KR20230045219A - New green algae originating from Ulleungdo and biodiesel production method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 울릉도 유래의 신규 녹조류인 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica; (수탁번호 KCTC 14645BP) 및 이를 이용한 바이오 디젤 생산방법에 대한 것이다.The present invention relates to Botryosphaerella sudetica, a novel green algae from Ulleungdo (Accession No. KCTC 14645BP) and a biodiesel production method using the same.
산업화로 인한 화석연료의 무분별한 사용은 대기 중 CO2 농도 증가를 초래하였고, 온실가스 효과 및 해수면 상승으로 인한 환경재해는 세계 GDP의 5~20%에 달하는 천문학적 경제적 손실을 가져다 줄 것으로 추정되고 있다.The indiscriminate use of fossil fuels due to industrialization has resulted in an increase in CO 2 concentration in the atmosphere, and environmental disasters caused by greenhouse gas effects and sea level rise are estimated to bring about astronomical economic losses ranging from 5 to 20% of world GDP.
약 35억 년 전 지구상에 출현하여 산소를 대기 중에 방출했던 최초의 생물체인 미세조류는 광합성 독립영양군(Photoautotrophs)으로 CO2를 탄소원으로 사용하고 미량원소 존재 하에 물과 빛만 있으면 증식하여 대량의 바이오매스를 생산할 수 있다. 성장시 이산화탄소를 소모하기 때문에 온실가스 저감의 효과가 있다.Microalgae, the first organisms that appeared on Earth about 3.5 billion years ago and released oxygen into the atmosphere, are photosynthetic autotrophs. They use CO 2 as a carbon source and proliferate with only water and light in the presence of trace elements to produce a large amount of biomass. can produce Since it consumes carbon dioxide during growth, it is effective in reducing greenhouse gases.
본 발명의 울릉도 유래 신규 미세조류 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)는 녹조류에 속한다. 녹조류는 생물자원으로 활용되는 광합성 유기체로 유망한 바이오에너지 공급원이며, 육상 식물보다 단위 면적당 많은 바이오매스를 생산할 수 있다. 또한, 생산된 바이오매스에는 다량의 지질이 함유되어 있다. 이는 바이오 디젤유로서 현재 보급되고 있는 엔진의 연료로 바로 사용가능하다. 이러한 특징을 가진 바이오 디젤은 기존의 시설을 통해 운반, 판매가 가능하기 때문에, 가장 중요한 교통 에너지 자원인 화석 연료의 대안으로 알맞다. The novel microalgae Botryosphaerella sudetica derived from Ulleungdo of the present invention belongs to green algae. Green algae are photosynthetic organisms used as biological resources and are promising sources of bioenergy, and can produce more biomass per unit area than terrestrial plants. In addition, the produced biomass contains a large amount of lipids. This is a biodiesel oil that can be used directly as a fuel for engines that are currently being supplied. Since biodiesel with these characteristics can be transported and sold through existing facilities, it is suitable as an alternative to fossil fuel, which is the most important transportation energy resource.
본 발명의 미세조류 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)는 침강성이 있어 생산된 바이오디젤의 회수에 용이하다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 보트리오스페렐라 수테티카 KNUA107 균주(Botryosphaerella sudetica KNUA107)는 바이오디젤 생산에 적합한 미세조류에 해당한다.The microalgae Botryosphaerella sudetica of the present invention has an advantage in that it is easy to recover biodiesel produced because it has sedimentation properties. Therefore, the novel Botryosperella sutetica KNUA107 strain of the present invention ( Botryosphaerella sudetica KNUA107) corresponds to microalgae suitable for biodiesel production.
본 발명의 목적은 수탁번호가 KCTC 14645BP인 신규 보트리오스페렐라 수테티카 균주(Botryosphaerella sudetica)를 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a novel Botryosphaerella Sudetica strain ( Botryosphaerella sudetica ) whose accession number is KCTC 14645BP.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신규 보트리오스페렐라 수테티카 균주를 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a composition for producing biodiesel comprising the novel Botriosperella suetica strain as an active ingredient.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신규 보트리오스페펠라 수테티카 균주를 이용한 바이오디젤의 생산방법을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a method for producing biodiesel using the novel Botriospepela sutetica strain.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 수탁번호가 KCTC 14645BP인 신규 보트리오스페렐라 수테티카 균주(Botryosphaerella sudetica)를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides accession number KCTC 14645BP a novel Botryosperella suetica strain ( Botryosphaerella sudetica ).
이어서, 본 발명은 상기 신규 보트리오스페렐라 수테티카 균주(수탁번호 KCTC 14645BP)를 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 생산용 조성물을 제공한다.Subsequently, the present invention provides a biodiesel production composition comprising the novel Botriosperella sutetica strain (Accession No. KCTC 14645BP) as an active ingredient.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 보트리오스페랄레 수테티카 균주는 탄소원에 따라 빛과 CO2를 이용하여 광합성을 통해 배양하는 독립영양배양(autotrophic growth) 및 탄소원으로 빛, CO2, 유기 탄소원을 사용하여 배양하는 혼합영양배양(mixotrophic growth)으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the Botriosperale suetica strain is autotrophic growth cultured through photosynthesis using light and CO 2 according to the carbon source, and light, CO 2 , and organic carbon source as the carbon source. It can be cultured by mixotrophic growth, which is cultured using, but is not limited thereto.
나아가, 본 발명은 유기 탄소원이 첨가된 배양배지에서 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica) 균주를 배양하는 1단계; 상기 1단계에서 배양된 균주로부터 바이오매스(biomass)를 수집하는 2단계; 및 상기 2단계의 바이오매스로부터 지질을 추출하는 3단계;를 포함하는 바이오디젤의 생산방법을 제공한다.Furthermore, the present invention comprises a first step of culturing a Botryosphaerella sudetica strain in a culture medium to which an organic carbon source is added; A second step of collecting biomass from the strain cultured in
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 3단계의 지질로부터 지방산 메틸 에스테르(FAME)을 분리하는 제4단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method may further include a fourth step of separating fatty acid methyl esters (FAME) from the lipids of the third step.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 보트리오스페렐라 수테티카 KNUA107(Botryosphaerella sudetica KNUA107, 수탁번호 KCTC 14645BP)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the strain may be Botryosphaerella sudetica KNUA107 (Botryosphaerella sudetica KNUA107, accession number KCTC 14645BP), but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 유기 탄소원은 수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스 및 리보스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the organic carbon source may include at least one selected from the group consisting of sucrose, glucose, fructose, galactose, and ribose, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 1단계의 배양은 혼합영양배양 조건하에 12 내지 30일 동안, 바람직하게는 25 내지 35일동한 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the first step of culture may be carried out for 12 to 30 days, preferably 25 to 35 days, under mixed nutrient culture conditions, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 혼합영양배양조건은 온도 20 내지 30℃, 회전속도 120 내지 200 rpm, 명암주기(light:dark) 18:6 내지 14:10, 유기 탄소원 35 내지 45 mM, 바람직하게는 온도 23 내지 27℃, 회전속도 150 내지 170 rpm 명암주기(light:dark) 17:7 내지 15:9, 유기 탄소원 38 내지 42 mM, 더욱 바람직하게는 온도 23℃, 회전속도 160 rpm, 명암주기(light:dark) 16:8 및 유기 탄소원 40mM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the mixed nutrient culture conditions are a temperature of 20 to 30 ° C, a rotational speed of 120 to 200 rpm, a light and dark cycle (light: dark) of 18: 6 to 14: 10, an organic carbon source of 35 to 45 mM, Preferably, the temperature is 23 to 27 ° C, the rotation speed is 150 to 170 rpm, the light:dark cycle is 17:7 to 15:9, the organic carbon source is 38 to 42 mM, more preferably the temperature is 23 ° C, the rotation speed is 160 rpm, The light/dark cycle may be 16:8 and the
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오디젤은 다중불포화지방산 20 내지 45중량부, 단일불포화지방산 30 내지 50중량부, 포화지방산 20 내지 35중량부를 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 다중불포화지방산 23 내지 26중량부, 단일불포화지방산 43 내지 46중량부, 포화지방산 29 내지 33중량부를 포함하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the biodiesel may contain 20 to 45 parts by weight of polyunsaturated fatty acids, 30 to 50 parts by weight of monounsaturated fatty acids, and 20 to 35 parts by weight of saturated fatty acids, preferably polyunsaturated fatty acids. It may include 23 to 26 parts by weight, 43 to 46 parts by weight of monounsaturated fatty acids, and 29 to 33 parts by weight of saturated fatty acids, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기의 다중불포화지방산은 C16:2, C16:3, C18:2 및 C18:3인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the polyunsaturated fatty acid may be C16:2, C16:3, C18:2 and C18:3, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기의 단일불포화지방산은 C16:1 및 C18:1인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the monounsaturated fatty acid may be C16:1 and C18:1, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기의 포화지방산은 C16:0, C17:0, C18:0, C20:0 및 C22:0인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the saturated fatty acid may be C16:0, C17:0, C18:0, C20:0 and C22:0, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 B. sudetica KNUA107 (수탁번호 KCTC 14645BP)를 포도당이 첨가된 BG-11 배지에서 혼합영양배양조건 하에 배양하여 생산된 바이오매스는 높은 침전성을 가져 바이오매스 수확 효율을 현저히 향상시킬 뿐만 아니라 이를 통해 생산된 바이오매스에서 추출된 FAME은 포화지방산 및 단일불포화지방산 함량이 높아 고품질의 바이오디젤의 원료로 이용될 수 있다.Biomass produced by culturing B. sudetica KNUA107 (Accession No. KCTC 14645BP) according to the present invention under mixed nutrient culture conditions in glucose-added BG-11 medium has high sedimentation and significantly improves biomass harvest efficiency. In addition, FAME extracted from biomass produced through this can be used as a raw material for high-quality biodiesel due to its high content of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids.
도 1은 본 발명 미세조류의 사진 및 공급된 탄소원별 성장성, 엽록소 및 총 색소량 비교 그래프를 나타낸 도이다(a: 본 발명 미세조류(단일) 사진, b: 본 발명 미세조류 콜로니(집락) 사진, c: 본 발명 미세조류 공급된 탄소원별 성장성 비교 그래프, d: 본 발명 미세조류 배양 12일째 탄소원별 엽록소 종류 비교 그래프, e: 본 발명 미세조류 배양 30일째 탄소원별 엽록소 종류 비교 그래프, f: 본 발명 미세조류 공급된 탄소원별 총 색소량 비교 그래프).
도 2는 본 발명 미세조류의 계통을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명 미세조류의 공급 배지별 시간에 따른 건조중량 및 플라스크 사진을 나타낸 도이다(a: 광독립영양조건의 건조중량, b: 공급된 탄소원별 건조중량, c: 광독립영양조건 및 공급된 탄소원별 배양 플라스크 사진).
도 4는 본 발명 미세조류의 집락 형성 능력 및 침강성을 조사하여 나타낸 도이다(a: 집락 형성 현미경 사진, b: 집락 직경 사진, c: 형성된 집락의 건조중량(상층액 1 mL), d: 형성된 집락의 건조중량(상층액 9 mL).
도 5는 본 발명 미세조류의 지질 생산성과 품질에 대해 나타낸 도이다(a: 광독립영양 및 공급 탄소원별 수확된 바이오매스의 총 지질 함량, b: 대수증식기 이후의 광독립영양 및 자당, 포도당 첨가 배지에서의 총 지질 생산량, c: 대수증식기 이후 광독립영양 및 자당, 포도당 첨가 배지의 지질 생산성, d: 광독립영양 및 자당, 포도당 첨가 배지의 배양후 12일 30일 지방산 조성 양상에 대한 그래프, e: 광독립영양 및 자당, 포도당 첨가 배지의 배양후 12일 30일 PUFA, MUFA, SFA의 비율 양상에 대한 그래프).1 is a diagram showing a photograph of microalgae of the present invention and a comparative graph of growth, chlorophyll, and total pigment amount for each supplied carbon source (a: microalgae (single) photograph of the present invention, b: photograph of a microalgae colony (colony) of the present invention , c: Comparison graph of growth potential by carbon source supplied with microalgae of the present invention, d: Comparison graph of chlorophyll types by carbon source on
2 is a diagram showing the results of analyzing the strains of microalgae of the present invention.
Figure 3 is a diagram showing the dry weight of the microalgae of the present invention over time for each feeding medium and flask photos (a: dry weight under photoautotrophic conditions, b: dry weight for each supplied carbon source, c: photoautotrophic conditions and Photos of culture flasks for each supplied carbon source).
Figure 4 is a diagram showing colony formation ability and sedimentation of the microalgae of the present invention by examining (a: colony formation micrograph, b: colony diameter photograph, c: dry weight of formed colony (
Figure 5 is a diagram showing the lipid productivity and quality of microalgae of the present invention (a: total lipid content of biomass harvested by photoautotrophic and supplied carbon sources, b: photoautotrophic after logarithmic growth, sucrose, and glucose addition Total lipid production in the medium, c: lipid productivity in photoautotrophic, sucrose, and glucose-added media after logarithmic growth phase, d: graph of fatty acid composition patterns at 12 days and 30 days after cultivation in photoautotrophic, sucrose, and glucose-added media, e: A graph of ratio patterns of PUFA, MUFA, and SFA at 12 days and 30 days after culture in photoautotrophic and sucrose and glucose supplemented media).
본 발명의 목적은 수탁번호가 KCTC 14645BP인 신규 보트리오스페렐라 수테티카 균주(Botryosphaerella sudetica) 및 이를 이용한 바이오디젤의 생산방법에 대해 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a novel Botryosphaerella sudetica strain having accession number KCTC 14645BP and a method for producing biodiesel using the same.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.Hereinafter, the present invention will be described in detail as an embodiment of the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the following implementation examples are presented as examples of the present invention, and if it is determined that a detailed description of a well-known technology or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted. , the present invention is not limited thereby. Various modifications and applications of the present invention are possible within the description of the claims described later and equivalent scopes interpreted therefrom.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, terms used in this specification (terminology) are terms used to appropriately express preferred embodiments of the present invention, which may vary according to the intention of a user or operator or customs in the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the contents throughout this specification. Throughout the specification, when a certain component is said to "include", it means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w)%, 고체/액체는(w/v)%, 그리고 액체/액체는(v/v)%이다.Throughout this specification, '%' used to indicate the concentration of a particular substance is solid/solid (w/w)%, solid/liquid (w/v)%, and Liquid/liquid is (v/v) %.
후술하는 바이오 디젤의 제조 방법은 하나의 구체적인 실험예로서, 각 단계에서 사용된 방법, 예컨대, 원심분리(Centrifugal separation), 증류(Distillation), 세정(Washing), 상분리(Phase separation), 필터링(Filtering), 추출(Extraction) 등이나 용매, 촉매 등의 종류 및 양은 구체적인 예이며, 본 발명의 기술 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변경될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.The biodiesel manufacturing method described later is a specific experimental example, and the method used in each step, such as centrifugal separation, distillation, washing, phase separation, filtering ), extraction, etc., solvent, catalyst, etc. are specific examples, and it is obvious to those skilled in the art that various changes can be made without departing from the spirit of the present invention.
또한, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예 또는 실험예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예 또는 실험예들에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예 또는 실험예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.In addition, the advantages and characteristics of the present invention and methods for achieving them will become clear with reference to examples or experimental examples described later in detail. Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples or experimental examples. However, these examples or experimental examples are intended to specifically explain the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
<실시예 1> 조류의 분리 및 동정<Example 1> Isolation and identification of algae
1-1. 미세조류의 생물학적 특징1-1. Biological characteristics of microalgae
녹조류의 분리 및 선별을 위해 2017년 4월 대한민국 울릉도 도동(37°29′51.5″N, 130°53′16.1″E)에서 담수 샘플을 채취하였다. 그 후 샘플을 실험실로 옮기고 250 mL 플라스크에 150 mL의 BG-11 배지(pH 7.4)에 접종하였다(Rippka et al., 1979). 접종된 시료는 형광등(약 55 μmol m-2s-1) 아래 16:8h light:dark의 광주기로 25℃에서 배양되었다. 배양은 orbital shaker(VS-202D, Vision Scientific, Bucheon, South Korea)를 사용해 160 rpm의 조건으로 배양하였다. 2주 배양 후, 조류 샘플을 BG-11(pH 7.4) 한천 플레이트에 스트리킹(streaking) 하였다. 그 후, 성장한 단일 콜로니는 무균 상태를 유지하여 신선한 BG-11 한천 플레이트로 옮겼다. 한 종으로 구성된 콜로니가 무균 상태로 획득될 때까지 전 과정을 반복하였다(Stanier et al., 1971).Freshwater samples were collected from Dodong (37°29′51.5″N, 130°53′16.1″E) in Ulleungdo, Republic of Korea in April 2017 for the isolation and screening of green algae. The samples were then transferred to the laboratory and 250 mL flasks were inoculated with 150 mL of BG-11 medium (pH 7.4) (Rippka et al., 1979). The inoculated samples were incubated at 25° C. under a fluorescent light (about 55 μmol m −2 s −1 ) with a photoperiod of 16:8h light:dark. Culture was incubated under conditions of 160 rpm using an orbital shaker (VS-202D, Vision Scientific, Bucheon, South Korea). After 2 weeks of culture, algae samples were streaked onto BG-11 (pH 7.4) agar plates. Thereafter, the single colonies that grew were aseptically transferred to fresh BG-11 agar plates. The entire process was repeated until colonies consisting of one species were obtained in sterile conditions (Stanier et al., 1971).
액체 배지에서 콜로니를 형성한 녹조류 균주는 울릉도 도동에서 분리된 균주이다(도 1a). 상기 세포의 평균 크기는 6.26 ± 1.34 μm으로 나타났다. B. sudetica KNUA107 균주(GenBank accession number MW683220) 액체 배지에서 단세포와 다세포 콜로니의 형태로 영양 세포를 성장시켰으며, 콜로니는 불규칙하고 세포 사이에 단단히 결합되어 있다(도 1b). The green algae strain that colonized in the liquid medium was isolated from Dodong, Ulleungdo (Fig. 1a). The average size of the cells was 6.26 ± 1.34 μm. B. sudetica strain KNUA107 (GenBank accession number MW683220) grew vegetative cells in the form of unicellular and multicellular colonies in liquid medium, and the colonies were irregular and tightly bound to each other (Fig. 1b).
UTEX 2629Botryococcus sp.
UTEX 138Neochloris aquatica
B. sudetica KNUA107 마커 유전자 서열의 NCBI blast 결과는 표 1에 기재하였다. 서열분석 결과 B. sudetica KNUA107이 Botryococcus sp., Botryosphaerella sudetica 및 Neochloris aquatica와 유사한 종으로 확인되었다(표 2). The NCBI blast results of the B. sudetica KNUA107 marker gene sequences are listed in Table 1. As a result of sequencing , B. sudetica KNUA107 was identified as a species similar to Botryococcus sp., Botryosphaerella sudetica and Neochloris aquatica (Table 2).
B. sudetica(95%)와 가장 높은 서열 유사성을 보였고, 뒤이어 Botryococcus sp.(92%) 및 N. aquatica(91%)의 유사도를 나타냈다. 본 발명의 녹조류의 일부가 B. sudetica KNUA107과 유사한 군체 형성 능력과 형태학적 특성과 유사한 것으로 보인다(Komarek, 1989; Senousy et al., 2004; Pribyl and Cepak, 2007; Tanoi et al., 2011). It showed the highest sequence similarity with B. sudetica (95%), followed by Botryococcus sp. (92%) and N. aquatica (91%). Some of the green algae of the present invention appear to have similar colony formation ability and morphological characteristics to B. sudetica KNUA107 (Komarek, 1989; Senousy et al., 2004; Pribyl and Cepak, 2007; Tanoi et al., 2011).
본 발명의 미세조류로 추정되는 B. sudetica는 이전에 Botryococcus sudeticus로 명명된 후 최근에 새로운 분류군으로 확립되었다. Botryosphaerella sp.의 세포 형태는 Botryococcus sp.의 세포 형태와 다르며, Neochloris sp.의 형태와 보다 유사하다. Botryosphaerella sp.와 Neochloris sp.의 구별은 형성된 콜로니는 형태와 특성으로 구분할 수 있다. B. sudetica , presumed to be the microalgae of the present invention, was previously named Botryococcus sudeticus and was recently established as a new taxon. The cell morphology of Botryosphaerella sp. is different from that of Botryococcus sp., but more similar to that of Neochloris sp.. The distinction between Botryosphaerella sp. and Neochloris sp. is based on the morphology and characteristics of colonies formed.
따라서, 위 3가지 속은 군체 형태로 구별 할 수 있는데 본 발명의 미세조류의 형태(도 1a)는 Botryosphaerella sp. 및 Neochloris sp.의 녹조류와 유사한 것으로 추정된다. 본 발명의 미세조류의 콜로니 형태(도 1b)를 고려하였을 때는 Botryosphaerella sp.와 군체의 형태 및 특성이 일치하였다. Therefore, the above three genera can be distinguished in the form of a colony, and the form of the microalgae of the present invention (Fig. 1a) is Botryosphaerella sp. and Neochloris sp. When considering the colony morphology of the microalgae of the present invention (FIG. 1b), the morphology and characteristics of the colony were consistent with Botryosphaerella sp.
B. sudetica KNUA107의 성장은 건조중량으로 추정되었다(Yoo et al., 2010). 샘플(3 mL)을 3일 간격으로 배양 플라스크에서 수집하고, 미리 칭량된 유리 섬유 필터로 여과하고 증류수로 세척하였다. 여과된 조류 세포 펠렛을 105℃의 건조 오븐에서 1일 동안 건조시킨 후 무게를 재었다(Yoo et al., 2010).The growth of B. sudetica KNUA107 was estimated by dry weight (Yoo et al., 2010). Samples (3 mL) were collected from culture flasks at 3-day intervals, filtered through pre-weighed glass fiber filters and washed with distilled water. The filtered algal cell pellets were dried in a drying oven at 105 °C for 1 day and weighed (Yoo et al., 2010).
엽록소 함량 분석은 OD680에서 100 mL 배양에서 조류 세포를 수확하여 수행되었다. 배양된 세포를 원심 분리하여 수확하고 펠렛을 90% 메탄올에 재현탁시켰다. 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하였다. 총 색소 함량 측정하기 위해 샘플을 초음파 처리하고 색소를 메탄올로 추출하였으며, 추출물의 OD666, OD653 및 OD470 값은 분광광도계로 측정되었다. 색소의 함량은 Lichtentaler와 Wellburn의 공식에 따라 측정된 OD값으로부터 계산되었다(Lichtenthaler and Wellburn, 1985). 색소와 엽록소 함량은 약 1개월 성장 후 12일과 30일에 측정하였다. 엽록소는 추출 가능한 색소이며, 카로티노이드 색소도 측정 가능한 것에 해당한다. 측정시 이전 연구의 방법(Schuurmans et al., 2015; Tubuxin et al., 2015; Sivakaminathan et al., 2018)을 사용하였다. Chlorophyll content assay was performed by harvesting algal cells from 100 mL cultures at OD 680 . Cultured cells were harvested by centrifugation and the pellet was resuspended in 90% methanol. All experiments were independently performed at least three times. To measure the total pigment content, the sample was sonicated and the pigment was extracted with methanol, and the OD 666 , OD 653 and OD 470 values of the extract were measured spectrophotometrically. The pigment content was calculated from the OD values measured according to the formula of Lichtentaler and Wellburn (Lichtenthaler and Wellburn, 1985). Pigment and chlorophyll contents were measured at 12 and 30 days after about 1 month of growth. Chlorophyll is an extractable pigment, and carotenoid pigments also correspond to measurable ones. For the measurement, the methods of previous studies (Schuurmans et al., 2015; Tubuxin et al., 2015; Sivakaminathan et al., 2018) were used.
선택된 균주는 다양한 환경 조건에서 대조군 보다 잘 자랐다. 엽록소를 분석한 결과에서도 선별된 균주는 대조군 균주보다 모든 색소 및 엽록소의 양이 많은 것으로 나타났다(Kim et al., 2018, 2020). 성장 6일 후, 포도당을 보충한 배지에서 엽록소와 색소 함량이 다른 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. B. sudetica KNUA107은 포도당을 보충했을 때(도 1c, 파랑색 선) 빠른 성장 회복률을 나타냈으며, 다른 혼합영양 배지에서 성장했을 때 보다 더 높은 생존율을 보였다. 포도당 보충 배지에서 배양 12일 및 30일 후, 엽록소(도 1d, e)와 총 색소 함량(도 1f)이 다른 혼합영양 배지에서 보다 약 2배 높은 것으로 나타났다.The selected strains grew better than the control under various environmental conditions. As a result of analyzing chlorophyll, the selected strains showed higher amounts of all pigments and chlorophyll than the control strain (Kim et al., 2018, 2020). After 6 days of growth, it was confirmed that the content of chlorophyll and pigment in the medium supplemented with glucose significantly increased compared to other control groups. B. sudetica KNUA107 showed a rapid growth recovery rate when supplemented with glucose (Fig. 1c, blue line), and showed a higher survival rate than when grown in other mixed nutrient media. After 12 and 30 days of culture in glucose-supplemented media, chlorophyll (Fig. 1d, e) and total pigment content (Fig. 1f) were found to be about twice as high as those in other mixed nutrient media.
1-2. 계통1-2. system
무균 분리된 B. sudetica KNUA107 균주의 분자식별을 위해 150 mL의 BG 11 배지에서 2주 동안 배양한 세포를 4000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 수집하고, 멸균 증류수로 2회 세척하였다. 수집된 조류 세포 2 mL를 microfuge tube에 넣고, 400 μL DNA 추출 버퍼(100 mM Tris HCl, 1 M KCl 및 10 mM EDTA)에 재현탁하였다. 8 μL RNAse A(50 mg/mL)와 멸균된 glass bead를 첨가한 후 현탁된 샘플을 5분 동안 볼텍싱하고 65℃에서 30분 동안 가열하였다. 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 400μL의 상층액을 새 튜브로 옮겼다. DNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 정제 키트(Wizard DNA Clean-Up System, Promega, Madison, WI, United States)로 정제되었다. 내부 전사 스페이서(Internal transcribed spacer, ITS), 리불로스 비스 포스페이트 카르복실라제 대형 서브 유닛(Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit, rbcL) 및 연장 인자 Tu(Tufa)를 마커 유전자로 사용하였다. ITS 영역은 하나의 프라이머 세트로 증폭되었고, rbcL 영역은 두 개의 프라이머 세트로 증폭되었으며, tufA 영역은 하나의 프라이머 세트로 증폭되었다. 본 발명에서 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다. 이후, 증폭된 DNA 단편은 제조사의 프로토콜에 따라 PCR Purification kit(Spin type-200, Elpis-Biotech, Daejeon, South Korea)로 정제하였다. For molecular identification of the aseptically isolated strain B. sudetica KNUA107, cells cultured for 2 weeks in 150 mL of BG 11 medium were collected by centrifugation at 4000 rpm for 10 minutes, and washed twice with sterile distilled water. 2 mL of collected algal cells were placed in a microfuge tube and resuspended in 400 μL DNA extraction buffer (100 mM Tris HCl, 1 M KCl and 10 mM EDTA). After adding 8 μL RNAse A (50 mg/mL) and sterilized glass beads, the suspended sample was vortexed for 5 minutes and heated at 65° C. for 30 minutes. Cell debris was removed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes, and 400 μL of the supernatant was transferred to a new tube. DNA was purified with a DNA purification kit (Wizard DNA Clean-Up System, Promega, Madison, WI, United States) according to the manufacturer's protocol. Internal transcribed spacer (ITS), ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (rbcL) and elongation factor Tu (Tufa) were used as marker genes. The ITS region was amplified with one primer set, the rbcL region was amplified with two primer sets, and the tufA region was amplified with one primer set. Primers used in the present invention are shown in Table 3. Then, the amplified DNA fragment was purified with a PCR Purification kit (Spin type-200, Elpis-Biotech, Daejeon, South Korea) according to the manufacturer's protocol.
DNA 시퀀싱을 위해 DNA 단편을 pGEM®-T Easy Vector 키트(Promega, Madison, WI, United States)로 정제하였다. DNA 염기 서열 분석은 제노텍 시설(대전, 제노텍)에서 수행되었다. 서열 정보는 NCBI를 참고하였다. 울릉도에서 수집한 B. sudetica KNUA107은 GenBank 수탁번호 MW683220을 받았다. 선택된 서열은 조류 균주간의 계통 발생 관계를 분석하기 위해 MEGA(버전 7.0) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석되었다(Kumar et al., 2016). Bayesian 정보 기준에 따라 각 마커 유전자의 최적 뉴클레오티드 치환 모델이 분석을 위해 사용되었다. 최대 가능성(Maximum likelihood, ML) 계통 발생 트리는 1,000 개의 부트스트랩(Bootstrap) 복제로 구축되었다(Felsenstein, 1985).For DNA sequencing, DNA fragments were purified with the pGEM ® -T Easy Vector kit (Promega, Madison, WI, United States). DNA sequencing was performed at the Genotech facility (Daejeon, Genotech). For sequence information, refer to NCBI. B. sudetica KNUA107 collected from Ulleungdo Island was given GenBank accession number MW683220. Selected sequences were analyzed using the MEGA (version 7.0) software package to analyze phylogenetic relationships between algal strains (Kumar et al., 2016). An optimal nucleotide substitution model of each marker gene according to the Bayesian information criterion was used for analysis. A maximum likelihood (ML) phylogenetic tree was built with 1,000 bootstrap replicates (Felsenstein, 1985).
보다 명확한 분류학적 계통 분석을 위해 ML trees를 사용하였다. 본 발명의 계통과 B. sudetica KNUA107 및 여러 녹조류 종의 ITS, rbcL 및 tufa 시퀀스를 기반으로 분석하여 나타낸 것이 도 2에 해당한다. 본 발명의 미세조류는 Botryococcus, Botryosphaerella 또는 Neochloris sp. 군과 유사한 것으로 나타났으며, 본 발명의 미세조류는 서열 유사성이 높은 세 균주와 가장 가까운 계통 발생 관계를 가지고 있음을 확인하였다. B. sudetica는 본 발명의 미세조류와 99%에 달하는 가장 높은 부트스트랩(Bootstrap)을 보였고, Botryococcus sp.는 91%, N. aquatica는 92%로 각각 나타났다. 본 발명의 미세조류는 B. sudetica와 가장 가까운 계통 발생 관계를 가짐을 알 수 있다. 따라서, 상기의 실험 및 분석 결과에 따라 본 발명의 신규한 미세조류 KNUA107는 Botryococcus sudetica으로 동정하였다.For a clearer taxonomic phylogenetic analysis, ML trees were used. Figure 2 shows the analysis based on the ITS, rbcL and tufa sequences of the strain of the present invention, B. sudetica KNUA107 and several green algae species. The microalgae of the present invention are Botryococcus , Botryosphaerella or Neochloris sp. It was found to be similar to the group, and it was confirmed that the microalgae of the present invention have the closest phylogenetic relationship with the three strains with high sequence similarity. B. sudetica showed the highest bootstrap of 99% with the microalgae of the present invention, Botryococcus sp. showed 91%, and N. aquatica showed 92%, respectively. It can be seen that the microalgae of the present invention have the closest phylogenetic relationship with B. sudetica . Therefore, according to the above experimental and analytical results, the novel microalgae KNUA107 of the present invention was identified as Botryococcus sudetica .
<실시예 2> 조류의 성장과 바이오매스 생산<Example 2> Algae growth and biomass production
30일된 Botryococcus sudetica KNUA107 배양물은 광독립영양 및 혼합영양 배양을 위해 준비되었다. 상기 조류 세포는 25℃의 광도의 배양기에서 160 rpm으로 회전 조건으로 배양되었다. 준비된 조류 세포는 약 156.67±20.81 mg/L로 희석되었다. BG-11 배지는 광독립영양 배양에 사용되었으며, 혼합영양 배양을 위해 40 mM의 유기 탄소원(수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스 및 리보스)을 BG-11 배지에 첨가하였다. 각 배지는 멸균한 후 150 mL를 250 mL 플라스크에 옮기고 제조된 조류 세포 15 mL를 접종하였다. 플라스크는 약 55 μmol m-2s-1 명기와 암기를 16:8시간의 주기로 조명된 인큐베이션 룸에서 orbital shaker의 160 rpm 조건하 25℃에서 배양되었다.30-day-old cultures of Botryococcus sudetica KNUA107 were prepared for photoautotrophic and mixed-trophic cultures. The algal cells were cultured in an incubator with a light intensity of 25° C. under rotation conditions of 160 rpm. Prepared algal cells were diluted to about 156.67 ± 20.81 mg/L. BG-11 medium was used for photoautotrophic culture, and 40 mM organic carbon sources (sucrose, glucose, fructose, galactose, and ribose) were added to the BG-11 medium for mixotrophic culture. After each medium was sterilized, 150 mL was transferred to a 250 mL flask and 15 mL of prepared algae cells were inoculated. The flask was incubated at 25 °C under conditions of 160 rpm of an orbital shaker in an incubation room illuminated with about 55 μmol m -2 s -1 bright period and dark period of 16:8 hours.
건조중량을 측정하여 배양된 B. sudetica KNUA107의 성장과 바이오매스 생산량을 측정하였다(도 3). 광독립영양조건에서 배양된 조류는 성장 기간이 가장 길었으며, 정지기에 도달하는데 30일 이상이 걸렸다. 최대 바이오매스 생산성은 1.94±0.75 g/L였다(도 3a). 이러한 결과는 광독립영양조건에서 B. sudetica KNUA107이 바이오매스 생산을 달성하기 위해 다른 녹조류 종보다 더 긴 배양 시간을 필요로 한다는 것을 시사한다. 그러나 배양 30일 후 생산된 바이오매스의 총량은 같은 성장기 이후 다른 녹조류 종보다 더 많았다.The growth and biomass production of the cultured B. sudetica KNUA107 were measured by measuring the dry weight (FIG. 3). Algae cultured under photoautotrophic conditions had the longest growth period, and it took more than 30 days to reach stationary phase. The maximum biomass productivity was 1.94±0.75 g/L (FIG. 3a). These results suggest that under photoautotrophic conditions, B. sudetica KNUA107 requires a longer cultivation time than other green algae species to achieve biomass production. However, the total amount of biomass produced after 30 days of cultivation was higher than that of other green algae species after the same growth period.
다음으로 5가지 유기 탄소원(40 mM의 수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스, 리보스)을 이용한 혼합영양 배양이 B. sudetica KNUA107의 바이오매스 생산성을 증가시키는지 조사하기 위해 각 조건에서 성장 패턴과 바이오매스 생산성을 분석하였다(도 3b).Next, to investigate whether mixed nutrient culture using five organic carbon sources (40 mM sucrose, glucose, fructose, galactose, and ribose) increases the biomass productivity of B. sudetica KNUA107, the growth pattern and biomass Productivity was analyzed (FIG. 3B).
수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스, 리보스와 같은 유기 탄소원을 사용하여 비교한 결과(Johnson and Alric, 2013; Sun et al., 2020), 포도당의 첨가가 배양 조류의 성장과 바이오매스 생산성을 증대시키는 것으로 나타났으며, 배양 9일째에 가장 많은 바이오매스를 생산하였다 (2.66±0.04 g/L). 테스트된 유기 탄소 공급원 중 세 가지인 과당, 갈락토오스 및 리보스를 각각 사용했을 때, 과당을 사용한 배지에서는 0.81±0.08 g/L, 갈락토스를 사용한 배지에서는 0.52±0.10 g/L, 리보스를 사용한 배지에서는 0.27±0.09 g/L의 생산성을 보였다. 이는 광독립영양 상태(1.94±0.75 g/L)에서 보다 낮은 생산량에 해당한다. 이와 달리, 수크로스가 함유된 배지에서는 광독립영양 상태와 유사한 정도의 성장과 생산량을 보였고, 수크로스가 첨가된 배지의 생산량은 1.96±0.08 g/L로 나타났다.Comparisons using organic carbon sources such as sucrose, glucose, fructose, galactose, and ribose (Johnson and Alric, 2013; Sun et al., 2020) show that the addition of glucose enhances the growth and biomass productivity of cultured algae. It was found that the most biomass was produced on the 9th day of culture (2.66±0.04 g/L). When using three of the organic carbon sources tested, fructose, galactose, and ribose, respectively, 0.81 ± 0.08 g/L in the medium using fructose, 0.52 ± 0.10 g/L in the medium using galactose, and 0.27 g/L in the medium using ribose. It showed a productivity of ±0.09 g/L. This corresponds to a lower yield in the photoautotrophic state (1.94 ± 0.75 g/L). In contrast, in the medium containing sucrose, growth and production were similar to those in the photoautotrophic state, and the production in the medium containing sucrose was 1.96±0.08 g/L.
또한, 혼합영양 배양의 바이오매스 생산성에 미치는 영향은 조류의 성장 변화를 관찰하여 분석 가능하다. 또한, 조류 배양의 세포 밀도는 측정된 건조중량에 비례한다. 포도당이 첨가된 조류 배양의 경우 광학 밀도의 최대 측정 범위(2.000)를 초과하여 OD값의 측정으로 세포 밀도를 분석하기 어려웠으나, 광독립영양 조건(1.698±0.039) 및 기타 혼합영양 조건(수크로스; 1.625±0.016, 과당; 0.722±0.013, 갈락토스; 0.389±0.036, 리보스; 0.313±0.015)에서 성장한 조류 배양은 건조중량에 비례하는 OD680 값을 가지는 것을 확인하였다. 이를 통해 포도당 혼합영양 조건에서 B. sudetica KNUA107이 고밀도로 배양될 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 또한, B. sudetica KNUA107 배양을 통해 생산된 바이오매스는 다른 녹조류 종보다 더 많이 생산되었지만 배양주기가 더 길었다.In addition, the effect of mixed nutrient culture on biomass productivity can be analyzed by observing the growth change of algae. Also, the cell density of an algae culture is proportional to the measured dry weight. In the case of algae culture with glucose added, it was difficult to analyze the cell density by measuring the OD value because the optical density exceeded the maximum measurement range (2.000), but under photoautotrophic conditions (1.698 ± 0.039) and other mixed nutrition conditions (sucrose ; 1.625 ± 0.016, fructose; 0.722 ± 0.013, galactose; 0.389 ± 0.036, ribose; 0.313 ± 0.015) was confirmed to have an OD 680 value proportional to dry weight. From this, it can be expected that B. sudetica KNUA107 can be cultured at a high density under glucose mixotrophic conditions. In addition, biomass produced by culturing B. sudetica KNUA107 was higher than that of other green algae species, but the cultivation cycle was longer.
따라서, 녹조류의 성장을 촉진하고 배양주기를 감소시키고 바이오매스 생산성을 향상시키기 위해 혼합영양 배양 조건으로 실험을 수행하였다. 혼합영양배양조건에서 포도당의 첨가는 성장과 바이오매스 생산성을 향상시키고 배양주기를 30일에서 9 내지 12일로 단축시킬 수 있었다. 바이오매스 생산성은 0.72 g/L로 보다 증가한 것으로 나타났다.Therefore, in order to promote the growth of green algae, reduce the culture cycle, and improve biomass productivity, experiments were performed under mixed nutrient culture conditions. In mixed nutrient culture conditions, the addition of glucose could improve growth and biomass productivity and shorten the culture cycle from 30 days to 9 to 12 days. The biomass productivity was found to be more increased to 0.72 g/L.
일반적으로 B. sudetica의 성장은 유기 탄소원의 첨가로 인해 혼합영양 조건에서 향상되는 것으로 알려져있다. 그러나, 본 발명의 B. sudetica KNUA107은 포도당만을 영양분으로 공급하였을 때, 성장이 촉진되었으며 일부 유기 탄소원은 오히려 B. sudetica KNUA107의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 혼합영양 배양이 녹조류의 배양주기를 단축시키고, 바이오매스 생산성을 향상시킬 수 있음을 시사한다.In general, it is known that the growth of B. sudetica is enhanced under mixed nutrient conditions due to the addition of an organic carbon source. However, the growth of B. sudetica KNUA107 of the present invention was promoted when only glucose was supplied as a nutrient, and some organic carbon sources rather inhibited the growth of B. sudetica KNUA107. These results suggest that mixed nutrient culture can shorten the cultivation cycle of green algae and improve biomass productivity.
<실시예 3> 정착성 분석 및 군락형성<Example 3> Settlement analysis and colony formation
정착 가능성과 관련된 표현형인 콜로니 크기는 0일부터 3일 간격으로 수집된 샘플에서 측정되었다. 콜로니 직경은 광학 현미경(Nikon Eclipse E100 Biological Microscope, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정되었다. 각 시험 조건에서 배양한 B. sudetica KNUA107의 침강도를 비교하기 위해 30일된 샘플을 원심분리하여 수집하였다. 샘플을 충분히 재현탁하고 각각 10 mL를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 21개의 원뿔형 튜브 세트를 사용하여 각 배양 조건에 대한 안정도를 측정하였다. 측정에 앞서 한 세트의 튜브를 동시에 뒤집고, 샘플에서 9 mL의 상층액을 분리하고 상등액(9 mL)과 침전물(9 mL)에 포함된 조류 세포의 건조 중량을 별도로 측정하여 튜브 1개를 분당 측정하였다. 측정은 배양 조건당 3세트로 1세트에 20분 동안 수행되었다.Colony size, a phenotype associated with colonization potential, was measured on samples collected at 3-day intervals starting at
광독립영양 및 혼합영양 조건에서 배양된 B. sudetica KNUA107의 콜로니 형성 능력과 침강성 분석 결과는 도 4에 나타내었다. 콜로니 형성 능력의 변화를 확인하기 위해 각 조건에서 형성된 조류 콜로니의 직경을 측정하였다(도 4a, b). 배양 배지에 추가된 탄소원은 평균 콜로니 크기에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 포도당을 탄소원으로 공급되는 경우 가장 큰 콜로니(137.25±36.57 μm)가 관찰되었으며, 리보스(61.84±22.93 μm)가 탄소원으로 공급되는 경우 가장 작은 콜로니가 관찰되었다. 다른 혼합영양 조건 및 광독립영양조건(BG-11)에서 얻은 콜로니 크기는 평균 80 내지 100 μm (95.12±24.62 μm)의 크기로 나타났으며, 수크로스를 탄소원으로 공급한 경우 98.23±16.67 μm, 과당을 탄소원으로 공급한 경우 89.42±16.30 μm, 갈락토스를 탄소원으로 공급한 경우 82.42±22.73 μm로 측정되었다.The results of colony formation ability and sedimentation of B. sudetica KNUA107 cultured under photoautotrophic and mixed trophic conditions are shown in FIG. 4 . In order to confirm the change in colony formation ability, the diameter of algae colonies formed under each condition was measured (Fig. 4a, b). The carbon source added to the culture medium has been shown to affect average colony size. The largest colony (137.25±36.57 μm) was observed when glucose was supplied as the carbon source, and the smallest colony was observed when ribose (61.84±22.93 μm) was supplied as the carbon source. The average size of colonies obtained under different mixed and photoautotrophic conditions (BG-11) was 80 to 100 μm (95.12±24.62 μm), and when sucrose was supplied as a carbon source, 98.23±16.67 μm, It was measured as 89.42±16.30 μm when fructose was supplied as a carbon source and 82.42±22.73 μm when galactose was supplied as a carbon source.
콜로니 크기는 포도당을 영양원으로 사용한 경우, 9 내지 12일이면 평균 콜로니 크기로 성장하였으나 다른 탄소원의 경우 27 내지 30일이 소요되었다. 탄소원에 따른 콜로니 크기 증가 패턴은 정상적인 B. sudetica KNUA107 성장과 크게 다르지 않았다. 각 조건에서 형성된 콜로니의 침강성은 퇴적물 건조 중량을 사용하여 추정되었다(도 4c-j). 침전물 건조 중량은 배양 조건 모두에서 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 나타났다(도 4c, d). 포도당이 보충된 배지의 건조 중량은 측정 1분 후에 증가하는 것을 멈췄다. BG-11 배지에서 8분, 수크로스가 함유된 배지에서 6분, 과당이 함유된 배지에서 3분, 갈락토스가 함유된 배지에서는 3분, 리보스가 함유된 배지에서는 3분에 건조 중량이 더 이상 증가되지 않았다. 모든 혼합영양 조류배양은 광독립영양 배양보다 더 빠르게 건조 중량의 증대의 한계가 도래한 것으로 확인되었다. 포도당을 유기 탄소원으로 사용하면, B. sudetica KNUA107 건조 중량의 최대 증식이 단기간 내에 가능하였으며, 이는 광독립영양 조건 보다 약 8배 빠르게 성장이 이루어진 것으로 계산된다. 포도당이 보충된 배지는 가장 높은 생산성을 가지는 것으로 나타났고, 전체 바이오매스의 84.02 내지 95.47%에 달한다. 그러나 침전된(Settled) 바이오매스의 비율은 다른 배양 조건에서 80% 미만이었으며 BG-11배지에서는 64.37 내지 78.74%, 수크로스가 함유된 배지에서는 56.86 내지 70.47%, 과당이 함유된 배지에서는 43.75 내지 64.20%, 갈락토스가 함유된 배지에서는 51.35 내지 76.84%, 리보스 함유된 배지에서는 50.69 내지 65.47%인 것으로 나타났다(도 4e-j).When glucose was used as a nutrient source, colonies grew to an average size in 9 to 12 days, but in the case of other carbon sources, it took 27 to 30 days. The pattern of colony size increase according to the carbon source was not significantly different from normal B. sudetica KNUA107 growth. Settling properties of colonies formed in each condition were estimated using the sediment dry weight (Fig. 4c-j). Sediment dry weight appeared to increase over time in both culture conditions (Fig. 4c, d). The dry weight of the medium supplemented with glucose stopped increasing after 1 min of measurement. At 8 minutes on BG-11 medium, 6 minutes on medium containing sucrose, 3 minutes on medium containing fructose, 3 minutes on medium containing galactose, and 3 minutes on medium containing ribose, the dry weight no longer did not increase It was confirmed that all mixotrophic algae cultures reached the limit of dry weight gain faster than photoautotrophic cultures. When glucose was used as an organic carbon source, the maximum dry weight growth of B. sudetica KNUA107 was possible within a short period of time, which was calculated to be about 8 times faster than under photoautotrophic conditions. The medium supplemented with glucose was found to have the highest productivity, ranging from 84.02 to 95.47% of the total biomass. However, the proportion of settled biomass was less than 80% under different culture conditions, ranging from 64.37 to 78.74% in BG-11 medium, 56.86 to 70.47% in sucrose-containing medium, and 43.75 to 64.20 in fructose-containing medium. %, 51.35 to 76.84% in the medium containing galactose and 50.69 to 65.47% in the medium containing ribose (FIG. 4e-j).
도 4a는 공급 유기탄소원별 조류의 세포크기를 측정한 사진이다. 광독립영양 조건에서 B. sudetica KNUA107 세포의 크기가 평균 6.26±1.34 μm이었지만 혼합영양 조건에서는 크기가 보다 작게 나타났다. 측정된 세포 크기는 수크로스를 첨가한 배지에서 5.32±1.56 μm, 포도당을 첨가한 배지에서 3.44±0.48 μm, 과당을 첨가한 배지에서 4.52±0.79 μm, 갈락토스를 첨가한 배지에서 3.94±0.15 μm, 리보스를 첨가한 배지에서 3.58±0.47 μm로 측정되었다. 포도당이 첨가된 배지에서 배양된 세포가 가장 작았지만 조류 자체로는 137.25±36.57 μm의 크기로 가장 큰 콜로니를 형성하였다. Figure 4a is a photograph of measuring the cell size of algae for each supplied organic carbon source. The average size of B. sudetica KNUA107 cells under photoautotrophic conditions was 6.26±1.34 μm, but smaller under mixed nutrition conditions. The measured cell size was 5.32±1.56 μm in the medium supplemented with sucrose, 3.44±0.48 μm in the medium supplemented with glucose, 4.52±0.79 μm in the medium supplemented with fructose, 3.94±0.15 μm in the medium supplemented with galactose, It was measured at 3.58±0.47 μm in medium supplemented with ribose. The cells cultured in the medium supplemented with glucose were the smallest, but the alga itself formed the largest colony with a size of 137.25±36.57 μm.
콜로니 크기는 정착(Settle) 가능성에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나이다. 본 발명의 미세조류의 정착성은 혼합영양 조건에 따라 차이가 있었으며, 포도당을 첨가한 경우 정착성이 증대되는 것으로 나타났다. 또한, 다른 조건에서의 성장 패턴은 콜로니 크기의 변화를 야기하였다. 이러한 결과는 B. sudetica KNUA107의 성장 및 콜로니 형성 능력이 포도당 보충에 의해 유사하게 향상되었음을 보여주었다.Colony size is one of the major factors influencing settlement potential. The fixability of the microalgae of the present invention was different depending on the mixed nutrient conditions, and it was found that the fixability increased when glucose was added. In addition, growth patterns under different conditions caused changes in colony size. These results showed that the growth and colony formation ability of B. sudetica KNUA107 were similarly enhanced by glucose supplementation.
침강율과 침강된 바이오매스의 비율은 침강성을 평가하기 위한 기준으로 사용되었다. 가장 빠른 침강 속도와 침전된 바이오매스의 가장 높은 비율은 포도당과 혼합영양 조건에서 측정되었다. 다른 배양 조건에서도 이와 유사한 경향으로 성장하였다. 침강 속도와 침강된 바이오매스의 비율을 바탕으로 혼합영양 조건에 의해 유도된 콜로니 크기의 변화가 침강성 변화와 관련이 있음을 확인하였다. 따라서 이러한 결과는 포도당이 보충된 혼합영양 상태가 B. sudetica KNUA107의 콜로니 형성 능력과 침강성을 향상시킨다는 점을 시사한다. 이러한 결과는 B. sudetica KNUA107 균주에서 혼합영양 조건으로 배양하는 경우 생물자원 수확 효율을 높아진다 는 것을 의미한다.The sedimentation rate and the percentage of biomass settled were used as criteria to evaluate sedimentation. The fastest sedimentation rates and highest proportions of biomass settled were measured under glucose and mixed nutrient conditions. Similar trends were observed in other culture conditions. Based on the sedimentation rate and the ratio of sedimented biomass, it was confirmed that the change in colony size induced by mixed trophic conditions was related to the change in sedimentation. Therefore, these results suggest that the glucose-supplemented mixed trophic state improves the colony formation ability and sedimentation of B. sudetica KNUA107. These results indicate that the biomass harvest efficiency increases when the B. sudetica KNUA107 strain is cultured under mixed nutrient conditions.
<실시예 4> 바이오매스 수집 및 지질 함량 분석<Example 4> Biomass collection and lipid content analysis
4-1. 바이오매스 수집 및 지질 추출4-1. Biomass collection and lipid extraction
지질 함량 분석을 위해 배양 기간의 대수성장기(12일)과 배양 후 30일에 조류를 수득한 후 4,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 조류 바이오매스를 수집하였다. 수집된 세포는 동결건조시켰다. For lipid content analysis, algal biomass was collected by centrifugation at 4,000 rpm for 30 minutes after obtaining algae at the logarithmic growth period (12 days) and 30 days after culture. Collected cells were lyophilized.
설포포스포바닐린 비색법(Sulfo-phosphovanillin colorimetric method)을 이용하여 상기 바이오매스에 함유된 총 지질 함량을 분석하였으며, 카놀라 오일(Canola oil)을 사용하여 equation과 standard curve을 생성하였다. 구체적으로, 미세하게 분쇄된 동결건조 샘플(10 mg)을 새로운 튜브에 넣고 1 mL의 증류수에 재현탁하였다. 재현탁된 샘플의 다른 부피(10, 20, 30, 40 및 50 μL)를 유리관에 첨가한 다음 증류수로 최대 100 μL까지 채웠다. 각 유리관에 황산(2 mL)을 첨가하고 혼합물을 수조에서 100℃에서 5분 동안 가열하였다. 가열 후 샘플을 얼음에서 5분 동안 냉각시키고, 각 튜브에 5 mL의 포스포바닐린 시약을 첨가하였다. 혼합물을 37℃의 인큐베이터에서 15분 동안 200 rpm의 조건으로 배양하였다. 530 nm에서의 광학 밀도(OD530)는 충분한 반응이 있는 혼합물에서 측정되었으며, 총 지질 함량은 측정된 값을 기반으로 계산되었다. The total lipid content contained in the biomass was analyzed using a sulfo-phosphovanillin colorimetric method, and an equation and standard curve were generated using canola oil. Specifically, a finely ground lyophilized sample (10 mg) was placed in a new tube and resuspended in 1 mL of distilled water. Different volumes (10, 20, 30, 40 and 50 μL) of the resuspended sample were added to the glass tubes and then filled up to 100 μL with distilled water. Sulfuric acid (2 mL) was added to each glass tube and the mixture was heated in a water bath at 100 °C for 5 minutes. After heating, the samples were cooled on ice for 5 minutes, and 5 mL of phosphovanillin reagent was added to each tube. The mixture was incubated at 200 rpm for 15 minutes in an incubator at 37°C. The optical density at 530 nm (OD 530 ) was measured in the sufficiently reactive mixture, and the total lipid content was calculated based on the measured value.
지질을 추출하고 가스크로마토그래피/질량 분광법(GC/MS)으로 분석하여 조성과 함량을 결정하였다. 동결건조된 시료(30 mg)를 분쇄하고 시료의 지질을 클로로포름:메탄올(1:1)을 사용하여 추출한 후, 회전 증발기를 사용하여 추출된 혼합물에서 클로로포름을 제거하였다. 지질 에스테르 교환을 촉진하기 위해 추출된 혼합물을 메탄올 및 수산화칼륨 시약으로 처리하였다. 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 분리를 위해 헥산을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃의 수조에서 3시간 동안 가열하였다. FAME 함량을 계산하기위한 외부 표준(external standard)으로 GLC-90(SUPEL Co, Bellefonte, PA, United States)을 사용하여 헥산층을 분석하였다. 내부 표준(internal standard)은 헬륨을 운반체로 사용했으며, 지방산 조성은 표준물질 대신 W11N17MAIN 화학 라이브러리 데이터베이스를 사용하여 분석되었다. 5973N 질량 선택 검출기(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 및 HP-5MS 모세관 컬럼(30m×0.25 mm ID×0.25 μm 필름)이 장착된 6890N 가스크로마토그래피(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 및 HP-5MS capillary column(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm film thickness; Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)를 사용하여 FAME에 포함된 지질을 분석하였다.Lipids were extracted and analyzed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) to determine composition and content. The lyophilized sample (30 mg) was pulverized and the lipids of the sample were extracted using chloroform:methanol (1:1), and then chloroform was removed from the extracted mixture using a rotary evaporator. The extracted mixture was treated with methanol and potassium hydroxide reagent to promote lipid transesterification. Hexane was added to the mixture for separation of fatty acid methyl esters (FAMEs). The reaction mixture was heated in a water bath at 70° C. for 3 hours. The hexane layer was analyzed using GLC-90 (SUPEL Co, Bellefonte, PA, United States) as an external standard for calculating the FAME content. The internal standard used helium as a carrier, and the fatty acid composition was analyzed using the W11N17MAIN chemical library database instead of the standard. 6890N gas chromatography (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) equipped with a 5973N mass selective detector (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) and an HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm ID × 0.25 μm film) And HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm ID × 0.25 μm film thickness; Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) was used to analyze lipids contained in FAME.
4-2. 지질 생산성4-2. lipid productivity
혼합영양 배지를 이용하여 생산된 바이오매스에서 지질을 추출하여 지질 생산성과 품질을 분석하였다(도 5). 30일에 수확된 바이오매스는 총 지질함량이 12 내지 18%로 나타났으며(도 5a), 광독립영양 조건에서 12.83±0.96%로 가장 낮았다. 혼합영양 조건하의 바이오매스는 수크로스가 함유된 배지에서 14.13±0.67%, 포도당이 함유된 배지에서 17.39±1.17%, 과당이 함유된 배지에서 14.34±1.13%, 갈락토스가 함유된 배지에서 13.66±1.15%, 리보스가 함유된 배지에서 13.74±2.16%로 광독립영양 조건보다 총 지질 함량이 전반적으로 높은 함유량을 가지는 것으로 나타나긴 하였으나 그 차이가 미미한 것으로 나타났다. 그러나 포도당이 함유된 배지에서는 광독립영양 조건보다 현저히 높은 지질 생산의 증대를 나타냈다. Lipids were extracted from biomass produced using a mixed nutrient medium and lipid productivity and quality were analyzed (FIG. 5). The biomass harvested on
지질 수율은 총 지질 함량의 결과를 기반으로 계산되었다. 지질 수율은 과당 첨가시 0.10±0.02 g/L, 갈락토스 첨가시 0.06±0.02 g/L 및 리보스 첨가시 0.03±0.01 g/L로 광독립영양 조건(0.25±0.05 g/L)보다 오히려 낮은 수율을 갖는 것으로 나타났다. 포도당 첨가 배지에서만 유일하게 지질 생산량을 증대시키는 것으로 나타났으며, 평균 0.35±0.01 g/L의 수율을 보였다. B. sudetica KNUA107은 포도당 혼합영양 조건에서 최대 성장이 나타나는 시점인 12일 이후 바이오매스의 총 지질 함유량 및 지질 생산성을 측정하였다(도 5b, c). 광독립영양 조건에서 배양 후 12일째의 바이오매스의 지질함량은 12.76±1.04%로 배양 후 30일째의 바이오매스의 지질함량은 12.83±0.96%로 총 지질 함량의 유의한 차이가 없었다. 이와 대조적으로 총 지질 함량은 혼합영양 조건에서 12일째 바이오매스 지질함량(수크로스 14.13±0.67%, 포도당 17.39±1.17%)이 30일째 바이오매스 지질함량(수크로스 12.27±1.13%, 포도당 14.86±0.81%)보다 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 최대 생산성을 보이는 12일 이후로는 지질함량이 감소한다는 것을 의미한다. Lipid yield was calculated based on the results of total lipid content. The lipid yield was 0.10 ± 0.02 g / L when fructose was added, 0.06 ± 0.02 g / L when galactose was added, and 0.03 ± 0.01 g / L when ribose was added. appeared to have It was found to increase lipid production only in the glucose-added medium, and showed an average yield of 0.35±0.01 g/L. B. sudetica KNUA107 was measured for total lipid content and lipid productivity of biomass after 12 days, when the maximum growth was observed under glucose mixtrophic conditions (Fig. 5b, c). In photoautotrophic conditions, the lipid content of biomass on
지질 생산성은 수크로스 첨가 조건의 경우 12일째 0.06±0.01 g/L, 30일째 0.25±0.05 g/L로 나타났으며, 광독립영양조건에서는 12일째 0.09±0.02 g/L 및 30일째 0.25±0.01 g/L로 나타났다. 즉, 수크로스 첨가 조건 및 광독립영양 조건에서는 12일차보다 30일차에서 더 높았다. 포도당 첨가 조건에서는 지질함량이 12일째 0.39±0.01 g/L, 30일째에 0.35±0.01 g/L로 유사하였다. 총 지질 함량과 지질 생산성은 배양 기간에 관계없이 포도당을 첨가한 혼합영양 조건에서 가장 높았다. 또한, 바이오매스 생산성도 포도당을 첨가한 배지에서 가장 높았다. Lipid productivity was 0.06±0.01 g/L on the 12th day and 0.25±0.05 g/L on the 30th day in the case of sucrose addition conditions, and 0.09±0.02 g/L on the 12th day and 0.25±0.01 on the 30th day under the photoautotrophic condition. It was expressed as g/L. That is, it was higher on the 30th day than on the 12th day under the sucrose addition condition and the photoautotrophic condition. In the condition of adding glucose, the lipid content was similar at 0.39±0.01 g/L on the 12th day and 0.35±0.01 g/L on the 30th day. Total lipid content and lipid productivity were highest in mixed nutrition conditions with glucose added regardless of the culture period. Also, biomass productivity was highest in the medium containing glucose.
4-3. 지질의 구성4-3. composition of lipids
지질 생산성이 향상된 바이오매스에서 추출된 FAME의 지방산 함량 구성을 분석하였다(도 5d, e 및 표 2). 광독립영양 조건하에서 바이오매스에서 추출된 FAME은 주로 C16:0(12일 15.64±0.68%, 30일 24.54±0.06%), C16:3(12일, 20.57±0.32%, 30일, 16.42±0.04%) 및 C18:3(12일, 38.38±1.34% 및 30일, 38.23±0.89%)로 구성되어있었다. 또한, 배양이 진행됨에 따라 C16:0이 증가하고 C16:3이 감소하였다. 수크로스를 첨가한 혼합영양 조건에서 얻은 바이오매스의 FAME은 주로 C16:0(12일 14.11±0.08%, 30일 18.98±0.38%), C16:3(12일 23.90±0.68%, 30일, 15.82±0.17%), C18:1 (12일, 8.12±0.11%, 30일, 17.91±0.34%), C18:3(12일, 36.01±0.01%, 30일, 28.92±0.68%)로 구성되었고 지방산의 비율은 광독립영양 조건과 유사하였다. 그러나 배양이 진행됨에 따라 수크로스를 첨가한 배지에서는 지방산 C18:1은 증가하고, C18:3은 감소하였다.The fatty acid content composition of FAMEs extracted from biomass with improved lipid productivity was analyzed (Fig. 5d, e and Table 2). FAMEs extracted from biomass under photoautotrophic conditions were mainly C16:0 (15.64±0.68% on
BG-11 배지에 포도당을 첨가하여 혼합영양 조건으로 배양하는 경우 생산된 바이오매스는 뚜렷한 특성을 가진 지방산을 함유하는 것으로 나타났다. 주로 C16:0(12일, 24.71±0.40%, 30일, 27.66±0.74%), C18:1(12일, 26.55±0.61%, 30일, 35.42±0.51%), 및 C18:3(12일, 18.72±0.97%, 30일, 11.47±0.33%)으로 구성되는 것을 나타났으며, 분석된 모든 샘플은 지방산 C16:0 및 C18:1의 비율이 가장 높았다. 다른 조건에서는 지방산 C18:3은 25 내지 40%로 구성되었으나 포도당 첨가 배지의 경우 20% 미만으로 구성되는 것으로 나타났다. When cultured under mixed nutrient conditions by adding glucose to BG-11 medium, the produced biomass was found to contain fatty acids with distinct characteristics. Mainly C16:0 (12 days, 24.71±0.40%, 30 days, 27.66±0.74%), C18:1 (12 days, 26.55±0.61%, 30 days, 35.42±0.51%), and C18:3 (12 days) , 18.72±0.97%, 30 days, 11.47±0.33%), and all samples analyzed had the highest ratios of fatty acids C16:0 and C18:1. Under other conditions, fatty acid C18:3 constituted 25-40%, but was found to constitute less than 20% in glucose-supplemented media.
분석된 지방산은 포화지방산(SFA; C16:0, C17:0, C18:0, C20:0, C22:0), 단일 불포화 지방산(MUFA; C16:1 및 C18:1), 및 다중 불포화 지방산(PUFA; C16:2, C16:3. C18:2 및 C18:3)으로 분류하여 FAME의 지방산 구성에 대해 분석하였다(도 5c 및 표 2). 광독립영양배양에서 12일부터 30일 사이에 PUFA(12일, 69.35±2.11%, 30일, 66.85±1.13%)의 변화가 거의 없었던 반면, MUFA(12일, 13.24±0.13%, 30일, 6.43±0.20%)는 감소한 것으로 나타났으며, SFA(12일, 17.42±1.05%, 30일, 26.72±0.07%)는 증가한 것으로 나타났다. 혼합영양배양에서 PUFA는 수크로스 첨가 배지에서 증가하였으며(12일, 69.73±0.81%, 30일, 55.91±1.32%), 반대로 포도당 첨가 배지에서는 감소하는 것으로 나타났다(12일, 39.67±1.25%, 30일, 24.63±1.37%). MUFA는 수크로스 첨가 배지에서 증가하였으며(12일, 15.24±0.41%, 30일, 23.01±1.34%), 포도당 첨가 배지에서는 감소하는 것으로 나타났다(12일, 34.15±0.79%, 30일, 44.18±0.98%). SFA는 수크로스 첨가 배지에서(12일, 15.03±0.11%, 30일, 21.08±0.39%) 증가하였으며, 포도당 첨가 배지에서도 증가하는 것으로 나타났다(12일, 26.18±0.48%, 30일, 31.19±0.98%).The analyzed fatty acids were saturated fatty acids (SFA; C16:0, C17:0, C18:0, C20:0, C22:0), monounsaturated fatty acids (MUFA; C16:1 and C18:1), and polyunsaturated fatty acids ( PUFAs; C16:2, C16:3. C18:2 and C18:3) were analyzed for the fatty acid composition of FAMEs (Fig. 5c and Table 2). In photoautotrophic culture, there was little change in PUFA (12 days, 69.35±2.11%, 30 days, 66.85±1.13%) between 12 and 30 days, whereas MUFA (12 days, 13.24±0.13%, 30 days, 6.43±0.20%) was found to decrease, and SFA (12 days, 17.42±1.05%, 30 days, 26.72±0.07%) increased. In the mixed nutrient culture, PUFA increased in sucrose-added medium (12 days, 69.73 ± 0.81%, 30 days, 55.91 ± 1.32%), but decreased in glucose-added medium (12 days, 39.67 ± 1.25%, 30 days). day, 24.63±1.37%). MUFA increased in sucrose supplemented medium (15.24±0.41% on
그러나 수크로스 첨가 배지에서의 PUFA 함량은 50% 이상으로 광독립영양 조건하의 함량과 거의 유사하였고, 포도당 조건 하에서 얻은 함량과는 현저한 차이가 있었다. 가장 낮은 PUFA와 가장 높은 MUFA 및 SFA 함량을 가지는 FAME(지방산 메틸 에스테르, 바이오디젤)은 포도당이 첨가된 혼합영양 조건에서 관찰되었다. 또한, 포도당은 PUFA 함량보다 MUFA 및 SFA 함량을 높인 유일한 탄소원으로 확인되었다. 지질은 녹조류를 생물자원으로 사용하여 얻을 수 있는 유용한 물질이다. 조류 바이오매스의 지질 함량을 높이기 위해 녹색 조류에 생물적 및 비생물적 스트레스를 주는 방법이 모색되었다. 예를 들어, 질소 공급 및 공급원 유형(예: 질산염)의 제어는 중량 단위에 대한 지질 비율을 증가시켰다. 그럼에도 불구하고 증가된 지질 함량은 바이오매스 생산성에 긍정적인 영향을 미치지 않았다. 그러나 유기 탄소 공급원을 제공하는 혼합영양 조건을 적용함으로써 생물학적 및 비생물적 스트레스 하에서 지질 생산성을 더욱 높일 수 있었다. 미세조류 바이오매스와 지질 생산은 혼합영양 배양 하에서 향상될 수 있다. 포도당이 첨가된 혼합영양 조건 하에서 B. sudetica KNUA107을 배양하여 지질 함량과 지질 생산성을 향상시켰다. 또한, 혼합영양 조건에서 증가된 지방산의 대부분이 포화 지방산에 해당됨을 확인하였다. B. sudetica KNUA107 배양에서 Mixotrophic 조건을 적용하면 지질 생산성을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 또한, 포도당을 유기 탄소원으로 제공함으로써 MUFA 및 SFA 함량이 강화된 고품질 지방산을 생산할 수 있다.However, the PUFA content in the sucrose-added medium was more than 50%, almost similar to the content under photoautotrophic conditions, and there was a significant difference from the content obtained under glucose conditions. FAME (fatty acid methyl ester, biodiesel) with the lowest PUFA and the highest MUFA and SFA contents were observed in the mixed nutrient condition with added glucose. In addition, glucose was identified as the only carbon source that increased the MUFA and SFA content over the PUFA content. Lipids are useful substances that can be obtained by using green algae as a biological resource. Methods of applying biotic and abiotic stress to green algae to increase the lipid content of algal biomass have been explored. For example, control of nitrogen supply and source type (eg, nitrate) increased the lipid to weight ratio. Nevertheless, increased lipid content did not positively affect biomass productivity. However, lipid productivity could be further enhanced under biotic and abiotic stresses by applying mixed-trophic conditions that provide an organic carbon source. Microalgal biomass and lipid production can be enhanced under mixed nutrient culture. The lipid content and lipid productivity were improved by culturing B. sudetica KNUA107 under mixed nutrient conditions supplemented with glucose. In addition, it was confirmed that most of the fatty acids increased under mixed nutrition conditions corresponded to saturated fatty acids. This suggests that the application of Mixotrophic conditions in B. sudetica KNUA107 culture can improve lipid productivity. In addition, by providing glucose as an organic carbon source, high-quality fatty acids with enhanced MUFA and SFA content can be produced.
이러한 결과는 B. sudetica KNUA107 (수탁번호 KCTC 14645BP)를 포도당이 첨가된 BG-11 배지에서 혼합영양배양 조건 하에 배양하여 생산된 바이오매스는 높은 침전성을 가져 바이오매스 수확 효율을 현저히 향상시킬 뿐만 아니라 이를 통해 생산된 바이오매스는 포화지방산 및 단일불포화지방산 함량이 높아 바이오디젤의 원료로 이용될 수 있다는 것을 의미한다.These results show that the biomass produced by culturing B. sudetica KNUA107 (Accession No. KCTC 14645BP) in glucose-added BG-11 medium under mixed nutrient culture conditions not only significantly improves biomass harvesting efficiency due to its high sedimentation property. The biomass produced through this means that it can be used as a raw material for biodiesel due to its high content of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.As described above, the specific embodiments of the present invention have been described in detail, but those skilled in the art who understand the spirit of the present invention may add, change, delete, etc. other components within the scope of the same idea, and other degenerate inventions. However, other embodiments included within the scope of the present invention can be easily suggested. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description above, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and equivalent concepts thereof are included in the scope of the present invention. should be interpreted as
Claims (12)
A new strain of Botryosphaerella sudetica with accession number KCTC 14645BP ( Botryosphaerella sudetica ).
A composition for producing biodiesel comprising the novel Botriosperella suetica strain of claim 1 as an active ingredient.
상기 1단계에서 배양된 균주로부터 바이오매스(biomass)를 수집하는 2단계; 및
상기 2단계의 바이오매스로부터 지질을 추출하는 3단계;를 포함하는, 바이오디젤의 생산방법.
A first step of culturing a Botryosphaerella sudetica strain in a culture medium to which an organic carbon source is added;
A second step of collecting biomass from the strain cultured in step 1; and
3 step of extracting lipids from the biomass of step 2; including, a method for producing biodiesel.
상기 방법은 상기 3단계의 지질로부터 지방산 메틸 에스테르(FAME)을 분리하는 제4단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 3,
The method further comprises a fourth step of separating fatty acid methyl ester (FAME) from the lipid of the third step; characterized in that it further comprises a method for producing biodiesel.
상기 균주는 보트리오스페렐라 수테티카 KNUA107(Botryosphaerella sudetica KNUA107, 수탁번호 KCTC 14645BP)인 것인, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 3,
The strain is Botryosphaerella Sutetica KNUA107 ( Botryosphaerella sudetica KNUA107, accession number KCTC 14645BP), a method for producing biodiesel.
상기 유기 탄소원은 수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스 및 리보스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이상의 유기 탄소원인 것을 특징으로 하는, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 3,
The organic carbon source is a method for producing biodiesel, characterized in that at least one organic carbon source selected from the group consisting of sucrose, glucose, fructose, galactose and ribose.
상기 1단계의 배양은 혼합영양배양 조건하에 12 내지 30일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 3,
Characterized in that the culturing of the first step is performed for 12 to 30 days under mixed nutrient culture conditions, a method for producing biodiesel.
상기 혼합영양배양 조건은 온도 20 내지 30℃, 회전속도 120 내지 200 rpm, 명암주기(light:dark) 18:6 내지 14:10, 유기 탄소원 35 내지 45 mM인 것을 특징으로 하는, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 7,
The mixed nutrient culture conditions are characterized in that the temperature is 20 to 30 ° C, the rotation speed is 120 to 200 rpm, the light and dark cycle is 18: 6 to 14: 10, and the organic carbon source is 35 to 45 mM. method.
상기 바이오디젤은 다중불포화지방산 20 내지 45중량부, 단일불포화지방산 30 내지 50중량부, 포화지방산 20 내지 35중량부만큼 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 3,
The biodiesel is characterized in that it contains 20 to 45 parts by weight of polyunsaturated fatty acids, 30 to 50 parts by weight of monounsaturated fatty acids, and 20 to 35 parts by weight of saturated fatty acids.
상기의 다중불포화지방산은 C16:2, C16:3, C18:2 및 C18:3인 것인, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 9,
The polyunsaturated fatty acids are C16: 2, C16: 3, C18: 2 and C18: 3, a method for producing biodiesel.
상기의 단일불포화지방산은 C16:1 및 C18:1인 것인, 바이오디젤의 생산방법.
According to claim 9,
The monounsaturated fatty acid is C16: 1 and C18: 1, a method for producing biodiesel.
상기의 포화지방산은 C16:0, C17:0, C18:0, C20:0 및 C22:0인 것인, 바이오디젤의 생산방법.According to claim 9,
The saturated fatty acids are C16: 0, C17: 0, C18: 0, C20: 0 and C22: 0, a method for producing biodiesel.
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|---|---|---|---|---|
| KR101769875B1 (en) | 2015-07-13 | 2017-08-23 | 한국에너지기술연구원 | Method of preparing triacylglycerol or biodiesel in microalgae |
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