KR20230034794A - 내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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김동현
손화영
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Abstract

본 발명은 활성성분으로서 덱사메타손, 생분해성 고분자로서 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 및 안정화제를 포함하는 나노입자; 및 하이드로겔;을 포함하는, 난치성 내이 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물에 관한 것으로서, 약물의 내이 체류 시간을 연장하고 덱사메타손의 방출을 지속화할 수 있는 효과가 있다.

Description

내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물 및 이의 제조방법{Hydrogel composition containing nanoparticles for topical drug delivery for the treatment of inner ear disease}
본 발명은 내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
내이 질환으로 유발되는 난청이 장기간의 소음 노출, 수명 연장, 및 항암제 등의 약물 사용으로 인해 증가하고 있다. 따라서, 내이로의 약물 전달에 대한 관심이 높아지고 있다. 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 글루코코르티코이드 약물이 항염 효과를 갖는 잠재적인 귀 보호 약물로 고려된다. 전신 약물 투여는 일반적으로 매우 적은 양의 약물만이 내이에 도달하고 부작용이 발생하는 문제가 있다. 반면, 내이로의 약물 전달은 혈-내이격막(blood-labyrinth barrier)을 통과하지 않고, 전신 투여시의 초회통과대사(first pass metabolism)를 피하며, 내이에서 높은 약물 농도를 유지하고 투여되는 약물의 총량을 감소시킬 수 있는 장점이 있다.
약물을 고막(eardrum)을 통해 중이(middle ear)로 주입해서 내이로 약물을 전달하는, 고실내(intratympanic, IT) 주입이 효과적이라는 것이 수년간 알려지고 연구되어 왔다. 1990년대 중반부터 귀에 약물을 국소 전달해서 임상적으로 치료하게 되었다. 약물이 중이에 투여되면, 내이에 도달하기 위해서 정원창막(round window membrane, RWM)을 통과해야만 한다. 이를 위해 투여된 약물이 충분한 시간 동안 중이에 남아있고, 정원창막과 접촉할 필요가 있다. 그러나, 중이로 투여된 약물은 점막의 흐름을 통해 유스타키오관(Eustachian tube)으로 빠르게 제거된다.
종래 생분해성 고분자로 제조된 나노입자에 대한 연구는 내이로의 약물 전달에 대한 관심을 불러일으켰다. 국소 약물 투여를 위한 담체로서 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)는 미국 식품의약국(Food and Drug Adminisatation, FDA) 및 유럽의약품청(European Medicine Agency, EMA)에 의해 승인되었다. 종전 연구를 통해, 시험동물의 정원창막에 로다민(rhodamine)-함유 PLGA 나노입자를 적용했을 때 외림프로 이동하는 것이 입증되었다(X. Ge, et al., 2005). 실제로 PLGA 나노입자가 정원창막을 통해 약물을 내이로 운반하지만, 나노입자 현탁액이 유스타키오관을 통해 손실되는 문제가 있는 것으로 확인되었다(H. Cai, et at., 2014).
종래 특허기술로서 한국등록특허 제10-1449785호에는 내이에 활성제의 지속 방출을 제공하는 약학 조성물로서, 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 공중합체, 및 다중미립자 활성제를 포함하는 약학 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 한국등록특허 제10-1449785호에는 활성제로서 덱사메타손을 사용하는 경우의 약물 방출 프로파일에 대해서는 구체적으로 제시하고 있지 않고, 폴리(d,l-락트산)과 PLA-PEG를 이용한 나노입자 조제물 또는 d,l-PLGA 미세구 조제물을 제조한 점, 시클로덱스트린 함유 겔제제 또는 리포좀/겔 제제를 제조한 점 등을 제시하고 있으나 PLGA 미세구가 포함된 열가역성 겔 제제를 제시하고 있지 않다.
본 발명자들은 덱사메타손의 약물 특성을 고려하여 세포독성을 감소시키면서도 약물 방출을 지속화할 수 있는 시스템을 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제10-1449785호
1) X. Ge, R.L. Jackson, J. Liu, et al., Distribution of PLGA nanoparticles in chinchilla cochleae, Otolaryngol, Head. Neck Surg., 137, 617-623 (2007). 2) H. Cai, X. Wen, et al., Enhanced local bioavailability of single or compound drugs delivery to the inner ear through application of PLGA nanoparticles via round window administration, Int. J. Nanomedicine, 9, 5591 (2014).
본 발명의 목적은 난치성 내이 질환을 치료하기 위해 덱사메타손 약물을 내이에 전달할 수 있는 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 난치성 내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은,
활성성분으로서 덱사메타손, 생분해성 고분자로서 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 및 안정화제를 포함하는 나노입자; 및 하이드로겔;
을 포함하는, 내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물에 관한 것이다.
상기 나노입자는 덱사메타손, PLGA 및 안정화제가 1: 2.8~3.6: 10~14의 중량비로 혼합된 것이 바람직하고, 1: 3.1~3.3: 11~13의 중량비로 혼합된 것이 보다 바람직하다.
상기 안정화제는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 메틸셀룰로오스(methylcellulose, MC), 히드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 히드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropylmethylcellulose, HPMC), 젤라틴(gelatin), 및 카보머(carbomer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 하이드로겔은 폴록사머를 포함할 수 있고, 상기 폴록사머는 폴록사머 188(poloxamer 188) 및 폴록사머 407(poloxamer 407) 중 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 폴록사머는 폴록사머 188 및 폴록사머 407이 혼합된 것일 수 있다. 바람직하게는 폴록사머 188 및 폴록사머 407이 1: 1.3~1.7의 중량비로 혼합된 것이고, 보다 바람직하게는 1: 1.4~1.6의 중량비로 혼합된 것이다.
상기 내이 질환은, 이명, 현기증, 난청, 감각신경성 난청, 만성 이통, 외림프 누공, 이차 내림프수종, 미로염 및 전정 신경염, 청신경종, 내이독성, 자가 면역성 내이 질병(AIED) 및 메니에르병으로 구성된 군으로부터 선택된 것이나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 양태에 따르면, 난치성 내이 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물의 제조방법으로서, 덱사메타손 및 PLGA를 유기용매에 용해하여 제1 혼합물을 제조하는 단계; 상기 제1 혼합물에 안정화제를 주입하고 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계; 상기 제2 혼합물에서 잔류 용매를 제거한 후 나노입자를 수득하는 단계; 및 상기 나노입자를 하이드로겔에 첨가해서 분산시키는 단계;를 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법에 있어서, 유기용매는 아세톤 및 디클로로메탄 중 1종 이상일 수 있다.
이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
본 발명은 활성성분으로서 덱사메타손, 생분해성 고분자로서 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 및 안정화제를 포함하는 나노입자; 및 하이드로겔;을 포함하는, 난치성 내이 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물에 관한 것이다.
상기 PLGA는 중량평균분자량이 5,000~200,000인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 중량평균분자량 10,000~75,000인 것을 사용하는 보다 바람직하며, 중량평균분자량이 38,000~54,000인 것을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서 안정화제로는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 메틸셀룰로오스(methylcellulose, MC), 히드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 히드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropylmethylcellulose, HPMC), 젤라틴(gelatin), 및 카보머(carbomer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 안정화제로서 폴리비닐알코올을 사용하는 것이 안정화 효과를 극대화할 수 있어 바람직하다. 폴리비닐알코올의 중량평균분자량은 10,000~100,000인 것이 바람직하며, 30,000~70,000인 것이 보다 바람직하다.
상기 나노입자는 덱사메타손, PLGA 및 안정화제가 1: 2.8~3.6: 10~14의 중량비로 혼합되어 제조되는 것이 바람직하고, 1: 3.1~3.3: 11~13의 중량비로 혼합되어 제조되는 것이 보다 바람직하다. 상기 중량비의 범위 내에서 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자가 제조되는 경우에, 나노입자의 크기가 정원창막을 통과할 수 있으며 장기 보관시 안정성이 우수하며, 나노입자의 봉입 효율이 향상되어 바람직하다.
본 발명에서 ‘하이드로겔’은 실온(room temperature)에서 용액 상태이고 체온에서 겔 상태로 존재하는, 이른바 ‘온도감응성 겔’을 의미한다. 이러한 온도감응성 겔로서, 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조를 갖는 삼중블록 공중합체인 폴록사머가 사용된다.
폴록사머는 폴록사머 188(poloxamer 188, P188) 및 폴록사머 407(poloxamer 407, P407) 중 1종 이상이 사용될 수 있고, 특히 폴록사머 188 및 폴록사머 407이 혼합된 것이 사용될 수 있다. 폴록사머 188 및 폴록사머 407이 1: 1.3~1.7의 중량비로 혼합된 것이 바람직하고, 1: 1.4~1.6의 중량비로 혼합된 것이 보다 바람직하다. 폴록사머 188 및 폴록사머 407이 상기 중량비로 혼합된 구성에 의해, 본 발명의 하이드로겔 조성물은 중이에 투여된 후 제형이 경화되는 겔화 시간이 약 50~70초가 될 수 있는 특징이 있다. 본 발명의 하이드로겔 조성물은 약 50~70초의 겔화 시간을 가짐으로써 제형이 RWM을 통해 내이로 충분히 전달되면서도 중이에 장시간 액체 상태로 머무르지 않고 겔화될 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 하이드로겔을 인산염완충식염수(PBS), 증류수 등에 폴록사머를 용해하여 제조할 수 있다. 이때 하이드로겔 내에는 폴록사머 188이 8~12%(w/v), 바람직하게는 10~12%(w/v), 및 폴록사머 407이 10~22%(w/v), 바람직하게는 14~20%(w/v)의 범위로 포함될 수 있다.
본 발명의 나노입자 함유 하이드로겔 조성물은 상기 하이드로겔에 덱사메타손 함유 PLGA 기반의 나노입자가 분산된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 PLGA 기반의 나노입자 및 이를 포함한 하이드로겔 조성물은 나노입자에 봉입되지 않은 덱사메타손에 비해 세포독성이 적고 내이 조직내에서의 독성도 나타나지 않는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명에 따른 나노입자 함유 하이드로겔 조성물은 내이 체류 시간을 연장하고 덱사메타손의 방출을 지속화할 수 있어, 내이 질환 치료 효과를 상승시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 조성물이 적용가능한 내이 질환은, 이명, 발작성 체위성 현기증(BPPV)과 같은 현기증, 난청, 감각신경성 난청, 만성 이통, 외림프 누공, 이차 내림프수종, 미로염 및 전정 신경염, 청신경종, 내이독성, 자가 면역성 내이 질병(AIED) 및 메니에르병으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 양태에 따르면, 내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물의 제조방법으로서, 덱사메타손 및 PLGA를 유기용매에 용해하여 제1 혼합물을 제조하는 단계; 상기 제1 혼합물에 안정화제를 주입하고 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계; 상기 제2 혼합물에서 잔류 용매를 제거한 후 나노입자를 수득하는 단계; 및 상기 나노입자를 하이드로겔에 첨가해서 분산시키는 단계;를 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
상기 제1 혼합물을 제조하는 단계에 있어서 덱사메타손 및 PLGA는 1: 2.8~3.6의 중량비로 사용되는 것이 바람직하고, 1: 3.1~3.3의 중량비로 사용되는 것이 보다 바람직하다. 덱사메타손 및 PLGA를 이 두성분의 총 중량에 대하여 10~100 부피배의 유기,에 용해한다. 이때, 유기용매는 제한되지 않으나, 디클로로메탄 및 아세톤 중 1종 이상을 사용할 수 있고, 아세톤을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제2 혼합물을 제조하는 단계에 있어서, 제1 혼합물에 안정화제를 자동주사기 등을 사용하여 주입하면서, 교반기를 이용하여 300~700 rpm의 교반속도로 교반한다. 여기서의 안정화제는 덱사메타손의 사용된 중량을 기준으로 1: 10~14의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하고, 1: 11~13의 중량비로 혼합되는 것이 보다 바람직하다. 안정화제로서 폴리비닐알코올을 사용하는 경우에 용매, 바람직하게는, 물에 0.5~2%(w/v)의 농도로 용해하여 사용하는 것이 바람직하다.
이후, 흄 후드(fume hood)에서 12~36시간 동안 잔류 용매를 제거하고 나서, 생성된 나노입자를 5,000~15,000 rpm에서 20분~1시간 동안 원심분리기를 이용하여 수집하고 증류수 등으로 수회 세척하여 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자를 수득한다.
상기 나노입자를 나노입자 100 중량부 기준 100~1000 중량부의 하이드로겔에 첨가해서, 믹서기 및 초음파 배스 등을 이용하여 분산시켜, 나노입자 함유 하이드로겔 조성물(DEX-NP-gel)을 제조한다.
본 발명의 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물은 내이 체류 시간을 연장하고 덱사메타손의 방출을 지속화할 수 있는 효과가 있다. 또한, 덱사메타손 함유 PLGA 기반의 나노입자 및 상기 나노입자 함유 하이드로겔 조성물은 나노입자에 봉입되지 않은 덱사메타손에 비해 세포독성이 적고 내이 조직내에서의 독성도 나타나지 않아 난치성 내이 질환의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
도 1은 덱사메타손(DEX), 물리적 혼합물(physical mixture, PM), 덱사메타손을 함유하지 않은 PLGA 나노입자(Blank-NP), 및 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)에 대한 시차 주사 열량 분석(Differential scanning calorimetry, DSC) 프로파일을 나타낸다.
도 2는 DEX, PM, Blank-NP, 및 DEX-NP에 대한 푸리에 변환 적외선 분광 스펙트럼이다.
도 3은 DEX, DEX-NP, 및 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자를 포함하는 하이드로겔 조성물(DEX-NP-gel)의 약물 방출 프로파일을 나타낸다.
도 4(A) 및 도 4(B)는 0~8주(week) 동안 시험관내 약물 방출 시험으로 DEX-NP(도 4(A)) 및 DEX-NP-gel(도 4(B))의 안정성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 인간 멜라닌 세포에 DEX, DEX-NP 및 DEX-NP-gel을 처리한 후 MTT 어세이를 이용하여 세포 생존율을 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 마우스의 고실 내에 Blank-NP(Control), DEX solution(DEX), DEX-NP 및 DEX-NP-gel를 투여한 후 마우스 달팽이관의 나선 신경절 세포(spiral ganglion cells, scale bar = 40 μm) 및 혈관선조(stria vascularis, scale = 20 μm)를 관찰한 사진이다.
도 7은 마우스의 고실 내에 쿠마린-6 용액(coumarin-6 solution, Cou), 쿠마린-6 캡슐화 제형(Cou-NP) 및 겔 분산 제형(Cou-NP-gel)을 투여한 후 생체 내 형광 이미지를 나타낸 사진(도 7(A)) 및 그 형광 강도를 정량화한 그래프(도 7(B))이다(* p<0.05, ** p<0.1).
도 8은 마우스의 고실 내에 DEX, DEX-NP 및 DEX-NP-gel를 투여한 후 달팽이관 내 덱사메타손의 체내분포(biodistribution) 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 하지만 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않으며, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지며, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
실험재료
폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA, lactide:glycolide=50:50, MW 38,000-54,000), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA, MW 30,000-70,000), 쿠마린-6(coumarin-6), 및 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS), 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 항생제, 및 MEM 배지는 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. Poloxamer 407 (P407) 및 Poloxamer 188(P188)은 BASF Laboratories(Wyandotte, Michigan, USA)에서 구입하였다. 덱사메타손(dexamethasone, DEX)은 Chemical Industry (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. SK-MEL-31 cells은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, South Korea)에서 구입하였다. 모든 용매는 삼전화학(Samchun chemical, Pyeongtaek, South Korea)에서 구입하였다.
실험예 1. 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자의 제조 및 평가
1-1. 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자의 제조
덱사메타손(dexamethasone, DEX)이 로딩된 PLGA 나노입자(DEX-NP)를 수정된 나노침전법(modified nanoprecipitation method)에 의해 제조하였다. 이때 하기 표 1의 성분 및 그 함량으로 실시예 1-1 내지 1-13의 DEX-NP를 제조하였다. 먼저, PLGA, 및 덱사메타손을 15분 동안 초음파 배스에서 5mL 유기 용매(디클로로메탄(DCM) 및/또는 아세톤)에 용해시켰다. 그리고 나서, 얻어진 용액을 폴리비닐알코올 1%(w/v) 수용액 30 mL에 주입하고 유속은 자동주사기(autoinjector, KDS 200, KD Scientific)를 사용하여 20 mL/h로 하였다. 주입 동안, 혼합물을 자기 교반기를 사용하여 500 rpm으로 교반하였다. 그 후, 흄 후드(fume hood)에서 24시간 동안 잔류 용매를 제거하였다. 생성된 나노입자를 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리기를 이용하여 수집하고 증류수로 3회 세척하였다. 나노입자를 인산염완충식염수(PBS, pH 7.4)에 분산시켜 입자 크기 등의 평가에 사용하였다.
실시예 PLGA (mg) DEX (mg) Solvent (5 mL) PVA
(1%, mL)
실시예 1-1 60 15 DCM : Acetone = 1 : 1 30
실시예 1-2 60 15 DCM : Acetone = 1 : 9 30
실시예 1-3 60 15 Acetone 30
실시예 1-4 60 15 DCM 30
실시예 1-5 60 20 Acetone 30
실시예 1-6 60 25 Acetone 30
실시예 1-7 60 30 Acetone 30
실시예 1-8 65 25 Acetone 30
실시예 1-9 70 25 Acetone 30
실시예 1-10 75 25 Acetone 30
실시예 1-11 80 25 Acetone 30
실시예 1-12 85 25 Acetone 30
실시예 1-13 90 25 Acetone 30
또한, 위 실시예 1-11의 나노입자 성분 중 안정화제로서 폴리비닐알코올 대신에 폴록사머 188(poloxamer 188)의 1%(w/v) 수용액 30 mL을 사용하는 점만을 달리하여 DEX-NP를 제조하였고, 이를 비교예 1로 하였다.
1-2. 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자의 입자 크기 및 제타 전위 측정
덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)의 입자 크기는 실온에서 Zetasizer Nano S90((Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용하여 측정하였다. 시료를 증류수로 희석하고 제조사의 지침에 따라 강도(intensity)를 주었다. 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자의 제타 전위는 Zetasizer Nano Z(Malvern Instruments, Malvern, UK)로 측정하였다.
1-3. 봉입효율 (encapsulation efficiency, EE ) 결정
덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)의 봉입효율(encapsulation efficiency, EE)을 결정하기 위해 분산된 나노입자를 99% 에탄올로 희석해서 나노입자의 전체 구조를 붕괴시켰다. 그리고 나서 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 상층액에서 덱사메타손의 양을 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 분석하였다. 봉입효율은 다음 식에 의해 계산되었다.
Figure pat00001
위 식에서 WT는 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)를 제조하기 위해 사용된 덱사메타손의 총 중량이고, WL은 덱사메타손 함유 나노입자에 로딩된 덱사메타손의 중량이다.
1-4. HPLC를 이용한 나노입자의 덱사메타손 함량 측정
덱사메타손의 농도는 HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 결정하였다. 이동상은 아세토니트릴과 물(35 : 65 v/v)이 혼합된 용액을 사용했다. 유속은 1 mL/min이었고, 분리는 40℃로 설정된 Capcell Pak C18 column(150 nm × 4.6 mm, 5 μm 입자 크기, Shiseido)을 이용하여 수행하였다. 시료의 주입 부피는 20 μL이고, UV/Vis 검출은 254 nm이었다. 시료의 머무름시간(retention time)은 약 4.1분이었다.
1-5. 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자의 평가 결과
덱사메타손 함유 PLGA 나노입자의 스크리닝은 입자 크기, 제타 전위 및 EE를 기반으로 수행되었다. 표 1에 기재된 조성물에 대한 측정 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
실시예 Size (nm) PDI Zeta potential (mV) EE (%)
실시예 1-1 1510.9 ± 20.5 0.308 ± 0.067 -30.3 ± 5.7 2.4 ± 0.5
실시예 1-2 141.3 ± 5.5 0.126 ± 0.019 -23.3 ± 2.2 20.4 ± 1.5
실시예 1-3 192.6 ± 0.8 0.176 ± 0.039 -15.9 ± 3.4 26.8 ± 0.7
실시예 1-4 175.0 ± 1.7 0.153 ± 0.021 -19.8 ± 0.5 1.9 ± 0.2
실시예 1-5 196.8 ± 4.8 0.144 ± 0.012 -23.4 ± 4.3 26.7 ± 2.5
실시예 1-6 209.6 ± 7.0 0.277 ± 0.021 -22.4 ± 5.5 36.9 ± 12.3
실시예 1-7 234.7 ± 11.3 0.226 ± 0.062 -22.1 ± 0.7 39.3 ± 16.7
실시예 1-8 206.6 ± 4.4 0.319 ± 0.057 -18.2 ± 0.6 31.1 ± 1.7
실시예 1-9 199.8 ± 3.0 0.146 ± 0.005 -17.8 ± 0.3 37.2 ± 0.5
실시예 1-10 186.2 ± 2.3 0.279 ± 0.045 -17.6 ± 0.5 40.5 ± 3.2
실시예 1-11 150.0 ± 3.2 0.077 ± 0.056 -18.7 ± 0.6 64.4 ± 2.0
실시예 1-12 142.5 ± 1.6 0.430 ± 0.038 -21.5 ± 0.6 37.8 ± 1.4
실시예 1-13 115.3 ± 9.2 0.502 ± 0.117 -22.6 ± 0.3 35.8 ± 1.5
비교예 1 306.0 ± 3.25 0.685 ± 0.191 -16.6 ± 0.4 22.1 ± 2.7
입자 크기는 내이 약물 전달을 결정하는 가장 중요한 파라미터 중 하나이다. 내이 약물 전달에 가장 적합한 PLGA 나노입자는 정원창막(RWM)을 통과할 수 있는 100~200 nm 크기와 높은 봉입 효율(encapsulation efficiency)을 갖는 것으로 확인되었다. 스크리닝 공정시 유기 용매로서 디클로로메탄(DCM)과 아세톤이 사용되었는데, 디클로로메탄을 유기용매로 사용한 경우에는 봉입 효율이 매우 낮은 경향이 있었다. PLGA 나노입자 제조 공정에서 용매로서 디클로로메탄을 사용하면 아세톤만 사용하는 것보다 입자 크기가 더 큰 것으로 나타났다. 또한, 덱사메타손의 양을 늘리면 크기가 증가하고 PLGA의 양을 늘리면 크기가 감소하는 경향이 있다. 아울러, 안정화제로서 폴록사머 188을 사용한 비교예 1의 경우, 입자크기가 약 300nm를 초과하고, 봉입효율이 낮은 경향이 있는 것으로 확인되었다. 최종적으로, 실시예 1-11의 나노입자의 경우, 정원창막 투과에 적합하고 안정성을 가지며, 봉입 효율 면에서 가장 우수한 것으로 확인되어, 이를 후술하는 실험에서의 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)로 사용하였다.
실험예 2. 시차 주사 열량 분석(Differential scanning calorimetry, DSC )
제형 내 약물 및 담체의 물리적 상태를 평가하고 이들의 열적 특성을 분석하기 위해 시차 주사 열량 분석(DSC)을 수행하였다. 덱사메타손(DEX), 덱사메타손을 함유하지 않은 PLGA 나노입자(Blank-NP), 실시예 1-11의 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP) 및 물리적 혼합물(physical mixture, PM)에 대한 열량 분석은 DSC(S-650, SCINCO, Korea)를 사용하여 수행하였다. 열량 분석을 위해 Balnk-NP 및 DEX-NP를 동결건조하였다. 모든 시료 2 mg을 알루미늄 팬에 넣었다. 10℃/min 의 스캐닝속도로 25℃ 에서 300℃까지 가열하였다.
각 시료의 DSC 프로파일은 도 1에서 확인되는 바와 같다. DEX는 261.74℃에서 단일 발열 피크를 보였다. 또한 덱사메타손, PLGA 및 PVA를 포함하는 물리적 혼합물에서 각각 53.15℃, 223.12℃ 및 260.69℃에서 발열 피크가 관찰되었다. 223.12℃에서의 발열 피크는 PVA, 53.25℃에서의 피크는 PLGA인 것으로 확인되었다. Blank-NP에서는 52.81℃와 223.85℃에서 피크를 보여 각각 PLGA와 PVA의 피크로 결정되었다. DEX-NP에서는 53.08℃와 222.58℃에서 피크를 보여 PLGA와 PVA 피크인 것으로 확인되었다. 한편, 261.63℃에서 약간의 피크가 발생하였는데, 피크 크기가 작기 때문에 이 피크는 제제 조제시 미세척 DEX가 검출된 것으로 추정되었다. DSC 분석 결과로부터 덱사메타손이 PLGA 나노입자에 잘 통합되었음을 확인하였다.
실험예 3. 푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier transform infrared spectrometry, FT -IR)
덱사메타손과 제형 간의 상호 작용을 조사하기 위해 푸리에 변환 적외선 분광법을 수행하였다. 덱사메타손을 함유하지 않은 PLGA 나노입자(Blank-NP) 및 실시예 1-11의 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)를 FT-IR 스펙트럼을 위해 동결 건조시켰다. 모든 시료의 구조를 VERTEX 80v(Bruker, Germany)로 분석하였다. 시료는 64번 스캔하고 스캔 범위는 4000 cm-1 ~ 600 cm-1이었다.
도 2는 덱사메타손(DEX), 물리적 혼합물(PM), Blank-NP 및 DEX-NP(실시예 1-11)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다. DEX의 스펙트럼에서 두 개의 특징적인 흡수 피크가 관찰되었다. 1704.96 cm-1의 피크는 C=O의 신축진동흡수와 겹쳤고, 1661.24 cm- 1 의 피크는 C=C에 해당하였다. 1754.87 cm-1 에서 C=O 피크는 Blank-NP(PLGA NP)의 스펙트럼에 표시되었다. 그리고 Blank-NP는 1090.30 cm-1 에서 C-O 메틸기 신축진동을 보였다. DEX와 Blank-NP의 신축진동흡수 피크는 모두 물리적 혼합물(PM)에서 변화가 없었다. DEX-NP에서는 1754.47 cm-1, 1090.36 cm-1에서 흡수피크가 나타나서 Blank-NP와 유사하게 관찰되었으나 DEX의 흡수피크는 관찰되지 않았다. 따라서 FT-IR의 스펙트럼은 DEX-NP가 입자에 완전히 둘러싸여 있음을 확인했다.
실험예 4. 온도감응성 하이드로겔의 제조 및 평가, 및 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조
4- 1. 온도감응성 하이드로겔의 제조 및 겔화 시간 평가
폴록사머를 사용하여 온도감응성 하이드로겔을 제조하였다. 폴록사머 188 및 폴록사머 407을 다양한 비율로 혼합하였다(표 3). 온도감응성 겔은 저온법(cold method)에 따라 제조되었다. 폴록사머 188 및 폴록사머 407를 PBS(pH 7.4)에서 천천히 혼합하면서 교반하였다. 2시간 동안 교반한 후 용액이 투명해질 때까지 혼합물을 4℃의 냉장고에 보관하였다.
온도감응성 겔의 겔화 온도를 마우스 귀 온도에 대한 연구에 따라 38℃로 설정하였다. 간단히, 준비된 액체 겔 1 mL를 넣은 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)를 38℃로 설정된 수조(VS-1250W, Vision Scientific, Daejeon, South Korea)에 두었다. 동시에 스탑워치로 시간을 측정하면서 겔의 유동성을 관찰하였다. 수조 내에서 겔의 유동성이 사라질 때까지 시간을 측정하고, 그 시간을 겔화 시간(gelation time)으로 정의하였다. 시간 측정은 300s까지 진행하였다.
Poloxamer (%, w/v)
(P188 : P407)		 Gelation time (sec)
G1 16 : 0 > 300
G2 18 : 0 > 300
G3 20 : 0 > 300
G4 0 : 16 223.75 ± 15.32
G5 0 : 18 48.67 ± 5.51
G6 0 : 20 12.33 ± 2.52
G7 10 : 16 55.77 ± 3.35
G8 12 : 18 64.00 ± 7.21
G9 12 : 20 139.67 ± 16.65
G10 14 : 18 217.67 ± 7.51
G11 14 : 20 222.67 ± 20.13
온도감응성 겔의 겔화 시간은 중이에 투여된 후 제형이 경화되는 시간이다. 제형이 RWM으로 충분히 흘러야 하고 중이에 장시간 액체 상태로 머무르면 제거될 수 있어, 특정 겔화 시간을 갖는 것이 중요하다. 본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 특히 약 50~70초의 겔화 시간을 갖는 것이 바람직하고, 약 60초의 겔화 시간을 갖는 것이 가장 바람직하다. 이처럼 약 50~70초의 겔화 시간을 갖는 것이 제제 투여 후 내이에 전달될 때 적정온도에 도달할 수 있는 효과가 있다. 위 표 3에서 확인되는 바와 같이, 폴록사머 188만으로 구성된 겔은 겔화 시간이 300초 이상(G1~G3)이었고, P407의 양이 증가함에 따라 겔화 시간이 감소했다. 결과적으로 G7 및 G8은 폴록사머 188이 10~12%(w/v) 및 폴록사머 407이 16~18%(w/v)의 농도 범위 내에서, 폴록사머 188:폴록사머 407이 1:1.4~1.6의 중량비로 혼합됨으로써 약 50~70초의 가장 적절한 겔화 시간을 갖는 것으로 확인되었다. 이중 G8이 적절한 조성의 온도감응성 하이드로겔로 선택되어, 하기와 같이, 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조에 사용되었다.
4-2. 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조
실시예 1-11의 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)를 봉입효율 계산 후 DEX로 10 mg/mL이 되도록 취하였다. 상기 DEX-NP를 3회 세척한 후 실험예 4-1에서 제조한 G8의 온도감응성 하이드로겔 10 mL에 첨가하였다. 이후 볼텍스 믹서(KMC-1300V, Vision Scientific, Daejeon, South Korea)와 초음파 배스를 이용하여 덱사메타손 함유 PLGA 나노입자(DEX-NP)를 분산시켜 최종적으로 나노입자 함유 겔 조성물(DEX-NP-gel)을 제조하여 실시예 2로 하였다.
실험예 5. 시험관 내 약물 방출 실험
시험관 내(in vitro) 약물 방출 시험은 경피 확산 세포 시스템(LOGAN instruments, New Jersey, USA)에 의해 평가되었다. 1 mL의 DEX, 실시예 1-11의 DEX-NP 및 실시예 2의 DEX-NP-gel 제형 각각을 프란츠 확산셀(Franz diffusion cell) 장치의 도너 챔버(donor chamber)에 적용하였다. 투석막(6~8 KD)을 투과층에 고정하였다. 20% (v/v%) 폴리에틸렌글리콜 400 (PEG 400)을 함유하는 12 mL의 PBS 용액 (pH 7.4) 및 마그네틱 바를 리셉터 챔버(receptor chamber)에 넣었다. 시료 0.5 mL를 1, 2, 4, 8, 12 및 24 시간별로 채취하고 새로운 PBS (20% PEG 400) 동일 양을 첨가하였다. 순환수(circulating water)의 온도는 37 ± 0.5℃였고, 교반 속도는 200 rpm이었다. 시료의 DEX 함량은 HPLC에 의해 측정하였다.
DEX, DEX-NP(실시예 1-11) 및 DEX-NP-gel(실시예 2)의 방출 양상은 도 3에 나타내었다. 이 실험에서 투석막이 정원창막(RWM)의 역할을 대체해서, 따라서 얼마나 많은 제형이 정원창막을 통해 내이로 통과할 수 있는지를 예측할 수 있었다. 24시간 후, DEX, DEX-NP 및 DEX-NP-gel의 방출은 각각 73.50 ± 1.42, 49.20 ± 2.94 및 46.27 ± 0.04%였다. 결과적으로, DEX가 가장 좋은 방출량을 보였고, DEX-NP와 DEX-NP-gel이 비슷한 방출량을 보였다.
실험예 6. 안정성 평가
덱사메타손 함유 나노입자, 및 이를 포함하는 하이드로겔 조성물의 안정성 평가를 위해, 실시예 1-11의 DEX-NP의 입자 크기, 제타 전위 및 봉입 효율(EE)을 8주 동안 측정하였다. 또한, 실시예 1-11의 DEX-NP 및 실시예 2의 DEX-NP-gel에 대해 8주 동안 in vitro 약물 방출 시험을 하였다. 그동안 모든 시료는 4℃에 보관하였고, 평가방법은 위 실험예 1 및 5의 방법과 동일하다.
실시예 1-11의 DEX-NP의 입자 크기, PDI, 제타 전위 및 봉입효율(EE)을 8주 동안 평가한 결과를 다음 표 4에 나타내었다.
Week Size (nm) PDI Zeta potential (mV) EE (%)
0 150.0 ± 3.2 0.077 ± 0.056 -18.7 ± 0.6 64.4 ± 2.0
1 151.9 ±1.7 0.122 ± 0.087 -18.8 ± 0.5 66.6 ± 1.9
2 149.5 ± 3.6 0.084 ± 0.042 -19.7 ± 0.6 65.0 ± 1.9
4 150.1 ± 1.7 0.114 ± 0.057 -18.4 ± 0.5 63.6 ± 2.3
8 150.6 ± 1.9 0.101 ± 0.033 -18.7 ± 0.5 63.0 ± 5.7
위와 같이, 8주 후, 실시예 1-11의 DEX-NP의 입자 크기는 150.0 ± 3.2 nm에서 150.6 ± 1.9로, PDI는 0.077 ± 0.056에서 0.101 ± 0.033으로, 제타 전위는 -18.7 ± 0.6 mV에서 -18.7 ± 0.5 mV로, EE는 64.4 ± 2.0% ~ 63.0 ± 5.7%로 변화가 거의 없어 안정한 것으로 확인되었다.
또한, DEX-NP 및 DEX-NP-gel에 대해 8주 동안의 in vitro 방출 시험 결과, 도 4(A) 및 4(B)에서와 같이, 초기 및 8주 후의 DEX-NP 및 DEX-NP-gel의 방출 패턴이 유사하였다. 따라서 8주 동안 유의한 변화는 관찰되지 않아, 제형은 안정한 것으로 확인되었다.
실험예 7. 세포 생존율(Cell viability) 평가
MTT 어세이를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. 인간 멜라닌 세포 (Human melanocyte)인 SK-MEL-31 세포를 10%(v/v) 소태아 혈청 및 항생제(Penicillin G sodium 100IU/mL 및 streptomycin sulfate 100 μg/mL)를 포함하는 MEM 세포 배지에서 배양하였다. 세포는 37℃ 습윤한 CO2 인큐베이터(5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 상기 세포를 96-웰 플레이트에 세포 농도 5 × 104 cells/well이 되도록 분주하였다. 배양을 시작하고 나서 24시간 후에, 동일한 DEX 농도를 함유한, DEX, DEX-NP(실시예 1-11) 및 DEX-NP-gel(실시예 2)을 MEM 배지에 다양한 농도로 용해한 후 각 웰(well) 100 μL에 첨가하였다. 각 제형을 첨가하여 배양한지 4시간 후에 배지를 FBS 및 항생제가 없는 새로운 MEM 배지로 대체하였다. 그리고 플레이트를 48시간 동안 배양하였다. 3-(4,5-디-메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 염료((3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide dye, MTT solution)를 새로운 배지에 넣은 것(5 mg/mL)을 이용하여 세포들을 분석하였다. 배양 후, 각 웰의 배지를 제거하고 100 μL의 MTT 용액을 첨가하였다. 3시간 동안 배양한 후 MTT 용액을 제거하고, 200 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 웰에 첨가하였다. 520 nm에서 마이크로플레이트 리더(Infinite M200 PRO, Tecan trading AG, Mannedorf, Swizerland)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
세포 생존율은 0에서 1000 μg/mL까지 다양한 농도에서 측정되었다. 제형 투여 시 달팽이관을 구성하는 세포 중 하나로 인간 멜라닌 세포인 SK-MEL-31을 사용해서 약물을 도달시켰다. 멜라닌 세포 결핍은 바르덴부르크 증후군(Waadenburg syndrome)에서 찾을 수 있다. 바르덴부르크 증후군은 다른 유전자에서의 돌연변이로 발생하는 임상적으로 이질적인 질환(heterogeneous diseases)이며, 귀에서의 감각신경성 난청이 특징이다. 멜라닌 세포 손상으로 인한 멜라닌 소실과 청력 소실 사이의 연관성은 거의 조사되지 않았지만 다양한 약물이 멜라닌과 복합체를 형성하여 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 세포 생존율 결과는 도 5에 나와 있다. 덱사메타손 용액은 농도가 증가함에 따라 독성이 증가했다. DEX-NP와 DEX-NP-gel의 독성은 유사하였다. 두 제형 모두 1000 μg/mL에서 약간의 독성이 있었기 때문에 동물 연구에서 고실 내 투여에도 독성이 관찰되는지를 확인할 필요가 있었다.
실험예 8. 조직학적 평가
8주령의 수컷 BALB/C 마우스 (Samtako, Osan, South Korea)를 이용하여 조직학적 평가를 수행하였다. 마우스를 실험 전 1주일 동안 적응시켰다. 모든 절차는 충남대학교 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다.
제형은 각각 Blank-NP(Control), 덱사메타손을 물에 용해한 DEX 용액(DEX), DEX-NP(실시예 1-11), 및 DEX-NP-gel(실시예 2)로 투여되었다. 이전 연구에 따른 용량은 5 μL 였고, DEX의 농도는 각 제형에 대해 4 mg/mL로 조절되었다. 마이크로피펫 팁을 이용하여 고실내 투여를 수행하였고, 투여 후 10분 동안 마우스의 자세를 고정하였다.
제형 투여 2일 후, 마우스를 안락사시키고 제형이 투여된 쪽의 와우(cochlear)를 적출하였다. 조직을 10% 완충 포르말린으로 고정하였고, 10% EDTA에서 4일 동안 석회를 제거하였다. 고정 및 탈석회(decalcification) 후 측두골(temporal bone)을 파라핀에 포매하고, 4 μm 두께로 절편을 만들었다. 절편을 헤마톡실린과 에오신(hematoxylin & eosin, H&E)으로 염색하고 조직병리학적 분석을 실시했다.
조직학적 평가 결과는 도 6에 나타내었다. 제조된 제형의 고실 내 투여시에, 마우스의 달팽이관에서 나선 신경절 세포(spiral ganglion cells) 및 혈관선조(stria vascularis)에서 세포독성 또는 염증 반응의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 세포 생존율 평가에서 DEX-NP와 DEX-NP-gel 모두 1 mg/mL에서 세포독성을 나타내었지만, 생체 내(in vivo)에서 4 mg/mL에서는 독성이 관찰되지 않았다. 또한, 조직학적 평가 결과, 10 mg/mL 약물 농도에서도 DEX-NP와 DEX-NP-gel은 세포 독성을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 제형이 정원창막(RWM) 통과시에 정원창막을 보호할 수 있는 것으로 확인되었다.
실험예 9. 생체 내 형광 이미징 분석
8주령의 수컷 BALB/C 마우스를 이용해서 생체 내(in vivo) 형광 이미징(fluorescence imaging) 분석을 이미징 장비(VISQUE® InVivo Smart, Vieworks, South Korea)로 수행하였다. 실시예 1-11의 성분 중 덱사메타손 대신 쿠마린-6(Coumarin-6)을 넣는 것만을 달리하여 실험예 1-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 쿠마린-6 캡슐화 제형(Coumarin-6 encapsulated formulation, Cou-NP)을 제조하였다. 또한, 실시예 2의 성분 중 덱사메타손 대신 쿠마린-6(Coumarin-6)을 넣는 것만을 달리하여 실험예 4-2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 쿠마린-6의 겔 분산 제형(gel dispersed formulation, Cou-NP-gel)을 제조하였다. 대조군으로서 형광물질인 쿠마린-6만을 물에 용해한 쿠마린-6 용액(Coumarin-6 solution, Cou)을 제조하여 사용하였다. 쿠마린-6의 농도는 각 제형에 대해 1 mg/mL로 설정하였다. 마이크로피펫으로 각 제형 5 μL를 고실 내 투여하였다. 투여 후 10분 동안 마우스의 자세를 고정하였다. 이미징은 조리개(iris) 3.6, 1x zoom으로 설정하고, 마우스의 머리에 초점을 맞추었다.
결과 데이터의 통계적 분석은 SigmaPlot (version 12.0, Systat Software Inc., USA)에서 대응표본 t-테스트(paired t-test)를 사용하여 수행하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차(S.D.)로 표현되었다. 모든 분석에서 p<0.05(*) 및 p<0.1(**)이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
생체 내 형광 이미지는 쿠마린-6 제형들의 고실내 투여 후 6, 24 및 48시간에 측정되었으며 도 7(A)에 나타내었다. 쿠마린-6 용액(Cou)을 투여했을 때 6시간 후 용액이 이미 유스타키오관을 통해 빠르게 소실된 것으로 나타났다. 쿠마린-6 캡슐화 제형(Cou-NP)은 24시간까지 약간의 형광을 보였고 겔 분산 제형(Cou-NP-gel)은 48시간까지 명확한 형광을 나타내어 손실이 가장 느렸다. 형광 강도를 정량화하여 도 7(B)에 그래프로 나타내었다. 전체 형광 강도는 모든 제형에서 시간이 지남에 따라 감소하는 경향이 있었다. 6시간 후, Cou의 형광 강도는 909.4 ± 63.2, Cou-NP는 1553.8 ± 225.4, Cou-NP-gel은 2590.8 ± 596.9였다. 48시간 후 형광 강도는 각각 580.9 ± 26.6, 919.1 ± 101.4, 1613.4 ± 687.8로 측정되었다. 6시간 후 측정에서 Cou는 Cou-NP-gel보다 약 3배 적었다. 이러한 결과는 고실내 투여 후 대부분의 Cou 용액이 유스타키오관으로 소실되었음을 시사한다. 모든 시점에서 Cou-NP-gel 제형은 가장 높은 형광 강도를 보였고 Cou와 비교하여 통계적으로 유의했다(p<0.05). 48시간에 Cou-NP-gel은 6시간에 측정된 형광 강도의 60%를 유지했으며 Cou 용액보다 약 3배 이상 측정되었다. 중이강(middle ear cavity)에 투여했을 때 Cou-NP-gel이 다른 제형보다 오래 머무름을 확인하였다.
따라서 온도감응성 겔에 PLGA 나노입자를 포함하는 제형은 중이에 오래 머무르면서 정원창막(RWM)과 접촉할 수 있다. 다른 연구에서 PLGA 나노입자 또는 다른 나노입자는 고실내(IT) 투여 후 정원창막을 통과하여 달팽이관의 다양한 부위에 분포하는 것으로 입증되었다. 따라서 DEX-NP-gel 제형이 실제로 정원창막을 통해 내이에 도달할 수 있는지 확인하기 위한 체내 분포 연구가 필요했다.
실험예 10. 체내분포 분석
체내분포(biodistribution) 분석을 위해 8주령 수컷 BALB/C 마우스의 달팽이관을 사용하였다. 마우스를 무작위로 3개의 그룹(각 그룹당 3마리의 마우스), 즉, DEX, 실시예 1-11의 DEX-NP 및 실시예 2의 DEX-NP-gel 제형 투여 그룹으로 나누었다. 상기 제형들을 조직학적 평가에서의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 제형 투여 24시간 후, 마우스를 희생시키고 달팽이관을 얻었다. 달팽이관을 수집하기 위해 마우스 머리를 해부하는 과정은 이전 연구(The Laryngoscope. 2013; 123(12): E109-E115) 등을 참조하여 수행하였다. 수집된 달팽이관의 무게를 재고 PBS(pH 7.4, 10 mg/mL)에 넣었다. 시료 준비를 위해 달팽이관 조각(cochlear fragments)을 균질화기(Omni mixer homogenizer, Omni International, USA)를 사용하여 균질화하였다. 3 mL의 균질물을 1 mL의 메탄올에 첨가하여 추출하고 5분 동안 혼합하였다. 시료를 오븐에 넣어 용매를 완전히 증발시켰다. 증발된 시료를 이동상(ACN:DW=35:65, 0.1 mL)에서 혼합하고 30분 동안 초음파 처리했다. 원심분리(12,000 rpm, 10분) 후 상층액 20 μL를 HPLC 시스템에 주입했다.
조직학적 평가 결과는 도 8과 같다. DEX 용액을 투여한 그룹에서 덱사메타손의 양은 1.83 ± 0.14 ng로 검출되었다. DEX-NP 및 DEX-NP-gel 그룹에서 각각 2.71 ± 0.53 ng 및 7.20 ± 1.76 ng이 검출되었다. 이러한 결과를 통해 IT 투여시 PLGA 나노입자 하이드로겔(DEX-NP-gel) 제형이 나노입자에 봉입되지 않은 제형에 비해 내이에 약 4배 더 많이 덱사메타손을 전달함을 알 수 있다. 또한 중이에서 DEX-NP-gel 제형의 긴 체류 시간은 덱사메타손의 흡수를 증가시킴으로써, 본 발명에 따른 DEX-NP-gel 제형이 덱사메타손을 효율적으로 전달할 수 있는 것으로 확인되었다. 덱사메타손을 로딩한 PLGA 나노입자가 손상된 코티(corti) 기관의 유모 세포(hair cell)를 복원하는 것을 통해 덱사메타손의 치료 효과가 확인되었다. 달팽이관 섹션의 공초점 이미지를 통해 PLGA 나노입자를 투여한 후 24시간 후에 나선 신경절 뉴런(spiral ganglion neurons)과 혈관선조(stria vascularis)에서 발견된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 DEX-NP-gel 제형이 IT 투여 후 24시간 이내에 달팽이관의 다양한 부위에 분포할 수 있음을 시사한다. 또한, 초기 용량의 절반 이상이 최대 48시간 동안 중이강에 남아 있었다. 따라서 DEX-NP-gel의 단회 투여로 장기간의 치료 효과를 가질 수 있을 것으로 예상된다

Claims (10)

  1. 활성성분으로서 덱사메타손, 생분해성 고분자로서 폴리락트산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 및 안정화제를 포함하는 나노입자;
    및 하이드로겔;
    을 포함하는, 내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 덱사메타손, PLGA 및 안정화제가 1: 2.8~3.6: 10~14의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 나노입자는 덱사메타손, PLGA 및 안정화제가 1: 3.1~3.3: 11~13의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 안정화제는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 메틸셀룰로오스(methylcellulose, MC), 히드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 히드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(hydroxypropylmethylcellulose, HPMC), 젤라틴(gelatin), 및 카보머(carbomer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 폴록사머를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴록사머는 폴록사머 188(poloxamer 188) 및 폴록사머 407(poloxamer 407) 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴록사머는 폴록사머 188 및 폴록사머 407이 1: 1.3~1.7의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 내이 질환은, 이명, 현기증, 난청, 감각신경성 난청, 만성 이통, 외림프 누공, 이차 내림프수종, 미로염 및 전정 신경염, 청신경종, 내이독성, 자가 면역성 내이 질병(AIED) 및 메니에르병으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 나노입자 함유 하이드로겔 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른, 내이 질환 치료를 위한 국소 약물전달용 나노입자 함유 하이드로겔 조성물의 제조방법으로서,
    덱사메타손 및 PLGA를 유기용매에 용해하여 제1 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 제1 혼합물에 안정화제를 주입한 후 교반하여 제2 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 제2 혼합물에서 잔류 용매를 제거한 후 나노입자를 수득하는 단계; 및
    상기 나노입자를 하이드로겔에 첨가해서 분산시키는 단계;를
    포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 유기용매는 아세톤 및 디클로로메탄 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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