KR20230030991A - 금 나노 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법은 검출 대상인 세로토닌을 세로토닌 이량체로 합성하여 변경시키는 단계, 금 입자의 표면을 코팅하는 단계, 상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자를 응집시켜 색 변화하는 단계, 및 상기 색 변화를 측정하여 세로토닌을 검출하는 단계를 포함한다.

Description

금 나노 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법{METHOD OF DETECTING SEROTONIN USING GOLD NANOPARTICLE}
본 발명은 금 나노 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 금 나노 입자와 세로토닌을 응집시켜 색체 검출을 통해 세로토닌을 검출하는 것에 관한 것이다.
실시간 색체학에 기반한 애플리케이션은 세로토닌성 신경 세포 분자, 감정의 일시적인 상태와 같은 뇌 활동의 교감 변곡으로 나타나는 신경전달물질 스트레스 바이오분자 그리고 면역, 혈액 항상성, 및 위장 기능과 같은 생물학적인 활동을 시각적으로 제공한다. 세로토닌은 사람의 웰빙(well-bding)과 행복과 관련된 핵심 호르몬으로서 작용하는 것으로 알려져 있지만, 심혈관, 위장관, 혈소판, 평활근 수축 및 자궁 평활근과 같은 생리학적 특성에도 영향을 끼친다. 세로토닌은 대부분 뇌에서 발견되고 신경 셀과 몸 사이에서 신호 전달을 하는 신경전달물질로 작용하며 중추신경계(central nervous system, CNS)에서 감각 정보를 조절하는 주요한 역할을 한다. 세로토닌의 약 95 %는 소화관의 장내 크롬친화 세포에 의해 생성되고 덴스 과립(dance granules)으로 혈액 혈소판에 저장된다. 세로토닌은 pH의 낮은 수준에서 체온 조절과 혈압 조절에 체계적으로 기여하고 혈소판을 활성화시킨다. 또한 혈관 투과성의 전신 투여, 장기 개발자 및 재생에도 중요한 역할을 한다. 낮은 세로토닌 수치는 공격적인 행동, 우울증, 강박 장애, 불안, 편두통, 양극성 장애 및 경계선 정신 장애를 유발한다. 미국 질병통재예방센터에 따르면 미국에서 1,600 명의 어린이들이 사망하거나 기형을 갖는데, 이중 뇌간에서 생성되는 세로토닌으로 인한 영아돌연사증후군(sudden infant death syndrome, SIDS)은 40 %로 파악되고 있다. 보스턴 영아 병원과 하버드 의과대학은 SIDS 사례의 약 1/3은 혈청 샘플에서 높은 세로토닌 수치를 나타낸다고 보고했다. 세로토닌 재흡수 억제제인 프로작(Prozac) 및 파록세틴(paroxetine)의 관리 및 치료는 대부분 항우울제 그리고 CNS 장애에서 세로토닌 신경전달물질과 관련되어 사용된다. 그러므로 국제적 문제와 역할을 고려하여 신경 장애에서 세로토닌 생체 분자의 선택적이고 민감한 검출은 의약품 응용에 우선되어야 한다.
최근에는 도파민, 노르에피네프린, 에피네프린, 및 세로토닌의 이중 분자 검출과 관련되어 신경화학적 스트레스 분자의 검출을 위한 바이오케미컬 애플리케이션으로 이루어진 다양한 광학 장치들이 보고되고 있다. 종래의 분석 기술로는 효소 면역 분석, ECD-HPLC(Electrochemical Detection-High performance liquid chromatography), 모세관 전기 영동, 화학 발광, 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA), 및 검출 양식을 위한 질량 분석법 등이 있다. 기존의 광학적인 측정 방법의 경우 세로토닌과 같이 작은 분석물은 분석이 매우 어려우며 복잡한 전처리가 필요하며 HPLC나 LC-MS와 같은 방법 또한 복잡한 처리과정과 고가의 장비를 이용하는 것으로 전문가에게 한정된다는 단점이 있다. 최근의 분석적 감지 방법으로는 앱타 센서, 재조합 형광 센서, 및 전기화학 센서 등이 세로토닌 정량 분석을 위해 개발되고 있다. 그러나 그라운드(ground) 바탕의 세로토닌 검출은 중요하다. 진료 현장에서 진단에 적용할 수 있는 세로토닌 바이오분자 검출 방법을 개발하기 위한 다양한 노력을 하고 있다.
금 나노 입자의 표면 기능화 적용은 다재다능하고 민감한 광학적 특성을 가진 감지를 위한 나노 바이오 인터페이스로부터 상당한 관심을 받고 있다. 특히, GNP는 가시적인 파장 범위 내에서 강력한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 변화를 보이며, 따라서 색도 면역 분석의 개발을 가능하게 한다.
본 발명의 일 목적은 금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 세로토닌 검출 방법을 이용하여 빠르고, 민감하고, 선택적이며, 정략적인 새로운 시각화를 제시하는 이량체 세로토닌 기반의 세로토닌 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법은 검출 대상인 세로토닌을 세로토닌 이량체로 합성하여 변경시키는 단계, 금 입자의 표면을 코팅하는 단계, 상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자를 응집시켜 색 변화하는 단계, 및 상기 색 변화를 측정하여 세로토닌을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세로토닌 이량체를 합성하여 변경시키는 단계는 세로토닌과 과산화수소(H2O2) 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)를 산화 반응시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 HRP의 농도는 21 - 27 mU/μL이고 상기 H2O2의 농도는 0.15 - 0.25 mM일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 금 입자의 표면을 코팅하는 단계에서 코팅 화합물로 숙신이미딜 프로피온산(3,3-dithio-bis(sulfosuccinimidyl)propionate, DTSP)을 사용할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자의 응집은 상기 세로토닌 이량체의 일차 아민(primary amine)과 상기 금 입자의 숙신이미딜 에스터(succinimidyl ester)가 결합하여 응집할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 색 변화 측정은 육안 또는 흡광도를 이용하여 측정할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 표면이 코팅된 금 입자는 적색이고 상기 표면이 코팅된 금 입자와 상기 세로토닌 이량체가 응집한 입자는 청색일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법은 인산염 버퍼에서 검출한계(limit of detection; LOD)는 2.6 nM이고 혈청에서 검출한계는 2.81 nM일 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위한 세로토닌 검출용 바이오센서는 상기에서 언급하는 방법을 이용하여 검출부에서 세로토닌을 검출할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세로토닌 검출용 바이오센서의 동적 범위가 100 - 300 nM일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법의 색체 검출 한계는 2.90 nM일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 위한 금 입자와 이량체 세로토닌의 응집을 이용한 세로토닌 검출 방법은 검출 대상인 세로토닌을 과산화수소 및 겨자무과산화효소와 산화 반응을 통해 세로토닌 이량체로 합성하여 변경시키는 단계, 금 입자의 표면을 숙신이미딜 프로피온산으로 코팅하는 단계, 상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자를 응집시켜 색 변화하는 단계, 및 상기 색 변화를 측정하여 세로토닌을 검출하는 단계를 포함하고 이때 세로토닌 이량체와 숙신이미딜 프로피온산으로 표면이 코팅된 금 입자의 응집은 상기 세로토닌 이량체의 일차 아민과 상기 금 입자의 숙신이미딜 에스터가 결합하여 응집할 수 있다.
본 발명은 H2O2와 HRP를 이용하여 세로토닌 이량체 복합체를 형성하고 DTSP로 코팅된 금입자를 이용하여 금 입자의 응집에 의한 색변화를 통해 세로토닌 호르몬과 같은 분자량이 작은 물질에 대해서 간단하면서 효과적으로 검출할 수 있는 바이오센서 기법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 통한 세로토닌 검출을 도시화한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 이량체-세토로닌을 합성하는 과정을 나타내는 화학 구조식이다.
도 3은 DTSP-GNPs 및 DTSP-GNPs와 응집한 입자의 색 변화를 나타내는 이미지 이다.
도 4는 세로토닌 및 이량체-세로토닌의 1H NMR 분광법에 관한 그래프이다.
도 5는 HRP와 H2O2와 반응한 세로토닌을 인큐베이션하는 동안 각 분마다 측정한 UV-Vis 분광법에 관한 그래프이다.
도 6은 H2O2의 농도에 따른 흡광도 시간을 나타내는 그래프이다.
도 7은 HRP의 농도에 따른 흡광도 시간을 나타내는 그래프이다.
도 8은 산화된 세로토닌의 효소 속도론(kinetics, Km) 분석에 관한 그래프이다.
도 9는 버퍼용액과 혈청에서의 세로토닌 산화에 대한 흡광도 그래프와 사진이다.
도 10은 세로토닌과 이량체-세로토닌에 대한 FT-IR 스펙트럼 그래프이다.
도 11은 GNPs와 GNPs-DTSP의 수중에서 입자 크기에 관한 그래프이다.
도 12는 GNPs-DTSP의 XPS 그래프이다.
도 13은 FT-IR 스펙트럼 그래프에 관한 것으로, 흑색은 구연산염으로 코팅된 GNPs이고 적색은 GNPs-DTSP이며 청색은 GNPs-DTSP와 이량체-세로토닌이 응집된 것이다.
도 14는 GNPs(검은색, 바이알 1), GNPs-DTSP(적색, 바이알 2), 및 GNPs-DTSP와 이량체-세로토닌이 응집된 것(청색, 바이알 3)에 관한 UV-Vis 그래프와 바이알(vial) 사진이다.
도 15는 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP와 응집한 것을 나타내는 바이알 사진이다.
도 16은 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP와 응집한 것을 나타내는 UV-Vis 스펙트럼 그래프이다.
도 17은 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 흡광도 A650/A520 그래프이다.
도 18은 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 RGB 강도에 관한 그래프이다.
도 19는 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 GNPs와의 응집을 나타내는 TEM 이미지이다.
도 20은 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP와 응집한 것을 나타내는 바이알 사진이다
도 21은 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP와 응집한 것을 나타내는 UV-Vis 스펙트럼 그래프이다.
도 22는 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 흡광도 A650/A520 그래프이다.
도 23은 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 RGB 강도에 관한 그래프이다.
도 24는 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 것을 나타내는 바이알 사진이다.
도 25는 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액 및 이량체-세로토닌과 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 UV-Vis 스펙트럼 그래프이다.
도 26은 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액 및 이량체-세로토닌과 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 흡광도 A650/A520 그래프이다.
도 27은 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액 및 이량체-세로토닌과 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 RGB 강도 그래프이다.
도 28은 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 것을 나타내는 바이알 사진이다.
도 29는 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 UV-Vis 스펙트럼 그래프이다.
도 30은 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 흡광도 A650/A520 그래프이다.
도 31은 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 RGB 강도 그래프이다.
도 32는 이량체-세로토닌 및 GNP와 응집된 입자에 대한 Delta-E 그래프이다.
도 33은 사람 샘플에 대한 RGB 강도 그래프 및 바이알 사진 이미지이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 DTSP로 코팅한 금 입자와 과산화 촉매제로 산화 처리한 세로토닌의 응집 반응에 의한 색 변화를 통해 간단하고 신속하게 정량적으로 세로토닌을 검출하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 통한 세로토닌 검출을 도시화한 이미지이고, 도 2는 HRP-H2O2 시스템을 통한 세로토닌 효소 산화 촉매 변환 신경전달 물질 형성과정을 나타내는 화학 구조식이며, 도 3은 DTSP-GNPs 및 DTSP-GNPs와 응집한 입자의 색 변화를 나타내는 이미지이다.
도 1, 도 2, 및 도 3을 참조하면, 금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법은 검출 대상인 세로토닌을 세로토닌 이량체로 합성하여 변경시키는 단계, 금 입자의 표면을 코팅하는 단계, 상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자를 응집시켜 색 변화하는 단계, 및 상기 색 변화를 측정하여 세로토닌을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
세로토닌은 모노아민 신경전달물질로 단일 하이드록시 그룹과 1차 아민 그룹이 통합된 도전적인 화학 구조 때문에 비반응성을 갖는 분자로서 생체 분자의 크기가 작아 경쟁 면역 검사(competitive immunoassay)가 어렵다. 그렇기 때문에 본 발명에서는 우선 세로토닌을 이량체 복합체로 재구성할 수 있다. 세로토닌을 이량체 자가조립 복합체로 재구성하기 위해서 효소 매개 과산화(enzyme intermediated peroxidation)의 생리학적 반응을 수행할 수 있다. 이때 과산화 촉매제로 과산화수소(H2O2) 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)를 사용하여 세로토닌을 산화 반응시킬 수 있다. H2O2는 라디컬 중간체(라디컬-라디컬) 결합 형태를 제공하는 단일 전자를 생성하게 되고 HRP는 일정한 전하 전달을 하는 역할을 통해 세로토닌 잔기의 위치 변경 없이 오직 인돌링(indole ring)의 C(4) 위치에서 국부적으로 단일 전자 산화의 촉매 활성을 가속화할 수 있다. HRP와 H2O2가 존재할 때 세로토닌의 C(4)-C(4) 위치에서 이중 페놀 라디칼이 생성되어 선택적으로 페녹시 중심의 라디컬 결합이 형성되어 이량체-세로토닌(3,3'-bis(2-aminoethyl)-1H,1H'-[4,4'-biindole]-5,5'-diol)을 합성하는 이원화 반응을 하게 된다. 이량체-세로토닌의 표준 2가 리간드 접근 이량체-세로토닌의 단일 반응성은 두 개의 자유 1차 아민 구조에 의해 잠재적으로 독립된 인식 부위 두 개를 제공하게 되고 두 개의 독립된 인식 부위는 단일 세로토닌의 결합 위치보다 추가적인 상호보완적인 결합 친화력이 향상된다. 본질적으로 인접한 결합 부위는 더 많은 특이성 플랫폼을 제공할 수 있는 두 개의 필수 결합 부분과 연결되는 화학물질로 지원되는 위치에서 쉽게 구별할 수 있다.
이 때, HRP의 농도는 21 - 27 mU/μL이고 상기 H2O2의 농도는 0.15 - 0.25 mM 일 수 있으며, 바람직하게는 HRP의 농도는 24 mU/μL이고 H2O2의 농도는 0.2 mM 일 수 있다.
색도 검사는 DTSP를 복잡한 탐침으로 사용하는 다일 기능화 GNP(gold nanoparticle)로 구성할 수 있다. 금 입자의 표면은 숙신이미딜 프로피온산(3,3-dithio-bis(sulfosuccinimidyl)propionate, DTSP)을 이용하여 코팅하게 되는데 DTSP와 GNPs의 작용 반응을 통해 두 개의 아민 그룹을 형성할 수 있다. 이는 응집을 유도하고 분자간 상호작용 메커니즘인 링커-분석체-링커 감지 시스템을 제공할 수 있게 된다.
세로토닌 이량체와 표면이 코팅된 금 입자의 응집은 1차 아민 그룹(primary amine group)과 숙신이미딜 에스터(succinimidyl ester)가 강하게 결합하여 안정적인 아미드 메커니즘(amide mechanism)을 제공함으로써 응집할 수 있다.
색 변화 측정은 육안 또는 흡광도를 이용하여 측정할 수 있다. 이량체 세로토닌은 UV-Vis 흡수 스펙트럼과 육안으로 색 변화가 뚜렷하게 나타날 수 있다. 이량체-세로토닌에 기초한 개발된 링커-분석체-링커 감지 시스템(linker-analyte-linker sensing system)은 보고된 적이 없다. 특히 혈액 혈청 검체 내 세로토닌의 면역분석법(immunoassay)으로 가시성 및 정량적 스펙트럼 분석을 할 수 있다.
GNPs-DTSP는 반투명한 적색이었으나 이량체 세로토닌과의 응집에 의해 짙은 적색에서 청색으로 변화할 수 있다. 이 색 변화의 감지를 통해 세로토닌을 검출할 수 있게 된다. 인산염 버퍼(phosphate buffer)에서 검출한계(limit of detection; LOD)는 2.6 nM이고 혈청에서 검출한계는 2.81 nM일 수 있다.
본 발명에 따른 세로토닌 검출 방법은 이량체-세로토닌을 사용하여 GNP와의 결합부위를 증가시키고 세로토닌과 GNP의 응집을 발생시키는 분자간 상호작용 단위를 인식할 수 있어 저렴하고 간단한 분석이 가능하게 된다. 상기에서 언급하는 세로토닌 검출 방법을 바이오센서의 검출부에 적용할 수 있으며, 이때 세로토닌 검출용 바이오센서의 동적 범위가 100 - 300 nM일 수 있고 색체 검출 한계는 2.90 nM일 수 있다. 과산화 이량체 세로토닌의 육안 검사 및 스펙트럼 분석은 민감하고 빠르게 확인 할 수 있으며 색도 측정법은 인산염 버퍼에서 세로토닌을 매우 민감하게 검출할 수 있다. 완충액 상태에서 센서의 동적 범위는 100~300 nM일 수 있다.
H2O2와 HRP가 존재하는 상태에서 촉매 산화에 의한 이량체-세로토닌 복합체의 형성과 DTSP로 코팅된 GNP와의 응집에 의한 세로토닌 검출 센서를 제안하였다. 세로토닌의 색체 감지용 프로브를 개발하면 이 전략이 다양한 생체 분석 응용에 매우 적합하다는 것을 명확히 보여준다. 색도 변화를 시각화적으로 적용한 세로토닌 센서 개발은 임상 샘플에서 세로토닌의 존재 여부를 분석하는 데 이 프로브를 성공적으로 활용할 수 있다. 제안된 방법은 선택적이고, 민감하며, 나노분자 수준에서 색체 시각화에 의해 세로토닌을 직접 검출할 수 있다. 다양한 응용 분야에서 색채 감지 전략이 널리 사용되었지만, 본 발명의 탐지 전략은 라벨이 부착하지 않아 간단하며 탐지 제한을 개선한다. 따라서 우리는 나노프로브의 놀라운 검출력과 실제 샘플 분석에서의 응용이 POCT(point-of-care testing; 현장 진단 검사) 진단 도구 개발에 이상적일 것으로 전망한다.
실시예 1: 이량체-세로토닌 제조
1 mM 세로토닌 10 μL, HRP 50 μL, 및 0.2 mM H2O2 50 μL은 0.1 M 인산칼륨 버퍼(pH 7)에서 37 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. 그 후 반응 혼합물에 0.2 mM H2O2를 첨가하였다. 초순수(~18 MΩ) 물과 반응시켜 반응 시간마다 HRP/H2O2 표준원액을 제조하였다.
제조된 표준원액은 UV 흡수 분광법, 1H NMR 분광법, 및 FT-IR 분광법을 통해 관찰하였다.
도 4는 세로토닌 및 이량체-세로토닌의 1H NMR 분광법 그래프에 관한 것으로, Ⅰ은 세로토닌을, Ⅱ는 0.1 mM H2O2와 18 mU/μL HRP 시스템으로 합성한 이량체 세로토닌을, Ⅲ은 0.2 mM H2O2와 24 mU/μL HRP 시스템으로 합성한 이량체 세로토닌을 나타낸다.
도 4를 참조하면, 세로토닌의 1H NMR 스펙트럼은 약 6.6~8.5 ppm에서 양성자 피크가 나타났으며 이는 인돌기 그룹(indolic group)의 방향족 양성자를 의미한다. 세로토닌과 H2O2-HRP 시스템의 1H NMR 스펙트럼에서는 세로토닌에서 나타났던 양성자 피크가 완화된 것을 확인할 수 있었다. HRP와의 결합에 H2O2가 첨가됨에 따라 세로토닌을 중심으로 한 C(4)의 전자 1개가 곧바로 이량체 세로토닌 복합체로 산화되었다. 이원화 반응은 C(4) 위치에 부착된 세로토닌 잔류물의 효소 산화와 라디칼 또는 라디칼-기질 결합에 의해 하나의 초기 전자 산화로 이어진다. 쌍을 이루지 않은 중간 라디칼 전자는 C(4) 위치에서 인돌릭 링에 재배치되었다. HRP/H2O2 시스템에서는 세로토닌 산화는 초기 1전자가 C(4)-중심에서 페녹실 중심 라디칼 형성을 위해 수행되었다. 이러한 두 페녹시 중심 라디칼의 결합은 안정적인 C(4)-C(4) 이량체 세로토닌을 제공한다. 초기에는 18 mU/μL HRP 와 0.1 mM H2O2를 첨가하여 과산화디메릭 생성물의 40 %를 계산하였으며, 여전히 미반응 세로토닌의 60 %가 관찰되었다. 그러나 24 mU/μL HRP와 0.2 mM H2O2를 첨가한 세로토닌 산화 반응에서는 D2O의 1H NMR 스펙트럼에서 거의 모든 세로토닌이 감소하였고 이량체-세로토닌은 최대 95 %의 농도 증가를 나타내었다.
도 5는 HRP 및 H2O2와 세로토닌을 반응시킨 후 인큐베이션하는 동안 각 분마다 측정한 UV-Vis 분광법에 관한 그래프이다.
도 5를 참조하면, HRP-H2O2 시스템의 효소 촉매 반응으로 세로토닌을 이량체 복합체로 빠르게 산화시키는 것을 흡광도 스펙트럼으로 확인하였다. 278 nm에서의 흡수 피크는 세로토닌의 방향족 고리를 나타내며, 이는 바이페놀릭 라디칼 결합 생성물의 과산화 형성에 의한 것이다. 317, 420, 556 nm에서 넓은 피크가 점차 이동하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 배양 시간 동안 HRP 및 H2O2가 결핍됐을 때는 불완전한 산화가 관찰되었다. 스펙트럼의 적색 선은 H2O2의 결핍과 HRP의 존재를 나타내고 반대로 청색 선은 H2O2의 존재와 HRP의 결핍을 나타낸다.
도 6은 H2O2의 농도에 따른 흡광도 시간을 나타내는 그래프이고, 도 7은 HRP의 농도에 따른 흡광도 시간을 나타내는 그래프이며, 도 8은 산화된 세로토닌의 효소 속도론(kinetics, Km) 분석에 관한 그래프이다.
도 6, 도 7, 및 도 8을 참조하면, 배양 시간 15 분에서 이량체-세라토닌 합성 시 최적의 HRP 농도 및 H2O2 농도를 확인하기 위해 HRP 및 H2O2 농도별로 흡광도 스펙트럼을 측정하였다. 1 mM 세로토닌과 0.2 mM H2O2는 일정하게 유지한 효소 반응에서 HRP의 농도를 12 mU/μL, 18 mU/μL, 24 mU/μL, 및 30 mU/μL로 변경하여 측정하였고, 또한 HRP의 농도를 24 mU/μL로 유지한 상태에서 H2O2의 농도를 0.05 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 및 0.3 mM로 변경하여 측정하였다. Michalis-Menten 방정식을 이용하여 효소 동역학을 조사한 결과, R2 값이 0.993 일 때 24 mU/μL HRP의 Km 값은 1.821 min-1 이고 0.2 mM H2O2의 Km 값은 1.330 min-1로 나타났다. 그 결과 HRP는 24 mU/μL에서, H2O2는 0.2 mM에서 세로토닌의 산화가 가장 최적인 것을 알 수 있었다.
도 9는 버퍼용액과 혈청에서의 세로토닌 산화에 대한 흡광도 그래프와 사진이다.
도 9를 참조하면, 혈청 및 버퍼 용액을 사용한 세로토닌의 산화 반응은 육안으로 시각화 할 수 있었고 이는 바이알 사진으로 확인할 수 있다. 운동 트레이스 곡선(kinetic trace curve)은 R2 값이 0.997인 Michaelis-Menten 방정식(Buffer Km=4.69 min-1, 혈청 Km= 8.69 min-1)에 적합하였다.
도 10은 세로토닌과 이량체-세로토닌에 대한 FT-IR 스펙트럼 그래프이다.
도 10을 참조하면, 과산화 이량체-세로토닌의 다양한 작용기를 확인하기 위해 FT-IR 분광법으로 측정하였다. 이량체-세로토닌에서 C=C 및 C-C와 같은 새로운 피크가 발견되었고 C-O 및 C-C와 관련된 피크는 사라진 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: GNP 제조
77.6 mM 구연산삼나트륨 5 mL를 HAuCl4 1 mM의 가열용액 100 mL에 첨가하여 적색으로 변할 때까지 30 분간 가열하였고 가열된 용액은 자석 교반으로 실온에서 식힌 후 여과하여 침전물을 제거하였다. 그 후 2 mM DTSP 40 μL를 첨가하고 2 시간 동안 37 ℃에서 혼합하였다.
GNP의 크기와 형태를 분석하기 위해 UV-Vis 분광, 동적광산란법(Dynamic light scattering, DLS), 및 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 을 사용하였다.
도 11은 GNPs와 GNPs-DTSP의 DLS에 관한 그래프이다.
도 11을 참조하면, 동적 광 산란(DLS) 측정 결과 DTSP 코팅 전후의 GNP의 유체역학 직경이 각각 15 nm와 25 nm인 것을 확인할 수 있었다. 코팅된 GNP는 또한 매우 분산적이며 수용액에서 뛰어난 안정성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. GNP의 제타 전위(ζ-potential)은 -11.13 ± 0.8 mV이고, DTSP로 코팅된 GNP는 -9.734 ± 0.7 mV로, 둘 다 음의 표면 전하를 띠고 있었다. GNPs-DTSP 프로브 용액 혼합물은 추가 사용이 있을 때까지 4 ℃에서 보관되었다. 4주 후에도 색상 가시성 및 SPR 특성 흡수 피크가 관찰되지 않아 4 ℃에 저장된 안정성이 양호한 것을 확인할 수 있었다.
도 12는 GNPs-DTSP의 XPS 그래프이다.
도 12를 참조하면, GNP에서 DTSP 기능화 조성을 확인하기 위해 X선 광전자 분광(XPS)을 측정하였다. O1s(523.16 eV), C1s(284.95 eV), S2p(162.37 eV), N1s(399.92 eV) 및 Au4f(84.21 eV) 신호가 나타났으며 이는 GNPs의 표면에 성공적으로 DTSP 링커가 형성된 것을 의미한다.
도 13은 FT-IR 스펙트럼 그래프에 관한 것으로, 흑색은 구연산염으로 코팅된 GNPs이고 적색은 GNPs-DTSP이며 청색은 GNPs-DTSP와 이량체-세로토닌이 응집된 것이다.
도 13을 참조하면, FT-IR 분석에서는 흑색 곡선과 같이 안정적인 구연산염에 대한 C=O 흡수 피크, 1076 cm-1에서 C-O 전분 밴드로서 GNP의 성공적인 합성이 관찰되었다. 다음으로 DTSP 코팅 후에는 1663.6 cm-1에서 C=O 스트레칭 밴드 진동이 관측되었고, 또한 C-O 스트레칭 흡수 피크는 각각 1268.3cm-1과 3332.4 cm-1에서 관측되었다. 적색 곡선과 청색 곡선을 비교해보면 C=C, C-N, C-H의 집적용액에서 DTSP-GNPs의 피크와 이량체 세로토닌은 1696.5, 1371.2, 1237.4 cm-1에서 검출되었으며, 농도 증가에 따라 이량체 세로토닌 존재의 작용기가 증가하였다. C=C, C-H, C-N 스트레칭(1696.5, 1371.2, 1237.4 cm-1)은 이량체-세로토닌이 GNP의 입자간 상호작용 결합 응집을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 14는 GNPs(검은색, 바이알 1), GNPs-DTSP(적색, 바이알 2), 및 GNPs-DTSP와 이량체-세로토닌이 응집된 것(청색, 바이알 3)에 관한 UV-Vis 그래프와 바이알(vial) 사진이다.
도 14에서 흑색 그래프와 바이알 1을 참조하면, 520 nm의 흡수 피크와 함께 용액의 적색 색상 외관의 특성은 원하는 GNPs의 형성을 확인할 수 있다. 적색 곡선과 바이알 2를 참조하면 DTSP에 흡착된 GNP에 대해 눈에 띄는 색상 변화는 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 바이알 3은 GNPs-DTSP의 숙신이미드 잔류물과 반응하는 다이머릭 아민 그룹(dimeric amine group)이 스펙트럼과 가시적 색상 변화를 GNP 집계를 나타내는 적색에서 청색으로 조사한다는 구조적 증거를 제공한다. 청색 곡선은 GNP의 스펙트럼 강도가 감소했고 GNP의 스캐폴드(scaffold) 형성에 의해 650 nm에서 새로운 광범위한 피크가 나타났다.
실시예 3: 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 GNPs-DTSP와의 응집 용액 제조
10 - 380 nm로 증가된 조광용액을 준비하였다. 상온에서 10 nM의 인산염-버퍼에 증가농도(10 - 380 nM)를 준비하였다. 이후 DTSP-GNPs 탐침 0.5 mL에 100 μL에 해당하는 이량체-세로토닌 용액을 직접 첨가한 후 조심스럽게 혼합한 후 모든 바이알을 상온에서 3 분간 배양하였다. DTSP로 수정된 GNP가 함유된 바이알에 이량체-세로토닌 농도를 첨가하여 곧바로 용액 색이 변화하면, 잠복기 3 분 후에 UV-vis 스펙트럼으로 측정하여 디지털카메라를 이용하여 가시영상을 촬영하였다. 과산화 이량체-세로토닌과 혼합된 인간 혈청은 DTSP-GNPs 탐침을 통해 배양되었다. 이 과정은 앞서 설명한 것과 동일한 절차를 따랐다.
도 15는 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 바이알 사진이다.
도 15를 참조하면, 농도가 서로 상이한 이량체-세로토닌에 GNPs-DTSP 용액을 첨가하여 배양한 후 3 분 이내에 나타나는 바이알의 색 변화를 사진을 통해 확인할 수 있다. 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP의 응집에 대한 색 변화는 투명한 적색에서 청색으로 변화하는 것으로 나타났다. 이는 1차 아민에 강하게 결합하는 DTSP에 의해 두 개의 동일한 GNP의 집계는 이원적인 이질 리간드(GNP-이량체-GNP) 스캐폴드(scaffold) 형성이 나타나는 것을 의미한다.
도 16은 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP와 응집한 UV-Vis 스펙트럼 그래프이다.
도 16을 참조하면, GNP의 SPR 특성에 해당하는 스펙트럼인 감지 흡광도는 520 nm에서 서서히 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 650 nm에서 새로운 흡수 피크가 확인되었는데 이는 응집 유도 입자 간의 요크(yoke)에 의한 것이다.
도 17은 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 흡광도 A650/A520 그래프이다.
도 17을 참조하면, UV-vis 흡광도 비 A650/A520는 이량체-세로토닌(<150 nM)의 농도가 증가함에 따라 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 농도가 150 nM 이상일 때 급격한 증가 추세를 확인할 수 있었다. 이는 DTSP-GNP 프로브가 이량체-세로토닌 용액의 특정한 양을 첨가하는 것이 검출 강도를 향상시킨다는 것을 의미한다. A650/A520에서 결정된 일반적인 흡수 스펙트럼은 PBS-버퍼에서 증가하는 이량체-세로토닌 농도에 대한 4변수 로지스틱 함수(four-parameter logistic function)를 이용하여 나타내었다.
도 18은 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 RGB 강도에 관한 그래프이다.
도 18을 참조하면, RGB 분석은 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 사진에서 상대적인 RGB 세기 값을 추출을 통해 수행되었고, 이를 통해 색 변화를 정량적으로 평가할 수 있었다. GNP의 가시적인 색 변화는 농도의 증가에 따라 얻어졌다. 255 ~ 0(빨간색 ~ 파란색)의 컬러 이미지 공간 정량화의 RGB 범위의 상대적인 강도를 고려하였다. 이량체-세로토닌 농도가 증가함에 따라 RGB 값은 상당히 변화하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 적색에서 청색으로의 색상 변화가 궁극적으로 RGB 값의 변화를 초래하였음을 나타낸다. 상대적인 RGB 세기 값은 육안으로 관찰한 색 변화 또는 로지스틱 플롯(logistic plot)과도 일치하는 것으로 나타났다.
도 19는 버퍼용액에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 GNPs와의 응집을 나타내는 TEM 이미지이다.
도 19를 참조하면, TEM 이미지를 통해 GNP의 구형 단층 분포와 그 직경이 15 nm(Ⅰ)인 것이 확인되었다. 이량체-세로토닌을 형성할 때 응집 스캐폴드가 형성되는데 이는 DTSP-GNPs와 이량체 아민 유도체의 입자 사이에서 리간드 결합에 의한 것으로, 이량체-세로토닌의 농도에 따라 응집 스캐폴드가 변화되는 것을 확인할 수 있었다.
또한 실제 검체를 대상으로 하는 분석을 하기 위해서 혈청 검체 내에 산화된 이량체-세로토닌을 0~380 nM 농도 범위로 준비하였고 DTSP-GNPs를 프로브로 사용하였다.
도 20은 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP와 응집한 바이알 사진이고, 도 21은 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따라 GNPs-DTSP와 응집한 UV-Vis 스펙트럼 그래프이며, 도 22는 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 흡광도 A520/A650 그래프이고, 도 23은 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도에 따른 RGB 강도에 관한 그래프이다.
도 20, 도 21, 도 22, 및 도 23을 참조하면, 혈청에서 이량체-세로토닌의 농도 증가에 따라 적색에서 청색으로 색 변화가 관찰되었다. 배양 3 분 후 기록된 UV-vis 흡수 스펙트럼은 A520 nm에서 피크가 감소하고 A650 nm에서 피크가 상당히 증가하는 것을 관찰하였다. 이량체-세로토닌 비율 A520/A650의 정략적 측정은 검체에서의 일치도와 우수한 재현성을 보여준다. 또한 혈청 샘플의 RGB 분석에 대한 시각적 증거를 확인하기 위해 RGB 값에서 세로토닌 농도 증가량이 유희한 변화로 계산되었으며, 이는 적색에서 청색으로 색상 변화가 RGB 값의 변화를 초래했음을 나타낸다. 도 23과 같이 RGB 명암은 혈청 검체의 육안 관찰을 통해 일치 가시성이 양호하다. 얻어진 값들은 해당 농도들 사이에 상관관계가 있어 좋은 합의점을 보여주며, 이를 통해 개발된 감지 메커니즘이 세로토닌 임상 샘플 분석의 검출에 실용적으로 적용될 수 있다. 조사된 검정 곡선은 하기 식 1을 사용하여 표준 4변수 로지스틱 방정식으로 작성하였다.
도 24는 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 바이알 사진이고 도 25는 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액 및 이량체-세로토닌과 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 UV-Vis 스펙트럼 그래프이며 도 26은 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액 및 이량체-세로토닌과 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 흡광도 A650/A520 그래프이다. 도 27은 세로토닌을 농도별로 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액 및 이량체-세로토닌과 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 RGB 강도 그래프이다.
도 24, 도 25, 도 26, 및 도 27을 참조하면, DTSP-GNP 메커니즘은 세로토닌의 화학적으로 유사한 다양한 구조가 존재하는 상황에서 색도 반응에 대한 선택성 분석을 확립하였다. 초기 색도측정 결과에 따르면 세로토닌 농도(0 ~ 380 nM)만 존재했을 때, 단일 세로토닌 리간드로 인한 용액의 (A650/A520)에서 스펙트럼 흡수 스펙트럼과 함께 시각적 색 변화에 의한 GNP 집계를 관찰하지 않았다. 또한 ImageJ 소프트웨어를 기반으로 RGB 강도를 추정하였다. 개발된 센서와 비교하였을 때 시각 RGB 강도 변화는 눈에 띄게 관찰되지 않았다.
도 28은 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 바이알 사진이고, 도 29는 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 UV-Vis 스펙트럼 그래프이다. 도 30은 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 흡광도 A650/A520 그래프이다. 도 31은 신경전달물질 분자의 종류에 따른 GNPs-DTSP와 응집시킨 용액에 대한 RGB 강도 그래프이다.
도 28, 도 29, 도 30, 및 도 31을 참조하면, 노르에피네프린, 에피네프린, 3,4-디하이드록시페닐아세트산, 도파민, 세로토닌, 포도당 및 기타 생물학적 화합물이 함유된 DTSP-GNPs 프로브로 신결전달물질 반응이 존재하는 상황에서 경쟁적인 실험을 수행하였다. 380 nM 신경전달물질 추가 후 유의한 색상과 스펙트럼 반응은 관찰되지 않았다. 이량체-세로토닌만 존재하여 최대 신호 응답(A650/A520)이 발생하였다. RGB 분석도 동일하였다. 제안된 감지 메커니즘과 비교하여 시각적 분석에 의한 높은 특수성과 선택성을 보였다.
도 32는 이량체-세로토닌 및 GNP와 응집된 입자에 대한 Delta-E 그래프이다.
세로토닌 과산화 반응으로 인한 이질 복합체 형성은 완충액과 혈청 검체 모두에서 관찰된 무색 용액에서 황색 용액으로 가시적인 변화를 나타내었다. 가시적인 모든 색상 차이 값은 ImageJ 분석을 통해 얻었다. 마찬가지로, PBS와 혈청 샘플 모두에서 GNP 응집 색상의 RGB 차이 가시성이 적색에서 청색으로 관측되었다. 또한, 우리는 △E를 계산하였다. 이광 및 집계를 구성하는 값이다. 국제 조명 위원회(CIE) 1976 알고리즘을 통해 측정된 인간의 눈 그림 △E의 색상 차이 가능성은 0~100 범위이다. 여기 △E 값에서 colormine이라는 온라인 계산기를 사용하여 계산되었다. 산화계수-황소 가시성 차이는 버퍼 내에서 △E=56.894 이었고 혈청 내에서 △E=53.998을 나타내었다. 이는 세로토닌 복합체와 이질 복합체 간의 시각적 차이가 구별된다는 것을 의미한다. 마찬가지로, GNPs 응집 색상의 초기 색상인 적색부터 최종 색상인 청색까지 △E 범위의 가시성은 버퍼의 380 nM 직경 스캐폴드 범위 △E=69.0091과 혈청 샘플의 △E=63.7935와 같이 가시적으로 구별할 수 있다.
도 33은 사람 샘플에 대한 RGB 강도 그래프 및 바이알 사진이다.
도 33을 참조하면, 세로토닌 검출에 대한 입원환자 인간 혈청을 직접적인 정량적 평가를 하기 위해서, 앞서 설명한 과산화 이량체-세로토닌 색도측정법에 근거하여 임상표본(n=20)을 시험하였다. 환자 시료에 과산화 성분을 첨가한 후 15 분 동안 모든 세로토닌이 완전히 산화되어 노란색을 시각화하였다. 그 후 UV 분광법을 준수하고 최종적으로 DTSP-GNP 탐침에 노출되는 산화디메릭 세로토닌이 적색에서 청색으로 변하는 것이 관찰되었다. 임상 분석 결과, 초기 단계 POCT 평가를 위해 개발된 색채 측정 방법을 위해 더 많은 환자 검체를 더 높은 농도로 검사해야 하는 것으로 나타났다. 그러나 혈청에서 단백질 및 기타 면역독소를 제거하지 않고 직접 환자 검체를 첨가한 경우 과산화 활성은 관찰되지 않았다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (12)

  1. 검출 대상인 세로토닌을 세로토닌 이량체로 합성하여 변경시키는 단계;
    금 입자의 표면을 코팅하는 단계;
    상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자를 응집시켜 색 변화하는 단계; 및
    상기 색 변화를 측정하여 세로토닌을 검출하는 단계;를 포함하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 세로토닌 이량체를 합성하여 변경시키는 단계는 세로토닌과 과산화수소(H2O2) 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)를 산화 반응시키는 것을 특징으로 하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 HRP의 농도는 23.5 - 24.5 mU/μL이고
    상기 H2O2의 농도는 0.15 - 0.25 mM인 것을 특징으로 하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 금 입자의 표면을 코팅하는 단계에서 코팅 화합물로 숙신이미딜 프로피온산(3,3-dithio-bis(sulfosuccinimidyl)propionate, DTSP)을 사용하는 것을 특징으로 하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자의 응집은,
    상기 세로토닌 이량체의 일차 아민(primary amine)과 상기 금 입자의 숙신이미딜 에스터(succinimidyl ester)가 결합하여 응집하는 것을 특징으로 하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 색 변화 측정은 육안 또는 흡광도를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 표면이 코팅된 금 입자는 적색이고
    상기 표면이 코팅된 금 입자와 상기 세로토닌 이량체가 응집한 입자는 청색인 것을 특징으로 하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법은,
    인산염 버퍼에서 검출한계(limit of detection; LOD)는 2.6 nM이고
    혈청에서 검출한계는 2.81 nM인 것을 특징으로 하는,
    금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 검출부에서 세로토닌을 검출하는,
    세로토닌 검출용 바이오센서.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 세로토닌 검출용 바이오센서의 동적 범위가 100 - 300 nM인 것을 특징으로 하는,
    세로토닌 검출용 바이오센서.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 금 입자를 이용한 세로토닌 검출 방법의 색체 검출 한계는 2.90 nM인 것을 특징으로 하는,
    세로토닌 검출용 바이오센서.
  12. 검출 대상인 세로토닌을 과산화수소 및 겨자무과산화효소와 산화 반응을 통해 세로토닌 이량체로 합성하여 변경시키는 단계;
    금 입자의 표면을 숙신이미딜 프로피온산으로 코팅하는 단계;
    상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자를 응집시켜 색 변화하는 단계; 및
    상기 색 변화를 측정하여 세로토닌을 검출하는 단계;를 포함하고,
    상기 세로토닌 이량체와 상기 표면이 코팅된 금 입자의 응집은,
    상기 세로토닌 이량체의 일차 아민과 상기 금 입자의 숙신이미딜 에스터가 결합하여 응집하는 것을 특징으로 하는,
    금 입자와 이량체 세로토닌의 응집을 이용한 세로토닌 검출 방법.
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WO2020185041A2 (ko) * 2019-03-14 2020-09-17 연세대학교 산학협력단 세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도

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