KR20230050814A - FRET Biosensor for Measuring Arginine Phosphorylation and Uses thereof - Google Patents

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KR20230050814A
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Abstract

The present invention relates to a FRET biosensor for measuring arginine phosphorylation and use thereof. Specifically, the present invention provides a FRET-based sensor for measuring activity of an arginine kinase or phosphorylated arginine phosphatase containing a donor fluorophore protein, a phosphorylated arginine binding domain, an arginine phosphorylation domain, a first linker connected to the arginine phosphorylation domain, and an acceptor fluorescent protein. In addition, according to the present invention, a detecting method for arginine phosphorylation, a kit for screening arginine kinase inhibitors, and a screening method for arginine kinase inhibitors using the sensor are provided. Accordingly, activity of the arginine kinase and phosphorylated arginine phosphatase can be measured simply and easily.

Description

아르기닌 인산화 측정용 FRET 바이오센서 및 이의 용도 {FRET Biosensor for Measuring Arginine Phosphorylation and Uses thereof}FRET biosensor for measuring arginine phosphorylation and uses thereof {FRET Biosensor for Measuring Arginine Phosphorylation and Uses thereof}

본 발명은 아르기닌 인산화 측정용 FRET 바이오센서 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아르기닌 인산화효소 또는 인산화 아르기닌 탈인산화효소의 활성을 측정하기 위한 FRET 바이오센서, 이를 사용하여 아르기닌 인산화를 검출하는 방법, 및 아르기닌 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a FRET biosensor for measuring arginine phosphorylation and its use. Specifically, the present invention relates to a FRET biosensor for measuring the activity of arginine kinase or phosphorylated arginine dephosphorylase, a method for detecting arginine phosphorylation using the same, and a screening method for arginine kinase inhibitors.

단백질 인산화(phosphorylation)은 타깃 단백질의 기능을 조절하는 핵심적인 기작 중 하나로서, 기초과학뿐 아니라 의학 및 약학에서도 큰 의미가 있다. 지금까지의 단백질 인산화 연구는 pSer, pThr, pTyr 등 3가지 형태의 단백질 O-인산화에 집중되어 있었다. 그러나 생체에는 인산화 아르기닌(Phosphoarginine, pArg)과 같은 단백질의 N-인산화 현상도 존재한다. N-인산화는 세포 신호 전달, 암세포 대사와 같은 현상에 관여한다는 것이 밝혀졌으나, pSer/pThr/pTyr 연구에 비하면 그 후속 연구는 상대적으로 부진한 상황이다. 이는 pArg이 매우 불안정하여 이를 정량적으로 검출할 수 있는 효과적인 방법이 없었기 때문이다.Protein phosphorylation is one of the key mechanisms for regulating the function of a target protein, and is of great significance not only in basic science but also in medicine and pharmacology. So far, protein phosphorylation studies have focused on three types of protein O-phosphorylation: pSer, pThr, and pTyr. However, N-phosphorylation of proteins such as phosphorylated arginine (pArg) also exists in living organisms. Although N-phosphorylation has been found to be involved in phenomena such as cell signal transduction and cancer cell metabolism, subsequent studies are relatively lacking compared to pSer/pThr/pTyr studies. This is because pArg is very unstable and there is no effective method to quantitatively detect it.

한편, 아르기닌 인산화효소(Arg kinase) 및 인산화 아르기닌 탈인산화효소(pArg phosphatase)는 특히 그람 양성균의 스트레스 조절과 병독성 조절에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌으며 이에 따라 아르기닌 인산화의 측정이 항생제 개발에서 후보물질 발굴의 기반이 된다. On the other hand, it has been found that arginine kinase (Arg kinase) and phosphorylated arginine dephosphorylation enzyme (pArg phosphatase) play an important role in regulating stress and virulence of Gram-positive bacteria. becomes the basis for

기존의 아르기닌 인산화효소 및 인산화 아르기닌 탈인산화효소의 활성 측정 방법은 주로 방사성 동위원소 표지법이나 면역블롯팅법 등에 의존하였다. 그러나 이들 방법은 위험하거나 실시가 번거롭고 복잡하였으며 효율도 낮고, 실시간 관찰도 불가능하였다. 이에 따라 최근에는 펩티드에 기반한 아르기닌 인산화효소 형광 센서가 개발되기도 하였으나 이는 살아있는 세포에서의 인산화 관찰이 불가능하다는 단점이 있었다.Existing methods for measuring the activity of arginine kinase and phosphorylated arginine dephosphorylase mainly depended on radioactive isotope labeling or immunoblotting. However, these methods are dangerous, cumbersome and complicated to implement, have low efficiency, and cannot be observed in real time. Accordingly, a peptide-based arginine kinase fluorescence sensor has recently been developed, but it has the disadvantage that it is impossible to observe phosphorylation in living cells.

본 발명의 목적은 방사성 동위원소 또는 항체와 같이 고가의 시약 등이 없어도 아르기닌 인산화효소 또는 인산화 아르기닌 탈인산화효소의 활성을 쉽고 빠르게, 그리고 정확히 측정할 수 있으며, 시험관내 뿐만 아니라 살아있는 세포 내에서도 실시간으로 아르기닌 인산화/탈인산화를 관찰할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to easily, quickly, and accurately measure the activity of arginine kinase or phosphorylated arginine dephosphorylase without expensive reagents such as radioactive isotopes or antibodies, and in vitro as well as in living cells in real time. It is to provide a method for observing phosphorylation/dephosphorylation.

본 발명의 일 양태에 따르면, 공여 형광체 단백질, 인산화 아르기닌 결합 도메인, 아르기닌 인산화 도메인, 상기 아르기닌 인산화 도메인에 연결된 제1 링커, 및 수용 형광체 단백질을 포함하는, 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 기반한 아르기닌 인산화 효소 또는 인산화 아르기닌 탈인산화 효소의 활성 측정용 센서가 제공된다.According to one aspect of the present invention, a fluorescence resonance energy transfer (FRET) comprising a donor phosphor protein, a phosphorylated arginine binding domain, an arginine phosphorylation domain, a first linker linked to the arginine phosphorylation domain, and an acceptor phosphor protein A sensor for measuring the activity of arginine kinase or phosphorylated arginine dephosphorylase based on ) is provided.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 센서를 사용하는 것을 특징으로 하는 FRET에 기반하여 아르기닌의 인산화를 검출하는 방법이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting phosphorylation of arginine based on FRET, characterized in that using the above-described sensor.

본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 전술한 센서를 포함하는, FRET에 기반하여 아르기닌 인산화를 측정하기 위한 키트가 제공된다.According to another aspect of the present invention, a kit for measuring arginine phosphorylation based on FRET, including the above-described sensor, is provided.

본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 전술한 센서를 사용하는 것을 특징으로 하는, 아르기닌 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법이 제공된다.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for screening arginine kinase inhibitors, characterized in that using the sensor described above.

본 발명에 따르면 기존에는 화학적 불안정성으로 인하여 활성의 측정이 어려웠던 아르기닌 인산화효소 및 인산화 아르기닌 탈인산화효소의 활성을 간단하고 쉽게 측정할 수 있다. 특히, 본 발명의 센서는 재조합 단백질에 기반한 형광 센서이므로 E.coli 등을 이용하거나 합성 형광 물질을 합성할 필요없이 유전자 발현만으로 쉽게 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 아르기닌의 인산화에 따른 형광 변화를 통해 인산화 반응 정도를 상대적인 정량으로 및 실시간으로 측정할 수 있으므로 인산화효소 저해제의 고속 스크리닝에 쉽게 적용하여 새로운 항생제 후보물질을 발굴하는데 활용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 센서는 살아있는 세포에 적용이 가능하므로 시험관내 측정 뿐만 아니라 살아있는 세포 내에서의 아르기닌 인산화 측정에도 사용될 수 있다.According to the present invention, the activities of arginine kinase and phosphorylated arginine dephosphorylase, which were previously difficult to measure due to chemical instability, can be simply and easily measured. In particular, since the sensor of the present invention is a fluorescence sensor based on a recombinant protein, it can be easily obtained only by gene expression without the need to use E. coli or synthesize a synthetic fluorescent material. In addition, according to the present invention, since the degree of phosphorylation can be measured in a relative quantity and in real time through fluorescence change according to phosphorylation of arginine, it can be easily applied to high-speed screening of kinase inhibitors and used to discover new antibiotic candidates. . Moreover, since the sensor of the present invention can be applied to living cells, it can be used for measuring arginine phosphorylation in living cells as well as in vitro measurement.

도 1에서 (a)는 본 발명의 일 구현예에 따른 센서를 모식적으로 나타낸 그림이고 (b)는 본 발명의 일 구현예에 따른 센서가 작동하는 메커니즘을 모식적으로 나타낸 그림이다.
도 2는 제2 링커와 제1 링커의 길이에 따른 FRET 강도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 제1 링커에 아르기닌을 추가하지 않거나(#0), 1 또는 2개 추가한(#1‘, #1, #2) FRET 센서에 있어서 시간에 따른 형광 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 탈인산화효소 YwlE, ADP, 또는 PK+PEP 처리와 같은 다양한 조건에서 FRET 강도의 변화를 관찰한 그래프이다.
도 5는 살아있는 세포 내에서 FRET 센서를 사용하였을 때 형광 발생 여부를 확인하는 공초점 현미경 사진이다.
도 6 및 도 7은 아르기닌 인산화 효소에 열 스트레스를 가해 활성화 시켰을 때 FRET 신호의 변화를 보여주는 그래프이다. In FIG. 1, (a) is a diagram schematically showing a sensor according to an embodiment of the present invention, and (b) is a diagram schematically showing a mechanism in which the sensor operates according to an embodiment of the present invention.
2 is a graph showing FRET intensities according to the lengths of the second linker and the first linker.
Figure 3 is a graph showing the change in fluorescence over time in the FRET sensor in which no (#0) or one or two (#1', #1, #2) arginine is added to the first linker.
Figure 4 is a graph observing changes in FRET intensity under various conditions such as dephosphorylation enzyme YwlE, ADP, or PK+PEP treatment.
5 is a confocal micrograph for confirming whether fluorescence is generated when a FRET sensor is used in living cells.
6 and 7 are graphs showing changes in FRET signals when arginine kinase is activated by applying heat stress.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. The terms used in this application are only used to describe specific embodiments and are not intended to limit the present invention. Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다, "함유"한다, "가지다"라고 할 때, 이는 특별히 달리 정의되지 않는 한, 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part “includes,” “includes,” or “has” a certain component, it means that it may further include other components unless otherwise specifically defined.

제1, 제2 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 전술한 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다.Terms such as first and second are used to distinguish one component from another, and the components are not limited by the aforementioned terms.

본 발명의 일 양태에 따르면, FRET에 기반한 아르기닌 인산화 효소 또는 인산화 아르기닌 탈인산화 효소의 활성 측정용 센서가 제공된다. 상기 센서에 대해 도 1을 참조하여 보다 구체적으로 설명하겠다. According to one aspect of the present invention, a sensor for measuring the activity of arginine kinase or phosphorylated arginine dephosphorylase based on FRET is provided. The sensor will be described in more detail with reference to FIG. 1 .

본 명세서에서 FRET(형광 공명 에너지 전이, fluorescence resonance energy transfer)은, 단파장 형광 단백질인 공여체(donor)가 외부에서 에너지를 흡수하면, 상기 공여체의 여기 에너지가 빛 에너지로 방출되는 대신, 소정의 거리 안에 위치한 장파장 형광 단백질인 수용체(acceptor)에 발광 없이 전달되어, 수용체의 장파장 형광만이 방출되는 현상을 의미한다. FRET에 의한 수용체 형광의 발생 또는 공여체 방출광의 소멸 현상(photobleaching)이 나타나려면 상기 공여체와 수용체가 매우 짧은 거리(10 nm 미만)에 위치해야 한다. 특정 파장의 빛을 내는 형광 단백질인 상기 공여체와 이 발광 에너지와 공명을 일으켜 에너지를 흡수할 수 있는 형광 단백질인 상기 수용체가 소정의 거리 이내로 가까워지면, 외부에서 상기 공여체를 여기시키기 위해 조사된 빛 에너지가 상기 공여체로부터 상기 수용체로 발광 없이 전달되어 공여체의 고유한 파장의 발광이 감소하고, 공여체로부터 에너지를 전달받은 수용체가 자신의 고유한 파장대의 빛을 발광하는 FRET 현상이 일어난다.In the present specification, fluorescence resonance energy transfer (FRET) is, when a donor, a short-wavelength fluorescent protein, absorbs energy from the outside, the excitation energy of the donor is emitted as light energy, but within a predetermined distance It refers to a phenomenon in which only the long-wavelength fluorescence of the receptor is emitted as it is transmitted to the receptor, which is a long-wavelength fluorescent protein, without light emission. To generate acceptor fluorescence by FRET or photobleaching of donor-emitted light, the donor and acceptor must be located at a very short distance (less than 10 nm). When the donor, which is a fluorescent protein that emits light of a specific wavelength, and the acceptor, which is a fluorescent protein that can absorb energy by resonating with this luminous energy, are brought closer within a predetermined distance, the light energy radiated from the outside to excite the donor is transferred from the donor to the acceptor without emitting light, thereby reducing the luminescence of the donor's unique wavelength, and a FRET phenomenon occurs in which the acceptor receiving energy from the donor emits light in its own unique wavelength range.

본 발명의 일 양태에 따르면 아르기닌 인산화효소 또는 인산화 아르기닌 탈인산화효소 활성 측정용 FRET 센서는 공여 형광체 단백질, 인산화 아르기닌 결합 도메인, 아르기닌 인산화 도메인, 상기 아르기닌 인산화 도메인에 연결된 제1 링커, 및 수용 형광체 단백질을 포함한다. According to one aspect of the present invention, the FRET sensor for measuring the activity of arginine kinase or phosphorylated arginine dephosphorylation enzyme comprises a donor phosphor protein, a phosphorylated arginine binding domain, an arginine phosphorylation domain, a first linker linked to the arginine phosphorylation domain, and an acceptor phosphor protein include

상기 센서는 아르기닌 인산화효소(Arg kinase)에 의해 아르기닌이 인산화되면 인산화 아르기닌(pArg)과 인산화 아르기닌 결합 도메인(pArg binding domain) 사이가 가까워지면서 두 형광체 단백질(예를 들어 ECFP, EYFP) 사이의 거리가 멀어지고 이러한 형광체 단백질들 사이의 거리 변화에 따라 FRET이 변화한다. 이러한 FRET 변화량을 이용하여 효소의 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어 도 1의 (b)에서 보는 바와 같이 아르기닌 인산화효소에 의해 아르기닌이 인산화되어 인산화 아르기닌 결합 도메인과의 결합이 일어나면 두 형광체 단백질 사이의 거리가 멀어져서 FRET이 감소 (형광 감소)하고, 이와 반대로 인산화 아르기닌 탈인산화효소에 의해 인산화 아르기닌이 탈인산화되면 두 형광체 단백질 사이의 거리가 가까워져서 FRET이 증가 (형광 증가)한다. 이러한 FRET의 감소 및 증가 여부에 의해 효소 활성의 유무를 측정 가능하며 상기 감소량, 증가량을 측정함으로써 효소 활성을 상대적 정량으로 측정할 수 있게 된다.When arginine is phosphorylated by arginine kinase (Arg kinase), the sensor becomes closer between phosphorylated arginine (pArg) and phosphorylated arginine binding domain (pArg binding domain), and the distance between the two fluorescent proteins (eg ECFP, EYFP) FRET changes as the distance between these phosphor proteins changes. The activity of the enzyme can be measured using this FRET change amount. For example, as shown in (b) of FIG. 1, when arginine is phosphorylated by arginine kinase and binding to the phosphorylated arginine-binding domain occurs, the distance between the two phosphor proteins increases, resulting in a decrease in FRET (decrease in fluorescence), and thus Conversely, when phosphorylated arginine is dephosphorylated by phosphorylated arginine dephosphorylase, the distance between the two phosphor proteins becomes closer, and FRET increases (fluorescence increase). The presence or absence of enzyme activity can be measured by the decrease or increase of FRET, and the enzyme activity can be measured in a relative quantity by measuring the amount of decrease or increase.

본 발명의 FRET 센서에서 공여 형광체 단백질, 인산화 아르기닌 결합 도메인, 아르기닌 인산화 도메인, 상기 아르기닌 인산화 도메인에 연결된 제1 링커, 및 수용 형광체 단백질은 반드시 앞서 기재한 순서에 따라 구성될 필요는 없다. 예를 들어 센서에서 아미노산 말단 측으로부터 수용 형광체 단백질, 인산화 아르기닌 결합 도메인, 아르기닌 인산화 도메인, 제1 링커, 및 공여 형광체 단백질의 순서에 따라 구성되어 있어도 된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, FRET 센서는 아미노산 말단 측으로부터 공여 형광체 단백질, 인산화 아르기닌 결합 도메인, 아르기닌 인산화 도메인, 제1 링커, 및 수용 형광체 단백질이 순서대로 연결된 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적인 예로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 FRET 센서는 서열번호 13을 포함하거나 서열번호 13으로 이루어진 것일 수 있다.In the FRET sensor of the present invention, the donor phosphor protein, the phosphorylated arginine binding domain, the arginine phosphorylation domain, the first linker linked to the arginine phosphorylation domain, and the acceptor phosphor protein do not necessarily have to be configured in the order described above. For example, the sensor may be configured in the order of the acceptor phosphor protein, phosphorylated arginine-binding domain, arginine phosphorylation domain, first linker, and donor phosphor protein from the amino acid terminal side. According to one embodiment of the present invention, the FRET sensor may include a structure in which a donor phosphor protein, a phosphorylated arginine binding domain, an arginine phosphorylation domain, a first linker, and an acceptor phosphor protein are sequentially connected from the amino acid terminal side. As a more specific example, according to one embodiment of the present invention, the FRET sensor may include SEQ ID NO: 13 or consist of SEQ ID NO: 13.

본 발명에서 "공여 형광체 단백질"은 외부에서 흡수한 에너지를 전달하는 물질로서 FRET의 원리상 단파장 형광 단백질 또는 단파장 형광 단백질과 융합된 융합 단백질을 말하며, "수용 형광체 단백질"이란 공여 형광체 단백질로부터 에너지를 받는 물질로서, 장파장 형광 단백질 또는 장파장 형광체 단백질과 결합된 융합 단백질을 말한다.In the present invention, "donor phosphor protein" is a material that transfers energy absorbed from the outside, and refers to a short-wavelength fluorescent protein or a fusion protein fused with a short-wavelength fluorescent protein in accordance with the principle of FRET, and "acceptor phosphor protein" refers to a material that transfers energy from a donor phosphor protein. As the receiving material, it refers to a long-wavelength fluorescent protein or a fusion protein coupled with a long-wavelength fluorescent protein.

이러한 형광체 단백질의 예로는 녹색 형광체 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광체 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광체 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광체 단백질(RFP), 증강된 적색 형광체 단백질(ERFP), 청색 형광체 단백질(BFP), 증강된 청색 형광체 단백질(EBFP), 황색 형광체 단백질(YFP), 증강된 황색체 형광 단백질(EYFP), 남색 형광체 단백질(CFP), 또는 증강된 남색 형광체 단백질(ECFP) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 이 중 단파장의 형광 단백질이 공여 형광체 단백질로 장파장의 형광체 단백질이 수용 형광체 단백질로 사용될 수 있다. 여기서, 용어 "단파장" 및 "장파장"은 상대적으로 결정된다. 즉, 공여 형광체 단백질에 사용되는 형광 단백질이 발광하는 빛의 파장은 수용 형광체 단백질에 사용되는 형광단백질이 발광하는 빛의 파장에 비해 상대적으로 파장이 짧다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 공여 형광체 단백질은 ECFP이고 상기 수용 형광체 단백질은 EYFP일 수 있다. Examples of such phosphor proteins are green phosphor protein (GFP), modified green fluorescent protein, enhanced green fluorescent protein (EGFP), red phosphor protein (RFP), enhanced red phosphor. protein (ERFP), blue phosphor protein (BFP), enhanced blue phosphor protein (EBFP), yellow phosphor protein (YFP), enhanced yellow body fluorescent protein (EYFP), indigo phosphor protein (CFP), or enhanced indigo phosphor protein (ECFP), etc., but is not limited thereto. According to one embodiment of the present invention, a short wavelength fluorescent protein may be used as a donor fluorescent protein and a long wavelength fluorescent protein may be used as a receiving fluorescent protein. Here, the terms "short wavelength" and "long wavelength" are determined relatively. That is, it means that the wavelength of light emitted by the fluorescent protein used for the donor fluorescent protein is relatively shorter than the wavelength of light emitted by the fluorescent protein used in the acceptor fluorescent protein. For example, according to one embodiment of the present invention, the donor phosphor protein may be ECFP and the acceptor phosphor protein may be EYFP.

본 발명에서 "인산화 아르기닌 결합 도메인"은 인산화 아르기닌을 탈인산화하는 활성은 없으면서 인산화 아르기닌에 결합하는 것이라면 특별히 제한되지 않다. 예를 들어 CtsR, McsB, ClpP와 같이 인산화 아르기닌에 결합하는 것으로 알려진 단백질에서 유래된 도메인이거나 YwlE와 같이 인산화 아르기닌 탈인산화효소에서 유래된 도메인 (예를 들어, YwlE의 활성 자리 포인트 돌연변이 YwlE_C9A)일 수 있다. 이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 인산화 아르기닌 결합 도메인은 인산화 아르기닌에 결합하는 CtsR, McsB, ClpP, 및 인산화 아르기닌 탈인산화효소 YwlE 중 어느 하나에서 유래된 것일 수 있으며, 보다 구체적인 예로는 서열번호 11을 포함하거나 서열번호 11로 이루어진 것일 수 있다.In the present invention, the "phosphorylated arginine binding domain" is not particularly limited as long as it binds to phosphorylated arginine without dephosphorylating activity. For example, a domain derived from a protein known to bind phosphorylated arginine, such as CtsR, McsB, or ClpP, or a domain derived from a phosphorylated arginine dephosphorylase, such as YwlE (e.g., the active site point mutation YwlE_C9A of YwlE). there is. Accordingly, according to one embodiment of the present invention, the phosphorylated arginine binding domain may be derived from any one of CtsR, McsB, ClpP, and phosphorylated arginine dephosphorylase YwlE that binds to phosphorylated arginine, and more specific examples include SEQ ID NO: It may include 11 or consist of SEQ ID NO: 11.

본 발명에서 "아르기닌 인산화 도메인"은 센서에 의해 인산화/탈인산화가 일어날 수 있는 아르기닌을 포함하는 도메인이다. 즉, 상기 도메인은 아르기닌을 포함하여, 아르기닌 인산화효소(kinase)에 의해 인산화되고 인산화 아르기닌 탈인산화효소(phosphatase)에 의해 탈인산화될 수 있는 도메인이다. 이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 아르기닌 인산화 도메인은 아르기닌 인산화효소의 기질에서 유래한 것, 예를 들어 McsB (Arg kinase)의 실제 기질로 알려진 CtsR에서 유래한 것일 수 있다. 보다 구체적인 예로는 상기 아르기닌 인산화 도메인은 서열번호 12를 포함하거나 서열번호 12로 이루어진 것일 수 있다.In the present invention, the "arginine phosphorylation domain" is a domain containing arginine that can be phosphorylated/dephosphorylated by a sensor. That is, the domain includes arginine and is phosphorylated by arginine kinase and dephosphorylated by phosphorylated arginine dephosphorylation enzyme (phosphatase). Accordingly, according to one embodiment of the present invention, the arginine phosphorylation domain may be derived from a substrate of arginine kinase, for example, derived from CtsR known as an actual substrate of McsB (Arg kinase). As a more specific example, the arginine phosphorylation domain may include SEQ ID NO: 12 or consist of SEQ ID NO: 12.

FRET 센서에서 링커(linker)는 FRET 센서를 구성하는 형광체 단백질이나 도메인들을 연결시키기 위한 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 FRET 센서는 상기 아르기닌 인산화 도메인에 연결된 “제1 링커”를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 링커는 상기 아르기닌 인산화 도메인과 상기 수용 형광체 단백질의 사이를 연결하는 것일 수 있다. In a FRET sensor, a linker is used to connect phosphor proteins or domains constituting the FRET sensor. According to one embodiment of the present invention, the FRET sensor of the present invention may include a “first linker” linked to the arginine phosphorylation domain. Specifically, the first linker may connect the arginine phosphorylation domain and the acceptor phosphor protein.

본 발명에 따르면 상기 제1 링커의 길이나 구성에 따라 FRET 센서의 효율이 달라질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 제1 링커는 6개 아미노산 잔기 이상 내지는 36개 아미노산 잔기 이하의 길이, 예를 들어 6개 아미노산 잔기 이상 내지는 30개 아미노산 잔기 이하의 길이를 갖는 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면 상기 제1 링커는 12개 아미노산 잔기의 길이를 가질 때 FRET 변화량이 가장 컸으며 이는 센서 성능이 가장 우수하다는 것을 의미한다. According to the present invention, the efficiency of the FRET sensor may vary depending on the length or configuration of the first linker. According to one embodiment of the present invention, the first linker may have a length of 6 amino acid residues or more to 36 amino acid residues or less, for example, 6 amino acid residues or more to 30 amino acid residues or less. According to an embodiment of the present invention, when the first linker has a length of 12 amino acid residues, the FRET change amount is the largest, which means that the sensor performance is the best.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 제1 링커는 아르기닌을 포함하는 것일 수 있다. 이와 같이 제1 링커에 아르기닌을 포함시킴으로써 아르기닌 인산화/탈인산화에 따른 신호 감도가 개선될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 제1 링커는 1 내지 3개의 아르기닌을 포함할 수 있으며, 예를 들어 SGIR의 아미노산 서열을 전체 아미노산 서열 중의 임의 위치에 포함하는 것, 구체적으로 SGIR의 아미노산 서열을 제1 링커의 전체 아미노산 서열의 말단, 예컨대 아르기닌 인산화 도메인에 연결되는 말단에 포함하거나 상기 제1 링커의 전체 아미노산 서열의 임의 중간부에 포함하는 것일 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 제1 링커는 GGSGGS 의 아미노산 서열을 1회 또는 2 내지 3회 반복하여 포함하는 것일 수 있으며, 더 구체적으로는, 상기 제1 링커는 서열번호 1 내지 서열번호 9 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1 내지 서열번호 9 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.Also, according to one embodiment of the present invention, the first linker may include arginine. As such, signal sensitivity according to arginine phosphorylation/dephosphorylation can be improved by including arginine in the first linker. According to one embodiment of the present invention, the first linker may include 1 to 3 arginines, for example, including the amino acid sequence of SGIR at any position in the entire amino acid sequence, specifically the amino acid sequence of SGIR It may be included at the end of the entire amino acid sequence of the first linker, for example, at the end connected to the arginine phosphorylation domain, or included in any middle part of the entire amino acid sequence of the first linker. As a specific example, the first linker may include the amino acid sequence of GGSGGS repeated once or 2 to 3 times, and more specifically, the first linker is any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 It may include the amino acid sequence or consist of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9.

본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 FRET 센서는 상기 인산화 아르기닌 결합 도메인에 연결된 제2 링커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 링커는 상기 인산화 아르기닌 결합 도메인과 상기 아르기닌 인산화 도메인의 사이를 연결하는 것일 수 있다. 상기 제2 링커는 반드시 포함될 필요는 없으나, 포함될 경우라면 상기 제1 링커에 비해 길이가 짧은 것이 센서 성능 측면에서 더 바람직하다. 구체적인 예로서, 상기 제2 링커는 GGS의 아미노산 서열을 1회 내지 2 내지 4회 반복하여 포함하는 것일 수 있다. 더 구체적인 예로서, 상기 제2 링커는 서열번호 1, 2, 및 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the FRET sensor of the present invention may further include a second linker linked to the phosphorylated arginine binding domain. The second linker may connect between the phosphorylated arginine binding domain and the arginine phosphorylated domain. The second linker does not necessarily need to be included, but if included, it is more preferable in terms of sensor performance that the length is shorter than that of the first linker. As a specific example, the second linker may include the amino acid sequence of GGS repeated 1 to 2 to 4 times. As a more specific example, the second linker may include or consist of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 10.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 바와 같은 FRET 센서를 사용하는 것을 특징으로 하는, FRET에 기반하여 아르기닌의 인산화를 검출하는 방법이 제공된다. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting phosphorylation of arginine based on FRET, characterized by using the FRET sensor as described above.

상기 아르기닌의 인산화 검출 방법은 본 발명에 따른 FRET 센서를 측정 대상 시료와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 도 1의 (b)에서 볼 수 있듯이 본 발명에 따른 FRET 센서는 아르기닌 인산화에 의해 FRET 강도가 감소한다. 아르기닌 인산화효소의 활성에 따라 아르기닌기의 인산화 정도가 변화하므로, 인산화에 따른 FRET 변화량, 즉, 초기 FRET 강도 (예를 들어 측정 대상 시료와의 접촉 전의 초기 FRET 강도)에 비하여 FRET 강도가 감소한 정도로부터 아르기닌의 인산화 정도를 상대적 정량으로 측정할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 아르기닌 인산화 검출 방법은 FRET 강도의 감소량으로부터 아르기닌 인산화를 상대적 정량으로 검출하는 단계를 포함할 수 있다. FRET의 켜짐에 의해 인산화를 측정하는 센서의 경우, 초기에 FRET 이 없기 때문에 실험시 인산화에 의한 FRET 증가가 없다고 하더라도 이것이 인산화가 이루어지지 않은 환경으로 인한 것인지 센서가 불량하기 때문인지를 확인하기가 어렵다. 그러나 본 발명에서와 같이 FRET 감소량으로부터 인산화를 측정하는 방법의 경우, 초기에 FRET이 있는 상태에서 실험을 실시하므로 FRET 센서가 불량하여 작동하지 않는 것인지 여부를 쉽게 판별할 수 있다는 장점이 있다. The method for detecting phosphorylation of arginine may include contacting the FRET sensor according to the present invention with a sample to be measured. As can be seen in (b) of FIG. 1, the FRET sensor according to the present invention has a decrease in FRET intensity due to arginine phosphorylation. Since the degree of phosphorylation of the arginine group changes according to the activity of arginine kinase, the amount of FRET change according to phosphorylation, that is, the initial FRET intensity (eg, the initial FRET intensity before contact with the sample to be measured). The degree of phosphorylation of arginine can be measured as a relative quantification. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the method for detecting arginine phosphorylation of the present invention is a relative quantification of arginine phosphorylation from the decrease in FRET intensity. detection may be included. In the case of a sensor that measures phosphorylation by turning on FRET, since there is no FRET at the beginning, even if there is no increase in FRET due to phosphorylation during the experiment, it is difficult to determine whether this is due to an environment in which phosphorylation is not achieved or because the sensor is poor. . However, in the case of the method of measuring phosphorylation from the amount of FRET reduction as in the present invention, since the experiment is initially conducted in the presence of FRET, it has the advantage of being able to easily determine whether or not the FRET sensor is not working due to a defect.

또한, 본 발명에 따른 FRET 센서는 인산화 아르기닌의 탈인산화에 의해 FRET 강도가 증가한다. 인산화 아르기닌 탈인산화효소의 활성에 따라 인산화 아르기닌기의 탈인산화 정도가 변화하므로, 탈인산화에 따른 FRET 변화량으로부터 탈인산화 정도를 상대적 정량으로 측정할 수 있다. 이에 본 발명에 따른 FRET 센서는 인산화 아르기닌의 탈인산화 검출 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 FRET 강도의 증가량으로부터 인산화 아르기닌의 탈인산화를 상대적 정량으로 검출하는 단계를 포함할 수 있다. In addition, the FRET sensor according to the present invention increases the FRET intensity by dephosphorylation of phosphorylated arginine. Since the degree of dephosphorylation of the phosphorylated arginine group changes according to the activity of the phosphorylated arginine dephosphorylation enzyme, the degree of dephosphorylation can be measured in a relative quantity from the amount of FRET change according to the dephosphorylation. Accordingly, the FRET sensor according to the present invention may be used in a method for detecting dephosphorylation of phosphorylated arginine, and the method may include a step of detecting dephosphorylation of phosphorylated arginine in a relative quantity based on an increase in FRET intensity.

또한, 이러한 본 발명의 FRET 센서는 in vitro 환경 뿐만 아니라 in vivo 환경에서도 작동하므로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 아르기닌 인산화 검출 방법은 살아있는 세포에서 아르기닌 인산화를 검출하는데 사용될 수 있다.In addition, since the FRET sensor of the present invention operates not only in an in vitro environment but also in an in vivo environment, the method for detecting arginine phosphorylation according to one embodiment of the present invention can be used to detect arginine phosphorylation in living cells.

또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 바와 같은 FRET 센서를 사용하는 것을 특징으로 하는, 아르기닌 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 또다른 일 양태에 따르면 전술한 바와 같은 FRET 센서를 사용하는 것을 특징으로 하는, 아르기닌 인산화효소 저해제의 스크리닝용 키트가 제공된다.In addition, according to another aspect of the present invention, there is provided a screening method for arginine kinase inhibitors, characterized in that using the FRET sensor as described above. In addition, according to another aspect of the present invention, a kit for screening an arginine kinase inhibitor characterized by using the FRET sensor as described above is provided.

상기 스크리닝 방법 및 스크리닝용 키트는 아르기닌 인산화효소 저해제 후보물질과 아르기닌 인산화효소를 본 발명의 FRET 센서와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아르기닌 인산화효소 저해제 후보물질과 상기 아르기닌 인산화효소를 먼저 접촉시킨 후, 상기 FRET 센서와 접촉시킬 수 있다. 여기서, 상기 저해제 후보물질과 상기 아르기닌 인산화효소의 접촉은 인큐베이팅일 수 있다. 본 발명의 FRET 센서에 의하면 인산화를 형광에 의해 쉽게 판별할 수 있으므로 96 well-plate 등을 사용하여 다량의 샘플을 동시에 측정하는데 이용될 수 있다. 따라서, 상기 스크리닝 방법 및 스크리닝용 키트는 고속 스크리닝 방법 및 키트일 수 있다.The screening method and kit for screening may include a step of contacting an arginine kinase inhibitor candidate and an arginine kinase with the FRET sensor of the present invention. According to one embodiment of the present invention, the arginine kinase inhibitor candidate material and the arginine kinase may be brought into contact with the FRET sensor first. Here, the contact between the inhibitor candidate and the arginine kinase may be incubation. According to the FRET sensor of the present invention, since phosphorylation can be easily determined by fluorescence, it can be used to simultaneously measure a large amount of samples using a 96 well-plate or the like. Therefore, the screening method and kit for screening may be a high-speed screening method and kit.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 참고하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

[실시예 1] FRET 센서의 제조 [Example 1] Preparation of FRET sensor

서열번호 13의 FRET 센서를 코딩하는 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)-pLys 균주에 형질전환시켰다. 암피실린 (50 mg/mL)을 첨가한 5 mL LB 배지에서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다. 200 mL의 배지에 2 mL를 접종하여 하룻밤 동안 배양하고 O.D.600가 0.2에 이를때까지 성장시켰다. 박테리아를 0.1 mM IPTG 으로 18℃, 200 rpm에서 20 시간 동안 유도한 후 원심분리 (4000 g, 30 min at 4℃)하여 수확하였다. 세포 펠릿을 4 ml의 pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 및 2 mM PMSF 중에 재현탁하고 3분 동안 초음파 처리하였다 (45% amplitude, 2초 펄스와 3초 휴지기를 36회). 불용성 세포 부산물은 4℃에서 30분 동안 4,000 g에서 원심분리하여 제거하였다. pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸을 포함한 평형 버퍼를 사용하여 Ni-NTA (Thermofisher)를 안정화시켰다. 상층액을 2ml의 Ni-NTA슬러리에 로딩하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. Ni-NTA 칼럼을 10 칼럼 부피의 평형 버퍼로 세척하였다. FRET 단백질을 5 ml의 pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 및 200 mM 이미다졸 버퍼로 용리하였다. 160분에 걸쳐 pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 버퍼, 1 ml/min 로 사이즈 배제 크로마토그래피(HiLoad® 16/600 Superdex® 75 pg, Cytiva)로 추가 정제하였다. 목적 분획을 수집하고 농축하였다 (Amicon Ultra centrifugal filter units, Ultra-15, MWCO 10 kDa, Millipore). FRET 단백질을 분주하고 -80℃에서 보관하였다.A plasmid encoding the FRET sensor of SEQ ID NO: 13 was transformed into E. coli BL21(DE3)-pLys strain. It was grown overnight at 37°C in 5 mL LB medium supplemented with ampicillin (50 mg/mL). 2 mL was inoculated into 200 mL of medium, cultured overnight, and grown until OD600 reached 0.2. Bacteria were harvested by centrifugation (4000 g, 30 min at 4°C) after induction with 0.1 mM IPTG at 18°C, 200 rpm for 20 hours. Cell pellets were resuspended in 4 ml of pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, and 2 mM PMSF and sonicated for 3 minutes (45% amplitude, 36 cycles of 2 s pulses and 3 s pauses). Insoluble cell debris was removed by centrifugation at 4,000 g for 30 min at 4°C. Ni-NTA (Thermofisher) was stabilized using an equilibration buffer containing pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl and 20 mM imidazole. The supernatant was loaded into 2 ml of Ni-NTA slurry and incubated for 1 hour at room temperature. The Ni-NTA column was washed with 10 column volumes of equilibration buffer. FRET protein was eluted with 5 ml of pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, and 200 mM imidazole buffer. It was further purified by size exclusion chromatography (HiLoad® 16/600 Superdex® 75 pg, Cytiva) at pH 7.5 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl buffer, 1 ml/min over 160 minutes. The target fractions were collected and concentrated (Amicon Ultra centrifugal filter units, Ultra-15, MWCO 10 kDa, Millipore). FRET protein was aliquoted and stored at -80°C.

[실시예 2] FRET 센서에 의한 아르기닌 인산화 측정 [Example 2] Measurement of arginine phosphorylation by FRET sensor

제1 링커 및 제2 링커의 서열이 다음의 표 1에서 보는 바와 같은 것을 제외하고는 전술한 실시예 1 에서와 동일한 방식으로 FRET 센서를 준비하고, 이를 McsB (아르기닌 인산화효소), ATP 및 Mg2+와 함께 60분간 30℃에서 배양하여 FRET 변화량 (즉, 인산화에 의한 FRET 감소 비율)을 측정하였다.A FRET sensor was prepared in the same manner as in Example 1, except that the sequences of the first linker and the second linker were as shown in Table 1 below, and McsB (arginine kinase), ATP and Mg 2 + was incubated at 30° C. for 60 minutes to measure the amount of FRET change (ie, FRET reduction rate due to phosphorylation).

[표 1][Table 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

센서 1번, 2번 (아미노산 잔기 총수 12개)를 비교하면 센서 2의 감도가 더 우수한데 이로부터 제1 링커의 길이가 FRET 변화를 이용한 센서의 감도를 높이는데 더 중요하다는 것을 알 수 있다.Comparing sensors No. 1 and No. 2 (total number of amino acid residues of 12), the sensitivity of sensor 2 is superior, indicating that the length of the first linker is more important in increasing the sensitivity of the sensor using FRET change.

또한, 센서 3번과 4번 (아미노산 잔기 총수 16개)는 센서 내에 인산화될 수 있는 Arg(아르기닌)을 링커에 추가함으로써 센서의 인산화 정도를 늘어나서 감도에 변화가 발생하는지를 알아보기 위한 것이다. 센서 3번은 Arg 이 없는 4개 아미노산 서열을 추가한 것 (SGIK 추가)인데 4개의 아미노산 서열을 추가하더라도 아미노산 길이 12개인 센서 2번과 FRET 변화량의 차이가 없음을 알 수 있고, 이는 해당 아미노산 서열 추가에 의해 아미노산 길이가 변화하더라도 인산화에 의한 FRET 변화에 영향이 없다는 것을 의미한다. 한편, Arg을 포함하는 4개 아미노산 서열을 추가하였을 때 (센서 4번, SGIR 추가), 인산화에 의한 FRET 변화가 더 극적으로 일어나는 것이 관찰된다 (센서 3번과 센서 4번의 비교). 이로부터 링커에 추가적인 아르기닌을 도입함으로써 센서의 감도가 향상된다는 것을 알 수 있다.In addition, sensors No. 3 and No. 4 (total number of amino acid residues of 16) are added to the linker Arg (arginine), which can be phosphorylated in the sensor, to increase the phosphorylation degree of the sensor to determine whether a change in sensitivity occurs. Sensor No. 3 is obtained by adding 4 amino acid sequences without Arg (SGIK addition). Even if 4 amino acid sequences are added, it can be seen that there is no difference in FRET change amount from sensor No. 2, which has a length of 12 amino acids. This means that even if the amino acid length is changed by , there is no effect on the FRET change due to phosphorylation. On the other hand, when a 4 amino acid sequence including Arg was added (sensor No. 4, SGIR added), it was observed that a more dramatic FRET change due to phosphorylation occurred (comparison between sensor No. 3 and sensor No. 4). From this, it can be seen that the sensitivity of the sensor is improved by introducing additional arginine into the linker.

센서 5번, 6번, 7번은 링커의 총 길이를 늘려서 유연성(flexibility)를 높인 것이다. 이들은 링커 길이가 더 짧은 센서 4번에 비해 효율이 떨어진다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 링커의 총 길이가 이보다 짧은 것이 더 유리함을 알 수 있다. 여기에서도 제1 링커의 길이가 늘어날수록 인산화 효소의 센서 감도가 더 좋아지는 것을 확인할 수 있다.Sensors 5, 6, and 7 increase flexibility by increasing the total length of the linker. It can be seen that they are less efficient than sensor No. 4, which has a shorter linker length. Therefore, it can be seen that it is more advantageous that the total length of the linker is shorter than this. Here, too, it can be seen that the sensor sensitivity of the kinase increases as the length of the first linker increases.

본 실험으로부터 제1 링커와 제2 링커를 포함하는 링커 전체의 길이는 짧을수록, 같은 링커 총 길이를 가지는 경우 제1 링커가 길어질수록, 또한 링커에 아르기닌이 추가될수록 센서의 감도가 좋아진다는 것을 알 수 있다.From this experiment, the shorter the length of the entire linker including the first linker and the second linker, the longer the first linker when having the same total linker length, and the more arginine is added to the linker, the better the sensitivity of the sensor. Able to know.

[실시예 3] 링커 길이의 최적화[Example 3] Optimization of linker length

본 실시예에서는 제1 링커와 제2 링커에서 아미노산 잔기수, 즉, 링커 길이에 따른 FRET 강도를 측정하였다. 동일한 아미노산 서열 반복 단위를 포함하도록 링커 서열을 구성하고, 각 링커에서의 아미노산 잔기수만 변화한 FRET 센서를 사용하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 0/12, 12/0, 6/6 등은 제2 링커에서의 아미노산 잔기수/제1 링커에서의 아미노산 잔기수를 의미한다. "FRET-linker 0/12 + inactive McsB"가 불활성 인산화효소를 사용한 초기 FRET을 나타내며, 이와 비교하여 FRET 이 감소하면 인산화가 이루어졌다는 것을 의미한다. In this Example, FRET intensity was measured according to the number of amino acid residues in the first linker and the second linker, that is, the length of the linker. A linker sequence was constructed to include repeating units of the same amino acid sequence, and a FRET sensor in which only the number of amino acid residues in each linker was changed was used, and the results are shown in FIG. 2 . In FIG. 2, 0/12, 12/0, 6/6, etc. means the number of amino acid residues in the second linker/the number of amino acid residues in the first linker. "FRET-linker 0/12 + inactive McsB" indicates initial FRET using an inactive kinase, and a decrease in FRET compared to this means that phosphorylation has been achieved.

"FRET linker-0/12 + McsB"가 가장 큰 변화량을 나타내었으며, 이는 "FRET linker-12/0 + McsB", "FRET linker-6/6 + McsB"에 비하여 FRET 효율이 현저히 더 우수하였고, 이로부터 제1 링커의 길이가 FRET 효율에 큰 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. "FRET linker-0/12 + McsB" showed the largest amount of change, which was significantly better in FRET efficiency than "FRET linker-12/0 + McsB" and "FRET linker-6/6 + McsB", From this, it can be seen that the length of the first linker has a great effect on the FRET efficiency.

다만, 제2 링커와 제1 링커의 총 길이가 "FRET linker-12/12 + McsB", "FRET linker-9/15 + McsB" 등에서와 같이 길어지면 FRET 효율이 저하되므로 전체 링커의 길이는 짧은게 더 유리하다는 것을 알 수 있다. However, if the total length of the second linker and the first linker becomes longer as in "FRET linker-12/12 + McsB", "FRET linker-9/15 + McsB", etc., FRET efficiency decreases, so the total length of the linker is short. It can be seen that it is more advantageous.

최적의 "제2 링커/제1링커" 길이는 "0/12" 였다.The optimal "second linker/first linker" length was "0/12".

[실시예 4] 링커에서의 아르기닌 개수/위치에 따른 영향[Example 4] Effect of number/position of arginine in linker

본 실시예에서는 실시예 3에서 사용한 "FRET linker-0/12" 링커를 사용하되, 제1 링커에 아르기닌을 추가하지 않거나(#0), 1 또는 2개 추가한(#1', #1, #2) FRET 센서에 있어서 시간에 따른 형광 변화를 알아보았다.In this example, the "FRET linker-0/12" linker used in Example 3 is used, but arginine is not added to the first linker (#0) or one or two are added (#1', #1, #2) Fluorescence change over time was investigated in the FRET sensor.

"#2 + inactive McsB"가 기준이며, 아르기닌을 추가하지 않은 경우에 비해 아르기닌을 추가함으로써 형광이 더 많이 감소하여 FRET 센서가 잘 작동한다는 것을 알 수 있다. 다만, 아르기닌을 추가하는 위치를 다르게 한 경우끼리는 FRET 변화량의 차이가 크지 않았다. "#2 + inactive McsB" is the standard, and it can be seen that the FRET sensor works well because the fluorescence is reduced more by adding arginine compared to the case where arginine is not added. However, the difference in the amount of FRET change was not significant between the cases where the position of adding arginine was different.

이로부터 링커에 아르기닌을 추가하는 것이 FRET 효율을 증가시킬 수 있으며 이 때 아르기닌의 추가 개수가 많을수록 효율이 더 크게 개선될 수 있어서 효소 활성 측정에 유리한 것을 알 수 있다. 링커 내에서 아르기닌의 위치는 FRET 효율에 큰 영향을 주지 않았다.From this, it can be seen that adding arginine to the linker can increase the FRET efficiency, and at this time, the greater the number of additional arginines, the greater the efficiency can be improved, which is advantageous in measuring the enzyme activity. The position of arginine within the linker did not significantly affect the FRET efficiency.

[실시예 5] (in vitro) 다양한 조건에서의 인산화 활성 측정[Example 5] (in vitro) Measurement of phosphorylation activity under various conditions

본 실시예에서는 실시예 3에서 사용한 "FRET linker-0/12" 링커를 포함하는 FRET 센서를 사용하되, 탈인산화효소 YwlE, ADP, 또는 PK+PEP 처리와 같은 다양한 조건에서 FRET 강도의 변화를 관찰하였다.In this example, a FRET sensor including the "FRET linker-0/12" linker used in Example 3 is used, but changes in FRET intensity are observed under various conditions such as dephosphorylation enzyme YwlE, ADP, or PK + PEP treatment did

도 4에서 보는 바와 같이 인산화의 진행 (형광 감소) 중에 YwlE, ADP, 또는 PK-PEP 처리를 실시하였다. YwlK 첨가에 의해 형광이 증가하였으며 이는 YwlK 와 같은 탈인산화효소 처리시 탈인산화 정도를 본 발명의 FRET 센서로 측정 가능하다는 것을 의미한다. 또한, ADP 처리에 의한 형광 증가로부터 아르기닌 인산화효소인 McsB의 reversibility 도 본 발명의 FRET 센서로 관찰 가능하다는 것을 알 수 있다. PK-PEP 처리로 반응 부산물인 ADP로부터 ATP의 재생산에 의한 추가적 인산화도 관찰되었다.As shown in FIG. 4, YwlE, ADP, or PK-PEP treatment was performed during phosphorylation (decreased fluorescence). Fluorescence was increased by the addition of YwlK, which means that the degree of dephosphorylation when treated with a dephosphorylation enzyme such as YwlK can be measured with the FRET sensor of the present invention. In addition, it can be seen that the reversibility of McsB, an arginine kinase, can also be observed with the FRET sensor of the present invention from the fluorescence increase by ADP treatment. Additional phosphorylation by regeneration of ATP from ADP, a reaction by-product, was also observed with PK-PEP treatment.

[실시예 6] (in vivo) 살아있는 세포에서의 아르기닌 인산화 효소 활성 실시간 관찰[Example 6] Real-time observation of arginine kinase activity in (in vivo) living cells

살아있는 세포 내에서 FRET 센서가 작동하는지 여부 및 FRET 센서에 의해 살아있는 세포 내에서의 인산화를 실시간으로 관찰할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 실험을 실시하였다. An experiment was conducted to determine whether the FRET sensor works in living cells and whether phosphorylation in living cells can be observed in real time by the FRET sensor.

본 실시예에서는 실시예 3에서 사용한 "FRET linker-0/12" 링커를 포함하는 FRET 센서를 사용하였으며, 이를 살아있는 세포 내에서 투입하고 형광이 발생하는지 여부를 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5로부터 FRET이 작동하여 형광이 발생한다는 것을 확인할 수 있다. In this example, a FRET sensor including the “FRET linker-0/12” linker used in Example 3 was used, and it was introduced into living cells and fluorescence was observed with a confocal microscope. The results are shown in FIG. 5 . It can be seen from FIG. 5 that FRET operates and fluorescence is generated.

한편, 아르기닌 인산화효소는 열 스트레스(Heat stress)를 부여할 경우 활성화된다는 것이 알려져 있다. 실제 세포 내에 있는 endogenous McsB의 활성을 관찰하기 위해 FRET 센서를 세포 내에서 발현시켰다. endogenous McsB를 활성화시키기 위해 세포에 50℃의 열 스트레스를 가하였다. 열 스트레스를 가하기 전과 후의 FRET 효율 변화를 도 6과 도 7에 나타내었다. 도 6과 7로부터 열 스트레스를 가할 경우 FRET 시그널이 감소된다는 것을 확인할 수 있다. 이는 인산화 아르기닌 효소가 활성화되었음을 살아있는 세포에서 실시간으로 측정할 수 있다는 것을 의미한다.Meanwhile, it is known that arginine kinase is activated when heat stress is applied. To observe the activity of endogenous McsB in actual cells, FRET sensors were expressed in cells. To activate endogenous McsB, cells were subjected to heat stress at 50°C. Changes in FRET efficiency before and after applying thermal stress are shown in FIGS. 6 and 7 . It can be seen from FIGS. 6 and 7 that the FRET signal is reduced when thermal stress is applied. This means that the activation of phosphorylated arginine enzyme can be measured in real time in living cells.

<110> UNIST(ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> FRET Biosensor for Measuring Arginine Phosphorylation and Uses thereof <130> PD21-310 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #1 <400> 1 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #2 <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #3 <400> 3 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #4 <400> 4 Ser Gly Ile Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #5 <400> 5 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #6 <400> 6 Ser Gly Ile Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ile Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #7 <400> 7 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #8 <400> 8 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ile Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser 20 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #9 <400> 9 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ile Arg Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 20 25 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #10 <400> 10 Gly Gly Ser 1 <210> 11 <211> 150 <212> PRT <213> pArg binding domain <400> 11 Met Pro Tyr Arg Ile Leu Phe Val Ala Thr Gly Asn Thr Cys Arg Ser 1 5 10 15 Pro Met Ala Ala Ala Leu Leu Glu Asn Lys Gln Leu Pro Gly Val Glu 20 25 30 Val Lys Ser Ala Gly Val Trp Ala Ala Glu Gly Ser Glu Ala Ser Val 35 40 45 His Ala Lys Met Val Leu Lys Glu Lys Gly Ile Glu Ala Ala His Arg 50 55 60 Ser Ser Gln Leu Lys Lys Glu His Ile Asp Trp Ala Thr His Val Leu 65 70 75 80 Ala Met Thr Ser Gly His Lys Asp Met Ile Val Glu Arg Phe Pro Glu 85 90 95 Ala Lys Asp Lys Thr Phe Thr Leu Lys Gln Phe Val Ser Gly Thr Asp 100 105 110 Gly Asp Ile Ala Asp Pro Phe Gly Gly Pro Ile Glu Val Tyr Arg Ala 115 120 125 Ala Arg Asp Glu Leu Glu Thr Leu Ile Asp Arg Leu Ala Glu Lys Leu 130 135 140 Gln Thr Glu Gln Leu Glu 145 150 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Arg phosphorylation domain <400> 12 Thr Ile Val Glu Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Lys Ile Ile 1 5 10 15 Lys Ile <210> 13 <211> 687 <212> PRT <213> FRET biosensor for Arg Phosphorylation <400> 13 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val 20 25 30 Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe 35 40 45 Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr 50 55 60 Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr 65 70 75 80 Leu Val Thr Thr Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro 85 90 95 Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly 100 105 110 Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys 115 120 125 Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile 130 135 140 Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His 145 150 155 160 Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp 165 170 175 Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile 180 185 190 Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro 195 200 205 Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr 210 215 220 Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val 225 230 235 240 Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu 245 250 255 Leu Tyr Lys Ser Gly Ile Arg Met Pro Tyr Arg Ile Leu Phe Val Ala 260 265 270 Thr Gly Asn Thr Cys Arg Ser Pro Met Ala Ala Ala Leu Leu Glu Asn 275 280 285 Lys Gln Leu Pro Gly Val Glu Val Lys Ser Ala Gly Val Trp Ala Ala 290 295 300 Glu Gly Ser Glu Ala Ser Val His Ala Lys Met Val Leu Lys Glu Lys 305 310 315 320 Gly Ile Glu Ala Ala His Arg Ser Ser Gln Leu Lys Lys Glu His Ile 325 330 335 Asp Trp Ala Thr His Val Leu Ala Met Thr Ser Gly His Lys Asp Met 340 345 350 Ile Val Glu Arg Phe Pro Glu Ala Lys Asp Lys Thr Phe Thr Leu Lys 355 360 365 Gln Phe Val Ser Gly Thr Asp Gly Asp Ile Ala Asp Pro Phe Gly Gly 370 375 380 Pro Ile Glu Val Tyr Arg Ala Ala Arg Asp Glu Leu Glu Thr Leu Ile 385 390 395 400 Asp Arg Leu Ala Glu Lys Leu Gln Thr Glu Gln Leu Glu Thr Ile Val 405 410 415 Glu Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Lys Ile Ile Lys Ile Ser 420 425 430 Gly Ile Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr 435 440 445 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 450 455 460 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 465 470 475 480 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 485 490 495 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 500 505 510 Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 515 520 525 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 530 535 540 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 545 550 555 560 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 565 570 575 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 580 585 590 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 595 600 605 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 610 615 620 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 625 630 635 640 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 645 650 655 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 660 665 670 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 675 680 685 <110> UNIST (ULSAN NATIONAL INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) <120> FRET Biosensor for Measuring Arginine Phosphorylation and Uses its <130> PD21-310 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #1 <400> 1 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #2 <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #3 <400> 3 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #4 <400> 4 Ser Gly Ile Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #5 <400> 5 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #6 <400> 6 Ser Gly Ile Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ile Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser 20 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #7 <400> 7 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #8 <400> 8 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ile Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser 20 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #9 <400> 9 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ile Arg Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 20 25 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Amino Acid Linker #10 <400> 10 Gly Gly Ser One <210> 11 <211> 150 <212> PRT <213> pArg binding domain <400> 11 Met Pro Tyr Arg Ile Leu Phe Val Ala Thr Gly Asn Thr Cys Arg Ser 1 5 10 15 Pro Met Ala Ala Ala Leu Leu Glu Asn Lys Gln Leu Pro Gly Val Glu 20 25 30 Val Lys Ser Ala Gly Val Trp Ala Ala Glu Gly Ser Glu Ala Ser Val 35 40 45 His Ala Lys Met Val Leu Lys Glu Lys Gly Ile Glu Ala Ala His Arg 50 55 60 Ser Ser Gln Leu Lys Lys Glu His Ile Asp Trp Ala Thr His Val Leu 65 70 75 80 Ala Met Thr Ser Gly His Lys Asp Met Ile Val Glu Arg Phe Pro Glu 85 90 95 Ala Lys Asp Lys Thr Phe Thr Leu Lys Gln Phe Val Ser Gly Thr Asp 100 105 110 Gly Asp Ile Ala Asp Pro Phe Gly Gly Pro Ile Glu Val Tyr Arg Ala 115 120 125 Ala Arg Asp Glu Leu Glu Thr Leu Ile Asp Arg Leu Ala Glu Lys Leu 130 135 140 Gln Thr Glu Gln Leu Glu 145 150 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Arg phosphorylation domain <400> 12 Thr Ile Val Glu Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Lys Ile Ile 1 5 10 15 Lys Ile <210> 13 <211> 687 <212> PRT <213> FRET biosensor for Arg Phosphorylation <400> 13 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val 20 25 30 Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe 35 40 45 Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr 50 55 60 Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr 65 70 75 80 Leu Val Thr Thr Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro 85 90 95 Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly 100 105 110 Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys 115 120 125 Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile 130 135 140 Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His 145 150 155 160 Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp 165 170 175 Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile 180 185 190 Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro 195 200 205 Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr 210 215 220 Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val 225 230 235 240 Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu 245 250 255 Leu Tyr Lys Ser Gly Ile Arg Met Pro Tyr Arg Ile Leu Phe Val Ala 260 265 270 Thr Gly Asn Thr Cys Arg Ser Pro Met Ala Ala Ala Leu Leu Glu Asn 275 280 285 Lys Gln Leu Pro Gly Val Glu Val Lys Ser Ala Gly Val Trp Ala Ala 290 295 300 Glu Gly Ser Glu Ala Ser Val His Ala Lys Met Val Leu Lys Glu Lys 305 310 315 320 Gly Ile Glu Ala Ala His Arg Ser Ser Gln Leu Lys Lys Glu His Ile 325 330 335 Asp Trp Ala Thr His Val Leu Ala Met Thr Ser Gly His Lys Asp Met 340 345 350 Ile Val Glu Arg Phe Pro Glu Ala Lys Asp Lys Thr Phe Thr Leu Lys 355 360 365 Gln Phe Val Ser Gly Thr Asp Gly Asp Ile Ala Asp Pro Phe Gly Gly 370 375 380 Pro Ile Glu Val Tyr Arg Ala Ala Arg Asp Glu Leu Glu Thr Leu Ile 385 390 395 400 Asp Arg Leu Ala Glu Lys Leu Gln Thr Glu Gln Leu Glu Thr Ile Val 405 410 415 Glu Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Lys Ile Ile Lys Ile Ser 420 425 430 Gly Ile Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Thr 435 440 445 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 450 455 460 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 465 470 475 480 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 485 490 495 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 500 505 510 Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 515 520 525 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 530 535 540 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 545 550 555 560 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 565 570 575 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 580 585 590 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 595 600 605 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 610 615 620 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 625 630 635 640 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 645 650 655 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 660 665 670 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 675 680 685

Claims (20)

공여 형광체 단백질, 인산화 아르기닌 결합 도메인, 아르기닌 인산화 도메인, 상기 아르기닌 인산화 도메인에 연결된 제1 링커, 및 수용 형광체 단백질을 포함하는, 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 기반한 아르기닌 인산화 효소 또는 인산화 아르기닌 탈인산화 효소의 활성 측정용 센서.An arginine kinase or phosphorylation based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) comprising a donor phosphor protein, a phosphorylated arginine binding domain, an arginine phosphorylation domain, a first linker linked to the arginine phosphorylation domain, and an acceptor phosphor protein A sensor for measuring the activity of arginine dephosphorylation enzyme. 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 6개 아미노산 잔기 이상 36개 아미노산 잔기 이하의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the first linker has a length of 6 amino acid residues or more and 36 amino acid residues or less. 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 GGSGGS 의 아미노산 서열을 1회 또는 2 내지 3회 반복하여 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the first linker comprises the amino acid sequence of GGSGGS once or repeated 2 to 3 times. 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 1 내지 3개의 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the first linker comprises 1 to 3 arginines. 제4항에 있어서, 상기 제1 링커는 SGIR의 아미노산 서열을 제1 링커의 전체 아미노산 서열 중의 임의 위치에 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 4, wherein the first linker comprises the amino acid sequence of SGIR at any position in the entire amino acid sequence of the first linker. 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 서열번호 1 내지 서열번호 9 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the first linker comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9. 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 상기 아르기닌 인산화 도메인과 상기 수용 형광체 단백질의 사이를 연결하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the first linker connects the arginine phosphorylation domain and the acceptor phosphor protein. 제1항에 있어서, 상기 인산화 아르기닌 결합 도메인과 상기 아르기닌 인산화 도메인의 사이를 연결하는 제2 링커를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, further comprising a second linker connecting between the phosphorylated arginine binding domain and the arginine phosphorylated domain. 제8항에 있어서, 상기 제2 링커는 상기 제1 링커에 비해 길이가 짧은 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 8, wherein the second linker has a shorter length than that of the first linker. 제8항에 있어서, 상기 제2 링커는 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 8, wherein the second linker comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 10. 제1항에 있어서, 상기 인산화 아르기닌 결합 도메인은 인산화 아르기닌에 결합하는 CtsR, McsB, ClpP, 및 인산화 아르기닌 탈인산화효소 YwlE 중 어느 하나에서 유래된 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the phosphorylated arginine binding domain is derived from any one of CtsR, McsB, ClpP, and phosphorylated arginine dephosphorylase YwlE that binds to phosphorylated arginine. 제1항에 있어서, 상기 인산화 아르기닌 결합 도메인은 서열번호 11을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the phosphorylated arginine binding domain comprises SEQ ID NO: 11. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 인산화 도메인은 아르기닌 인산화효소의 기질에서 유래한 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the arginine phosphorylation domain is derived from a substrate of arginine kinase. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 인산화 도메인은 서열번호 12를 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, wherein the arginine phosphorylation domain comprises SEQ ID NO: 12. 제1항에 있어서, 상기 센서는 서열번호 13으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 센서.The sensor according to claim 1, characterized in that the sensor consists of SEQ ID NO: 13. 제1항에 기재된 센서를 사용하는 것을 특징으로 하는, FRET에 기반하여 아르기닌의 인산화를 검출하는 방법.A method for detecting phosphorylation of arginine based on FRET, characterized by using the sensor according to claim 1. 제16항에 있어서, FRET 강도의 감소량으로부터 아르기닌 인산화를 상대적 정량으로 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.17. The method of claim 16, comprising detecting arginine phosphorylation in a relative quantity from the decrease in FRET intensity. 제16항에 있어서, 살아있는 세포에서 아르기닌 인산화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.17. The method of claim 16, wherein arginine phosphorylation is detected in living cells. 제1항에 기재된 센서를 포함하는, 아르기닌 인산화효소 저해제의 스크리닝용 키트.For screening of an arginine kinase inhibitor comprising the sensor according to claim 1 kit. 제1항에 기재된 센서를 사용하는 것을 특징으로 하는, 아르기닌 인산화효소 저해제의 스크리닝 방법.A method for screening an arginine kinase inhibitor, characterized in that the sensor according to claim 1 is used.
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