KR20230047264A - 나노세리아 화합물 및 이의 제조방법 - Google Patents

나노세리아 화합물 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230047264A
KR20230047264A KR1020210129914A KR20210129914A KR20230047264A KR 20230047264 A KR20230047264 A KR 20230047264A KR 1020210129914 A KR1020210129914 A KR 1020210129914A KR 20210129914 A KR20210129914 A KR 20210129914A KR 20230047264 A KR20230047264 A KR 20230047264A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nanoceria
compound
osteoarthritis
chondrocytes
nce
Prior art date
Application number
KR1020210129914A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102648221B1 (ko
Inventor
김해원
이정환
한드마 다쉬냠
김광진
Original Assignee
단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 filed Critical 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority to KR1020210129914A priority Critical patent/KR102648221B1/ko
Publication of KR20230047264A publication Critical patent/KR20230047264A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102648221B1 publication Critical patent/KR102648221B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물에 관한 것이다. 골관절염은 과도한 ROS 생성, 심각한 염증 반응, 연골 및 연골하 골의 해부학적 파괴를 수반한다. 나노세리아(Nanoceria) 화합물은 항산화 활성을 유지하여 높은 ROS 조건에서 치료 효능을 발휘한다. 생체 내에서 관찰된 나노세륨의 이러한 치료 효과는 특히 골관절염 모방 연골세포/대식세포 공동 배양 모델을 포함하는 시험관내 실험과 병행하여 추가적으로 입증되었다.

Description

나노세리아 화합물 및 이의 제조방법{Nanoceria compound and preparing method of the same}
본 발명은 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 골관절염 관절에 국소적으로 주입되는 나노세리아의 용량을 최적화하여, 세포 사멸 및 염증의 억제 및 궁극적으로 연골 및 연골하 골의 회복에 대한 나노세리아 화합물의 효과를 심층적으로 분석하였다.
심각한 염증은 다양한 만성 질환 및 조직 기능 장애의 주요 원인을 구성하여 건강 관리에 심각한 문제를 야기한다. 골관절염(Osteoarthritis, OA)은 주로 국소 염증 또는 병리학적 기계적 스트레스에 의해 발생하며 관절에서 발생하는 가장 흔한 염증성 질환 중 하나이다.
골관절염 환경은 일반적으로 활성 산소 종(ROS)의 과잉 생산과 친염증성 사이토카인의 분비를 수반하며, 이는 세포의 항상성과 기능을 악화시켜 세포 사멸, 세포 외 분자 변성, 연골 및 과하골의 분해를 초래하여 궁극적으로 관절 기능과 일상 생활을 무력화시킨다. 따라서 골관절염의 치료 전략은 주로 염증 유발 사건을 개선하는 방법에 기초한다.
임상적으로 사용할 수 있는 옵션에는 관절에 스테로이드 또는 히알루론산을 관절 내 주사하는 것이 포함되며, 이는 염증 및 관련 통증을 완화하고 퇴행성 과정을 지연시키는 것을 목표로 하지만 차선책으로 간주된다. 이에 최근 많은 노력을 기울이고 있다.
예를 들어, 항-세포사멸적(anti-apoptotic) /-염증성 분자가 발견되거나 직접 치료하도록 설계되었다. 또한 약물 분자의 생물학적 안정성과 국소 기능을 향상시키기 위해 나노 입자, 마이크로 입자 및 주사 가능한 하이드로겔과 같은 전달 매개체를 개발하였다.
참고로, 생체 재료의 부류는 고유한 특성, 즉 촉매 및/또는 항산화(산소 조절) 활성을 나타내는 고유한 특성으로 인해 최근 강조되었으며, 이는 친염증성 과정을 약화시키는 데 중요한 역할을 하는 것으로 간주되어 OA의 무약물 요법에 사용될 수 있다.
나노세리아는 우수한 촉매, 항산화 및 ROS 소거 능력을 가진 이러한 종류의 생체 재료를 구성하며, 이는 주로 Ce4+/Ce3+ 산화환원 반응에서 파생된다.
ROS를 직접 소거하는 것과 함께 나노세리아는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 기타 항산화 효소의 활성을 조절하여 궁극적으로 자가 전파 자유 라디칼 및 세포 손상/사망에서 피드백 반응 주기를 방해하는 것으로 알려져 있다. 나노세리아의 치료 효과는 뇌허혈 뇌졸중, 류마티스 관절염(페라이트 포함) 및 척수 손상을 포함하여 염증이 우세한 여러 병리학적/외상 상태에서 입증되었다.
특허등록공보 제10-1990004호
한편, 조절된 산화 스트레스와 대식세포의 변형으로 인한 세포 사멸의 방지는 염증 및 퇴행성 상태를 회복 및 복구 단계로 전환할 가능성이 있는, 세포 및 분자 사건의 일부이다. 이러한 연구를 통해, 나노세리아가 염증성 골관절염에 대해서도 효과적일 수 있는지 검토되어 왔다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 나노세리아(nanoceria) 화합물은 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선할 수 있다.
나노세리아 화합물(이하, '나노세리아' 또는 'nCe'라 한다.)은 세륨(Ce)산화물인 세리아의 나노사이즈 화합물로, 본 발명에서 핵심을 이루는 요소이다. 세리아에 대해 보다 자세히 살펴보면 다음과 같다. 세리아(CeO2) 나노입자는 가역적으로 산소와 결합하고, CeO2 나노입자 표면에서 Ce3+ 및 Ce4+ 간의 산화상태 변화에 의해 자유라디칼 제거 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.
여기서, 상기 조직의 산화 스트레스(oxidative stress) 지표를 나타내는 iNOS(inducible Nitruc Oxide Synthase)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 관절 조직의 연골세포에서 ROS(Reactive Oxygen Species)의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
상기 골관절염에 의해 얇아진 상기 관절 조직의 연골층의 두께를 회복시키는 것을 특징으로 한다.
상기 관절 조직의 연골(cartilage) 및 연골하(subchondral) 골의 프로테오글리칸(proteoglycan)의 분해를 완화하는 것을 특징으로 한다.
상기 연골 및 연골하 골의 침식을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
상기 관절 조직에 포함된 연골세포의 생존율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.
상기 연골세포의 세포사멸(apoptotic)을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
항-세포사멸(anti-apoptotic)의 지표인 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)가 상향 조절되는 것을 특징으로 한다.
대식세포에 의한 상기 연골세포의 사멸을 방지하는 것을 특징으로 한다.
상기 대식세포에 의해 영향을 받는 상기 연골세포 내의 ROS(Reactive Oxygen Species) 수준을 하향 조절시키는 것을 특징으로 한다.
상기 골관절염에 의해 상기 관절 조직의 연골을 손상시키는 시클로옥시나아제 2(cyclooxygenase 2, COX2)와 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
상기 골관절염에 의한 퇴행 또는 손상에 대항하여 상기 관절 조직의 연골하(subchondral) 골을 보호하는 것을 특징으로 한다.
상기 나노세리아는 400 내지 600 μg/ml의 용량 범위에서 효과적으로 산화 스트레스를 줄이고, 연골세포의 분화를 촉진하며, 골관절염 변성으로부터 연골하 골을 보호하는 데 효과적이다.
상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선할 수 있는 나노세리아 (nanoceria) 화합물의 제조방법은, a) 질산암모늄세륨(Ce(NH4)2(NO3)6)과 헥사데실트리메틸암모늄브롬화물 (hexadecyltrimethylammonium bromide을 준비하는 단계와, b) 상기 질산암모늄세륨(Ce(NH4)2(NO3)6)과 헥사데실트리메틸암모늄브롬화물(hexadecyltrimethylammonium bromide)을 용매에 투입하고 분산 및 용해시켜 혼합용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용매는 탈이온수이되, 상기 탈이온수의 pH는 8.0인 것을 특징으로 한다.
상기 혼합용액을 140℃의 온도인 열수 반응기로 이동시켜 24시간동안 반응시켜 나노세리아 화합물을 합성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제조된 상기 나노세리아 화합물을 에탄올로 세척하고 80℃의 온도에서 24시간 동안 건조 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의할 경우, 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물이 제공된다.
또한, 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물의 제조방법이 제공된다.
도 1은 국부적으로 전달된 nCe가 골관절염 하악 관절의 병리학적 산화 스트레스를 감소시킨다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 2는 nCe는 골관절염 손상으로부터 연골층을 보호한다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 3은 nCe가 세포 사멸을 억제하여 산화 스트레스로부터 연골세포를 구한다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 4는 nCe가 항염증성 이벤트를 보조하여 대식세포를 조절하는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 5는 nCe에 의해 회수된 연골세포가 시험관 내에서 기능적 활성을 보존한다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 6은 nCe가 시험관내에서 연골세포와 친염증성 대식세포의 상호작용을 조절한다는 실험결과를나타낸 것이다.
도 7은 생체 내 골관절염 연골하 골 파괴는 nCe에 의해 방지된다는 실험결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] nCe 준비 및 특성화
nCe는 열수 방법을 사용하여 합성되었다. 요약하면, 0.1M의 헥사데실트리메틸암모늄(CTAB; Sigma) 및 1M 세륨(IV) 질산암모늄 [Ce(NH4)2(NO3)6, 99.9% 순도, Sigma]을 pH 8.0의 탈이온수(DW)에 용해시키고 얻어진 용액을 140℃에서 24시간 동안 열수 오토클레이브로 옮겼다.
nCe를 에탄올로 충분히 세척하고 원심분리하여 분리한 다음 공기 중에서 80℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 입자 크기, ζ-전위 및 표면적과 같은 물리화학적 특성은 이전에 설명한 대로 분석되었다. 요약하면, 입자의 평균 크기는 투과전자현미경 사진을 기준으로 19.5 nm이고 유체역학적 크기는 동적 광산란법으로 측정한 결과 28.4 nm였다.
ζ-전위는 17.5mV였고 표면적은 217m2/g이었다.
nCe의 산화효소 유사 활성은 다른 농도에서 1M H2O2에 대한 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 기반(TMB) 촉매 분석을 사용하여 테스트되었다. 이를 위해 320μg/mL까지 다양한 농도로 제조된 nCe를 TMB 용액에 첨가하고 혼합물 용액을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
그 후, UV-vis 분광법에 의해 652nm의 흡수에서 TMB의 청색으로의 촉매 산화를 분석하였다.
프로토콜에 따라 SOD 분석 키트(STA-340)를 사용하여 다양한 농도(40, 80, 160 및 320 μg/mL)에서 nCe의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(dismutase) 모방(SOD) 활성을 조사하였다. 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH(1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) 키트로 측정하였다. nCe로의 FITC-접합은 생체 내 존재를 추적하기 위해 수행되었다. 이를 위해 나노세리아를 APTES에 의해 양성자화한 후 FITC와 결합시켰다.
[실시예 2] 생체 내 골관절염 모델 및 nCe 주입
생체 내 실험 절차는 대한민국 단국대학교 동물관리이용위원회에서 제정한 지침에 따라 검토 및 입증되었다. Sprague-Dawley 쥐(수컷, 8주)를 측두하악 관절(TMJ) 골관절염 모델에 사용하였다.
쥐는 제어된 습도(30 - 70%)와 온도(20 - 24℃)로 12시간 명암 주기로 유지되었다.
케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg) 혼합액을 근육주사하여 쥐를 마취시킨 후, 상부관절강에 Complete Freund's Adjuvant(CFA; 15μg/mL)를 20μL 주사하여 해밀턴 주사기가 있는 30게이지 바늘을 이용하여 염증성 골관절염을 유도하였다.
3일 후, 다양한 농도(인산염 완충 식염수 중 250, 500, 1000, 2000μg/mL)로 제조된 nCe를 관절 활막강에 30μL 주입 부피로 주입했다(각 그룹에 대해 n = 4).
[실시예 3] microCT 및 조직학에 의한 생체 내 분석
희생 후 TMJ 과두를 분리한 다음 일정한 교반 하에 24시간 동안 고정시켰다. 골 조직은 μCT 분석으로 평가되었다.
조직 샘플은 전류 385μA, 전압 65kV의 X선으로 카메라 픽셀 크기 12.56μm에서 μCT 스캐너(Skyscan 1176, Skyscan, Belgium)를 사용하여 스캔하였다.
컴퓨터 분석 프로그램(CTAn Skyscan)을 통해 3차원(3D) 영상을 재구성하고 원기둥 모양의 관심 영역(ROI)을 선택하여 TMJ의 골 부피(㎣)를 계산하였다.
조직학적 분석을 위해 고정된 조직을 탈회 용액으로 옮기고 자일렌과 일련의 등급별 에탄올 용액(70, 90, 95 및 100%)에서 탈수 과정을 수행하였다. 파라핀 블록은 마이크로톰(RM2245, Leica, Germany)에 의해 약 5μm 두께로 절단되었다.
샘플을 Hematoxylin & Eosin(H&E)으로 염색한 다음 광학 현미경(IX71, Olympus, Japan)으로 검사하였다. 염색 이미지는 연골 미란, 연골 세포 배열 및 구조, 배경 염색 강도를 평가할 수 있는 Mankin의 점수 시스템을 사용하여 점수를 매겼다.
절편된 샘플을 0.2% Triton X-100으로 5분 동안 투과하고 3% BSA 용액으로 1시간 동안 차단한 다음 PBS로 세척하였다.
샘플을 1:200에서 밤새 1차 항체로 처리하고 여러 번 세척한 다음 DAPI(Vector Laboratories)의 대조염색을 사용하여 1:200에서 90분 동안 2차 항체와 접합하였다. 슬라이드를 형광 현미경으로 캡처하고 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 강도를 정량화하였다.
[실시예 4] 생체 외 이식편 연구
연골 조직으로의 나노세리아 침투 연구를 위해, 쥐의 TMJ 및 무릎 연골에서 관찰되지 않는 nCe의 이동을 시각화하기 위한 적절한 3D 연골 부피를 갖는 이식편 샘플을 토끼 연골로부터 제조하였다. 연골 외식편에 FITC-컨쥬게이션된 nCe를 처리한 후 샘플을 37℃, 5% CO2, 정적 조건에서 배양하였다.
배양 2일 후 체외이식편을 PBS로 세척하고 과두 연골 부분을 절개한 후 공초점 레이저 현미경(z-stack mode, CLSM, LSM 700, Carl Zeiss)으로 관찰하였다. 그런 다음 침투 깊이를 계산하였다.
[실시예 5] 체외 연골 세포 배양
모든 생화학 제품은 달리 명시되지 않는 한 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 공급되었다.
체외 세포 배양 실험을 위해 흉골 부착부 근처의 갈비뼈 앞쪽 끝인 늑골의 관절 연골에서 쥐의 1차 늑골 연골세포를 추출하고 최대 3개의 계대 동안 세포를 단층 확장시켰다.
세포 성장 배지는 Dulbecco의 Modified Eagle 배지(DMEM), 10% FBS 및 1% PS로 구성된다. 연골세포(5000/웰)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 24시간 동안 배양한 후, nCe(80 ~ 320μg/mL)를 처리하였다.
높은 산화 스트레스 조건은 30분 동안 H2O2(0.5 또는 1mM)의 전처리에 의해 활성화되었다.
ROS 수준은 제조사 지침에 따라 Cellrox orange (Thermofisher, USA)에 의해 나노세리아 처리 1시간 후 측정되었으며 (H2O2를 추가하기 전에 염료 전처리 30분), ROS 신호는 디지털 이미징 시스템 (Celena® S, Logos Biosystems, 한국)으로 시각화되었다. 신호 강도는 Image J(1.46 version, USA)로 측정하였다.
[실시예 6] 세포 생존율 및 세포자멸사(apoptosis) 분석
세포 생존율은 수용성 테트라졸륨염(WST, EZ-CYTOX, Daeillab Service, Korea)을 사용하여 평가하였다.
세포 생존은 또한 이전 문헌에 따라 살아있는/죽은 염색(0.5μM 칼세인 AM 및 2μM ethidium homodimer-1 용액, Thermofisher, USA)에 의해 조사되었다.
세포 사멸 거동을 평가하기 위해 4시간 동안 nCe로 처리한 세포를 분석을 위해 수집하였다. Annexin V 및 PI 염색은 제조사 지침에 따라 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, USA)를 사용하여 수행되었다.
면역블롯팅 분석을 위해 세포(3mL의 5x104/mL)를 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 시드하고 90% 합류에 도달하도록 보충 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
1% FBS 보충 배지에서 30분 동안 nCe(20μg/mL)를 처리한 후, 8시간 동안 배양하는 동안 750μM H2O2를 첨가하였다.
단백질은 정지 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Sigma Aldrich PPC1010)가 보충된 빙냉(ice cold) 용해 완충액(ELPISBIO EBA-1149)을 사용하여 세포로부터 추출하고 4℃에서 12,000g에서 원심분리하였다.
pierce BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher Scientific 23225)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. Western blot은 이전 문헌에 따라 수행되었다.
요약하면, 용해물을 로딩 완충액(0.25M Tris-HCl pH 6.8, 0.5M DTT, 10% SDS, 50% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루)과 1:5로 혼합하였다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하였다.
12.5% 또는 15%의 SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔에 각 샘플 20μg을 로딩하였다. 단백질을 전기영동으로 분리하고 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인(공극 크기 0.22μm, Bio RAD 162 - 0112)으로 이동시켰다.
멤브레인을 먼저 5% BSA(SolMate SM-BOV-100), 10x TBST 완충액(LPS 용액 CBT007) 및 DW로 구성된 차단 용액에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
그런 다음 블로킹 버퍼에 희석된 1차 항체를 4℃에서 락킹 플랫폼에서 밤새 첨가하였다. TBST 용액으로 헹군 후, 멤브레인을 1시간 동안 흔들 플랫폼에서 실온에서 HRP-접합 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다.
단백질은 고감도를 위해 supersignal west pico PLUS 화학발광 기질(ThermoFisher Scientific 34580)을 사용하여 검출되었다. iBright CL1500 이미징 시스템(Thermofisher Scientific)을 사용하여 화학발광 검출을 수행하였다.
다음의 항체가 사용되었다: 항-BAX (1:1000, abcam ab32503), 항-Bcl-2 (1:1000, 세포 신호 3498 s), 항-절단된 카스파제-3 (세포 신호 9664), b-액틴(1:15000, Sigma aldrich A3854), 항-토끼 이차 HRP 항체 (세포 신호 7074).
[실시예 7] 연골세포의 분화 분석
정상 또는 고 ROS 조건에서 연골 세포의 분화는 성장 배지, 50μg/mL 아스코르브산, 1% ITS 프리믹스, 100nM 덱사메타손 및 10ng/mL 형질전환 성장 인자-β1로 구성된 분화 배지에서 평가되었다(Pepro-Tech, USA).
쥐의 1차 연골세포(30000개 세포)를 분화 전 1일 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 7일 또는 14일 동안 분화하는 동안 H2O2(0.125 - 0.5mM)를 격일로 선택적으로 처리하였다. nCe는 0.5mM H2O2-손상의 30분 후에 연골세포에 처리되었다.
연골세포 분화 마커(Sox9 및 aggrecan)는 실시간 PCR 분석을 사용하여 7일째에 평가되었다.
사프라닌 O (safranin O) 염색은 0.05% 패스트 그린(fast green) (5분), 1% 아세트산(acetic acid)(10초), 0.1% 사프라닌 O(safranin O) 용액(5분)을 사용하여 수행되었다(n = 5).
[실시예 8] IL-1β 처리된 연골세포의 염증 징후
생체 내 염증 상태를 모방하기 위해 IL-1β(100ng/mL)를 연골 세포에 처리하였다. 24웰 플레이트의 각 웰에 5,000개의 세포를 시드한 후 나노세리아와 IL-1β를 함께 투여하였다.
그런 다음 유전자 및 단백질 수준을 실시간 PCR 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)법에 의해 분석하였다. 세포 증식은 WST 분석에 의해 측정되었다.
세포노화는 Cellular Senescence Detection Kit를 이용하여 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 효소활성을 조사하였다. 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2,PGE2)의 분비는 또한 ELISA Kit(Abcam, Cambridge, United Kingdom)에 의해 세포 배양 상층액으로부터 분석되었다(n = 3).
[실시예 9] 대식세포 배양
대식세포에 대한 효과는 RAW264.7 세포(ATCC, USA)를 사용하여 평가하였다.
세포(1x104, 600μL)를 24웰 플레이트의 각 웰에 시드하고 1시간의 기아 상태(완전 배지를 추가하지 않음) 후, 10% FBS, 1% PS 및 0.5mM H2O2로 보충된 DMEM에서 72시간 동안 배양하였다.
그런 다음 세포 내 ROS 수준의 변화를 Cellrox orange assay(Thermofisher, USA)로 측정하였다.
3일째에 염증유발(IL-1β 및 TNF-α) 및 항염(IL-10 및 CD163)과 관련된 mRNA 수준의 발현을 qPCR로 분석하였다.
[실시예 10] 연골세포/대식세포의 공동 배양
연골 세포와 RAW264.7 세포의 공동 배양은 24웰과 트랜스웰(Transwell) 삽입물(3μm 기공)을 사용하여 수행되었다.
RAW264.7 세포를 2% FBS가 보충된 배지의 24개 웰에 24시간 동안 시딩한 후, 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS, 1μg/mL), 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA, 1μM), H2O2(0.5mM)를 4시간 동안 공동 처리하였다. 그 후, 배지를 교체하고 4시간 동안 배양하였다.
상층액(500g, 3분)에서 세포 또는 파편을 제거한 후, 컨디셔닝된 배지를 삽입물에 미리 부착된 연골세포(5,000개 세포)로 24시간 동안 이동시켰다.
1시간의 공동 배양 후, 나노세리아를 연골세포로 삽입물에 직접 처리하였다. WST 분석에 의한 살아있는/죽은 염색 및 세포의 생존력은 삽입된 세포 샘플로 24시간에 수행되었다.
활성화된 RAW264.7에서 생성된 과산화수소 수준은 Pierce™ Quantitative Peroxide Assay Kit(Thermofisher)를 사용하여 조절 배지(24시간 동안)로 평가되었다.
컨디셔닝된 배지를 원심분리하고(12000g, 5분) 제조사 프로토콜에 따라 수준을 측정하였다.
컨디셔닝된 배지로부터의 ROS 수준의 변화는 컨디셔닝된 배지를 연골세포에 처리하기 30분 전에 첨가한 Cellrox 오렌지(Thermofisher)에 의해 감지되었으며, 30분 후에 적색 강도를 포착하고 Image J(1.46 version, USA)로 정량화하였다.
연골 세포의 상층액을 4시간에서 수확하고 ELISA Kit(Abcam)에 의한 PGE2 검출을 위해 80℃에서 보관하였다.
[실시예 11] 통계분석
모든 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 모든 분석에 대해 일원 ANOVA 및 Tukey의 비교 테스트를 수행하여 그룹 간의 가능한 유의미한 차이를 확인하였다. 통계 계산에는 SPSS PASW 버전 23.0 소프트웨어 프로그램(SPSS Inc.)이 사용되었다.
[실험예 1] 나노세리아의 국소 전달은 골관절염 관절의 병리학적 산화 스트레스를 감소시킴
합성된 나노세리아(nCe)는 양의 표면 전하(ζ-전위 +17.8 mV)를 갖는 ~20nm(±6.5 nm, 도 1의 A의 삽입 이미지)의 평균 크기를 갖는다.
급성 골관절염 동물 모델은 잘 알려진 골관절염 유도제이며 불활성화 및 건조 마이코박테리아로 구성된 완전한 프로인트(Freund) 보조제(CFA)의 관절 활막 주사에 의해 측두하악 관절(TMJ)에 생성되었다(보통 결핵균).
CFA 주입 3일 후 μCT 및 조직학적 분석으로 골관절염의 유도가 확인되었으며, 비대층이 손상된 연골 용해, 하부관절에서 표면이 거칠어진 과두골 파괴 등 4기(중증 형태) 골관절염의 증상을 보였다.
CFA 주입 후 3일 후, 500μg/ml nCe(인산염 완충 식염수 중 용액 30μL)의 농도를 국소적으로 한 번 주입하여 치료 효과를 결정하였다.
첫째, 관절 활막에서 nCe의 존재는 FITC-conjugated nCe의 광학 신호를 기반으로 시각화되었으며 (도 1의 B), ~120μm(±40)μm 깊이의 프로파일로 측정된 토끼 과두 외식편을 사용하여 (자세한 내용은 측정된 방법 섹션) 평가한 바와 같이 과두 조직으로의 깊은 침투도 입증되었다.
치료 후 3일째에 회수된 조직 샘플을 분석하여 골관절염 염증 진행에 대한 500㎍/ml nCe의 효과를 평가하였다. CFA에 의해 유발된 염증 연골에서 붕괴된 비대층이 nCe 처리된 샘플에서 실질적으로 회복되었다.
nCe의 생체 내 독성과 관련하여, 국소 주사 후 주요 장기(간, 폐 및 신장)에 nCe의 축적 가능성도 분석했지만, 전신 투여 시에도 nCe의 심각한 장기 독성이 확인되지 않았다.
조직 샘플의 조직학적 관찰은 TMJ 주입 nCe의 식별 가능한 기관 독성을 명확히 하지 않았지만, nCe의 미래에 대한 장기적인 임상적 이용 가능성을 찾아야 할 수도 있다.
다음으로 조직 내 높은 산화 스트레스의 지표로 잘 알려진 iNOS의 발현을 확인하였다.
면역 조직 화학에 기초하여, OA군에서 다수의 Inos(+) 세포가 확인된 반면, nCe 처리군(도 1의 D)에서 그 수가 현저히 감소하여 생체 내 세포에 의한 iNOS 생성을 억제하는 nCe의 효과적인 역할을 시사한다.
조직 샘플에서 생성된 ROS는 염료 강도에 의해 시각화된 바와 같이 상당히 감소되었다(도 1의 E).
본 발명자들은 높은 산화 스트레스 조건하의 연골 세포 배양에서 세포 수준으로 nCe의 효능을 추가로 테스트하였다.
nCe 농도(최대 640μg/mL)의 시험관 내 세포 생존 범위를 스크리닝한 후, 쥐의 연골 세포의 시험관 내 배양을 모델링하였다.
ROS assay의 경우, 두 가지 다른 용량의 H2O2(0.5 또는 1mM)를 먼저 30분 동안 연골세포에 처리한 다음, nCe(80 ~ 320μg/mL)를 60분 동안 처리하였다.
H2O2 처리는 세포 내 ROS 수준을 증가시켰고, nCe 처리 시 ROS 수준은 nCe의 용량 의존적으로 실질적으로 감소(30 ~ 80% 감소)하여 산화 스트레스를 받은 연골 세포에서 nCe의 ROS 소거 효과를 보여주었다(도 1의 F).
사실, nCe의 효소 및 촉매 활성이 주목할만하다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 분석에 의한 퍼옥시다제 활성, SOD 억제 및 DPPH 억제는 모두 용량 의존적 방식으로 nCe 처리에 의해 증가되었다. 이는 생체 내 골관절염 조건 및 시험관 내 높은 산화 스트레스 조건 모두에서 세포에서 과도한 ROS를 제거하는 데 nCe의 효과적인 역할을 지원한다.
관찰된 바와 같이, 염증이 심한 관절에 대한 단일 국소 치료와 함께 nCe의 효과적인 역할은 이전에 개발된 생체 재료가 치료 효능을 얻기 위해 다중 주입되었기 때문에 주목할만한 것이다.
[실험예 2] nCe는 골관절염 손상으로부터 연골층을 보호함
골관절염 조건에서 500μg/ml nCe의 생체 내 효능을 간단히 확인한 후, 농도 범위를 250 - 2000μg/mL로 확장했다.
10일째의 헤마톡실린 및 에오신(H&E)의 조직학적 관찰 결과, 섬유성 붕해층('F')과 증식층('P', 줄기층)의 과형성이 있는 골관절염 대조군에서 연골층에 심한 염증 징후가 나타났으며, 연골의 조직학적 표지자로 여겨지는 비대('H', 붉은 점선) 층이 현저하게 얇아졌다(도 2의 A). 그러나, nCe 처리 그룹은 500μg/mL에서 피크로 포물선 형태로 연골층의 용량 의존적 보존을 보여주었다.
조직학적 이미지에서 측정된 비대층의 두께를 기반으로 nCe의 효능은 명확했다. 온전한 그룹에서 125μm의 두께는 OA 그룹에서 50μm까지 얇아졌고 500μg/mL nCe로 최대 105μm까지 회복되었다(보존은 다른 nCe의 투여량에서도 관찰되었으며, 각각 250, 1000 및 2000μg/mL에서 70, 90 및 75μm).
이러한 nCe의 포물선 효과는 500mg/mL가 개별 나노입자가 잘 분산되고 응집되어 관련 세포 독성을 일으키지 않고 생물학적 분자와 세포와 효과적으로 상호 작용하는 데 최적일 수 있기 때문에 고려되며, 이는 다른 생체 내 실험에서도 유사하게 나타났다.
다음으로 사프라닌 O(safranin O)/패스트 그린(fast green) 염색으로 연골 프로테오글리칸(연골 내 주요 ECM 분자로 수화 및 팽창을 통한 압축력에 견디는)을 평가하였다.
아그레칸(aggrecan)에 부착된 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 조직학적 염색을 반정량적으로 평가하였다(도 2의 B).
풍부하고 균일하게 분포된 프로테오글리칸(proteoglycan)은 손상되지 않은 그룹에서 잘 관찰되었지만 연골과 연골하골이 실질적으로 침식된 OA 그룹에서는 거의 파괴되었다.
nCe(특히 500μg/mL)로 처리했을 때 연골 프로테오글리칸은 연골과 연골하 골의 침식을 감소시키면서 잘 보존되는 것으로 나타났다.
연골의 골관절염 병변의 중증도에 대해 자주 사용되는 조직병리학적 분류인 Mankin 점수는 프로테오글리칸 분해를 포함한 병리학적 중증도를 완화하는 데 nCe 처리의 효과를 분명히 보여주었으며, 이는 압축 하중에 대한 저항과 같은 연골의 기계적 기능의 가능한 회복을 제안한다.
[실험예 3] nCe는 세포 사멸을 억제하여 산화 스트레스로부터 연골 세포를 구함
생체 내 연구 결과에 따라 nCe 치료가 연골 세포 생존에 영향을 미칠 수 있다고 가정하고, 이를 테스트하기 위해 H2O2 손상(insult)을 사용하여 높은 산화 스트레스 조건에서 쥐 연골 세포의 시험관 내 배양을 설계하고 살아있는/죽은 염색 및 세포 계수 키트-8(CCK 분석)에 의해 세포 생존을 측정하였다(도 3의 B).
연골세포(chondrocytes)의 30%만이 저산소 조건으로 인해 1mM의 H2O2에서 생존했지만, nCe 처리(최대 160μg/ml의 용량)로 생존율이 ~80%로 증가하였다. nCe에 의한 세포 구조 효과는 세포 사멸 사건의 관점에서 더 조사되었다.
1mM H2O2에 의한 높은 산화 스트레스 하에서, 배양 4시간 및 8시간에 연골세포의 annexin V 및 PI 염색은 80㎍/ml의 nCe 처리가 세포사멸적(apoptotic) 세포의 분율을 유의하게 감소시키는 것을 보여주었다(H2O2군 대비 25~40%)(도 3의 C).
nCe의 항-세포사멸적(anti-apoptotic) 효과는 백혈구 세포주(U937 및 Jurkat 세포)와 같은 다른 유형의 세포에서도 보고되었다. 그런 다음 친-(pro-) 또는 항-(anti-) 세포사멸적(apoptotic) 경로와 관련된 주요 신호 분자 중 일부(각각 Bax2 및 Bcl-2)는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(도 3의 D).
결과는 항 세포 사멸 마커 Bcl-2가 높은 ROS 조건에서 nCe 치료군에서 상향 조절되었지만 친-세포사멸적(pro-apoptotic) 마커 BAX는 크게 변경되지 않았음을 보여 주었으며, 아마도 친-세포사멸적 경로(pro-apoptotic pathways)의 억제가 아니라, Bcl-2가 nCe의 항-세포사멸적(anti-apoptotic) 역할을 매개한다는 것을 암시한다.
다음으로, 관절염 연골에서 세포 DNA 손상 정도를 검출하는 데 사용되어 온 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP nick end labeling(TUNEL) 분석에 의해 생체 내 샘플에서 항-세포자멸사 효과를 분석하였다.
골관절염 관절 조직에서 TUNEL 양성 세포는 특히 OA 그룹의 증식층(빨간색 화살표)과 연골하 영역의 일부(흰색 화살표)에서 명확하게 검출되었지만, 가장 높은 나노세리아 그룹에서 실질적으로 감소하였고, 500㎍/ml에서 관찰된 효과(도 3의 E)는 연골 비대층 두께 및 프로테오글리칸 함량의 전술한 조직학적 발견과 일치하였다.
생체 내 및 시험관 내에서 관찰된 이러한 발견은 항-세포자멸사에 대한 nCe 효과가 항산화제인 시스타티오닌과 유사한 경우로 간주되는 특히 산화환원 의존적일 수 있음을 의미한다.
프로그램된 죽음으로 인한 높은 산화 스트레스 하에서의 세포 구조는 퇴행성 상태를 복구 단계로 전환하기 위한 전제 조건으로 간주되며, 이는 항염증성 사이토카인 분비 및 기질 합성과 같은 일련의 부스팅 이벤트를 동반하여 기능 회복으로 이어진다.
[실험예 4] nCe는 대식세포를 항염증제로 조절함
다음으로 본 발명자들은 골관절염 상태에서 관찰된 항-세포자멸사 및 세포 구조 역할과 관련된 nCe의 항염증 작용을 조사하였다. 조직 샘플을 면역조직화학적 염색으로 분석하여 몇 가지 주요 친전염성 마커를 확인하였다.
시클로옥시게나아제 2(cyclooxygenase 2, COX2)와 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)는 골관절염이 COX2의 활성화를 통해 연골 분해에 중요한 금속단백분해효소(metalloproteinase, MMP) 효소를 생산하는 주요 이화(catabolic) 인자 중 하나인 PGE2의 생산을 자극한다고 알려져 선택되었고, COX2의 과잉 생산은 친전염성 사이토카인에 의해 유발된다.
COX2 및 PGE2(적색)의 발현은 OA 그룹에서 실질적으로 상승한 반면, 두 발현 모두 nCe 처리 그룹에서 유의하게 감소하였다(OA군 대비 50~20% 하락)(도 4의 A). nCe에 의한 COX2 및 PGE2의 하향 조절은 연골 세포에 무독성인 것으로 스크리닝된 농도(20 ~ 80μg/mL)를 사용하는 시험관 연골 세포 배양에서 추가로 확인되었다.
이를 위해 IL-1β를 연골세포에 4시간 동안 처리하여 PGE2 및 COX2 생성을 활성화시켰다(도 4의B-i).
IL-1β-자극된 COX2 mRNA 발현(IL-1β로 자극된 ~3.8배)은 H2O2 조건에서 특히 두드러진 nCe에 의해 상당히 하향 조절되는 것으로 나타났다(도 4의 B-ii).
nCe에 의한 COX2 유전자의 하향 조절은 손상된 척수에서도 관찰되었다. 또한, IL-1β에 의해 자극된 PGE2의 분비는 산화 스트레스 조건에서 nCe 처리에 의해 유의하게 감소되었다.
다음으로 조직 샘플을 분석하여 대식세포 표현형의 유병률을 확인하여 해당 과정이 염증을 유발하는지 또는 복구 단계로 이동하는지를 나타낸다.
관절 연골에 침투한 대식세포는 초기에 고전적으로 활성화되어(M1), 친염증성 사이토카인으로 신호를 보내는 동안 세포 파편의 식균 작용에 참여하는 반면 대안적으로 활성화된 단계(M2)로, 극성화되어 환경을 항염증성으로 전환한다.
여기에서 두 개의 서로 다른 마커(M2의 경우 CD206 및 M1의 경우 IL-1β)를 사용한 조직 샘플의 면역조직화학적 염색은 연골층 전체에 걸쳐 OA 대조군과 나노세리아 처리군 사이의 분명한 차이를 보여주었다.
nCe 그룹은 IL-1β(+) 세포의 발현이 적은 더 뚜렷한 CD206(+) 세포를 나타낸 반면, OA 그룹은 반대 현상(도 4의 C)을 보여 특히 OA 환경에서 대식세포를 항염증 및 복구 단계로 분극화하는 면역 조절에서 nCe의 역할을 입증하였다.
그런 다음 산화 스트레스 하에 nCe에 대한 대식세포의 전환 가능한(친염증 또는 항염증) 행동을 시험관 내 배양에서 조사하였다.
높은 H2O2 손상(insult) 하에서 나노세리아로 처리된 대식세포 세포주 (RAW264.7)는 생체 내 연구 결과와 일치하는 도 4의 D와 같이 항염증 유전자(IL-10)의 동시 상향 조절과 함께 유의하게 하향 조절된 친염증 유전자(TNF-α 및 IL-1β)를 발현하였다.
[실험예 5] 연골 세포의 기능적 활성은 nCe에 의해 보존됨
높은 산화 스트레스로부터 연골 세포를 구출할 뿐만 아니라 대식세포를 항염증 및 회복으로 조절하는 nCe의 효과적인 역할을 확인한 후, 본 발명자들은 그 효과가 연골 세포의 기능적 활성(분화)에도 반영될 수 있다고 가정하였다.
이를 위해 H2O2(0.5mM의 단일 용량)로 분화 조건에서 쥐의 1차 연골세포를 배양하였다(도 5의A-i).
정상산소 상태에서 nCe 처리는 사프라닌 O(safranin O) 염색에 의한 보존된 GAG 침착과 qPCR에 의한 주요 연골원성 전사(Sox2) 및 기질 유전자(aggrecan)의 자극된 발현에 의해 나타난 바와 같이 연골세포 분화를 감소시키지 않았다(도 5의 A-ii).
일시적인 산화 스트레스 조건(0.5mM에서 단일 H2O2 손상)에서 nCe 처리된 연골세포는 처리되지 않은 것보다 GAG 침착 및 유전자 발현이 약간 더 높은 것으로 나타났다(그림 5의 A-iii).
H2O2 손상이 연속적인 골관절염 미세 환경을 더 잘 모방하기 위해 H2O2(0.125, 0.25 및 0.5mM)를 분화 조건의 7일까지 격일로 처리하였다(도 5의 B-i).
nCe 처리군은 훨씬 더 많은 생존 세포를 나타내었지만, 산화 스트레스 조건에서는 거의 관찰되지 않은 반면 GAG 침착은 크게 다르지 않았다(도 5의 B-ii, iii).
나노세리아에 의해 회수된 연골세포를 분화 배지에서 추가로 7일(총 14일) 동안 배양했을 때, 사프라닌 O에 대해 양성인 보다 강한 신호가 관찰되었으며(도 5의 B-iv), 이는 높은 산화 스트레스로부터 구조된 연골세포에 연장된 분화 신호가 제공될 때 후속 연골 분화 활성을 발휘함을 나타낸다.
[실험예 6] nCe는 염증성 대식세포와 연골세포의 상호작용을 조절함
i) ROS의 제거, ii) 연골세포의 구조 및 분화 기능 보존, 및 iii) 대식세포 표현형의 이동을 포함하는 일련의 분자 및 세포 이벤트에서 높은 산화 스트레스 또는 친염증성 조건에서 nCe의 역할을 확인했지만, 연골세포와 대식세포의 상호작용 행동도 조사할 필요가 있다.
조직 상주 기질 세포(연골 세포, 섬유아세포, 내피 세포 등)와 면역 세포의 상호 작용은 변경된 환경과 세포 및 조직 운명에 답하는 데 중요한 것으로 간주된다.
이 문제를 해결하기 위해 여기에서 연골 세포로 염증을 유발하도록 고도로 활성화된 대식세포의 공동 배양을 모델링하였다.
대식세포의 활성화는 4시간 동안 H2O2와 함께 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 및 프로볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(probol 12-myristate 13-acetate, PMA)의 추가 인자로 가능했으며 연골 세포와의 상호 작용은 조절 배지를 통하거나 트랜스웰(transwell)에서 공동 배양을 통해 이루어졌다.
LPS/PMA/H2O2를 사용한 자극은 현미경 이미지에서 볼 수 있듯이 대식세포를 손상시키고 활성화시키는 것으로 나타났다. 또한, 활성화된 대식세포의 조절 배지로 처리하면 많은 연골세포가 사멸되는 것으로 나타났지만 (도 6의 C에서 정량화된 바와 같이 처리되지 않은 대조군의 ~30%까지) 나노세리아의 투여에 의해 상당히(최대 80%) 회복될 수 있었다.
활성화된 대식세포와 직접 공동 배양하는 경우, 연골세포는 nCe를 투여해야만 잘 생존할 수 있었다(도 6의 D).
동시에 활성화된 대식세포에서 정량화된 산화 스트레스 수준은 배양 기간 동안 상당히 높은 것으로 기록되어 (특히 4h에서 정점)(도 6의 E), 활성화된 대식세포에 의해 생성된 산화 스트레스가 연골세포 손상의 중요한 원인일 수 있음을 시사한다.
결과적으로, 활성화된 대식세포에 의해 영향을 받는 연골세포의 세포내 ROS 수준(조건 배지 포함)은 ~2.5배 증가를 보여 nCe의 존재 하에서 후속적으로 하향 조절되었다(도 6의 F). 또한, 면역 반응성 연골세포 이화 작용의 주요 다운스트림 산물로 간주되는 연골세포의 이화 마커 PGE2를 분석하였다.
ELISA(도 6의 F)에 의한 정량 분석은 PGE2가 친염증성 대식세포로 조절된 연골세포로부터 상당한 수준으로 분비되었음을 보여주었으며, 이는 나노세리아의 존재와 함께 배양될 때 유의하게 감소하여 염증성 이화 작용에 대한 연골세포의 보호를 시사한다.
연골 세포가 이화 작용을 하고 대식세포와의 피드백에 관여하는 것을 금지함으로써, 활성화된 대식세포가 있는 연골세포의 모델링된 실험은 대식세포로부터의 염증촉진 신호(특히 여기에서 설명된 ROS 및 PGE2)가 연골세포의 생존 가능성과 추가 기능적 활성에 미치는 중요한 영향과 세포 상호작용에서 nCe의 개입 역할의 기초가 된다.
연골세포에서 나노세리아의 직접적인 역할과 함께, 세포 상호작용에 대한 개입은 세포가 고도의 염증 환경을 극복하고 복구 과정에 응답하는 데 도움이 될 것이다.
[실험예 7] nCe는 연골하 골 파괴를 예방함
본 발명자들은 항염증 및 연골 보호 이벤트가 일반적으로 연골 변성을 동반하는 연골하 골 손실의 변화와 관련이 있는지 조사하고 심각한 골관절염 관절의 최신 병리학적 증상으로 간주하였다. 하부 관절 뼈는 μCT 분석으로 평가되었다.
시상면 및 관상면에서 재구성된 3D 이미지는 OA 그룹에서 뼈 파괴의 주목할만한 징후, 즉, 원래 위치 (빨간색 점선 영역)에서 뼈 가장자리의 수축 및 과두 조직의 경계 근처의 다공성 형태 (강도 기준)를 나타내었지만, 이는 나노세리아-처리군에서 실질적으로 방지되었다(도 7의 A).
이미지에서 정량화된 골용적(BV), 골용적/조직용적비(BV/TV), 골표면/골용적비(BS/BV)는 OA군에서 유의하게 감소된 골손실(무손상 대조군의 ~50%)을 나타내었지만, 특히 500μg/mL에서 nCe 처리로 잠재적으로 예방(손상되지 않은 대조군의 ~70-80%로 회복됨)할 수 있었고(도 7의 B), nCe가 심각한 골관절염 변성으로부터 연골하 골을 보호하는 데 효과적임을 입증했으며, 그렇지 않으면 심각하게 손상될 수 있다.
nCe 단회 투여는 다른 병리학적 경로의 개입으로 인한 연골 및 연골 내 뼈의 손상을 완전히 예방할 수 없었지만 연골 기질과 골량을 보존하는 데 매우 효과적이었다.
골관절염 관절 재생을 위한 분자 및 세포 이벤트에서 nCe의 역할은 다음과 같이 요약될 수 있다.
최적의 nCe 용량(여기서 500μg/ml)은 세포에서 생성된 ROS를 소거함으로써 산화 스트레스를 줄이는 데 매우 효과적이며, 이는 차례로 연골 세포가 세포 사멸 및 이화 작용으로부터 구출되어 궁극적으로 분화 및 기질 합성에 관여하도록 돕는다
친염증성 사건을 억제하여 항염증성 표현형으로 분극화하는 대식세포의 부스팅은 퇴행성 환경을 회복 단계로 전환하는 데 도움이 되는 nCe 치료에서 고무적인 현상으로 입증되었다.
nCe의 개입은 활성화된 대식세포가 연골세포로 보내는 역 신호전달이 억제될 수 있는 대식세포와 연골세포의 상호작용 이벤트에서도 분명했으며, 친염증성 세포 피드백 루프를 깨는 데 도움이 될 수 있다.
결국 관절에 대한 nCe의 국소 전달은 연골 기질과 뼈 질량이 실질적으로 보존된 해부학적 골연골 구조를 복원하는 데 매우 효과적이었다.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (17)

  1. 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 조직의 산화 스트레스(oxidative stress) 지표를 나타내는 iNOS(inducible Nitruc Oxide Synthase)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 관절 조직의 연골세포에서 ROS(Reactive Oxygen Species)의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 골관절염에 의해 얇아진 상기 관절 조직의 연골층의 두께를 회복시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 관절 조직의 연골(cartilage) 및 연골하(subchondral) 골의 프로테오글리칸(proteoglycan)의 분해를 완화하는 것을 특징으로 하는 나노세리아 (nanoceria) 화합물.
  6. 제5 항에 있어서,
    상기 연골 및 연골하 골의 침식을 감소시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 관절 조직에 포함된 연골세포의 생존율을 향상시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아 (nanoceria) 화합물.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 연골세포의 세포사멸(apoptotic)을 감소시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아 (nanoceria) 화합물.
  9. 제8 항에 있어서,
    항-세포사멸(anti-apoptotic)의 지표인 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)가 상향 조절되는 것을 특징으로 하 는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  10. 제7 항에 있어서,
    대식세포에 의한 상기 연골세포의 사멸을 방지하는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 대식세포에 의해 영향을 받는 상기 연골세포 내의 ROS(Reactive Oxygen Species) 수준을 하향 조절시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 골관절염에 의해 상기 관절 조직의 연골을 손상시키는 시클로옥시나아제 2(cyclooxygenase 2, COX2)와 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  13. 제1 항에 있어서,
    상기 골관절염에 의한 퇴행 또는 손상에 대항하여 상기 관절 조직의 연골하(subchondral) 골을 보호하는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물.
  14. 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선할 수 있는 나노세리아 (nanoceria) 화합물의 제조방법에 있어서,
    a) 질산암모늄세륨(Ce(NH4)2(NO3)6)과 헥사데실트리메틸암모늄브롬화물 (hexadecyltrimethylammonium bromide을 준비하는 단계와,
    b) 상기 질산암모늄세륨(Ce(NH4)2(NO3)6)과 헥사데실트리메틸암모늄브롬화물(hexadecyltrimethylammonium bromide)을 용매에 투입하고 분산 및 용해시켜 혼합용액을 제조하는 단계를 포함하는 나노세리아(nanoceria) 화합물의 제조방법.
  15. 제14 항에 있어서,
    상기 용매는 탈이온수이되, 상기 탈이온수의 pH는 7.5 내지 8.5인 것을 특징으로 하는 나노세리아 (nanoceria) 화합물의 제조방법.
  16. 제14 항에 있어서,
    상기 혼합용액을 130 내지 150℃의 온도의 열수 반응기로 이동시켜 12 내지 36시간 동안 반응시켜 나노세리아 화합물을 합성하는 단계를 더 포함하는 나노세리아(nanoceria) 화합물의 제조방법.
  17. 제16 항에 있어서,
    제조된 상기 나노세리아 화합물을 에탄올로 세척하고 70 내지 90℃의 온도에서 12 내지 36시간 동안 건조하는 것을 특징으로 하는 나노세리아 (nanoceria) 화합물의 제조방법.
KR1020210129914A 2021-09-30 2021-09-30 나노세리아 화합물을 포함하는 조성물 KR102648221B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210129914A KR102648221B1 (ko) 2021-09-30 2021-09-30 나노세리아 화합물을 포함하는 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210129914A KR102648221B1 (ko) 2021-09-30 2021-09-30 나노세리아 화합물을 포함하는 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230047264A true KR20230047264A (ko) 2023-04-07
KR102648221B1 KR102648221B1 (ko) 2024-03-15

Family

ID=85979207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210129914A KR102648221B1 (ko) 2021-09-30 2021-09-30 나노세리아 화합물을 포함하는 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102648221B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101990004B1 (ko) 2018-02-01 2019-06-17 인제대학교 산학협력단 미토콘드리아 표적화 나노 리포좀을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20210111646A (ko) * 2020-03-03 2021-09-13 서울대학교산학협력단 나노입자 구조체 및 그 형성 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101990004B1 (ko) 2018-02-01 2019-06-17 인제대학교 산학협력단 미토콘드리아 표적화 나노 리포좀을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20210111646A (ko) * 2020-03-03 2021-09-13 서울대학교산학협력단 나노입자 구조체 및 그 형성 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102648221B1 (ko) 2024-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yao et al. Fibroblast growth factor 18 exerts anti-osteoarthritic effects through PI3K-AKT signaling and mitochondrial fusion and fission
Ito et al. Multiple organ damage caused by a new toxin azaspiracid, isolated from mussels produced in Ireland
Rodrigues et al. Ursodeoxycholic acid prevents cytochrome c release in apoptosis by inhibiting mitochondrial membrane depolarization and channel formation
Zernii et al. Mitochondria‐Targeted Antioxidant SkQ1 Prevents Anesthesia‐Induced Dry Eye Syndrome
Dashnyam et al. Optimally dosed nanoceria attenuates osteoarthritic degeneration of joint cartilage and subchondral bone
Pan et al. Alpha-Mangostin suppresses interleukin-1β-induced apoptosis in rat chondrocytes by inhibiting the NF-κB signaling pathway and delays the progression of osteoarthritis in a rat model
Sawazaki et al. Diclofenac protects cultured human corneal epithelial cells against hyperosmolarity and ameliorates corneal surface damage in a rat model of dry eye
Aierken et al. Melatonin treatment improves human umbilical cord mesenchymal stem cell therapy in a mouse model of type II diabetes mellitus via the PI3K/AKT signaling pathway
Wang et al. Calpain inhibitor attenuates ER stress-induced apoptosis in injured spinal cord after bone mesenchymal stem cells transplantation
Massieu et al. Effect of Ginkgo biloba (EGb 761) on staurosporine-induced neuronal death and caspase activity in cortical cultured neurons
Sun et al. Drug discovery for polycystic kidney disease
KR101756201B1 (ko) 급성 뇌혈관 질환 치료용 약제 제조에 있어서의 백시니아 바이러스에 의해 염증이 발생된 토끼 피부로부터 유래된 추출물의 용도
Wu et al. Retracted: GABARAP promotes bone marrow mesenchymal stem cells‐based the osteoarthritis cartilage regeneration through the inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway
Lazzeri et al. Mechanisms involved in the formation of dopamine‐induced intracellular bodies within striatal neurons
Yuce et al. Effects of intra-articular resveratrol injections on cartilage destruction and synovial inflammation in experimental temporomandibular joint osteoarthritis
Ohnishi et al. Mitogen‐activated protein kinases support survival of activated microglia that mediate thrombin‐induced striatal injury in organotypic slice culture
Harnroongroj Free radicals in primary knee osteoarthritis
Lv et al. A combination of CMC and α-MSH inhibited ROS activated NLRP3 inflammasome in hyperosmolarity stressed HCECs and scopolamine-induced dry eye rats
Li et al. Preparation and characterization of a naringenin solubilizing glycyrrhizin nanomicelle ophthalmic solution for experimental dry eye disease
Wang et al. Metformin ameliorates chronic colitis-related intestinal fibrosis via inhibiting TGF-β1/Smad3 signaling
Zhang et al. Electroacupuncture ameliorates mechanical allodynia of a rat model of CRPS-I via suppressing NLRP3 inflammasome activation in spinal cord dorsal horn neurons
Kimura et al. The chondroprotective agent ITZ-1 inhibits interleukin-1β–induced matrix metalloproteinase–13 production and suppresses nitric oxide–induced chondrocyte death
KR102648221B1 (ko) 나노세리아 화합물을 포함하는 조성물
JP6506177B2 (ja) ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤を含む医薬処方物
Ünal et al. Prevention of gentamicin induced ototoxicity by trimetazidine in animal model

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant