KR20230041744A - 화학식 -nh-cx-a 또는 -nh-cx-nh-a의 적어도 하나의 말단 라디칼을 포함하는 지질 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

화학식 -nh-cx-a 또는 -nh-cx-nh-a의 적어도 하나의 말단 라디칼을 포함하는 지질 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 지질 화합물, 이를 함유하는 지질 나노입자(LNPs), 및 핵산 전달을 위한 지질 화합물 또는 LNPs의 용도에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 하기 화학식 I의 적어도 하나의 말단 라디칼:
[화학식 I]
*-NH-CX-(NH)n-A[여기서, - *-는 상기 화학식 I의 라디칼을 하나의 C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결하는 단일 결합을 나타내고; - n은 0 또는 1이고; - X는 산소 또는 황 원자이고, - A는 선택적 치환 5원 또는 6원 불포화 복소환식 라디칼 또는 5원 또는 6원 헤테로방향족 고리 라디칼(이들 둘 다 하나 이상의 질소 원자를 함유함)을 나타냄]; 또는 상기 화학식 I의 라디칼의 제약상 허용가능한 염들 중 하나를 포함하며, 상기 화합물은 모든 가능한 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태로 존재한다.

Description

화학식 -NH-CX-A 또는 -NH-CX-NH-A의 적어도 하나의 말단 라디칼을 포함하는 지질 화합물, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
본 발명은, 예를 들어 다른 지질 성분, 예컨대 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르 및 중합체 콘쥬게이션된 지질과 조합된, 핵산과 같은 치료제의 전달을 위한 지질 나노입자를 형성하는 데 사용될 수 있는 신규한 지질 화합물의 분야이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물로 제조된 제형은 항원 코딩 폴리뉴클레오티드의 투여 후 면역 반응을 유도할 수 있게 한다.
폴리뉴클레오티드 치료제 분야는 최근 몇 년에 걸쳐 놀라운 발전을 보였다. 폴리뉴클레오티드는 메신저 RNA(mRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA자임, 플라스미드 또는 면역 자극 핵산과 같은 다양한 핵산 기반 화합물을 포함한다. 일부 핵산, 예컨대 mRNA, 플라스미드 및 ssDNA는, 예를 들어 단백질 또는 효소의 결핍과 관련된 질환의 치료, 또는 특정 면역 반응을 유도하기 위한 백신 항원의 발현에 유용한 특정 세포 생성물의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 번역가능한 뉴클레오티드의 전달의 치료적 응용은, 구축물이 시스템에 고유한지 여부에 관계없이 임의의 선택된 단백질 서열을 생성하도록 합성될 수 있기 때문에 매우 광범위하다. 핵산의 발현 산물은 단백질의 기존 수준을 증가시키거나, 누락 또는 비기능성 버전의 단백질을 대체하거나, 세포 또는 유기체에 새로운 단백질 및 관련 기능을 도입하거나, 특정 면역 반응을 유도하기 위해 외래 단백질에 노출시킬 수 있다.
그러나, 생물학적 시스템에서 원하는 반응에 영향을 미치기 위한 폴리뉴클레오티드의 전달과 관련된 많은 난제가 있으며, 이의 세포내 작용 부위로의 폴리뉴클레오티드의 효과적인 전달은 주요 쟁점으로 남아 있다. 작용 부위에 효율적으로 전달되기 위해, 폴리뉴클레오티드는 (i) 효소적 및 비효소적 분해로부터 보호되어야 하고, (ii) 관심 있는 생물학적 구획에 적절하게 분포되어야 하며, (iii) 표적화 세포에 의해 효과적이고 효율적으로 내재화되어야 하고, 그 후 (iv) 관련 번역 기구가 있는 세포내 구획으로 전달되어야 한다.
다른 지질 성분, 예컨대 중성 지질, 콜레스테롤 및 페길화 지질을 이용하여 제형화된 양이온성 지질로부터 형성된 지질 나노입자는 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하고 이의 세포 흡수를 촉진하기 위해 사용되어 왔다.
양이온성 지질 성분을 포함하는 지질 나노입자 기반 비히클은 캡슐화, 안정성 및 부위 국소화와 관련하여 유망한 결과를 보여주었지만, 지질 나노입자 기반 전달 시스템의 개선에 대한 큰 필요성이 여전히 남아 있다.
개선된 약동학적 특성을 나타내고 다양한 유형의 폴리뉴클레오티드를 매우 다양한 세포 유형 및 조직에 향상된 효율로 전달할 수 있는 개선된 양이온성 및 이온화가능 지질에 대한 필요성이 여전히 남아 있다. 중요하게는, 감소된 독성을 갖고 캡슐화된 폴리뉴클레오티드를 표적 세포, 조직 및 기관에 효율적으로 전달할 수 있는 신규한 양이온성 이온화가능 지질에 대한 필요성도 여전히 남아 있다. 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 개선된 양이온성 지질 및 지질 나노입자는 또한 최적의 폴리뉴클레오티드/지질 비를 제공하고, 폴리뉴클레오티드가 혈청에서 분해 및 제거되는 것을 방지하고, 전신 또는 국소 전달에 적합하고, 폴리뉴클레오티드의 세포내 전달을 제공할 것이다. 또한, 지질-폴리뉴클레오티드 입자는 내약성이 우수하고 적절한 치료 지수를 제공하여 폴리뉴클레오티드의 유효 용량으로 환자를 치료하는 것이 환자에 대한 허용할 수 없는 독성 및/또는 위험과 관련되지 않도록 해야 한다. 또한, 지질-핵산 입자는 제약상 허용가능한 완충제에서 4~8℃에서 장기간 동안 보관하는 경우 액제 제형으로서 안정해야 한다.
본 발명은 이들 및 관련 장점을 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적 중 하나는 하기 화학식 I의 하나 이상의 말단 라디칼:
[화학식 I]
*-NH-CX-(NH)n-A
[여기서,
- *-는 상기 화학식 I의 라디칼을 하나의 C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결하는 단일 결합을 나타내고;
- n은 0 또는 1이고;
- X는 산소 또는 황 원자이고;
- A는 선택적 치환 5원 또는 6원 불포화 복소환식 라디칼 또는 5원 또는 6원 헤테로방향족 고리 라디칼(이들 둘 다 하나 이상의 질소 원자를 함유함)을 나타냄];
또는 상기 화학식 I의 라디칼의 제약상 허용가능한 염들 중 하나를 포함하는 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질 화합물에 관한 것으로서, 상기 지질 화합물은 모든 가능한 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태로 존재한다.
예를 들어, 본 발명의 지질 화합물은 양이온성 지질이다. 본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 II의 하나의 화합물:
[화학식 II]
R1-Z-NH-CX-(NH)n-A
[여기서,
- X, n 및 A는 화학식 I에서 정의된 바와 같고;
- R1은 C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기이고;
- Z는 분지형 또는 비분지형 선형 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬(상기 사슬에는 산소 원자 및/또는 ―S―S― ; (C=O)― O―; ―O―(O=C)―; ―S―; ―NH― , ―NH―(O=C)― ; ―(O=C)― NH― 및 ―NH―(C=O)― O― 중에서 선택되는 모이어티 하나 또는 여러 개가 개재되고/되거나 말단에서 산소 원자 또는 ―NH―(O=C)― ―O―(O=C)―― 및 ―(O=C)― 중에서 선택되는 모이어티가 소수성 테일 기에 연결됨)에 2 내지 24개, 예를 들어 2 내지 18개, 예를 들어 4 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 스페이서 아암(arm)이고;
- p는 0 또는 1임];
또는 상기 화학식 II의 화합물의 제약상 허용가능한 염들 중 하나; 및 임의의 그의 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태에 관한 것이다.
일 실시 형태에 따르면, 화학식 II의 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군에서 선택된다. 참고로, 하기 개발된 화학식에서, 2차 아미노 모이어티는 -NH- 또는 -N-으로 무차별적으로 표기될 수 있다.
화합물 (III)
[화학식 III]
Figure pct00001
화합물 (IV)
[화학식 IV]
Figure pct00002
화합물 (V)
[화학식 V]
Figure pct00003
화합물 (VI)
[화학식 VI]
Figure pct00004
화합물 (VII)
[화학식 VII]
Figure pct00005
화합물 (VIII)
[화학식 VIII]
Figure pct00006
화합물 (IX)
[화학식 IX]
Figure pct00007
화합물 (X)
[화학식 X]
Figure pct00008
화합물 (XI)
[화학식 XI]
Figure pct00009
화합물 (XII)
[화학식 XII]
Figure pct00010
화합물 (XIII)
[화학식 XIII]
Figure pct00011
화합물 (XIV)
[화학식 XIV]
Figure pct00012
화합물 (XV)
[화학식 XV]
Figure pct00013
화합물 (XVI)
[화학식 XVI]
Figure pct00014
화합물 (XVII)
[화학식 XVII]
Figure pct00015
화합물 (XVIII)
[화학식 XVIII]
Figure pct00016
화합물 (XIX)
[화학식 XIX]
Figure pct00017
화합물 (XX)
[화학식 XX]
Figure pct00018
화합물 (XXI)
[화학식 XXI]
Figure pct00019
화합물 (XXII)
[화학식 XXII]
Figure pct00020
화합물 (XXIII)
[화학식 XXIII]
Figure pct00021
화합물 (XXIV)
[화학식 XXIV]
Figure pct00022
화합물 (XXV)
[화학식 XXV]
Figure pct00023
화합물 (XXVI)
[화학식 XXVI]
Figure pct00024
화합물 (XXVII)
[화학식 XXVII]
Figure pct00025
및 이들의 제약상 허용가능한 염, 및 이들의 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태.
예를 들어, 화학식 II의 화합물은 화합물 (III), (IV), (V), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII) 중 어느 하나, 또는 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII) 중 어느 하나, 또는 화합물 (IV), (IX), (XII), 또는 (XVI) 중 어느 하나, 또는 화합물 (IV) 또는 (XII) 중 어느 하나, 또는 예를 들어 화학식 III, IV 또는 V의 화합물 중 어느 하나, 또는 화합물 (IV)(DOG-IM4로도 명명됨), 또는 이들의 염 또는 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태 중 하나일 수 있다.
놀랍게도, 그리고 실시예 섹션에서 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 본원에 개시된 바와 같은 신규한 지질 화합물이 mRNA 및/또는 다른 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 시험관 내 및 생체 내에서의 전달을 위한 개선된 조성물, 예컨대 지질 나노입자의 제형화를 가능하게 함을 관찰하였다. 더욱이, 이렇게 형성된 조성물은 또한 4 내지 8℃의 범위의 온도에서 안정화된 액체 형태로 보관될 수 있다.
실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 지질 나노입자는 pH, 오스몰랄 농도, 입자 크기, mRNA 캡슐화 및/또는 mRNA 무결성 측면에서 5℃, 25℃ 및 심지어 37℃에서 매우 안정한 것으로 입증되었다. 이러한 강한 안정성은 본 발명의 지질 나노입자의 다양한 응용을 가능하게 한다. 예를 들어, 지질 나노입자는 백신과 같은 제약 조성물이 저온 대신 실온에서 보관되게 할 수 있다.
개선된 지질 나노입자는 mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현에 유용하다. 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 내인성 단백질의 발현을 조절하기 위한 miRNA 또는 miRNA 억제제, 또는 트랜스진의 발현을 위한 mRNA 또는 플라스미드를 전달함으로써 단백질 발현의 조절, 상향 조절 또는 하향 조절에 사용될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 적합한 항원 또는 항체를 코딩하는 mRNA의 전달을 통해 감염에 대한 보호를 유도하거나 단백질 발현에 따른 약리학적 효과를 유도하는 데 사용될 수 있다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 단백질, 예컨대 에리트로포이에틴의 발현에 따른 약리학적 효과를 유도하는 데 사용될 수 있고, 대사 질환 또는 단백질 결핍에 따른 질환의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물 및 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물 및 적어도 하나의 핵산을 포함하는 지질 나노입자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물은 면역원성 조성물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 (i) 항원을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 항원을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자(여기서, 핵산은 적어도 하나의 항원을 코딩함)를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 의약으로 사용하기 위한, (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감염성 질환, 알러지, 자가면역 질환, 희귀 혈액 질환, 희귀 대사 질환, 희귀 신경계 질환, 및 종양 또는 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료 방법에 사용하기 위한, (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
용어 "희귀 질환"은 100,000명당 40 내지 50건의 평균 유병률 역치를 갖는 질환을 의미하는 것으로 당업계에서 인정되는 의미에 따라 본원에서 사용된다(문헌[Richter et al., Value Health. 2015 Sep;18(6):906-14]).
본 발명의 또 다른 목적은 면역원성 조성물로 사용하기 위한, (i) 항원을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 항원을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 또한, 감염성 질환, 알러지, 자가면역 질환, 희귀 혈액 질환, 희귀 대사 질환, 희귀 신경계 질환, 및 종양 또는 암 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한, (i) 항원을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 항원을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 방법은 감염성 질환, 알러지, 자가면역 질환, 희귀 혈액 질환, 희귀 대사 질환, 희귀 신경계 질환, 및 종양 또는 암 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 적어도 하나의 단리된 표적 세포를 핵산으로 형질감염시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 적어도 하나의 표적 세포를 유효량의 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자와 접촉시켜 상기 적어도 하나의 표적 세포를 상기 핵산으로 형질감염시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 적어도 하나의 표적 세포에서 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 적어도 하나의 표적 세포를 유효량의 (i) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 화합물, 또는 (ii) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자(여기서, 핵산은 상기 폴리펩티드를 코딩함)와 접촉시켜, 상기 폴리펩티드를 작동가능하게 코딩하는 핵산으로 상기 적어도 하나의 표적 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산 충전된 지질 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:
a) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물을 수혼화성 유기 용매에 용해시키는 단계,
b) 단계 a)에서 수득된 유기 용매를 충전시킬 적어도 하나의 핵산을 포함하는 수성 용매와 혼합하는 단계, 및
c) 수성 용매 중 상기 지질 나노입자를 수득하는 단계.
본 발명의 다양한 실시 형태에 대한 설명에서, 다양한 실시 형태 또는 개별적인 특징이 개시된다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 이러한 실시 형태들 및 특징들의 모든 조합이 가능하고 이는 본 발명의 실행을 초래할 수 있다. 본 발명의 다양한 실시 형태 및 개별적인 특징이 예시되고 기술되었지만, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고서 다양한 다른 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 또한 명백한 바와 같이, 전술한 개시내용에서 교시된 실시 형태들 및 특징들의 모든 조합이 가능하고 이는 본 발명의 실행을 초래할 수 있다.
도 1: LNPs L319, LNPs Lip. (III), LNPs Lip. (IV) 또는 LNPs Lip. (V)(화학식 III, IV 또는 V의 지질 화합물로 제조됨)(이들 각각은 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 mRNA가 로딩됨)로 1회 면역화한 후의 마우스로부터의 혈청에서 (D20에) 측정된 혈구응집 억제 항체 평균 역가(HI 역가). 주사된 총 mRNA는 LNPs L319의 경우 0.5, 1, 2.5 또는 5.0 μg/용량이고 LNPs Lip. (III), LNPs Lip. (IV) 및 LNPs Lip. (V)의 경우 1 또는 5 μg/용량이다. 음성 대조군으로서, 마우스를 PBS 완충제로 면역화시켰고, 양성 대조군으로서 마우스에 Vaxigrip™ 유래의 1가 독감 백신 A/California/07/2009(H1N1) 주 10 μg을 투여하였다. 기하 평균 역가 및 개별 HI 역가가 각 군에 대해 표시되어 있다.
도 2: LNPs L319, LNPs Lip. (III), LNPs Lip. (IV) 또는 LNPs Lip. (V)(화학식 III, IV 또는 V의 지질 화합물로 제조됨)(이들 각각은 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 mRNA가 로딩됨)로 2회 면역화한 후의 마우스로부터의 혈청에서 (D42에) 측정된 혈구응집 억제 항체 평균 역가(HI 역가). 주사된 총 mRNA는 LNPs L319의 경우 0.5, 1, 2.5 또는 5.0 μg/용량이고 LNPs (III), LNPs (IV) 및 LNPs (V)의 경우 1 또는 5 μg/용량이다. 음성 대조군으로서, 마우스를 PBS 완충제로 면역화시켰고, 양성 대조군으로서 마우스에 Vaxigrip™ 유래의 1가 독감 백신 A/California/07/2009(H1N1) 주 10 μg을 투여하였다. 기하 평균 역가 및 개별 HI 역가가 각 군에 대해 표시되어 있다.
도 3: 상이한 LNPs L319 및 LNPs Lip. (IV)(중성 지질로서 DOPE를 함유하고 각각 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 mRNA가 로딩됨)로 D0 및 D21에 면역화된 마우스에서 D42에 수집된 혈청에서 측정된 혈구응집 억제 항체 평균 역가(HI 역가). LNPs Lip. (IV)에 로딩된 mRNA는 천연(Nat) 또는 변형 우리딘 염기(Mod)를 함유하고 있었다. LNPs L319에 로딩된 mRNA는 천연 우리딘 염기를 함유하고 있었다. 기하 평균 역가 및 개별 HI 역가가 각 군에 대해 표시되어 있다.
도 4: 상이한 LNPs L319 및 LNPs Lip. (IV)로 D0 및 D21에 면역화된 마우스에서 D42에 수집된 혈청에서 측정된 혈구응집 억제 항체 평균 역가(HI 역가). LNPs Lip. (IV)는 중성 지질로서 DSPC 또는 DOPE를 함유하고 있었다. LNP L319는 중성 지질로서 DSPC를 함유하고 있었다. LNPs는 천연 우리딘 염기를 함유하는 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 mRNA가 로딩되었다. 기하 평균 역가 및 개별 HI 역가가 각 군에 대해 표시되어 있다.
도 5: LNPs Lip. (IV)(중성 지질로서 DSPC를 함유하고, 천연 우리딘 염기를 함유하는 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 mRNA가 로딩됨)로 D0 및 D21에 면역화된 마우스에서 D42에 수집된 혈청에서 측정된 혈구응집 억제 항체 평균 역가(HI 역가). LNPs는 사용 전 다음의 상이한 기간 동안 보관되었다: 0, 6 및 12개월. 1년의 기간을 커버하는 시간에 걸쳐 3회의 독립 실험을 수행하였다. 기하 평균 역가 및 개별 HI 역가가 각 군에 대해 표시되어 있다.
도 6: 암컷 BALB/c ByJ 마우스에서 루시퍼라아제를 코딩하는 mRNA(mRNA-Luc) 5 μg이 로딩된 LNPs 319 또는 LNPs Lip. (IV)의 근육내 투여 후 주사된 부위(대퇴사두근)에서 단백질 발현을 모니터링한 생물발광 신호 획득. 발광 수준은 6시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 주사 부위 영역에 적용된 ROI에 의해 평가되었고, 결과는 LNPs/ mRNA-Luc 주사 후 시간(h)의 함수에서 총 플럭스(ph/s)로 표현된다. 완충제 PBS를 대조군으로 사용하였다.
도 7은 화합물 (XIII)의 합성 반응식을 보여준다.
도 8은 화합물 (XIV)의 합성 반응식을 보여준다.
도 9는 화합물 (XVII)의 합성 반응식을 보여준다.
도 10은 화합물 (XXI)의 합성 반응식을 보여준다.
도 11은 화합물 (XXII)의 합성 반응식을 보여준다.
도 12: 시간의 함수로 기록된 hEPO mRNA를 포함하는 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 크로마토그램.
도 13은 상이한 보관 온도들에서 시간이 지남에 따른 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 pH의 안정성을 보여준다.
도 14는 상이한 보관 온도들에서 시간이 지남에 따른 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 오스몰랄 농도의 안정성을 보여준다.
도 15는 상이한 보관 온도들에서 시간이 지남에 따른 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 입자 크기의 안정성을 보여준다.
도 16은 상이한 보관 온도들에서 시간이 지남에 따른 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 mRNA 캡슐화율의 안정성을 보여준다.
도 17은 상이한 보관 온도들에서 시간이 지남에 따른 LNPs Lip. (IV)/DSPC에서의 mRNA 무결성을 보여준다.
도 18a~도 18c는 상이한 보관 온도들에서 시간이 지남에 따른 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 지질 크로마토그램의 안정성을 보여준다. 도 18a: 상단 패널은 4℃에서 18주 후 LNPs Lip.(IV)/DSPC를 보여주며; 하단 패널은 T0에서의 상기 LNPs를 보여준다. 도 18b: 상단 패널은 25℃에서 18주 후 LNPs Lip.(IV)/DSPC를 보여주며; 하단 패널은 T0에서의 상기 LNPs를 보여준다. 도 18C: 상단 패널은 37℃에서 18주 후 LNPs Lip.(IV)/DSPC를 보여주며; 하단 패널은 T0에서의 상기 LNPs를 보여준다.
도 19는 상이한 보관 온도들에서 시간이 지남에 따른 LNPs Lip.(IV)/DSPC로부터의 hEPO 발현의 안정성을 보여준다.
도 20은 4주 간격으로 2회(D0, D28) 면역화된 시노몰구스 마카크에 대한 인플루엔자 HA mRNA를 포함하는 LNPs의 면역원성을 보여주며, 이때 LNPs 중 mRNA 50 μg을 500 μl의 부피로 이두박근에 IM 주사하였다.
도 21: 중성 지질로서 DSPC를 함유하고 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 mRNA가 로딩된 LNPs L319, LNPs Lip. (IV)[DOG-IM4], LNPs Lip. (IX), LNPs Lip. (XII) 및 LNPs Lip. (XVI)로 D0 및 D21에 면역화된 마우스에서 D21에 수집된 혈청에서 측정된 혈구응집 억제 항체 평균 역가(HI 역가).
정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 개시내용의 맥락 내에서 그리고 각 용어가 사용된 특정 맥락에서 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 개시내용의 조성물 및 방법 및 이들을 제조하고 사용하는 방법을 설명하는 데 있어서의 추가 지침을 제공하기 위해 아래 또는 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 청구범위를 포함하여 본 명세서에 대해 하기 정의가 제공된다.
용어 "말단 라디칼"은 상기 라디칼이 헤드 기 또는 테일 기임을 의미한다.
용어 "제약상 허용가능한 염"은 이러한 화합물과 예를 들어 비독성 산 부가염의 조합으로부터 유도된 본원에 개시된 바와 같은 화합물의 부가염을 포함한다.
용어 "산 부가염"은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산 및 인산과 같은 무기 산과, 아세트산, 시트르산, 프로피온산, 타르타르산, 글루탐산, 살리실산, 옥살산, 메탄술폰산, 파라-톨루엔술폰산, 숙신산 및 벤조산과 같은 유기 산, 및 관련 무기 및 유기 산을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 화합물의 제약상 허용가능한 염은 또한 물, 메탄올, 에탄올, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트 등과 같은 다양한 용매화물로서 존재할 수 있다. 그러한 용매화물들의 혼합물이 또한 제조될 수 있다. 이러한 용매화물의 공급원은 결정화 용매로부터의 것이거나, 제조 또는 결정화 용매에 내재되어 있거나, 이러한 용매에 우발적인 것일 수 있다. 그러한 용매화물은 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명의 맥락에서 아래의 화학 용어는 하기 의미를 갖는다:
- 할로겐 원자: 불소, 염소, 브롬 또는 요오드;
- Ct-Cz: t 내지 z개의 탄소 원자를 가질 수 있는 탄소 사슬(여기서, t 및 z는 1 내지 7의 값을 가질 수 있음); 예를 들어, C1-C4는 1 내지 4개의 탄소 원자를 가질 수 있는 탄소 사슬이고;
- 본원에서 사용되는 바와 같이, C1-C4 알킬은 각각 C1-C4 노르말, 2차 또는 3차 포화 탄화수소를 지칭한다. 비제한적 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 또는 tert부틸이 있고;
- C1-C4 알콕시는 -O-(C1-C4)알킬 라디칼을 의미하는 것으로 의도되며, 여기서,
- C1-C4 알킬 기는 위에서 정의된 바와 같다. 비제한적 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, sec-부톡시 또는 tert-부톡시가 있고;
- 헤테로원자는 질소, 산소 또는 황을 의미하는 것으로 이해되며;
- 헤테로방향족 고리는 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 5원 또는 6원 방향족 고리를 나타내고;
- 방향족 고리는 모 방향족 고리 시스템의 탄소 원자로부터 1개의 수소를 제거함으로써 유도되는 6 내지 20개의 원자, 예를 들어 6개의 원자의 단환식 또는 다환식, 예를 들어 단환식 방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 본원에 개시된 바와 같은 방향족 고리는 예를 들어 페닐 기이고;
- 본 발명의 화학식 I에서 n이 0인 경우, 이것은 모이어티 -NH가 존재하지 않음을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")에는 맥락 상 달리 명확히 지정하지 않는 한 복수의 언급대상이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 본 기술 분야의 숙련자가 쉽게 알고 있는 각각의 값에 대한 일반 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "대략적인" 값, 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값, 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시 형태를 포함(및 기술)한다. 일부 실시 형태에서, 용어 "약"은 주어진 값의 ±10%를 지칭한다. 그러나 당해 값이 비분할성 객체, 예컨대 뉴클레오티드 또는 세분화되면 아이덴티티를 상실하는 다른 객체를 언급할 때마다 "약"은 비분할성 객체의 ±1을 나타낸다.
용어 "항원"은 면역 반응을 유발하고/하거나 면역 반응이 유도되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 임의의 분자, 예를 들어 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 항원은, 선택적으로 프로세싱 후, 예를 들어 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다. 프로세싱 후, 항원은 MHC 분자에 의해 제시될 수 있으며 T 림프구(T 세포)와 특이적으로 반응한다. 따라서, 항원 또는 이의 단편은 T 세포 수용체에 의해 인식가능해야 하고, 적절한 공동 자극 신호의 존재 하에 항원 또는 단편을 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 지닌 T 세포의 클론 확장을 유도할 수 있어야 하는데, 이는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 초래한다.
본 발명에 따르면, 면역 반응을 위한 후보인 임의의 적합한 항원이 구상될 수 있다. 항원은 자연 발생 항원에 상응하거나 자연 발생 항원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 자연 발생 항원은 알러젠, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 기타 감염원 및 병원체를 포함할 수 있거나 이로부터 유래될 수 있거나, 또는 항원은 또한 종양 항원일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수성 용액" 또는 "수성 용매"는 물을 포함하는 조성물을 지칭한다.
본 명세서 내에서 용어 "양이온성 기" 또는 "양이온성 암모늄 기"는 양전하를 갖고 적어도 하나의 이온화가능한 질소 원자를 포함하는 이온 또는 이온 그룹을 지칭한다. 본원에 개시된 바와 같은 양이온성 기는 본원에 정의된 바와 같은 하기 화학식 I의 라디칼로 구성된다:
[화학식 I] -NH-CX-(NH)n-A.
본원에 기술된 본 발명의 양태 및 실시 형태는 양태 및 실시 형태를 "갖는", 이를 "포함하는", 이로 "이루어진" 및 이로 "본질적으로 이루어진" 것을 포함하는 것으로 이해된다. "갖다" 및 "포함하다"라는 용어 또는 "갖고 있다", "갖고 있는", "포함하고 있다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 요소(들)(예컨대 물질의 조성물 또는 방법 단계)의 포함을 의미하며 임의의 다른 요소의 배제를 의미하는 것은 아님이 이해될 것이다. "~로 이루어진"이라는 용어는 임의의 추가 요소를 제외하고 언급된 요소(들)를 포함함을 의미한다. "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는 언급된 요소 및 가능하게는 다른 요소(들)(여기서, 상기 다른 요소(들)는 본 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않음)의 포함을 의미한다. 문맥에 따라, "포함하다"라는 용어는 또한, 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소를 엄격하게 특정할 수 있으므로 이러한 경우 이것은 "이루어지다"로 대체될 수 있다.
용어 "하전된 지질"은 유용한 생리학적 범위, 예를 들어 pH 대략 3 내지 pH 대략 9 내에서 양으로 하전되거나 음으로 하전된 형태로 존재하는 다수의 지질 화학종 중 임의의 것을 지칭한다. 하전 지질은 합성 또는 천연 유래일 수 있다. 하전 지질의 예는 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 스테롤 헤미숙시네이트, 디알킬 트리메틸암모늄-프로판(예를 들어 DOTAP, DOTMA), 디알킬디메틸아미노프로판, 에틸 포스포콜린, 디메틸아미노에탄 카르바모일 스테롤(예를 들어 DC-Choi)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "자연 발생"은 객체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 나타낸다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있으며 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형된 것이 아닌 펩티드 또는 핵산이 자연 발생된 것이다.
용어 "중성 지질"은 선택된 pH, 예를 들어 생리학적 pH에서 이온화될 수 없거나 중성 쯔비터이온성 화합물인 다수의 지질 화학종 중 임의의 것을 지칭한다. 이러한 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고마이엘린(SM), 또는 세라마이드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 중성 지질은 합성 또는 천연 유래일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "지질"은 지방산의 에스테르를 포함하지만 이에 한정되지 않고 일반적으로 물에는 난용성이지만 많은 유기 용매에는 용해성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물 군을 지칭한다.
지질은 지방, 지방 오일, 에센셜 오일, 왁스, 인지질, 당지질, 술포지질, 아미노지질, 크로몰지질(리포크롬) 및 지방산을 포괄하는 일반적인 용어이다. 본 명세서 내에서, "지질"은 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화된 지질을 포함한다.
용어 "지질 나노입자"(LNP)는 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 중 적어도 하나를 이용하여 제형화될 수 있는 나노미터 정도(예를 들어, 1~1000 nm)의 적어도 하나의 차원을 갖는 입자를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 지질 나노입자는 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관, 종양 등)에 핵산과 같은 활성제 또는 치료제를 전달하기 위해 사용될 수 있는 제형에 포함된다. 전형적으로 이러한 지질 나노입자는 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 및 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 중합체 콘쥬게이션된 지질로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지질 캡슐화된"은 전체 캡슐화, 부분 캡슐화 또는 이들 둘 다를 이용하여 핵산과 같은 활성제 또는 치료제를 제공하는 지질 나노입자를 지칭한다. 일 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 지질 나노입자에 완전히 캡슐화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤드 기" 및 "테일 기"는 이러한 화합물의 작용기와 같은 본 발명의 화합물의 일부를 기술한다는 점에 유의해야 한다. 이들은 상기 화합물의 다른 작용기에 대한 하나 이상의 작용기의 배향을 설명하는 데 사용된다. 이들은 둘 다 "말단 기"이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친유성 또는 소수성 테일 기"는 테일이 지질에 대한 친화성을 갖고(그리고 전형적으로 지용성이고) 물을 기피함을(그리고 전형적으로 수용성이 아님을) 정성적 용어로 나타낸다.
용어 "페길화된 지질"은 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 둘 모두를 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화된 지질은 당업계에 공지되어 있고 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG) 등을 포함한다.
본 명세서 내에서 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용된다. 이들은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 이들의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 핵산은 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 이것은 선형 또는 환형일 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연결 분석으로부터 정해진 유전자좌(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 폐쇄-말단 DNA(ceDNA), 자가 증폭 RNA, 가닥 DNA(ssDNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로 RNA(miRNA), 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 상기 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 성분과의 콘쥬게이션 등에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드의 보체"는 기준 서열과 완전한 충실도로 혼성화할 수 있도록 기준 서열과 비교하여 상보성 염기 서열 및 역배향을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드에 적용되는 "재조합체"는 폴리뉴클레오티드가 시험관 내 클로닝, 제한 및/또는 라이게이션 단계, 및 숙주 세포에서 잠재적으로 발현될 수 있는 구축물을 생성하는 기타 절차의 다양한 조합의 산물임을 의미한다.
용어 "스테로이드 알코올" 또는 "스테롤"은 히드록실 모이어티를 함유하는 스테란 코어로 이루어진 지질 군을 지칭한다. 스테로이드 알코올의 예로는 콜레스테롤, 캄페스테롤, 시토스테롤, 스티그마스테롤 및 에르고스테롤을 들 수 있다. 스테로이드 알코올의 에스테르 또는 스테롤의 에스테르는 카르복실산과 스테로이드 알코올의 히드록실 기의 에스테르를 지칭한다. 적합한 카르복실산은 카르복실 모이어티에 추가로 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 알킬 기를 포함한다. 일부 실시 형태에서 알킬 기는 C1-C20 알킬 기일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 카르복실산은 지방산일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 질환 또는 장애와 관련하여 "예방하다", "예방하는" 또는 "~의 진행을 지연시키다"(및 이의 문법적 변형)라는 용어는 예를 들어, 질환에 걸린 것으로 의심되거나 질환 발생 위험이 있는 개체에서의 질환의 예방적 치료와 관련된다. 예방은 질환의 발병 또는 진행을 예방하거나 지연시키는 것 및/또는 질환의 적어도 하나의 증상을 원하는 수준으로 유지하거나 병리학적 수준 미만으로 유지하는 것을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. "예방"이라는 용어는 이벤트 발생 가망성 또는 가능성을 100% 제거할 것을 요구하지 않는다. 오히려, 이것은 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 방법의 존재 하에 이벤트 발생 가능성이 감소되었음을 나타낸다.
본 명세서 내에서, 변화와 관련하여 사용된 "유의하게"라는 용어는 관찰된 변화가 뚜렷하고/하거나 통계적 의미를 가짐을 의미하고자 한다.
본 명세서 내에서, 본 발명의 특징과 함께 사용되는 "실질적으로"라는 용어는, 대체로 이 특징과 유사하지만 완전히 유사한 것은 아닌 이 특징과 관련된 일련의 실시 형태를 규정하고자 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 세포" 또는 "표적화 세포"는 관심 세포를 지칭한다. 세포는 시험관 내, 생체 내, 원위치에서 또는 유기체의 조직 또는 기관에서 발견될 수 있다. 유기체는 동물, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간, 예를 들어 인간 환자일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포는 개체로부터 단리된 세포이다.
본 명세서에서 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "요법"이라는 용어는 병태의 증상, 장애를 고치거나, 치료하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경하거나, 해소하거나, 좋아지게 하거나, 개선하거나, 또는 영향을 주거나, 또는 증상, 합병증의 발병을 예방 또는 지연하거나, 그렇지 않으면 통계적으로 유의한 방식으로 장애의 추가 발생을 저지하거나 억제할 목적으로 위한 본원에 개시된 바와 같은 조성물을 투여하거나 소비하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량" 및 "예방적 유효량"은 고려되는 병리학적 과정의 치료, 예방 또는 관리에서 치료적 이점을 제공하는 양을 지칭한다. 치료적으로 효과적인 특정한 양은 일반 의사가 쉽게 결정할 수 있으며, 고려되는 병리학적 과정의 유형 및 단계, 환자의 병력 및 연령, 및 다른 치료제의 투여와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.
이하에 기술된 바와 같은 공급원, 성분 및 구성요소의 목록은 이들의 조합 및 혼합물이 또한 고려되고 본원의 범주 내에 있도록 열거되어 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 한계치는 마치 모든 수치 하한치가 본원에 명시적으로 기재된 것처럼 이러한 모든 수치 하한치를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 한계치는 마치 모든 수치 상한치가 본원에 명시적으로 기재된 것처럼 이러한 모든 수치 상한치를 포함할 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는 마치 모든 더 좁은 수치 범위가 모두 본원에 명시적으로 기재된 것처럼 그러한 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.
예를 들어 성분 목록과 같은 모든 항목 목록은 Markush 군으로 해석하고자 하며 그렇게 해석되어야 한다. 따라서 모든 목록은 "...항목의 목록... " 및 이들의 조합 및 혼합물"로 이루어진 군으로부터 선택되는" 항목으로 판독되고 해석될 수 있다.
본원에서 참고되는 것은 본 발명에 사용되는 다양한 성분을 포함하는 구성요소에 대한 상표명일 수 있다. 본원에서 본 발명자들은 임의의 특정 상표명 하의 물질에 의해 제한되는 것으로 의도하지 않는다. 상표명으로 언급된 것과 동등한 재료(예를 들어, 다른 명칭 또는 참조 번호로 다른 공급처로부터 획득된 것)가 본원의 설명에서 치환 및 사용될 수 있다.
화학식 I의 라디칼 및 지질 화합물의 상세한 정의
상기 명시된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 이온화가능하고, 예를 들어 양이온성 지질 화합물이다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 예를 들어 이온화가능하며 그 이유는 이것이 아민-함유 지질 화합물이기 때문이다. 이러한 화합물은 쉽게 양성자화될 수 있으므로 pH 값에 따라 pKa가 변경된다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 화합물은 예를 들어 7 미만, 예를 들어 4.5 내지 6.7 범위의 pKa를 갖는다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 비대칭 중심, 키랄 축 및 키랄 평면을 가질 수 있으며(문헌[E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190]에 설명된 바와 같음), 라세미체, 라세미 혼합물 및 개별 부분입체 이성질체로서 나타나며, 이때 광학 이성질체를 포함한 모든 가능한 이성질체들 및 이들의 혼합물이 본 발명에 포함된다. 또한, 본원에 개시된 양이온성 지질은 호변이성질체로서 존재할 수 있고, 단지 하나의 호변이성질체 구조가 묘사되더라도, 두 호변이성질체 형태 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 개시된 바와 같은 화합물의 제약상 허용가능한 염은, 일반적으로 생리학적으로 허용가능한 하나 또는 여러 개의 반대 이온을 갖는다. 가능한 반대 이온으로는 예를 들어 할라이드, 포스페이트, 트리플루오로아세테이트, 술파이트, 니트레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 갈락투론산 라디칼, 알킬술포네이트, 알킬카르복실레이트, 프로피오닉 술포네이트 및 메탄술폰산 라디칼을 들 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 염은 또한 물, 메탄올, 에탄올, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트 등에 의한 것과 같은 다양한 용매화물로서 존재할 수 있다. 그러한 용매화물들의 혼합물이 또한 제조될 수 있다. 이러한 용매화물의 공급원은 결정화 용매로부터의 것이거나, 제조 또는 결정화 용매에 내재되어 있거나, 이러한 용매에 우발적인 것일 수 있다. 그러한 용매화물은 본 발명의 범주 내에 있다.
예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 소수성 또는 친유성 테일의 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다는 사실을 예시하도록 말단 라디칼로도 명명된 화학식 I의 하나의 라디칼에 의해 형성된 하나의 친수성 헤드 기를 갖는다.
다음의 화학식 I의 라디칼은 하기 정의를 갖는다:
[화학식 I]
*-NH-CX-(NH)n-A
[여기서,
- *-는 상기 화학식 I의 라디칼을 하나의 C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결하는 단일 결합을 나타내고;
- n은 0 또는 1이고;
- X는 산소 또는 황 원자이고,
- A는 선택적 치환 5원 또는 6원 불포화 복소환식 라디칼 또는 5원 또는 6원 헤테로방향족 고리 라디칼(이들 둘 다 하나 이상의 질소 원자를 함유함)을 나타냄].
화학식 I의 하나 이상의 라디칼을 포함하는 화합물은 또한 그의 제약상 허용가능한 염들 중 하나; 및 그의 가능한 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태 중 하나일 수 있다.
아미드 작용체의 질소 원자가 양성자화될 수 있기 때문에 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물이 양성자화될 수 있다. 따라서, 그리고 이전에 언급된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 pH 값에 따라 변할 수 있는 겉보기 pKa를 갖는다.
일 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 화합물은 7 미만의 pKa를 갖는다.
또 다른 특정 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 화합물은 4.5 내지 6.7 범위의 pKa를 갖는다. 이러한 pKa는 임의의 통상적인 방법에 의해 결정될 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, X는 황 원자이고 A는 피리디닐 라디칼이다.
일 실시 형태에 따르면, A는 3-피리디닐 라디칼이다.
또 다른 실시 형태에 따르면, X는 산소 원자이고 A는 적어도 하나의 질소 원자를 포함하는 5원 헤테로방향족 고리이다. 일 실시 형태에 따르면 A는 이미다졸릴 라디칼이다. 예를 들어, A는 4-이미다졸릴 라디칼일 수 있다.
화학식 I의 하나의 라디칼은 소수성(친유성) 테일 기에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다(예를 들어, 공유 결합).
소수성 또는 친유성 테일은 일반적으로 C10~C55로 존재한다.
예를 들어, 이것은 선택적으로 치환된 분지형 또는 비분지형 선형 포화 또는 불포화 C10 내지 C55 탄화수소 라디칼이며, 상기 탄화수소 골격에는 하나 또는 여러 개의 산소 또는 질소 원자 및/또는 하나 또는 여러 개의 -O-CO- 또는 -CO-O- 기가 개재되고, 상기 하나의 질소 원자는 골격에 존재하는 경우 화학식 I의 상기 라디칼에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
예를 들어, 소수성 또는 친유성 테일은 적어도 2개, 3개 또는 그 이상의 탄화수소 사슬(각각 독립적으로 선택적 치환 C8-C24, 예를 들어 C10-C20, 알킬 사슬, 선택적 치환 가변적 포화 또는 불포화 C8-C24, 예를 들어 C10-C20, 알케닐 사슬 및 선택적 치환 포화, 가변적 포화 또는 불포화 C8-C24, 예를 들어 C10-C20, 아실 사슬로부터 선택되고, 이때 상기 알킬, 알케닐 또는 아실 사슬에는 하나 또는 여러 개의 산소 또는 질소 원자 및/또는 하나 또는 여러 개의 모이어티, 예컨대 -O-CO- 또는 -CO-O-, 바람직하게는 적어도 하나의 모이어티, 예컨대 -O-CO- 또는 -CO-O-가 개재될 수 있음)을 포함할 수 있다.
각각의 탄화수소 사슬은 -OH 및 CO2H로부터 선택되는 하나 이상의 라디칼로 치환될 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 소수성 또는 친유성 테일은 다음으로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 화합물의 소수성 또는 친유성 테일은 스페이서에 대한 그의 연결에 관련된 적어도 하나의 아미노 모이어티를 함유한다. 이 특정 실시 형태에서, 소수성 또는 친유성 테일은 구체적으로 R1g, h, q, r, u, v, w 및 z 중에서 선택된다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 화합물의 소수성 또는 친유성 테일은 또한, 예를 들어 소수성 또는 친유성 테일 R1m, p, q, r, s, u, v, w, x, y 및 z에서와 같이 적어도 3개 이상의 탄화수소 사슬을 함유할 수 있다. 각각의 탄화수소 사슬은 치환 C8-C24, 예를 들어 C10-C20, 알킬 사슬 및 치환 가변적 포화 또는 불포화 C8-C24, 예를 들어 C10-C20, 알케닐 사슬 중에서 선택될 수 있으며, 이때 상기 알킬 또는 알케닐 사슬에는 선택적으로 그리고 바람직하게는 하나 또는 여러 개의 모이어티, 예컨대 -O-CO- 또는 -CO-O-가 개재된다.
특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 화합물의 소수성 또는 친유성 테일은, 각각 DOG 알킬 또는 DOG 에테르로도 명명된 테일 (R1a) 또는 (R1b)이다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질 화합물은 다음의 것이다: 하기 화학식 II의 화합물:
[화학식 II]
R1 -Z -NH-CX-(NH)n-A
[여기서,
- X, n 및 A는 이전에 정의된 바와 같고;
- R1은 하나의 C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기로서, 예를 들어 이전에 정의된 바와 같고;
- Z는 분지형 또는 비분지형 선형 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬(상기 사슬에는 산소 원자 및/또는 ―S―S― ; ―(O=C)― ; ―(C=O)― O―; ―O―(O=C)― ; ―S― ; ―NH― , ―NH―(O=C)― ; ―(O=C)― NH― 및 ―NH―(C=O)― O― 중에서 선택되는 모이어티 하나 또는 여러 개, 바람직하게는 ―(C=O)― O―; ―O―(O=C)― 및 ―NH―(C=O)― O―가 개재되고, 선택적으로, 말단에서 산소 원자 또는 ―NH―(O=C)― ―O―(O=C)――; ―(C=O)― O―; 및 ―(O=C)― 중에서 선택되는 모이어티가 소수성 테일 기에 연결됨)에 2 내지 24개, 예를 들어 2 내지 18개, 예를 들어 4 내지 12개, 또는 예를 들어 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 스페이서 아암(arm)이고;
- p는 0 또는 1임];
또는 상기 화학식 II의 화합물의 제약상 허용가능한 염들 중 하나; 및 임의의 그의 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태.
스페이서 아암과 관련하여, 이것은 지질 양이온성 화합물 분야에서 통상적으로 고려되는 것과 같다. 따라서, 그러한 스페이서 아암의 선택은 당업자에게 어떤 어려움도 일으키지 않는다. 이것은 불활성이거나 지질 화합물의 효율성에 해가 되지 않아야 한다.
일반적으로, 스페이서는 2 내지 24개, 예를 들어 4 내지 12개의 탄소 원자, 또는 예를 들어 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖고, 적어도 하나 또는 여러 개의 에틸렌 옥시드 단위 및 선택적으로 하나 또는 여러 개의 모이어티를 포함하며, 이는 이전에 개시된 바와 같다.
본 발명에 편리한 스페이서 아암의 예로서, 우측 말단이 친유성 또는 소수성 테일 기에 연결된 것인 하기의 것들이 인용될 수 있다:
Figure pct00031
Figure pct00032
일 실시 형태에 따르면, 스페이서는 에틸렌 옥시드 단위로 이루어지고, 1 내지 24개, 예를 들어 2 내지 15개, 예를 들어 3 내지 12개, 예를 들어 4 내지 10개, 및 예를 들어 6 내지 8개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 실시 형태에 따르면, 스페이서는 하기 화학식 A1의 것일 수 있다:
[화학식 A1]
Figure pct00033
[여기서,
- 우측 말단은 친유성 또는 소수성 테일 기에 연결된 것이고;
- l은 0 또는 1이고;
- m은 1 내지 24, 예를 들어 2 내지 15, 예를 들어 3 내지 12의 범위이며, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이고;
- p는 0 또는 1이고;
- R'는 p가 1인 경우 하나의 산소 원자, 또는 -C=O- ; -NH- ; -O-CH2- ; -NH-C(=O)- ; -NH-C(=O)-O-CH2- ; O- C(=O)- ; C=O-NH-(CH2)2-; O CH2 C(=O)-O- ; --C(=O)-O-(CH2)2- 및 -S-S-, 구체적으로 -NH-C(=O)- ; -NH-C(=O)-O-CH2- ; -O- C(=O)- ; -C=O-NH-(CH2)2-; 및 -C(=O)-O-(CH2)2로부터 선택되는 모이어티를 나타낸다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 스페이서는 1 내지 24개, 예를 들어 2 내지 15개, 예를 들어 3 내지 12개, 예를 들어 4 내지 10개, 및 예를 들어 6 내지 8개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함할 수 있고, 바람직하게는 ―(C=O)― O―; ―O―(O=C)― ;―NH―(O=C)― ; ―(O=C)―NH― 및 ―NH―(C=O)― O― 중에서 선택되는 적어도 하나의 모이어티, 더 바람직하게는 적어도 하나의 ―NH―(C=O)― O―를 포함한다.
일 실시 형태에서, 화학식 II의 지질 화합물에서, X는 황 원자이고 A는 피리디닐 라디칼이다. 예를 들어, A는 3-피리디닐 라디칼일 수 있다.
이 실시 형태에 따르면, 화학식 II의 화합물은 예를 들어 하기 화학식 V의 화합물:
[화학식 V]
Figure pct00034
또는 이의 염들 중 하나, 또는 이의 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태들 중 하나이다.
예를 들어, 이 화합물 (V) 또는 이의 유도체는 염화되지 않는다. 예를 들어, 이것은 그의 유리 염기 형태로 존재한다.
또 다른 실시 형태에서, 화학식 II의 지질 화합물에서, X는 산소 원자이고 A는 적어도 하나의 질소 원자를 함유하는 5원 헤테로방향족 고리 라디칼이다. 따라서, 일 실시 형태에 따르면 A는 이미다졸릴 라디칼이고, 예를 들어 A는 4-이미다졸릴 라디칼일 수 있다.
이 실시 형태에 따르면, 화학식 II의 화합물은 예를 들어 하기 화합물 (III) 내지 (XXVII) 및 이들의 염 또는 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태 중에서 선택된다. 참고로, 하기 개발된 화학식에서, 2차 아미노 모이어티는 -NH- 또는 -N-으로 무차별적으로 표기될 수 있다.
[화학식 III]
Figure pct00035
[화학식 IV]
Figure pct00036
[화학식 VI]
Figure pct00037
[화학식 VII]
Figure pct00038
[화학식 VIII]
Figure pct00039
[화학식 IX]
Figure pct00040
[화학식 X]
Figure pct00041
[화학식 XI]
Figure pct00042
[화학식 XII]
Figure pct00043
[화학식 XIII]
Figure pct00044
[화학식 XIV]
Figure pct00045
[화학식 XV]
Figure pct00046
[화학식 XVI]
Figure pct00047
[화학식 XVII]
Figure pct00048
[화학식 XVIII]
Figure pct00049
[화학식 XIX]
Figure pct00050
[화학식 XX]
Figure pct00051
[화학식 XXI]
Figure pct00052
[화학식 XXII]
Figure pct00053
[화학식 XXIII]
Figure pct00054
[화학식 XXIV]
Figure pct00055
[화학식 XXV]
Figure pct00056
[화학식 XXVI]
Figure pct00057
및
[화학식 XXVII]
Figure pct00058
더 구체적으로, 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX) 및 (XXII), 구체적으로 화합물 (IV), (IX), (XII), 또는 (XVI), 더 구체적으로 화합물 (IV) 또는 (XII), 및 모든 구체적으로 화합물 (IV)는 이들의 염 또는 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태와 같이 흥미롭다. 예를 들어, 이들은 그의 유리 염기로 존재할 수 있다.
실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX) 및 (XXII)는 예를 들어, 비경구 투여 후 기능성 mRNA를 표적 조직 내로 전달할 수 있고 전달된 mRNA가 항원을 코딩하는 경우 면역 반응 또는 EPO와 같은 단백질의 발현을 유도하기 위한 안정한 LNPs(4~8℃에서 액체 형태로 안정함)의 제형화에 효율적이다.
양이온성 지질의 제조
본 발명에 따른 화합물은 숙련자에게 공지된 방법 및 절차를 사용하여 쉽게 상업적으로 입수가능하거나 문헌에 기술된 출발 물질로부터 제조될 수 있다.
예를 들어, 화학식 II의 지질 화합물은 화학식 I의 라디칼의 전구체와, 상기 전구체와 반응할 수 있는 말단 반응기를 갖는 지질 화합물 또는 이의 유도체 사이의 공유적 커플링에 의해 수득될 수 있다.
이 말단 반응기는 직접적으로 지질 화합물의 소수성 또는 친유성 부분의 말단에 위치하여 변환되거나 또는 지질 화합물의 소수성 또는 친유성 부분에 이미 연결된 스페이서의 말단에 위치할 수 있다.
예상되는 공유 결합을 형성하도록 지질 화합물과 반응시키고자 하는 화학식 I의 라디칼의 편리한 전구체의 선택은 분명히 당업자의 능력 내에 있다. 상기 전구체는 공유 결합을 형성하도록 지질 화합물 중 하나와 화학적으로 반응할 수 있는 기를 갖기만 하면 된다.
이들 출발 화합물, 즉 화학식 I의 라디칼의 전구체 및 지질 화합물 또는 이의 유도체(변환을 위해)와 관련하여, 이들은 예를 들어 하기 실시예에 제시된 제조 방법에 따라 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
공유적 커플링은 또한, 변환시킬 지질 화합물 또는 이의 유도체 상의 반응기 및 화학식 I의 라디칼의 전구체의 반응기의 화학적 성질과 관련하여 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
일반적으로, 공유 결합은 에스테르화, 아미드화 또는 카바메이션에 의해 형성될 수 있다.
A에 대한 피리디닐 기를 갖는 화학식 I의 라디칼에 대한 대표적인 편리한 전구체로서, 그의 상응하는 피리딜 이소티오시아네이트, 예를 들어 3-피리딜 이소티오시아네이트를 들 수 있다.
A에 대한 이미다졸릴 기를 갖는 화학식 I의 라디칼에 대한 대표적인 편리한 전구체로서, 상응하는 이미다졸카르복실산을 들 수 있다.
화학식 IV의 화합물로서 화학식 I의 화합물을 수득하기 위한 하나의 구체적인 접근법은 하기 반응식 1에 도시되어 있다.
[반응식 1]
Figure pct00059
Figure pct00060
전형적이거나 특정한 실험 조건(즉, 반응 온도, 시간, 시약의 몰, 용매 등)이 주어지는 경우, 달리 진술되지 않는 한 다른 실험 조건도 사용될 수 있음을 알 것이다. 최적 반응 조건은 사용되는 특정한 반응물 또는 용매에 따라 달라질 수 있지만, 이러한 조건은 일상적인 최적화 절차를 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
선택적 염화는 예상되는 양이온 형태를 형성하도록 통상적인 방식으로 수행될 수 있다.
유리하게는 커플링 반응에 이어서, 수득된 최종 생성물의 정제 및/또는 단리의 후속 단계가 뒤따를 수 있다. 편리한 정제 방법은 하기 실시예에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어, 수득된 화합물의 정제는 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로부터 더 잘 이해될 것이며, 이들 모두는 단지 예시를 위한 것으로서 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.
조성물, 지질 나노입자 및 제조 공정
본 발명은 상기 기술된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 조성물은 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 적어도 하나의 핵산을 함유하는 지질 나노입자로 제형화될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 적어도 하나의 치료적, 음이온성 또는 다중음이온성 제제, 예를 들어 적어도 하나의 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
중성 지질
본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 중성 지질을 포함할 수 있다. 중성 지질의 존재는 지질 나노입자의 구조적 안정성을 향상시킬 수 있다. 중성 지질은 핵산의 전달 효율을 고려하여 적절히 선택될 수 있다.
중성 지질은 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물과 구별된다. 중성 지질은 선택된 pH에서 이온화할 수 없거나 중성 쯔비터이온성 화합물이다.
본 발명에 유용한 중성 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고마이엘린, 및 세라마이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민은 쯔비터이온성 지질이다. 스핑고마이엘린 및 세라마이드는 이온화가능한 지질이 아니다.
본 발명에 유용한 포스파티딜콜린의 예로는 DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPC(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DMPC(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), POPC(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPC(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린)를 들 수 있다.
본 발명에 유용한 포스파티딜에탄올아민의 예로는 DOPE(1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DPPE(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DMPE(1,2 -디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DSPE(1,2-디스테아로일-s/i-글리세로-3-포스포에탄올아민), DLPE(1,2-디라우로일-SM-글리세로-3-포스포에탄올아민), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 또는 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE)을 들 수 있다.
중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, POPC, DOPC와 같은 포스파티딜콜린; DOPE, DPPE, DMPE, DSPE, DLPE와 같은 포스파티딜에탄올아민; 스핑고마이엘린; 및 세라마이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 중성 지질은 DSPC, DOPC 및 DOPE일 수 있으며, 예를 들어 DSPC 또는 DOPE일 수 있다.
중성 지질은 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 및 지질의 총 몰량에 대해 약 0% 내지 약 50%, 예를 들어 약 5% 내지 약 45%, 예를 들어 약 8% 내지 약 40%, 예를 들어 약 10% 내지 약 30%의 범위의 몰량으로 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자를 제형화하기 위한 방법의 단계 a)에 존재할 수 있다.
중성 지질은 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 및 지질의 총 몰량에 대해 약 0% 내지 약 50%, 예를 들어 약 5% 내지 약 45%, 예를 들어 약 8% 내지 약 40%, 예를 들어 약 10% 내지 약 30%의 범위의 몰량으로 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자에 존재할 수 있다.
중성 지질은 약 70:1 내지 약 1:2, 예를 들어 약 30:1 내지 약 1:1, 예를 들어 약 15:1 내지 약 2:1, 예를 들어 약 10:1 내지 약 4:1의 범위일 수 있고, 더욱 예를 들어 약 5:1인 지질 화합물:중성 지질의 몰비로 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자에 존재할 수 있다.
스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르
본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 스테로이드 알코올(또는 스테롤) 또는 이의 에스테르를 포함할 수 있다. 스테롤 또는 스테롤의 에스테르의 존재는 또한 지질 나노입자의 구조적 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 유용한 스테롤 또는 스테로이드 알코올은 콜레스테롤 또는 이의 유도체, 에르고스테롤, 데스모스테롤(3β-히드록시-5,24-콜레스타디엔), 스티그마스테롤(스티그마스타-5,22-디엔-3-올), 라노스테롤(8,24-라노스타디엔-3b-올), 7-데히드로콜레스테롤(Δ5,7-콜레스테롤), 디히드로라노스테롤(24,25-디히드로라노스테롤), 자이모스테롤(5α-콜레스타-8,24-디엔-3β-올) , 라토스테롤(5α-콜레스트-7-엔-3β-올), 디오스게닌((3β,25R)-스피로스트-5-엔-3-올), 시토스테롤(22,23-디히드로스티그마스테롤), 시토스타놀, 캄페스테롤(캄페스트- 5-엔-3β-올), 캄페스타놀(5a-캄페스탄-3b-올), 24-메틸렌 콜레스테롤(5,24(28)-콜레스타디엔-24-메틸렌-3β-올)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
스테로이드 알코올의 에스테르 또는 스테롤의 에스테르는 카르복실산과 스테로이드 알코올의 히드록실 기의 에스테르를 지칭한다. 적합한 카르복실산은 카르복실 모이어티에 추가로 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 알킬 기를 포함한다. 일부 실시 형태에서 알킬 기는 C1-C20 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 알킬 기, 예를 들어 C2-C18, 예를 들어 C4-C16, 예를 들어 C8-C12 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 알킬 기일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 카르복실산은 지방산일 수 있다. 예를 들어, 지방산은 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 스테아르산, 마르가르산, 올레산, 리놀레산, 또는 아라키드산일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 스테롤의 에스테르는 콜레스테릴 에스테르일 수 있다.
본 발명에 유용한 스테롤의 에스테르 또는 스테로이드 알코올의 에스테르는 콜레스테릴 마르가레이트(콜레스트-5-엔-3β-일 헵타데카노에이트), 콜레스테릴 올레에이트, 및 콜레스테릴 스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 유용한 스테롤 또는 스테로이드 알코올 또는 이들의 에스테르는 콜레스테롤 또는 이의 유도체, 에르고스테롤, 데스모스테롤(3β-히드록시-5,24-콜레스타디엔), 스티그마스테롤(스티그마스타-5,22-디엔-3-올), 라노스테롤(8,24-라노스타디엔-3b-올), 7-데히드로콜레스테롤(Δ5,7-콜레스테롤), 디히드로라노스테롤(24,25-디히드로라노스테롤), 자이모스테롤(5α-콜레스타-8,24-디엔-3β-올), 라토스테롤(5α-콜레스트-7-엔-3β-올), 디오스게닌((3β,25R)-스피로스트-5-엔-3-올), 시토스테롤(22,23-디히드로스티그마스테롤), 시토스타놀, 캄페스테롤(캄페스트- 5-엔-3β-올), 캄페스타놀(5a-캄페스탄-3b-올), 24-메틸렌 콜레스테롤(5,24(28)-콜레스타디엔-24-메틸렌-3β-올), 콜레스테릴 마르가레이트(콜레스트-5-엔-3β-일 헵타데카노에이트), 콜레스테릴 올레에이트, 및 콜레스테릴 스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 유용한 스테롤은 산화된 콜레스테롤과 같은 콜레스테롤 유도체일 수 있다.
본 발명에 적합한 산화된 콜레스테롤은 25-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 20α-히드록시콜레스테롤, 6-케토-5α-히드록시콜레스테롤, 7-케토-콜레스테롤, 7β,25-히드록시콜레스테롤 및 7β-히드록시콜레스테롤일 수 있다. 예를 들어, 산화된 콜레스테롤은 25-히드록시콜레스테롤 및 20α-히드록시콜레스테롤일 수 있고, 예를 들어 이것은 20α-히드록시콜레스테롤일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 스테롤 또는 스테로이드 알코올, 또는 이의 에스테르는 콜레스테롤, 콜레스테릴 에스테르, 또는 콜레스테롤 유도체, 예를 들어 산화된 콜레스테롤일 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 스테롤 또는 스테로이드 알코올은 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 에스테르일 수 있고, 예를 들어 콜레스테롤일 수 있다.
스테롤 또는 스테로이드 알코올, 또는 이의 에스테르는 조성물 또는 지질 나노입자에 존재할 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 지질 및 지질 화합물의 총 몰량에 대해 약 0 내지 약 60%, 예를 들어 약 10% 내지 약 50%, 예를 들어 약 20% 내지 약 50%의 범위의 몰량으로 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자에 존재할 수 있다.
스테롤 또는 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르는 약 4:1 내지 약 1:2, 예를 들어 약 3.5:1 내지 약 1:1.8, 예를 들어 약 2:1 내지 약 1:1.5, 예를 들어 약 1.5:1 내지 약 1:1.2의 범위일 수 있고, 예를 들어 약 1.3:1 내지 약 1: 1.3인 지질 화합물:스테로이드 알코올, 또는 이의 에스테르의 몰비로 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자에 존재할 수 있다.
페길화 지질
본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 페길화된(또는 PEG-) 지질을 포함할 수 있다.
고려되는 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 갖는 지질에 공유적으로 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자의 조성물에의 PEG-변성 지질의 첨가는 복잡한 응집을 방지할 수 있고, 순환 수명을 증가시키고 조성물 또는 지질 나노입자의 표적 세포로의 전달을 증가시키는 수단을 또한 제공할 수 있다.
적합한 페길화 지질은 예를 들어 페길화 디아실글리세롤(PEG-DAG), 예컨대 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(DMG-PEG), 페길화 포스파티딜에탄올로아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEG-S-DAG), 예컨대 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-0-(코-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG), 페길화 세라마이드(PEG-cer) 또는 PEG 디알콕시프로필카르바메이트, 예컨대 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데칸옥시)프로필)카르바메이트, 2,3-디(테트라데칸옥시)프로필-N-(코-메톡시(폴리에톡시)에틸)카르바메이트, 또는 mPEG-N,N-디테트라데실아세트아미드(2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드 또는 ALC-0159로도 공지됨)일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 페길화 지질은 PEG-DAG, DMG-PEG, PEG-PE, PEG-S-DAG, PEG-S-DMG, PEG-cer, 또는 mPEG-N,N-디테트라데실아세트아미드, 또는 PEG-디알콕시프로필카르바메이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 적합한 페길화 지질은 DMG-PEG, PEG-PE, 또는 mPEG-N,N-디테트라데실아세트아미드일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 페길화 지질은 DMG-PEG 또는 PEG-PE일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 페길화 지질은 mPEG-N,N-디테트라데실아세트아미드일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 지질 및 지질 화합물의 총 몰량에 대해 약 1 내지 약 15%, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 예를 들어 약 1% 내지 약 5%, 예를 들어 약 1% 내지 약 3.5%의 범위의 몰량의 페길화 지질을 포함할 수 있다.
페길화 지질 및 지질 화합물은 약 70:1 내지 약 4:1, 예를 들어 약 40:1 내지 약 10:1, 예를 들어 약 35:1 내지 약 15:1의 지질 화합물:페길화 지질의 몰비로 존재할 수 있으며, 예를 들어 약 33:1 또는 약 14:1이다.
일 실시 형태에서, 조성물 또는 지질 나노입자는 상기 기술된 바와 같은 지질 화합물에 추가로, 적어도 하나의 중성 지질, 적어도 하나의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 적어도 하나의 페길화 지질을 포함할 수 있다.
중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르 및 페길화 지질은 상기 나타낸 바와 같을 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 지질 나노입자는 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물, 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질을 지질 및 지질 화합물의 총량에 대해 약 30% 내지 약 70%의 지질 화합물, 약 0% 내지 약 50%의 중성 지질, 20% 내지 약 50%의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 약 1% 내지 약 15%의 페길화된 것의 몰량으로 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 지질 나노입자는 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물, 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질을 지질 및 지질 화합물의 총량에 대해 약 30% 내지 약 60%의 지질 화합물, 약 5% 내지 약 30%의 중성 지질, 약 30% 내지 약 48%의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 약 1.5% 내지 약 5%의 페길화된 것의 몰량으로 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 지질 나노입자는 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물, 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질을 지질 및 지질 화합물의 총량에 대해 약 35% 내지 약 50%의 지질 화합물, 약 10% 내지 약 16%의 중성 지질, 약 38.5% 내지 약 46.5%의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 약 1.5%의 페길화된 것의 몰량으로 포함할 수 있다.
일 실시 형태로서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 지질 및 지질 화합물의 총량에 대해 약 35%의 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물, 약 16%의 중성 지질, 약 46.5%의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 약 1.5%의 페길화된 것을 포함할 수 있다.
또 다른 실시 형태로서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 지질 및 지질 화합물의 총량에 대해 약 50%의 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물, 약 10%의 중성 지질, 약 38.5%의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 약 1.5%의 페길화된 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 및 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질의 몰비는 약 35/16/46.5/1.5, 약 50/10/38.5/1.5, 약 57.2/7.1/34.3/1.4, 약 40/15/40/5, 약 50/10/35/4.5/0.5, 약 50/10/35/5, 약 40/10/40/10; 약 35/15/40/10, 약 52/13/30/5일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 및 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질의 몰비는 약 35/16/46.5/1.5 또는 약 50/10/38.5/1.5일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 임의의 화합물 (III) 내지 (XXVII), 또는 화합물 (III), (IV), (V), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII), 또는 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII), 또는 화합물 (IV), (IX), (XII), 또는 (XVI), 또는 화합물 (IV) 또는 (XII)일 수 있으며, 예를 들어 화합물 (IV)이고, 중성 지질은 DSPC 또는 DOPE일 수 있고, 스테로이드 알코올은 콜레스테롤일 수 있고, 페길화 지질은 PEG-PE(PEG2000-PE) 또는 PEG-DMG(PEG2000-DMG)일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 화합물 (III), (IV), (V), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII)일 수 있고, 중성 지질은 DSPC일 수 있고, 스테로이드 알코올은 콜레스테롤일 수 있고, 페길화 지질은 PEG-PE(PEG2000-PE)일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII)일 수 있고, 중성 지질은 DSPC일 수 있고, 스테로이드 알코올은 콜레스테롤일 수 있고, 페길화 지질은 PEG-PE(PEG2000-PE)일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 화합물 (IV), (IX), (XII), 또는 (XVI)일 수 있고, 중성 지질은 DSPC일 수 있고, 스테로이드 알코올은 콜레스테롤일 수 있고, 페길화 지질은 PEG-PE(PEG2000-PE)일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 화합물 (IV) 또는 (XII)일 수 있고, 중성 지질은 DSPC일 수 있고, 스테로이드 알코올은 콜레스테롤일 수 있고, 페길화 지질은 PEG-PE(PEG2000-PE)일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 화합물 (IV)일 수 있고, 중성 지질은 DSPC일 수 있고, 스테로이드 알코올은 콜레스테롤일 수 있고, 페길화 지질은 PEG-PE(PEG2000-PE)일 수 있다.
지질 나노입자(LNPs)
본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물 및 적어도 하나의 핵산을 함유하는 지질 나노입자에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 화학식 III 내지 XXVII의 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물, 또는 화합물 (III), (IV), (V), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII), 또는 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII), 또는 화합물 (IV), (IX), (XII) 또는 (XVI), 또는 화합물 (IV) 또는 (XII), 또는 예를 들어 화학식 III, IV 또는 V, 예를 들어 화학식 IV의 화합물을 함유할 수 있다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 중성 인지질 또는 스핑고지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 조성물은 상기 기술된 바와 같이 지질 나노입자로서 제형화될 수 있다.
지질 나노입자는 전신 투여, 예를 들어 비경구 투여, 또는 근육내, 피내 또는 피하 투여에 적합하도록 하는 직경을 가질 수 있다. 전형적으로, 지질 나노입자는 600 나노미터(nm) 미만, 예를 들어 400 nm 미만의 Z-평균 크기를 갖는다.
일 실시 형태에서, LNPs는 200 nm 미만의 Z-평균 크기를 갖는다. 이러한 크기는 유리하게는 살균 여과와 양립가능하고, 근육내 또는 피하 투여 후 림프관을 통한 이동에 가장 적절하다. 이 크기는 정맥내 투여에도 적절하며, 그 이유는 더 큰 입자 주사가 모세혈관 혈전증을 유발할 수 있기 때문이다.
일부 실시 형태에서, 지질 나노입자는 약 20 nm 내지 약 300 nm, 예를 들어 약 20 nm 내지 약 250 nm, 예를 들어 약 30 nm 내지 약 200 nm, 약 40 nm 내지 약 180 nm, 약 60 nm 내지 약 170 nm, 약 80 내지 약 160 nm, 및 약 90 내지 약 150 nm의 범위의 Z-평균 크기를 가질 수 있다. 일 실시 형태에서, 나노입자는 약 90 내지 약 150 nm의 범위의 직경을 가질 수 있다.
지질 나노입자의 "Z-평균 크기"는 동적 광 산란(DLS)에 의해 결정될 수 있다. 동적 광 산란에 사용되는 Z-평균 크기 또는 Z-평균 평균치는 누적 평균으로도 공지되어 있는 파라미터이다. 이것은 당해 기술에 의해 생성된 일차적이고 가장 안정한 파라미터이다. Z-평균 평균치는 '조화 강도 평균 입자 직경'으로 정의된다. Z-평균 크기는 제타 사이저 Nano ZS 광 산란 기기(Malvern Instruments)로 측정될 수 있다. Nano ZS를 사용한 정확한 입자 크기 측정을 위해, 상기 완충제의 점도 및 상기 재료의 굴절률을 장비 소프트웨어에 제공해야 했다(PBS: v=1.02 cP, RI =1.45).
제조 공정 중에 크기에 약간의 변동이 발생할 수 있으므로 명시된 치수의 최대 20~30%의 변동이 허용가능하며, 이는 명시된 크기 내인 것으로 간주된다. 대안적으로 크기는 여과 스크리닝 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 입자의 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 97%가 명시된 크기의 "스크린 타입" 필터를 통과하는 경우 입자 제제는 명시된 크기보다 작다.
"다분산 지수"는 지질 나노입자 혼합물에서 개별 지질 나노입자의 균일 또는 불균일 크기 분포의 측정치이며, 혼합물 중 입자 분포의 폭을 나타낸다. PI는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
일 실시 형태에서, 동적 광 산란에 의해 측정된 본원에 기술된 나노입자의 다분산 지수는 0.5 이하, 예를 들어 0.4 이하, 예를 들어 0.3 이하, 또는 심지어 예를 들어 0.2 이하이다.
일 실시 형태에서, 지질 나노입자는 응집, 침전, 또는 동적 광 산란에 의해 측정된 크기 및 다분산 지수의 증가가 주어진 기간에 걸쳐, 예를 들어 적어도 2시간 내지 수 개월에 걸쳐, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 12개월에 걸쳐 관찰되지 않을 수 있거나 실질적으로 관찰되지 않을 수 있다는 의미에서 콜로이드적으로 안정하다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 4.5 내지 6.7의 범위의 pKa를 갖는다.
이 pKa는 형광 프로브 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 술폰산(TNS) 및 대략 6 mM의 총 지질 농도의 PBS 중 양이온성 지질/DOPE/콜레스테롤/PEG-지질(35:16:35:2.5 mol%)로 구성된 미리 형성된 LNPs를 이용하여 결정될 수 있다. 간단히 말해서, TNS를 증류수 중 100 μM 스톡으로 제조한다. LNPs는 10 mM HEPES, 10 mM 4-모르폴린에탄술폰산, 10 mM 아세트산암모늄, 130 mM NaCl을 포함하는 완충 용액(삼중) 90 μL에서 총 지질 100 μM까지 희석되며, 여기서, pH 범위는 2.71 내지 11.5이다. 스톡 TNS 10 마이크로리터를 LNP 용액들에 첨가하고 흑색 96웰 플레이트에서 잘 혼합한다. 형광 강도는 321 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 Tecan Pro200 플레이트 판독기에서 모니터링된다. 생성된 형광 값을 이용하여, 형광 대 완충제 pH의 S자형 그래프를 생성한다. 이 곡선의 변곡점의 로그는 LNP 제형의 겉보기 pKa이다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Semple, S. C. et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat. Biotechnol. 28, 172-176 (2010)]에 상세히 기술되어 있다.
지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산을 포함하거나 캡슐화할 수 있다.
핵산은 지질 나노입자의 외측 표면 상에 흡착되고/되거나 이의 내부에 캡슐화될 수 있다. 지질 화합물은 핵산과 복합체를 형성하고/하거나 핵산을 캡슐화할 수 있다. 대안적으로, 지질 화합물은 핵산을 캡슐화하는 소포에 포함될 수 있다.
지질 나노입자는 입자 표면의 음전하와 양전하의 합이고 제타 전위로 표시되는 전체 표면 전하를 갖는다. 제타 전위는 분산 매질과 분산된 입자에 부착된 정지 유체층 사이의 전위차이다. 제타 전위는 이중층에서 전하의 크기를 정량화하는 데 널리 사용된다.
제타 전위는 이론적 모델을 사용하여 계산될 수 있으며, 전기영동 이동도 또는 동적 전기영동 이동도 측정을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 미립자의 제타 전위를 추정하기 위해 전기영동을 사용할 수 있다. 실제로, 분산액의 제타 전위는 분산액에 전기장을 적용하여 측정할 수 있다. 제타 전위가 있는 분산액 내의 입자는 제타 전위의 크기에 비례하는 속도로 반대 전하의 전극을 향해 이동한다. 이 속도는 레이저 도플러 풍속계(Laser Doppler Anemometer) 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 이동 중인 입자에 의해 야기되는 입사 레이저 빔의 주파수 편이 또는 위상 편이는 입자 이동도로서 측정될 수 있으며, 이 이동도는 분산제의 점도 및 유전율을 입력하고 Smoluchowski 이론을 적용하여 제타 전위로 변환할 수 있다. 전기영동 속도는 측정가능한 파라미터인 전기영동 이동도에 비례한다. 전기영동 이동도와 제타 전위를 연결하는 몇 가지 이론이 있다.
Nicomp 380 ZLS 시스템 또는 Malvern nanoZS와 같은 적합한 시스템을 제타 전위의 결정에 사용할 수 있다. 이러한 시스템은 일반적으로 액체 현탁액에서 하전 입자의 전기영동 이동성 및 안정성을 측정한다. 이들 값은 현탁액 중 입자에 의해 가해지는 반발력의 예측 변수이며 콜로이드 시스템의 안정성과 직접적으로 관련된다.
중성 pH에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자의 제타 전위는 중성에 가깝다.
한 가지 장점은 0에 가까운 제타 전위를 갖는 것이 체내에서 입자 이동성을 촉진하고, 옵소닌화를 줄이고, 표적 조직에 대한 접근을 증가시킨다는 것이다.
일 실시 형태에서, pH 6.0 내지 7.5에서, 나노입자의 제타 전위는 약 -30 mV 내지 약 +5 mV, 예를 들어 약 -20 mV 내지 약 0 mV, 예를 들어 약 -10 mV 내지 약 0 mV의 범위일 수 있다.
본원에 기술된 지질 나노입자는 예를 들어 제조시 본원에 기술된 바와 같은 지질 화합물의 전하비(4차 암모늄으로부터의 양이온 전하:지질 화합물의 N 화합물):핵산(포스페이트로부터의 음이온 전하:P)에 따라 양전하에서 음전하로 조정하고 핵산과 지질 화합물을 혼합함으로써 형성될 수 있다. 지질 화합물 및 핵산의 전하는 약 6.5 내지 약 7.5인 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에서의 전하이다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자 내의 핵산에 대한 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물의 +/- (N/P) 전하비는 하기 방정식에 의해 계산될 수 있다. (+/- 전하비)=[(양이온성 지질의 양(mol)) * (양이온성 지질의 총 양전하 수)] : [(핵산의 양(mol)) * (핵산의 총 음전하 수)].
핵산의 양 및 지질 화합물의 양은 나노입자 제조시 로딩량을 고려하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 본 발명에 적합한 나노입자에서의 양전하 대 음전하의 비는 중성 또는 그 부근에서 전체 음전하 또는 전체 전하를 가질 수 있도록 하는 것이다.
일 실시 형태에서, 나노입자에서의 양전하 대 음전하의 전하비는 약 4:1 내지 약 15:1, 예를 들어 약 5:1 내지 약 12:1, 예를 들어 약 6:1 내지 약 9:1의 범위이며, 예를 들어 약 6:1 내지 약 8:1이다.
일 실시 형태에서, 핵산을 캡슐화하는 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 약 80~200 nm의 Z-평균 크기 및 약 4~8:1의 전하비 N/P를 가질 수 있다.
지질 나노입자 제조 공정
본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물을 사용하여 지질 나노입자, 예를 들어 적어도 하나의 핵산을 포함하는 지질 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 함유 지질 나노입자는 적어도 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능할 수 있다:
a) 본원에 개시된 바와 같은, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물을 함유하는 것을 수혼화성 유기 용매에 용해시키는 단계,
b) 단계 a)에서 수득된 유기 용매를 적어도 하나의 핵산을 포함하는 수성 용매와 혼합하는 단계, 및
c) 수성 용매 중 상기 핵산을 함유하는 상기 지질 나노입자를 수득하는 단계.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자를 제조하는 방법은 적어도 하기 단계를 포함할 수 있다:
a) 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 및 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 지질을 수혼화성 유기 용매에 용해시키는 단계,
b) 단계 a)에서 수득된 유기 용매를 적어도 하나의 핵산을 포함하는 수성 용매와 혼합하는 단계, 및
c) 수성 용매 중 상기 핵산을 함유하는 상기 지질 나노입자를 수득하는 단계.
본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물은 지질 나노입자를 구조화하고 캡슐화될 임의의 로드(load)를 캡슐화하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 지질 나노입자에 사용되는 이온화가능한 지질 화합물의 양은 임의의 공지된 기술에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있고, 로드의 성질 및 양, 및 존재할 수 있는 다른 지질의 성질 및 양에 따라 조정된다.
일 실시 형태에서, 단계 a)는 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 유기 용매에 용해시키는 것을 추가로 포함한다.
본 발명에 적합한 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화 지질은 본원에 기술된 바와 같을 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 단계 a)는 하나 이상의 중성 지질, 하나 이상의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 하나 이상의 페길화 지질을 유기 용매에 용해시키는 것을 추가로 포함할 수 있고, 상기 지질 화합물, 상기 중성 지질, 상기 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 상기 페길화 지질은 지질 및 지질 화합물의 총량에 대해 약 30% 내지 약 70%의 지질 화합물, 약 0% 내지 약 50%의 중성 지질, 20% 내지 약 50%의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 약 1% 내지 약 15%의 페길화된 것의 몰량으로 유기 용매에 존재한다.
유용한 수혼화성 유기 용매는 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 및 임의의 다른 첨가된 지질을 용해시킬 수 있는 임의의 수혼화성 유기 용매일 수 있다. 적합한 유기 용매의 예로는 에탄올 또는 메탄올, 1-프로판올, 이소프로판올, t-부탄올, THF, DMSO, 아세톤, 아세토니트릴, 디글라임, DMF, 1,4-디옥산, 에틸렌 글리콜, 글리세린, 헥사메틸포스포르아미드, 헥사메틸포스포러스 트리아미드를 들 수 있다. 일 실시 형태에서, 유기 용매는 에탄올 및 이소프로판올일 수 있다.
단계 b)에서 사용가능한 수성 용매는 수성 완충 용액을 포함한다.
적합한 수성 완충 용액의 예로는 시트레이트 완충제, 아세트산나트륨 완충제, 숙시네이트 완충제, 보레이트 완충제 또는 포스페이트 완충제 등을 포함하는 산성 완충제를 들 수 있다. 예를 들어, 수성 완충 용매는 시트레이트 완충 용액 또는 아세테이트 완충 용액일 수 있다.
수성 용매의 pH는 약 4.5 내지 약 7.0, 예를 들어 약 5.0 내지 약 6.5, 예를 들어 약 5.5 내지 약 6.0의 범위일 수 있고, 예를 들어 약 6.5일 수 있다.
단계 b)에서 유기 용매와 수성 용매는 약 1:1 내지 약 1:6의 범위의 유기 용매:수성 용매의 비로 혼합될 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 비는 약 1:2 내지 약 1:4의 범위일 수 있고, 예를 들어 약 1:3의 비일 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 단계 b)에서 유기 용매와 수성 용매는 약 0.01 ml/분 내지 약 12 ml/분의 범위의 유량으로 혼합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 유량은 약 0.02 ml/분 내지 약 10 ml/분, 약 0.5 ml/분 내지 약 8 ml/분, 약 1 ml/분 내지 약 6 ml/분, 또는 약 4 ml/분의 범위일 수 있다.
혼합 단계는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 두 용매는 T-튜브 또는 Y-커넥터를 이용하여 혼합될 수 있다. 대안적으로, 상기 혼합은 문헌[Belliveau et al. (2012)]에 기술된 바와 같이 미세유체 마이크로믹서를 이용하여 층류 혼합에 의해 수행될 수 있다.
나타낸 바와 같이, 단계 b)에서 수성 용매는 핵산을 포함한다. 일 실시 형태에서, 핵산은 적어도 하나의 항원을 코딩할 수 있다. 적합한 핵산은 예를 들어 아래에 상세히 설명된 바와 같을 수 있다.
본 방법은 필요한 경우 pH를 산성에서 중성으로 증가시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시 형태에서, 본 방법은 단계 c)에서 수득되는 지질 나노입자에 함유되는 수성 용매의 pH를 약 5.5 내지 약 7.5, 예를 들어 약 6.0 내지 약 7.0, 예를 들어 약 6.5 내지 약 7.0의 범위의 pH로 증가시키는 단계 d)를 포함할 수 있다.
pH를 증가시키는 단계는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, pH의 변화는 투석 또는 정용여과 단계에 의해 수행될 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 방법의 단계 d)는 지질 나노입자를 투석 또는 정용여과하는 적어도 하나의 단계를 추가로 포함할 수 있다. 투석 또는 정용여과 단계는 pH 범위가 약 5.5 내지 약 7.5, 예를 들어 약 6.0 내지 약 7.0, 예를 들어 약 6.5 내지 약 7.0, 예를 들어 약 6.5인 수성 용매에 대해 이루어질 수 있다.
단계 d)에서 사용가능한 수성 용매는 지질 나노입자의 안정화 및 용액의 오스몰 농도를 향상시키기 위해 탄수화물을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 탄수화물은 수크로스, 만니톨, 글루코스, 덱스트로스 또는 트레할로스일 수 있다. 탄수화물은 수성 용매 총량에 대해 약 5% 내지 약 10%, 예를 들어 약 8%의 양으로 존재할 수 있다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 방법의 단계 d)는 지질 나노입자를 투석하는 적어도 두 단계를 포함할 수 있다. 첫 번째 투석 단계는 유사한 수성 용매(pH 및 함량 면에서 유사)에 대해 이루어질 수 있고 유기 용매를 제거할 수 있다. 두 번째 투석 단계는 상이한 수성 용매(pH 면에서 그리고 가능하게는 함량 면에서 상이함)에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 경우 투석 용액의 pH는 약 5.5 내지 약 7.5, 예를 들어 약 6.0 내지 약 7.0, 예를 들어 약 6.5 내지 약 7.0의 범위, 예를 들어 약 6.5일 수 있다. 두 번째 투석의 투석 용액은 완충액, 예를 들어 포스페이트 완충제, 트리스 완충제, Hepes 완충제, 히스티딘 완충제 또는 글리신 완충제일 수 있다. 완충제의 오스몰 농도는 NaCl과 같은 염, 또는 글리세롤, 수크로스, 만니톨, 글루코스, 덱스트로스 또는 트레할로스와 같은 탄수화물로 조정될 수 있다.
일 실시 형태에서, 오스몰 농도는 체내에 등장액을 주사하기 위해 290 mOsmol/kg에 가까운 최종 오스몰랄 농도에 도달하도록 조정된다.
단계 c) 및/또는 d)에 더하여, 본 방법은 지질 나노입자를 수확, 정제, 농축 및/또는 살균하여 제약 조성물, 예를 들어 면역원성 조성물로서 추가로 제형화하기에 적합한 임의의 추가 단계를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 제조 방법에 따라 수득할 수 있는 지질 나노입자에 관한 것이다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 본 발명은 적어도 하기 단계를 포함하는 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다:
i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물을 혼합하거나, 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물을 혼합하거나, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 적어도 하나의 지질 나노입자를 제조하는 단계, 및
ii) 핵산과 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물이 혼합된 것, 또는 핵산과 본원에 개시된 조성물이 혼합된 것, 또는 단계 i)에서 수득된 지질 나노입자를 적어도 하나의 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체와 조합하는 단계.
또 다른 실시 형태에 따르면, 본 발명은 적어도 하기 단계를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법에 관한 것이다:
i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물을 혼합하거나, 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 조성물을 혼합하거나, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 적어도 하나의 핵산 함유 지질 나노입자를 제조하는 단계(여기서, 핵산은 적어도 하나의 항원을 코딩함), 및
ii) 핵산과 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물이 혼합된 것, 또는 핵산과 본원에 개시된 조성물이 혼합된 것, 또는 단계 i)에서 수득된 지질 나노입자를 적어도 하나의 제약상 허용가능한 부형제 또는 담체와 조합하는 단계.
본 발명에 적합한 제약 조성물 및 면역원성 조성물은 이하에 더 상세히 설명된다.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 화학식 III 내지 XXVII의 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물, 또는 화합물 (III), (IV), (V), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII), 또는 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX), 또는 (XXII), 또는 화합물 (IV), (IX), (XII) 또는 (XVI), 또는 화합물 (IV) 또는 (XII), 또는 예를 들어 화학식 III, IV 또는 V, 예를 들어 화학식 IV의 화합물을 이용하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 DSPC 또는 DOPE인 중성 지질, 콜레스테롤인 스테로이드 알코올, 및 PEG-PE(PEG2000-PE) 또는 DMG-PEG(DMG-PEG2000)인 페길화 지질을 이용하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 화학식 III 내지 XXVII의 지질 화합물, DSPC인 중성 지질, 콜레스테롤인 스테로이드 알코올, 및 PEG-PE(PEG2000-PE)인 페길화 지질을 이용하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 화학식 III, IV, V, VIII, IX, XII, XVI, XIX, 또는 XXII의 지질 화합물, DSPC인 중성 지질, 콜레스테롤인 스테로이드 알코올, 및 PEG-PE(PEG2000-PE)인 페길화 지질을 이용하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 화학식 IV, VIII, IX, XII, XVI, XIX, 또는 XXII의 지질 화합물, DSPC인 중성 지질, 콜레스테롤인 스테로이드 알코올, 및 PEG-PE(PEG2000-PE)인 페길화 지질을 이용하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 화학식 IV, IX, XII, 또는 XVI의 지질 화합물, DSPC인 중성 지질, 콜레스테롤인 스테로이드 알코올, 및 PEG-(IV),(IX), PE(PEG2000-PE)인 페길화 지질을 이용하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 화학식 IV 또는 XII의 지질 화합물, DSPC인 중성 지질, 콜레스테롤인 스테로이드 알코올, 및 PEG-PE(PEG2000-PE)인 페길화 지질을 이용하여 제조될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자는 화학식 IV의 지질 화합물, DSPC인 중성 지질, 콜레스테롤인 스테로이드 알코올, 및 PEG-PE(PEG2000-PE)인 페길화 지질을 이용하여 제조될 수 있다.
핵산
본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자는 적어도 하나의 음이온성 또는 다중음이온성 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 치료제는 핵산일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 예를 들어 RNA, 예를 들어 시험관 내 전사 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적 생성 및 화학적 합성 분자를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 선형이거나 공유적으로 폐쇄되어 원을 형성하는 분자의 형태일 수 있다. 핵산은 예를 들어 DNA 주형으로부터 시험관 내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA의 형태로 세포 내로 도입되거나 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 또한 RNA는 서열 안정화, 캡핑 및 폴리아데닐화에 의해 적용 전에 변형될 수 있다.
핵산은 진핵 또는 원핵 기원일 수 있고, 예를 들어 인간, 동물, 식물, 박테리아, 효모 또는 바이러스 기원 등일 수 있다. 이것은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 수득될 수 있으며, 예를 들어 라이브러리 스크리닝, 화학적 합성 또는 대안적으로 라이브러리 스크리닝에 의해 얻어진 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합 방법에 의해 수득될 수 있다. 이들은 화학적으로 변형될 수 있다.
핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있고 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 PI 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 발현 벡터 및 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하고, 일반적으로, 원하는 코딩 서열, 및 특정 숙주 유기체(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물)에서 또는 시험관 내 발현 시스템에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는 데 필요한 적절한 DNA 서열을 함유한다. 일반적으로 클로닝 벡터는 원하는 특정 DNA 단편을 조작하고 증폭하는 데 사용되며 상기 원하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능성 서열이 결여되어 있을 수 있다.
일 실시 형태에서, 핵산은 이중 가닥 RNA(dsRNA); 단일 가닥 RNA(ssRNA); 이중 가닥 DNA(dsDNA); 단일 가닥 DNA(ssDNA); 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시 형태에서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA); 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO); 짧은 간섭 RNA(siRNA): 자가 증폭 RNA(saRNA); 마이크로 RNA(miRNA); 작은 핵 RNA(snRNA); 소형 뉴클레올라 RNA(snoRNA); 자가 증폭 RNA(saRNA); 플라스미드 DNA(pDNA); 폐쇄-말단 DNA(ceDNA), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA); 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO); 짧은 간섭 RNA(siRNA): 자가 증폭 RNA(saRNA); 마이크로 RNA(miRNA); 플라스미드 DNA(pDNA); 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA); 짧은 간섭 RNA(siRNA): 자가 증폭 RNA(saRNA); 마이크로 RNA(miRNA); 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA)일 수 있다.
일 실시 형태에서, 핵산은 mRNA이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 단백질 또는 효소를 코딩하는 RNA일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 기능성 효소 또는 단백질의 생산을 촉진하기 위해 표적 세포에 의해 발현될 수 있는 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 표적 세포에 의한 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 발현시 세포 또는 개체에서 기능성 효소 또는 단백질의 생산이 결핍되어 있다.
표적 세포는 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 지질 나노입자가 향하거나 표적화하는 세포이다. 표적 세포는 특정 조직 또는 기관을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포는 간세포, 상피 세포, 조혈 세포, 상피 세포, 내피 세포, 폐세포, 골세포, 줄기 세포, 중간엽 세포, 신경 세포(예를 들어, 수막, 성상 세포, 운동 뉴런, 후근 신경절 및 전각 운동 뉴런의 세포), 광수용기 세포(예를 들어 간상세포 및 원추세포), 망막 색소 상피 세포, 분비 세포, 심장 세포, 지방 세포, 혈관 평활근 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 윤활막 내층 세포, 난소 세포, 고환 세포, 섬유아세포, B 세포, T 세포, 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포일 수 있다.
mRNA
용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자, 예를 들어 전적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2'-위치에 히드록실 기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다.
상기 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 또는 재조합적으로 생성된 RNA를 포함한다.
이들은 천연 또는 인공 기원의 서열일 수 있으며, 예를 들어 mRNA(메신저 RNA), tRNA(운반 RNA), rRNA(리보솜 RNA), siRNA(침묵 RNA), miRNA(마이크로 RNA), mtRNA(미토콘드리아 RNA), shRNA (짧은 헤어핀 RNA), tmRNA(운반-메신저 RNA), vRNA(바이러스 RNA), 단일 가닥, 이중 가닥 및/또는 염기쌍 RNA(각각 ssRNA; dsRNA 및 bpRNA), 블런트-말단 RNA 또는 아닌 것, 성숙 및 미성숙 mRNA, 코딩 및 비코딩 RNA, 올리고뉴클레오티드들의 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열(변형되거나 그렇지 않은 것), 및 이들의 혼합물일 수 있다.
따라서 이들은 전구체 mRNA(pre-mRNA) 또는 이종 핵 mRNA(hnRNA) 및 성숙 mRNA와 같은 성숙 및 미성숙 mRNA를 포함하는 메신저 RNA(mRNA)일 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 RNA 분자는 또한 모노시스트론 및 폴리시스트론 메신저 RNA를 포함한다.
명확히 하기 위해, mRNA는 진핵 숙주에 의해 단백질로 번역될 수 있는 임의의 코딩 RNA 분자를 포함한다. 일반적으로 코딩 RNA 분자는 관심 단백질을 코딩하고 진핵 숙주에 의해 번역될 수 있는 서열을 포함하는 RNA 분자를 지칭하며, 상기 서열은 개시 코돈(ATG)으로 시작하고 예를 들어 종결 코돈(즉, TAA, TAG, TGA)으로 종결된다.
RNA는 자연 발생 RNA이거나 적어도 하나의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이해진 변형된 RNA일 수 있다. 그러한 변경은 예를 들어 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA의 적어도 하나의 뉴클레오티드와 같은 것에 비-뉴클레오티드 물질이 부가된 것을 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 자연 비발생 뉴클레오티드 또는 화학적 합성 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 자연 발생 RNA의 유사체 또는 유사체로 지칭될 수 있다.
일 실시 형태에서, RNA는 mRNA(메신저 RNA)이다. mRNA는 주형으로서 DNA를 사용하여 생성될 수 있고 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사체일 수 있다.
mRNA는 전형적으로 5'Cap, 5' 비번역 영역(5-UTR), 단백질 또는 펩티드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR) 및 3' 폴리A 테일을 포함한다. mRNA는 세포에서 그리고 시험관 내에서 제한된 반감기를 갖는다. 예를 들어, mRNA는 DNA 주형을 사용하여 시험관 내 전사에 의해 생성된다. 대안적으로, 상기 RNA는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 시험관 내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 구매가능한 다양한 시험관 내 전사 키트가 있다.
상기 RNA는 적절한 세포 추출물 및 적절한 DNA 주형을 사용하여 무세포 시스템에서 시험관 내에서 합성될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터가 전사체 생성에 적용된다. 전사 조절을 위한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라아제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 폴리머라아제의 일부 예로는 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라아제가 있다. 시험관 내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 예를 들어 cDNA를 클로닝하고 이를 시험관 내 전사를 위한 적절한 벡터에 도입함으로써 수득될 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터는 전사체를 생성하는 데 사용되는데, 이는 일반적으로 전사 벡터로 표기된다.
일 실시 형태에서, 상기 RNA는 단백질 또는 펩티드를 코딩할 수 있다. 즉, 적절한 환경, 예를 들어 세포, 예컨대 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포 내에 존재하는 경우, RNA는 이것이 코딩하는 단백질 또는 펩티드를 생성하도록 발현될 수 있다.
RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변경될 수 있다. 본 발명 내에서 RNA의 변형은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 지칭한다.
일반적인 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 mRNA는 하기 일반식을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
[5'Cap]w - [5'UTR]x - [관심 유전자] - [3'UTR]y - [폴리A]z
여기서, [5'UTR] 및 [3'UTR]은 비번역 영역(UTR)이고,
[5'UTR]은 Kozak 서열을 포함하고,
[관심 유전자]는 관심 단백질을 코딩하는 임의의 유전자이고,
[5'Cap]은 5'→5' 연결을 통해 mRNA에 연결된 메틸 구아닌 뉴클레오티드를 포함하고,
[폴리A]는 폴리(A) 테일이고,
w, x, y 및 z는 동일하거나 상이하고 0 또는 1이다.
일 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 mRNA는 하기 일반식으로 이루어질 수 있다:
[5'Cap] - [5'UTR] - [관심 유전자] - [3'UTR] - [폴리A]
여기서, [5'UTR] 및 [3'UTR]은 비번역 영역이고,
[5'UTR]은 Kozak 서열을 포함하고,
[관심 유전자]는 관심 단백질을 코딩하는 임의의 핵산이고,
[5'Cap]은 5'→5' 연결을 통해 mRNA에 연결된 메틸 구아닌 뉴클레오티드를 포함하고,
[폴리A]는 폴리(A) 테일이다.
Kozak 서열은, 일반적으로 콘센서스(consensus) 서열(진핵생물 mRNA에서 발생)이고 번역 과정의 개시에 중요한 역할을 하는 서열을 지칭함이 상기된다. Kozak 서열 및 Kozak 콘센서스 서열은 당업계에 잘 알려져 있다.
또한 폴리(A) 테일은 당업계에 잘 알려진 다수의 아데노신 모노포스페이트로 이루어짐이 상기된다. 일반적으로 폴리(A) 테일은 성숙 메신저 RNA의 생산 중에 일반적으로 발생하는 번역 후 변형 중 하나인 폴리아데닐화라고 하는 단계 중에 생성되며; 그러한 폴리(A) 테일은 상기 mRNA의 안정성 및 반감기에 기여하고 가변적 길이의 것일 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 테일은 10개 이상의 A 뉴클레오티드일 수 있는데, 이는 20개 이상의 A 뉴클레오티드를 포함하고, 이는 100개 이상의 A 뉴클레오티드, 예를 들어 약 120개의 A 뉴클레오티드를 포함한다.
[3'UTR]은 어떤 단백질도 발현하지 않는다. [3'UTR]의 목적은 mRNA의 안정성을 증가시키는 것이다. 일 실시 형태에 따르면, a-글로빈 UTR은 불안정성이 없는 것으로 알려져 있기 때문에 선택된다.
유리하게는, 고려되는 숙주 내에서 만족스러운 단백질 생산을 얻기 위해 관심 유전자에 상응하는 서열을 코돈-최적화할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 RNA 분자는 가변적 길이의 것일 수 있다. 따라서, 상기 RNA 분자는 짧은 RNA 분자, 예를 들어 약 100개 뉴클레오티드보다 짧은 RNA 분자, 또는 예를 들어 약 100개 뉴클레오티드보다 길거나 심지어 약 300개 뉴클레오티드보다 긴 RNA 분자일 수 있다.
mRNA와 같은 RNA는 합성 또는 인공 RNA 분자뿐만 아니라 자연 발생 RNA 분자도 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, mRNA와 같은 RNA 분자는 하기 종을 포함할 수 있다:
(i) 캡핑된 비변형 RNA 분자;
(ii) 캡핑된 변형 RNA 분자;
(iii) 비캡핑 비변형 RNA 분자;
(iv) 비캡핑 변형 RNA 분자.
캡핑 및 비캡핑 RNA 분자
가장 일반적인 실시 형태에 따르면, "캡핑된 RNA 분자"는 5' 말단이 구아노신 또는 변형된 구아노신, 예를 들어 7-메틸구아노신(m7G)(5'→5' 트리포스페이트 연결에 연결됨) 또는 유사체에 연결된 RNA 분자를 지칭한다. 이 정의는 5'캡, 예를 들어 자연 발생 및/또는 생리학적 캡의 가장 널리 받아들여지는 정의와 일치한다.
본 발명의 의미에서, "캡 유사체"는 7-메틸구아노신(m7G)(5'→5' 트리포스페이트 연결에 연결)과 생물학적으로 동등하고 따라서 진핵 숙주에서 상응하는 메신저 RNA의 단백질 발현을 손상시키지 않고서 치환이 또한 될 수 있는 캡을 포함한다.
캡의 예로는 m7GpppN, m7GpppG, m7GppspG, m7GppspspG, m7GppspspG, m7Gppppm7G, m2 7’,3’-OGpppG, m2 7’,2’-OGpppG, m2 7’,2’-OGppspsG, 또는 m2 7’,2’-OGpppspsG를 들 수 있다.
합성 캡 및/또는 캡 유사체의 예는 다음으로 이루어진 목록에서 선택될 수 있다: 글리세릴, 역전 데옥시 비염기성 잔기(모이어티), 4',5' 메틸렌 뉴클레오티드, 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보시클릭 뉴클레오티드, 1,5-언히드로헥시톨 뉴클레오티드, L-뉴클레오티드, 알파-뉴클레오티드, 변형 염기 뉴클레오티드, 트레오-펜토푸라노스 l 뉴클레오티드, 비환형 3',4'-세코 뉴클레오티드, 비환형 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드, 비환형 3,5 디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역전 뉴클레오티드 모이어티, 3'-3'-역전 비염기성 모이어티, 3'-2'-역전 뉴클레오티드 모이어티, 3'-2'-역전 비염기성 모이어티, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포르아미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 3'포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 모이어티.
합성 캡 또는 캡 유사체의 다른 예는 ARCA 캡 유사체, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신 및 2 -아지도-구아노신을 포함한다.
중요한 것은 합성 캡 중에서 위에 언급된 캡 중 일부는 유사체로서 적합하지만 반대로 단백질 발현을 방해할 수 있는 다른 캡은 적합하지 않다. 그러한 구별은 당업자에 의해 이해된다.
참고로, 그리고 비제한적 방식으로, ARCA(Anti Reverse Cap Analog) 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Cap 유사체의 구조는 이하에 제시되어 있다:
Figure pct00061
예를 들어, ARCA 캡 유사체는 시험관 내 전사 중에 사용되는 캡 유사체의 예이며, 이것은 3'OH 기(m7G에 더 가까움)가 -OCH3으로 대체된 변형된 캡이다. 그러나 5' 말단에서 ARCA로 합성된 전사체 100%는 번역가능하여 번역에 대한 강한 자극 효과로 이어진다.
RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형의 시험관 내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공동 전사에 혼입되거나, 또는 상기 RNA는 예를 들어 시험관 내 전사에 의해 생성될 수 있고, 5'-캡은 캡핑 효소, 예를 들어 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 상기 RNA에 전사 후 부착될 수 있다.
"비캡핑 RNA 분자"는 "캡핑된 RNA 분자"의 정의에 속하지 않는 임의의 RNA 분자를 지칭한다.
따라서, 일반적인 실시 형태에 따르면, "비캡핑 mRNA"는 5' 말단이 7-메틸구아노신(5'→5' 트리포스페이트 연결을 통해), 또는 이전에 정의된 바와 같은 유사체에 연결된 것이 아닌 mRNA를 지칭할 수 있다.
비캡핑 RNA 분자, 예컨대 메신저 RNA는 (5')ρρρ(5'), (5')ρρ(5'), (5')ρ(5') 또는 (5')OH 말단을 갖는 비캡핑 RNA 분자일 수 있다. 이러한 RNA 분자는 각각 5'ρρρRNA; 5'ρρRNA; 5'ρRNA; 5'OHRNA로 약칭될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 비캡핑 RNA 분자는 메신저 5'ρρρRNA이다.
따라서, RNA 분자가 단일 가닥 RNA 분자인 경우, 이것은 각각 5'pppssRNA; 5'ppssRNA; 5'pssRNA; 5'OHssRNA로 약칭될 수 있다.
따라서, RNA 분자가 이중 가닥 RNA 분자인 경우, 각각 5'pppdsRNA; 5'ppdsRNA; 5'pdsRNA; 5'OHdsRNA로 약칭될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 비캡핑 mRNA는 비캡핑 단일 가닥 mRNA이다.
일 실시 형태에 따르면, 비캡핑 단일 가닥 mRNA는 비캡핑 메신저 5'pppssRNA일 수 있다.
비제한적 방식으로, 상기 비캡핑 RNA 분자의 제1 염기는 아데노신, 구아노신, 시토신 또는 우리딘일 수 있다.
따라서, 비캡핑 RNA 분자는 (5')ppp(5'), (5')pp(5'), (5')p(5') 또는 심지어 블런트-말단 5' 구아노신 말단을 갖는 비캡핑 RNA 분자일 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, RNA는 비캡핑 5'-트리포스페이트를 갖지 않을 수 있다. 이러한 비캡핑 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타아제로 처리함으로써 달성될 수 있다.
변형 및 비변형 RNA 분자
RNA는 추가 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용된 RNA의 추가 변형은 자연 발생 폴리(A) 테일의 연장 또는 절단 또는 5'- 또는 3'-비번역 영역(UTR)의 변경, 예컨대 상기 RNA의 코딩 영역과 관련되지 않은 UTR의 도입, 예를 들어 기존 3'-UTR을 글로빈 유전자, 예컨대 알파 2-글로빈, 알파 1-글로빈, 베타-글로빈, 예를 들어 베타-글로빈, 및 예를 들어 인간 베타-글로빈으로부터 유래된 3'-UTR의 적어도 하나의, 예를 들어 2개의 카피와 교환하는 것, 또는 글로빈 유전자, 예컨대 알파 2-글로빈, 알파 1-글로빈, 베타-글로빈, 예를 들어 베타-글로빈, 및 예를 들어 인간 베타-글로빈으로부터 유래된 3'-UTR의 적어도 하나의, 예를 들어 2개의 카피의 삽입일 수 있다.
본 개시내용 내에서, "변형된 RNA 분자"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기, 예컨대 변형된 퓨린 또는 변형된 피리미딘을 함유하는 RNA 분자를 지칭한다. 변형된 뉴클레오시드 또는 염기는 A, U, C 또는 G(각각 뉴클레오시드의 경우 아데노신, 우리딘, 시티딘 또는 구아노신; 및 당 모이어티만을 언급하는 경우 아데닌, 우라실, 시토신 또는 구아닌)가 아닌 임의의 뉴클레오시드 또는 염기일 수 있다.
따라서, "비변형 RNA 분자"는 변형된 RNA 분자의 정의에 상응하지 않는 임의의 RNA 분자를 지칭한다.
본 개시내용의 의미에서, 용어 "변형된 및 비변형된"은 "캡핑된 및 비캡핑된"이라는 용어와 구별되는 것으로 간주되며, 이는 후자가 구체적으로 본 개시내용의 의미에서 RNA 분자의 5'-말단에 있는 염기와 관련되기 때문이다.
일 실시 형태에서, 핵산, 예를 들어 RNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 존재는 핵산의 안정성을 증가시키고/시키거나 세포독성을 감소시킬 수 있다.
RNA의 안정성이라는 용어는 RNA의 반감기, 즉 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 기간에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA 발현 지속기간에 영향을 미칠 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장기간 발현될 것으로 예상할 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, "변형된 RNA 분자"는 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 염기 또는 당 변형, 및 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 염기 변형을 함유하는 RNA 분자, 예컨대 mRNA를 지칭한다.
예를 들어, 일 실시 형태에서, 본 발명에 적합한 RNA에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 예를 들어 완전히 시티딘을 치환할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 일 실시 형태에서, 이것은 부분적으로 또는 완전히, 예를 들어 완전히 우리딘을 치환할 수 있다.
비제한적 방식으로, 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및 염기의 예는 WO 2015/024667A1에 개시되어 있다.
따라서, 변형된 RNA 분자는 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함하는 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기를 포함할 수 있다.
본 발명과 관련된 백본 변형은 본원에 정의된 바와 같은 RNA 분자에 함유된 뉴클레오티드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형을 포함한다.
본 발명과 관련된 당 변형은 본원에 정의된 바와 같은 RNA 분자의 뉴클레오티드의 당의 화학적 변형을 포함한다.
본 발명과 관련된 염기 변형은 RNA의 뉴클레오티드의 염기 모이어티의 화학적 변형을 포함한다. 이와 관련하여 뉴클레오티드 유사체 또는 변형은 예를 들어 진핵 세포에서 RNA 분자의 전사 및/또는 번역에 적합한 뉴클레오티드 유사체로부터 선택된다.
당 변형은 2' 히드록시(OH) 기의 대체 또는 변형으로 이루어질 수 있으며, 이는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체로 변형 또는 대체될 수 있다.
"옥시" -2' 히드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(-OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; 2' 히드록실이 예를 들어 메틸렌 가교체에 의해 동일 리보스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠긴" 핵산(LNA); 및 아미노 기(-O-아미노, 여기서 아미노 기, 예를 들어 NRR은 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노일 수 있음) 또는 아미노알콕시를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"데옥시" 변형은 수소, 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노 또는 아미노산)를 포함하거나; 또는 아미노 기는 링커를 통해 당에 부착될 수 있으며, 여기서, 링커는 원자 C, N 및 O 중 적어도 하나를 포함한다.
당 기는 또한 리보스의 상응하는 탄소와 반대되는 입체화학적 배열을 갖는 적어도 하나의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서 변형된 RNA는 예를 들어 아라비노스를 당으로 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
포스페이트 백본은 본원에 기술된 바와 같이 추가로 변형되어 변형 RNA 분자에 혼입될 수 있다. 백본의 포스페이트 기는 적어도 하나의 산소 원자를 다른 치환체로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 비변형 포스페이트 모이어티를 본원에 기술된 변형된 포스페이트로 완전히 대체하는 것을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 포스포로디티오에이트는 둘 모두의 비-연결 산소가 황으로 대체된 것을 갖는다. 또한 포스페이트 링커는 연결 산소를 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌-포스포네이트)로 대체하여 변형될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은, 변형된 RNA 분자에 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 핵염기 모이어티에서 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 주요 그루브 표면(groove face)에서 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 주요한 그루브의 화학적 변형은 아미노 기, 티올 기, 알킬 기 또는 할로 기를 포함할 수 있다.
예를 들어, 뉴클레오티드 유사체/변형은 다음으로 이루어진 목록에서 선택되는 염기 변형으로부터 선택된다: 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보시드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로티미딘-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸 이노신-5'-트리포스페이트 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보시드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸-리보시드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 및 잔토신-5'-트리포스페이트.
일부 실시 형태에서, 변형된 뉴클레오시드는 다음으로 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있다: 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-히드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, l-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘.
일부 실시 형태에서, 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1 -메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-l-메틸-슈도이소시티딘을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 변형된 뉴클레오시드는 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2, 6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2, 6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 변형된 뉴클레오시드는 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드는 주요 그루브 표면에서 변형될 수 있고 우라실의 C-5 상의 수소를 메틸 기 또는 할로 기로 대체한 것을 포함할 수 있다.
변형된 염기 및/또는 변형된 RNA 분자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Warren et al. ("Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA"; Cell Stem Cell; 2010)]에 추가로 교시되어 있다.
상기의 관점에서, 변형된 염기는 변형된 퓨린 염기 또는 변형된 피리미딘 염기일 수 있다.
비제한적 방식으로, 변형된 퓨린 염기의 예는 변형된 아데노신 및/또는 변형된 구아노신, 예컨대 하이포잔틴; 잔틴; 7-메틸구아닌; 이노신; 잔토신 및 7-메틸구아노신을 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 변형된 RNA 분자 또는 mRNA는 우리딘, 시티딘, 아데노신 및/또는 리보티미딘에 상응하는 각각의 뉴클레오시드가 변형된 RNA에 상응한다.
비제한적 방식으로, 변형된 피리미딘 염기의 예는 변형된 시티딘 및/또는 변형된 우리딘, 예컨대 5,6-디히드로우라실; 슈도우리딘; 5-메틸시티딘; 5-히드록시메틸시티딘; 디히드로우리딘 및 5-메틸시티딘을 포함한다.
비제한적 방식으로, 본원에 개시된 바와 같은 변형된 염기는 슈도우리딘 및 5-메틸시티딘과 같은 변형된 우리딘 또는 시티딘일 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 변형된 RNA는 U(우라실의 경우), C(시토신의 경우), A(아데닌의 경우) 및/또는 T(티민의 경우)에 상응하는 적어도 하나의 염기가 변형된 RNA에 상응한다.
변형된 염기의 예로는 메틸-5 우리딘(m5U), 2-티오-우리딘(s2U), 2'-O-메틸-5 우리딘(Ome5U), 슈도우리딘(ψ), 메틸-1 슈도우리딘(m1ψ), 메틸-5 시토신(m5C), 2'O-메틸-5 시토신(Om5C), N6-메틸-아데노신(m6A) 및 N1-메틸-아데노신(m6A)을 들 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 변형된 mRNA는 변형된 염기로서 2'-O-메틸-5 우리딘(Ome5U) 또는 메틸-1 슈도우리딘(m1ψ)을 포함할 수 있다.
캡핑된 mRNA 및 비캡핑된 mRNA는 또한, 변형된 것이든지 비변형된 것이든지 간에 상업적으로 획득될 수 있다.
비차단 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 차단 폴리-A 서열을 갖는 RNA보다 더 효율적으로 번역된다.
용어 "폴리(A) 테일" 또는 "폴리-A 서열"은, 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐(A) 잔기의 서열에 관한 것이며, "비차단 폴리-A 서열"은 RNA 분자의 3' 말단에 있는 폴리-A 서열이 폴리-A 서열의 A로 끝나고 폴리-A 서열의 3' 말단, 즉 하류에 위치한 A 이외의 뉴클레오티드가 뒤따르지 않음을 의미한다. 또한, 약 120개 염기쌍의 긴 폴리-A 서열은 최적의 전사체 안정성 및 RNA 번역 효율을 초래한다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위해, 이것은 예를 들어 길이가 10 내지 500개, 예를 들어 30 내지 300개, 심지어 예를 들어 65 내지 200개 및 예를 들어 100 내지 150개의 아데노신 잔기인 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 일 실시 형태에서 폴리-A 서열은 대략 120개의 아데노신 잔기의 길이를 갖는다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 안정성 및/또는 발현을 추가로 증가시키기 위해, 폴리-A 서열은 비차단될 수 있다.
또한, RNA 분자의 3'-비번역 영역에 3'-비번역 영역(UTR)을 포함시키면 번역 효율을 높일 수 있다. 시너지 효과는 이러한 3'-비번역 영역 중 2개 이상을 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 3'-비번역 영역은 이들이 도입되는 RNA에 대해 자가 또는 이종 영역일 수 있다. 일 실시 형태에서 3'-비번역 영역은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유래된다.
상기 기술된 변형들의 조합, 즉 폴리-A 서열의 혼입, 폴리-A 서열의 비차단 및 적어도 하나의 3'-비번역 영역의 혼입은 RNA의 안정성 및 번역 효율 증가에 상승적 영향을 미친다.
본 발명에 따라 사용되는 RNA의 발현을 증가시키기 위해, 이것은, GC 함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하여 세포에서 번역을 향상시키도록, 예를 들어 발현 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않고서 코딩 영역, 즉 발현 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 서열 내에서 변형될 수 있다.
비캡핑 RNA 분자는 변형된 RNA 분자 또는 비변형된 RNA 분자일 수 있음이 이해된다.
따라서, 캡핑된 RNA 분자는 변형된 RNA 분자 또는 비변형된 RNA 분자일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 RNA 분자는 메신저 RNA(mRNA)이다.
본원에 개시된 바와 같은 RNA 분자는 예를 들어 변형된 형태 또는 비변형된 형태의 비캡핑 메신저 RNA이다.
본원에 개시된 바와 같은 RNA 분자는 예를 들어 변형된 형태 또는 비변형된 형태의 캡핑된 메신저 RNA이다.
비제한적 방식으로, 비캡핑 RNA 분자, 예컨대 메신저 RNA는 또한 자연 발생 염기만을 갖는 비캡핑 RNA 분자일 수 있다.
본 발명에 따르면, "자연 발생 염기"는 숙주에 의해 생체 내에서 RNA 분자, 예컨대 메신저 RNA에 자연적으로 혼입될 수 있는 염기에 관한 것이다. 따라서, "자연 발생 염기"는 합성 염기와 구별되는데, 상기 합성 염기에 대해서는 상기 숙주 내에서 천연 등가물이 없을 것이다. 그러나, "자연 발생 염기"는 변형된 염기일 수도 있고 아닐 수도 있는데, 그 이유는 상기 두 용어가 본 발명의 의미에서 혼동되지 않아야 하기 때문이다.
비캡핑 메신저 RNA는 또한 비캡핑되고 변형된 메신저 RNA일 수 있으며, 따라서 적어도 하나의 변형된 염기를 포함한다.
따라서, 비캡핑 메신저 RNA는 또한 (5')ppp(5') 구아노신 말단을 갖고 적어도 하나의 변형된 염기를 함유하는 비캡핑되고 변형된 메신저 RNA일 수 있다.
비캡핑 메신저 RNA는 또한 (5')ppp(5') 구아노신 말단을 갖고 적어도 하나의 슈도-우리딘 및 적어도 하나의 5-메틸시토신을 함유하는 비캡핑되고 변형된 메신저 RNA일 수 있다.
캡핑된 메신저 RNA는, 5'→5' 트리포스페이트 연결에 연결되고 자연 발생 염기 또는 변형된 염기, 예를 들어 슈도-우린 또는 5-메틸 시토신을 함유하는, 7-메틸구아노신 또는 유사체에 5' 말단이 연결된 메신저 RNA일 수 있다.
변형 RNA 분자 및 비변형 RNA 분자 둘 다가 본 발명의 일 실시 형태 내에서 사용될 때, 이들은 혼합물로서 및/또는 정제된 형태로 사용될 수 있음이 또한 이해된다.
항원
일 실시 형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 예컨대 지질 나노입자는 핵산 면역원성 조성물 또는 핵산 백신(적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 구축물(이는 적어도 하나의 야생형 또는 조작 항원을 코딩함)을 포함함)일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항원-함유 조성물은 그의 결합가가 다양할 수 있다. 결합가는 조성물 또는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드) 또는 폴리펩티드 내의 항원성 구성요소의 수를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 1가이다. 이것은 또한 2가, 3가 또는 다가 조성물과 같은 1가 초과의 결합가를 포함하는 조성물일 수 있다. 다가 면역원성 조성물 또는 백신은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12,13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 항원 또는 항원성 모이어티(예를 들어, 항원성 펩티드 등)를 포함할 수 있다. 항원성 구성요소는 단일 폴리뉴클레오티드 상에 또는 별개의 폴리뉴클레오티드들 상에 있을 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 및 기생충과 같은 감염원과의 접촉으로부터 발생하는 감염을 보호, 치료 또는 치유하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 암 질환을 보호, 치료 또는 치유하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시 형태에 따르면, 핵산은 박테리아 항원, 원생동물 항원, 바이러스 항원, 진균 항원, 기생충 항원 또는 종양 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 항원을 코딩할 수 있다.
박테리아 항원
본원에 기술된 박테리아는 그람-양성 박테리아 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다. 박테리아 항원은 다음으로부터 수득될 수 있다: 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 서틸리스(Bacillus subtilis), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 코아귤라아제 음성 스타필로코커스(coagulase Negative Staphylococcus), 코리네박테륨 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 장독소생성 에스케리이아 콜라이(ETEC), 장병원성 이. 콜라이, 이 콜라이 0157:H7, 엔테로박터(Enterobacter) sp., 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarralis), 마이코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티데스(Neisseria meningitides), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스(Proteus) sps., 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케차 리케치이(Rickettsia rickettsii), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcesens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis).
바이러스 항원
바이러스 항원은 다음으로부터 수득될 수 있다: 아데노바이러스; 헤르페스 심플렉스, 1형; 헤르페스 심플렉스, 2형; 뇌염 바이러스, 유두종 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스; 엡스타인-바 바이러스; 인간 사이토메갈로바이러스; 인간 헤르페스바이러스, 8형; 인유두종 바이러스; BK 바이러스; JC 바이러스; 스몰폭스; 폴리오 바이러스, B형 간염 바이러스; 인간 보카바이러스; 파보바이러스 B19; 인간 아스트로바이러스; 노워크 바이러스; 콕사키바이러스; A형 간염 바이러스; 폴리오바이러스; 리노바이러스; 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스; C형 간염 바이러스; 황열병 바이러스; 뎅기 바이러스; 웨스트 나일 바이러스; 루벨라 바이러스; E형 간염 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(HIV); 인플루엔자 바이러스, A형 또는 B형; 과나리토 바이러스; 주닌 바이러스; 라사 바이러스; 마추포 바이러스; 사비아 바이러스; 크리미안-콩고 출혈열 바이러스; 에볼라 바이러스; 마버그 바이러스; 홍역 바이러스; 볼거리 바이러스; 파라인플루엔자 바이러스; 호흡기 세포융합 바이러스; 인간 메타뉴모바이러스; 헨드라 바이러스; 니파 바이러스; 광견병 바이러스; D형 간염; 로타바이러스; 오르비바이러스; 콜티바이러스; 한타바이러스, 중동 호흡기 코로나바이러스; SARS-Cov-2 바이러스; 치쿤구니야 바이러스 ; 지카 바이러스 ; 파라인플루엔자 바이러스; 인간 엔테로바이러스; 한타 바이러스; 일본 뇌염 바이러스; 수포성 발진증 바이러스(Vesicular exanthernavirus); 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitisor); 또는 반나 바이러스.
일 실시 형태에서, 항원은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스 주 또는 이들의 조합으로부터 유래된다. 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 주는 새, 돼지, 말, 개, 인간 또는 비-인간 영장류와 관련될 수 있다.
핵산은 헤마글루티닌 단백질 또는 이의 단편을 코딩할 수 있다. 헤마글루티닌 단백질은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18 또는 이의 단편일 수 있다. 헤마글루티닌 단백질은 헤드 도메인(HA1)을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로, 헤마글루티닌 단백질은 세포질 도메인을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
예를 들어, 실시 형태들에서, 헤마글루티닌 단백질은 절단형 헤마글루티닌 단백질이다. 절단형 헤마글루티닌 단백질은 막관통 도메인의 일부를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 바이러스는 H1N1, H3N2, H7N9, H5N1 및 H10N8 바이러스 또는 B 주 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 항원은 코로나바이러스, 예컨대 SARS-Cov-1 바이러스, SARS-Cov-2 바이러스 또는 MERS-Cov 바이러스로부터 유래된다.
진균 항원
진균 항원은 다음으로부터 수득될 수 있다: 자낭균류(Ascomycota)(예를 들어, 푸사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 뉴모시스티스 지로벡시이(Pneumocystis jirovecii), 아스페르길루스(Aspergillus) spp., 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis)/포사다시이(posadasii), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 담자균류(Basidiomycota) (예를 들어, 필로바시디엘라 네오포르만스(Filobasidiella neoformans), 트리코스포론(Trichosporon)), 미포자충(Microsporidia)(예를 들어, 엔세팔리토준 쿠니쿨리(Encephalitozoon cuniculi), 엔테로사이토준 비에네우시(Enterocytozoon bieneusi), 및 뮤코로마이코티나(Mucoromycotina)(예를 들어, 뮤코르 시르시넬로이데스(Mucor circinelloides), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 리히테미아 코림비페라(Lichtheimia corymbifera)).
원생동물 항원
원생동물 항원은 다음으로부터 수득될 수 있다: 엔타모에바 히스토라이티카(Entamoeba histolytica), 기아르디아 람빌라(Giardia lambila), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 티. 크루지(T. cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 발란티듐 콜라이(Balantidium coli), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 플라스모듐(Plasmodium) spp., 및 바베시아 미크로티(Babesia microti).
기생충 항원
기생충 항원은 다음으로부터 수득될 수 있다: 아칸타모에바(Acanthamoeba), 아니사키스(Anisakis), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 말파리(botfly), 발란티듐 콜라이(Balantidium coli), 빈대(bedbug), 세스토다(Cestoda), 치게르스(chiggers), 코클리오마이이아 호미니보락스(Cochliomyia hominivorax), 엔타모에바 히스토라이티카(Entamoeba histolytica), 파시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 기아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 구충(hookworm), 리슈마니아(Leishmania), 린구아툴라 세라타(Linguatula serrata), 간흡충, 로아사상충(Loa loa), 폐흡충속(Paragonimus), 요충, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 주혈흡충(Schistosoma), 스트론길로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis), 진드기, 촌충, 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트리파노소마(Trypanosoma), 편충, 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti).
종양 항원
일 실시 형태에서, 항원은 종양 항원, 즉 암세포에서 발현되는 단백질 또는 펩티드와 같은 암세포의 구성요소일 수 있다. 용어 "종양 항원"은 예를 들어 정상적인 조건 하에서 제한된 수의 조직 및/또는 기관에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되고 적어도 하나의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현되는 단백질에 관한 것이다. 종양 항원은 예를 들어 분화 항원, 예를 들어 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉 정상적인 조건 하에서 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 단백질 및 생식세포 계열 특이적 항원을 포함한다. 예를 들어, 종양 항원은 이것이 발현되는 암세포에 의해 제시된다.
예를 들어, 종양 항원은 암배아 항원, 1-태아단백질, 이소페리틴, 태아 술포당단백질, cc2-H-철단백질 및 γ-태아단백질을 포함한다.
본 발명에 유용할 수 있는 종양 항원의 다른 예로는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1 , CASP-8, CDC27/m, CD 4/m, CEA, 클라우딘 패밀의 세포 표면 단백질, 예컨대 CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1 , G250, GAGE, GnT-V, Gapl OO, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT(또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE- A, 예를 들어 MAGE-A1 , MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE- A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A1 1, 또는 MAGE- A12, MAGE-B, MAGE-C, MART- 1 /Melan-A, MC1 R, Myosin/m, MUC1 , MUM-1 , -2, -3, NA88-A, NF1 , NY-ESO-1 , NY-BR-1 , pl 90 마이너(minor) BCR-abL, Pm l/RARa, PRAME, 프로테이나아제 3, PSA, PSM, RAGE, RUl 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP 1 , SCP2, SCP3, SSX, SURVrVIN, TEL/AMLl , TPI/m, TRP-1 , TRP-2, TRP-2/1NT2, TPTE 및 WT, 예를 들어 WT-1이 있다.
아쥬반트
본원에 개시된 바와 같은 핵산 함유 조성물 또는 지질 나노입자는 아쥬반트 또는 면역 증강제를 추가로 포함할 수 있거나 이와 함께 공동 투여될 수 있다.
본 발명에 유용한 아쥬반트는 천연 또는 합성 아쥬반트를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이는 유기물이거나 무기물일 수 있다.
아쥬반트는 다음의 임의의 부류로부터 선택될 수 있다: (1) 미네랄 염, 예를 들어 수산화알루미늄 및 인산알루미늄 또는 인산칼슘 겔; (2) 다음을 포함하는 에멀젼: 오일 에멀젼 및 계면활성제 기반 제형, 예를 들어 미세유동화 세제 안정화 수중유 에멀젼, 정제된 사포닌, 수중유 에멀젼, 안정화 유중수 에멀젼; (3) 미립자형 아쥬반트, 예를 들어 바이로솜(인플루엔자 헤마글루티닌을 포함하는 단층 리포좀 비히클), 사포닌 및 지질의 구조화된 복합체, 폴리락티드 코-글리콜라이드(PLG); (4) 미생물 유도체; (5) 내인성 인간 면역조절제; 및/또는 (6) 금 입자와 같은 불활성 비히클; (7) 미생물 유래 아쥬반트; (8) 장력작용성(tensioactive) 화합물; (9) 탄수화물; 또는 이들의 조합.
적절한 아쥬반트 및 적절한 아쥬반트 양의 선택은 당업자에게 자명할 것이다.
특정 아쥬반트는 제한 없이, 양이온성 리포좀-DNA 복합체 JVRS-100, 수산화알루미늄 백신 아쥬반트, 인산알루미늄 백신 아쥬반트, 황산칼륨알루미늄 아쥬반트, 알히드로겔, ISCOM(s)™, 프로인트 완전 아쥬반트(Freund's Complete Adjuvant), 프로인트 불완전 아쥬반트, CpG DNA 백신 아쥬반트, 콜레라 독소, 콜레라 독소 B 서브유닛, 리포좀, 사포닌 백신 아쥬반트, DDA 아쥬반트, 스쿠알렌 기반 아쥬반트, Etx B 서브유닛 아쥬반트, IL-12 백신 아쥬반트, LTK63 백신 돌연변이 아쥬반트, TiterMax Gold 아쥬반트, 리비 백신 아쥬반트, Montanide ISA 720 아쥬반트, 코리네박테륨(Corynebacterium)-derb/ed P40 백신 아쥬반트, MPL™ 아쥬반트, AS04, AS02, AS01, 리포폴리사카라이드 백신 아쥬반트, 뮤라밀 디펩티드 아쥬반트, CRL1005, 코리네박테륨 파르붐(Corynebacterium parvum) 사백신 아쥬반트, Montanide ISA 51, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 성분 백신 아쥬반트, 양이온성 리포좀 백신 아쥬반트, 아다만틸아미드 디펩티드 백신 아쥬반트, Arlacel A, VSA-3 아쥬반트, 알루미늄 백신 아쥬반트, Polygen 백신 아쥬반트, Adjumer™, 조류 글루칸(Algal Glucan), Bay R1005, Theramide®, 스테아릴 티로신, 스페콜(Specol), 알감물린(Algammulin), Avridine®, 인산칼슘 겔, CTA1-DD 유전자 융합 단백질, DOC/Alum 복합체, 감마 이눌린, Gerbu 아쥬반트, GM-CSF, GMDP, 재조합 hlFN-감마/인터페론-g, 인터루킨-β, 인터루킨-2, 인터루킨-7, Sclavo 펩티드, Rehydragel LV, Rehydragel HPA, 록소리빈(Loxoribine), MF59, MTP-PE 리포좀, 뮤라메티드(Murametide), 뮤라팔미틴(Murapalmitine), D-뮤라팔미틴, NAGO, 비이온성 계면활성제 소포, PMMA, PAA, Protein Cochleate, QS-21, SPT(항원 제형), 나노에멀젼 백신 아쥬반트, AS03, Quil-A 백신 아쥬반트, RC529 백신 아쥬반트, LTR192G 백신 아쥬반트, 이. 콜라이 열-불안정성 독소, LT, 비정질 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 아쥬반트, 인산칼슘 백신 아쥬반트, Montanide 불완전 Seppic 아쥬반트, 이미퀴모드(Imiquimod), 레스퀴모드(Resiquimod), AF03, 플라젤린(Flagellin), Poly(LC), ISCOMATRIX®, Abisco-100 백신 아쥬반트, 알부민-헤파린 미립자 백신 아쥬반트, AS-2 백신 아쥬반트, B7-2 백신 아쥬반트, DHEA 백신 아쥬반트, 공동자극 분자에 대한 항체를 함유하는 이뮤노리포좀, SAF-1, 센다이 프로테오리포좀(Sendai Proteoliposome), 센다이-함유 지질 매트릭스, 트레오닐 뮤라밀 디펩티드(TMDP), Ty 입자 백신 아쥬반트, 부피바카인(Bupivacaine) 백신 아쥬반트, DL-PGL(폴리에스테르 폴리(DL-락티드-코-글리콜라이드)) 백신 아쥬반트, IL-15 백신 아쥬반트, LTK72 백신 아쥬반트, MPL-SE 백신 아쥬반트, 콜레라 독소 mCT-El 12K의 비독성 돌연변이 El 12K, 및/또는 Matrix-S를 포함할 수 있다.
단백질 발현
본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자(적어도 하나의 핵산을 캡슐화함)는 또한 단백질이 결핍된 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 핵산, 예를 들어 mRNA를 포함하는 지질 나노입자를 투여하는 단계를 포함하는, 단백질이 결핍된 개체를 치료하는 방법에 사용될 수 있으며, 여기서, 핵산은 개체에서 결핍된 단백질에 상응하는 기능성 단백질을 코딩한다. 실시 형태들에서, 표적 세포에 의한 핵산의 발현 후에 기능성 단백질이 생성된다.
본 발명은 또한 기존의 유전적 결함을 교정할 수 있고/있거나 적어도 하나의 표적 세포에 유익한 기능을 제공할 수 있는 핵산의 세포내 전달 방법에 관한 것이다. 표적 조직 및 세포로의 성공적인 전달 후, 본 발명의 조성물 및 핵산은 그 표적 세포를 형질감염시키고, 핵산(예를 들어, mRNA)은 관심 있는 유전자 생성물(예를 들어, 기능성 단백질 또는 효소)로 번역될 수 있거나 그렇지 않으면 관심 있는 유전자 생성물의 존재 또는 발현을 조정 또는 조절할 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 방법은 다수의 질환, 예를 들어 단백질 및/또는 효소 결핍으로 인한 질환의 관리 및 치료에 유용하다. 이러한 질환을 앓고 있는 개체는, 예를 들어 단백질의 비합성, 단백질의 합성 감소, 또는 단백질의 합성 결여 또는 생물학적 활성 감소를 포함한, 단백질 또는 효소의 발현 손상을 초래하는 근본적인 유전적 결함을 가질 수 있다.
대안적으로, 핵산은 전장 길이 항체 또는 더 작은 항체(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 둘 모두)를 코딩하여 대상체에게 면역성을 부여할 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 일시적으로 또는 만성적으로 기능적 반응에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있는 항체를 코딩한다. 예를 들어, 본 발명의 mRNA 핵산은 기능성 단클론 또는 다클론 항체를 코딩할 수 있으며, 이는 번역시(및 적용가능한 경우, 표적 세포로부터의 전신 배출) 생물학적 표적(예를 들어, 종양 괴사 인자와 같은 자극성 사이토카인)을 표적화하고/하거나 불활성화시키는 데 유용할 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 mRNA 핵산은 예를 들어, 막증식성 사구체신염 II형 또는 급성 용혈성 요독 증후군의 치료에 유용한 기능성 항-신염 인자 항체를 코딩할 수 있거나, 또는 대안적으로, 암과 같은 항-혈관 내피 성장 인자(VEGF)-매개 질환의 치료에 유용한 항-혈관 내피 성장 인자(VEGF) 항체를 코딩할 수 있다.
제약 조성물
일부 실시 형태에 따르면, 본 발명은 제약 조성물에 관한 것이다.
투여 목적을 위해, 예를 들어 핵산과 같은 치료제를 이용하여 지질 나노입자로서 제형화되는 본 발명의 지질 화합물은 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 지질 화합물 및 가능하게는 적어도 하나의 제약상 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
일부 실시 형태에 따르면, 본 발명에 적합한 제약 조성물은 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 함유 지질 나노입자, 및 적어도 하나의 제약상 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제약 조성물은 면역원성 조성물일 수 있다. 본 발명에 적합한 면역원성 조성물은 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 함유 지질 나노입자(여기서, 핵산은 적어도 하나의 항원을 코딩함), 및 적어도 하나의 제약상 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 추가로 면역원성 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 아쥬반트를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에 따르면, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, (i) 적어도 하나의 핵산 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 의약은 본원에 나타낸 바와 같은 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에 다르면, 본 발명은 감염성 질환, 알러지, 자가면역 질환, 희귀 혈액 질환, 희귀 대사 질환, 희귀 신경계 질환, 및 종양 또는 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 그리고 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료 방법에 사용하기 위한, (i) 적어도 하나의 핵산 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시 형태에 따르면, (i) 적어도 하나의 핵산 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 함유 지질 나노입자(여기서, 핵산은 적어도 하나의 항원을 코딩함)는 면역원성 조성물로서 사용하기 위한 것일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 면역원성 조성물은 본원에 나타낸 바와 같은 감염성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 이것은 본원에 기술된 바와 같은 항원을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 화학식 I의 지질 화합물은 관심 있는 특정 질환 또는 병태를 치료하기 위한, 지질 나노입자를 형성하고 치료제, 예를 들어 핵산을 전달하기에 효과적인 양으로 제약 조성물 또는 면역원성 조성물에 존재할 수 있다.
적절한 농도 및 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물 및 면역원성 조성물의 투여는 유사한 용도를 제공하기 위한 조성물의 임의의 허용된 투여 방식을 통해 수행될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 분말, 용액, 현탁액 또는 주사제와 같은 고체, 반고체, 액체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 제약 조성물을 투여하는 전형적인 경로는 제한 없이 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 비강내를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 피내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물은 경피, 피하, 피내 또는 근육내 경로에 의해 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 그 안에 함유된 활성 성분이 환자에게 조성물을 투여할 때 생체이용가능하도록 제형화된다.
그러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)]을 참조한다.
조성물은 적어도 하나의 불활성 희석제 또는 담체를 함유할 수 있다.
일 실시 형태에서, 조성물은 액체, 예를 들어 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 주사 투여용 조성물은 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정제 중 적어도 하나를 함유할 수 있으며, 등장화제가 포함될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 액체 조성물은 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 살균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 예를 들어 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로서의 역할을 할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이팅제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조절제; 수크로스 또는 트레할로스와 같은 동결 보호제로 작용하는 제제.
비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다. 주사가능한 제약 조성물은 예를 들어 살균 조성물이다.
본원에 개시된 바와 같은 제약 조성물 및 면역원성 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방법론에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사 투여용 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자를 살균 증류수 또는 다른 담체와 조합하여 용액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 촉진하기 위해 계면활성제를 첨가할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 치료적 유효량으로 투여되며, 이는 사용된 특정 치료제의 활성; 치료제의 대사 안정성 및 작용 시간 길이; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 방식 및 시간; 배출 속도; 약물 조합; 특정 장애 또는 병태의 중증도; 및 치료를 받고 있는 대상체를 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 조성물은 또한 적어도 하나의 다른 치료제의 투여와 동시에, 그 이전에, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 이러한 병용 요법은 본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 적어도 하나의 추가 활성제의 단일한 제약적 투여 제형의 투여와, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 각각의 활성제(그 자체의 별개의 제약적 투여 제형의 형태)의 투여를 포함한다. 별개의 투여 제형이 사용되는 경우, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 및 적어도 하나의 추가 활성제는 본질적으로 동일 시점에, 즉 동시적으로, 또는 별개로 시차를 둔 시점에, 즉 순차적으로 투여될 수 있으며; 병용 요법은 이러한 모든 치료법을 포함하는 것으로 이해된다.
치료 방법
일부 실시 형태에서, 본 발명은 또한 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 유효량의 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 핵산을 함유하는, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 핵산을 함유하는, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 지질 나노입자를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 LNP를 함유하는 조성물은 감염성 질환, 알러지, 자가면역 질환, 희귀 혈액 질환, 희귀 대사 질환, 희귀 신경계 질환, 및 종양 또는 암 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료 방법에 사용하기 위한 것일 수 있다.
예를 들어, 본 발명과 관련될 수 있는 질환은 바이러스 감염성 질환, 박테리아 감염성 질환, 진균 또는 기생충 감염성 질환과 같은 감염성 질환일 수 있다. 또한 본 발명과 관련된 질환은 암 또는 종양 질환일 수 있다.
바이러스 감염성 질환은 급성 열성 인두염, 인두결막열, 유행성 각결막염, 유유자설사증, 콕새키(Coxsackie) 감염, 감염성 단핵구증, 버킷 림프종, 급성 간염, 만성 간염, 간경변증, 간세포암, 일차성 HSV-1 감염(예컨대, 소아에서의 치은구내염, 성인에서의 편도염 및 인두염, 각결막염), 잠복성 HSV-1 감염(예컨대, 헤르페스 구순염 및 구순 포진), 일차성 HSV-2 감염, 잠복성 HSV-2 감염, 무균성 수막염, 감염성 단핵구증, 거대세포봉입체병, 카포시 육종, 다중심 캐슬만 병, 원발성 삼출액 림프종, AIDS, 독감, 라이 증후군, 홍역, 감염후뇌척수염, 볼거리, 과증식성 상피 병변(예컨대, 보통, 편평, 족저 및 성기 사마귀, 후두 유두종, 사마귀양 표피이형성증), 자궁경부암, 편평세포암종, 크루프(croup), 폐렴, 세기관지염, 일반 감기, 소아마비, 광견병, 세기관지염, 폐렴, 독감-유사 증후군, 폐렴을 갖는 중증 세기관지염, 풍진, 선천성 풍진, 수두, 코비드-19, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염, 및 대상포진일 수 있다.
일 실시 형태에서, 질환은 독감, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염, 또는 코비드-19이며, 예를 들어 독감이다.
박테리아 감염성 질환은 농양, 방선균증, 급성 전립선염, 아에로모나스 히드로필라(aeromonas hydrophila), 애뉴얼 라이그래스 독성(annual ryegrass toxicity), 탄저병, 바실루스 자색반병, 균혈증, 세균성 위장염, 세균성 수막염, 세균성 폐렴, 세균성 질염, 세균-관련 피부 병태, 바르토넬라증, BCG-oma, 포도상진균증, 보툴리눔 독소증, 브라질 자반열, 브로디 농양, 브루셀라병, 부룰리 궤양, 캄필로박터증, 카리에스(caries), 카리온 병, 고양이 할큄병, 봉소염, 클라미디아 감염, 콜레라, 만성 세균성 전립선염, 만성 재발성 다소성 골수염, 클로스트리듐 괴사 장염, 조합 치주-근관 병변, 전염성 소 능막폐렴, 디프테리아, 디프테리아성 구내염, 에르리키아증, 단독증, 후두개염, 단독증, 피츠-휴-커티스(Fitz-Hugh-Curtis) 증후군, 벼룩-매개 홍반열(flea-borne spotted fever), 부제병(감염성 지간염), 가래(Garre) 경화성 골수염, 임질, 서혜부 육아종, 인간 과립구 아나플라즈마증, 인간 단핵구성 에르리키아증, 백일해, 농가진, 만기 선천 매독성 안병증, 레지오넬라증, 레미에르 증후군, 나병(한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임병, 림프절염, 유비저, 수막구균성 질환, 수막구균성 패혈증, 메티실린-내성 황색포도상구균(MRS A) 감염, 마이크로박테륨 아비늄-인트라셀룰라(MAI), 마이코플라스마 폐렴, 괴사 근막염, 노카르디아증, 노마(수양암 또는 괴저성 구내염), 제대염, 안와 봉소직염, 골수염, 전격성 비장적출술 후 감염(OPSI), 양 브루셀라병, 파스퇴렐라증, 안와 봉소염, 백일해(pertussis(whooping cough)), 페스트, 폐렴구균성 폐렴, 포트 병, 직장염, 슈도모나스 감염, 앵무병, 농혈증, 화농근육염, Q 열, 재귀열(회귀열), 류마티스 열, 로키산 홍반열(RMSF), 리케차병, 살모넬라증, 성홍열, 패혈증, 셀라티아 감염, 시겔라증, 남부 진드기-관련 발진 병, 포도알균성 화상피부 증후군, 포도알균성 인두염, 수영장 육아종, 돼지 브루셀라병, 매독, 매독성 대동맥염, 파상풍, 독성 쇼크 증후군(TSS), 트라코마, 참호열, 열대궤양, 결핵, 야토병, 장티푸스, 발진 티푸스, 비뇨생식기 결핵, 요로 감염, 반코마이신-내성 황색포도상구균 감염, 워터하우스-프리데릭센 증후군, 가성결핵(예르시니아) 병, 및 예르시니아증과 같은 것일 수 있다.
기생충 감염성 질환은 아메바증, 편모충증, 트리코모나스증, 아프리카 수면병, 아메리카 수면병, 리슈만편모충증(Kala-Azar), 바란티디움증, 톡소플라스마증, 말라리아, 가시아메바 각막염, 및 바베시아증일 수 있다.
진균 감염성 질환은 아스페르길루스증, 분아균증, 칸디다증, 콕시디오이데스 진균증, 호모균증, 히스토플라스마증, 진균종, 파라콕시디오이드진균증, 및 족부 백선일 수 있다. 추가로, 면역 결핍이 있는 사람은 예를 들어 아스페르길루스, 칸디다, 크립토코쿠스, 히스토플라스마, 및 뉴모시스티스와 같은 진균 속에 의한 질환에 걸리기 쉽다. 다른 진균, 소위 피부사상균 및 각질친화진균은 눈, 손발톱, 모발, 및 특히 피부를 공격할 수 있으며, 다양한 병태를 유발할 수 있으며, 그 중에는 무좀과 같은 백선이 흔하다. 진균 포자는 또한 알러지의 주요 원인이며, 다양한 분류학적 그룹으로부터의 광범위한 진균이 일부 사람들에게 알러지 반응을 일으킬 수 있다.
암 또는 종양 질환은, 예를 들어, 흑색종, 악성 흑색종, 결장 암종, 림프종, 육종, 모세포종, 신장 암종, 위장관 종양, 신경아교종, 전립선 종양, 방광암, 직장 종양, 위암, 식도암, 췌장암, 간암, 유암종(= 유방암), 자궁암, 자궁경부암, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 간종양, 다양한 바이러스-유발 종양, 예를 들어, 유두종 바이러스-유발 암종(예컨대 자궁경부암종 = 자궁경부암), 선암종, 헤르페스 바이러스-유발 종양(예컨대 버킷 림프종, EBV-유발 B-세포 림프종), B형 간염-유발 종양(간세포 암종), HTLV-1- 및 HTLV-2-유발 림프종, 청신경종, 폐 암종(= 폐암 = 기관지 암종), 소세포 폐 암종, 인두 암 및 암종, 교모세포종, 직장 암종, 성상세포종, 뇌암, 망막모세포종, 기저세포종, 뇌 전이, 수모세포종, 질암, 췌장암, 고환암, 호지킨 증후군, 수막종, 슈니버거(Schneeberger) 병, 뇌하수체 종양, 균상식육종, 카르시노이드, 신경초종, 척수종(spinalioma), 버킷 림프종, 후두암, 직장암, 흉선종, 자궁체부 암종, 골암, 비-호지킨 림프종, 요도암, CUP 증후군, 두경부 암종, 핍지교종, 외음부암, 장암, 결장 암종, 식도 암종(= 식도암), 사마귀 관련, 소장의 종양, 두개인두종, 난소 암종, 생식기 종양, 난소암(= 난소 암종), 췌장 암종(= 췌장암), 자궁내막암종, 간 전이, 음경암, 설암, 담낭암, 백혈병, 형질세포종, 안검 종양, 전립선암(= 전립선 종양)로부터 선택되는 암 또는 종양 질환일 수 있다.
본 발명이 치료적 개입으로서 유용할 수 있는 질환에는 SMN1-관련 척수성 근위축(SMA); 근위축성 축삭경화증(ALS); GALT-관련 갈락토스혈증; 낭포성 섬유증(CF); 시스틴뇨증을 포함하는 SLC3A1-관련 장애; 알포트 증후군을 포함하는 COL4A5-관련 장애; 갈락토세레브로시다제 결핍; X-연관 부신백질형성장애 및 부신척수신경병; 프리드리히 실조증; 펠리체우스-메르츠바허 병; TSC1 및 TSC2-관련 결절성 경화증; 산필리포 B 증후군(MPS IIIB); CTNS-관련 시스틴증; 취약 X 증후군, 취약 X-관련 진전/실조 증후군 및 취약 X 조기 난소 부전을 포함하는 FMR1-관련 장애; 프래더-윌리 증후군; 유전성 출혈성 모세혈관확장증(AT); 니만-피크 병 타입 C1; 연소성 신경원성세로이드 리포푸신증(JNCL), 연소성 바텐 병, 산타부로리-할티아(Santavuori-Haltia) 병, 얀스키-비엘쇼스키 병, 및 PTT-1 및 TPP1 결핍을 포함하는 신경원성세로이드 리포푸신증-관련 질환; 중추신경계 저수초화/소실성 백질을 갖는 EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 및 EIF2B5-관련 유아기 실조증; CACNA1A 및 CACNB4-관련 발작적 실조증 타입 2; 고전적 레트 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증 및 PPM-X 증후군을 포함하는 MECP2-관련 장애; CDKL5-관련 비전형적 레트 증후군; 케네디 병(SBMA); Notch-3 관련 피질하 경색과 백질뇌증을 동반하는 상염색체 우성 뇌동맥질환(CADASIL); SCN1A 및 SCN1B-관련 경련 장애; 알퍼스-허튼로처(Alpers-Huttenlocher) 증후군, POLG-관련 감각 실조 신경병증, 구음장애, 및 안구운동마비, 및 미토콘드리아 DNA 결손을 갖는 상염색체 우성 및 열성 진행성 외부 안구운동마비를 포함하는 폴리머라제 G-관련 장애; X-연관 부신 저형성증; X-연관 무감마글로불린혈증; 파브리 병; 및 윌슨 병과 같은 질환이 포함된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 핵산, 및 예를 들어 mRNA는 기능성 단백질 또는 효소를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 에리트로포이에틴(EPO), α1-항트립신, 카르복시펩티다아제 N, 알파 갈락토시다아제(GLA), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제(OTC), 또는 인간 성장 호르몬(hGH)을 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 단리된 표적 세포를 핵산으로 형질감염시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 적어도 하나의 표적 세포를 유효량의 적어도 하나의 핵산 폴리뉴클레오티드 및 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 핵산을 함유하는, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 기술된 바와 같은, 핵산을 함유하는 적어도 하나의 지질 나노입자와 접촉시켜 상기 적어도 하나의 표적 세포를 상기 핵산으로 형질감염시키는 단계를 포함한다.
표적 세포는 간세포, 상피 세포, 조혈 세포, 상피 세포, 내피 세포, 폐세포, 골세포, 줄기 세포, 중간엽 세포, 신경 세포(예를 들어, 수막, 성상 세포, 운동 뉴런, 후근 신경절 및 전각 운동 뉴런의 세포), 광수용기 세포(예를 들어 간상세포 및 원추세포), 망막 색소 상피 세포, 분비 세포, 심장 세포, 지방 세포, 혈관 평활근 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 윤활막 내층 세포, 난소 세포, 고환 세포, 섬유아세포, B 세포, T 세포, 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일 실시 형태에서, 표적화되는 세포는 비장, 간, 폐, 심장 및 신장 세포일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 표적화되는 세포는 비장 및 신장 세포일 수 있고, 예를 들어 비장 세포일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 간 클리어런스를 피할 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 지질 나노입자 또는 조성물이 특히 관심의 대상일 수 있다.
예를 들어, 지질 나노입자 내에 캡슐화된 핵산에 의한 적어도 하나의 표적 세포의 형질감염 후, 그러한 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 생산이 예를 들어 자극될 수 있고 이러한 표적 세포가 핵산을 발현하고 예를 들어 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 능력이 향상된다. 예를 들어, mRNA를 캡슐화하는 조성물에 의한 표적 세포의 형질감염은 이러한 mRNA에 의해 코딩되는 단백질 또는 효소의 생산을 향상(즉, 증가)시킬 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 표적 세포에서 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 적어도 하나의 표적 세포를 유효량의 (i) 적어도 하나의 핵산 및 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 지질 화합물, 또는 (ii) 핵산을 함유하는, 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 조성물, 또는 (iii) 본원에 기술된 바와 같은, 핵산을 함유하는 적어도 하나의 지질 나노입자와 접촉시켜, 상기 폴리펩티드를 작동가능하게 코딩하는 핵산으로 상기 적어도 하나의 표적 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
달리 지시되지 않는 한 또는 모순이나 불일치가 발생한다는 것이 당업자에게 명백하지 않는 한, 본 발명은 열거된 청구범위 중 적어도 하나로부터의 적어도 하나의 제한, 요소, 절, 설명적 용어 등이 동일한 기본 청구항(또는 관련되는 경우, 임의의 다른 청구항)에 의존하는 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 요소가 목록으로 제시되는 경우(예컨대 Markush 군 또는 유사한 형식), 요소의 각 하위 군이 또한 개시되며 임의의 요소(들)가 군에서 제거될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 양태가 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 그들은 또한 이러한 요소, 특징 등으로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 실시 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 단순함을 위해 이들 실시 형태는 모든 경우에 본원에 그렇게 많은 단어로 구체적으로 제시되지 않았다. 또한 본 발명의 임의의 실시 형태 또는 양태는 특정 배제가 명세서에 인용되는지 여부에 관계없이 청구범위에서 명시적으로 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가 세부 사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 간행물 및 기타 참고 자료는 본 명세서에 참고로 포함된다.
다음 실시예는 제한이 아니라 설명을 위해 제공된다.
[실시예]
재료 및 방법
핵 자기 공명 분광법(H, C NMR)
- H 및 C NMR 스펙트럼을 하기 분광계에서 실온에서 기록하였다: Brucker Advance 400(NMR H: 400 MHz 및 NMR C: 75 MHz).
기록된 이동을 백만분율(δ)로 보고하고, 다음을 사용하여 보정하였다: 잔존 비중수소화 3: H 7.26 ppm; C 77.16 ppm, MeOH H 3.31 ppm; C: 49.0 ppm). 데이터를 다음과 같이 표시하였다: 화학적 이동, 다중도(s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선 및 m = 다중선), 결합 상수(J(Hz)), 적분 및 속성.
NMR 스펙트럼을 상용 소프트웨어 NMRnotebook을 사용하여 얻었다.
- 고해상도 질량 스펙트럼(HRMS)을 Agilent Q-TOF(비행 시간) 6520을 사용하여 얻었고 저해상도 질량 스펙트럼(LCMS)을 Agilent HPLC 1200 SL이 갖추어진 Agilent MSD 1200 SL(ESI/APCI)을 사용하여 얻었다.
실시예 1: N-((Z)-14-(((E)-옥타데스-9-엔-1-일)옥시)-3,6,9,12,16-펜타옥사테트라트리아콘트-25-엔-1-일)-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 IV) (DOG-IM4로도 명명됨)의 합성
Figure pct00062
(IV)
화합물 IV를 하기 합성 반응식에 따라 제조한다:
[반응식 1]
Figure pct00063
1.1 DOGP4NH 2 로도 명명된 DOG-PEG 4 -NH 2 의 합성
이의 합성 반응식은 다음과 같다:
[반응식 2]
Figure pct00064
Figure pct00065
[반응식 3]
Figure pct00066
1.1.1 트리페닐메탄-글리세롤 (1)의 합성
글리세롤 (30.0 g; 325.8 mmole), 트리틸 클로라이드 (22.5 g; 80.7 mmole ) 및 DMAP (225 mg; 1.84 mmole)를 60 mL의 무수 THF에 용해시켰다. 트리에틸아민 (13.5 mL; 96.9 mmol)의 첨가 후, 혼합물을 실온에서 22시간 동안 격렬하게 교반시켰다. 그 후 100 mL의 에틸 아세테이트 및 70 mL의 H2O를 상기 용액에 첨가하였다. 수성 상을 2 x 70 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 70 mL의 10% (w/v) NaHCO3 및 70 mL의 염수로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시켰다. 수득된 생성물을 추가로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용출 구배: CH2Cl2/MeOH)로 정제하여 화합물 1을 백색 고체로서 수득하였다 (15.7 g; 수율 58%).
RMN 1 H (300 MHz; CDCl3): δ : 7.49-7.29 (m; 15Hf-j), 3.93-3.90 (m; 1Hb), 3.76-3.62 (m; 2Ha),3.35-3.24 (m; 2Hc).
ES-SM (N2) m/z: 357.1589 ([M + Na]+); 정확한 질량: 334.1689 g.mol-1
1.1.2 1-메탄술포닐-올레일 알코올 (2)의 합성
올레익 알코올 (45.0 g; 167.6 mmole) 및 트리에틸아민 (38 mL; 272.0 mmole)을 600 mL의 디클로로메탄 (CH2Cl2)에 용해시키고, 혼합물을 4℃에서 교반시켰다. 메탄술포닐 클로라이드 (17 mL; 217.0 mmole)를 적가하고, 반응 혼합물을 격렬한 교반 하에 두었다 (아르곤 하에 실온에서). 12시간 후, 250 mL의 H2O를 첨가하고, 수성 상을 2 x 250 ml의 CH2Cl2로 추출하였다. 유기 층을 250 mL의 1 N HCl, 250 mL의 10% (w/v) NaHCO3, 및 250 mL의 염수로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시켰다. 그 후 용매를 진공 하에 증발시켰다. 수득된 생성물을 추가로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (용출 구배: 10/0으로부터 10/1까지의 시클로헥산/AcOEt)로 정제하였다. 화합물 2를 누르스름한 오일로서 수득하였다 (44 g; 수율 76%).
RMN 1 H (300 MHz; CDCl3): δ : 5.39-5.31 (m; 2H9-10), 4.21 (t; J=6.4 Hz; 2H1), 2.99 (s; 3Ha), 2.14-1.88 (m; 4H8,11), 1.80-1.67 (tt; J=6.8 Hz; 2H2), 1.52-1.14 (m; 22H3-7,12-17), 0.88 (t; J=6.8 Hz; 3H18).
ES-SM (N2) m/z: 385.3969 ([M + K]+); 정확한 질량: 346.2989 g.mol-1
1.1.3 트리페닐메탄-디올레일글리세롤 (3)의 합성
무수 DMF 35 mL 중 NaH (6.0 g (오일 중 60%); 149.5 mmole)의 현탁액에 무수 DMF 145 mL 중 용액 상태의 화합물 1 (10.0 g; 29.2 mmole)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 환류 하에 15분 동안 가열하고, 실온까지 냉각시켰다. 무수 DMF 90 mL 중 생성물 2 (25.9 g; 74.8 mmole)를 상기 혼합물에 적가하고, 그 후 이를 환류 하에 15시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 120 mL의 H2O를 첨가하여 잔존 NaH를 제거하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 2 x 240 mL의 1 N HCl, 2 x 240 mL의 5% (w/v) NaHCO3 및 240 mL의 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시켰다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 누르스름한 조 오일로서 수득된 화합물 3을 추가 정제 없이 사용하였다 (17 g; 수율 70%).
ES-SM (N2) m/z: 857.5507 ([M + Na]+); 정확한 질량: 834.5607 g.mol-1 (생성물을 MS로 탐지함)
1.1.4 디올레일글리세롤 (4)의 합성
화합물 3 (16.0 g; 19.5 mmole) 및 파라-톨루엔술폰산 (pTs-OH.H2O) (1.2 g; 6.1 mmole)을 270 mL의 THF/MeOH (1/1)에 용해시키고, 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 그 후 트리에틸아민 (860 μl; 6.1 mmole)을 상기 혼합물에 첨가하여 여분의 pTsOH.H2O를 제거하고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류 오일을 실리카 겔 크로마토그래피 (시클로헥산/AcOEt)로 정제하여 화합물 4를 무색 오일로서 수득하였다 (6.5 g; 수율 57%).
RMN 1 H: (300 MHz; CDCl3): δ : 5.38-5.32 (m; 4H9-10), 3.76-3.41 (m; 9Hb-a-c-1), 2.13-1.89 (m;8H8,11), 1.69-1.48 (m; 4H2), 1.47-1.12 (m; 44H3-7,12-17), 0.89 (t; J=6.6 Hz; 6H18).
ES-SM (N2) m/z: 615.5213 ([M + Na]+); 정확한 질량: 592.5313 g.mol-1
1.1.5 메탄술포닐옥시-에톡시-에톡시-에톡시-에틸-아지드 (5)의 합성
디-메실레이트 테트라에틸렌글리콜 (25.0 g; 71.4 mmole)을 환류 하에 NaN3 (5.8 g; 89.5 mmole)의 존재 하에 150 mL의 CH3CN에서 가열하였다. 19시간 후 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 침전물을 여과에 의해 회수하고, 실리카 겔 크로마토그래피 (시클로헥산/AcOEt (7/3에서 3/7까지))로 정제하여 화합물 5를 황색 오일로서 수득하였다 (8.7 g; 수율 41%).
RMN 1 H (200 MHz; CDCl3): δ : 4.26-4.22 (m; 2Hd), 3.66-3.61 (m; 2He), 3.60-3.52 (10Hf-j), 3.26(t; J=5.4 Hz; 2Hk), 2.95 (s; 3Hl).
ES-SM (N2) m/z: 320.0539 ([M + Na]+); 정확한 질량: 297.0639 g.mol-1
1.1.6 디올레일글리세로-에톡시-에톡시-에톡시-에틸-아지드 (6)의 합성
무수 THF 13 mL 중 NaH (810 mg (오일 중 60%); 20.2 mmole)의 현탁액에 HMPA 13 mL을 함유하는 무수 THF 50 mL 중 용액 상태의 화합물 4 (4 g; 6.8 mmole)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 환류 하에 15분 동안 가열하고, 이어서 실온까지 냉각시켰다. 무수 THF 25 mL 중 용액 상태의 화합물 5 (4 g; 13.5 mmole)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 환류 하에 15시간 동안 가열하고, 실온까지 냉각시키고, 여분의 NaH를 400 mL의 H2O의 첨가에 의해 제거하였다. 유기 상을 수집하고, 수성 상을 3 x 400 mL의 AcOEt로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 2 x 400 mL의 1 N HCl, 2 x 400 mL의 5% (w/v) NaHCO3 및 400 mL의 염수로 연속적으로 세척하고, MgSO4로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 생성된 오일을 실리카 겔 컬럼 (시클로헥산/AcOEt로 용출)에서 정제하여 누르스름한 오일 (4 g; 수율 74%)을 수득하였다.
RMN 1 H (300 MHz; CDCl3): δ : 5.39-5.33 (m; 4H9-10), 3.70-3.50 (m; 23Ha-j,1), 3.45-3.39 (t; J=5.3 Hz; 2Hk), 2.05-1.95 (m; 8H8,11), 1.58-1.53 (m ; 4H2), 1.43-1.21 (m; 44H3-7,12-17), 0.88 (t; J=6.8 Hz; 6H18)
ES-SM (N2) m/z: 816.6715 ([M + Na]+); 정확한 질량: 793.6815 g.mol-1
1.1.7 2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(~{Z})-옥타데스-9-에녹시]프로폭시]에톡시]
에톡시]에톡시]에탄아민 (DOG-PEG 4 -NH 2 ) (7)의 합성
화합물 6 (1.8 g; 2.3 mmole)을 트리페닐포스핀 (1.8 g; 6.8 mmole) 및 400 mL의 H2O의 존재 하에 180 mL의 THF에 용해시켰다. 상기 혼합물을 환류 하에 15시간 동안 가열하고, 그 후 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔존 오일을 실리카 겔 컬럼 (용출 구배: CH2Cl2/MeOH/NH4OH 9/0.9/0.1)에서 정제하여 화합물 7을 무색 오일로서 수득하였다 (1.5 g; 수율 86%).
RMN 1 H (300 MHz; CDCl3/MeOD 1/1): δ : 5.35-5.29 (m; 4H9-10), 3.64-3.43 (m; 23Ha-j-1), 2.78- 2.90 (m; 2Hk), 2.06-1.90 (m; 8H8,11), 1.60-1.52 (m; 4H2), 1.40-1.19 (m; 44H3-7,12-17), 0.86 (t; J=7,1 Hz; 6H18).
ES-SM (N2) m/z: 768.6636 ([M]+); 정확한 질량: 768.6636 g.mol-1
1.2 N-((Z)-14-(((E)-옥타데스-9-엔-1-일)옥시)-3,6,9,12,16-펜타옥사테트라트리아콘트-25-엔-1-일)-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 IV; DOG-IM4로도 명명됨)의 합성
4-이미다졸카르복실산 (50 mg, 446 μmol)을 1 mL의 옥살릴 클로라이드에 용해시키고, 한 드롭의 DMF를 첨가하여 반응을 촉매하였다. 반응물을 질소 분위기 하에 실온에서 교반시켰다. 3시간 후, 유기 상을 증발시키고, 잔존 황색 고체를 진공 펌프 하에 하룻밤 건조시켜, 정제 없이 상응하는 산 클로라이드 (58 mg, 정량적)를 수득하였다.
DOG-PEG4-NH2 (30 mg, 39 μmol)를 5 mL의 무수 DCM에 용해시키고, DIPEA (25 μL) 및 1.5 mL 무수 DMF 중 산 클로라이드 (5.6 mg, 43 μmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피 (4g 컬럼, DCM/MeOH/NH4OH 9/0.9/0.1)로 정제하여 원하는 화합물 (30 mg, 87%)을 수득하였다.
1 H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.69-7.61 (m, 3H, NH, N=CH-NH, NHCH=C), 5.40-5.29 (m, 4H, 2 x CH=CH), 3.68-3.39 (m, 25H, 12 x OCH 2, 1 x OCH, CH 2NHC(O)), 2.06-1.90 (m, 8H, 2 x CH 2 CH=CHCH 2 ), 1.59-1.49 (m, 4H, 2 x OCH2CH 2 ), 1.39-1.20 (m, 44H, 22 x 올레일-CH 2 ), 0.87 (t, J=6.8, 6H, 2 x CH 3 ) ppm.
13 C-NMR (CDCl3, 75MHz): δ 163.04 (NHC=O), 135.52 (N=CH-NH), 130.53, 130.43, 130.07, 129.97 (2 x CH=CH, NHCH=C, CH=C), 78.06 (OCH), 71.88-70.15 (12 x OCH2), 39.09 (CH2NHC(O)), 32.76-26.23 (올레일), 22.83 (2 x CH3 CH2), 14.25 (2 x CH3) ppm.
HR-MS (직접 주입, 양이온화): m/z = 884.7039 [M+Na]+ (이론치: 884.71)
실시예 2: N -(( Z )-14-((( E )-옥타데스-9-엔-1-일)옥시)-3,6,9,12,16-펜타옥사테트라트리아콘트-25-엔-1-일)-1 H -이미다졸-2-카르복스아미드 (화합물 III)의 합성
Figure pct00067
4-이미다졸카르복실산 대신 2-이미다졸카르복실산을 사용하여 실시예 1에서 고려된 몰량 및 반응식 1에 따라 이것을 제조하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피 (4g 컬럼, DCM/MeOH/NH4OH 9/0.9/0.1)로 정제하여 원하는 화합물 (45 mg, 65%)을 수득하였다.
1 H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.15 (m, 1H, N-CH=CH), 7.16 (m, 1H, CH=CH-NH), 5.40-5.29 (m, 4H, 2 x CH=CH), 3.68-3.37 (m, 25H, 12 x OCH 2, 1 x OCH, CH 2NHC(O)), 2.2 (br s, 1H, NH 신호), 2.1-1.90 (m, 8H, 2 x CH 2 CH=CHCH 2 ), 1.59-1.49 (m, 4H, 2 x OCH2CH 2 ), 1.37-1.20 (m, 44H, 22 x 올레일-CH 2 ), 0.87 (t, J=6.8, 6H, 2 x CH 3 ) ppm.
13 C-NMR (CDCl3, 75MHz): δ 158.95 (NHC=O), 141.20 (N=CH-NH), 130.52, 130.44, 130.06, 129,98, 129.87 (2 x CH=CH, CH=CH-NH), 119.09 (N-CH=C), 78.06 (OCH), 71.83-69.80 (12 x OCH2), 39.30 (CH2NHC(O)), 32.76-26.23 (올레일), 22.83 (2 x CH3 CH2), 14.25 (2 x CH3) ppm.
HR-MS (직접 주입, 양이온화): m/z = 884.7057 [M+Na]+ (이론치: 884.71)
실시예 3: N-((Z)-14-(((E)-옥타데스-9-엔-1-일)옥시)-3,6,9,12,16-펜타옥사테트라트리아콘트-25-엔-1-일)-1H-피리디닐-3-카르복스아미드 (화합물 V)의 합성
Figure pct00068
반응식 1에 따라, 실시예 1에서 고려된 몰량에 따라, 그리고 4-이미다졸카르복실산 대신 3-피리딜 이소티오시아네이트를 사용하여 이것을 제조하였다.
1 H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 8.79-8.01 (m, 3H, 피리딘), 7.26 (m, 1H, 피리딘), 5.40-5.29 (m, 4H, 2 x CH=CH), 3.94-3.29 (m, 25H, 12 x OCH 2, 1 x OCH, CH 2NHC(S)), 2.1-1.90 (m, 8H, 2 x CH 2 CH=CHCH 2 ), 1.61-1.45 (m, 4H, 2 x OCH2CH 2 ), 1.42-1.18(m, 44H, 22 x 올레일-CH 2 ), 0.87 (t, J=6.8, 6H, 2 x CH 3 ) ppm.
1 H-NMR (MeOD, 400 MHz): δ 8.62, 8.29, 8.09, 7.39 (m, 4H, 피리딘), 5.42-5.31 (m, 4H, 2 x CH=CH), 3.88-3.39 (m, 25H, 12 x OCH 2, 1 x OCH, CH 2NHC(S)), 2.08-1.94 (m, 8H, 2 x CH 2 CH=CHCH 2 ), 1.61-1.49 (m, 4H, 2 x OCH2CH 2 ), 1.40-1.24 (m, 44H, 22 x 올레일-CH 2 ), 0.90 (t, J=6.8, 6H, 2 x CH 3 ) ppm.
13 C-NMR (CDCl3, 75MHz): δ 181.82 (CH2NHC(S)), 145.86, 145.01, 136.18, (3C, 피리딘) 131.20-129.84 (1C 피리딘, 2 x CH=CH), 123.22 (1C, 피리딘), 78.05 (OCH), 77.94, 72.72-70.22 (12 x OCH2), 44.86 (CH2NHC(S)), 32.73-26.24 (올레일), 22.80 (2 x CH3 CH2), 14.23 (2 x CH3) ppm.
HR-MS (직접 주입, 양이온화): m/z = 904.7166 [M+H]+ (이론치: 904.72)
실시예 4: N-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 IV)의 합성
Figure pct00069
DCM (30 mL) 중 2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에탄아민 (1.2 g, 1.56 mmol)의 혼합물에 DMF (20 mL) 중 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (0.612 g, 4.69 mmol) 및 DIEA (1.01 g, 7.81 mmol)의 용액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔에서 컬럼 크로마토그래피 (DCM 중 0%~10% MeOH로 용출)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4- 카르복스아미드 (0.504 g, 37.4%)를 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 10.99 (s, 1H), 7.73 - 7.59 (m, 3H), 5.39 - 5.30 (m, 4H), 3.69 - 3.40 (m, 25H), 2.09 - 1.92 (m, 8H), 1.60 - 1.50 (m, 4H), 1.28 (t, J = 14.5 Hz, 44H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
실시예 5 : N-[2-[2-[2-[2-(2,3-디헥사데스옥시프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 VI)의 합성
Figure pct00070
(VI)
4-이미다졸카복실산 (2.5 g, 22.3 mmol)을 옥살릴 클로라이드 60 mL에 용해시키고, 몇 드롭의 DMF를 첨가하여 반응을 촉매하였다. 상기 반응물을 질소 분위기 하에 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 유기 상을 증발시키고, 잔존 황색 고체를 진공 펌프 하에 하룻밤 건조시켜, 정제 없이 상응하는 산 클로라이드 (2.5 g, 정량적)를 수득하였다. 2-[2-[2-[2-(2,3-디헥사데스옥시프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에탄아민 (400 mg, 0.5 mmol)을 25 mL의 무수 DCM에 용해시키고, 산 클로라이드 (262 mg, 2 mmol) (3 mL 무수 DMF 중) 및 DIPEA (0.325 g, 2.5 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피 (12 g 컬럼, DCM/MeOH/NH4OH 9/0.9/0.1)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-(2,3-디헥사데스옥시프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (250 mg, 0.293 mmol, 58.3% 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.65 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 3.69 - 3.40 (m, 25H), 1.60 - 1.49 (m, 4H), 1.33 - 1.22 (m, 52H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
실시예 6 : N-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 VII)의 합성
Figure pct00071
(VII)
반응식 4에 나타낸 화학에 기초하여 화합물을 합성하였다.
Figure pct00072
합성
단계 (1)
Figure pct00073
0℃의 DCM (20 ml) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판-1-올 (1 g, 1.69 mmol)의 용액에 Dess-Martin 퍼요오디난 (841 mg, 1.69 mmol)을 5분 동안 첨가하였다. 그 후 상기 혼합물을 N2 하에 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 DCM (30 ml)으로 희석시키고, NaHCO3/Na2S2O3(1/1) (50 ml x3) 및 염수 (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판알 (1.2 g, 조 물질)을 황색 오일로서 제공하고, 이를 직접적으로 다음 단계로 가져갔다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.72 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 5.35 (t, J = 5.4 Hz, 4H), 3.84 - 3.79 (m, 1H), 3.74 - 3.56 (m, 5H), 3.44 (ddd, J = 12.6, 9.4, 2.7 Hz, 3H), 2.03 - 1.96 (m, 8H), 1.63 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.54 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 1.26 (d, J = 4.5 Hz, 44H), 0.90 - 0.87 (m, 6H).
단계 (2)
Figure pct00074
2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판알 (1.2 g, 1.62 mmol)을 t-BuOH: H2O (3:1, 20 mL) (NaH2PO4.2H2O (759 mg, 4.87 mmol), 2-메티-2-부텐 (3.4 mL) 및 아염소산나트륨 (411 mg, 4.87 mmol)을 함유함)에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반시키고, 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판산 (778 mg, 수율 78.9%)을 무색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40 - 5.31 (m, 4H), 4.04 (dd, J = 5.0, 3.3 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 10.5, 3.2 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 10.5, 5.1 Hz, 1H), 3.62 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.51 - 3.44 (m, 2H), 2.01 (dd, J = 14.7, 8.9 Hz, 8H), 1.65 - 1.54 (m, 4H), 1.27 (dd, J = 6.7, 2.7 Hz, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (3)
Figure pct00075
DCM (2 ml) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판산 (100 mg, 0.165 mmol)의 용액에 tert-부틸 N-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (48 mg, 0.165mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (2 mg, 0.02 mmol), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (94 mg, 0.25 mmol) 및 트리에틸아민 (33 mg, 0.33 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 DCM (50 ml)으로 희석시키고, 물 (50 ml x 2), 염수 (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 2%~8% 메탄올로 용출)로 정제하여 tert-부틸 N-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트를 연한 황색 오일로서 제공하였다.
단계 (4)
Figure pct00076
DCM (2 ml) 중 tert-부틸 N-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (226 mg, 0.256 mmol)의 용액에 TFA (0.5 ml)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 농축시켜 tert-부틸 N-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (300 mg, 조 물질)를 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.31 (m, 4H), 3.94 (s, 1H), 3.83 - 3.69 (m, 7H), 3.53 (dddd, J = 26.7, 22.9, 11.7, 4.5 Hz, 15H), 2.06 - 1.91 (m, 8H), 1.54 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 1.26 (d, J = 4.3 Hz, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (5)
Figure pct00077
DCM (10 ml) 중 N-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에틸]-2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판아미드 (400 mg, 0.512 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (265 mg, 2.05 mmol), 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (200 mg, 1.54 mmol) (DMF (2 ml) 중)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 EA (100 ml)로 희석시키고, 물 (100 ml x2), 염수 (100 ml)로 세척하였다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10% MeOH)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (280 mg, 수율 61.2%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.35 - 10.08 (m, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 5.44 - 5.31 (m, 4H), 3.89 (dd, J = 5.6, 2.8 Hz, 1H), 3.77 (dd, J = 10.6, 2.6 Hz, 1H), 3.69 - 3.39 (m, 21H), 2.10 - 1.93 (m, 7H), 1.63 - 1.52 (m, 5H), 1.26 (d, J = 4.6 Hz, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 7 : 노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (화합물 VIII)의 합성
Figure pct00078
(VIII)
반응식 5에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (VIII)을 합성하였다.
Figure pct00079
합성
단계 (1)
Figure pct00080
질소 하에 건조 디클로로메탄 (500 mL) 중 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에탄올 (50 g, 176 mmol) 및 트리에틸아민 (35.6 g, 352 mmol)을 -5℃까지 냉각시켰다. 건조 DCM (20 mL) 중 메탄술포닐 클로라이드 (30.2 g, 264 mmol)를 0℃에서 이 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온까지 가온하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 트리-에틸아민 히드로클로라이드를 여과 제거하고, 상기 DCM 용액을 0.1 N HCl로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거하여 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (69.1 g, 175 mmol, 정량적)를 연한 황색 오일로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 4.56 (s, 2H), 4.39 - 4.33 (m, 2H), 3.78 - 3.73 (m, 2H), 3.69 - 3.60 (m, 12H), 3.06 (s, 3H).
단계 (2)
Figure pct00081
THF (500 mL) 중 (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메탄올 (24.4 g, 175 mmol)의 용액에 NaH (14 g, 351 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 가열하여 환류시켰다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (69.1 g, 175 mmol)를 첨가하고 (질소 하에), 반응물을 80℃에서 24시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 20~50% 에틸 아세테이트로 용출)를 통해 정제하여 24-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란(54.4 g, 70% 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 4.28 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.05 (dd, J = 8.3, 6.4 Hz, 1H), 3.72 (dd, J = 8.3, 6.4 Hz, 1H), 3.70 - 3.61 (m, 16H), 3.57 (dd, J = 10.0, 5.8 Hz, 1H), 3.49 (dd, J = 10.0, 5.5 Hz, 1H), 1.42 (s, 3H), 1.35 (s, 3H).
단계 (3)
Figure pct00082
AcOH (200 mL) 및 H2O (200 mL) 중 4-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 (54.4 g, 123 mmol)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다.
TLC (EA/PE 1/1, SM Rf: 0.5; 생성물, Rf: 0.1)는 모든 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 용매를 진공 하에 제거하고, 톨루엔과 수 회 공비혼합하였다. 연한 황색 오일로서의 2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (49 g, 123 mmol, 정량적)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 3.88 - 3.81 (m, 1H), 3.70 - 3.51 (m, 21H).
단계 (4)
Figure pct00083
질소 하에 건조 DMF (200 mL) 중 3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판-1,2-디올 (24 g, 60.3 mmol)의 용액에 NaH (9.64 g, 241 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 15분 동안 가열하였다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 9-브로모논-1-엔 (31.9 g, 151 mmol)을 이 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30분 동안, 그 후 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다.
TLC (EA/PE = 1/1, Rf: 0.5)는 새로운 스폿이 형성되었음을 나타냈다. 반응물을 물 (50 mL)로 켄칭하고, 그 후 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 20%~50% 에틸 아세테이트로 용출)로 정제하여 2-[2-[2-[2-[2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시메틸벤젠 (9.3 g, 14.6 mmol, 24.2% 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 5.89 - 5.72 (m, 2H), 5.04 - 4.89 (m, 4H), 4.57 (s, 2H), 3.71 - 3.60 (m, 17H), 3.59 - 3.38 (m, 9H), 2.03 (q, J = 6.7 Hz, 4H), 1.60 - 1.49 (m, 4H), 1.43 - 1.23 (m, 16H).
단계 (5)
Figure pct00084
MeCN (80 mL), CCl4 (80 mL) 및 물 (80 mL) 중 2-[2-[2-[2-[2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시메틸벤젠 (9.3 g, 14.6 mmol)의 용액에 NaIO4 (24.9 g, 116 mmol) 및 RuCl3 (656 mg, 2.91 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다.
LCMS는 표제 화합물이 부분적인 모노-알데히드 생성물과 함께 주요 생성물임을 나타냈다. 반응물을 여과시키고, 여과액을 에틸 아세테이트 (800 mL)로 희석시키고, 1 N 수성 HCl (400 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2S2O3 용액으로 세척하고, 그 후 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (10 g, 12.4 mmol)을 황색 오일로서 제공하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 (6)
8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-옥소옥톡시)프로폭시]옥탄산 (10 g, 8 mmol)을 t-BuOH : H2O ( 3:1, 160 mL) (NaH2PO4.2H2O (3.73 g, 24 mmol), 2-메티-2-부텐 (40 mL) 및 아염소산나트륨 (2.71 mg, 24 mmol)을 함유함)에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켜 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (10 g, 3.22 mmol, 정량적)을 연한 황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 3.71 - 3.61 (m, 17H), 3.59 - 3.37 (m, 9H), 2.33 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 1.69 - 1.51 (m, 8H), 1.39 -1.28 (m, 14H).
단계 (7)
Figure pct00085
질소 하에 건조 디클로로메탄 (200 mL) 중 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (10 g, 14.8 mmol) 및 1-노난올 (5.12 g, 35.5 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (11.5 g, 88.7 mmol), DMAP (0.722 g, 5.91 mmol) 및 EDCI (7.37 g, 38.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 20%~55% 에틸 아세테이트로 용출)로 정제하여 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (5 g, 35.9%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.70 - 3.61 (m, 16H), 3.59 - 3.39 (m, 9H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.67 - 1.50 (m, 12H), 1.37 - 1.21 (m, 36H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (8)
Figure pct00086
에틸 아세테이트 (100 mL) 중 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (5 g, 5.31 mmol)의 용액에 Pd/C (1.13 g, 20% wt/wt)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 하에 실온에서 18시간 동안 교반시켰다.
TLC (에틸 아세테이트/석유 에테르 1/1)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다.
반응물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 에틸 아세테이트로 세척하여 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (4.22 g, 4.98 mmol, 93.8%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.74 - 3.38 (m, 27H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.68 - 1.50 (m, 12H), 1.39 - 1.21 (m, 37H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (9)
Figure pct00087
디메틸 포름아미드 (DMF, 부피: 30 ml) 중 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (4.5 g, 4.8 mmol)의 용액에 소듐 아지드 (0.378 g, 5.81 mmol)를 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 그 후 물 (200 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (100 mL * 2)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (100 mL)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하고, 이를 컬럼 크로마토그래피 (석유 에테르 : 에틸 아세테이트 = 100:1~3:1로 용출)로 정제하여 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (4 g, 4.58 mmol, 94% 수율)를 무색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.71 - 3.36 (m, 25H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.67 - 1.50 (m, 12H), 1.38 - 1.21 (m, 36H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (10)
Figure pct00088
테트라히드로푸란 (THF), 비: 33, 부피: 10 ml) / Green (명칭: 물, 비: 1, 부피: 0.3 ml) 중 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (1 g, 1.14 mmol) 및 트리페닐포스핀 (0.45 g, 1.72 mmol)의 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반시켰다. TLC (디클로로메탄 중 5% 메탄올)는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 제거하고, 잔사를 실리카 겔 상에 로딩하고, 크로마토그래피 (실리카, 1~10% 메탄올/암모니아 (디클로로메탄 중))로 정제하여 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (0.68 g, 0.8 mmol, 70% 수율)를 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 3.70 - 3.39 (m, 23H), 2.91 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.47 (s, 2H), 2.32 - 2.25 (m, 4H), 1.66 - 1.50 (m, 12H), 1.38 - 1.21 (m, 36H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H).
단계 (11)
Figure pct00089
4-이미다졸카복실산 (2.5 g, 22.3 mmol)을 옥살릴 클로라이드 60 mL에 용해시키고, 몇 드롭의 DMF를 첨가하여 반응을 촉매하였다. 상기 반응물을 질소 분위기 하에 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 유기 상을 증발시키고, 잔존 황색 고체를 진공 펌프 하에 하룻밤 건조시켜, 정제 없이 상응하는 산 클로라이드 (2.5 g, 정량적)를 수득하였다.
노닐8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (680 mg, 0.8 mmol)를 30 mL의 무수 DCM에 용해시키고, 산 클로라이드 (419 mg, 3.2 mmol) (3 mL 무수 DMF 중) 및 DIPEA (0.519 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피 (40 g 컬럼, DCM/MeOH 20/1~10/1), 이어서 분취용 TLC (디클로로메탄 중 10% 메탄올로 용출)로 정제하여 노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-2-(8-논옥시-8-옥소-옥톡시)프로폭시]옥타노에이트 (302.3 mg, 0.326 mmol, 40.6% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
MS (ESI) m/z=898.7 (M+H)+
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.95 (s, 1H), 7.72 - 7.60 (m, 3H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.68 - 3.37 (m, 25H), 2.33 - 2.25 (m, 4H), 1.66 - 1.48 (m, 12H), 1.38 - 1.21 (m, 37H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 8 : 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1- 옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (화합물 IX)의 합성
Figure pct00090
화합물 (IX)
반응식 6에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (IX)을 합성하였다.
Figure pct00091
Figure pct00092
합성
단계 (1)
Figure pct00093
질소 하에 건조 디클로로메탄 (600 mL) 중 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에탄올 (50 g, 0.176 mol) 및 트리에틸아민 (36.2 g, 0.352 mol)을 0℃까지 냉각시켰다.
메탄술포닐 클로라이드 (30.6 g, 0.264 mol)를 0℃에서 이 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온까지 가온하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 트리에틸아민 히드로클로라이드를 여과 제거하고, 상기 DCM 용액을 0.1 N HCl로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거하여 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (62 g, 92%)를 연한 황색 오일로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS MS 363 (M+1)
단계 (2)
Figure pct00094
THF (600 mL) 중 (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메탄올 (62 g, 0.171 mol)의 용액에 NaH (6.17 g, 0.257 mol)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 가열하여 환류시켰다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (25.0 g, 0.171 mol)를 첨가하고 (질소 하에), 반응물을 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 20~50% 에틸 아세테이트로 용출)를 통해 정제하여 4-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 (43 g, 71% 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
LCMS MS 421(M+23)
단계 (3)
Figure pct00095
AcOH (200 mL) 및 물 (200 mL) 중 4-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 (43 g, 0.103 mol)의 혼합물. 상기 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 제거하여 3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판-1,2-디올 (36 g, 95%)을 연한 황색 오일로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS MS 381(M+23)
단계 (4)
Figure pct00096
THF (200 mL) 중 3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판-1,2-디올 (20 g, 0.050 mol)의 용액에 NaH (8.03 g, 0.201 mol)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 가열하여 환류시켰다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 9-브로모논-1-엔 (26.6 g, 0.126 mol)을 첨가하고 (질소 하에), 반응물을 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 10~30% 에틸 아세테이트로 용출)를 통해 정제하여 2-[2-[2-[2-[2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시메틸벤젠 (8.8 g, 26% 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 5.87 - 5.73 (m, 2H), 5.04 - 4.87 (m, 4H), 4.57 (s, 2H), 3.71 - 3.59 (m, 16H), 3.59 - 3.38 (m, 9H), 2.03 (q, J = 6.5 Hz, 4H), 1.60 - 1.49 (m, 4H), 1.41 - 1.28 (m, 16H).
단계 (5)
Figure pct00097
MeCN (80 mL), CCl4 (80 mL) 및 물 (80 mL) 중 2-[2-[2-[2-[2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시메틸벤젠 (8.5 g, 0.0140 mol)의 용액에 NaIO4 (24.9 g, 0.116 mol) 및 RuCl3 (0.66 g, 2.93 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. LCMS는 표제 화합물이 주요 생성물임을 나타냈다. 반응물을 여과시키고, 여과액을 에틸 아세테이트 (600 mL)로 희석시키고, 1 N 수성 HCl (200 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (8.7 g, 97% 수율)을 황색 오일로서 제공하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.31 (dd, J = 22.6, 3.2 Hz, 5H), 4.57 (s, 2H), 3.71 - 3.61 (m, 19H), 3.59 - 3.38 (m, 11H), 2.32 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.68 - 1.47 (m, 10H), 1.32 (s, 14H).
단계 (6)
Figure pct00098
DCM (500 mL) 중 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (40 g, 49.8 mmol, 순도: 80%), 헵타데칸-9-올 (25.5 g, 99.6 mmol), N,N-디메틸피리딘-4-아민 (12.2 g, 99.6 mmol), EDC HCl (19.1 g, 99.6 mmol) 및 DIEA (19.3 g, 149 mmol)의 혼합물. 상기 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물에 DCM (500 mL)을 첨가하고, 이를 1 N HCl, 염수로 세척하고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (1:1의 에틸 아세테이트 / 석유 에테르로 용출)로 정제하여 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (15 g, 27%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 4.90 - 4.82 (m, 2H), 3.70 - 3.60 (m, 16H), 3.58 - 3.37 (m, 9H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.53 (dd, J = 22.4, 6.0 Hz, 12H), 1.28 (d, J = 22.7 Hz, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (7)
Figure pct00099
에틸 아세테이트 (150 mL) 중 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (15 g, 13.4 mmol)의 용액에 Pd/C (2.85 g, 20% wt/wt)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 하에 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC (에틸 아세테이트/석유 에테르 1/1)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 에틸 아세테이트로 세척하여1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (11.1 g, 80.5%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.91 - 4.82 (m, 2H), 3.75 - 3.39 (m, 24H), 2.27 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.66 - 1.43 (m, 17H), 1.38 - 1.17 (m, 61H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (8)
Figure pct00100
DCM (20 mL) 중 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.4 g, 1.36 mmol) 및 N,N-디에틸에탄아민 (0.275 g, 2.72 mmol)의 혼합물에 메탄술포닐 클로라이드를 첨가하였다 (0℃에서). 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물에 DCM (100 mL)을 첨가하고, 이를 물, 염수로 세척하고, 농축시켜 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.4 g, 93%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 4.90 - 4.82 (m, 2H), 3.70 - 3.60 (m, 16H), 3.58 - 3.37 (m, 9H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.53 (dd, J = 22.4, 6.0 Hz, 12H), 1.28 (d, J = 22.7 Hz, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (9)
Figure pct00101
실온에서 DMF (10 mL) 중 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.4 g, 1.26 mmol)의 혼합물에. 상기 혼합물을 70℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물에 물 (50 mL)을 첨가하고, 이를 EtOAc (50 mL*3)로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켜 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.3 g, 97.5%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.86 (p, J = 6.3 Hz, 2H), 3.72 - 3.58 (m, 15H), 3.60 - 3.35 (m, 11H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.56 (ddd, J = 22.2, 14.3, 6.1 Hz, 18H), 1.38 - 1.19 (m, 64H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (10)
Figure pct00102
THF (20 mL) 및 물 (3 mL) 중 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.3 g, 1.23 mmol) 및 트리페닐포스판의 혼합물. 상기 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시켜 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.1 g, 87%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.86 (p, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 - 3.39 (m, 23H), 2.91 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.4 Hz, 7H), 1.54 (dd, J = 32.2, 15.1 Hz, 16H), 1.28 (d, J = 23.3 Hz, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (11)
Figure pct00103
DCM (40 mL) 중 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.1 g, 1.04 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민 (1.35 g, 10.4 mmol)의 혼합물에 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (0.545 g, 4.17 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔에서 컬럼 크로마토그래피 (DCM 중 2%~15% MeOH로 용출)로 정제하여 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (0.22 g, 18.8%)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.78 (s, 1H), 7.63 (s, 3H), 4.86 (s, 2H), 3.70 - 3.36 (m, 25H), 2.28 (dd, J = 10.6, 4.4 Hz, 4H), 1.94 (s, 3H), 1.66 - 1.43 (m, 17H), 1.36 - 1.16 (m, 62H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
실시예 9 : 2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에틸 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노에이트 (화합물 X)의 합성
Figure pct00104
(X)
화합물 (X)의 합성
DCM (10 ml) 중 2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에틸 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노에이트 (282 mg, 0.36 mmol)의 용액에 DIEA (233 mg, 1.8 mmol) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (188 mg, 1.44 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 EA (100 ml)로 처리하고, 물 (100 ml x2), 포화 수성 NaCl (100 ml)로 세척하였다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10% MeOH)로 정제하여 2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노) 에톡시] 에톡시] 에톡시] 에틸 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]프로파노에이트 ( 192 mg, 수율 59.6%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.77 - 9.65 (m, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.51 - 7.44 (m, 1H), 5.34 (t, J = 5.4 Hz, 4H), 4.27 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 4.08 - 4.05 (m, 1H), 3.75 - 3.57 (m, 17H), 3.49 - 3.39 (m, 3H), 2.18 - 1.90 (m, 8H), 1.60 (s, 2H), 1.55 - 1.52 (m, 2H), 1.27 (s, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 10 : 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트 (화합물 XI)의 합성
Figure pct00105
(XI)
화합물 (XI)의 합성
DCM (15 ml) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트 (623 mg,0.79 mmol)의 용액에 DIEA (515 mg, 3.98 mmol), 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (416 mg, 3.19 mmol) (DMF (5 ml) 중)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, EA (50 ml)로 처리하고, 물 (50 mlx2), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 5% MeOH)로 정제하여 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4- 카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트 (380 mg, 수율 53.4 mmol)를 무색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.97 (s, 1H), 7.64 (d, J = 15.8 Hz, 3H), 5.34 (t, J = 5.4 Hz, 4H), 4.32 (dd, J = 11.5, 4.0 Hz, 1H), 4.20 - 4.11 (m, 3H), 3.72 - 3.61 (m, 13H), 3.55 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.46 (dt, J = 13.0, 5.5 Hz, 4H), 2.13 - 1.86 (m, 8H), 1.54 (d, J = 6.2 Hz, 4H), 1.33 - 1.24 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H
실시예 11 : 2,3-비스[(~{Z})-옥타데스-9-에녹시]프로필 ~{N}-[2-[2-[2-(1~{H}-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (화합물 XII)의 합성
Figure pct00106
(XII)
화합물 (XII)의 합성
단계 (1)
Figure pct00107
DMF (10 ml ) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판-1-올 (1g, 1.65 mmol)의 용액에 비스(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (1.34 g, 4.96 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (202 mg, 1.65 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (50 ml)로 처리하고, 물 (50 mlx2), 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 20% EA)로 정제하여 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (937 mg, 수율 75.7%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.48 - 5.30 (m, 4H), 4.46 (dd, J = 11.1, 3.9 Hz, 1H), 4.38 - 4.31 (m, 1H), 3.74 - 3.66 (m, 1H), 3.60 - 3.39 (m, 6H), 2.83 (s, 4H), 2.01 (dd, J = 14.8, 9.2 Hz, 8H), 1.54 (d, J = 6.6 Hz, 4H), 1.33 - 1.22 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (2)
Figure pct00108
DCM (10 ml) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (937 mg, 1.28 mmol)의 용액에 tert-부틸 N-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카르바메이트 (327 mg, 1.28 mmol), TEA (194 mg, 1.91 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (15 mg, 0.128 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 DCM (50 ml)으로 처리하고, 물 (50 ml x2), 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 0~50% EA)로 정제하여 tert-부틸 N-[2-[2-[2- [2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로폭시카르보닐아미노]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (802 mg, 수율 71%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.36 (dt, J = 9.9, 5.0 Hz, 4H), 5.27 (s, 1H), 5.06 (s, 1H), 4.20 (dd, J = 11.4, 3.8 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 11.5, 5.3 Hz, 1H), 3.62 - 3.53 (m, 11H), 3.48 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.45 - 3.32 (m, 6H), 2.02 (dt, J = 12.3, 6.3 Hz, 8H), 1.57 - 1.51 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.34 - 1.25 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H).
단계 (3)
Figure pct00109
DCM (10 ml) 중 tert-부틸 N-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]프로폭시카르보닐아미노]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (802 mg, 0.925 mmol)의 용액에 TFA (1.3 ml)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 진공에서 농축시켜 2,3- 비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 N-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카르바메이트 (1.19 g, 조 물질)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52 (s, 2H), 5.39 - 5.31 (m, 4H), 4.26 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.14 (dd, J = 11.7, 4.5 Hz, 1H), 3.76 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.70 - 3.51 (m, 12H), 3.46 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.39 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 3.25 (s, 2H), 2.01 (dd, J = 12.5, 6.6 Hz, 8H), 1.56 (d, J = 8.9 Hz, 4H), 1.31 - 1.23 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (4)
Figure pct00110
DCM (15 ml) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 N-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카르바메이트 (709 mg, 0.924 mmol)의 용액에 DIEA (717 mg, 5.54 mmol) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (483 mg, 3.7 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, EA (50 ml)로 처리하고, 물 (50 mlx2), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 5%~10% MeOH)로 정제하여 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 N-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (462 mg, 수율 56.9%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.85 - 9.75 (m, 1H), 7.66 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 7.52 (s, 1H), 5.75 (s, 1H), 5.34 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 4.19 (s, 1H), 4.12 - 4.07 (m, 1H), 3.71 - 3.59 (m, 9H), 3.56 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.50 - 3.42 (m, 4H), 3.37 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 2.10 - 1.87 (m, 8H), 1.54 (d, J = 6.4 Hz, 4H), 1.26 (d, J = 4.7 Hz, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 12 : [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-2- [8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (화합물 XIII)의 합성
Figure pct00111
(XIII)
도 7에 예시된 바와 같이 반응식 7에 나타낸 화학에 기초하여 화합물을 합성하였다.
화합물 (XIII)의 합성
단계 (1)
Figure pct00112
DCM (300 mL) 중 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에탄올 (40 g, 0.206 mol), N,N-디메틸피리딘-4-아민 (1.26 g, 0.0103 mol) 및 [클로로(디페닐)메틸]벤젠 (45.9g, 0.165 mol)의 혼합물. 상기 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 그 후 N,N-디에틸에탄아민 (41.7 g, 0.412 mol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반시켰다. LCMS는 양호한 반응을 나타냈다. 상기 혼합물을 물 (600 mL)에 붓고, DCM (2*400 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 물, NaCl로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (3:1의 에틸 아세테이트 / 석유 에테르로 용출)로 정제하여 2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에탄올 (33.0 g, 36.7%)을 무색 오일로서 제공하였다.
LCMS 459 (M+23), 99% UV 214 nm
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49 - 7.44 (m, 6H), 7.32 - 7.26 (m, 6H), 7.25 - 7.19 (m, 3H), 3.72 - 3.64 (m, 12H), 3.61 - 3.57 (m, 2H), 3.27 - 3.22 (m, 2H), 2.55 - 2.50 (m, 1H).
단계 (2)
Figure pct00113
DCM (600 mL) 중 2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에탄올 (33 g, 0.0756 mol) 및 N,N-디에틸에탄아민 (15.3 g, 0.151 mol)의 혼합물에 메탄술포닐 클로라이드 (10.4 g, 0.0907 mol)를 0℃에서 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. CH2Cl2 (400 mL)를 상기 용액에 첨가하고, 혼합물을 묽은 HCl (1 M, 1000 mL)로 세척하였다. 상기 혼합물을 진탕시키고, 층들을 분리하고, 유기 층을 수집하였다. 유기 층을 추가로 물 (1000 mL) 및 염수 (1000 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 제거하여 2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (38.8 g, 99.8%)를 황색 오일로서 제공하였다.
LCMS 537.2 (M+23) 98% UV (214 nm)
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 - 7.44 (m, 6H), 7.32 - 7.27 (m, 5H), 7.26 - 7.20 (m, 4H), 4.35 - 4.30 (m, 2H), 3.75 - 3.71 (m, 2H), 3.70 - 3.63 (m, 10H), 3.26 - 3.20 (m, 2H), 2.98 (s, 3H).
단계 (3)
Figure pct00114
무수 DMF 300 mL 중 NaH (17.9 g)의 현탁액에 3-트리틸옥시프로판-1,2-디올 (30 g)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 80℃에서 15분 동안 가열하고, 실온까지 냉각시켰다. 무수 DMF 10 mL 중 9-브로모논-1-엔 (46 g)을 상기 혼합물에 적가하고, 그 후 이를 80℃ 미만에서 18시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 500 mL의 H2O를 첨가하여 잔존 NaH를 파괴하였다. 유기 상을 750 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 300 mL의 5% (w/v) NaHCO3 및 150 mL의 염수로 연속적으로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 생성된 오일을 실리카 겔 컬럼 (석유 에테르/에틸 아세테이트 (석유 에테르 중 6%~25% 에틸 아세테이트)로 용출)에서 정제하여 무색 오일 (15.1 g, 28.9%)을 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.60 - 7.05 (m, 17H), 5.95 - 5.66 (m, 2H), 4.97 (ddd, J =21.1, 11.4, 5.9 Hz, 4H), 3.69 - 3.31 (m, 7H), 3.21 - 3.06 (m, 2H), 2.02 (dt, J = 7.9, 3.7 Hz,4H), 1.50 - 1.25 (m, 18H).
단계 (4)
Figure pct00115
메탄올 / THF (600 mL, 1/1 v/v) 중 [2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시-디페닐-메틸]벤젠 (30.7 g, 50 mmol)의 용액에 p-톨루엔술폰산 (47.6 g, 250 mmol)을 실온에서 한꺼번에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC (석유 에테르 중 4% 에틸 아세테이트)는 출발 물질이 완전히 사라졌음을 나타냈다. 20 mL의 트리에틸아민을 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 20%~30% 에틸 아세테이트(21%)로 용출)로 정제하여 2,3-비스(논-8-에녹시)프로판-1-올 (12.33 g,36.2 mmol 72.4% 수율)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.89 - 5.73 (m, 2H), 5.03 - 5.00 (m, 1H), 4.99 - 4.96 (m, 1H), 4.94 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.76 - 3.69 (m, 1H), 3.65 - 3.41 (m, 8H), 2.26 - 2.19 (m, 1H), 2.09 - 2.00 (m, 4H), 1.61 - 1.52 (m, 4H), 1.41 - 1.27 (m, 16H).
단계 (5)
Figure pct00116
2,3-비스(논-8-에녹시)프로판-1-올(12.33 g,36.2 mmol)의 혼합물에 200 mL의 건조 THF 중 NaH (60% 광유 분산액, 2.77 g, 72.4 mmol)를 첨가하고, 그 후 80℃에서 15분 동안 교반시켰다. 이어서 용매를 실온으로 되돌린 후, 60 mL의 건조 THF에 용해시킨 2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트(22.4 g, 43.4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 교반 환류 (80℃)하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 물 (200 mL)을 첨가하였다. EtOAc (400 mL)를 첨가하고, 혼합물을 진탕시키고, 층들을 분리하고, 유기 층을 수집하였다. 수성 층을 EtOAc (400 mL * 2)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 잔사를 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (석유 에테르 중 에틸 아세테이트 (0~15%)(14%)로 용출)로 정제하여 표적 생성물 (23.17 g,30.5 mmol, 84.3% 수율)을 담황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 - 7.44 (m, 6H), 7.31 - 7.26 (m, 6H), 7.25 - 7.19 (m, 3H), 5.88 - 5.72 (m, 2H), 5.02 - 4.99 (m, 1H), 4.98 - 4.95 (m, 1H), 4.93 (dd, J = 2.0, 0.9 Hz, 1H), 4.92 - 4.89 (m, 1H), 3.70 - 3.64 (m, 10H), 3.63 - 3.59 (m, 4H), 3.59 - 3.40 (m, 9H), 3.26 - 3.21 (m, 2H), 2.07 - 1.99 (m, 4H), 1.60 - 1.50 (m, 4H), 1.41 - 1.25 (m, 16H).
단계 (6)
Figure pct00117
MeCN (200 mL), CCl4 (200 mL) 및 물 (200 mL) 중 [2-[2-[2-[2-[2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시-디페닐-메틸]벤젠(23.17 g,30.5 mmol)의 용액에 NaIO4 (52.2 g, 244 mmol) 및 RuCl3 (1.27 g, 6.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 반응물을 여과시키고, 여과액을 에틸 아세테이트 (800 mL)로 희석시키고, 수성 1 N HCl (900 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2S2O3 용액 (700 mL*2)으로 세척하고, 그 후 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 8-[2-(7-카르복시헵트옥시)-3-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]옥탄산(23.28 g, 22 mmol, 순도: 75%, 71.9% 수율)을 황색 오일로서 제공하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.75 (s, 1H), 7.46 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.34 - 7.27 (m, 12H), 7.25 - 7.19 (m, 1H), 3.75 - 3.72 (m, 1H), 3.69 - 3.40 (m, 23H), 3.26 - 3.20 (m, 1H), 2.45 - 2.28 (m, 4H), 1.68 - 1.50 (m, 8H), 1.32 (s, 12H).
단계 (7)
8-[2-(8-옥소옥톡시)-3-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]
옥탄산 (12.5 g, 4.81 mmol)을 t-BuOH : H2O ( 3:1, 400 mL) (NaH2PO4 (1.72 g, 14.4 mmol), 2-메티-2-부텐 (15 mL) 및 아염소산나트륨 (1.3 g, 14.4 mmol)을 함유)에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 H2O로 희석시켰다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (800 mL*2)로 추출하였다. 잔사를 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (DCM 중 CH3OH (0~6%)(3%)로 용출)로 정제하여 표적 생성물 (4.663 g(EXP-20-IQ8160-P2: 0.576 g + EXP-20-IQ8160-2: 4.082 g), 19.2% 수율 (2단계 산화의 합산 수율))을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
LCMS: 다음의 피크를 발견:MS(ESI) m/z=818.5 (M+Na)+ (2.300분).
다중선 기록
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49 - 7.43 (m, 6H), 7.32 - 7.26 (m, 6H), 7.25 - 7.19 (m, 3H), 4.23 (s, 1H), 3.69 - 3.39 (m, 23H), 3.26 - 3.21 (m, 2H), 2.37 - 2.29 (m, 4H), 1.67 - 1.50 (m, 8H), 1.33 (s, 12H).
단계 (8)
Figure pct00118
그 후 건조 디클로로메탄 (150 mL) 중 8-[2-(7-카르복시헵트옥시)-3-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]옥탄산(4.087 g, 5.14 mmol) 및 (Z)-논-2-엔-1-올 (1.75 g, 12.3 mmol)의 용액에 DIPEA (3.99 g, 30.8 mmol), DMAP (0.251 mg, 2.06 mmol)를 첨가하고, 빙조 하에 EDCI(2.56 g, 13.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 0%~40%(25%) 에틸 아세테이트로 용출)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.646 g,1.58 mmol, 30.7% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 - 7.44 (m, 6H), 7.32 - 7.27 (m, 6H), 7.25 - 7.18 (m, 3H), 5.69 - 5.59 (m, 2H), 5.57 - 5.47 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 3.70 - 3.38 (m, 23H), 3.26 - 3.21 (m, 2H), 2.33 - 2.26 (m, 4H), 2.13 - 2.05 (m, 4H), 1.65 - 1.50 (m, 8H), 1.39 - 1.25 (m, 28H), 0.92 - 0.84 (m, 6H).
단계 (9)
Figure pct00119
메탄올 / THF (80 mL, 1/1 v/v) 중 [(Z)-논-2-에닐] 8-[2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.881 g, 1.8 mmol)의 용액에 p-톨루엔술폰산 (1.71 mg, 9.01 mmol)을 실온에서 한꺼번에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. TLC (석유 에테르 중 30% 에틸 아세테이트)는 출발 물질이 완전히 사라졌음을 나타냈다. 5 mL의 트리에틸아민을 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (DCM 중 0%~10% (6%) CH3OH로 용출)로 정제하여 2,3-비스(논-8-에녹시)프로판-1-올 (1.32 g,1.65 mmol,91.4%)을 무색 오일로서 제공하였다.
다중선 기록
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.69 - 5.58 (m, 2H), 5.57 - 5.47 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.7 Hz, 4H), 3.75 - 3.71 (m, 2H), 3.68 - 3.60 (m, 14H), 3.58 - 3.40 (m, 9H), 2.76 (s, 1H), 2.33 - 2.27 (m, 4H), 2.14 - 2.03 (m, 4H), 1.66 - 1.51 (m, 8H), 1.39 - 1.21 (m, 28H), 0.96 - 0.80 (m, 6H).
단계 (10)
Figure pct00120
디클로로메탄 (DCM) 30 mL 중 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]프로폭시]
옥타노에이트 (1.32 g, 1.65 mmol) 및 TEA (트리에틸아민) (0.333 g,3.3 mmol)의 용액에 Ms-Cl (0.283 g, 2.47 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. TLC (CH3OH/DCM 3%)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 물 (10 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 노닐을 제공하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.384 g, 1.57 mmol, 95.5% 수율)를 담황색 액체로서 수득하고, 이를 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.70 - 5.59 (m, 2H), 5.56 - 5.48 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.7 Hz, 4H), 4.40 - 4.36 (m, 2H), 3.78 - 3.75 (m, 2H), 3.68 - 3.63 (m, 12H), 3.58 - 3.40 (m, 9H), 3.08 (s, 3H), 2.33 - 2.27 (m, 4H), 2.14 - 2.05 (m, 4H), 1.64 - 1.51 (m, 8H), 1.40 - 1.25 (m, 28H), 0.92 - 0.84 (m, 6H).
단계 (11)
Figure pct00121
그 후, DMF (25 mL)에 용해시킨 운데실운데실[(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]
프로폭시]옥타노에이트 (1.38 g, 1.57 mmol)의 용액에 Na3N(0.123 g , 1.89 mmol)을 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물을 70℃에서 18시간 동안 교반시켰다.
TCL은 출발 물질이 사라지고 새로운 스폿이 관찰되었음을 보여주었다. 그 후 물 (100 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (100 mL * 2)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하고, 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (DCM 중 CH3OH (0~10%) (6%)로 용출)(0.995 g,1.2 mml, 76.5% 수율) (무색 액체로서).
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.71 - 5.59 (m, 2H), 5.58 - 5.46 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 3.69 - 3.66 (m, 10H), 3.64 (s, 3H), 3.59 - 3.37 (m, 12H), 2.32 - 2.27 (m, 4H), 2.14 - 2.05 (m, 4H), 1.63 - 1.50 (m, 8H), 1.39 - 1.25 (m, 28H), 0.92 - 0.85 (m, 6H).
단계 (12)
Figure pct00122
THF(20 mL) / 물(0.6 mL) 중 운데실 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (0.995 g, 1.2 mmol) 및 트리페닐포스핀 (0.474 g, 1.81 mmol)의 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반시켰다. TLC (닌히드린, 디클로로메탄 중 3% 메탄올)는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 제거하고, DCM에 첨가하고, 그 후 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하고, 이를 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 CH3OH(0~20%(14%))로 용출)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (0.689 g, 0.861 mmol, 71.5% 수율)를 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.70 - 5.60 (m, 2H), 5.57 - 5.48 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.7 Hz, 4H), 3.72 - 3.38 (m, 25H), 2.94 - 2.87 (m, 2H), 2.32 - 2.28 (m, 4H), 2.14 - 2.06 (m, 4H), 1.65 - 1.51 (m, 8H), 1.38 - 1.26 (m, 28H), 0.91 - 0.85 (m, 6H).
단계 (13)
Figure pct00123
[(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (190 mg, 0.237 mmol)를 10 mL의 무수 DCM에 용해시키고, 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (124 mg, 0.95 mmol) (1 mL의 무수 DMF 중) 및 DIPEA (153 mg, 1.19 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피 (40 g 컬럼, DCM/MeOH 0%~15%) (디클로로메탄 중 메탄올 (4%)로 용출)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (112 mg, 0.119 mmol, 50.1% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.71 - 7.56 (m, 3H), 5.70 - 5.59 (m, 2H), 5.57 - 5.47 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 3.67 - 3.39 (m, 25H), 2.33 - 2.27 (m, 4H), 2.13 - 2.05 (m, 4H), 1.64 - 1.50 (m, 8H), 1.41 - 1.25 (m, 28H), 0.92 - 0.84 (m, 6H).
LCMS: MS (ESI) m/z=895.7 (M+H)+
실시예 13 : 2-부틸옥틸 8-[2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (화합물 XIV)의 합성
Figure pct00124
(XIV)
도 8에 예시된 바와 같이 반응식 8에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (XIV)을 합성하였다.
화합물 (XIV)의 합성
단계 (1)
Figure pct00125
질소 하에 건조 디클로로메탄 (600 mL) 중 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에탄올 (50 g, 0.176 mol) 및 트리에틸아민 (36.2 g, 0.352 mol)을 0℃까지 냉각시켰다. 메탄술포닐 클로라이드 (30.6 g, 0.264 mol)를 0℃에서 이 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온까지 가온하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 트리에틸아민 히드로클로라이드를 여과 제거하고, 상기 DCM 용액을 0.1 N HCl로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거하여 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (62 g, 92%)를 연한 황색 오일로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS MS 363 (M+H)
단계 (2)
Figure pct00126
THF (600 mL) 중 (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메탄올 (62 g, 0.171 mol)의 용액에 NaH (6.17 g, 0.257 mol)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 가열하여 환류시켰다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (25.0 g, 0.171 mol)를 첨가하고 (질소 하에), 반응물을 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 20~50% 에틸 아세테이트로 용출)를 통해 정제하여 4-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 (43 g, 71 % 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
LCMS MS 421(M+Na)
단계 (3)
Figure pct00127
AcOH (200 mL) 및 물 (200 mL) 중 4-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 (43 g, 0.103 mol)의 혼합물. 상기 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 제거하여 3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판-1,2-디올 (36 g, 95% 수율)을 연한 황색 오일로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS MS 381(M+Na)
단계 (4)
Figure pct00128
THF (200 mL) 중 3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판-1,2-디올 (20 g, 0.050 mol)의 용액에 NaH (8.03 g, 0.201 mol)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 가열하여 환류시켰다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 9-브로모논-1-엔 (26.6 g, 0.126 mol)을 첨가하고 (질소 하에), 반응물을 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 10~30% 에틸 아세테이트로 용출)를 통해 정제하여 2-[2-[2-[2-[2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시메틸벤젠 (8.8 g, 26 % 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 5.87 - 5.73 (m, 2H), 5.04 - 4.87 (m, 4H), 4.57 (s, 2H), 3.71 - 3.59 (m, 16H), 3.59 - 3.38 (m, 9H), 2.03 (q, J = 6.5 Hz, 4H), 1.60 - 1.49 (m, 4H), 1.41 - 1.28 (m, 16H).
단계 (5)
Figure pct00129
MeCN (80 mL), CCl4 (80 mL) 및 물 (80 mL) 중 2-[2-[2-[2-[2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시]에톡시]에톡시]
에톡시]에톡시메틸벤젠 (8.5 g, 0.0140 mol)의 용액에 NaIO4 (24.9 g, 0.116 mol) 및 RuCl3 (0.66 g, 2.93 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. LCMS는 표제 화합물이 주요 생성물임을 나타냈다. 반응물을 여과시키고, 여과액을 에틸 아세테이트 (600 mL)로 희석시키고, 1 N 수성 HCl (200 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (8.7 g, 97% 수율)을 황색 오일로서 제공하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.31 (dd, J = 22.6, 3.2 Hz, 5H), 4.57 (s, 2H), 3.71 - 3.61 (m, 19H), 3.59 - 3.38 (m, 11H), 2.32 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.68 - 1.47 (m, 10H), 1.32 (s, 14H).
단계 (6)
Figure pct00130
질소 하에 디클로로메탄 (500 mL) 중 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (0.0135 mol, 8.7 g) 및 2-부틸옥탄-1-올 (0.0324 mol, 6.04 g)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.081 mol, 10.47 g ), 4-디메틸아미노피리딘 (5.4 mmol, 0.66 g) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (0.0351 mol, 6.73 g)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 유기 층을 1 N HCl로 세척하였다. 그 후 유기 층을 염수로 세척하고, 그 후 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 0~60% 에틸 아세테이트로 용출)로 정제하여 2-부틸옥틸8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시] (2.3 g, 16.5% 수율) 옥타노에이트를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.28 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 3.96 (d, J = 5.8 Hz, 4H), 3.74 - 3.60 (m, 18H), 3.59 - 3.38 (m, 11H), 2.29 (t, 4H), 1.84 (s, 1H), 1.67 - 1.50 (m, 12H), 1.40 - 1.19 (m, 54H), 0.89 (t, 12H).
단계 (7)
Figure pct00131
에틸 아세테이트 (50 mL) 중 2-부틸옥틸 8-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (2.15 g, 2.2 mmol)에 Pd/C (500 mg, 20% wt/wt)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 하에 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC (에틸 아세테이트/석유 에테르=1/1)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 에틸 아세테이트로 세척하여 2-부틸옥틸 8-[2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]
에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.51 g, 77.1% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.97 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 3.74 - 3.40 (m, 27H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.69 - 1.48 (m, 11H), 1.37 - 1.21 (m, 48H), 0.88 (t, J = 5.3 Hz, 12H).
단계 (8)
Figure pct00132
질소 하에 건조 디클로로메탄 (10 mL) 중 2-부틸옥틸 8-[2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)
에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.0 g, 1.12 mmol) 및 트리에틸아민 (228 mg, 2.25 mmol)을 -5℃까지 냉각시켰다. 건조 디클로로메탄 (10 mL) 중 메탄술포닐 클로라이드 (193 mg, 1.69 mmol)를 0℃에서 이 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온까지 가온하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. TLC (EA:PE=1:1, Rf=0.6)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 트리에틸아민 히드로클로라이드를 여과 제거하고, 상기 DCM 용액을 1 N HCl로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거하여 2-부틸옥틸 8-[2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]
에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.03 g, 94.7% 수율)를 무색 오일로서 수득하고, 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.41 - 4.36 (m, 2H), 3.96 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 3.79 - 3.75 (m, 2H), 3.70 - 3.39 (m, 22H), 3.08 (s, 3H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.67 - 1.49 (m, 11H), 1.39 - 1.18 (m, 48H), 0.89 (t, J = 6.6, 3.8 Hz, 12H).
단계 (9)
Figure pct00133
N,N-디메틸포름아미드 (20 mL) 중 2-부틸옥틸 8-[2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐
옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.0 g, 1.0 eq)에 NaN3 (0.134 g, 2.0 eq)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물 (200 mL)로 켄칭하고, 그 후 에틸 아세테이트 (3*100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜, 정제 없이 2-부틸옥틸 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (900 mg, 95.2% 수율)를 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.97 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 3.72 - 3.37 (m, 26H), 2.30 (t, 4H), 1.66 - 1.50 (m, 11H), 1.37 - 1.23 (m, 48H), 0.89 (t, 12H).
단계 (10)
Figure pct00134
2-부틸옥틸 8-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (0.900 g, 1.0 eq) 및 트리페닐포스핀 (0.775 g, 3.0 eq)을 THF (30 mL) 및 물 (3 mL)에 용해시켰다. 반응물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 반응물을 농축시키고, 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (DCM 중 5%~25% MeOH로 용출)로 정제하여 2-부틸옥틸 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (643 mg, 74% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.98 - 3.95 (m, 4H), 3.68 - 3.40 (m, 26H), 2.94 - 2.90 (m, 2H), 2.36 - 2.32 (m, 4H), 1.66 - 1.51 (m, 11H), 1.35 - 1.23 (m, 48H), 0.89 (t, J = 6.6, 3.9 Hz, 12H).
단계 (11)
Figure pct00135
건조 DCM (70 mL) 중 2-부틸옥틸 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (600 mg, 0.675 mmol)에 N,N-디에틸에탄아민 (0.478 g, 7.0 eq) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (0.353 g, 4.0 eq)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다.
TLC (DCM/MeOH=10:1) 및 LCMS는 출발 물질이 사라졌음을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 그 후 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 0%~20% 메탄올로 용출)로 정제하여 2-부틸옥틸 8-[2-[8-(2-부틸옥톡시)-8-옥소-옥톡시]-3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]
에톡시]에톡시]프로폭시]옥타노에이트 (310 mg, 47% 수율)를 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.62 (t, J = 14.2 Hz, 3H), 3.97 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 3.68 - 3.39 (m, 26H), 2.30 (t, J = 7.6, 1.5 Hz, 4H), 1.66 - 1.51 (m, 11H), 1.44 - 1.14 (m, 48H), 0.88 (t, J = 6.9, 4.0 Hz, 12H).
실시예 14 : N-[2-[2-[2-[2-[3-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필-옥틸-아미노]-3-옥소프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 XV)의 합성
Figure pct00136
(XV)
반응식 13에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (XV)을 합성하였다.
Figure pct00137
Figure pct00138
화합물 (XV)의 합성
단계 (1)
Figure pct00139
DCM (20 mL) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판-1-올 (1.0 g, 1.69 mmol), 트리에틸아민 (0.512 g, 5.06 mmol)의 용액에 메탄술포닐 클로라이드 (0.386 g, 3.37 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 수성 층을 다시 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 메탄술포네이트 (1.1 g, 97%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.37 - 5.32 (m, 3H), 4.25 (dd, J = 10.9, 5.7 Hz, 1H), 3.68 (s, 2H), 3.59 - 3.39 (m, 7H), 3.17 - 3.07 (m, 7H), 3.04 (s, 3H), 2.01 (dd, J = 12.4, 6.6 Hz, 6H), 1.56 (d, J = 4.5 Hz, 4H), 1.37 - 1.22 (m, 45H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 (2)
Figure pct00140
3-2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필 메탄술포네이트 (4.5 g, 6.71 mmol) 및 옥탄-1-아민 (17.3 g, 134 mmol)의 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 (석유 에테르 중 10~50% 에틸 아세테이트로 용출)를 통해 정제하여 N-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필]옥탄-1-아민 (4.2 g, 89% 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 - 5.27 (m, 3H), 3.68 - 3.38 (m, 7H), 2.78 - 2.52 (m, 4H), 2.08 - 1.90 (m, 7H), 1.68 - 1.43 (m, 9H), 1.39 - 1.19 (m, 55H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 9H).
단계 (3)
Figure pct00141
DCM (10 mL) 중 3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (0.4 g, 1.09 mmol), 비스(디메틸아미노)메틸렌-(트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일)옥소늄;헥사플루오로포스페이트 (0.624 g, 1.64 mmol), DIEA (0.283 g, 2.19 mmol) 및 N-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필]옥탄-1-아민 (0.771 g, 1.09 mmol)의 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 DCM (100 mL)에 부었다. 유기 층을 1 N HCl, 포화 NaCl로 세척하고, NaSO4로 건조시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (1:81의 에틸 아세테이트 /석유 에테르로 용출)로 정제하여 tert-부틸 N-[2-[2-[2-[2-[3-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필-옥틸-아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시] 에톡시]에틸]카르바메이트 (0.95 g, 82.5%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.36 (dt, J = 10.6, 4.7 Hz, 3H), 3.84 - 3.16 (m, 31H), 2.69 - 2.61 (m, 2H), 2.07 - 1.93 (m, 6H), 1.60 - 1.47 (m, 6H), 1.44 (s, 9H), 1.23 (d, J = 33.4 Hz, 56H), 0.91 - 0.85 (m, 9H).
단계 (4)
Figure pct00142
DCM (5 mL) 중 tert-부틸 N-[2-[2-[2-[2-[3-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필-옥틸-아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트 (0.95 g, 0.903 mmol)의 혼합물에 TFA (2.06 g, 18.1 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 주위 온도에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시켜 3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-N-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필]-N-옥틸-프로판아미드;2,2,2-트리플루오로아세트산 (0.94 g, 97.7%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.46 - 5.27 (m, 3H), 3.87 - 3.79 (m, 2H), 3.77 - 3.15 (m, 28H), 2.84 - 2.58 (m, 2H), 2.10 - 1.88 (m, 6H), 1.63 - 1.44 (m, 6H), 1.27 (s, 54H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 9H).
단계 (5)
Figure pct00143
DCM (40 mL) 중 3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-N-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필]-N-옥틸-프로판아미드;2,2,2-트리플루오로아세트알데히드 (0.5 g, 0.476 mmol) 및 N,N-디에틸에탄아민 (0.289 g, 2.86 mmol)의 혼합물에 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (0.249 g, 191 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔에서 컬럼 크로마토그래피 (DCM 중 2%~8% MeOH로 용출)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-[3-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로필-옥틸-아미노]-3-옥소-프로폭시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (0.305 g, 61%)를 황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 5.46 - 5.23 (m, 3H), 3.83 - 3.20 (m, 29H), 2.77 - 2.57 (m, 2H), 2.14 - 1.86 (m, 8H), 1.63 - 1.42 (m, 7H), 1.27 (s, 55H), 0.93 - 0.82 (m, 9H).
실시예 15 : N-[2-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일-옥틸아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 XVI)의 합성
Figure pct00144
(XVI)
화합물 (XVI)의 합성
단계 (1)
Figure pct00145
DCM (50 ml) 중 N-[2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]옥탄-1-아민 (2 g, 2.87 mmol)의 용액에 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판산 (2.09 g, 3.45 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (35 mg), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (1.64 g, 4.3 mmol) 및 TEA (581 mg, 5.74 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 DCM (50 ml)으로 처리하고, 물 (250 mlx2), 포화 수성 NaCl (250 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 플래시 (DCM 중 5% MeOH)로 정제하여 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]-N-옥틸-N-[2-[2-[2-[2-(2- 트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]프로판아미드 (2.7 g, 2.17 mmol, 수율 75.6%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46 (d, J = 7.6 Hz, 6H), 7.29 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 7.25 - 7.20 (m, 3H), 5.34 (s, 3H), 4.36 (d, J = 36.5 Hz, 1H), 3.85 - 3.17 (m, 29H), 2.20 - 1.89 (m, 7H), 1.60 - 1.14 (m, 60H), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 9H)
단계 (2)
Figure pct00146
THF/MeOH (20 ml, 1/1) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]-N-옥틸-N-[2-[2-[2-[2-(2- 트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]프로판아미드 (1020 mg, 0.86 mmol)의 용액에 톨루엔-4-술폰산 (822 mg, 4.32 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. TEA (1.5 ml)를 이 혼합물에 첨가하고, 상기 혼합물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10 MeOH%)로 정제하여 N-[2- [2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]-N-옥틸-프로판아미드 (766 mg, 0.8 mmol, 수율 92.6%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.39 - 5.31 (m, 4H), 3.75 - 3.56 (m, 27H), 3.46 - 3.43 (m, 2H), 1.99 (dd, J = 14.3, 7.9 Hz, 8H), 1.55 (dd, J = 11.6, 6.7 Hz, 4H), 1.26 (d, J = 7.0 Hz, 56H), 0.90 - 0.87 (m, 9H).
단계 (3)
Figure pct00147
DCM (10 ml) 중 N-[2-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]-N-옥틸프로판아미드 (860 mg, 0.92 mmol)의 용액에 TEA (185 mg, 1.83 mmol) 및 메탄술포닐 클로라이드 (157 mg, 1.37 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 DCM (50 ml)으로 처리하고, 물 (50 ml), 1 N HCl (50 ml), 포화 수성 NaHCO4 (50 ml), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시켜 2-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일-옥틸아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (806 mg, 0.75 mmol)를 무색 오일로서 제공하였다. EXP-21-IV4334-N2 (621 mg)
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.34 (s, 4H), 4.38 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 3.76 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 3.70 - 3.55 (m, 22H), 3.43 (d, J = 18.9 Hz, 4H), 3.08 (s, 3H), 2.01 (d, J = 5.2 Hz, 8H), 1.56 - 1.50 (m, 4H), 1.27 (s, 56H), 0.88 (t, J = 5.0 Hz, 9H).
단계 (4)
Figure pct00148
DMF (10 ml) 중 2-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일-옥틸아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (806 mg, 0.79 mmol)의 용액에 NaN3 (155 mg, 2.38 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (50 ml)로 처리하고 , 물 (50 ml), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 50% EA)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-2,3-비스[(Z)- 옥타데스-9-에녹시]-N-옥틸-프로판아미드 (400 mg, 0.4 mmol, 수율 50.3%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42 - 5.29 (m, 4H), 4.37 (dt, J = 39.0, 5.4 Hz, 1H), 3.71 - 3.57 (m, 22H), 3.47 - 3.39 (m, 6H), 2.12 - 1.91 (m, 8H), 1.57 - 1.23 (m, 70H), 0.88 (t, J = 5.0 Hz, 9H).
단계 (5)
Figure pct00149
DCM (5 ml) 중 N-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]-N-옥틸프로판아미드 (420 mg, 0.45 mmol )의 용액에 DIEA (290 mg, 2.24 mmol) 및 1H-이미다졸-4- 카르보닐 클로라이드 (234 mg, 1.79 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 DCM (50 ml)으로 처리하고, 물 (50 ml), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 0~10% MeOH)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]프로파노일-옥틸-아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드 (278 mg, 0.26 mmol, 수율 58.8%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (s, 1H), 7.59 (d, J = 17.0 Hz, 1H), 7.52 (s, 1H), 5.34 (s, 4H), 4.33 (s, 1H), 3.71 - 3.36 (m, 28H), 2.01 (d, J = 5.4 Hz, 8H), 1.27 (s, 60H), 0.88 (t, J = 5.2 Hz, 9H)
실시예 16 : 6-[2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트 (화합물 XVII)의 합성
Figure pct00150
(XVII)
도 9에 예시된 바와 같이 반응식 9에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (XVII)을 합성하였다.
화합물 (XVII)의 합성
단계 (1)
Figure pct00151
DCM (150 mL) 중 6-브로모헥산-1-올 (10 g, 55.2 mmol) 및 3,4-디히드로-2H-피란 (4.78 g, 56.9 mmol)의 용액에 PPTS (1.61 g,6.41 mmol)를 첨가하고, 그 후 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. TLC (EA/PE 9/1, SM Rf: 0.2; 생성물, Rf: 0.7)는 모든 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 용매를 농축시키고, 플래시 크로마토그래피 컬럼 (PE 중 0~10% EA (5%))으로 정제하여 2-(6-브로모헥속시)테트라히드로피란 (12.72 g, 48 mmol, 86.9% 수율)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.60 - 4.53 (m, 1H), 3.90 - 3.83 (m, 1H), 3.77 - 3.71 (m, 1H), 3.53 - 3.47 (m, 1H), 3.44 - 3.35 (m, 3H), 1.93 - 1.79 (m, 3H), 1.76 - 1.67 (m, 1H), 1.65 - 1.36 (m, 10H).
단계 (2)
Figure pct00152
0℃의 건조 디클로로메탄 (100 mL) 중 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에탄올 (10 g, 35.2 mmol) 및 트리에틸아민 (7.12 g, 70.3 mmol)의 용액에 건조 DCM (10 mL) 중 메탄술포닐 클로라이드 (6.04 g, 52.8 mmol)를 적가하였다. 상기 혼합물을 실온까지 가온하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 트리에틸아민 히드로클로라이드를 여과 제거하고, 상기 DCM 용액을 0.1 N HCl로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거하여 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (12.7 g, 35 mmol, 정량적)를 연한 황색 오일로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.35 - 7.26 (m, 5H), 4.56 (s, 2H), 4.38 - 4.34 (m, 2H), 3.77 - 3.73 (m, 2H), 3.69 - 3.61 (m, 12H), 3.06 (s, 3H).
단계 (3)
Figure pct00153
건조 THF (90 mL) 중 (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메탄올 (4.63 g, 35 mmol)의 용액에 NaH (4.2 g, 105 mmol)를 0℃에서 일부씩 첨가하고, 그 후 혼합물을 30분 동안 가열하여 환류시켰다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 건조 THF(30 mL) 중 2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (12.7 g, 35 mmol)를 첨가하고 (질소 하에), 반응물을 80℃에서 24시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (DCM 중 0~5% CH3OH로 용출)를 통해 정제하여 4-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란(7.217 g, 18.1 mmol, 51.7% 수율)을 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 4.32 - 4.23 (m, 1H), 4.07 - 4.02 (m, 1H), 3.75 - 3.70 (m, 1H), 3.69 - 3.61 (m, 16H), 3.60 - 3.54(m, 1H), 3.52 - 3.46 (m, 1H), 1.42 (s, 3H), 1.35 (s, 3H).
단계 (4)
Figure pct00154
AcOH (30 mL) 및 H2O (30 mL) 중 4-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 (7.217 g, 18.1 mmol)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC (EA/PE 1/1, SM Rf: 0.5; 생성물, Rf: 0.1)는 모든 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 용매를 진공 하에 제거하고, 톨루엔과 수 회 공비혼합하였다. 연한 황색 오일로서의 2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (6.48 g, 18.1 mmol, 정량적)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36 - 7.26 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 3.88 - 3.81 (m, 1H), 3.71 - 3.49 (m, 20H).
단계 (5)
Figure pct00155
건조 DMF(40 mL) 중 3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로판-1,2-디올(3.3 g, 9.21 mmol)의 용액에 NaH (1.84 g, 46 mmol)를 0℃에서 수 회 첨가하고, 그 후 혼합물을 30분 동안 80℃까지 가열하였다. 그 후 반응물을 실온까지 냉각시키고, 건조 DMF (20 mL) 중 2-(6-브로모헥속시)테트라히드로피란(6.1 g, 23 mmol)을 첨가하고 (질소 하에), 반응물을 80℃에서 18시간 동안 가열하였다. TLC는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (DCM 중 0~5% CH3OH로 용출)를 통해 정제하여 2-[6-[1-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2-(6-테트라히드로피란-2-일옥시헥속시)에톡시]헥속시]테트라히드로피란 (2.834 g, 3.9 mmol, 42.3% 수율)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.35 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (d, J = 1.0 Hz, 4H), 3.90 - 3.83 (m, 2H), 3.78 - 3.30 (m, 31H), 1.75 - 1.65 (m, 3H), 1.63 - 1.49 (m, 17H), 1.41 - 1.34 (m, 8H).
단계 (6)
Figure pct00156
EtOH (70 mL) 중 2-[6-[1-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시메틸]-2-(6-테트라히드로피란-2-일옥시헥속시)에톡시]헥속시]테트라히드로피란 (2.834 g, 3.9 mmol)의 용액에 p-톨루엔술폰산 (0.742 g, 3.9 mmol)을 실온에서 한꺼번에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. TLC (DCM 중 4% CH3OH)는 출발 물질이 완전히 사라졌음을 나타냈다. 반응물을 묽은 중탄산나트륨 용액 (150 mL)으로 켄칭한 후, 용매를 EA (2*100 mL)로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (DCM 중 0%~5% CH3OH (4%)로 용출)로 정제하여 6-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(6-히드록시헥속시)프로폭시]헥산-1-올 (1.435 g, 2.57 mmol,65.9% 수율)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 3.70 - 3.39 (m, 29H), 1.67 - 1.53 (m, 9H), 1.40 - 1.35 (m, 7H).
단계 (7)
Figure pct00157
건조 디클로로메탄 (30 mL) 중 6-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-(6-히드록시헥속시)프로폭시]헥산-1-올 (1.435 g, 2.57 mmol) 및 2-부틸옥탄산 (1.54 g, 7.7 mmol)의 용액에 DIPEA (1.99 g, 15.4 mmol), DMAP (0.126 g, 1.03 mmol)를 첨가하고, 빙조 하에 EDCI (1.28 g, 6.68 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응물을 NaHCO3 (30 mL)으로 켄칭하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (DCM 중 0%~5% (3%) CH3OH로 용출)로 정제하여 6-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]프로폭시]
헥실 2-부틸옥타노에이트 (1.816 g(P:1.15 g+NP:0.666g ),1.97 mmol, 76.6% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36 - 7.27 (m, 5H), 4.57 (s, 2H), 4.10 - 4.01 (m, 4H), 3.72 - 3.61 (m, 16H), 3.60 - 3.40 (m, 9H), 2.35 - 2.26 (m, 2H), 1.66 - 1.52 (m, 12H), 1.47 - 1.20 (m, 36H), 0.92 - 0.83 (m, 12H).
단계 (8)
Figure pct00158
EtOAc (20 mL) 중 6-[3-[2-[2-[2-(2-벤질옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트 (1.15 g,1.25 mmol)의 용액을 N2로 10분 동안 퍼지하고, Pd/C (230 mg)를 첨가하고, N2로 퍼지하면서 반응을 계속하였다. 그 다음, 반응물을 진공 하에 소기시키고, H2로 3회 백필링하였다(backfilled). 그 다음, 반응물을 H2 분위기 하에 실온에서 하룻밤 교반시켰다. TLC (DCM 중 5% CH3OH)는 반응이 종료되었음을 보여준다. 슬러리를 셀라이트를 통해 여과시키고, 셀라이트를 EtOAc로 수 회 헹구었다. 그 다음, 합한 유기물을 진공에서 농축시켜 6-[2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트(1.0 g, 1.2 mmol, 96.4% 수율)를 무색 액체로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.09 - 4.03 (m, 4H), 3.76 - 3.39 (m, 25H), 2.82 (s, 1H), 2.35 - 2.26 (m, 2H), 1.67 - 1.52 (m, 12H), 1.47 - 1.21 (m, 36H), 0.92 - 0.83 (m, 12H).
단계 (9)
Figure pct00159
디클로로메탄 (DCM) 10 mL 중 6-[2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트(0.6 g, 0.72 mmol) 및 TEA (트리에틸아민) (0.146 g,1.44 mmol)의 용액에 Ms-Cl (0.124 g, 1.08 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. TLC (CH3OH/DCM 3%)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 물 (10 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 노닐을 제공하여 6-[2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트(0.582 g, 0.639 mmol, 88.7% 수율)를 담황색 액체로서 수득하고, 이를 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.41 - 4.36 (m, 2H), 4.08 - 4.02 (m, 4H), 3.78 - 3.74 (m, 2H), 3.71 - 3.39 (m, 21H), 3.08 (s, 3H), 2.35 - 2.25 (m, 2H), 1.64 - 1.55 (m, 12H), 1.47 - 1.20 (m, 36H), 0.91 - 0.84 (m, 12H).
단계 (10)
Figure pct00160
그 후, DMF (10 mL)에 용해시킨 6-[2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트 (0.582 g, 0.639 mmol)의 용액에 Na3N (50 m g , 0.766 mmol)을 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물을 70℃에서 18시간 동안 교반시켰다. TCL은 출발 물질이 사라지고 새로운 스폿이 관찰되었음을 보여주었다. 그 후 물 (100 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (100 mL * 2)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하고, 이를 컬럼 크로마토그래피 (DCM 중 CH3OH (0~10%)(4%)로 용출)로 정제하여 6-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트 (0.409 g,0.477 mmol, 74.6% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.09 - 4.03 (m, 4H), 3.70 - 3.62 (m, 14H), 3.60 - 3.37 (m, 11H), 2.34 - 2.26 (m, 2H), 1.63 - 1.53 (m, 12H), 1.46 - 1.21 (m, 36H), 0.91 - 0.84 (m, 12H).
단계 (11)
Figure pct00161
THF(10 mL) / 물(0.3 mL) 중 6-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트 (0.409 g, 0.477 mmol) 및 트리페닐포스핀 (0.187 g, 0.715 mmol)의 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반시켰다. TLC (닌히드린, 디클로로메탄 중 3% 메탄올)는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 제거하고, DCM에 첨가하고, 그 후 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하고, 이를 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 CH3OH(0~20%(14%))로 용출)로 정제하여 6-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트(0.300 g, 0.237 mmol, 75.6% 수율)를 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.09 - 4.03 (m, 4H), 3.70 - 3.41 (m, 23H), 2.91 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.46 (s, 2H), 2.34 - 2.27 (m, 2H), 1.68 - 1.51 (m, 12H), 1.46 - 1.21 (m, 36H), 0.92 - 0.84 (m, 12H).
단계 (12)
Figure pct00162
6-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)
헥속시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트(300 mg, 0.36 mmol)를 10 mL의 무수 DCM에 용해시키고, 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (188 mg, 1.44 mmol) (1 mL의 무수 DMF 중) 및 DIPEA (233 mg, 1.80 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피 (25 g 컬럼, DCM/MeOH 0%~5%) (디클로로메탄 중 메탄올 (4%)로 용출)로 정제하여 6-[2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트(259 mg, 0.266 mmol, 73.7% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
LCMS: EXP-21-IX3021-29498-LCMSA020 다음의 피크를 발견: MS(ESI) m/z=926.8/927.8 (M+H)+ (2.854분)
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.77 - 7.56 (m, 3H), 4.09 - 4.02 (m, 4H), 3.69 - 3.39 (m, 25H), 2.34 - 2.27 (m, 2H), 1.65 - 1.53 (m, 12H), 1.46 - 1.22 (m, 36H), 0.91 - 0.84 (m, 12H).
실시예 17 : N-[2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H이미다졸-4-카르복스아미드 (화합물 XVIII)의 합성
Figure pct00163
(XVIII)
화합물 (XVIII)의 합성
단계 (1)
Figure pct00164
DCM (40 ml) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판-1-올 (5 g, 8.43 mmol)의 용액에 Dess-Martin 퍼요오디난 (5.05 g, 10.1 mmol)을 0℃에서 5분 동안 첨가하였다. 그 후 상기 혼합물을 N2 하에 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 DCM (40 ml)으로 처리하고, NaHCO3/Na2S2O3(1/1) (50 ml x3), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 10% EA)로 정제하여 2,3-비스[(Z)- 옥타데스-9-에녹시]프로판알 (3.04 g,5.04 mmol, 수율 59.8%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.73 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 5.41 - 5.31 (m, 4H), 3.85 - 3.77 (m, 1H), 3.75 - 3.64 (m, 2H), 3.58 (tt, J = 9.3, 4.6 Hz, 2H), 3.49 - 3.40 (m, 2H), 2.21 - 1.91 (m, 8H), 1.64 (dd, J = 14.1, 7.0 Hz, 2H), 1.57 - 1.48 (m, 2H), 1.26 (d, J = 4.4 Hz, 44H), 0.88 (dd, J = 8.7, 5.0 Hz, 6H).
단계 (2)
Figure pct00165
무수 THF (5 ml) 중 Mg (3.75 g) 및 I2 (1.31 g)의 용액에 1-브로모도데칸 (2.56 g, 10.28 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 N2 하에 70℃에서 혼합물이 무색인 것으로 될 때까지 교반시켰다. 1-브로모도데칸 ( 10.24 g, 41.12 mmol)을 상기 반응물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 무수 THF (45 ml) 중 2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로판알 (3.04 g, 5.14 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 7℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (150 ml)로 처리하고, 물 (150 ml x2), 포화 수성 NaCl (150 ml)로 세척하였다. 유기물을 플래시 (PE 중 5% EA)로 정제하여 1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]펜타데칸-3-올 (3.97 g, 5.21 mmol, 수율 100%)을 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.40 - 5.31 (m, 3H), 3.76 - 3.36 (m, 7H), 3.31 - 3.23 (m, 1H), 2.03 - 1.94 (m, 6H), 1.64 - 1.57 (m, 2H), 1.54 - 1.50 (m, 2H), 1.27 (d, J = 12.1 Hz, 66H), 0.87 (d, J = 6.7 Hz, 9H).
단계 (3)
Figure pct00166
THF (20 ml) 중 1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]펜타데칸-3-올 (1 g, 1.31 mmol)의 용액에 NaH (210 mg, 5.25 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (1.01 g, 1.97 mmol)를 이 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 70℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (150 ml)로 처리하고, 물 (150 ml x2), 포화 수성 NaCl (150 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 10% EA)로 정제하여 [2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)- 옥타데스-9-에녹시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시-디페닐-메틸]벤젠 (1.08 g, 0.9 mmol, 수율 68.3%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.48 - 7.44 (m, 6H), 7.28 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 7.22 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 5.39 - 5.31 (m, 3H), 3.73 - 3.54 (m, 16H), 3.50 - 3.32 (m, 6H), 3.23 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.04 - 1.93 (m, 7H), 1.53 (s, 4H), 1.37 - 1.18 (m, 66H), 0.89 - 0.85 (m, 9H). EXP-21-IV4361-N2 (571 mg, 수율 24%)
단계 (4)
Figure pct00167
THF/MeOH (20 ml 1/1) 중 [2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시-디페닐메틸]벤젠 (1.65 g, 1.4 mmol)의 용액에 톨루엔-4-술폰산 (1.33 g, 6.99 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, EA (150 ml)로 처리하고, 포화 수성 NaHCO3 (150 ml x2), 포화 수성 NaCl (150 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 50% EA)로 정제하여 2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에탄올 (1.18 g, 1.23 mmol, 수율 87.8%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.31 (m, 3H), 3.74 - 3.54 (m, 18H), 3.50 - 3.33 (m, 6H), 2.59 (dd, J = 9.7, 6.0 Hz, 1H), 2.04 - 1.93 (m, 7H), 1.57 - 1.22 (m, 70H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H).
단계 (5)
Figure pct00168
DCM (15 ml) 중 2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에탄올 (1.1 g, 1.17 mmol)의 용액에 TEA (297 mg, 2.93 mmol) 및 메탄술포닐 클로라이드 (269 mg, 2.35 mmol)를 0℃에서 5분 동안 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 DCM (50 ml)으로 처리하고, 물 (50 ml x2), 1 N HCl (50 ml), 포화 수성 NaHCO3 (50 ml)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시켜 2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (860 mg, 0.8 mmol, 수율 70.7%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.39 - 5.31 (m, 3H), 4.40 - 4.36 (m, 2H), 3.77 - 3.56 (m, 16H), 3.49 - 3.34 (m, 6H), 3.07 (s, 3H), 2.06 - 1.91 (m, 7H), 1.56 - 1.51 (m, 4H), 1.35 - 1.21 (m, 66H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H).
단계 (6)
Figure pct00169
DMF (10 ml) 중 2-[2-[2-[2-[2-[2,3-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]프로파노일-옥틸아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (860 mg, 0.85 mmol)의 용액에 NaN3 (165 mg, 2.54 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (50 ml)로 처리하고, 물 (50 ml), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 50% EA)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-2,3-비스[(Z)- 옥타데스-9-에녹시]-N-옥틸-프로판아미드 (657 mg, 0.65 mmol, 수율 77.4%%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.40 - 5.30 (m, 3H), 3.78 - 3.28 (m, 24H), 2.04 - 1.92 (m, 7H), 1.56 - 1.20 (m, 70H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H).
단계 (7)
Figure pct00170
THF/물 (20 ml/0.6ml) 중 (Z)-1-[3-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]-2-[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]펜타데콕시]옥타데스-9-엔 (657 mg, 0.68 mmol)의 용액에 트리페닐 포스핀 (269 mg, 1 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10%~20% MeOH)로 정제하여 2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에탄아민 (560 mg, 0.59 mmol, 수율 85.8%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.41 - 5.31 (m, 3H), 3.77 - 3.33 (m, 22H), 2.89 (dt, J = 12.6, 5.0 Hz, 2H), 2.06 - 1.90 (m, 7H), 1.57 - 1.51 (m, 4H), 1.48 - 1.15 (m, 66H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H).
단계 (8)
Figure pct00171
DCM (20 ml) 중 2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-에녹시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에탄아민 (560 mg, 0.6 mmol)의 용액에 DIEA (386 mg, 3 mmol) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (312 mg, 2.39 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 DCM (50 ml)으로 처리하고, 물 (50 ml), 염수 (50 ml x2)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10% MeOH)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-[1-[1,2-비스[(Z)-옥타데스-9-엔옥시]에틸]트리데콕시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]-1H-이미다졸-4-카르복스아미드(348 mg, 0.32 mmol)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.65 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H), 5.40 - 5.31 (m, 3H), 3.80 - 3.30 (m, 24H), 2.06 - 1.93 (m, 7H), 1.60 - 1.17 (m, 70H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 9H).
실시예 18 : 비스(2-부틸옥틸) 10-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸-노닐-아미노]노나데칸디오에이트;히드로클로라이드 (화합물 XIX)의 합성
Figure pct00172
(XIX)
화합물 (XIX)의 합성을 하기 반응식 (10)에 따라 수행하였다.
Figure pct00173
화합물 (XIX)의 합성
단계 (1)
Figure pct00174
디에틸 3-옥소펜탄디오에이트 (20 g) 및 20% 소듐 에톡시드-에탄올 용액 (33.5 g)의 혼합물을 80℃에서 20분 동안 교반시키고, 그 후 에틸 8-브로모옥타노에이트 (25 g)를 여기에 첨가하고, 혼합물을 4시간 동안 교반시켰다. 20% 소듐 에톡시드-에탄올 용액 (33.5 g)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 5분 동안 교반시키고, 그 후 에틸 8-브로모옥타노에이트 (25 g)를 여기에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 그 후 헥산 및 20% 염화암모늄 수용액 (110 mL)을 여기에 첨가하고, 유기 층을 분리하고, 용매를 감압 하에 증류 제거하여 테트라에틸 9-옥소헵타데칸-1,8,10,17-테트라카르복실레이트 (51.5 g)를 조 생성물로서 수득하였다.
LCMS Rt =2.194
단계 (2)
Figure pct00175
수득된 테트라에틸 9-옥소헵타데칸-1 ,8,10,17-테트라카르복실레이트 (25 g), 아세트산 (40 mL), 및 30% 수성 염산 용액 (80 mL)의 혼합물을 115℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 그 후 용매를 감압 하에 증류 제거하고, 물 및 아세톤을 잔사에 첨가하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물 및 아세톤으로 세척하고, 그 후 감압 하에 건조시켜 10-옥소노난 데칸디오익산 (0.6 g)을 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.97 (s, 2H), 2.38 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 2.18 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.54 - 1.35 (m, 8H), 1.23 (s, 16H).
단계 (3)
Figure pct00176
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (8.53g)를 10-옥소노난 데칸디오익산 (6.10 g), 2-부틸옥탄-1-올 (6.63 g), 트리에틸아민 (12.5 mL), 4-디메틸아미노피리딘 (2.17 g), 및 디클로로메탄 (60 mL)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반시켰다. 10% 황산수소칼륨 수용액 (120 mL), 헥산 (60 mL), 및 에틸 아세테이트 (60 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 유기 층을 분리하고, 그 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압 하에 증류 제거하였다. 수득된 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트-헥산)로 정제하여, 비스(2-부틸옥틸)IO-옥소노난 데칸디오에이트 (6 mg)를 무색 유성 물질로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.97 (d, J = 5.8 Hz, 4H), 2.37 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.71 - 1.43 (m, 11H), 1.28 (d, J = 1.2 Hz, 49H), 0.89 (tt,J = 6.6, 4.1 Hz, 12H).
단계 (4)
Figure pct00177
비스(2-부틸옥틸)IO-옥소노난 데칸디오에이트 (2.3 g) 및 Boc-1-아미노-3,6-8-옥탄디아민디옥사 디아민 (1;27 g)의 혼합물을 실온에서 15분 동안 디클로로메탄에서 교반시켰다. 그 후 소듐 트리아세토보로히드라이드 (0.76 g) 및 아세트산 (0.21 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 교반시켰다. 디클로로메탄 (25 mL)으로 희석시킨 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 (NaHCO3)으로 세척하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매의 제거 후, 잔사를 플래시 크로마토그래피 (DCM/MeOH/TEA, 85/15/1, (v,v,v))로 정제하여 비스(2-부틸옥틸)-10-[2-[2-[2-(ter-부톡시카르보닐아미노]에톡시]에틸아미노]노나데칸디오에이트를 무색 유성 물질로서 수득하였다.
단계 (5)
Figure pct00178
비스(2-부틸옥틸)-10-[2-[2-[2-(ter-부톡시카르보닐아미노]에톡시]에틸아미노]노나데칸디오에이트 (0.5 g) 및 노나날 (0.18 g)의 혼합물을 실온에서 15분 동안 디클로로메탄에서 교반시켰다. 그 후 소듐 트리아세토보로히드라이드 (0.174 g) 및 아세트산 (0.05 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 8시간 교반시켰다. 디클로로메탄 (20 mL)으로 희석시킨 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 (NaHCO3)으로 세척하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 용매의 제거 후, 잔사를 플래시 크로마토그래피 (헵탄 / AcOEt (구배 0~50%))로 정제하여 비스(2-부틸옥틸) 10-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸-노닐-아미노]노나데칸디오에이트를 무색 유성 물질로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.83 - 0.88 (m, 15 H), 1.14 - 1.43 (m, 82 H), 1.46 - 1.59 (m, 6 H), 2.23 - 2.29 (m, 4 H), 2.34 - 2.36 (m, 2 H), 3.01 - 3.07 (m, 2 H), 3.30 - 3.34 (m, 4 H), 3.46 (s, 4 H), 3.91 (dd, J=6, 2 Hz, 4 H), 6.47 - 6.75 (m, 1 H), 유사 분자 이온 m/z =1038, 체류 시간 (분) = 2,37
단계 (6)
Figure pct00179
A 비스(2-부틸옥틸) 10-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸-노닐-아미노]노나데칸디오에이트 (0.080 g)를 디클로로메탄 (5 mL)에서 희석시켰다. 그 후 염화수소산 용액 (디옥산 중 4 M, 5 당량)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매의 제거 후, 잔사를 이소프로필 에테르 (3 mL)와 함께 교반시키고, 여과시키고, 건조시켜 비스(2-부틸옥틸) 10-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸-노닐-아미노]노나데칸디오에이트;히드로클로라이드를 흡습성 백색 고체로서 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.79 - 0.92 (m, 15 H), 1.14 - 1.59 (m, 72 H), 1.62 - 1.88 (m, 3 H), 2.27 (t, J=7 Hz, 5 H), 2.90 - 3.01 (m, 2 H), 3.01 - 3.12 (m, 2 H), 3.13 - 3.29 (m, 3 H), 3.54 - 3.66 (m, 6 H), 3.77 - 3.87 (m, 2 H), 3.92 (d, J=6 Hz, 4 H), 7.89 - 8.21 (m, 3 H), 9.51 (br s, 1 H). 유사 분자 이온 m/z = 937, 체류 시간 (분) = 2,17
단계 (7)
Figure pct00180
비스(2-부틸옥틸) 10-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸-노닐-아미노]노나데칸디오에이트;히드로클로라이드 (0.011 g), 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (0.023 g)의 혼합물 (디클로로메탄 (3 mL)에 의한 용액 상태)을 실온에서 교반시켰다. 그 후 트리에틸아민 (0.038 mL)을 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 디클로로메탄 (20 mL)으로 희석시킨 후, 반응 혼합물을 물로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시켰다. 용매의 제거 후, 잔사를 플래시 크로마토그래피 (DCM / MeOH = 92 / 2 및 95 / 5 (v / v))로 정제하여 비스(2-부틸옥틸) 10-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸-노닐-아미노]노나데칸디오에이트를 황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.73 - 0.91 (m, 15 H), 1.03 - 1.38 (m, 68 H), 1.41 - 1.63 (m, 6 H), 2.26 (t, J=7 Hz, 4 H), 2.77 - 3.18 (m, 9 H), 3.34 - 3.40 (m, 2 H), 3.43 - 3.57 (m, 6 H), 3.91 (dd, J=6, 3 Hz, 4 H), 7.58 (dd), 유사 분자 이온 m/z = 1031, 체류 시간 (분) = 2,45.
실시예 19 : 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4- 카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥틸]아미노]옥타노에이트 (화합물 XX)의 합성
Figure pct00181
(XX)
반응식 11에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (XX)을 합성하였다.
Figure pct00182
화합물 (XX)의 합성
단계 (1)
Figure pct00183
건조 DCM (10 mL) 중 노닐 8-[2-히드록시에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.00 g, 1.41 mmol) 및 3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (0.772 g,2.11 mmol)의 용액에 DMAP (17.2 mg,0.141 mmol), DIPEA (0.218 g,1.69 mmol)를 첨가하고, 그 후 EDCI(0.324 g,1.69 mmol)를 첨가하였다 (0℃에서). 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC는 출발 물질이 사라지고 새로운 스폿이 형성되었음을 나타냈다. 물 (20 mL)을 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 혼합물을 DCM (50 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 포화 중탄산나트륨으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM 중 0~5% CH3OH (3%))로 정제하여 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시] 에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.126 g, 1.06 mmol, 75.6 %수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.07 (s, 1H), 4.92 - 4.81 (m, 1H), 4.16 - 4.02 (m, 4H), 3.78 - 3.72 (m, 2H), 3.68 - 3.58 (m, 12H), 3.58 - 3.50 (m, 2H), 3.37 - 3.26 (m, 2H), 2.71 - 2.57 (m, 4H), 2.47 - 2.38 (m, 4H), 2.33 - 2.24 (m, 4H), 1.66 - 1.56 (m, 6H), 1.53 - 1.22 (m, 65H), 0.92 - 0.83 (m, 9H).
단계 (2)
Figure pct00184
노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]
프로파노일옥시]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트(1.13 g, 1.06 mmol)를 10 mL의 DCM에 용해시키고, 그 후 TFA (4 mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 교반시켰다. TLC(DCM 중 3% CH3OH)는 반응이 완료되었음을 보여준다. 용매를 증발시키고 (50 mL DCM*2), 그 후 DCM (100 mL)에 용해시키고, 포화 NaHCO3 (10 mL)으로 세척하고, 유기 층을 분리하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 용매를 제거하여 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]
에톡시]프로파노일옥시]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.0 g, 1.04 mmol, 98.1% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.90 - 4.82 (m, 1H), 4.15 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.76 (dd, J = 10.8, 5.0 Hz, 4H), 3.72 - 3.61 (m, 12H), 3.14 - 3.09 (m, 2H), 2.73 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.51 - 2.42 (m, 4H), 2.28 (dd, J = 14.1, 7.3 Hz, 4H), 1.67 - 1.36 (m, 14H), 1.35 - 1.22 (m, 48H), 0.90 - 0.84 (m, 9H).
단계 (3)
Figure pct00185
노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트(1.0 g, 1.04 mmol)를 15 mL의 무수 DCM에 용해시키고, 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (545 mg, 4.18 mmol) (1 mL의 무수 DMF 중) 및 DIPEA (675 mg, 5.22 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피 (25 g 컬럼, DCM/MeOH 0%~5%) (디클로로메탄 중 0~5% 메탄올 (4%)로 용출)로 정제하여 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일옥시]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트(542.5 mg, 0.495 mmol, 47.4% 수율)를 담황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 11.22 (s, 1H), 7.63 (s, 3H), 4.86 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.75 - 3.57 (m, 18H), 2.72 (s, 2H), 2.54 (dd, J = 24.0, 17.5 Hz, 6H), 2.28 (dd, J = 13.5, 7.4 Hz, 4H), 1.61 (dd, J = 13.0, 6.5 Hz, 6H), 1.53 - 1.22 (m, 56H), 0.91 - 0.84 (m, 9H).
LCMS: 다음의 피크를 발견: MS(ESI) m/z=1052.9 (M+H)+ (2.278분)
실시예 20 : 6-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4- 카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트 (화합물 XXI)의 합성
Figure pct00186
(XXI)
도 10에 예시된 바와 같이 반응식 11에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (XXI)을 합성하였다.
합성
단계 (1)
Figure pct00187
CH3CN(10 mL) 및 시클로펜틸 메틸 에테르(3 mL) 중 2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에탄올(0.450 g,1.90 mmol) 및 6-브로모헥실 2-헥실데카노에이트(1.75 g,4.17 mmol) 및 DIPEA(0.539 g,4.17 mmol)의 용액을 65℃에서 72시간 동안 교반시켰다. 반응물을 실온까지 냉각시키고, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔사를 EtOAc (50 mL*2) 및 H2O (20 mL)에 녹였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0~5% MeOH (3%))로 정제하여 6-[6-(2- 헥실데카노일옥시)헥실-[2-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트 (1.082 g,1.18 mmol, 56.2% 수율)를 담황색 오일로서 수득하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.09 - 4.02 (m, 4H), 3.91 - 3.55 (m, 18H), 2.84 (s, 6H), 2.34 - 2.26 (m, 2H), 1.68 - 1.51 (m, 10H), 1.47 - 1.20 (m, 54H), 0.90 - 0.84 (m, 12H).
단계 (2)
Figure pct00188
디클로로메탄 (DCM) 15 mL 중 6-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실-[2-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시] 에톡시]에틸]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트(1.55 g, 1.70 mmol) 및 TEA (트리에틸아민) (0.343 g,3.39 mmol)의 용액에 Ms-Cl (291 mg, 2.54 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. TLC (CH3OH/DCM 4%)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 물 (10 mL)로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 6-[2-[6-(2-부틸옥타노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시] 프로폭시]헥실 2-부틸옥타노에이트(1.592 g, 1.60 mmol, 94.6% 수율)를 황색 오일로서 수득하고, 이를 다음 단계에 직접적으로 사용하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.44 - 4.32 (m, 2H), 4.05 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.91 - 3.52 (m, 16H), 3.17 - 2.36 (m, 9H), 2.35 - 2.25 (m, 2H), 1.67 - 1.52 (m, 10H), 1.48 - 1.19 (m, 54H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 12H).
단계 (3)
Figure pct00189
그 후, DMF(10 mL)에 용해시킨 6-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실-[2-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트 (1.592 g, 1.6 mmol)의 용액에 NaN3(125 m g ,1.92 mmol)을 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물을 70℃에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC는 출발 물질이 사라지고 새로운 스폿이 형성되었음을 나타냈다 (DCM 중 CH3OH (3%)). DMF를 진공 하에 제거하고, 잔사를 H2O(20 mL)로 희석시키고, 그 후 EA(2*50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 염수 (50 mL*3)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 컬럼 (DCM 중 0~4% CH3OH (2%)로 용출)으로 정제하여 6-[2-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트(1.059 g,1.13 mmol, 70.3% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.09 - 4.01 (m, 4H), 3.71 - 3.46 (m, 16H), 3.42 - 3.36 (m, 2H), 2.54 (d, J = 83.2 Hz, 6H), 2.36 - 2.25 (m, 2H), 1.68 - 1.51 (m, 8H), 1.49 - 1.20 (m, 56H), 0.92 - 0.83 (m, 12H).
단계 (4)
Figure pct00190
THF(20 mL) / 물(0.6 mL) 중 6-[2-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트(1.059 g, 1.13 mmol) 및 트리페닐포스핀 (0.443 g, 1.69 mmol)의 혼합물을 20℃에서 16시간 동안 교반시켰다. TLC (디클로로메탄 중 3% 메탄올)는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 용매를 제거하고, 잔사를 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 0~20% CH3OH (14%)로 용출)로 정제하여 6-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트(0.843 g, 0.923 mmol, 81.9% 수율)를 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.10 - 4.01 (m, 4H), 3.71 - 3.50 (m, 16H), 2.93 - 2.86 (m, 2H), 2.70 - 2.62 (m, 2H), 2.51 - 2.41 (m, 4H), 2.34 - 2.27 (m, 2H), 1.67 - 1.51 (m, 8H), 1.48 - 1.21 (m, 56H), 0.92 - 0.83 (m, 12H).
단계 (5)
Figure pct00191
6-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트 (840 mg, 0.92 mmol)를 10 mL의 무수 DCM에 용해시키고, 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (480 mg, 3.68 mmol) 및 DIPEA (594 mg, 4.60 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 용액에 물(10 mL)을 첨가하고, 그 후 이를 DCM으로 추출하고, 유기물을 염수로 세척하고, 그 후 Na2SO4로 건조시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (40 g 컬럼, DCM/MeOH 0%~6%) (디클로로메탄 중 메탄올 (6%)로 용출)로 정제하여 6-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥실-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]헥실 2-헥실데카노에이트 (488.6 mg, 0.461 mmol, 50.1% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.62 (d, J = 7.7 Hz, 3H), 4.10 - 4.00 (m, 4H), 3.71 - 3.52 (m, 18H), 2.72 (d, J = 73.5 Hz, 6H), 2.36 - 2.26 (m, 2H), 1.66 - 1.21 (m, 64H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 12H).
LCMS: EXP-21-IX3047-32609-LCMSA020
실시예 21 : 6 노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일-[8- (1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (화합물 XXII)의 합성
Figure pct00192
화합물 (XXII)
도 11에 예시된 바와 같이 반응식 12에 나타낸 화학에 기초하여 화합물 (XXII)을 합성하였다.
화합물 (XXII)의 합성
단계 (1)
Figure pct00193
무수 DMF (10 mL) 및 무수 DCM (2 mL) 중 노닐 8-[[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.00 g, 1.51 mmol)의 용액에 3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (551 mg,1.51 mmol), HATU(0.859 g,2.26 mmol) 및 DIPEA(0.389 g,3.01 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC (DCM 중 4% 메탄올)는 반응이 종료되었음을 나타냈다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔사를 H2O (20 mL)와 에틸 아세테이트 (2*50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수 (50 mL*3)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 컬럼 (디클로로메탄 중 0%~3%(2%) 메탄올로 용출)으로 정제하여 노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.319 g, 1.3 mmol, 86.4% 수율)를 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.12 (s, 1H), 4.90 - 4.82 (m, 1H), 4.08 - 4.01 (m, 2H), 3.78 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.69 - 3.60 (m, 12H), 3.55 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.36 - 3.16 (m, 6H), 2.62 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.33 - 2.23 (m, 4H), 1.65 - 1.47 (m, 14H), 1.44 (s, 9H), 1.35 - 1.23 (m, 48H), 0.90 - 0.85 (m, 9H).
단계 (2)
Figure pct00194
DCM 10 mL 중 노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.319 g, 1.3 mmol)의 용액에 TFA (4 mL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. TLC (DCM 중 4% CH3OH)는 반응이 종료되었음을 나타냈다 .용매를 제거하고, 디클로로메탄 (50 mL DCM*2)과 함께 공비혼합하고, 그 후 DCM (100 mL)에 용해시키고, 포화 NaHCO3(10 mL)으로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.19 g, 1.24 mmol, 95.1% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.92 - 4.80 (m, 1H), 4.09 - 4.02 (m, 2H), 3.84 - 3.71 (m, 4H), 3.71 - 3.52 (m, 12H), 3.33 - 3.04 (m, 6H), 2.60 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.33 - 2.22 (m, 4H), 1.57 (dd, J = 32.9, 14.6 Hz, 14H), 1.38 - 1.21 (m, 48H), 0.92 - 0.83 (m, 9H).
단계 (3)
Figure pct00195
무수 DCM 10 mL 중 노닐 8-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (600 mg, 0.657 mmol)의 용액에 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (343 mg, 2.63 mmol) (1 mL의 무수 DMF 중) 및 DIPEA (424 mg, 3.28 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 그 후 잔사를 플래시 크로마토그래피 컬럼 (디클로로메탄 중 0%~5% 메탄올 (4%)로 용출)으로 정제하여 노닐 8-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (312.3 mg, 0.294 mmol, 44.8% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.60 (t, J = 23.3 Hz, 2H), 4.91 - 4.83 (m, 1H), 4.09 - 4.02 (m, 2H), 3.80 - 3.51 (m, 18H), 3.31 - 3.16 (m, 4H), 2.60 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.33 - 2.24 (m, 4H), 1.66 - 1.45 (m, 14H), 1.34 - 1.23 (m, 48H), 0.90 - 0.85 (m, 9H).
LCMS: 다음의 피크를 발견: MS(ESI) m/z=1008.8 (M+H)+ (4.616분)
실시예 22 : 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4- 카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥틸]아미노]옥타노에이트 (화합물 XXIII)의 합성
Figure pct00196
(XXIII)
화합물 (XXIII)의 합성
단계 (1)
Figure pct00197
아세토니트릴 중 노닐 8-브로모옥타노에이트 (4.65 g, 0.0133 mol),1-옥틸노닐 8-[2-(tert부톡시카르보닐아미노)에틸아미노]옥타노에이트 (6 g, 0.0111 mol) 및 N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민 (1.72 g, 0.0133 mol)의 용액을 65℃에서 72시간 동안 교반시켰다. 반응물을 실온까지 냉각시키고, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 및 포화 중탄산나트륨에 녹였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4로 건조시키고, 진공에서 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 1%NH4OH, 20% MeOH)로 정제하여 노닐 8-[2-(tert부톡시카르보닐아미노)에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (7.24 g,80.7%수율)를 수득하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.98 (s, 1H), 4.86 (s, 1H), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.14 (s, 2H), 2.49 (s, 2H), 2.38 (s, 4H), 2.31 - 2.24 (m, 4H), 1.61 (dd, J = 14.0, 6.8 Hz, 6H), 1.50 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 1.45 (d, J = 7.2 Hz, 9H), 1.40 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 1.35 - 1.22 (m, 48H), 0.88 (td, J = 6.8, 2.0 Hz, 9H).
단계 (2)
Figure pct00198
빙조 하에 CH2Cl2 (30 mL) 중 [(Z)-논-2-에닐] 8-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸-[(7R,11R)-3,7,11,15- 테트라메틸헥사데실]아미노]옥타노에이트 (3.22 g, 0.00456 mol)의 용액에 TFA(10.4 g)를 적가하고, 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반시켰다. 반응물을 0℃의 포화 NaHCO3으로 켄칭하였다. 유기 층을 포화 NaHCO3, 0.1 M NaOH 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 진공 하에 제거하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[2-아미노에틸-[(7R,11R)-3,7,11,15- 테트라메틸헥사데실]아미노]옥타노에이트 (2.03 g, 수율:73.3%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.90 - 4.82 (m, 1H), 4.10 - 4.02 (m, 2H), 2.79 - 2.69 (m, 2H), 2.50 - 2.45 (m, 2H), 2.43 - 2.38 (m, 3H), 2.32 - 2.25 (m, 4H), 2.11 - 1.99 (m, 4H), 1.66 - 1.57 (m, 6H), 1.55 - 1.47 (m, 4H), 1.46 - 1.38 (m, 4H), 1.37 - 1.19 (m, 51H), 0.95 - 0.81 (m, 9H).
단계 (3)
Figure pct00199
디클로로메탄 (10 ml) 중 노닐 8-[2-아미노에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.33 g, 0.00187 mol)의 용액에 3-[2-[2-[2-[2-(tert부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (0.684 g, 0.00187mol), DIPEA (0.484 g, 0.00375 mol), HATU (1.07 g, 0.00281 mol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 DCM (100 ml)으로 희석시키고, 물 (300 ml x2), 염수 (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 크로마토그래피 컬럼 (석유 에테르 중 20% 에틸 아세테이트로 용출)으로 정제하여 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]에틸-[8- (1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (1.28 g, 수율 64.8%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.14 - 5.06 (m, 1H), 4.91 - 4.81 (m, 1H), 4.09 - 4.01 (m, 2H), 3.80 - 3.70 (m, 3H), 3.68 - 3.59 (m, 14H), 3.56 - 3.50 (m, 2H), 3.41 - 3.22 (m, 4H), 2.51 - 2.41 (m, 4H), 2.32 - 2.24 (m, 4H), 2.05 - 1.85 (m, 2H), 1.65 - 1.57 (m, 6H), 1.53 - 1.40 (m, 17H), 1.37 - 1.22 (m, 48H), 0.92 - 0.83 (m, 9H).
단계 (4)
Figure pct00200
디클로로메탄 (6 mL) 중 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2-(tert부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥틸]아미노]옥타노에이트 (0.275 g, 0.247 mmol)의 용액에 TFA (0.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC (DCM 중 5% 메탄올)는 출발 물질이 소비되었음을 나타냈다. 용매를 제거하고, 잔사를 DCM (50 ml)으로 희석시키고, 0.2 N NaOH 용액 (10 ml), NaHCO3 용액 (10 ml)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-(2- 아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥틸]아미노]옥타노에이트 (0.21 g, 0.198 mmol, 수율 84.4%)를 연한 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.09 - 4.00 (m, 2H), 3.82 - 3.49 (m, 17H), 3.21 - 3.04 (m, 4H), 2.94 - 2.84 (m, 3H), 2.81 - 2.80 (m, 8H), 2.54 - 2.48 (m, 2H), 2.33 - 2.22 (m, 4H), 1.65 - 1.46 (m, 12H), 1.37 - 1.18 (m, 48H), 0.92 - 0.82 (m, 9H).
단계 (5)
Figure pct00201
노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥틸]아미노]옥타노에이트 (580 mg, 0.546 mmol) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드(285 mg, 2.18 mmol)를 15 mL의 무수 DCM에 용해시키고, DIPEA (353 mg, 2.73 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 생성물을 플래시 크로마토그래피 (25 g 컬럼, DCM/MeOH 0%~5%) (디클로로메탄 중 메탄올 (4%)로 용출)로 정제하여 노닐 8-[2-[3-[2-[2-[2-[2- (1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노일아미노]에틸-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥틸]아미노]옥타노에이트 (308 mg,51.6% 수율)를 담황색 오일로서 제공하였다. 이 단계의 생성물을 [(Z)-논-2-에닐] 8-[2-아미노에틸-[(7R,11R)-3,7,11,15- 테트라메틸헥사데실]아미노]옥타노에이트 (단계 2에서 수득됨)와 합하였다
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.72 - 7.56 (m, 3H), 4.93 - 4.77 (m, 1H), 4.11 - 3.99 (m, 2H), 3.78 - 3.42 (m, 20H), 2.94 - 2.59 (m, 6H), 2.53 - 2.43 (m, 2H), 2.31 - 2.24 (m, 4H), 1.64 - 1.56 (m, 9H), 1.53 - 1.48 (m, 4H), 1.34 - 1.23 (m, 49H), 0.90 - 0.85 (m, 9H). LSMC: 526(M+1) 98% UV (214 nm)
1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.72 - 7.56 (m, 3H), 4.93 - 4.77 (m, 1H), 4.11 - 3.99 (m, 2H), 3.78 - 3.42 (m, 20H), 2.94 - 2.59 (m, 6H), 2.53 - 2.43 (m, 2H), 2.31 - 2.24 (m, 4H), 1.64 - 1.56 (m, 9H), 1.53 - 1.48 (m, 4H), 1.34 - 1.23 (m, 49H), 0.90 - 0.85 (m, 9H).
LSMC: 526(M+1) 98% UV (214 nm).
실시예 23 : 6-[2-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4- 카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-3-옥소-프로폭시]헥실 2-헥실데카노에이트 (화합물 XXIV)의 합성
Figure pct00202
(XXIV)
화합물 (XXIV)의 합성
건조 DCM (20 mL) 중 6-[3-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[6-(2-헥실데카노일옥시)헥속시]-3-옥소프로폭시]헥실 2-헥실데카노에이트 (790 mg, 0.71 mmol)에 N,N-디에틸에탄아민 (0.72 g, 7.10 mmol) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (0.74 g, 5.67 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC는 출발 물질이 사라졌음을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 그 후 실리카 겔에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 3%~6% (5%) 메탄올로 용출)로 정제하여 6-[2-[6- (2-헥실데카노일옥시)헥속시]-3-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸옥틸-아미노]-3-옥소-프로폭시]헥실 2-헥실데카노에이트 (570 mg, 66.5% 수율)를 제공하였다.
다중선 기록
1 H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.65 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 4.47 - 4.30 (m, 1H), 4.09 - 4.01 (m, 4H), 3.73 - 3.36 (m, 28H), 2.35 - 2.27 (m, 2H), 1.65 - 1.32 (m, 28H), 1.25 (s, 50H), 0.90 - 0.85 (m, 15H).
실시예 24 : 1-헥실노닐 8-[[8-(1-헥실논옥시)-8-옥소-옥틸]-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]
옥타노에이트 (화합물 XXV)의 합성
Figure pct00203
(XXV)
화합물 (XXV)의 합성
1-헥실노닐 8-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-[8-(1-헥실논옥시)-8-옥소옥틸]아미노]옥타노에이트(780 mg, 0.828 mmol)를 10 mL의 무수 DCM에 용해시키고, 1H-이미다졸-4- 카르보닐 클로라이드 (433 mg, 3.31 mmol) 및 DIPEA (535 mg, 4.14 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 용액에 물(10 mL)을 첨가하고, 그 후 이를 DCM으로 추출하고, 유기물을 염수로 세척하고, 그 후 Na2SO4로 건조시켰다. 잔사를 플래시 크로마토그래피 (40 g 컬럼, DCM/MeOH 0%~6%) (디클로로메탄 중 메탄올 (4%)로 용출)로 정제하여 1-헥실노닐 8-[[8-(1- 헥실논옥시)-8-옥소-옥틸]-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4- 카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]옥타노에이트(533.4 mg, 0.518 mmol, 62.6% 수율)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.65 - 7.57 (m, 2H), 7.54 (s, 1H), 4.90 - 4.83 (m, 2H), 3.69 - 3.49 (m, 18H), 2.73 (d, J = 90.4 Hz, 6H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.67 - 1.17 (m, 68H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 12H).
실시예 25 : 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸카르바모일옥시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (화합물 XXVI)의 합성
Figure pct00204
합성
단계 (1)
Figure pct00205
DMF (150 ml) 중 3-벤질옥시프로판-1,2-디올 (5 g, 27.4 mmol)의 용액에 NaH (5.40 g, 137 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. DMF (10 ml) 중 9-브로모논-1-엔 (14.1 g, 68.6 mmol)을 25℃에서 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후 상기 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (300 ml)로 처리하고, 물 (300 mlx2), 수성 LiCl (300 ml), 포화 수성 NaCl (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 5% EA)로 정제하여 2,3-비스(논-8-에녹시)프로폭시메틸벤젠 (3.74 g, 8.51 mmol, 수율 31%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.26 (m, 5H), 5.81 (ddt, J = 16.9, 10.2, 6.7 Hz, 2H), 4.94 (ddd, J = 17.4, 10.2, 9.3 Hz, 4H), 4.55 (s, 2H), 3.63 - 3.39 (m, 9H), 2.03 (td, J = 7.9, 1.3 Hz, 4H), 1.58 - 1.26 (m, 20H).
단계 (2)
Figure pct00206
ACN/CCl4/H2O (80ml/80ml/80ml) 중 2,3-비스(oct-7-에녹시)-N-옥틸-N-[2-[2-[2-[2-(2- 트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]프로판아미드 (3.74 g, 8.68 mmol)의 용액에 NaIO4 (14.9 g, 69.5 mmol) 및 염화루테늄 (III) 수화물 (392 mg, 1.74 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, EA (500 ml)로 처리하고, 수성 Na2S2O3 (500 ml), 염수 (500 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, tert-부틸 알코올/물 (90 ml/30 ml)로 처리하였다. 아염소산나트륨 (2.36 g, 26.1 mmol), 2-메틸-2-부텐 (15.2 g, 217 mmol) 및 인산이수소나트륨 (3.13g, 26.1 mmol)을 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 EA (500 ml)로 처리하고, 물 (500 ml), 염수 (500 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10% MeOH)로 정제하여 7-[2-(6- 카르복시헥속시)-3-[옥틸-[2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]-3-옥소-프로폭시]헵탄산 (2.58 g, 5.25 mmol, 수율 60.5%)을 회색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.55 (s, 2H), 3.62 - 3.41 (m, 9H), 2.44 - 2.29 (m, 4H), 1.59 (dt, J = 44.8, 6.8 Hz, 8H), 1.33 (s, 12H).
단계 (3)
Figure pct00207
DCM (20 ml) 중 8-[3-벤질옥시-2-(7-카르복시헵트옥시)프로폭시]옥탄산 (2.58 g, 5.53 mmol)의 용액에 헵타데칸-9-올 (3.12 g, 12.2 mmol)을 첨가하고, 3-(에틸이미노메틸렌아미노)-N,N-디메틸-프로판-1- 아민;히드로클로라이드 (3.18 g, 16.6 mmol), N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민 (2.5 g, 19.4 mmol) 및 N,N디메틸피리딘-4-아민 (338 mg)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (300 ml)로 처리하고, 물 (300 mlx2), 포화 수성 NaCl (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 5% EA)로 정제하여 1-옥틸노닐 8-[3-벤질옥시-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (2 g, 2.08 mmol)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 4.90 - 4.82 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 3.59 - 3.40 (m, 9H), 2.30 - 2.24 (m, 4H), 1.52 - 1.23 (m, 76H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (4)
Figure pct00208
EA (50 ml) 중 1-옥틸노닐 8-[3-벤질옥시-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (2.28 g, 2.42 mmol)의 용액에 pd/c (514 mg)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 H2 하에 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 여과시키고, 농축시켜 1-옥틸노닐 8-[3-히드록시-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.93 g, 2.22 mmol, 수율 91.7%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.95 - 4.80 (m, 2H), 3.81 - 3.38 (m, 9H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.72 - 1.14 (m, 76H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (5)
Figure pct00209
DMF (50 ml) 중 1-옥틸노닐 8-[3-히드록시-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.93 g, 2.26 mmol)의 용액에 비스(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (2.32 g, 9.05 mmol) 및 N,N-디메틸 피리딘-4-아민 (1.11 g, 9.05 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (300 ml)로 처리하고, 물 (300 mlx2), 수성 LiCl (300 ml), 포화 수성 NaCl (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 10~20% EA)로 정제하여 1-옥틸노닐 8-[3-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시카르보닐옥시-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1.66 g, 1.64 mmol, 수율 72.3%)를 무색 오일로서 제공하였다.
단계 (6)
Figure pct00210
DCM (15 ml) 중 tert-부틸 N-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카르바메이트 (300 mg, 1.21 mmol)의 용액에 1-옥틸노닐 8-[3-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시카르보닐옥시-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (1 g, 1.01 mmol), N,N-디에틸에탄아민 (153 mg, 1..51 mmol) 및 N,N디메틸피리딘-4-아민 (12 mg)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 EA (50 ml)로 처리하고, 물 (50 mlx2), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 20% EA)로 정제하여 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(tert부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸카르바모일옥시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (763 mg, 0.67 mmol, 수율 65.9%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.26 (s, 1H), 5.05 (s, 1H), 4.91 - 4.80 (m, 2H), 4.14 (ddd, J = 16.8, 11.4, 6.5 Hz, 2H), 3.63 - 3.22 (m, 19H), 2.33 - 2.20 (m, 4H), 1.60 - 1.14 (m, 85H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H).
단계 (7)
Figure pct00211
DCM (10 ml) 중 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸카르바모일옥시]-2-[8-(1- 옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (763 mg, 0.68 mmol)의 용액에 2,2,2- 트리플루오로아세트산 (0.5 ml)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (50 ml)로 처리하고, 수성 NaHCO3 (50 ml), 포화 수성 NaCl (50 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 5~10% EA)로 정제하여 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸카르바모일옥시]-2-[8- (1-옥틸논옥시)-8-옥소-옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (310 mg, 0.3 mmol, 수율 43.7%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.73 (s, 1H), 4.86 (p, J = 6.3 Hz, 2H), 4.16 (ddd, J = 60.4, 11.6, 4.6 Hz, 2H), 3.72 - 3.29 (m, 19H), 2.98 (s, 2H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.56 (ddd, J = 28.8, 18.1, 6.3 Hz, 16H), 1.33 - 1.24 (m, 60H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 12H).
단계 (8)
Figure pct00212
DCM (5 ml) 중 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸카르바모일옥시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (310 mg, 0.3 mmol)의 용액에 N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민 (195 mg, 1.51 mmol) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (158 mg, 1.21 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 7% MeOH)로 정제하여 1-옥틸노닐 8-[3-[2-[2-[2- (1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에틸카르바모일옥시]-2-[8-(1-옥틸논옥시)-8-옥소옥톡시]프로폭시]옥타노에이트 (259 mg, 0.23 mmol, 수율 75%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 7.52 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 4.91 - 4.82 (m, 2H), 4.21 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 11.6, 5.3 Hz, 1H), 3.70 - 3.34 (m, 19H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.61 - 1.13 (m, 76H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 12H)
실시예 26 : [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4- 카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소옥톡시]-3-옥소-프로폭시]옥타노에이트 (화합물 XXVII)의 합성
Figure pct00213
(XXVII)
화합물 (XXVII)의 합성
단계 (1)
Figure pct00214
2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸 메탄술포네이트 (11 g, 17.7 mmol)를 옥탄1-아민 (44 ml)에 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. LCMS는 출발 물질이 소비되고 생성물이 형성되었음을 보여주었다. 상기 혼합물을 EA (500 ml)로 처리하고, 물 (500 mlx2), 포화 수성 NaCl (500 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10% MeOH)로 정제하여 N-[2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]옥탄-1-아민 (9.5 g, 15.7 mmol, 수율 88.4%)을 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.49 - 7.42 (m, 6H), 7.29 (dd, J = 10.4, 4.8 Hz, 6H), 7.25 - 7.20 (m, 3H), 3.71 - 3.54 (m, 16H), 3.23 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.61 - 2.55 (m, 2H), 1.27 (d, J = 4.2 Hz, 12H), 0.87 (d, J = 7.1 Hz, 3H).
단계 (2)
Figure pct00215
DCM (200 ml) 중 2,3-비스(논-8-에녹시)프로판-1-올 (12.8 g, 37.6 mmol)의 용액에 Dess-Martin 퍼요오디난 (23.9 g, 56.4 mmol)을 0℃에서 5분 동안 첨가하였다. 그 후 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, EA (500 ml)로 처리하고, 수성 Na2S2O3/수성 NaHCO3 (500 ml/ 500ml), 염수 (500 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시켜 2,3-비스(논-8-에녹시)프로판알 (11.7 g, 조 물질, 수율 90.1%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.72 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 5.81 (ddt, J = 16.9, 10.2, 6.7 Hz, 2H), 5.05 - 4.87 (m, 4H), 3.86 - 3.33 (m, 7H), 2.09 - 1.97 (m, 4H), 1.61 - 1.20 (m, 20H)
단계 (3)
Figure pct00216
tert-부틸 알코올/물 (180 ml/60 ml) 중 2,3-비스(논-8-에녹시)프로판알 (11.7 g, 34.6 mmol)의 용액에 아염소산나트륨 (9.38 g, 104 mmol, 2-메틸-2-부텐 (60.6 g, 864 mmol) 및 인산이수소나트륨 (9.38 g, 104 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 후, 상기 혼합물을 EA (500 ml)로 처리하고, 물 (500 mlx2), 염수 (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시켜 2,3-비스(논-8-에녹시)프로판산 (9.75 g, 27 mmol, 수율 78%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.81 (ddt, J = 16.9, 10.2, 6.7 Hz, 2H), 5.07 - 4.87 (m, 4H), 4.04 (dd, J = 5.1, 3.3 Hz, 1H), 3.81 - 3.44 (m, 6H), 2.04 (dd, J = 13.1, 6.5 Hz, 4H), 1.66 - 1.54 (m, 4H), 1.32 (ddd, J = 12.7, 9.1, 5.4 Hz, 16H)
단계 (4)
Figure pct00217
DCM (150 ml) 중 N-[2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]옥탄-1-아민 (9.52 g, 16.1 mmol)의 용액에 2,3-비스(논-8-에녹시)프로판산 (5 g, 14.1 mmol), [디메틸아미노(트리아졸로[4,5- b]피리딘-3-일옥시)메틸렌]-디메틸-암모늄;헥사플루오로포스페이트 (8.04 g, 21.2 mmol), N,N-디에틸에탄 아민 (2.85 g, 28.2 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 EA (300 ml)로 처리하고, 물 (300 mlx2), 포화 수성 NaCl (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 25% EA)로 정제하여 2,3-비스(논-8-에녹시)-N-옥틸-N-[2-[2-[2-[2-(2- 트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]프로판아미드 (8.22 g, 8.69 mmol, 수율 61.5%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.46 (d, J = 7.5 Hz, 6H), 7.29 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 7.22 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 5.86 - 5.74 (m, 2H), 5.03 - 4.89 (m, 4H), 4.43 - 4.29 (m, 1H), 3.70 - 3.22 (m, 29H), 2.03 (dd, J = 13.5, 6.5 Hz, 4H), 1.57 - 1.51 (m, 4H), 1.40 - 1.23 (m, 28H), 0.88 (q, J = 6.9 Hz, 3H)
단계 (5)
Figure pct00218
ACN/CCl4/H2O (80ml/80ml/80ml) 중 2,3-비스(oct-7-에녹시)-N-옥틸-N-[2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]프로판아미드 (8.22 g,9.13 mmol)의 용액에 NaIO4 (15.6 g ,73 mmol), 염화루테늄 (III) 수화물 (412 mg, 1.83 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, EA (500 ml)로 처리하고, 수성 Na2S2O3 (300 ml), 염수 (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, tert-부틸 알코올/물 (120 ml/40 ml)로 처리하였다. 아염소산나트륨 (2.48 g, 27.4 mmol), 2-메틸-2-부텐 (16 g, 228 mmol) 및 인산이수소나트륨 (3.29 g, 27.4 mmol)을 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 EA (500 ml)로 처리하고, 물 (500 ml), 염수 (300 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 10% MeOH)로 정제하여 7-[2-(6-카르복시헥속시)-3-[옥틸-[2-[2-[2-[2-(2- 트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]-3-옥소-프로폭시]헵탄산 ( 5.11 g, 5.19 mmol, 수율 56.8%)을 회색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 (dd, J = 15.2, 13.8 Hz, 6H), 7.29 (dd, J = 10.1, 4.8 Hz, 6H), 7.22 (dd, J = 8.3, 6.1 Hz, 3H), 4.38 (ddd, J = 35.0, 7.3, 4.4 Hz, 1H), 3.80 - 3.33 (m, 26H), 3.23 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.50 - 2.24 (m, 4H), 1.56 - 1.18 (m, 28H), 0.87 (q, J = 6.8 Hz, 3H).
단계 (6)
Figure pct00219
DCM (80 ml) 중 7-[2-(6-카르복시헥속시)-3-[옥틸-[2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]-3-옥소-프로폭시]헵탄산 (5.1 g, 5.45 mmol)의 용액에 (Z)-논-2-엔-1-올 (1.86 mg, 13.1 mmol), EDC HCl (3.13 g, 16.3 mmol), DIEA (2.46 g, 19.1 mmol) 및 DMAP (333 mg)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 25% EA)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[2-[8- [(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-[옥틸-[2-[2-[2-[2-(2-트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]-3-옥소프로폭시]옥타노에이트 (2.27 g, 1.83 mmol, 수율 33.7%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.46 (d, J = 7.4 Hz, 6H), 7.29 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 7.22 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 5.64 (dd, J = 18.3, 7.5 Hz, 2H), 5.55 - 5.47 (m, 2H), 4.61 (d, J = 6.9 Hz, 4H), 4.42 - 4.28 (m, 1H), 3.69 - 3.38 (m, 26H), 3.23 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.09 (q, J = 7.3 Hz, 4H), 1.52 - 1.24 (m, 48H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 9H)
단계 (7)
Figure pct00220
THF/MeOH (15ml/15ml) 중 [(Z)-논-2-에닐] 8-[2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-[옥틸-[2-[2-[2-[2-(2- 트리틸옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸]아미노]-3-옥소-프로폭시]옥타노에이트 (2.38 g, 1.96 mmol)의 용액에 톨루엔-4-술폰산 (560 mg, 2.94 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 후 상기 혼합물을 EA (150 ml)로 처리하고, 물 (150 ml), 염수 (150 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 5% MeOH)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2- 히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소프로폭시]옥타노에이트(1.51 g, 1.52 mmol, 수율 77.7%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.69 - 5.46 (m, 4H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 4.43 - 4.29 (m, 1H), 3.74 - 3.40 (m, 28H), 2.29 (td, J = 7.7, 1.5 Hz, 4H), 2.10 (dd, J = 14.1, 7.0 Hz, 4H), 1.61 - 1.21 (m, 48H), 0.88 (td, J = 6.7, 4.3 Hz, 9H).
단계 (8)
Figure pct00221
[(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)- 논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소-프로폭시]옥타노에이트 (742 mg)의 용액에 N,N-디에틸에탄아민 (155 mg, 1.53 mmol) 및 메탄술포닐 클로라이드 (131 mg, 1.15 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (100 ml)로 처리하고, 물 (100 mlx2), 1 N HCl (50 mlx2), 수성 NaHCO3 (100 ml), 포화 수성 NaCl (100 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시켜 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2- 메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소프로폭시]옥타노에이트 (753 mg,0.7 mmol, 수율 92%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.77 - 5.44 (m, 4H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 4.44 - 4.29 (m, 3H), 3.79 - 3.39 (m, 26H), 3.08 (s, 3H), 2.34 - 2.26 (m, 4H), 2.14 - 2.02 (m, 4H), 1.62 - 1.23 (m, 48H), 0.88 (td, J = 6.7, 4.2 Hz, 9H).
단계 (9)
Figure pct00222
DMF (10 ml) 중 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2-메틸술포닐옥시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸아미노]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소-프로폭시]옥타노에이트 (753 mg, 0.72 mmol)의 용액에 소듐;아지드 (70 mg, 1.08 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 EA (100 ml)로 처리하고, 물 (100 ml), 포화 수성 NaCl (100 ml)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기물을 농축시키고, 플래시 (PE 중 30% EA)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2- 아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소프로폭시]옥타노에이트 (364 mg, 0.36 mmol)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.58 (dtd, J = 17.7, 10.9, 7.1 Hz, 4H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 4.44 - 4.30 (m, 1H), 3.72 - 3.35 (m, 28H), 2.30 (td, J = 7.7, 1.6 Hz, 4H), 2.10 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.61 - 1.22 (m, 48H), 0.88 (td, J = 6.8, 4.1 Hz, 9H)
단계 (10)
Figure pct00223
THF/물 (10ml/0.3ml) 중 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)- 논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소-프로폭시]옥타노에이트 (364 mg, 0.366 mmol)의 용액에 트리페닐포스판 (288 mg, 1.1 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 5% MeOH)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2- 아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소프로폭시]옥타노에이트 (300 mg, 0.3 mmol, 수율 82.9%)를 무색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.69 - 5.59 (m, 2H), 5.56 - 5.47 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 4.44 - 4.30 (m, 1H), 3.69 - 3.35 (m, 26H), 2.96 (dt, J = 44.2, 5.2 Hz, 2H), 2.30 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 2.12 - 2.07 (m, 4H), 1.58 (dd, J = 16.2, 7.3 Hz, 8H), 1.37 - 1.22 (m, 40H), 0.88 (dd, J = 8.7, 4.9 Hz, 9H)
단계 (11)
Figure pct00224
DCM (5 ml) 중 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸-아미노]-2-[8-[(Z)- 논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소-프로폭시]옥타노에이트 (300 mg, 0.31 mmol)의 용액에 N-에틸-N이소프로필-프로판-2-아민 (240 mg, 1.86 mmol) 및 1H-이미다졸-4-카르보닐 클로라이드 (202 mg, 1.55 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 플래시 (DCM 중 5% MeOH)로 정제하여 [(Z)-논-2-에닐] 8-[3-[2-[2-[2-[2-[2-(1H-이미다졸-4-카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸-옥틸아미노]-2-[8-[(Z)-논-2-에녹시]-8-옥소-옥톡시]-3-옥소-프로폭시]옥타노에이트 (213 mg, 0.20 mmol, 수율 63.5%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.65 (s, 1H), 7.60 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 5.64 (dd, J = 18.3, 7.5 Hz, 2H), 5.55 - 5.48 (m, 2H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 4.32 (s, 1H), 3.74 - 3.34 (m, 28H), 2.29 (dd, J = 10.7, 4.4 Hz, 4H), 2.09 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.59 - 1.50 (m, 8H), 1.43 - 1.16 (m, 40H), 0.92 - 0.84 (m, 9H)
실시예 27 : 지질 나노입자(LNPs)의 제조
유기 상의 제조
지질을 50:10:38.5:1.5 (이온화가능한 지질:DSPC:콜레스테롤:PEG2000-PE)의 몰비로 에탄올에 용해시켰다.
PEG2000-PE는 또한 DMG-PEG2000으로 대체될 수 있다.
DSPC는 또한 DOPE(Avanti Polar Lipids로부터 획득)로 대체될 수 있다.
다음의 4가지의 이온화가능한 양이온성 지질 화합물을 사용하여 LNPs를 제조하였다: L319(DLin-MC3-DMA) 및 화학식 III, IV 및 V의 지질 화합물.
L319-함유 LNPs(LNPs L-319) 제형을 위한 1.5 mL의 유기 상의 제조
3.9 mg의 DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 - Avanti Polar Lipids: 850365), 2 mg의 PEG2000-PE(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염) - Avanti Polar Lipids:
880150P) 및 7.4 mg의 콜레스테롤(Sigma Aldrich: C3045)을 1319 μL의 에탄올에 용해시켰다. 그 후 167 μL의 L319 스톡 용액(에탄올 중 100 mg/mL - DLin-MC3-DMA - Maier et al., Molecular Therapy, 2013, 21(8): 1570-1578)을 첨가하여 20 mg/mL의 지질 상 용액을 수득하였다.
화학식 III의 지질 화합물-함유 LNPs(LNPs Lip. (III))를 위한 1.7 mL의 유기 상의 제조
3.8 mg의 DSPC, 2 mg의 PEG2000-PE 및 7.2 mg의 콜레스테롤을 1477 μL의 에탄올에 용해시켰다. 그 후 210 μL의 화학식 III의 지질 화합물의 스톡 용액(에탄올 중 100 mg/mL)을 첨가하여 20 mg/mL의 지질 상 용액을 수득하였다.
화학식 IV의 지질 화합물-함유 LNPs(LNPs Lip. (Iv))를 위한 1.7 mL의 유기 상의 제조
3.8 mg의 DSPC, 2 mg의 PEG2000-PE 및 7.2 mg의 콜레스테롤을 1477 μL의 에탄올에 용해시켰다. 그 후 210 μL의 화학식 IV의 지질 화합물의 스톡 용액(에탄올 중 100 mg/mL)을 첨가하여 20 mg/mL의 지질 상 용액을 수득하였다.
화학식 V의 지질 화합물-함유 LNPs(LNPs Lip. (V))를 위한 1.7 mL의 유기 상의 제조
3.9 mg의 DSPC, 2 mg의 PEG2000-PE 및 7.4 mg의 콜레스테롤을 1561 μL의 에탄올에 용해시켰다. 그 후 226 μL의 화학식 V의 지질 화합물의 스톡 용액(에탄올 중 100 mg/mL)을 첨가하여 20 mg/mL의 지질 상 용액을 수득하였다.
수성 상의 제조
L319 LNPs를 위한 1.8 mL의 수성 상의 제조
A/Netherlands HA(서열 번호 1)를 코딩하는 비복제 mRNA를 사용하였다. 인플루엔자 HA mRNA는 야생형 염기 및 T7 RNA 폴리머라아제를 사용하여 PCR에 의해 생성된 선형 DNA 주형으로부터 비변형 mRNA 전사체로서 시험관 내 전사(IVT)에 의해 생성되었다(Avci-Adali et al (J. Vis. Exp. (93), e51943, doi:10.3791/51943 (2014) 및 Kwon et al., Biomaterials 156 (2018) 172e193). mRNA는 3' 폴리아데닐화되고(A120) 5' 캡핑되었다(Cap 1).
Dnase 및 포스파타아제 처리 후, mRNA를 실리카 막 여과, 이어서 HPLC에 의해 고순도까지 정제하였다. mRNA를 pH 6.4의 1 mM 시트르산나트륨 중 2 mg/mL 용액의 1 mL 분취물로서 패키징하였다.
수성 상에 사용할 mRNA 농도를 계산하여 6의 양이온성 아미노 기/음이온성 포스페이트 기 비(N/P=6)를 얻었다. 이 농도는 1 μg의 mRNA가 0.003 μmol의 포스페이트에 상응하는 것으로 가정하여 양이온성 지질 농도로부터 결정하였다. NanoAssemblR®(Precision Nanosystem의 Nanoassemblr Benchtop; Belliveau et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012))을 사용하여 3:1의 수성 용액:에탄올 용액의 비를 사용할 때 1.5 mL의 수성 용액이 2 mL의 LNPs의 제조에 필요하기 때문에, 필요한 mRNA 농도는 305 μg/mL인 것으로 계산되었다.
mRNA 용액을 50 mM 시트레이트 완충제(pH 4.0)에서 제조하였다.
LNPs Lip. (III), LNPs Lip. (IV) 및 LNPs Lip. (V)을 위한 1.8 mL의 수성 상의 제조
mRNA를 위에 기술된 바와 같이 제조하였으며, N/P=6인 LNPs를 제조하기 위해 계산된 농도는 0.265 mg/ml이었다.
LNPs의 제조
제조업체 권장 사항에 따라 NanoAssemblR 장비를 사용하여 LNPs를 제조하였다.
수성 상 및 유기 상 각각을 제조업체 권장 사항에 따라 NanoAssemblR에 적합한 시린지에 로딩하였다. 유량을 비: 3:1 및 총 유량: 4 ml/분으로 설정하였다. 그 후 수성 상 및 지질 상을 혼합하여 LNPs를 수득하였다.
LNPs의 정제 및 수확
수득된 LNPs를 시트레이트 완충제(50 mM - pH 4.0)에 대해 투석하여 잔존 에탄올을 제거하고, 그 후 PBS 완충제(pH 7.4)에 대해 2회 투석하였다. 각 투석을 4℃에서 적어도 12시간 동안 수행하였다. 그 후 LNPs를 0.22 μm 필터를 통해 여과시키고, 질소 하에 +4℃에서 보관하였다.
실시예 28: LNPs의 특성 확인
RNA 적정 / 캡슐화율
LNPs에서의 캡슐화된 mRNA의 백분율 및 mRNA 농도를 제조업체 권장 사항(Invitrogen Detection Technologies)에 따라 Quant-iT Ribogreen RNA 시약 키트를 사용하여 측정하고, 플루오레세인 여기 및 방출 파장을 사용하여 표준 분광 광도계 또는 형광 마이크로플레이트 판독기로 정량화하였다.
비캡슐화 RNA의 정량화를 위해, LNPs를 트리스/EDTA 분석 완충제(10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 희석시켰다.
RNA의 총량의 정량화를 위해, LNPs를 0.5%(v/v) 트리톤 X100을 포함하는 트리스/EDTA 분석 완충제(10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 희석시켰다.
Ribogreen 염색제(200X 희석)를 샘플(50/50 믹스; 샘플/Ribogreen 시약)에 첨가하고, 철저히 혼합하고, 암소에서 실온에서 5분 인큐베이션하였다. 형광을 플레이트 판독기에서 측정하였다.
지질의 정량화
제형화 과정 동안 지질의 손실이 없는 것으로 가정하였다. 또한 투석 전 총 지질 농도는 5 mg/mL인 것으로 가정하였다. 투석 단계 동안 발생하는 희석 계수를 고려하여 최종 지질 농도를 정의하였다.
입자 크기 분포, 다분산 지수 제타 전위 및 오스몰 농도,
제조업체 권장 사항에 따라 제타 사이저 Nano ZS 광 산란 기기(Malvern Instruments)를 사용하여 LNPs의 제타 전위 및 입자 크기 분포를 측정하였다. 입자 크기는 입자 크기 분포의 "폭"의 지표인 다분산 지수(PDI)와 함께 Z-평균 크기(고조파 강도 평균 입자 직경)로 보고되었다. 샘플을 측정 전에 인산염 완충 염수(PBS)에서 1/100까지 희석시켰다. Nano ZS를 사용한 정확한 입자 크기 측정을 위해, 상기 완충제의 점도 및 상기 재료의 굴절률을 장비 소프트웨어에 제공해야 했다(PBS: v=1.02 cP, RI =1.45). 제타 전위 측정을 위해 샘플을 물에 희석시켰다(v=0.8872 cP). Malvern Instruments의 Zetasizer Software V 7.11을 사용하여 데이터를 분석하였다.
상기 장비의 제조업체의 지침에 따라 각각 마이크로-샘플 Osmometer(Fiske Associates 모델) 및 pHmeter(Mettler Toledo)를 사용하여 제형의 오스몰 농도 및 pH를 측정하였다.
결과
LNPs L319, LNPs Lip. (III), LNPs Lip. (IV), 및 LNPs Lip. (V)의 특성 확인이 하기 표 1에 기술되어 있다.
[표 1]
Figure pct00225
실시예 29: 마우스에서 인플루엔자 HA mRNA를 포함하는 LNPs의 면역원성
이 연구의 목적은 4가지의 상이한 지질 나노입자, LNPs L319, LNPs Lip. (III), LNPs Lip. (IV), 및 LNPs Lip. (V)로 제형화된 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 천연 비복제 mRNA의 상이한 용량들의 면역원성을 비교하는 것이었다.
LNPs를 실시예 27에 기술된 바와 같이 제조하였다.
마우스 면역화 절차
8마리의 BALBc/ByJ 마우스(D0에서 8주령)의 10개 군은 각각의 상기 4가지의 LNPs 제형과 함께 1 또는 5 μg의 mRNA의 근육내(IM) 주사를 2회 받았다(3주 간격으로 주어짐).
LNPs L319를 벤치마크로 사용하였으며 0.5 μg, 1, 2.5 및 5 μg의 총 mRNA의 4개 용량에서 테스트하여 잠재적으로 용량-범위 효과를 입증하였다. 3가지 LNPs 제형, LNPs (III), LNPs (IV), 및 LNPs (V)를 5 및 1 μg의 총 mRNA의 2개 용량에서 테스트하였다.
8마리 마우스의 양성 대조군은 상기 면역화 일정에 따라 10 μg의 1가 A/California/07/2009(H1N1) 분할 백신 Vaxigrip®을 받았다.
4마리 마우스의 음성 대조군을 PBS로 면역화하였다.
혈구응집 억제 분석법(HI)에 의한 항체 반응 분석을 위해 D20(1회 후(post-1)) 및 D42(2회 후(post-2))에 혈액 샘플을 수집하였다.
혈구응집 억제 항체 역가(HI 역가)의 결정
이 기술은 HA에 대해 유도된 특정한 기능성 항체를 함유하는 혈청가 인플루엔자 바이러스 혈구응집 활성을 억제하는 능력에 기초하여 인플루엔자 면역화 동물의 혈청에 존재하는 기능성 항-HA 항체를 적정하는 데 사용된다.
바이러스 (청징 요막액) A/H1N1/California/7/2009 주의 연속 희석을 PBS에서 수행하여 바이러스 현탁을 보정하고 cRBC(PBS 중 0.5%)의 존재 하에 4 HAU(혈구응집 단위)를 얻었다. 그 후, 보정된 바이러스 (50 μL)를 96웰 플레이트의 V자형 웰에 PBS 중 혈청 연속 희석액(2배)(1:10으로부터 시작) 50 μL에 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다.
HA에 대해 유도된 혈청 비특이적 억제제를 제거하기 위해, 각각의 혈청을 수용체-파괴 효소(receptor-destroying enzyme; RDE)(비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 유래의 뉴라미니다아제 - 타입 III - Sigma Aldrich N7885) 및 닭 적혈구(cRBC)로 처리하였다. 간략하게는, 10 mU/mL의 RDE를 각각의 혈청에 첨가하였다. 그 후, 상기 믹스를 37℃에서 18시간 인큐베이션하고, 이어서 56℃에서 1시간 불활성화하였다. 냉각을 위해, "혈청-RDE" 혼합물을 30분~4시간의 범위의 시간 동안 4℃에 두었다. 그 후 "혈청-RDE" 혼합물을 실온에서 30분 동안 PBS 중 10% cRBC에 흡수시키고, 그 후, 5℃에서 700 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 10배 희석된 혈청에 상응하는 상청액을 수집하여 HI 분석을 수행하였다.
그 후 닭 적혈구(PBS 중 0.5%)(50 μL)를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 후에 혈구응집 억제 또는 혈구응집을 육안으로 판독하였다.
HI 항체의 역가는 혈구응집을 일으키지 않는 마지막 희석률의 역수이다. 통계 분석을 수행하기 위해 음성으로 판정된 모든 혈청에 대해 초기 희석률(1:10)의 절반에 상응하는 5의 값을 임의로 부여하였다.
통계 분석
HI 역가를 통계 분석 전에 log10 변환하였다.
4가지 LNP 제형(LNPs L319, LNPs Lip. (III), LNPs Lip. (IV), 및 LNPs Lip. (V))을 비교하기 위해, 2가지 요인(LNPs 및 용량)을 사용한 분산 분석 모델을 다중 비교를 위해 Turkey 조정과 함께 적용하였다. 반응 마우스 중 50%가 넘는(8마리 중 4마리가 넘는) 마우스가 있는 군에 대해 통계 분석을 수행하였다. 모델의 잔차를 연구하여 모델의 유효성(정상성, 극단적인 개체 등)을 테스트하였다. 모든 분석을 SAS v9.4®에서 수행하였다. 주요 요인의 영향에 대해 5%의 오차 범위를 사용하였다.
결과
A/California/7/2009(H1N1)에 대해 유도된 항체 반응을 D20 및 D42에 모든 동물로부터 수집된 개별 혈청에서 HI 분석에 의해 측정하였다.
LNPs의 1회 및 2회 IM 주사 후 마우스에서 측정된 평균 HI 역가
용량당 총 mRNA 함량에 따라 분석한 결과는 다음을 보여주었다:
mRNA의 단회 주사 후(1회 면역화 후(D20)), 5 μg 미만의 용량은 테스트된 LNP에 관계없이 매우 낮거나 탐지불가능한 HI 반응을 유도하였다. 5 μg의 총 mRNA의 최고 용량에서(D20), LNPs Lip. (III) 또는 LNPs Lip. (V)를 투여한 동물 중 일부는 탐지가능한 HI 반응(8마리 중 4~5마리)을 보여 보통의 평균 HI 반응(20 미만)을 달성하였다. 반대로, LNPs (IV) 또는 L319 LNPs를 이용하여 제형화된 5 μg의 총 mRNA를 주사한 모든 동물은 혈청전환되었으며, 이때 평균 HI 역가는 각각 73 및 37이었다(다음을 참조: 표 2: 1회 주사 후 역가 - 도 1).
[표 2]
Figure pct00226
두 번째 용량의 mRNA-LNP는 모든 군에서 반응을 부스팅하였다(2회 면역화 후(D42)).
mRNA/LNPs L319 제형을 2회 주사한 후, 유의한 용량-효과가 입증되었으며, 이때 평균 HI 역가는 0.5~5 μg의 총 mRNA에서 각각 67~1974의 범위였다(p-값 < 0.001). 부스터 주사 후 5 μg의 총 mRNA의 용량에서, 4가지의 LNPs, LNPs L319, LNPs Lip. (IV), LNPs Lip. (III) 또는 LNPs Lip. (V)는 모든 마우스에서 HI 반응을 유도하였으며, 이때 평균 HI 역가는 각각 4060, 1974, 427 및 174였다(다음을 참조: 도 2 및 표 3: 2회 주사 후 역가).
LNPs(IV) 제형으로 얻어진 평균 HI 반응은 LNPs L319 제형에 의해 유도된 것보다 2배 더 높았고, 통계적 유의성은 입증되지 않았다.
LNPs Lip. (IV)는 LNPs (III) 제형에 의해 유도된 것보다 유의하게 더 높은 HI 반응을 유도할 수 있었다(각각의 p-값 0.007 및 0.001). 또한, LNPs Lip. (IV) 제형은 LNPs Lip. (V)에 의해 유도된 것보다 유의하게 더 높은 HI 반응을 유도하였다(p-값= 0.013).
1 μg의 총 mRNA 용량에서, LNPs L319 또는 LNPs Lip. (IV)를 이용하여 제형화된 두 군을 제외하고는 반응이 너무 낮아 통계적으로 분석할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 다시 한번, LNPs Lip. (IV)에 의해 유도된 평균 HI 역가는 LNPs L319에 의해 유도된 것보다 더 높은 경향이 있었다(830 대 207, 유의성에 근접함, p=0.057).
[표 3]
Figure pct00227
LNPs를 주사한 마우스에서 관찰된 반응원성
1회 면역화 후, 어떠한 동물에서도 임상 징후가 관찰되지 않았다. 2회 면역화 후, LNP(IV) 중 5 μg의 총 mRNA 를 받은 8마리의 마우스 및 LNPs Lip. (III) 중 5 μg의 총 mRNA를 받은 4마리의 마우스에서 D22, D23 또는 D24에, 즉, 부스터 주사한지 1일 내지 3일 후에 주사 부위에서 약간의 염증이 관찰되었다.
실시예 30 : BALBc/ByJ 마우스에서의 LNPs Lip. (IV) 및 인플루엔자 HA mRNA의 평가
연구의 목적 및 설계
본 연구의 목적은 다음과 같았다:
- 다음 중 어느 하나에서 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 비복제 mRNA를 이용하여 LNPs Lip. (IV)를 테스트하는 것: i) 전부 천연 염기의 mRNA(Nat.) 또는 ii) 1-메틸 슈도-우리딘(우리딘 대신) 변형 mRNA(Mod.).
- 각각의 주사 후 뒷다리 종창의 관점에서 평가된 면역원성 및 주사 부위 반응원성의 관점에서 LNP 조성물에서 DSPC를 DOPE로 대체하는 것을 평가하는 것.
- PBS(pH 7.4) 중 액체 제형으로서 4℃에서 1년 보관 후 LNPs- Lip. (IV)/HA mRNA의 안정성 및 면역원성을 테스트하는 것. 마우스 군에 2.5 μg의 mRNA를 이용하여 LNPs Lip. (IV)/HA mRNA의 LNPs 배치를 주사하였다. 이 테스트는 4℃에서 액체 제형으로서 보관하는 경우 LNPs Lip. (IV)의 장기 안정성을 평가하기 위한 "효력 테스트"로 수행되었다.
[표 4]
Figure pct00228
LNPs의 제조
양이온성 지질((IV) 또는 L319), 중성 지질(DSPC 또는 DOPE) 또는 mRNA(전부 천연 염기의 mRNA 또는 우리딘-변형 염기 mRNA)를 변화시켜 실시예 27에 기술된 바와 같이 LNP를 제조하였다. 스테로이드 알코올(콜레스테롤)과 페길화(PEGylated) 지질(PEG2000-PE)은 동일하였다.
표시된 양이온(N) / 음이온(P) 전하 비에 도달하도록 mRNA 및 양이온성 지질의 양을 조정하였다.
LNPs-Lip. (IV)/DSPC의 몰비는 다음과 같았다: (IV):DSPC:PEG200-PE:콜레스테롤 = 50:10:1.5:38.5.
LNPs- Lip. (IV)/DOPE의 몰비는 다음과 같았다: (IV):DOPE:PEG200-PE:콜레스테롤 = 50:10:1.5:38.5.
LNPs-L319의 몰비는 다음과 같았다: L319:DSPC:PEG200-PE:콜레스테롤 = 50:10:1.5:38.5.
안정성 테스트를 위해 LNPs-(IV)/HA mRNA의 배치를 PBS(pH 7.4) 중 액체 제형으로 4℃에서 1년 동안 보관하고, t=0, t=6개월 및 t=1년에 테스트하였다.
마우스의 면역화 절차 및 판독값
면역화 절차 및 판독값은 다음과 같았다.
간단히 말해서, 8마리의 BALBc/ByJ 마우스(D0에서 8주령)의 군은 표시된 LNPs의 2회의 근육내(IM) 주사를 받았다(3주 간격(D0 및 D21)으로 주어짐). 4마리 마우스의 음성 대조군은 완충제를 받았고, 8마리 마우스의 양성 대조군은 상기 면역화 일정에 따라 10 μg의 1가 A/California/07/2009(H1N1) 분할 백신 Vaxigrip®을 받았다.
실시예 29에 기술된 바와 같이 혈구응집 억제 분석법(HI)에 의한 항체 반응 분석을 위해 D42(투약 2를 수행한지 3주 후)에 혈액 샘플을 수집하였다.
각각의 주사 후, 주사 부위를 관찰하여 국소 반응원성을 평가하였다. 종창이 동물의 일부에서 관찰되었고, 이는 종창 없음, 저 종창, 중저 종창, 중고(medium high) 종창~고 종창으로 분류되었다.
결과
상이한 mRNA: HI 반응 및 국소 반응원성의 비교
수득된 HI 결과가 도 3 및 도 4에 예시되어 있다.
전부 천연 또는 1-메틸 슈도-우리딘-변형 mRNA는 LNPs Lip. (IV)/DSPC에서 제형화될 때 HI 반응을 유도하는 데 효과적이었다(도 3).
1-메틸 슈도-우리딘 변형 mRNA는 LNPs Lip. (IV)/DSPC에서 제형화될 때 HI 반응의 유도에서 천연 mRNA보다 더 효과적이었다(p 값 = 0.044)(도 3).
전반적으로, LNPs Lip. (IV)/DSPC는 LNP L319/DSPC보다 더 많은 국소 종창을 유도했지만, 종창은 각각을 주사한지 3일 후에 감소하였다(군 B, C, D 대 F - 표 5 참조).
[표 5]
Figure pct00229
LNPs 구성에서 DSPC를 DOPE로 대체: HI 반응 및 국소 반응원성
DSPC를 DOPE로 대체해도 LNPs Lip. (IV) 또는 LNPs L319에 의해 유도된 HI 반응에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 4에 나타낸 결과 참조).
Lip. (IV) LNPs에서 DSPC를 DOPE로 대체한 경우 국소 종창의 현저한 감소가 있었다(군 E - 표 6 참조).
Lip. (IV)/DOPE/Chol/PEG-PE(50/10:38.5/1.5) LNPs 제형에서는 면역원성 측면에서 유효성과 주사 부위에서의 내약성이 이상적으로 조합된 것으로 보인다.
[표 6]
Figure pct00230
안정성
상이한 mRNA 농도에서의 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 상기 제제들을 t=0, t=6개월 및 t=1년에서 수행된 3회의 독립 실험에서 테스트하였다. 결과가 도 5에 예시되어 있다.
실험 전반에 걸쳐 테스트된 상이한 용량 수준 때문에 통계적 결론을 도출할 수 없다. 그러나 도 5에 제시된 결과의 추세로부터, LNPs Lip. (IV)/DSPC가 4℃에서 액체 제형으로 보관시 6개월 내지 12개월의 범위의 보관 기간 동안 면역원성이 변하지 않았기 때문에 현저한 안정성을 나타낸다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 31 : LNP 전달 루시퍼라아제 mRNA 이미징
본 연구의 목적은 정상 마우스에서 상이한 LNP 제형들의 간 형질도입 효율 및 조직 생체분포를 결정하는 것이었다.
재료 및 방법
LNPs 시약
1,3-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG)를 Avanti Polar Lipids(올버니 알라바스터 소재)에서 구입하였다. 3β-히드록시-5-콜레스텐, 5-콜레스텐-3β-올(콜레스테롤) 및 Supor Membrane이 갖추어진 Acrodisc Syringe Filters(살균-0.2 μm, 13 mm)를 Sigma Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 구입하였다. Coatsome SS-OP(SS-OP)를 NOF America Corporation(일본에 본사를 둠, 미국 뉴욕주 화이트 플레인스 소재)에서 구입하였다. 뉴클레아제 무함유 물, 10X PBS 완충제(pH 7.4), 시트르산나트륨, 이수화물, 시트르산, 염화나트륨, 수크로스, 에틸 알코올, BD Vacutainer General Use Syringe Needles(BD Blunt Fill Needle 18G), BD Slip Tip Sterile Syringes(3 ml 및 1 mL), Amicon Ultra Centifugal Filter Units, DNA 무함유 마이크로원심분리 튜브(1.5 mL), Invitrogen RNase-free Microfuge Tubes(0.5 mL), Invitrogen Conical Tubes(15 mL)(DNase-RNase-무함유), Fisher Brand Semi-Micro Cuvette, Quant-iT™ RiboGreen® RNA Assay Kit 및 RnaseZapTM을 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬 소재)에서 구입하였다. 루시퍼라아제를 코딩하는 mRNA를 TriLink™ Biotechnologies (mRNA-Luc - Ref.: L-7602에서 구입하였다.
모든 LNPs를 Precision Nanosystems(캐나다 브리티시 컬럼비아 소재)의 NanoAssemblr Benchtop을 사용하여 제조하였다.
LNPs의 제조
하기 완충제 시스템을 사용하였다:
- 인산염 완충 염수(PBS): 8 mM Na2HPO4, 및 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4
- 시트레이트 완충제-10 mM: 5 mM 시트르산나트륨, 5 mM 시트르산, 150 mM 염화나트륨, pH 4.5
- 시트레이트 완충제-50 mM: 25 mM 시트르산나트륨, 25 mM 시트르산, pH 4.0
- 시트레이트-수크로스 완충제: 5 mM 시트르산나트륨, 5 mM 시트르산, 8% (w/v) 수크로스, pH 6.3
실시예 27에 기술된 절차에 따라 하기 LNPs를 제조하였다.
지질 상
LNPs SS-OP : SS-OP/DOPC/Chol=52.5/7.5/40, DMG-PEG2000 1.5 mol%
1.5 mL 코니칼 튜브에서 하기 용액들을 혼합함으로써 533 μL의 혼합 지질 용액을 제조하였다(총 지질 농도 9 mM) (총 지질 = SS 지질 + DOPC + Chol):
[표 7]
Figure pct00231
LNPs Lip. (IV) : 지질 화합물 (IV)/DSPC/Chol/DMG-PEG=50/10/38.5/1.5
1.5 mL 코니칼 튜브에서 하기 용액들을 혼합함으로써 533 μL의 혼합 지질 용액(총 지질 농도 5 mM)을 제조하였다.
[표 8]
Figure pct00232
수성 핵산 함유 상
하기 mRNA 함유 수성 용액들을 LNPs 제조에 사용하였다.
[표 9]
Figure pct00233
절차
LNPs를 하기 파라미터에 대한 제조업체의 권장 사항에 따라 NanoAssemblr™로 제조하였다.
[표 10]
Figure pct00234
LNPs를 4.25 μg의 mRNA(최종 함량)를 캡슐화하도록 제형화하였다.
LNPs의 수확 및 정제
수확된 LNPs SS-OP를 PBS에서의 희석 및 여과(100KD MWCO)에 의해 3회 세척하였다. 그 후, 재현탁된 LNPs를 0.2 μm 필터에서 여과시켰다.
수확된 LNPs Lip. (IV)를 PBS(pH 7.4)에서의 희석 및 여과(100KD MWCO)에 의해 3회 세척하였다. 그 후, 재현탁된 LNPs를 0.2 μm 필터에서 여과시켰다.
동물 연구
2개의 군(각각 10~12주령의 암컷 SKH1 무모 마우스 4마리씩)을 LNPs SS-OP 및 LNPs Lip. (IV)(루시퍼라아제 코딩 mRNA를 캡슐화함)로 테스트하였다. 마지막 군의 2마리 마우스에 PBS를 주사하고 대조군으로 사용하였다.
LNPs를 4.25 μg의 mRNA(최종 함량)를 캡슐화하도록 제형화하였다.
[표 11]
Figure pct00235
간, 비장, 신장, 폐 및 심장의 복사휘도를 하기 절차에 따라 생체 외에서 24시간에 취하였다.
루시페린(200 mg/kg)을 피하 주사한지 대략 15분 후에 CO2에 의해 동물을 안락사시킨 직후 단리된 장기의 생체 외 생물발광을 수행하였다. 해부된 장기를 블랙 시트 상에 두고, IVIS Spectrum CT(PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 홉킨턴 소재)로 이미징하였다. 생물발광 방출 신호를 정량화하기 위해, 동일한 관심 영역(regions of interest; ROI)을 각 장기 영역을 둘러싸도록 배치하였으며, 이미징 신호를 평균 복사휘도(광자/s/cm2/스테라디안)로 정량화하였다.
결과
생체 외 장기 분석을 주사한지 24시간 후에 수행하였다. 장기에 대한 데이터가 표 12에 요약되어 있다.
다른 장기(비장, 신장, 심장 및 폐)와 비교하여 비장에서 LNPs (IV)에 대해 유의한 형질도입 및 루시퍼라아제 발현이 관찰되었다(10~50배 더 높음). 간과 비교하여 비장을 표적화하는 LNPs (IV)의 특이성이 LNPs SS-OP보다 10배 더 높았다. LNPs SS-OP는 LNPs (IV)와 비교하여 비장에서 더 높은 절대 발현을 나타냈지만, 간에서의 상대적 발현이 유의하게 더 높았으며, 이는 LNPs SS-OP 제형이 비장보다 간을 표적화하는 데 더 많이 적합함을 보여준다. 따라서 상기 발견은 LNPs (IV)가 정맥내 투여를 통해 핵산을 특이적으로 비장으로 전달하는 데 효과적으로 사용될 수 있다는 주장을 뒷받침한다.
[표 12]
Figure pct00236
실시예 32 : IM 주사 후 바이오이미징
본 연구의 목적은 정상 마우스에서의 LNP 제형의 주사 후의 생체 내 단백질 발현을 결정하는 것이었다.
재료 및 방법:
10주령의 암컷 BALB/c ByJ 마우스를 Charles River lab(프랑스 69210 생-제르맹-누엘 레 온신스 소재)에서 획득하였다. T0에서 동물에게 50 μl의 LNPs 319 또는 LNPs Lip. (IV)(실시예 27에 기술된 바와 같이 제조됨)(5 μg의 루시퍼라아제 코딩 mRNA(mRNA-Luc - 참조번호: L-7602 TriLink™ Biotechnologies)를 함유함)을 근육내(IM) 경로로 주사하였다. PBS에 희석시킨 루시페린 칼륨 염(D-루시페린, K+ 염 Fluoprobes, Interchim)을 복강내(i.p) 경로를 통해 마우스당 3 mg(이는 루시퍼라아제 양에 비해 크게 과량임))으로 주사하였다.
광학 이미징은 IVIS Spectrum CT 장치(PerkinElmer Inc., 프랑스 파리 소재)를 사용하여 수행하였다. 생물발광 획득은 기질을 주입한지 15분 후에 시작되었다. 발광 수준을 주사 부위 영역에 적용된 ROI에 의해 평가하였다(Living Image 소프트웨어, 프랑스 파리 소재의 PerkinElmer Inc.). 결과를 LNPs/mRNA-Luc 주사 후 시간(h)의 함수로 총 플럭스(ph / s)로 표현한다.
결과
결과가 도 6에 제시되어 있다. 대퇴사두근에 LNPs / mRNA-Luc를 주사한 후 6시간, 24시간, 48시간 및 78시간에 생물발광 이미징을 하여 단백질 발현(루시퍼라아제)을 측정하였다. 마우스에게 3 mg의 루시페린을 i.p. 경로로 주사하고, 생물발광 신호 획득을 IVIS CT 카메라로 수행하였다. LNPs Lip. (IV)(n=5)를 L319 LNP(n=3); 양성 대조군과 비교하여 테스트하였다. PBS(n=2)는 음성 대조군이었다. 결과를 시간(h)의 함수로 총 플럭스(ph/s)로서 표현한다. 평균 ± SD
단백질 발현이 PBS(백색 박스)와 비교하여 상기 두 군에서 관찰되었으며, 이때 발현 피크는 LNPs / mRNA-Luc의 IM 주사 후 6시간에 있었다. 생물발광 신호는 모든 LNP에 대해 유사한 프로파일로 시간이 지남에 따라 감소하였다. LNPs (IV)(회색 박스)는 양성 대조군 LNP L319(흑색 박스)와 유사한 생물발광 신호 패턴을 보여주었다.
실시예 33 : 본 발명의 이온화가능한 양이온성 지질을 포함하는 LNPs에서의 hEPO mRNA의 제형화
인간 에리트로포이에틴을 코딩하는 비복제, 고도 정제 mRNA인 CleanCap® EPO mRNA(5moU)를 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 TriLink Biotechnologies에서 획득하였다(카탈로그 번호 L7209; hEPO mRNA). TriLink의 고유한 공동 전사 캡핑 방법인 CleanCap을 사용하여 이 mRNA를 캡핑하는데, 이는 자연 발생 Cap 1 구조를 생성하고, 이때 캡핑 효율은 높다. 이것은 폴리아데닐화되고, 5-메톡시우리딘으로 변형되고 포유류 시스템에 최적화된다. 이것은 완전히 프로세싱된 성숙 mRNA를 모방한다.
hEPO mRNA(N/P 전하비 = 6), 및 화학식 IV의 이온화가능한 지질(DOG-IM4) 또는 화합물 (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX) 또는 (XXII)의 주어진 유사체, DSPC, Chol 및 DMG-PEG2000(50:10:3.5:1.5의 몰비)을 포함하는 LNPs를 NanoassemblR을 사용하여 실시예 27에 기술된 바와 같이 제조하였다. 3/1의 수성/에탄올 상 부피 비 및 4 mL/분의 총 유량을 사용하였다. LNPs를 PBS 1X 중 60 μg의 hEPO mRNA/mL 농도로 제조하였다.
실시예 34 : LNPs Lip. (IV)/DSPC, 또는 주어진 유사체(hEPO mRNA를 함유)를 이용한 마우스의 근육내 주사 및 혈청에서의 hEPO 발현의 검출
동물
암컷 Balb/c ByJ 마우스(수령시 7주령)를 Charles River Laboratories(프랑스 생-제르맹-누엘 소재)에서 구입하고, 1주 적응을 위해 수용한 후 연구를 시작하였다. 마우스를 털 착색에 의해 개별적으로 식별하였다. 실험은 Sanofi Pasteur의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 동물 관리 표준에 대한 유럽 지침을 따랐다.
연구 일정
군당 4마리의 8주령 마우스에게 LNPs Lip. (IV)/DSPC에 제형화된 1 μg 용량의 hEPO mRNA를 50 μL의 최종 부피로 대퇴사두근 내에 근육내 경로를 통해 D0에 주사하였다. 음성 대조군으로서, 4마리의 마우스는 동일한 부피의 PBS(가속화 안정성 연구 및 지질 스크리닝을 위해) 또는 시트레이트 완충제(지질 스크리닝을 위해)를 받았다.
특정 ELISA 분석법을 사용하여 혈청에서 hEPO의 발현을 측정하기 위해 주사한지 6시간 후에 혈액 샘플을 수집하였다.
혈액 샘플
혈액 샘플은 혈청-분리 튜브(BD Vacutainer # BD367957)에서
Figure pct00237
(1.6 mg의 케타민 / 0.32 mg의 자일라진)을 이용한 깊은 마취 하에 경동맥 절개에 의해 주사한지 6시간 후에 수집하였다. 혈청을 분취하고, hEPO를 측정할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
마우스 혈청에서의 hEPO의 측정
마우스 혈청에서의 hEPO 발현을 인간 에리트로포이에틴 Quantikine IVD ELISA 키트(R&D Systems #DEP00)를 사용하여 평가하였다. ELISA를 공급업체의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게는, 혈청을 미리 코팅된 플레이트에 첨가하고, 오비탈 진탕 하에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청 제거 후, 에리트로포이에틴 콘쥬게이트를 오비탈 진탕 하에 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 기질 용액을 실온에서 20~25분 동안 첨가한 후 정지 용액으로 반응을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도(650 nm 신호 차감)를 마이크로플레이트 판독기에서 측정하였다. 데이터를 SoftmaxPro 소프트웨어를 사용하여 분석하고, pg/mL 단위의 마우스 혈청에서 측정된 hEPO 농도의 log10으로 표현하였다.
[표 13]
Figure pct00238
실시예 35 : 화학식 IV의 지질(DOG-IM4) 및 hEPO mRNA를 포함하는 LNPs의 안정성
LNPs Lip. (IV)/DSPC를 이용하여 실시예 30에서 관찰된 장기간 안정성을 확인하기 위해 안정성 연구를 수행하였다.
상기 기술된 바와 같이 hEPO mRNA를 이용하여 제형화된 LNPs Lip. (IV)/DSPC를 먼저 PBS 1X로 20 μg/ml의 농도까지 희석시켰다. 그 후, LNP 현탁액을 5℃, 25℃ 및 37℃에서 최대 18주 동안 온도 제어 인큐베이터에 보관하여 생성물 안정성을 연구하였다. 제형의 하기 물리화학적 특성을 상이한 시점들에서 모니터링하였다(표 14):
[표 14]
Figure pct00239
RNA 적정, 캡슐화율, LNP 입자 크기, 다분산 지수 및 LNP 현탁액의 pH 및 오스몰랄 농도를 실시예 27에 기술된 바와 같이 결정하였다.
LNPs에서의 mRNA 무결성의 결정을 위해, 먼저 추출 절차(아래 참조)를 사용하여 mRNA를 추출하고, Fragment Analyzer 5200(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)을 사용하여 그의 무결성을 결정하였다.
LNP 지질 무결성은 CAD 검출을 이용하여 HPLC 방법을 사용하여 결정하였다(아래 참조).
LNPs로부터의 mRNA의 추출
간단히 말해서, 본 절차에서는 LNP 트리톤 X100 처리와 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 지질 추출이 조합되며, 이는 이하에 기술된 바와 같다.
RNase가 없는 마이크로퓨즈 튜브에 192 μL의 LNP 및 8 μL의 25% 용액 트리톤 X100(Acros Organics)을 첨가하여 1% 트리톤 X100의 최종 농도를 얻는다. 그 후, 상기 현탁액을 볼텍싱하고, Eppendorf 서모사이클러에서 700 rpm에서 교반하면서 50℃에서 10분 동안 가열한다. 실온까지 냉각시킨 후, 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1 vol/vol)(Sigma 참조번호 77617) 200 μL를 첨가한다. 상기 혼합물을 볼텍싱하고, 그 후 Eppendorf 탁상용 마이크로원심분리기를 사용하여 12000g에서 5분 동안 원심분리한다. 원심분리 후, mRNA를 포함하는 상부 수성 상을 RNAse가 없는 새로운 마이크로퓨즈 튜브로 옮기고, 200 μL의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1 vol/vol)(Acros Organics 참조번호 327155000)을 첨가한다. 상기 혼합물을 볼텍싱하고, 그 후 Eppendorf 마이크로원심분리기에서 12000g에서 5분 동안 원심분리한다. 상부 수성 상을 수집하고, 0.1 부피의 3 M 아세트산나트륨 용액(pH 5.2)(Molecular biologics 참조번호 R1181) 및 2.5 부피의 100% 에탄올과 혼합하여 mRNA를 침전시킨다. 상기 혼합물을 -20℃에서 12시간 동안 보관하고, 12000g에서 10분 동안 원심분리한다. 원심분리 후, 상청액을 버리고, mRNA 펠렛을 200 μL의 70% 에탄올로 헹군다. 현탁액을 12000g에서 5분 동안 다시 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 잔존 고체를 SpeedVac 진공 농축기에서 건조시킨다.
마지막으로, 건조 펠렛을 30 μL의 RNAse 무함유 물로 재현탁시키고, 생성된 용액의 mRNA 함량을 NanoDrop 2000c UV 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 UV 분광광도법(260 nm에서의 흡광도)으로 측정하고, Fragment Analyzer 5200(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)을 사용한 주요 피크 백분율 분석에 의해 이의 무결성을 분석한다.
LNP 지질 함량 및 무결성 분석을 위한 HPLC-CAD 방법
LNPs에서의 상이한 지질 성분들의 분리 및 분석을 위해 하전 에어로졸 검출(Charged Aerosol Detection; CAD)을 사용하는 RP-HPLC 방법을 사용하였다. 장비 및 크로마토그래피 조건은 하기 표에 설명되어 있다.
[표 15]
Figure pct00240
컬럼을 하기 단계에 따라 A 중 용매 시스템 B의 구배로 용출시켰다.
[표 16]
Figure pct00241
이 방법을 사용하면 DOG-IM4, DSPC, Chol 및 DMG-PEG2000이 C18-HPLC 컬럼에서 잘 분리되며, 이는 아래의 전형적인 크로마토그램에서 나타난 바와 같다.
4 마이크로리터의 LNPs Lip. (IV)/DSPC(hEPO mRNA를 함유)(안정성 연구에서 기술된 바와 같이 제조)를 크로마토그래피 시스템에 주입하였으며, 시간의 함수로서 기록된 크로마토그램이 도 12에 예시되어 있다.
결과
도 13에 예시된 바와 같이, LNPs Lip. (IV)/DSPC의 pH는 상이한 보관 온도들에서 시간이 지나도 안정하다.
도 14는 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 오스몰랄 농도가 상이한 보관 온도들에서 시간이 지나도 안정함을 보여준다.
도 15는 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 입자 크기가 상이한 보관 온도들에서 시간이 지나도 안정함을 보여준다.
도 16은 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 mRNA 캡슐화율이 상이한 보관 온도들에서 시간이 지나도 안정함을 보여준다.
도 17은 LNPs Lip. (IV)/DSPC에서의 mRNA 무결성이 상이한 보관 온도들에서 시간이 지나도 안정함을 보여준다.
도 18은 LNPs Lip. (IV)/DSPC의 지질 크로마토그램이 상이한 보관 온도들에서 시간이 지나도 안정함을 보여준다. 도 18a에서, 상단 패널은 4℃에서 18주 후 LNPs Lip.(IV)/DSPC를 보여준다. 하단 패널은 T0에서의 상기 LNPs를 보여준다. 도 18b에서, 상단 패널은 25℃에서 18주 후 LNPs Lip.(IV)/DSPC를 보여준다. 하단 패널은 T0에서의 상기 LNPs를 보여준다. 도 18c에서, 상단 패널은 37℃에서 18주 후 LNPs Lip.(IV)/DSPC를 보여준다. 하단 패널은 T0에서의 상기 LNPs를 보여준다.
도 19에서, LNPs Lip. (IV)/DSPC로부터의 hEPO 발현이 상이한 보관 온도들에서 시간이 지나도 안정함이 나타나 있다.
결론
LNPs Lip. (IV)/DSPC(hEPO mRNA를 함유)는 4℃에서 PBS 중 액체 제형으로 보관될 때 현저한 안정성을 나타냈다. 안정성은 마우스에 IM 투여시 그 다음의 상이한 물리화학적 특성들과, hEPO 발현에 의해 관찰될 수 있었다(효력 분석법으로 사용됨). 제형은 4℃에서 적어도 18주 동안 및 25℃에서 적어도 1주 동안 안정하였다.
실시예 36 : 비인간 영장류에서의 인플루엔자 HA mRNA(Amptec으로부터의 1MpU-변형)를 포함하는 LNPs의 면역원성
재료 및 방법:
Lip. (IV)[또는 각각 대조군에서 L319], DSPC, Chol 및 DMG-PEG2000(50:10:3.5:1.5의 몰비), 및 1MpU-변형 HA mRNA(N/P 전하 비 = 6)로부터 제조된 LNPs를 실시예 27에 기술된 바와 같이 제조하고, 시노몰구스 마카크의 면역화에 사용하였다.
5마리의 암컷 시노몰구스 마카크의 군을 4주 간격으로 2회(D0, D28) 면역화하였으며, 이때 , LNPs 중 mRNA 50 μg을 500 μl의 부피로 이두박근에 IM 주사하였다.
HI 분석법에 의한 항체 반응 분석을 위해 혈액 샘플을 D-33(예비-면역화) 및 면역화 후 상이한 시간 간격으로 수집하였다(실시예 6에 기술된 바와 같음).
결과가 도 20에 예시되어 있다.
결론
LNPs Lip. (IV)/DSPC(1MpU-변형 HA mRNA를 함유)는 2회의 IM 투여 후 마카크에서 강력한 HI 반응을 유도한다.
실시예 37: 마우스에서 인플루엔자 HA mRNA를 포함하는 LNPs의 면역원성
본 연구의 목적은 인플루엔자 바이러스의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 비복제 mRNA를 함유하는 그리고 본원에 개시된 바와 같은 상이한 지질 화합물로 만들어진 상이한 LNPs로 유도된 면역원성을 평가하는 것이었다.
BALBc/ByJ 마우스(D0에서 8주령; 군당 8마리)를 다음의 5가지의 상이한 지질 나노입자에 제형화된 인플루엔자 바이러스 주 A/Netherlands/602/2009(H1N1)의 전장 헤마글루티닌(HA)을 코딩하는 천연, 비복제 mRNA 5 μg으로 실시예 29에 기술된 바와 같이 면역화하였다: LNPs L319, LNPs Lip. (IV)[DOG-IM4], LNPs Lip. (IX), LNPs Lip. (XII) 및 LNPs Lip. (XVI).
LNPs를 실시예 27에 기술된 바와 같이 제조하였고, 이는 항상 50:10:38.5:1.5의 몰비의 이온화가능 지질/DSPC/Chol/DMG-PEG2000으로 구성되었다. 비 N/P는 항상 6이었다.
실시예 29에 기술되고 도 21에 보고된 바와 같이 2차 면역화 3주 후에 HI 역가를 측정하였다.
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI PASTEUR <120> LIPIDIC COMPOUNDS AND COMPOSITIONS CONTAINING THEREOF, AND USES THEREOF <130> PR86814 <160> 1 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus (A/Netherlands/602/2009(H1N1)) <220> <223> Hemagglutinin <400> 1 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser 210 215 220 Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys 245 250 255 Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro 275 280 285 Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565

Claims (30)

  1. 하기 화학식 I의 하나 이상의 말단 라디칼:
    [화학식 I]
    *-NH-CX-(NH)n-A
    [여기서,
    - *-는 상기 화학식 I의 라디칼을 하나의 C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결하는 단일 결합을 나타내고;
    - n은 0 또는 1이고;
    - X는 산소 또는 황 원자이고,
    - A는 선택적 치환 5원 또는 6원 불포화 복소환식 라디칼 또는 5원 또는 6원 헤테로방향족 고리 라디칼(이들 둘 다 하나 이상의 질소 원자를 함유함)을 나타냄];
    또는 상기 화학식 I의 라디칼의 제약상 허용가능한 염들 중 하나를 포함하는 지질 화합물(상기 화합물은 모든 가능한 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태로 존재함).
  2. 제1항에 있어서, 양이온 형태인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X는 황 원자이고, A는 피리디닐 라디칼, 예를 들어 3-피리디닐 라디칼인 화합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, X는 산소 원자이고, A는 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 5원 헤테로방향족 고리 라디칼이고, 예를 들어 A는 이미다졸릴 라디칼, 예를 들어 4-이미다졸릴 라디칼인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 II의 하나의 화합물:
    [화학식 II]
    R1 -Z -NH-CX-(NH)n-A
    [여기서,
    - X, n 및 A는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고;
    - R1은 하나의 C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기이고;
    - Z는 분지형 또는 비분지형 선형 포화 또는 불포화 탄화수소 사슬(상기 사슬에는 산소 원자 및/또는 ―S―S― ; ―(O=C)― ; ―(C=O)― O―; ―O―(O=C)― ; ―S― ; ―NH― , ―NH―(O=C)― ; ―(O=C)― NH― 및 ―NH―(C=O)― O― 중에서 선택되는 모이어티 하나 또는 여러 개, 바람직하게는 ―(C=O)― O―; ―O―(O=C)― 및 ―NH―(C=O)― O―가 개재되고, 선택적으로, 말단에서 산소 원자 또는 ―NH―(OC)― ―O―(O=C)――; ―(C=O)― O―; 및 ―(O=C)― 중에서 선택되는 모이어티가 소수성 테일 기에 연결됨)에 2 내지 24개, 예를 들어 2 내지 18개, 예를 들어 4 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 스페이서 아암(arm)이고;
    - p는 0 또는 1임];
    또는 상기 화학식 II의 화합물의 제약상 허용가능한 염들 중 하나; 및 임의의 그의 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 7 미만, 또는 4.5 내지 7의 범위의 겉보기 pKa를 갖는 화합물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, A 및 X는 제3항에 정의된 바와 같은 화합물.
  8. 제4항 또는 제6항에 있어서, A 및 X는 제4항에 정의된 바와 같은 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기는 선택적 치환, 분지형 또는 비분지형 선형, 포화 또는 불포화, C10 내지 C55 탄화수소 라디칼이고, 상기 탄화수소 골격에는 하나 또는 여러 개의 산소 또는 질소 원자 및/또는 하나 또는 여러 개의 -O-CO- 또는 -CO-O-가 선택적으로 개재되고, 상기 하나의 질소 원자는 골격에 존재하는 경우 제1항의 화학식 I을 갖는 상기 라디칼에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있는 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, C10 내지 C55 친유성 또는 소수성 테일 기는 다음으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 (R1a) 또는 (R1b)인 화합물:
    Figure pct00242

    Figure pct00243

    Figure pct00244

    Figure pct00245

    Figure pct00246
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 또는 친유성 테일은 스페이서에 대한 그의 결합에 관여하는 하나 이상의 아미노 모이어티를 포함하는 화합물.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 또는 친유성 테일은 적어도 3개 이상의 탄화수소 사슬을 포함하는 화합물.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 아암 Z는 1 내지 24개, 구체적으로 2 내지 15개, 더 구체적으로 3 내지 12개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하고, 바람직하게는 ―(C=O)― O―; ―O―(O=C)―; ―NH―(O=C)―; ―(O=C)― NH― 및 ―NH―(C=O)― O― 중에서 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하는 화합물.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 아암 Z는 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물:
    Figure pct00247

    Figure pct00248
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 아암 Z는 1 내지 24개, 구체적으로 2 내지 15개, 더 구체적으로 3 내지 12개의 에틸렌 옥시드 단위를 포함하고, 하나 이상의 NH―(CO)― O―를 추가로 포함하는 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물:
    [화학식 III]
    Figure pct00249

    [화학식 IV]
    Figure pct00250

    [화학식 V]
    Figure pct00251

    [화학식 VI]
    Figure pct00252

    [화학식 VII]
    Figure pct00253

    [화학식 VIII]
    Figure pct00254

    [화학식 IX]
    Figure pct00255

    [화학식 X]
    Figure pct00256

    [화학식 XI]
    Figure pct00257

    [화학식 XII]
    Figure pct00258

    [화학식 XIII]
    Figure pct00259

    [화학식 XIV]
    Figure pct00260

    [화학식 XV]
    Figure pct00261

    [화학식 XVI]
    Figure pct00262

    [화학식 XVII]
    Figure pct00263

    [화학식 XVIII]
    Figure pct00264

    [화학식 XIX]
    Figure pct00265

    [화학식 XX]
    Figure pct00266

    [화학식 XXI]
    Figure pct00267

    [화학식 XXII]
    Figure pct00268

    [화학식 XXIII]
    Figure pct00269

    [화학식 XXIV]
    Figure pct00270

    [화학식 XXV]
    Figure pct00271

    [화학식 XXVI]
    Figure pct00272

    [화학식 XXVII]
    Figure pct00273

    및 이들의 제약상 허용가능한 염, 및 이들의 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태.
  17. 제16항에 있어서, 화합물 (IV), (VIII), (IX), (XII), (XVI), (XIX) 및 (XXII), 및 이의 염 또는 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태 중에서, 또는 화합물 (IV), (IX), (XII), 또는 (XVI), 더 구체적으로 화합물 (IV) 또는 (XII), 및 이의 염 또는 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태 중에서 선택되거나, 하기 화학식 IV의 화합물, 및 이의 염 또는 라세미, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태인 화합물:
    [화학식 IV]
    Figure pct00274
    .
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지질 화합물 및 중성 지질, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 페길화(PEGylated) 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, POPC, DOPC 등의 포스파티딜콜린; DOPE, DPPE, DMPE, DSPE, DLPE 등의 포스파티딜에탄올아민; DPPS; DOPG; 스핑고마이엘린; 및 세라마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르는 콜레스테롤 및 이의 유도체, 에르고스테롤, 데스모스테롤, 스티그마스테롤, 라노스테롤, 7-데히드로콜레스테롤, 디히드로라노스테롤, 자이모스테롤, 라토스테롤, 디오스게닌, 시토스테롤, 시토스타놀, 캄페스테롤, 24-메틸렌 콜레스테롤, 콜레스테릴 마르가레이트, 콜레스테릴 올레에이트, 및 콜레스테릴 스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 페길화 지질은 PEG-DAG, DMG-PEG, PEG-PE, PEG-S-DAG, PEG-S-DMG, PEG-cer, mPEG-N,N-디테트라데실아세트아미드, 또는 PEG-디알콕시프로필카르바메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 중성 지질, 하나 이상의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 하나 이상의 페길화 지질을 포함하고, 상기 지질 화합물, 상기 중성 지질, 상기 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르 및 상기 페길화 지질은 지질 및 지질 화합물의 총량에 대해 약 30% 내지 약 70%의 지질 화합물, 약 0% 내지 약 50%의 중성 지질, 20% 내지 약 50%의 스테로이드 알코올 또는 이의 에스테르, 및 약 1% 내지 약 15%의 페길화된 것의 몰량으로 존재하는 조성물.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 핵산을 추가로 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산은 항원을 코딩하는 조성물.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지질 화합물 및 하나 이상의 핵산을 포함하는 지질 나노입자.
  26. 제25항에 있어서, 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 지질을 추가로 포함하는 지질 나노입자.
  27. (i) 하나 이상의 핵산 및 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지질 화합물, 또는 (ii) 하나 이상의 핵산 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물, 또는 (iii) 제25항 또는 제26항에 따른 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 제약 조성물.
  28. (i) 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지질 화합물, 또는 (ii) 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물, 또는 (iii) 제25항 또는 제26항에 따른 하나 이상의 지질 나노입자(여기서, 상기 핵산은 하나 이상의 항원을 코딩함)를 포함하는 면역원성 조성물.
  29. 의약으로 사용하기 위한, (i) 하나 이상의 핵산 및 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지질 화합물, 또는 (ii) 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물, 또는 (iii) 제25항 또는 제26항에 따른 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 조성물.
  30. 감염성 질환, 알러지, 자가면역 질환, 희귀 혈액 질환, 희귀 대사 질환, 희귀 신경계 질환, 및 종양 또는 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료 방법에 사용하기 위한, (i) 하나 이상의 핵산 및 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 지질 화합물, 또는 (ii) 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물, 또는 (iii) 제25항 또는 제26항에 따른 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 조성물.
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