS), 500 μl of Trizol (Invitrogen) was added and the cells were destroyed by strong vortexing. Next, chloroform was added and centrifuged at 13,000 rpm and 4°C for 15 minutes to separate RNA, DNA, and protein/lipid layers. Carefully separate 200 μl of the upper water layer (RNA layer) and transfer to a new 1.5 ml e-tube, add 200 μl of isopropyl alcohol (2-propanol) in the same amount, mix carefully by inverting, and incubate in a -20 ° C freezer for 1 hour. RNA was precipitated through the dehydration reaction. After centrifugation at 13,000 rpm and 4°C for 10 minutes, the supernatant was discarded to obtain solidified RNA. RNA was washed twice by adding 1 ml of 75% DEPC (diethyl phosphorocyanidated)-ethanol (EtOH) to each tube, the pellet was dried, and RNA was prepared by elution in 20 μl of DEPC-treated water.

추출한 RNA는 ㈜이바이오젠에 의뢰하여 유전체 분석 (QuantSeq 3'mRNA-sequencing)을 수행하였다. 유전체 분석 방법은 상기 실험방법에 제한되지 않으며, 마이크로어레이, RNA-시퀀싱 등 기타 공지된 유전체 분석 방법을 적절히 활용할 수 있다. The extracted RNA was commissioned by eBiogen Co., Ltd. and genome analysis (QuantSeq 3'mRNA-sequencing) was performed. The genome analysis method is not limited to the above experimental methods, and other known genome analysis methods such as microarray and RNA-sequencing may be appropriately utilized.

면역억제제-처리 THP-1 세포 및 대조군 세포의 유전체 분석 결과를 비교하여, 면역억제제제 의해 유의미한 발현 변화를 보이는 유전자 세트를 선별하였다. 구체적으로, 대조군 (면역억제제를 처리하지 않은 세포) 대비 특정 면역억제제를 처리한 세포에서 유의적인 발현 증가를 보이는 유전자들을 선별하였으며, 1종의 면역억제제에 의해서만 발현이 증가한 유전자, 2종, 3종, 4종, 또는 5종 면역억제제 처리군에서 공통적으로 발현이 증가한 유전자 그룹으로 각각 분류하였다. 이 중, 3종 이상의 면역억제제에 의해 대조군 대비 발현 증가를 보인 유전자들을 면역억제물질 예측용 유전자 집단 (ISG)으로 선별하였다. 본 실시예를 통해 선별된 ISG는 표 1 내지 4에 정리하였다. By comparing the genome analysis results of immunosuppressant-treated THP-1 cells and control cells, a set of genes exhibiting significant expression changes by the immunosuppressant were selected. Specifically, genes showing a significant increase in expression in cells treated with a specific immunosuppressant compared to the control group (cells not treated with immunosuppressant) were selected, and genes whose expression increased only by one type of immunosuppressant, 2 types, and 3 types , 4, or 5 immunosuppressant treatment groups, respectively, were classified into gene groups with increased expression in common. Among them, genes whose expression was increased compared to the control group by three or more types of immunosuppressants were selected as an immunosuppressant prediction gene group (ISG). ISGs selected through this Example are summarized in Tables 1 to 4.

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1-4. 통계 분석1-4. statistical analysis

두 그룹간 차이의 유의성은 Welch's t-test로 확인하였다. 셋 이상의 그룹간 비교는 One-way ANOVA로 통계적 유의성을 분석했다. P-value 가 0.05 미만일 때 그룹간 차이에 통계적 유의성이 있다고 판단했다.The significance of the difference between the two groups was confirmed by Welch's t-test. Comparisons between three or more groups were analyzed for statistical significance by one-way ANOVA. When the P-value was less than 0.05, the difference between groups was judged to be statistically significant.

1-5. 최종 ISG 선별 및 면역억제능 예측용 수식 확인1-5. Confirmation of final ISG selection and formula for predicting immunosuppressive activity

시험물질의 면역억제능을 판별하기 위한 최적의 알고리즘을 구축하기 위해, 앞선 실시예에서 선별된 ISG를 대상으로 단변량 회귀분석 (univariate elastic net logistic regression) 모델을 사용하여 유전자별 p-value를 분석하였으며, 이를 근거로 61개의 최종 ISG 선별하였다 (표 5). 단변량 회귀분석은 R 프로그램을 사용하여 수행하였다. In order to construct an optimal algorithm for determining the immunosuppressive ability of a test substance, the p-value for each gene was analyzed using a univariate elastic net logistic regression model for the ISG selected in the previous example. , based on this, 61 final ISGs were selected (Table 5). Univariate regression analysis was performed using the R program.

최종 ISGFinal ISG PRPSAP1PRPSAP1 ERAP2ERAP2 SLC7A5SLC7A5 DDIT4DDIT4 UBTD1UBTD1 LINC-RORLINC-ROR KIAA0040KIAA0040 ATF4ATF4 INHBEINHBE LRRC56LRRC56 APC2APC2 GPER1GPER1 ASNSASNS EIF4EBP1EIF4EBP1 LMNTD2LMNTD2 TBXA2RTBXA2R LAMB1LAMB1 GARSGARS VLDLR-AS1VLDLR-AS1 CLDND2CLDND2 SLC44A2SLC44A2 GKAP1GKAP1 TRIB3TRIB3 SLC6A9SLC6A9 ZNF425ZNF425 FSIP2FSIP2 ARMCX5-GPRASP2ARMCX5-GPRASP2 CARSCARS FYNFYN HACD2HACD2 CLIC6CLIC6 GPRASP2GPRASP2 SLC3A2SLC3A2 BATF3BATF3 NUDT13NUDT13 ADM2ADM2 TSC22D3TSC22D3 YARSYARS ST6GALNAC3ST6GALNAC3 MORF4L2-AS1MORF4L2-AS1 ADRA2CADRA2C XKR8XKR8 GRB10GRB10 FAM84BFAM84B RHOVRHOV F11RF11R GPR162GPR162 STC2STC2 ZBED3ZBED3 　
　
　
　　
　
　
　 PDGFRAPDGFRA BCL11BBCL11B CBSCBS METRNLMETRNL BTCBTC PARP16PARP16 ALDH1L2ALDH1L2 ITPRIPITPRIP DKK2DKK2 DPEP1DPEP1 DDIT3DDIT3 JAG1JAG1

또한, 다변량 회귀분석 (Multivariate elastic net logistic regression) 모델에 상기 61개 유전자들의 정보 (유전자의 RNA 발현량)를 입력하여 validation set의 선천면역 억제제 (innate immune suppressor) 및 비-억제제 (non-suppressor)를 구별하고 β 값을 산출할 수 있는 수식을 도출하였다. 다변량 회귀분석은 R 프로그래밍으로 수행하였다.In addition, by inputting the information (RNA expression level of genes) of the 61 genes into a multivariate elastic net logistic regression model, innate immune suppressors and non-suppressors of the validation set were determined. , and derived a formula that can calculate the β value. Multivariate regression analysis was performed with R programming.

본 발명에서 시험물질의 면역억제능을 나타내는 점수인 S-score (Signature score)는 하기 2가지 방법을 통해 산출할 수 있다: i) ISG 집단의 발현값의 중앙값을 산출하여 계산함, ii) 다변량 회귀분석을 통해 파악되는 유전자별 beta 값을 해당 유전자의 RNA 발현량과 곱하여 계산함. 이 때, 상기 방법 ii)에 따른 S-score의 계산식은 다음과 같다.In the present invention, the S-score (Signature score), a score representing the immunosuppressive ability of a test substance, can be calculated through the following two methods: i) calculated by calculating the median value of the expression values of the ISG population, ii) multivariate regression Calculated by multiplying the beta value for each gene identified through analysis by the RNA expression level of the gene. At this time, the calculation formula of the S-score according to method ii) is as follows.

S-score (Signature score) = Σβi*RNAiS-score (Signature score) = Σβi*RNAi

- βi : elastic net regularization coefficient of ISG- βi: elastic net regularization coefficient of ISG

- RNAi: RNA expression level of ISG- RNAi: RNA expression level of ISG

실시예 2. 면역억제능 S-스코어 계산을 통한 시험물질의 면역억제능 확인-1Example 2. Confirmation of immunosuppressive ability of test substance through immunosuppressive ability S-score calculation-1

실시예 1을 통해 선별한 ISG를 이용해 시험물질의 면역억제능을 확인하는 과정에 대해 이하 기술한다. ISG 및 S-score를 이용한 시험물질의 면역억제능 예측 과정은 도 1에 간략히 나타냈다. 실시예 1과 마찬가지로 24-웰 플레이트에 웰당 5×105개 세포의 밀도로 THP-1 세포를 씨딩한 후 2시간이 지났을 때 면역억제능을 확인하고자 하는 시험물질 (Experimental group; 사이클로스포린 및 아시클로버를 사용함)을 THP-1 세포에 처리하였으며, 대조군 (Comparison group)으로서 IGS 선별을 위해 사용했던 덱사메타손, 타크로리무스, 토파시티시닙, 프레드니솔론, 로릴 황산 나트륨을 처리하였다. 5% CO2 및 37℃ 조건에서 12시간 동안 배양한 후, 시험물질 처리군과 대조군으로부터 총 RNA를 추출하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 유전체 분석을 수행하였다. 유전체 분석 결과를 바탕으로, 시험물질 처리군 및 대조군에서의 실시예 1에서 선별된 ISG 유전자 각각의 발현 수준을 확인하여 S-score를 계산하였다. 즉, 이 때 S-score는 시험물질 처리군 또는 대조군에서의 ISG의 발현 수준의 중간값을 산출하여 계산하였다. ISG를 기반으로 산출한 시험물질 처리군의 S-score가 대조군에 비해 유의미하게 높을수록 상기 시험물질의 면역억제능이 높다고 예측할 수 있다. 본 실시예에 따른 S-score 비교 결과는 도 2에 나타냈다.The process of confirming the immunosuppressive ability of the test substance using the ISG selected in Example 1 will be described below. The process of predicting immunosuppressive ability of a test substance using ISG and S-score is briefly shown in FIG. 1 . As in Example 1, after seeding THP-1 cells at a density of 5×10 5 cells per well in a 24-well plate, the immunosuppressive ability was confirmed 2 hours later (Experimental group; cyclosporine and acyclovir were used). ) was treated with THP-1 cells, and dexamethasone, tacrolimus, topaciticinib, prednisolone, and sodium lauryl sulfate, which were used for IGS selection, were treated as a control (Comparison group). After incubation at 5% CO 2 and 37°C for 12 hours, total RNA was extracted from the test substance-treated group and the control group, and genome analysis was performed in the same manner as in Example 1. Based on the genome analysis results, the expression level of each ISG gene selected in Example 1 in the test substance treatment group and the control group was confirmed to calculate the S-score. That is, at this time, the S-score was calculated by calculating the median value of ISG expression levels in the test substance treatment group or control group. The higher the S-score of the test substance-treated group calculated based on the ISG is significantly higher than that of the control group, the higher the immunosuppressive ability of the test substance can be predicted. The S-score comparison results according to this embodiment are shown in FIG. 2 .

실시예 3. 면역억제능 S-스코어 계산을 통한 시험물질의 면역억제능 확인-2Example 3. Confirmation of immunosuppressive ability of test substance through immunosuppressive ability S-score calculation-2

다음으로, 단변량 및 다변량 회귀분석을 통해 산출되는 S-score를 바탕으로 시험물질의 면역억제능을 확인하였다. 실시예 1과 마찬가지로 24-웰 플레이트에 웰당 5×105개 세포의 밀도로 THP-1 세포를 씨딩한 후 2시간이 지났을 때 면역억제능을 확인하고자 하는 시험물질을 THP-1 세포에 처리하였다. 본 발명에 따른 ISG의 면역억제능을 검증하기 위해, 시험물질로 면역억제제인 덱사메탁손, 타크로리무스, 토파시티시닙, 프레드니솔론, 로릴황산나트륨, 사이클로스포린, 벤조산, 염화수은, 및 아시클로버를 사용하였으며, 비교를 위해 면역 활성화제인 LPS 및 리바비린을 사용하였다. 대조군으로는 미처리 대조군 (vehicle)을 사용하였다. 5% CO2 및 37℃ 조건에서 12시간 동안 배양한 후, 시험물질 처리군과 대조군으로부터 총 RNA를 추출하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 유전체 분석을 수행하였다. 유전체 분석 결과를 바탕으로, 시험물질 처리군 및 대조군에서의 실시예 1에서 선별된 ISG 유전자 각각의 발현 수준을 확인하고, 다변량 분석을 통해 회귀계수 β 값을 확인하여 S-score를 산출하였다. Next, the immunosuppressive ability of the test substance was confirmed based on the S-score calculated through univariate and multivariate regression analysis. As in Example 1, THP-1 cells were seeded at a density of 5×10 5 cells per well in a 24-well plate, and 2 hours later, the test substance to be confirmed for immunosuppressive activity was treated with THP-1 cells. In order to verify the immunosuppressive ability of the ISG according to the present invention, immunosuppressive agents such as dexametaxone, tacrolimus, tofacitinib, prednisolone, sodium lauryl sulfate, cyclosporine, benzoic acid, mercury chloride, and acyclovir were used as test substances, and the comparison was performed. LPS and ribavirin, which are immune activators, were used for this purpose. As a control group, an untreated control group (vehicle) was used. After incubation at 5% CO 2 and 37°C for 12 hours, total RNA was extracted from the test substance-treated group and the control group, and genome analysis was performed in the same manner as in Example 1. Based on the genome analysis results, the expression level of each ISG gene selected in Example 1 in the test substance treatment group and the control group was confirmed, and the regression coefficient β value was confirmed through multivariate analysis to calculate the S-score.

각 시험물질 및 대조군의 S-score 비교 그래프는 도 3에 나타냈다. 도면에서 확인 가능한 바와 같이, 면역억제성 물질 (덱사메탁손, 타크로리무스, 토파시티시닙, 프레드니솔론, 로릴황산나트륨, 사이클로스포린, 벤조산, 염화수은, 또는 아시클로버)이 처리된 그룹은 미처리 대조군에 비해 S-score가 현저히 높았으며, 반대로 면역을 활성화시키는 LPS 또는 리바비린이 처리된 그룹은 미처리 대조군에 비해 낮은 S-score를 나타냈다. 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 ISG 및 이의 S-score가 시험물질의 면역억제능을 정확히 판별할 수 있음을 보여준다.S-score comparison graphs of each test substance and control group are shown in FIG. 3 . As can be seen in the figure, the group treated with immunosuppressive substances (dexametaxone, tacrolimus, tofacitycinib, prednisolone, sodium lauryl sulfate, cyclosporine, benzoic acid, mercury chloride, or acyclovir) compared to the untreated control group S-score was remarkably high, and on the contrary, the group treated with LPS or ribavirin, which activates immunity, showed a lower S-score than the untreated control group. These results show that the ISG and its S-score according to the present invention can accurately determine the immunosuppressive ability of the test substance.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다. The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims (14)

면역억제물질 예측용 유전자 집단 (Immune suppressive gene set, ISG set)을 선별하는 방법으로서,
(S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 3종 이상의 면역억제제를 각각 단독으로 처리하는 단계;
(S2) 상기 면역억제제가 처리된 인간 단핵구 유래 세포 및 대조군에 대해 유전체 분석을 수행하는 단계로서, 상기 대조군은 상기 면역억제제가 처리되지 않은 인간 단핵구 유래 세포주인, 단계; 및
(S3) 상기 대조군과 비교하여 적어도 3종 이상의 면역억제제에 의해 발현이 증가한 유전자를 면역억제물질 예측용 유전자 집단으로 선별하는 단계를 포함하는, 면역억제물질 예측용 유전자 집단을 선별하는 방법.
As a method for selecting an immunosuppressive gene set (ISG set) for predicting immunosuppressive substances,
(S1) treating the separated human monocyte-derived cell line with three or more immunosuppressive agents alone;
(S2) performing genome analysis on the human monocyte-derived cells treated with the immunosuppressant and a control, wherein the control is a human monocyte-derived cell line not treated with the immunosuppressant; and
(S3) a method for selecting a gene group for predicting an immunosuppressant, comprising the step of selecting genes whose expression is increased by at least three or more immunosuppressive agents compared to the control group as a gene group for predicting an immunosuppressant.
 제1항에 있어서,
상기 면역억제제는 덱사메타손, 타크로리무스, 토파시티닙, 프레드니솔론, 로릴 황산 나트륨, 벤조산, 염화수은, 및 아시클로버로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역억제물질 예측용 유전자 집단을 선별하는 방법.
According to claim 1,
The immunosuppressive agent is selected from the group consisting of dexamethasone, tacrolimus, tofacitinib, prednisolone, sodium lauryl sulfate, benzoic acid, mercury chloride, and acyclovir.
 (S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(S2) 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군에서 제1항의 방법에 의해 선별된 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법으로서,
상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 하기로 이루어진 군에서 선택된 2 이상인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법:
PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, 및 RHOV.
(S1) treating the test substance to the isolated human monocyte-derived cell line; and
(S2) A method for predicting the immunosuppressive ability of a test substance, comprising the step of measuring the expression level of the gene group for prediction of an immunosuppressive substance selected by the method of claim 1 in the cells treated with the test substance and in the control group,
The method for predicting immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that the gene group for predicting the immunosuppressant is at least two selected from the group consisting of:
PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, and RHOV.
 제3항에 있어서,
상기 방법은 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군의 S-score를 산출하는 단계를 더 포함하고, 상기 S-score는 하기 중 어느 하나로 표현되는 것인, 시험물질의 면역억제능 예측 방법:
a) 상기 면역억제물질 예측용 유전자의 발현 수준의 중앙값; 또는
b) Σβi*RNAi
(여기서, βi, 면역억제물질 예측용 유전자의 회귀계수; RNAi, 면역억제물질 예측용 유전자의 RNA 발현 수준).
According to claim 3,
The method further comprises calculating S-scores of the cells treated with the test substance and the control group, and the S-score is expressed as one of the following methods for predicting immunosuppressive ability of a test substance:
a) the median value of the expression level of the gene for predicting the immunosuppressive substance; or
b) Σβi*RNAi
(Where, βi, the regression coefficient of a gene for predicting an immunosuppressant; RNAi, the RNA expression level of a gene for predicting an immunosuppressant).
 제4항에 있어서,
상기 방법은 대조군 대비 상기 시험물질이 처리된 세포의 S-score가 증가되어 있는 경우 상기 시험물질을 면역억제성 물질로 예측하는 단계를 더 포함하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법.
According to claim 4,
The method further comprises the step of predicting the test substance as an immunosuppressive substance when the S-score of the cells treated with the test substance compared to the control group is increased.
 제3항에 있어서,
상기 대조군은 면역억제제가 처리된 인간 단핵구 유래 세포주인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법.
According to claim 3,
The control group is a method for predicting immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that the human monocyte-derived cell line treated with an immunosuppressive agent.
 제3항에 있어서,
상기 발현 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, 전유전체 염기서열 분석법 (WGS, Whole Genome Sequencing), 마이크로어레이 (microarray), 타켓 시퀀싱 (target sequencing), 생어 시퀀싱 (Sanger sequencing), 차세대염기서열분석법 (NGS), RNA 시퀀싱 (RNA sequencing), 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법 (Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법.
According to claim 3,
The expression level was measured by PCR, RNase protection assay, northern blotting, southern blotting, in situ hybridization, whole genome sequencing (WGS), microarray, Target sequencing, Sanger sequencing, next-generation sequencing (NGS), RNA sequencing, western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Ouchterlony immunodiffusion method characterized by being measured by one or more methods selected from the group consisting of immunodiffusion), rocket immunoelectrophoresis, immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, mass spectrometry, FACS, and protein chip , Methods for predicting immunosuppressive activity of test substances.
 제3항에 있어서,
상기 면역억제능은 선천성 면역에 대한 억제능인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법.
According to claim 3,
The immunosuppressive ability is a method for predicting immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that the suppressive ability for innate immunity.
 제3항에 있어서,
상기 인간 단핵구 유래 세포주는 THP-1 세포주인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측 방법.
According to claim 3,
Characterized in that the human monocyte-derived cell line is a THP-1 cell line, a method for predicting immunosuppressive ability of a test substance.
 제1항의 방법에 의해 선별된 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 키트로서,
상기 면역억제물질 예측용 유전자 집단은 하기로 이루어진 군에서 선택된 2 이상인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 키트:
PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, 및 RHOV.
A kit for predicting the immunosuppressive ability of a test substance, comprising as an active ingredient an agent for measuring the mRNA or protein level of the gene group for predicting immunosuppressive substances selected by the method of claim 1,
The kit for predicting the immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that the gene group for predicting the immunosuppressive substance is two or more selected from the group consisting of:
PRPSAP1, LINC-ROR, APC2, TBXA2R, SLC44A2, FSIP2, CLIC6, ADM2, ADRA2C, F11R, PDGFRA, BTC, DKK2, ERAP2, KIAA0040, GPER1, LAMB1, GKAP1, ARMCX5-GPRASP2, GPRASP2, TSC22D3, XKR8, GPR162, BCL11B, PARP16, DPEP1, SLC7A5, ATF4, ASNS, GARS, TRIB3, CARS, SLC3A2, YARS, GRB10, STC2, CBS, ALDH1L2, DDIT3, DDIT4, INHBE, EIF4EBP1, VLDLR-AS1, SLC6A9, FYN, BATF3, ST6GALNAC3, FAM84B, ZBED3, METRNL, ITPRIP, JAG1, UBTD1, LRRC56, LMNTD2, CLDND2, ZNF425, HACD2, NUDT13, MORF4L2-AS1, and RHOV.
 제10항에 있어서,
상기 키트는 하기 단계를 포함하는 시험물질의 면역억제능 예측 방법이 기재된 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 키트:
(S1) 분리된 인간 단핵구 유래 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(S2) 상기 시험물질이 처리된 세포 및 대조군에서 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 발현 수준을 측정하는 단계.
According to claim 10,
The kit for predicting immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that it further comprises an instruction in which a method for predicting immunosuppressive ability of a test substance comprising the following steps is described:
(S1) treating the test substance to the isolated human monocyte-derived cell line; and
(S2) measuring the expression level of a gene group for predicting an immunosuppressive substance in the cells treated with the test substance and in the control group.
 제10항에 있어서,
상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 키트.
According to claim 10,
The agent for measuring the level of the mRNA is a kit for predicting immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that a primer set or a probe that specifically binds to the mRNA.
 제10항에 있어서,
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 키트.
According to claim 10,
A kit for predicting the immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that the agent for measuring the level of the protein is an antibody or an aptamer specific to the protein.
 제10항에 있어서,
상기 키트는 마이크로어레이 키트, 유전자 증폭 키트, 및 RNA 시퀀싱 키트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 시험물질의 면역억제능 예측용 키트.According to claim 10,
The kit for predicting immunosuppressive ability of a test substance, characterized in that the kit is any one selected from the group consisting of a microarray kit, a gene amplification kit, and an RNA sequencing kit.
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