KR20230060494A - Novel biomarker for predicting prognosis of peripheral T-cell lymphoma and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 말초 T세포 림프종 환자의 예후를 예측하기 위한 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 말초 T세포 림프종 예후를 예측하기 위한 정보의 제공 방법, 및 이를 이용한 말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템, 조성물 및 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a novel biomarker for predicting the prognosis of patients with peripheral T-cell lymphoma and its use, and more specifically, to a method for providing information for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma, and a prognosis of peripheral T-cell lymphoma using the same. It relates to predictive systems, compositions and kits.
림프종(Lymphoma)은 림프관, 비장, 골수, 혈액 또는 다른 기관들에서 발생할 수 있으며 여성보다는 남성에서 더 많이 발생한다. 전형적으로, 림프종은 림프계 세포(lymphoid cell)의 고형 종양을 나타낸다. 치료방법은 대부분 화학요법을 이용하나 몇몇 사례(case)에서는 방사선요법 및/또는 골수 이식법을 이용한다. 일반적으로, 림프종은 병력(history), 타입 및 단계에 따라 치료 가능하다. Lymphoma can occur in the lymphatic vessels, spleen, bone marrow, blood or other organs and is more common in men than women. Typically, lymphomas represent solid tumors of lymphoid cells. Most treatments use chemotherapy, but in some cases, radiation therapy and/or bone marrow transplantation are used. Generally, lymphoma is treatable depending on the history, type and stage.
림프종 중 T세포에서 기원한 림프종을 말초 T세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma, PTCL)이라 하며, 다양한 형태의 림프절 또는 림프절 외에서 발생한 T세포 계열의 림프종을 아우르는 질환이다. 특히 우리나라에서는 분류 불가능한 말초 T세포 림프종(PTCL, not otherwise specified), 혈관면역모구 T세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma) 및 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma)이 비교적 흔하게 발병한다. 분류 불가능한 말초 T세포 림프종은 전체 림프종의 6.3%로 가장 흔하며, 주로 평균 53세에 발생하며, 남자가 2.1배 더 많다. 혈관면역모구 T세포 림프종은 주로 60대에 발생하며, 역형성 큰세포 림프종은 역형성 림프종 활성효소(anaplastic lymphoma kinase, ALK) 여부에 따라 양성의 경우 20대에, 음성의 경우 40 ~ 65세에 흔하게 발생한다.Among lymphomas, lymphoma originating from T cells is called peripheral T-cell lymphoma (PTCL), and it is a disease encompassing various types of lymphomas of the T cell lineage arising from lymph nodes or extralymph nodes. In particular, in Korea, unclassifiable peripheral T-cell lymphoma (PTCL, not otherwise specified), angioimmunoblastic T-cell lymphoma, and anaplastic large cell lymphoma are relatively common. Unclassifiable peripheral T-cell lymphoma is the most common, accounting for 6.3% of all lymphomas. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma occurs mainly in the 60s, and anaplastic large cell lymphoma is diagnosed in the 20s in the case of benign cases and between the ages of 40 and 65 in the case of negative cases depending on the presence of anaplastic lymphoma kinase (ALK). It happens frequently.
림프종은 후기 단계로 진행될수록 재발하는 경향을 가지기 때문에 림프종의 치료는 초기 단계에 시도되어야 하며, 치료 후 재발을 예측하여 후속 치료 방안을 세우는 것이 중요하다. 그러나 현재 B세포를 기원으로 하는 림프종이나 중추신경계 림프종에 대한 진단 및 예후 예측용 바이오마커가 개발되었으나, 아직까지 T세포 림프종에 대한 바이오마커의 연구 및 개발이 부족한 실정이다.Since lymphoma tends to recur as it progresses to a later stage, treatment of lymphoma should be attempted at an early stage, and it is important to predict recurrence after treatment and establish a follow-up treatment plan. However, although biomarkers for diagnosis and prognosis of B-cell-derived lymphoma or central nervous system lymphoma have been developed, research and development of biomarkers for T-cell lymphoma are still lacking.
본 발명은 말초 T세포 림프종의 예후를 예측 가능한 신규 바이오마커의 발현 수준을 측정하여 말초 T세포 림프종 예후를 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for providing information for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma by measuring the expression level of a novel biomarker capable of predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma.
또한, 본 발명은 말초 T세포 림프종 환자의 예후를 예측 가능한 신규 바이오마커를 분석할 수 있는 말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a peripheral T-cell lymphoma prognosis prediction system capable of analyzing novel biomarkers that can predict the prognosis of patients with peripheral T-cell lymphoma.
또한, 본 발명은 말초 T세포 림프종 환자의 예후를 예측 가능한 신규 바이오마커를 검출 또는 측정할 수 있는 말초 T세포 림프종 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a composition and kit for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma, which can detect or measure novel biomarkers that can predict the prognosis of patients with peripheral T-cell lymphoma.
본 발명자들은 말초 T세포 림프종 환자의 혈장 내 세포유리(cell-free) DNA에 대한 시퀀싱을 통해 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 하나 이상의 유전자에서 변이가 발견된 경우가 변이가 없는 경우에 비해 생존율이 현저히 낮다는 것을 확인하고, 변이된 CREBBP 유전자와 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 하나 이상의 유전자를 조합할 경우 예후 예측의 정확도가 증가함을 확인함으로써 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2의 변이 유전자를 말초 T세포 림프종 예후를 예측하는 바이오마커로 제시하며, 이러한 바이오마커를 활용한 말초 T세포 림프종 예후를 예측하기 위한 정보의 제공 방법, 및 이를 이용한 말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템, 조성물 및 키트를 제공하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors found that mutations in one or more of RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53, and IDH2 genes through sequencing of cell-free DNA in the plasma of patients with peripheral T-cell lymphoma were significantly better than those without mutations. Mutations in RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 by confirming that the survival rate is remarkably low and that the accuracy of prognosis prediction increases when combining the mutated CREBBP gene with one or more genes of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 A gene is presented as a biomarker to predict the prognosis of peripheral T-cell lymphoma, and a method for providing information for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma using the biomarker, and a system, composition, and kit for predicting peripheral T-cell lymphoma prognosis using the same The present invention was completed by providing.
본 발명의 일 양상은 a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; b) 상기 생물학적 시료에서 CREBBP 유전자, 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 변이 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 측정된 유전자의 변이 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 말초 T세포 림프종 예후를 예측하기 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.One aspect of the present invention comprises the steps of a) taking a biological sample from a subject; b) measuring the mutation level of the CREBBP gene and at least one gene selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 in the biological sample; And c) provides a method for providing information for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma, comprising comparing the mutation level of the measured gene with a control group.
상기 a) 내지 c) 단계에 대해 다음에서 자세히 살펴본다.Steps a) to c) will be described in detail below.
상기 a) 단계는 말초 T세포 림프종 환자의 생존 예후에 대한 검사가 필요한 개체로부터 생물학적 시료를 채취하는 과정이다.Step a) is a process of collecting a biological sample from an individual in need of an examination on the survival prognosis of a patient with peripheral T-cell lymphoma.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 피험자는 치료 전 또는 후의 말초 T세포 림프종 환자인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the subject in step a) may be a peripheral T-cell lymphoma patient before or after treatment.
상기 말초 T세포 림프종은 T 림프구에 생기는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)의 일종으로 림프절, 비장, 위장 및 피부와 같은 골수의 외부 림프 조직에서 발생하며, 피부 T세포 림프종과 같은 일부 성장이 느린 림프종을 제외하고는 대부분 공격형 림프종이여서 진행 속도가 빠르며 재발률이 높은 암종이다. 말초 T세포 림프종의 치료에서는 주로 화학요법이 처방되는데, 현재 표준치료법인 1차 병용 화학요법 (CHOP; Cyclophosphamide/Doxorubicin hydrochloride/Vincristine sulfate/Prednisolon)을 진행함에도 질병이 완화되지 않는 경우가 많고, 특히 1차 치료에 실패하거나 재발한 경우 생존기간이 약 5.8개월 (중간값)로 예후가 좋지 않다. 그 외에는 화학요법에 대한 보조적 치료법으로 방사선요법, 자가 줄기세포 이식 등이 있다.The peripheral T-cell lymphoma is a type of non-Hodgkin's lymphoma that occurs in T lymphocytes and occurs in external lymphoid tissues such as lymph nodes, spleen, stomach, and skin, and has slow growth in some, such as cutaneous T-cell lymphoma. Except for lymphoma, most are aggressive lymphomas, which are cancerous tumors with a high rate of progression and a high recurrence rate. In the treatment of peripheral T-cell lymphoma, chemotherapy is mainly prescribed. In many cases, the disease is not alleviated even with the current standard treatment, first-line combination chemotherapy (CHOP; Cyclophosphamide/Doxorubicin hydrochloride/Vincristine sulfate/Prednisolon). If primary treatment fails or relapses, the survival time is about 5.8 months (median value), and the prognosis is poor. Other adjuvant treatments for chemotherapy include radiation therapy and autologous stem cell transplantation.
본 발명에서 사용된 "예후"는 아직 진단되지 않거나 진단을 받은 개체를 대상으로 치료 전/후 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 말초 T세포 림프종 환자의 CREBBP 유전자, 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 변이 수준을 확인하여 말초 T세포 림프종 환자의 향후 생존 예후가 좋을지 여부에 대해 예측하는 것을 의미한다.As used herein, “prognosis” refers to determining recurrence, metastasis, drug responsiveness, resistance, etc. of an individual before/after treatment for an individual who has not yet been diagnosed or has been diagnosed. In the present invention, the CREBBP gene of peripheral T-cell lymphoma patients and the mutation level of one or more genes selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 are checked to predict whether the future survival prognosis of peripheral T-cell lymphoma patients will be good means to do
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 말초 T세포 림프종은 분류 불가능한 말초 T세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS), 혈관면역모구 T세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL), 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL), T 여포 보조 세포(T follicular helper cell, TFH) 표현형(phenotype)을 가진 결절 말초 T세포 림프종(nodal peripheral T-cell lymphoma, PTFH), 여포 T세포 림프종(follicular T-cell lymphoma, FTCL), 단형성 상피 장 T세포 림프종(monomorphic epitheliotropic intestinal T-cell lymphoma, MEITL), 피하 지방층염 유사 T세포 림프종(subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma, SPTCL) 및 변형 근상식육종(transformed mycosis fungoides, transformed MF)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the peripheral T-cell lymphoma is unclassifiable peripheral T-cell lymphoma (not otherwise specified, PTCL-NOS), angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), nodal peripheral T-cell lymphoma (PTFH) with T follicular helper cell (TFH) phenotype , follicular T-cell lymphoma (FTCL), monomorphic epitheliotropic intestinal T-cell lymphoma (MEITL), subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma , SPTCL) and transformed mycosis fungoides (transformed MF).
본 발명에서 사용된 "바이오마커(biomarker)"는 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 물질로서 생체 변화를 알아낼 수 있는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 본 발명에서는 바이오마커로서 변이된 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자을 이용할 수 있다.As used in the present invention, "biomarker" is a substance that is generally detectable in biological samples, and organic biomolecules such as polypeptides, proteins, nucleic acids, genes, lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars, etc. All inclusive. In the present invention, mutated RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 genes can be used as biomarkers.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 소변 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the biological sample in step a) may be at least one selected from the group consisting of blood, plasma, serum, lymph, saliva, urine, and tissue.
본 발명의 일 실시예에서는 말초 T세포 림프종 환자에서 얻은 혈장 세포유리 DNA와 종양 조직의 체세포 돌연변이가 일치하는 것을 확인함으로써 비침습적이며 신속, 정확하고 간편하게 말초 T세포 림프종 예후를 예측할 수 있도록 생물학적 시료가 혈액, 혈장 또는 혈청인 것이 바람직하다.In one embodiment of the present invention, a biological sample is prepared so that the prognosis of peripheral T-cell lymphoma can be predicted non-invasively, quickly, accurately and simply by confirming that the plasma cell-free DNA obtained from a patient with peripheral T-cell lymphoma matches the somatic mutation in the tumor tissue. It is preferably blood, plasma or serum.
상기 b) 단계는 생물학적 시료에서 바이오마커 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2의 존재 여부와 함께 각 유전자의 변이 수준을 측정하는 과정이다. Step b) is a process of measuring the mutation level of each gene together with the presence or absence of the biomarkers RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 in the biological sample.
상기 RHOA 유전자는 서열번호 1로 이루어진 염기서열 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 상기 CREBB 유전자는 서열번호 3으로 이루어진 염기서열 또는 서열번호 4로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 상기 KMT2D 유전자는 서열번호 5로 이루어진 염기서열 또는 서열번호 6으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 상기 TP53 유전자는 서열번호 7로 이루어진 염기서열 또는 서열번호 8로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 상기 IDH2 유전자는 서열번호 9로 이루어진 염기서열 또는 서열번호 10으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다.The RHOA gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The CREBB gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The KMT2D gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The TP53 gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The IDH2 gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 유전자의 변이는 단일 염기서열 변이, 1 ~ 50개의 뉴클레오티드의 염기서열 부위의 결실 또는 삽입, 및 복제수 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the gene mutation in step b) is one or more selected from the group consisting of single nucleotide sequence mutation, deletion or insertion of a nucleotide sequence of 1 to 50 nucleotides, and copy number mutation. can
본 발명에서 사용된 "변이"는 유전체에서 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 변경(alteration)을 의미한다. 상기 변이는 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 치환(substitution), 삽입(insertion), 결실(deletion) 등을 포함할 수 있다. 여기서, 치환은 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 다른 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산으로 바뀌는 변경을 의미한다. 삽입은 다른 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 추가되는 변경을 의미한다. 결실은 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 제거되는 변경을 의미한다.As used herein, “mutation” means an alteration of bases, nucleotides, polynucleotides or nucleic acids in a genome. The mutation may include substitution, insertion, or deletion of a base, nucleotide, polynucleotide, or nucleic acid. Here, substitution means a change in which a base, nucleotide, polynucleotide or nucleic acid is replaced with another base, nucleotide, polynucleotide or nucleic acid. An insertion is a change in which another base, nucleotide, polynucleotide or nucleic acid is added. Deletion refers to an alteration in which a base, nucleotide, polynucleotide or nucleic acid is removed.
상기 단일 염기서열 변이(single nucleotide variant, SNV)는 유전체 상에서 하나의 염기 또는 뉴클레오티드의 차이를 보이는 서열의 변경 또는 변이를 의미하며, 여러 사람의 유전체의 같은 위치에서 특정 염기 하나가 다른 염기로 변화되어 다른 형질로 표현되는 것을 의미하는 단일 염기서 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)과 혼용될 수 있다. The single nucleotide variant (SNV) refers to a change or mutation of a sequence showing a difference of one base or nucleotide on the genome, and one specific base is changed to another base at the same location in the genome of several people It can be used interchangeably with single nucleotide polymorphism (SNP), which means that it is expressed in other traits.
상기 1 ~ 50개의 염기서열 결실 또는 삽입은 유전체 상에서 1 ~ 50개 이상의 연속적 또는 비연속적 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 차이를 보이는 서열의 변경 또는 변이를 의미한다. The 1 to 50 nucleotide sequence deletion or insertion refers to a sequence change or mutation showing a difference of 1 to 50 or more consecutive or discontinuous bases, nucleotides, polynucleotides or nucleic acids on the genome.
이러한 염기서열 변이는 3개의 염기서열로 구성되는 하나의 아미노산에도 영향을 미칠 수 있으며, 염기 차이가 특정 질환에 대한 감수성, 질환의 발현 양상, 치료제 반응성 등 개인 간의 차이를 나타내는데 기여할 수 있다.Such nucleotide sequence variations can affect even one amino acid composed of three nucleotide sequences, and base differences can contribute to individual differences in susceptibility to specific diseases, disease expression patterns, and therapeutic response.
상기 복제수(copy number) 변이는 참조 서열(reference sequence)과 비교했을 때 반복되는 서열의 수 차이를 보이는 1kb 이상 길이의 변이 구간을 말하며, 복제수 차이로 인해 특정 질환에 대한 감수성, 질환의 발현 양상, 치료제 반응성 등 개인 간의 차이를 나타내는데 기여할 수 있다.The copy number mutation refers to a mutation section of 1 kb or more in length showing a difference in the number of repeated sequences when compared to a reference sequence, and susceptibility to a specific disease and expression of a disease due to the difference in copy number It can contribute to the expression of individual differences in aspects, treatment responsiveness, etc.
이러한 유전자의 변이 수준을 측정하기 위해서는 염기서열분석(sequencing) 또는 증폭 반응을 이용할 수 있다.In order to measure the mutation level of these genes, sequencing or amplification reactions can be used.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 유전자의 변이 수준은 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)을 이용하여 측정되는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the mutation level of the gene in step b) may be measured using next-generation sequencing (NGS).
상기 NGS는 수십만 개의 반응을 동시에 수행하는 다중화(multiplexing) 능력이 있으며, 적은 양의 샘플로도 시퀀싱이 가능하다. NGS는 상용화된 기술에 따라 구체적인 적용 기법이 다소 다르지만, 일반적으로 클론증폭(clonal amplification), 대량병렬 시퀀싱 및 Sanger 방법과 작용기전이 다른 새로운 염기서열결정법을 사용한다. 상용화 기술로는 2007년에 Roche가 출시한 454 GS 개량형 FLX model sequencer, 2006년에 Illumina가 출시한 Genome Analyzer HiSeq, 2007년에 Applied Biosystems가 출시한 SOLiD 등이 있다. 이러한 세 가지의 플랫폼은 공통적으로 복잡한 라이브러리 구축과 클로닝 과정을 버리고 클론증폭기술을 채택하였고, 한꺼번에 대량으로 처리할 수 있는 대량병렬방식(massively parallel sequencing) 기술을 택하였으며, 순환 시퀀싱(cyclic sequencing)을 통한 합성신호읽기(sequencing by synthesis)로 염기서열을 결정하여 번잡한 전기영동과정을 배제하였다. 또한 shotgun 방식을 사용하여 읽혀진 짧은 리드(read)를 컴퓨터로 배열하여 중복된 부분을 찾아 전체를 완성하는 알고리즘을 사용한다.The NGS has a multiplexing ability to simultaneously perform hundreds of thousands of reactions, and sequencing is possible even with a small amount of sample. NGS has slightly different specific application techniques depending on the commercialized technology, but in general, clonal amplification, massively parallel sequencing, and a new sequencing method with a different mechanism of action from the Sanger method are used. Commercialized technologies include the 454 GS improved FLX model sequencer released by Roche in 2007, Genome Analyzer HiSeq released by Illumina in 2006, and SOLiD released by Applied Biosystems in 2007. In common, these three platforms abandoned complex library construction and cloning processes and adopted clonal amplification technology, chose massively parallel sequencing technology that can process a large amount at once, and adopted cyclic sequencing. The nucleotide sequence was determined by sequencing by synthesis, thereby eliminating the cumbersome electrophoresis process. It also uses an algorithm that arranges the short reads read using the shotgun method into a computer to find overlapping parts and complete the whole.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.In addition, according to one embodiment of the present invention, the mutation levels of the RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 genes are polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, It may be measured by one or more methods selected from the group consisting of real-time RT-PCR, nuclease protection assay, in situ hybridization, DNA microarray, and Northern blot.
본 발명의 일 실시예에서는 말초 T세포 림프종 환자로부터 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준을 측정하기 위해 표적 심층 염기서열분석(targeted ultra-deep sequencing)을 실시하였고 해당 유전자의 염기서열 전체가 포함된 패널을 사용하였다. 전향 코호트 연구에 등록된 총 94명의 말초 T세포 림프종 환자 중 혈장에서 세포유리 DNA 돌연변이가 검출된 53명에 대해 돌연변이 프로파일을 분석한 결과, 말초 T세포 림프종 환자의 체세포 돌연변이 상위 5개 유전자로서 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2를 확인하였다.In one embodiment of the present invention, targeted ultra-deep sequencing was performed to measure the mutation levels of RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 genes from patients with peripheral T-cell lymphoma, and the nucleotide sequence of the gene All included panels were used. As a result of analyzing the mutation profile of 53 patients with cell-free DNA mutations detected in plasma among a total of 94 patients with peripheral T-cell lymphoma enrolled in the prospective cohort study, the top 5 genes with somatic mutations in patients with peripheral T-cell lymphoma were RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 were identified.
보다 구체적으로, RHOA의 변이는 주로 TFH 기원 림프종에서 아미노산 서열 (서열번호 2)의 17번째 잔기가 G에서 V로 치환되었으며, PTCL-NOS에서 아미노산 서열의 19번째 잔기가 T에서 I로 치환되었다.More specifically, the mutation of RHOA was mainly substituted from G to V at the 17th residue of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) in lymphoma originating from TFH, and substituted from T to I at the 19th residue of the amino acid sequence in PTCL-NOS.
CREBBP의 변이는 주로 아미노산 서열 (서열번호 4)의 2384번째 잔기가 치환, 예를 들면 H에서 T 또는 P로 치환되었으며, 일부에서는 아미노산 서열의 72번째 잔기가 E에서 G로, 238번째 잔기가 S에서 V로, 1118번째 잔기가 Q에서 종결 코돈(*)으로, 및 1894번째 잔기가 T에서 H로 치환되었다. AITL 환자에서는 화학요법 후 CREBBP p.S2382V 돌연변이가 증가하여 재발하였으며, ALK 양성 ALCL인 재발 환자에서는 CREBBP p.H2384P 돌연변이가 증가하면서 질병 진행을 보였다.The mutation of CREBBP is mainly a substitution of the 2384th residue of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4), for example, H to T or P substitution, and in some cases, the 72nd residue of the amino acid sequence from E to G and the 238th residue to S to V, the 1118th residue was substituted from Q to a stop codon (*), and the 1894th residue from T to H. In patients with AITL, CREBBP p.S2382V mutation increased and relapsed after chemotherapy, and in relapsed patients with ALK-positive ALCL, CREBBP p.H2384P mutation increased and disease progression was observed.
KM2TD의 변이는 전반적인 아미노산 서열에서 변이가 확인되었으며, 예를 들면 아미노산 서열 (서열번호 6)의 1712번째 잔기가 K에서 R로, 2120번째 잔기가 A에서 P로, 2215번째 잔기가 S에서 T로, 2466번째 잔기가 L에서 F 또는 C로, 2494번째 잔기가 F에서 S로, 2599번째 잔기가 P에서 A로, 2681번째 잔기가 R에서 Q로, 3099번째 잔기가 R에서 C로, 3435번째 잔기가 I에서 S로, 4341번째 잔기가 P에서 Q로, 4540번째 잔기가 R에서 W로, 및 4995번째 잔기가 T에서 I로 치환되었다. PTCL-NOS 환자에서는 화학요법 후 KM2TD p.R2681Q 및 p.R1524C 돌연변이가 제거되어 생존되었다.The mutation of KM2TD was confirmed in the overall amino acid sequence, for example, the 1712th residue of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) from K to R, the 2120th residue from A to P, and the 2215th residue from S to T ,
TP53의 변이는 전반적인 아미노산 서열에서 변이가 확인되었으며, 예를 들면 아미노산 서열 (서열번호 8)의 11번째 잔기가 E에서 Q로, 72번째 잔기가 P에서 R로, 126번째 잔기가 Y에서 C로, 134번째 잔기가 F에서 V로, 181번째 잔기가 R에서 C 또는 H로, 214번째 잔기가 H에서 R로, 224번째 잔기가 E에서 D로, 237번째 잔기가 M에서 I로, 241번째 잔기가 S에서 F로, 273번째 잔기가 R에서 C로, 및 287번째 잔기가 P에서 S로 치환되었다. PTCL-NOS 환자에서 화학요법 후 TP53 p.Y126C 돌연변이가 제거된 경우에는 생존한 반면, TP53 p.F134V 돌연변이가 다시 증가한 경우에는 재발하였다. 또한 AITL 재발 환자에서는 TP53 p.H214R 돌연변이가 증가하면서 질병 진행을 보였다.The mutation of TP53 was confirmed in the overall amino acid sequence, for example, the 11th residue of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) from E to Q, the 72nd residue from P to R, and the 126th residue from Y to C ,
IDH2의 변이는 주로 아미노산 서열 (서열번호 10)의 172번째 잔기가 치환, 예를 들면 R에서 K, G 또는 S로 치환되었으며, 146번째 잔기가 T에서 P로 치환된 경우도 확인되었다.Mutations in IDH2 were mainly substituted at the 172nd residue of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10), for example, substitution of K, G or S from R, and substitution of 146th residue from T to P was also confirmed.
이러한 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 아미노산 변이는 말초 T세포 림프종 환자에서 공통적으로 나타나며, 특히 CREBBP 유전자 또는 이의 변이는 이전 연구에서 말초 T세포 림프종과의 연관성에 관해 알려진 바가 없었다.Amino acid mutations in the RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53, and IDH2 genes are common in patients with peripheral T-cell lymphoma, and in particular, the CREBBP gene or its mutations have not been known to be associated with peripheral T-cell lymphoma in previous studies.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 말초 T세포 림프종 환자 중 세포유리 DNA 돌연변이가 검출된 경우에는 세포유리 DNA 돌여변이가 검출되지 않은 경우에 비해 무진행 생존율(PFS) 및 전체 생존율(OS)이 현저히 낮았다. 또한, 바이오마커로서 CREBBP 유전자만을 가진 경우에 비해 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 하나 이상의 유전자를 조합한 경우에서 생존율에 대한 예후 예측의 정확도가 증가하였다. 보다 구체적으로, 유전자의 조합에 따른 예후 예측 정확도를 비교하면, CREBBP 유전자 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 1개의 유전자를 조합한 경우에는 30 ~ 70% 수준으로, CREBBP 유전자 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 2개의 유전자를 조합한 경우에는 50 ~ 80% 수준으로, CREBBP 유전자 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 3개의 유전자를 조합한 경우에는 70 ~ 90% 수준으로, CREBBP, RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자를 모두 포함하는 경우에는 90% 이상이였다.According to one embodiment of the present invention, when a cell-free DNA mutation is detected among patients with peripheral T-cell lymphoma, the progression-free survival rate (PFS) and overall survival rate (OS) are significantly higher than those when the cell-free DNA mutation is not detected. It was low. In addition, the accuracy of predicting prognosis for survival rate increased in the case of combining one or more genes of RHOA, KMT2D, TP53, and IDH2 compared to the case of having only the CREBBP gene as a biomarker. More specifically, when comparing the prognosis prediction accuracy according to the combination of genes, the CREBBP gene and RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 were 30 to 70% when one gene was combined, and the CREBBP gene and RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 at a level of 50 to 80%, and at a level of 70 to 90% when combining the CREBBP gene and three genes among RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2, at a level of 70 to 90%, CREBBP, RHOA, KMT2D, In the case of including both TP53 and IDH2 genes, it was more than 90%.
상기 c) 단계는 생물학적 시료에서 측정된 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준을 해당 유전자에 대해 변이를 나타내지 않는 대조군과 비교하여 말초 T세포 림프종 환자의 생존 예후를 판단하는 과정이다.Step c) is a process of determining the survival prognosis of patients with peripheral T-cell lymphoma by comparing the mutation levels of RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53, and IDH2 genes measured in the biological sample with a control group that does not show mutations in the corresponding genes.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 대조군은 정상인 또는 말초 T세포 림프종 환자 중 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자에 대한 변이가 없는 개체인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the control group may be a normal person or an individual without mutations in the RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 genes among patients with peripheral T-cell lymphoma.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계는 측정된 CREBBP 유전자, 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 변이 수준이 대조군에 비해 증가한 경우, 말초 T세포 림프종 예후가 나쁜 것으로 판별하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, in step c), when the measured CREBBP gene and the mutation level of one or more genes selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 are increased compared to the control group, peripheral T-cell lymphoma It may be that the prognosis is determined to be poor.
본 발명의 다른 양상은 피험자의 CREBBP 유전자, 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자에 대한 서열 데이터를 입력받는 입력부; 및 상기 유전자에 대한 서열 데이터를 기반으로 각 유전자의 변이 수준을 측정하여 상기 피험자의 말초 T세포 림프종 예후를 수행하는 분석부를 포함하는 말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템을 제공한다.Another aspect of the present invention is an input unit for receiving sequence data for a subject's CREBBP gene, and one or more genes selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2; and an analyzer configured to perform a prognosis of peripheral T-cell lymphoma of the subject by measuring a mutation level of each gene based on the sequence data of the gene.
여기서 전술한 내용과 공통된 내용에 대하 설명은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Here, the description of the contents common to the foregoing is omitted in order to avoid excessive complexity.
상기 입력부는 피험자에 대한 데이터를 제공하는 장치에 해당하는 것으로, 피험자의 각 유전자에 대한 전체 염기서열 또는 아미노산 서열을 분석부에 전달한다The input unit corresponds to a device that provides data on the subject, and transmits the entire nucleotide sequence or amino acid sequence of each gene of the subject to the analysis unit.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 유전자에 대한 서열 데이터는 차세대 염기서열분석(NGS)에서 얻은 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, sequence data for the gene may be obtained from next-generation sequencing (NGS).
상기 분석부는 서열 데이터를 기반으로 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준을 측정하고, 기존에 마련된 알고리즘을 통해 말초 T세포 림프종 예후를 예측한다.The analysis unit measures the mutation levels of the RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 genes based on the sequence data, and predicts the prognosis of peripheral T-cell lymphoma through a previously prepared algorithm.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 분석부는 변이된 CREBBP 유전자와 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 조합에 따른 말초 T세포 림프종 예후의 정확도를 산출하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the analysis unit may calculate the accuracy of peripheral T-cell lymphoma prognosis according to a combination of the mutated CREBBP gene and one or more genes selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 .
이러한 입력부 및 분석부를 포함하는 말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템은 예후에 대한 정보를 일정한 형태로 출력할 수 있는 표시부를 더 포함할 수 있다.The peripheral T-cell lymphoma prognosis prediction system including the input unit and the analysis unit may further include a display unit capable of outputting information on the prognosis in a certain form.
또한, 이러한 입력부 및 분석부를 포함하는 말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템은 말초 T세포 림프종 예후를 예측하는 컴퓨터 장치로 구현될 수 있다.In addition, the system for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma including the input unit and the analysis unit may be implemented as a computer device for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma.
본 발명의 다른 양상은 CREBBP 유전자, 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 변이 수준을 측정하는 제제를 포함하는 말초 T세포 림프종 예후 예측용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma comprising an agent for measuring the mutation level of the CREBBP gene and one or more genes selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2.
여기서 전술한 내용과 공통된 내용에 대하 설명은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Here, the description of the contents common to the foregoing is omitted in order to avoid excessive complexity.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 말초 T세포 림프종은 분류 불가능한 말초 T세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS), 혈관면역모구 T세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL), 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL), T 여포 보조 세포(T follicular helper cell, TFH) 표현형(phenotype)을 가진 결절 말초 T세포 림프종(nodal peripheral T-cell lymphoma, PTFH), 여포 T세포 림프종(follicular T-cell lymphoma, FTCL), 단형성 상피 장 T세포 림프종(monomorphic epitheliotropic intestinal T-cell lymphoma, MEITL), 피하 지방층염 유사 T세포 림프종(subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma, SPTCL) 및 변형 근상식육종(transformed mycosis fungoides, transformed MF)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the peripheral T-cell lymphoma is unclassifiable peripheral T-cell lymphoma (not otherwise specified, PTCL-NOS), angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), nodal peripheral T-cell lymphoma (PTFH) with T follicular helper cell (TFH) phenotype , follicular T-cell lymphoma (FTCL), monomorphic epitheliotropic intestinal T-cell lymphoma (MEITL), subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma , SPTCL) and transformed mycosis fungoides (transformed MF).
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 유전자의 변이는 단일 염기서열 변이, 1 ~ 50개의 염기서열 결실 또는 삽입, 및 복제수 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the mutation of the gene may be at least one selected from the group consisting of single nucleotide sequence mutation, 1 to 50 nucleotide sequence deletion or insertion, and copy number mutation.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 각 유전자에 특이적으로 결합하여 유전자 또는 그의 변이 여부 및 발현 수준을 측정할 수 있는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the agent may specifically bind to each gene to measure the gene or its mutation and its expression level.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the agent may include one or more selected from the group consisting of primers, probes, antibodies, aptamers, oligopeptides, and PNAs.
보다 구체적으로, 상기 제제는 각 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것이 바람직하다.More specifically, the agent is preferably a primer or probe that specifically binds to each gene.
본 발명에서 사용된 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.As used herein, “specifically binding” means that the binding ability to a target substance is superior to other substances to the extent that the presence or absence of the target substance can be detected by binding.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만, 전형적으로 15 ~ 30 뉴클레오티드로 구성된다.As used herein, "primer" refers to a primer capable of acting as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., four different nucleoside triphosphates and polymerases) at a suitable temperature and buffer. It refers to a single stranded oligonucleotide. The suitable length of a primer varies depending on various factors, such as temperature and use of the primer, but typically consists of 15 to 30 nucleotides.
본 발명에서 사용된 "프로브(probe)"는 자연의 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.As used herein, “probe” refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, comprising deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and specifically hybridizing to a target nucleotide sequence It can exist naturally, or it can be artificially synthesized.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 말초 T세포 림프종 예후 예측용 키트를 제공한다.In addition, one aspect of the present invention provides a kit for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma comprising the composition.
본 발명에서 사용된 "말초 T세포 림프종 예후 예측용 키트"는 검사 대상자 또는 말초 T세포 림프종 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 통해 향후 생존 예후가 좋을지 여부를 예측할 수 있는 물질을 의미하며, 이를 통해 검사 대상자의 생존 예후를 신속, 정확하고 간편하게 진단할 수 있다. 본 발명에서는 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준을 측정하는 제제를 포함한다.The "kit for predicting prognosis of peripheral T-cell lymphoma" used in the present invention refers to a substance that can predict whether or not a future survival prognosis will be good through a biological sample collected from a test subject or a patient with peripheral T-cell lymphoma. The prognosis of survival can be diagnosed quickly, accurately and simply. In the present invention, an agent for measuring the mutation level of RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 and IDH2 genes is included.
상기 키트는 통상적인 유전자 정량 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함할 수 있다.The kit may include, without limitation, a diagnostic kit based on conventional genetic quantitative analysis.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 PCR 키트, RT-PCR 키트 및 DNA 칩 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the kit may be at least one selected from the group consisting of a PCR kit, an RT-PCR kit, and a DNA chip kit.
예를 들면, 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.For example, when the kit is applied to a PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally include reagents necessary for PCR amplification, such as a buffer, DNA polymerase, DNA polymerase cofactor, and dNTPs, When the kit is applied to an immunoassay, the kit of the present invention may optionally include a substrate of a secondary antibody and a label. In addition, the kit according to the present invention may be manufactured in a plurality of separate packaging or compartments including the reagent components described above, and the kit of the present invention may be a diagnostic kit including essential elements necessary for performing a DNA chip. there is. A DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and reagents, reagents, enzymes, and the like for producing a fluorescently labeled probe. In addition, the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.
본 발명에서는 말초 T세포 림프종 예후를 예측할 수 있는 신규 바이오마커의 조합을 제시함으로써 말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템, 조성물 및 키트를 제공하여 비침습적이며 신속, 정확하고 간편하게 말초 T세포 림프종 예후를 판별할 수 있다.The present invention provides a prognostic system, composition, and kit for peripheral T-cell lymphoma prognosis by presenting a combination of novel biomarkers capable of predicting peripheral T-cell lymphoma prognosis, which can non-invasively, quickly, accurately, and conveniently discriminate peripheral T-cell lymphoma prognosis. can
도 1은 전향 코호트의 기준 시료에서 얻은 말초 T세포 림프종 환자 53명의 혈장 세포유리 DNA의 돌연변이 프로파일을 나타낸 것이다. RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2의 체세포 돌연변이는 다양한 아형에서 가장 흔하게 발견되며, 붉은색 상자는 각 유전자에서 돌연변이가 검출된 것을 나타낸다.
도 2는 가장 흔한 세포유리 DNA 돌연변이의 돌연변이 부위를 나타낸 것이다. 대부분은 p.Gly17Val를 암호화하는 RHOA 돌연변이를 포함하며, IDH2 돌연변이는 잔기 R172에 주로 영향을 미친다. CREBBP의 우성돌연변이는 p.His2384Thr를 포함한 2384 위치에 존재하며, TP53 및 KM2TD의 돌연변이 부위는 겹치지 않는다.
도 3은 혈장 세포유리 DNA 돌연변이와 종양 조직 DNA 돌연변이를 비교한 것이다. 21개의 사례를 이용한 쌍 분석(paired analysis)에서는 혈장 세포유리 DNA와 종양 조직의 체세포 돌연변이가 일치한 것을 보여준다.
도 4는 혈장 세포유리 DNA 돌연변이의 종단 분석은 치료 결과와의 상관관계를 보여준다. (A) PTCL-NOS인 61세 남성은 TP53 돌연변이가 사라지면서 완전 반응을 유지한다. (B) PTCL-NOS인 65세 여성은 치료 말기에 TP53 돌연변이가 증가하는 것을 보이며 결국 재발하였다. (C) PTCL-NOS인 59세 남성은 EZH2를 포함한 초기에 검출된 돌연변이가 감소하면서 완전 반응을 유지한다. (D) AITL인 58세 남성은 ASCT 후 CREBBP 및 MEF2B 돌연변이가 증가하여 추적기간 동안 재발하였다. (E) 재발된 AITL인 50세 남성은 질병 진행 중에 구제 치료 후 TP53 및 SOCS1 돌연변이가 증가하였다. (F) ALK 양성 ALCL인 34세 여성은 구제 치료 후 CREBBP 및 STAT6 돌연변이가 증가하였다.
도 5는 체세포 돌연변이를 포함하는 혈장 세포유리 DNA의 모니터링에서 질병 재발 또는 진행 중에 새로운 체세포 돌연변이가 출현한 것을 나타낸다. (A) ALK 음성 ALCL인 56세 남성은 브렌투시맙 베도틴(brentuximab vedotin)으로 구체 치료한 후에도 질병 진행 시 CREBBP, SOCS1, MAPK1 및 MAP2K1 돌연변이가 증가하는 반면 (상단), KMT2D 및 BRAF 돌연변이는 돌연변이 부위에 따라 다양한 패턴을 보여준다 (중간). KRAS 및 PIK3CA의 돌연변이가 감소하는 것과 반대로 PIM1, MTOR 및 CARD11 돌연변이는 새로운 돌연변이의 출현을 반영하여 질병이 진행됨에 따라 증가한다 (하단). (B) 완전 반응 시 CREBBP, KMT2D, GATA3 및 MEF2B와 같은 복수 유전자에서 돌연변이 부피가 상승하는 PTCL-NOS를 가진 57세 남성은 마침내 ASCT 후에도 돌연변이가 더 증가하면서 질병 재발하는 것을 보여준다 (상단 및 중간). 재발한 환자에서는 BRAF 및 IRK1과 같은 새로운 돌연변이가 나타난다 (하단). (C) 코판리십(copanlisib) 및 젬시타빈(gemcitabine)과 병합 치료를 받은 PTCL-NOS인 48세 남성은 CREBBP, MEF2B, MAPK3, KRAS, STAT3 및 STAT6를 포함한 다발성 돌연변이를 보인다.
도 6은 혈장 세포유리 DNA 기반 생존 결과 예측을 나타낸다. (A, B) 세포유리 DNA의 돌연변이가 검출된 환자는 돌연변이 미검출 환자보다 무진행 생존율 및 전체 생존율이 더 나쁘다. (C, D) 치료 종료 시 돌연변이 부피가 감소된 환자 (GE의 로그 변화 ≥ 1.5)는 돌연변이 부피가 증가된 환자 (GE의 로그 변화 < 0) 또는 약간 감소된 환자 (GE의 로그 변화 < 1.5)보다 무진행 생존율 및 전체 생존율이 더 양호하다.
도 7은 말초 T세포 림프종 예후 예측용 바이오마커 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2의 조합에 따른 예후 예측 정확도를 나타낸 그래프이다 (R; RHOA, C; CREBB, K; KMT2D, T; TP53 및 I;IDH2).Figure 1 shows the mutation profile of plasma cell-free DNA of 53 patients with peripheral T-cell lymphoma obtained from a reference sample from a prospective cohort. Somatic mutations of RHOA , CREBBP , KMT2D , TP53 and IDH2 are most commonly found in various subtypes, and the red boxes indicate mutations detected in each gene.
Figure 2 shows the mutation site of the most common cell-free DNA mutation. Most contain a RHOA mutation encoding p.Gly17Val, while the IDH2 mutation primarily affects residue R172. The dominant mutation of CREBBP exists at
Figure 3 compares plasma cell-free DNA mutations and tumor tissue DNA mutations. A paired analysis using 21 cases showed concordance between plasma cell-free DNA and tumor tissue somatic mutations.
Figure 4 shows the correlation of longitudinal analysis of plasma cell-free DNA mutations with treatment outcomes. (A) A 61-year-old male with PTCL-NOS maintains a full response as the TP53 mutation disappears. (B) A 65-year-old woman with PTCL-NOS showed an increase in TP53 mutations at the end of treatment and eventually relapsed. (C) A 59-year-old male with PTCL-NOS maintains a complete response with a decrease in initially detected mutations including EZH2 . (D) In a 58-year-old male with AITL, CREBBP and MEF2B mutations increased after ASCT and recurred during the follow-up period. (E) A 50-year-old male with relapsed AITL had increased TP53 and SOCS1 mutations after rescue treatment during disease progression. (F) A 34-year-old woman with ALK-positive ALCL had increased CREBBP and STAT6 mutations after rescue treatment.
Figure 5 shows the emergence of new somatic mutations during disease relapse or progression in the monitoring of plasma cell-free DNA containing somatic mutations. (A) In a 56-year-old male with ALK-negative ALCL, CREBBP , SOCS1 , MAPK1 , and MAP2K1 mutations increased during disease progression even after specific treatment with brentuximab vedotin (top), whereas KMT2D and BRAF mutations Various patterns are shown depending on the mutation site (middle). Mutations in PIM1 , MTOR and CARD11 increase as the disease progresses, reflecting the emergence of new mutations, whereas mutations in KRAS and PIK3CA decrease (bottom). (B) A 57-year-old male with PTCL-NOS with elevated mutation volume in multiple genes, such as CREBBP , KMT2D , GATA3 and MEF2B upon complete response, finally shows disease relapse with a further increase in mutations after ASCT (upper and middle) . In relapsed patients, new mutations such as BRAF and IRK1 appear (bottom). (C) A 48-year-old male with PTCL-NOS treated in combination with copanlisib and gemcitabine has multiple mutations including CREBBP , MEF2B , MAPK3 , KRAS , STAT3 and STAT6 .
Figure 6 shows the prediction of survival outcome based on plasma cell-free DNA. (A, B) Patients with detected mutations in cell-free DNA have poorer progression-free and overall survival rates than patients with undetected mutations. (C, D) Patients with reduced mutation volume (log change in GE ≥ 1.5) at the end of treatment were compared with patients with increased mutation volume (log change in GE < 0) or patients with a slight decrease (log change in GE < 1.5). Progression-free survival and overall survival are better.
Figure 7 is a graph showing the prognosis prediction accuracy according to the combination of biomarkers RHOA , CREBBP , KMT2D , TP53 and IDH2 for predicting prognosis of peripheral T-cell lymphoma (R; RHOA, C; CREBB, K; KMT2D, T; TP53 and I ;IDH2).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail. However, these descriptions are merely presented as examples to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these exemplary descriptions.
1. 재료 및 방법1. Materials and Methods
1-1. 환자1-1. patient
결절외(extranodal) NK/T세포 림프종을 제외한 PTCL 환자에 대한 바이오마커로서 ctDNA 유전자형분석(genotyping) 및 모니터링의 유용성 탐구를 목적으로 수행하였다.It was performed for the purpose of exploring the usefulness of ctDNA genotyping and monitoring as a biomarker for PTCL patients excluding extranodal NK/T-cell lymphoma.
모든 환자는 삼성서울병원의 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board of the Samsung Medical Center) (승인번호 2016-11-040)에 의해 승인된 림프종에 대한 전향 코호트 연구(prospective cohort study) (NCT03117036)에 등록되었다. 승인된 지침에 따라, 병원에 입원한 환자의 서면 사전 동의를 얻은 후 -80℃에서 생식세포(germline) DNA와 혈장 세포유리(cell-free) DNA를 수집 및 저장하였다. 혈장 시료는 전향 코호트 등록 시 (기준), 중간 평가 시 (중간), 1차 치료 후 최종 반응 평가 시 (치료 종료) 및/또는 재발 또는 진행 시 (진행) 수집되었다. 임상 실무 중 병기 분류 작업에는 컴퓨터 단층촬영(CT), 18F-플루오르데독시글루코스(fluorodeoxyglucose) 양전자 방출 단층촬영/컴퓨팅 단층 촬영(PET/CT) 및 골수 생검이 포함되었다. 종양 병리학은 두 명의 림프종 병리학자 (K.Y.H. 및 C.H.)에 의해 확인되었다. 새로 진단받은 환자는 CHOP과 같은 1차 치료를 받았고, 재발 또는 치료저항성(refractory) 환자는 구제 치료를 받았다. 반응 평가는 Lugano Classification에 따른 CT 및 PET/CT를 사용하여 수행되었다 (Cheson BD, et al. J Clin Oncol. 2014;32(27):3059-3068). 계획된 치료 완료 후 3 ~ 6개월마다 환자를 추적하였으며, CT와 PET/CT 스캔으로 재발 또는 질병 진행의 발생을 확인하였다. 등록된 모든 환자의 생존 상태가 정기적으로 업데이트되었고, 생존 및 질병 상태에 대한 마지막 업데이트는 2021년 5월에 완료되었다.All patients were enrolled in a prospective cohort study for lymphoma (NCT03117036) approved by the Institutional Review Board of the Samsung Medical Center (approval number 2016-11-040). It became. Germline DNA and plasma cell-free DNA were collected and stored at -80 °C after obtaining written informed consent from patients admitted to the hospital according to approved guidelines. Plasma samples were collected at prospective cohort enrollment (baseline), at interim assessment (interim), at final response assessment after first-line treatment (end of treatment), and/or at relapse or progression (progression). Staging work during clinical practice included computed tomography (CT), 18 F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography (PET/CT), and bone marrow biopsy. Tumor pathology was confirmed by two lymphoma pathologists (KYH and CH). Newly diagnosed patients received primary treatment such as CHOP, and relapsed or refractory patients received salvage treatment. Response evaluation was performed using CT and PET/CT according to the Lugano Classification (Cheson BD, et al. J Clin Oncol. 2014;32(27):3059-3068). Patients were followed up every 3 to 6 months after completion of the planned treatment, and CT and PET/CT scans were used to confirm the occurrence of recurrence or disease progression. The survival status of all enrolled patients was updated regularly, and the last update on survival and disease status was done in May 2021.
1-2. 시료 준비1-2. sample preparation
진단 및 치료 반응 평가를 위해 검사 당시 T세포 림프종 환자 94명을 대상으로 총 206개의 말초혈액 시료를 확보하였다. 조직 시료 (n = 19)는 포르말린으로 고정된 파라핀 포매 조직에서 얻었다. 전혈 시료는 Cell-Free DNA™ BCT 튜브 (Streck Inc., 미국)에 수집되었다. 혈장은 상온에서 원심력을 높이는 3단계 원심분리 (840 xg에서 10분, 1,040 xg에서 10분 및 5,000 xg에서 10분)를 사용하여 준비되었다. 말초혈액 백혈구(Peripheral blood leukocyte, PBL)는 초기 원심분리로부터 수집되었다. 초기 원심분리에서 혈장을 분리한 후 Ficoll 구배 원심분리로 분리하고 적혈구 용해 완충액(lysis buffer) (Qiagen, 미국)을 사용하여 침전된 림프구로부터 과립구(granulocyte)를 분리하였다. 또한 비교를 위해, 삼성서울병원 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인 (SMC 2016-04-107)을 얻어 남성 16명과 여성 10명 (중위 연령: 38세, 범위: 25 ~ 50세)으로 구성된 26명의 건강한 지원자로 구성된 대조군(control group)으로부터 혈장 시료를 수집하였다. A total of 206 peripheral blood samples were obtained from 94 patients with T-cell lymphoma at the time of examination for diagnosis and evaluation of treatment response. Tissue samples (n = 19) were obtained from paraffin-embedded tissues fixed in formalin. Whole blood samples were collected in Cell-Free DNA™ BCT tubes (Streck Inc., USA). Plasma was prepared using a three-step centrifugation at room temperature with increasing centrifugal force (840 xg for 10 min, 1,040 xg for 10 min, and 5,000 xg for 10 min). Peripheral blood leukocyte (PBL) was collected from initial centrifugation. Plasma was separated in the initial centrifugation, followed by Ficoll gradient centrifugation, and granulocytes were separated from precipitated lymphocytes using lysis buffer (Qiagen, USA). Also, for comparison, 16 males and 10 females (median age: 38 years old, range: 25-50 years old) were selected with the approval (SMC 2016-04-107) of the Institutional Review Board of Samsung Medical Center. Plasma samples were collected from a control group consisting of 26 healthy volunteers.
1-2-1. DNA 추출1-2-1. DNA extraction
순환(Circulating) DNA는 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, 미국)를 사용하여 혈장에서 추출되었다. 포르말린으로 고정된 파라핀 포매 조직으로부터 gDNA를 정제하기 위해 AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen)가 사용되었다. DNA 농도 및 순도는 Nanodrop 8000 UV-Vis spectrometer (Thermo Fisher Scientific, 미국)와 Qubit 2.0 fluorometer (Thermo Fisher Scientific, 미국)에서 피코그린 형광 분석(Picogreen fluorescence assay)을 사용하여 정량화되었다. 단편 크기 분포는 2200 TapeStation Instrument (Agilent Technologies, 미국)를 사용하여 측정되었다.Circulating DNA was extracted from plasma using the QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, USA). An AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen) was used to purify gDNA from paraffin-embedded tissues fixed in formalin. DNA concentration and purity were quantified using a Picogreen fluorescence assay on a Nanodrop 8000 UV-Vis spectrometer (Thermo Fisher Scientific, USA) and a Qubit 2.0 fluorometer (Thermo Fisher Scientific, USA). Fragment size distribution was measured using a 2200 TapeStation Instrument (Agilent Technologies, USA).
1-2-2. 라이브러리 제작1-2-2. library creation
정제된 gDNA는 Covaris S2 (Covaris Inc., 미국)를 사용하여 150 ~ 200 bp 단편으로 초음파처리되었다. 진단을 위해 이전에 획득한 조직 시료를 사용하여 참조 라이브러리(reference library)를 제작하고 표적 시퀀싱하였다. 종양 생검 시료에 대한 라이브러리는 제조사의 지침에 따라 SureSelect XT reagent kit인 HSQ (Agilent Technologies)를 사용하여 구축되었다. gDNA 및 세포유리 DNA 라이브러리는 KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, 미국)를 사용하여 생성되었다.The purified gDNA was sonicated into 150-200 bp fragments using Covaris S2 (Covaris Inc., USA). For diagnosis, a reference library was constructed using previously obtained tissue samples and subjected to targeted sequencing. Libraries for tumor biopsy samples were constructed using the SureSelect XT reagent kit, HSQ (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions. gDNA and cell-free DNA libraries were generated using the KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, USA).
1-3. 표적 심층 시퀀싱(Ultra-deep targeted sequencing) 및 데이터 처리1-3. Ultra-deep targeted sequencing and data processing
하이브리드 선택(Hybrid selection)은 426개의 림프종 관련 유전자를 대상으로 맞춤형 프로브(probe)를 사용하여 수행되었다. 또한, 426개의 유전자 패널에서 선택한 유전자 66개에 대한 캡쳐 프로브(capture probe)를 자체 제작하여 세포유리 DNA 시퀀싱에 사용하고 정상 시료와 매칭(matching)한 후 HiSeq 2500 system (Illumina, 미국)에서 분석하였다. 모든 시퀀싱 데이터(sequencing data)는 BWA-mem (v0.7.17; Wellcome Trust Sanger Institute, 영국) 알고리즘을 사용하여 hg19 reference 에 정렬되었다. SAMTOOLS 소프트웨어 (v1.9; Wellcome Trust Sanger Institute)를 사용하여 SAM(sequence alignment map) 형식을 BAM(binary alignment map) 파일로 변환하였다. Picard 패키지 (v2.19.1; Broad Institute, 영국)의 MarkDuplicates 소프트웨어를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 복제물(duplicate)을 식별하였다. Home-built Python (v3.6.4) 스크립트를 사용하여 IDE(integrated design environment) 방법을 시행하고 복제물 리드(read)를 처리하였다 (Newman AM, et al. Nat Biotechnol. 2016;34(5):547-555). 기본 품질 재교정(recalibration)과 SAM 및 BAM 파일 분류에 GATK (v4.1.0.0), Picard (v2.19.1) 및 SAMTOOLS (v1.9)을 사용하였다. 필터링 단계 및 시퀀싱 매트릭스(sequencing metrics)는 다음과 같은 방법으로 수행되었다. ctDNA 수준은 총 세포유리 DNA 농도의 산물로 결정된 유전체 당량(genome equivalent, GE)과 체세포 돌연변이(somatic mutation)의 최대 변이 대립유전자 빈도(variant allele frequency, VAF)로 정량화되었다.Hybrid selection was performed using custom probes for 426 lymphoma-related genes. In addition, capture probes for 66 genes selected from the 426 gene panel were prepared in-house, used for cell-free DNA sequencing, matched with normal samples, and analyzed on the HiSeq 2500 system (Illumina, USA). . All sequencing data were aligned to the hg19 reference using the BWA-mem (v0.7.17; Wellcome Trust Sanger Institute, UK) algorithm. The SAM (sequence alignment map) format was converted to a BAM (binary alignment map) file using SAMTOOLS software (v1.9; Wellcome Trust Sanger Institute). Polymerase chain reaction (PCR) duplicates were identified using the MarkDuplicates software from the Picard package (v2.19.1; Broad Institute, UK). A home-built Python (v3.6.4) script was used to implement the integrated design environment (IDE) method and process duplicate reads (Newman AM, et al. Nat Biotechnol. 2016;34(5):547- 555). GATK (v4.1.0.0), Picard (v2.19.1) and SAMTOOLS (v1.9) were used for basic quality recalibration and classification of SAM and BAM files. The filtering step and sequencing metrics were performed in the following way. ctDNA levels were quantified by genome equivalent (GE) determined as the product of total cell-free DNA concentration and maximum variant allele frequency (VAF) of somatic mutations.
1-3-1. 시퀀싱 데이터 처리1-3-1. Sequencing data processing
기본 재교정 프로세스는 GATK 소프트웨어의 BaseRecalibrator 및 ApplyBQSR 함수를 사용하여 수행되었다. Picard는 PCR 복제물의 각 그룹에서 고유 식별자(unique identifier, UID) 패밀리를 식별하는데 사용되었다. UID 패밀리를 파악한 후 중복 리드를 처리하기 위해 내부(in-house) built Python (v. 2.7.9; Python Software Foundation, 미국) 스크립트를 적용하였다. Newman 등이 설명한 iDES(integrated digital error suppression) 방법을 수정하고 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)의 민감한 검출을 위한 분자 바코딩 전략(molecular barcoding strategy)으로 정형화된 배경 오차(stereotypical background error)의 in silico 제거로 결합된 방법을 수행하기 위한 스크립트를 만들었다 (Vose J, et al. J Clin Oncol. 2008;26(25):4124-4130). 매치된 백혈구의 평행 시퀀싱(parallel sequencing)은 클론 조혈(clonal hematopoiesis)과 관련된 돌연변이를 배제하고 적절한 변이 호출을 가능하게 하기 위해 수행되었다. 처리하는 동안 불일치 쌍과 대상에서 벗어난(off-target) 리드가 필터링되었다.The basic recalibration process was performed using the BaseRecalibrator and ApplyBQSR functions in GATK software. Picard was used to identify a unique identifier (UID) family in each group of PCR replicates. After identifying the UID family, an in-house built Python (v. 2.7.9; Python Software Foundation, USA) script was applied to handle duplicate leads. A modification of the integrated digital error suppression (iDES) method described by Newman et al. and a molecular barcoding strategy for the sensitive detection of circulating tumor DNA (ctDNA) to reduce stereotypical background error. A script was created to perform the combined method with in silico removal (Vose J, et al. J Clin Oncol. 2008;26(25):4124-4130). Parallel sequencing of matched leukocytes was performed to exclude mutations associated with clonal hematopoiesis and to allow for proper mutation calling. During processing, discordant pairs and off-target reads were filtered out.
1-3-2. 체세포 돌연변이의 검출1-3-2. Detection of somatic mutations
체세포 돌연변이는 표적 심층 시퀀싱 방법으로 식별되었다. 분석 전에 낮은 품질 점수를 가진 염기서열을 제거하고 시퀀싱 심부(depth)가 500x 이상인 위치만 변이 검출에 사용하였다. 사소한 수정으로 시퀀싱 배경 오차를 최소화하기 위해 디지털 오류 억제 방법을 사용하여 체세포 돌연변이를 식별하였다 (Vose J, et al. J Clin Oncol. 2008;26(25):4124-4130). 체세포 돌연변이를 식별하기 위한 자세한 프로세스는 (Briski R, et al. Blood Cancer J. 2014;4:e214)를 참고하였다. 간략하게는, 모든 환자의 PBL gDNA를 일치된 정상 시료로 사용하여 환자 고유의 생식세포(germline) 돌연변이를 제거하였다. 배경 노이즈에서 낮은 변이 대립유전자 빈도(VAF) 돌연변이를 구별하고 거짓 긍정(false positive)을 제거하기 위해, 일치된 정상 시료에서 생성된 오차 분포를 사용하였다. 변이에는 그 효과에 대한 주석을 달았고 동의돌연변이(synonymous mutation)는 분석에서 제외되었다. VAF가 0.15% 이상인 돌연변이를 선택하여 분석에 사용하였다. 정상 시료의 해당 배경 오차보다 유의하게 높은 빈도로 존재하는 변이를 식별하기 위해 Z 검정(Z-test)을 수행하였다 (Bonferroni 보정 p 값 < 0.05). 또한, 대립유전자 빈도 ≥ 0.5% 및 대체 대립유전자 수 ≥ 20인 임계값을 적용하였다. 생검 검체의 경우, 총 심부 ≥ 100x, 대립유전자 빈도 ≥ 2% 및 대체 대립유전자 수 ≥ 10인 다양한 임계값으로 단일 뉴클레오티드 변이(SNV) 프로파일링을 수행하였다. Indel (뉴클레오티드의 삽입(insertion) 및 결실(insertion)을 의미함)는 Somatic Strelka2 및 기본 매개변수를 사용한 MANTA를 사용하여 모든 시료에서 호출되었다 (Ellin F, et al. Blood. 2014;124(10):1570-1577; Phan A, et al. Curr Hematol Malig Rep. 2016;11(6):492-503). Strelka2에서 필터를 통과한 변이들은 추가로 검토되었다.Somatic mutations were identified with a targeted deep sequencing method. Prior to analysis, base sequences with low quality scores were removed, and only positions with a sequencing depth of 500x or higher were used for mutation detection. Somatic mutations were identified using a digital error suppression method to minimize sequencing background errors with minor corrections (Vose J, et al. J Clin Oncol. 2008;26(25):4124-4130). For a detailed process for identifying somatic mutations, refer to (Briski R, et al. Blood Cancer J. 2014;4:e214). Briefly, the PBL gDNA of all patients was used as a matched normal sample to remove patient-specific germline mutations. Error distributions generated from matched normal samples were used to discriminate low variant allele frequency (VAF) mutations from background noise and eliminate false positives. Mutations were annotated for their effect and synonymous mutations were excluded from analysis. Mutants with a VAF of 0.15% or more were selected and used for analysis. A Z-test was performed to identify variants present at significantly higher frequencies than the corresponding background error in normal samples (Bonferroni corrected p value < 0.05). In addition, a threshold of allele frequency ≥ 0.5% and alternative allele number ≥ 20 was applied. For biopsy specimens, single nucleotide variation (SNV) profiling was performed with various thresholds of total core ≥ 100x, allele frequency ≥ 2% and number of alternative alleles ≥ 10. Indels (meaning insertions and deletions of nucleotides) were called in all samples using Somatic Strelka2 and MANTA with default parameters (Ellin F, et al. Blood. 2014;124(10) :1570-1577;Phan A, et al. Curr Hematol Malig Rep. 2016;11(6):492-503). Variants that passed the filter in Strelka2 were further reviewed.
1-4. 통계 분석1-4. statistical analysis
기술 통계량(Descriptive statistic)은 비율과 중간값으로 결정되었고 범주형 변수에 대한 그룹 간 비교는 Fisher's exact test를 통해 평가되었다. 세포유리 DNA 농도의 차이는 Wilcoxon rank sum test에 의해 비교되었다. 무진행 생존율(Progression-free survival, PFS)은 등록일로부터 질병 재발, 또는 어떤 원인으로 인한 진행 또는 사망으로 지정된 PFS의 날짜까지의 기간으로 계산되었다. 전체 생존율(Overall survival, OS)은 등록일로부터 사망할 때까지 또는 후속 조치의 마지막 날짜까지의 기간으로 정의되었다. 생존 곡선은 Kaplan-Meier estimate를 사용하여 설명하고 로그 순위 검정(log-rank test)을 사용하여 그룹 간에 비교하였다. 통계 분석은 IBM PASW version 24.0 소프트웨어 프로그램 (IBM SPSS Inc., 미국)을 사용하여 수행되었다.Descriptive statistics were determined as proportions and medians, and comparisons between groups for categorical variables were assessed using Fisher's exact test. Differences in cell-free DNA concentration were compared by the Wilcoxon rank sum test. Progression-free survival (PFS) was calculated as the period from the date of enrollment to the date of PFS designated as disease recurrence, or progression or death from any cause. Overall survival (OS) was defined as the period from the date of enrollment until death or the last date of follow-up. Survival curves were described using the Kaplan-Meier estimate and compared between groups using the log-rank test. Statistical analysis was performed using the IBM PASW version 24.0 software program (IBM SPSS Inc., USA).
2. 결과2. Results
2-1. 환자2-1. patient
말초혈액(Peripheral blood) 시료는 2017년 3월과 2019년 11월 사이에 진행된 전향 코호트 연구에 연속적으로 등록된 말초 T세포 림프종(PTCL) 환자 94명으로부터 얻었다. 하기 표 1를 참고하면, 신규 진단/1차 치료 환자 73명과 등록 당시 재발되거나 치료저항성을 가진 환자 21명이었으며, 환자의 평균 연령은 58세 (범위: 19 ~ 82세) 였다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO) 분류에 따르면, 39명의 환자는 혈관면역모구 T세포 림프종(AITL) (n = 31), 여포 T세포 림프종(FTCL) (n = 4) 및 TFH 표현형을 가진 결절 말초 T세포 림프종(PTFH) (n = 4)을 포함한 TFH 기원의 결절 림프종이었다. FTCL과 PTFH를 제외한 33명의 환자는 분류 불가능한 말초 T세포 림프종(PTCL-NOS)이었다. 역형성 큰세포 림프종(ALCL) 환자 14명에는 전신 ALK 음성 ALCL (n = 6), 전신 ALK 양성 ALCL (n = 5) 및 피부 ALK 음성 ALCL (n = 3) 환자가 포함되었다. 그 밖의 질병 아형(subtype)으로는 단형성 상피 장 T세포 림프종(MEITL) (n = 4), 피하 지방층염 유사 T세포 림프종(SPTCL) (n = 3) 및 변형 근상식육종(transformed MF) (n = 1)가 있었다. 2021년 5월 31일 마지막 업데이트 기준으로, 추적기간(follow-up)의 중간값은 31.8개월 (95% 신뢰 구간: 26.9 ~ 36.7개월)이었으며, 56명의 환자에서 PFS가 발생하였었다. 이 중 분석 당시 36명의 환자가 사망하였으며, 치료 관련 독성 1건을 제외한 모든 환자의 사인은 림프종이었다.Peripheral blood samples were obtained from 94 patients with peripheral T-cell lymphoma (PTCL) consecutively enrolled in a prospective cohort study conducted between March 2017 and November 2019. Referring to Table 1 below, there were 73 newly diagnosed/primary treatment patients and 21 patients with relapse or treatment resistance at the time of enrollment, and the average age of the patients was 58 years (range: 19 to 82 years). According to World Health Organization (WHO) classification, 39 patients had angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) (n = 31), follicular T-cell lymphoma (FTCL) (n = 4), and TFH phenotype. Nodular lymphoma of TFH origin, including nodular peripheral T-cell lymphoma (PTFH) (n = 4). Excluding FTCL and PTFH, 33 patients had unclassifiable peripheral T-cell lymphoma (PTCL-NOS). The 14 patients with anaplastic large cell lymphoma (ALCL) included patients with systemic ALK-negative ALCL (n = 6), systemic ALK-positive ALCL (n = 5), and cutaneous ALK-negative ALCL (n = 3). Other disease subtypes include monomorphic epithelial intestinal T-cell lymphoma (MEITL) (n = 4), subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma (SPTCL) (n = 3), and transformed MF ( n = 1). As of the last update on 31 May 2021, the median follow-up was 31.8 months (95% confidence interval: 26.9 to 36.7 months), and PFS had occurred in 56 patients. Of these, 36 patients died at the time of analysis, and the cause of death of all patients except for one treatment-related toxicity was lymphoma.
BMI: 골수 연루(Bone marrow involvement)
IPI: 국제 예후 지표(International Prognostic Index)LDH: lactate dehydrogenase
BMI: Bone marrow involvement
IPI: International Prognostic Index
2-2. 기준 세포유리 DNA 유전자형분석2-2. Baseline cell-free DNA genotyping
세포유리 DNA는 등록 시 얻은 기준 시료에서 추출하여 측정하였으며, 94명의 환자 (12.0 ng/dL, 범위: 2.3 ~ 648.0 ng/dL) 에서 혈장 세포유리 DNA의 중간 기준 수준(median baseline level)은 건강한 지원자 (7.4 ng/dL, 범위: 3.7 ~ 14.4 ng/dL, p < 0.001)보다 유의미하게 높았다. 기준 세포유리 DNA 시료를 사용한 표적 시퀀싱에서는 종양 유래 분획(tumor-derived fraction)을 나타내는 체세포 돌연변이를 포함한 세포유리 DNA를 가진 53명의 환자 (56%, 53/94)가 확인되었다 (도 1). AITL (24/31), FTCL (2/4) 및 PTFH (2/4)에서 체세포 돌연변이가 자주 검출되기 때문에 PTCL-NOS (18/33, 54.5%)보다 TFH 기원 림프종 (28/39, 71.8%)에서 체세포 돌연변이가 더 자주 확인되었다. 또한 ALK 음성 ALCL은 수가 적었지만 ALK 양성 ALCL (1/5)과 피부 ALCL (0/3)보다 돌연변이 빈도 (3/6)가 더 높았다. 그러나 TFH 기원 림프종 환자의 중간 혈장 세포유리 DNA 농도 (13.3 ng/dL, 범위: 2.4-648.0 ng/dL)는 PTCL-NOS (10.5 ng/dL, 범위: 2.5-299.6 ng/dL) 및 ALCL (15.4 ng/dL, 범위: 3.1 ~ 44.1 ng/dL, p > 0.05)과 유의미한 차이가 없었다. 임상적으로 단계 III/IV인 환자 (44/69, 63.8%)와 재발/치료저항성 환자 (16/21, 76.2%)는 단계 I/II 환자 (9/25, 36.0%)와 새로 진단된 환자 (37/73, 50.7%)보다 각각 더 높은 체세포 돌연변이를 보였다 (상기 표 1 참고). 체세포 돌연변이는 서열화된 유전자 66개 중 51개에서 검출되었으며, 상위 10개 유전자는 다음과 같다: RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53, IDH2, ALK, MEF2B, SOCS1, CARD11, KRAS (도 1). 가장 일반적으로 확인된 돌연변이는 RHOA에서 주로 AITL (n = 16), FTCL (n = 1) 및 PTFH (n = 1)와 같은 TFH 기원 림프종에서 검출되었고, 드물게 PTCL-NOS (n = 3)에서 검출되었다. 대부분의 사례 (n = 20)는 p.Gly17Val를 암호화하는 RHOA 돌연변이를 포함하며, 하나의 사례 (PTFH)에서만 p.Thr19Ile를 암호화하는 RHOA 돌연변이를 포함하였다 (도 2). R172 잔기에 영향을 미치는 모든 IDH2 돌연변이 (예; p.Arg172Ser)는 PTCL-NOS (n = 1)보다 AITL (n = 8) 및 FTCL (n = 1)을 포함한 TFH 기원 림프종에서 더 자주 발견되었다 (도 2). CREBBP, TP53 및 KM2TD의 체세포 돌연변이는 모든 아형에서 확인되었다 (도 2). CREBBP의 우성돌연변이(dominant mutation)는 p.His2384Thr를 포함한 2384 위치에서 검출되었으나 TP53 및 KM2TD의 돌연변이 부위는 겹치지 않았다 (도 2). 기준 세포유리 DNA의 유전자형분석 결과는 종양과 혈장 시료를 쌍으로 사용할 수 있는 21명의 환자를 대상으로 1차 종양 조직(primary tumor tissue)의 돌연변이 프로파일과 비교되었다. 앞서 언급한 상위 10개 유전자 (도 3)에 대해 혈장 세포유리 DNA와 종양 조직의 체세포 돌연변이가 일치하는 것을 발견하였다. 예를 들어, RHOA 돌연변이의 일치성은 FTC 기원 림프종인 AITL (n = 7), FTCL (n = 1) 및 PTFH (n = 1)의 혈장 세포유리 DNA와 종양 조직에서 관찰된 반면, TP53 돌연변이 일치성은 PTCL-NOS (N = 4), AITL (n = 1) 및 ALCL (n = 1)에서 확인되었다 (도 3).Cell-free DNA was extracted and measured from reference samples obtained at enrollment, and the median baseline level of plasma cell-free DNA in 94 patients (12.0 ng/dL, range: 2.3 to 648.0 ng/dL) was found in healthy volunteers. (7.4 ng/dL, range: 3.7 to 14.4 ng/dL, p < 0.001). Targeted sequencing using reference cell-free DNA samples identified 53 patients (56%, 53/94) with cell-free DNA containing somatic mutations representing the tumor-derived fraction (FIG. 1). Lymphoma of TFH origin (28/39, 71.8%) than PTCL-NOS (18/33, 54.5%) because somatic mutations are frequently detected in AITL (24/31), FTCL (2/4) and PTFH (2/4) ), somatic mutations were identified more frequently. In addition, ALK-negative ALCL, although fewer in number, had a higher mutation frequency (3/6) than ALK-positive ALCL (1/5) and cutaneous ALCL (0/3). However, the median plasma cell-free DNA concentration (13.3 ng/dL, range: 2.4-648.0 ng/dL) of patients with lymphoma of TFH origin was significantly higher than PTCL-NOS (10.5 ng/dL, range: 2.5-299.6 ng/dL) and ALCL (15.4 ng/dL). ng/dL, range: 3.1 to 44.1 ng/dL, p > 0.05). Clinically stage III/IV patients (44/69, 63.8%) and relapsed/treatment resistant patients (16/21, 76.2%) were compared with stage I/II patients (9/25, 36.0%) and newly diagnosed patients. (37/73, 50.7%) showed higher somatic mutations (see Table 1 above). Somatic mutations were detected in 51 of 66 genes sequenced, and the top 10 genes were: RHOA , CREBBP , KMT2D , TP53 , IDH2 , ALK , MEF2B , SOCS1 , CARD11 , KRAS (FIG. 1). The most commonly identified mutations were detected in RHOA , primarily in lymphomas of TFH origin, such as AITL (n = 16), FTCL (n = 1) and PTFH (n = 1), and rarely in PTCL-NOS (n = 3). It became. Most cases (n = 20) contained the RHOA mutation encoding p.Gly17Val, and only one case (PTFH) contained the RHOA mutation encoding p.Thr19Ile (FIG. 2). All IDH2 mutations affecting the R172 residue (e.g. p.Arg172Ser) were found more frequently in lymphomas of TFH origin including AITL (n = 8) and FTCL (n = 1) than in PTCL-NOS (n = 1) ( Fig. 2). Somatic mutations in CREBBP , TP53 and KM2TD were identified in all subtypes (Fig. 2). A dominant mutation of CREBBP was detected at
2-3. 세포유리 DNA의 돌연변이 종단 평가(Longitudinal assessment)2-3. Longitudinal assessment of cell-free DNA mutations
기준에서 재발 또는 진행 시점까지 연속적으로 채취한 혈장 시료를 사용한 종단 분석은 돌연변이와 임상 결과의 상관관계를 보여주었다. CHOP 화학요법을 받은 신규 진단 PTCL-NOS 환자 2명 중 1명은 중간 평가에서 TP53 돌연변이의 빠른 제거(clearance)를 보여 완전 반응(complete response)으로 살아남은 반면, 다른 1명은 TP53 돌연변이가 지속되어 재발된 것으로 보였다 (도 4A, B). 선행(upfront) 자가 줄기세포 이식(autologous stem cell transplantation, ASCT)을 받은 환자 중, 특히 EZH2에서 초기에 높은 GE 수준의 ctDNA 돌연변이를 가지고 있던 PTCL-NOS 환자 1명은 치료 종료 시 돌연변이 수준이 1.5로그를 초과하는 수준으로 감소하였으며, 완전 반응이 유지되었다 (도 4C). 반면, AITL 환자는 CREBBP와 MEF2B에서 기준 돌연변이의 제거를 보여주지 못하였고, 방사선이 ASCT 후 완전 반응을 나타냈음에도 MEF2B에서 추가 돌연변이가 발전하였다. 결국 지속적인 돌연변이 검출과 함께 재발하였다 (도 4D). 질병 진행과 체세포 돌연변이 증가의 연관성은 재발 환자에서도 발견되었다. 예를 들어, 구제 화학요법을 받은 AITL이 재발한 환자 1명은 TP53과 SOCS1 돌연변이가 증가하였으며 (도 4E), ALK 양성 ALCL이 재발한 다른 환자 1명도 브렌투시맙 베도틴(brentuximab vedotin) 치료 후 CREBP와 STAT6 돌연변이가 증가하면서 질병 진행을 보였다 (도 4F).Longitudinal analyzes using serially drawn plasma samples from baseline to relapse or progression showed a correlation between mutation and clinical outcome. One out of two patients with newly diagnosed PTCL-NOS who received CHOP chemotherapy showed rapid clearance of the TP53 mutation at interim evaluation and survived with a complete response, while the other patient had a recurrence due to persistence of the TP53 mutation. were seen (Fig. 4A, B). Among patients who underwent upfront autologous stem cell transplantation (ASCT), one PTCL-NOS patient, who initially had a high GE ctDNA mutation in EZH2 , had a mutation level of 1.5 logs at the end of treatment. decreased to an excess level, and full response was maintained (Fig. 4C). On the other hand, patients with AITL failed to show clearance of baseline mutations in CREBBP and MEF2B , and developed additional mutations in MEF2B even though radiation showed a complete response after ASCT. It eventually relapsed with persistent mutation detection (Fig. 4D). An association between disease progression and increased somatic mutations was also found in relapsed patients. For example, TP53 and SOCS1 mutations were increased in one patient with AITL relapse who received salvage chemotherapy (FIG. 4E), and in another patient with ALK-positive ALCL relapse after treatment with brentuximab vedotin. Disease progression was shown with increasing CREBP and STAT6 mutations (Fig. 4F).
2-4. 질병 진행 중 신규 체세포 돌연변이의 출현2-4. Emergence of novel somatic mutations during disease progression
세포유리 DNA의 종단 유전자형분석은 초기에 검출된 돌연변이의 증가와 함께 새로운 체세포 돌연변이의 질병 진행 중 출현을 확인하였다. 질병 진행 중에 ALK 음성 ALCL을 가진 56세 남성은 초기에 검출된 SOCS1, MAPK1, MAP2K1i 및 KM2TD 돌연변이가 증가하였다. 또한 PIK3CA를 포함한 유전자의 다른 돌연변이 수준이 감소하였음에도 PIM1, MTOR 및 CARD11을 포함한 유전자의 새로운 돌연변이 출현도 관찰되었다. BRAF 돌연변이가 있는 환자에서는 BRAF p.D594G가 증가한 반면 BRAF p.V600G 및 p.V600M이 감소하였고, 이 환자는 브렌투시맙 베도틴을 사용한 후속 치료에서 치료저항성을 가지게 되었다 (도 5A). PTCL-NOS를 가진 57세 남성은 분할 이포스파미드(ifosfamide), 카보플라틴(carboplatin) 및 에토포시드(etoposide) 화학요법을 6회 반복하여 완전 반응을 보인 후 ASCT를 받았다. 그러나 CREBBP, KMT2D, MEF2B, BRAF, IRK1 및 GATA3와 관련된 돌연변이는 그 환자의 완전 반응 당시에 검출되었고, 이러한 돌연변이 출현이 더욱 증가하면서 결국에는 재발하였다 (도 5B). PTCL-NOS가 재발한 48세 남성은 임상시험의 일환으로 젬시타빈(gemcitabine)과 함께 PI3K 억제제인 코판리시브(copanlisib)로 치료를 받았다. 그 환자는 치료 중 질환이 진행하면서 KRAS와 STAT3를 포함한 새로운 돌연변이의 개발을 보여주었다 (도 5C).Termination genotyping of cell-free DNA confirmed the emergence during disease progression of new somatic mutations with an increase in mutations detected earlier. During disease progression, a 56-year-old male with ALK-negative ALCL had an increase in initially detected SOCS1 , MAPK1 , MAP2K1i and KM2TD mutations. In addition, the appearance of new mutations in genes including PIM1 , MTOR and CARD11 was also observed, although the levels of other mutations in genes including PIK3CA decreased. In patients with BRAF mutation, BRAF p.D594G increased, whereas BRAF p.V600G and p.V600M decreased, and this patient developed treatment resistance in subsequent treatment with brentuximab vedotin (FIG. 5A). A 57-year-old man with PTCL-NOS underwent ASCT after achieving a complete response to six cycles of divided ifosfamide, carboplatin, and etoposide chemotherapy. However, mutations related to CREBBP , KMT2D , MEF2B , BRAF , IRK1 and GATA3 were detected at the time of complete response in the patient, and as the appearance of these mutations further increased, they eventually recurred (FIG. 5B). A 48-year-old man with relapsed PTCL-NOS was treated with the PI3K inhibitor copanlisib in combination with gemcitabine as part of a clinical trial. The patient showed development of new mutations including KRAS and STAT3 as the disease progressed during treatment (Fig. 5C).
2-5. 세포유리 DNA 및 생존 결과2-5. Cell-free DNA and survival results
세포유리 DNA 돌연변이의 기준 검출에 따른 생존 결과를 비교하면, 세포유리 DNA 돌연변이가 검출된 PFS 및 OS인 환자 53명은 돌연변이가 검출되지 않은 환자 41명보다 현저히 나빴다 (도 6A, B). 또한, 생존 결과는 기준과 치료 종료 사이에 세포유리 DNA의 돌연변이 부피(mutation volume)에서 차이가 나타나는 GE의 종단 차이에 따라 달라졌다. 따라서 치료 말기에 돌연변이 부피가 1.5 로그 이상 감소한 환자는 1.5 로그 미만 감소한 환자보다 PFS 및 OS가 더 나은 것으로 나타났다. 특히 로그 변화가 0 미만으로 나타난 치료 후 GE가 증가한 환자는 최악의 PFS와 OS를 보였다 (도 6C, D).Comparing survival results according to baseline detection of cell-free DNA mutations, 53 patients with PFS and OS with cell-free DNA mutations were significantly worse than 41 patients with no mutations (Fig. 6A, B). In addition, survival outcomes depended on longitudinal differences in GE, which indicated differences in mutation volume of cell-free DNA between baseline and end of treatment. Thus, patients with more than 1.5 log reduction in mutation volume at the end of treatment showed better PFS and OS than patients with less than 1.5 log reduction. In particular, patients with increased GE after treatment with a log change less than zero had the worst PFS and OS (Fig. 6C,D).
2-6. 바이오마커의 조합에 따른 예후 예측 정확도2-6. Prognostic prediction accuracy according to the combination of biomarkers
전술한 표적 심층 시퀀싱에 사용된 체세포 돌연변이를 가진 말초 T세포 림프종 53명의 환자를 대상으로 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자 중 개별 유전자 또는 유전자 조합별로 해당되는 환자의 비율을 확인하였다. For 53 patients with peripheral T-cell lymphoma with somatic mutations used in the above-mentioned targeted deep sequencing, the proportion of patients corresponding to individual genes or gene combinations among RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53, and IDH2 genes was identified.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 또는 IDH2 유전자는 각각 말초 T세포 림프종 환자의 20 ~ 40%만 포함하지만 (도 7A), 2종 이상의 유전자를 조합할 경우 환자를 포함하는 범위가 증가하였다. 특히 CREBBP 유전자와 함께 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 2개의 유전자와 조합한 경우 포함 범위가 약 50% 이상으로, 3개의 유전자와 조합한 경우 포함 범위가 약 70% 이상으로 늘어났다 (도 7B 및 C). 그리고 RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자를 모두 포함하는 경우에는 약 90% 수준으로 나타났으나, CREBBP를 제외한 4종의 유전자를 포함하는 경우에는 70% 수준에 그쳤다 (도 7D).As a result, as shown in FIG. 7, RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53 or IDH2 genes each contain only 20 to 40% of peripheral T-cell lymphoma patients (FIG. 7A), but combining two or more genes The scope of inclusion has increased. In particular, when two genes of RHOA, KMT2D, TP53, and IDH2 were combined with the CREBBP gene, coverage increased to about 50% or more, and when combined with three genes, coverage increased to about 70% or more (Fig. 7B and C ). In the case of including the RHOA, CREBBP, KMT2D, TP53, and IDH2 genes, the level was about 90%, but in the case of including the four genes except CREBBP, the level was only 70% (FIG. 7D).
이러한 결과는 피험자의 변이 유전자, 특히 CREBBP 유전자 및 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 중 어느 하나 이상의 유전자의 조합을 통해 말초 T세포 림프종 예후를 높은 정확도를 예측할 수 있음을 시사한다.These results suggest that the prognosis of peripheral T-cell lymphoma can be predicted with high accuracy through a combination of the subject's mutated gene, particularly the CREBBP gene and any one or more genes of RHOA, KMT2D, TP53, and IDH2.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at with respect to its preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent scope will be construed as being included in the present invention.
Claims (12)
b) 상기 측정된 유전자의 변이 수준을 대조군과 비교하는 단계
를 포함하며,
상기 b) 단계는 상세불명의 말초 T세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS) 환자 또는 혈관면역모구 T세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL) 환자의 생물학적 시료에서 CREBBP, RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준이 대조군에 비해 증가한 경우 예후가 나쁜 것으로 판별하고,
역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL) 환자의 생물학적 시료에서 CREBBP, KMT2D 및 TP53 유전자의 변이 수준이 대조군에 비해 증가한 경우 예후가 나쁜 것으로 판별하는 것인
말초 T세포 림프종 예후를 예측하기 위한 정보의 제공 방법.
a) measuring the mutation level of the CREBBP gene and at least one gene selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 in a biological sample isolated from the subject; and
b) comparing the mutation level of the measured gene with a control group
Including,
Step b) is CREBBP in a biological sample of an unspecified peripheral T-cell lymphoma (not otherwise specified, PTCL-NOS) patient or angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) patient. , If the mutation level of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2 genes increased compared to the control group, the prognosis was determined to be poor,
In a biological sample of a patient with anaplastic large cell lymphoma (ALCL), if the mutation levels of CREBBP, KMT2D, and TP53 genes are increased compared to the control group, the prognosis is determined to be poor
A method for providing information to predict the prognosis of peripheral T-cell lymphoma.
상기 a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 소변 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법.
The method of claim 1,
Wherein the biological sample of step a) is at least one selected from the group consisting of blood, plasma, serum, lymph, saliva, urine and tissue.
상기 a) 단계의 유전자의 변이는 단일 염기서열 변이, 1 ~ 50개의 뉴클레오티드의 염기서열 부위의 결실 또는 삽입, 및 복제수 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법.
The method of claim 1,
The mutation of the gene in step a) is at least one selected from the group consisting of a single nucleotide sequence mutation, deletion or insertion of a nucleotide sequence of 1 to 50 nucleotides, and copy number mutation.
상기 a) 단계의 유전자의 변이 수준은 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing)을 이용하여 측정되는 것인 방법.
The method of claim 1,
Wherein the mutation level of the gene in step a) is measured using next-generation sequencing.
상기 a) 단계의 유전자의 변이 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것인 방법.
The method of claim 1,
The level of mutation of the gene in step a) is determined by polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, nuclease protection assay, A method that is measured by at least one method selected from the group consisting of in situ hybridization, DNA microarray, and Northern blot.
상기 유전자에 대한 서열 데이터를 기반으로 각 유전자의 변이 수준을 측정하여 상기 피험자의 말초 T세포 림프종 예후를 수행하는 분석부
를 포함하며,
상기 분석부는 상세불명의 말초 T세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS) 환자 또는 혈관면역모구 T세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL) 환자의 CREBBP, RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준으로부터 예후를 예측하고,
역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL) 환자의 CREBBP, KMT2D 및 TP53 유전자의 변이 수준으로부터 예후를 예측하는 것인
말초 T세포 림프종 예후 예측 시스템.
an input unit for receiving sequence data for the subject's CREBBP gene and at least one gene selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2; and
An analysis unit that measures the level of mutation of each gene based on the sequence data of the gene and performs the prognosis of the subject's peripheral T-cell lymphoma.
Including,
The analysis unit is a peripheral T-cell lymphoma (not otherwise specified, PTCL-NOS) patient or angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) patient's CREBBP, RHOA, KMT2D, Prognosis is predicted from the mutation level of TP53 and IDH2 genes,
To predict prognosis from mutation levels of CREBBP, KMT2D and TP53 genes in anaplastic large cell lymphoma (ALCL) patients
A prognostic system for peripheral T-cell lymphoma.
상기 서열 데이터는 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing)에서 얻은 것인 시스템.
The method of claim 6,
The system wherein the sequence data is obtained from next-generation sequencing.
상기 분석부는 변이된 CREBBP 유전자와 RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 조합에 따른 말초 T세포 림프종 예후의 정확도를 산출하는 것인 시스템.
The method of claim 6,
The analysis unit calculates the accuracy of peripheral T-cell lymphoma prognosis according to a combination of the mutated CREBBP gene and one or more genes selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2.
상세불명의 말초 T세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS) 또는 혈관면역모구 T세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL)의 예후 예측을 위해 CREBBP, RHOA, KMT2D, TP53 및 IDH2 유전자의 변이 수준을 측정하고,
역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL)의 예후 예측을 위해 CREBBP, KMT2D 및 TP53 유전자의 변이 수준을 측정하는
말초 T세포 림프종 예후 예측용 조성물.
A CREBBP gene and an agent for measuring the mutation level of one or more genes selected from the group consisting of RHOA, KMT2D, TP53 and IDH2,
CREBBP, RHOA, KMT2D, TP53 for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma (not otherwise specified, PTCL-NOS) or angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), unspecified And measuring the mutation level of the IDH2 gene,
Measuring mutation levels of CREBBP, KMT2D and TP53 genes to predict the prognosis of anaplastic large cell lymphoma (ALCL)
A composition for predicting the prognosis of peripheral T-cell lymphoma.
상기 유전자의 변이는 단일 염기서열 변이, 1 ~ 50개의 염기서열 결실 또는 삽입, 및 복제수 변이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
The method of claim 9,
The mutation of the gene is at least one selected from the group consisting of a single nucleotide sequence mutation, 1 to 50 nucleotide sequence deletion or insertion, and copy number mutation composition.
상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, 올리고펩티드 및 PNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 조성물.
The method of claim 9,
Wherein the agent comprises at least one selected from the group consisting of primers, probes, antibodies, aptamers, oligopeptides and PNAs.
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