KR20230019780A

KR20230019780A - 히스톤 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 관절염 진단용 조성물

Info

Publication number: KR20230019780A
Application number: KR1020220076208A
Authority: KR
Inventors: 송정식; 변재철; 손동현
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2023-02-09

Abstract

본 발명은 관절염을 일으키는 염증반응의 원인이 되는 세포 외 히스톤의 활성 또는 발현량을 측정하여 해당 질환을 진단하는 방법 및 세포 외 히스톤의 활성 또는 발현을 조절함으로써 해당 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 심한 통증과 삶의 질 저하를 유발하는 관절염, 특히 류마티스관절염의 발생을 세포 외 히스톤 단백질을 측정함으로써 높은 신뢰도로 예측할 수 있는 방법을 제공함과 동시에, 궁극적으로는 세포 외 히스톤 단백질의 활성 또는 발현량을 억제함으로써 관절염의 병인을 제거하는 근원적인 치료제 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

히스톤 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 관절염 진단용 조성물{A Composition for Diagnosing Arthritis Comprising Histone Peptide as Active Ingredients}

본 발명은 활액 내의 세포외 히스톤 단백질에 의한 세포독성이 야기하는 관절염의 발생 여부를 진단하거나, 해당 히스톤 단백질의 활성을 조절함으로써 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

히스톤은 DNA에 부착되는 양이온성 단백질로써, 모든 진핵세포의 핵에 존재한다. 히스톤은 뉴클레오좀(Nucleasomes)를 형성하며, 염색질의 기본적인 소단위체로써, 유전자의 발현 조절에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 히스톤은 양전하를 가짐으로써 인산기에 의하여 음전하를 띄는 DNA와 결합하여 안정적인 구조를 형성한다.

이러한 히스톤은 두가지의 그룹으로 분류되는데, 하나는 코어 히스톤(Histone Core)이고, 다른 하나는 링커 히스톤(Linker Histone)이다. 코어 히스톤은 세부적으로 H2A, H2B, H3 및 H4의 소단위체를 각 2개씩 포함한 옥타머로 구성되어 있고, 링커 히스톤은 H1으로 코어 히스톤들을 연결한다.

반면, 히스톤은 세포 내부에 있을 때와 달리 세포괴사(Necrosis); 세포예정사(Apoptosis) 또는 호중구 세포외 덫에 의한 세포사멸(NETosis) 등으로 인하여 세포가 손상되거나 사멸되어 세포 외 공간으로 나오게 되는 경우 세포독성을 가져 염증반응의 원인이 된다.

한편, 관절에 발생한 염증에 의한 질병인 관절염은 통증과 거동 불편으로 건강에 악영향을 끼칠 뿐만 아니라 삶의 질을 급격히 떨어뜨리는 질병으로써, 특히 류마티스관절염은 병의 진행속도가 빨라서 보통 1-2년내에 관절 손상이 나타나는 반면 기존에 진단을 받기까지 평균 2년이 소요되어 빠른 진단이 절실한 상황이었으나, 명확한 발병 기작이 밝혀져 있지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 세포 외 히스톤이 야기하는 염증반응과 류마티스관절염의 발생 및 진행에 연관성이 있을 수 있다는 점에 착안하여 연구를 진행함으로써, 세포 외 히스톤이 양전하를 통해 활막 세포(Synoviocyte) 또는 대식세포(Macrophage)등의 세포막에 결합하여 해당 세포들의 사멸을 유도하고 이를 통해 류마티스관절염의 발생 및 진행에 중요한 원인이 됨을 확인하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 대한민국등록특허공보 제10-2377420호

본 발명자들은, 환자의 삶의 질에 지대한 영향을 미치면서 발병 후 2-3년 안에 환자의 20%-30%에서 영구 장애로 발전하는 중대한 질병임에도 정확한 병인이 완전히 규명되지 못한 관절염, 특히 류마티스관절염에서 염증 반응의 정확한 원인 인자를 탐색하기 위하여 예의 연구 노력 하였다. 그 결과, 활액 속에 존재하는 세포 외 히스톤(extracellular histone)이 양전하로 인하여 대식세포나 활막세포에 부착됨으로써 세포독성을 일으키고, 특히 히스톤 소단위체인 H2B-α1 펩타이드가 가장 강한 세포독성을 일으킨다는 것을 발견하여 관절염 및 류마티스관절염에 대한 새로운 진단 또는 치료용 타겟이 될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 관절염의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 관절염의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 활액(synovial fluid)내의 세포 외 히스톤(Extracellular Histone) 단백질, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 활성 또는 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 관절염(Arthritis)의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은, 환자의 삶의 질에 지대한 영향을 미치면서 발병 후 2-3년 안에 환자의 20%-30%에서 영구 장애로 발전하는 중대한 질병임에도 정확한 병인이 완전히 규명되지 못한 관절염, 특히 류마티스관절염에서 염증 반응의 정확한 원인 인자를 탐색하기 위하여 예의 연구 노력 하였다. 그 결과, 활액 속에 존재하는 세포 외 히스톤(extracellular histone)이 양전하로 인하여 대식세포나 활막세포에 부착됨으로써 세포독성을 일으키고, 특히 히스톤 소단위체인 H2B-α1 펩타이드가 가장 강한 세포독성을 일으킨다는 것을 발견하여 관절염 및 류마티스관절염에 대한 새로운 진단 또는 치료용 타겟이 될 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서 용어 “활액”이란, 관절강; 사지의 근이나 건에서 볼 수 있는 건초; 근이나 건이 뼈, 연골, 또는 인대에 접할 때 볼 수 있는 소낭 속에 있는 담황색의 점성이 있는 액체로써, 관절 내면을 습하게 하여 마찰을 방지하는 윤활유와 같은 역할을 하는 액체를 의미하며, “관절액”도 같은 의미를 가진다.

본 명세서에서 용어“세포 외 히스톤 단백질”이란, 세포 내부에 존재하던 양이온성의 띄며 DNA와 결합하는 히스톤 단백질이, 세포사멸에 의하여 세포 외부로 나와서 존재하게 된 경우를 의미한다. 이러한 세포 외 히스톤은 DAMP 단백질로 작용하여 면역반응을 활성화시키거나 수리 기작을 작동시키는 기능을 수행할 수도 있다. 본 명세서에서 용어 “DAMPs”는 손상 연관 분자 유형(damage-associated molecular pattern)라고도 지칭되며, 외부충격 또는 병원에 감염되어 손상되거나 사멸된 세포에서 방출되는 물질로써 선천성 면역 반응(innate immune response)에 관여하는 물질을 의미하며, 위험 연관 분자유형(danger-associated molecular patterns); 위험 신호(danger signal) 또는 알라민(alarmin)이라고도 불릴 수 있다.

본 명세서에서 용어 “히스톤 서브유닛”은 DNA와 결합하는 히스톤 단백질을 구성하는 패밀리 히스톤 아형을 의미한다. 구체적으로 히스톤은 코어 히스톤(core histone)과 링커 히스톤(linker histone)으로 나뉘며, 코어 히스톤은 H2A, H2B, H3 및 H4가 각각 2개씩 모여서 구성되는 히스톤 팔량체(histone octamer)로 구성되고, 링커 단백질(H1)은 이러한 히스톤 팔량체를 연결하는 역할을 수행한다.

본 명세서에서 용어“히스톤 펩타이드 절편”은 히스톤 서브유닛의 아미노산 중 일부의 절편을 가지는 펩타이드를 의미하며, 구체적으로는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 펩타이드를 의미한다.

본 명세서에서 용어“관절염”은 하나 이상의 관절에서 붓기나 압통(tenderness)에 의해 골 연결부의 윤활작용이 상실 또는 저해되는 질환을 의미하며, 관절에서의 염증 발생이 병의 주요한 원인으로 알려져 있다. 또한, 본 명세서의 “관절염”이라는 질병의 범주에는 염증성 관절염(Inflammation Arthritis, IA)뿐만 아니라, 관절의 물리적인 손상에 의하여 염증이 발생하는 골관절염(Osteoarthritis, OA)도 해당되나, 언급한 질병에 국한되지 않고 관절부위에서 과도한 염증이 수반되는 모든 형태의 질병이 포함된다.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.

본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체의 관절염 발병 여부를 판단하거나 발명 가능성을 예측하기 위해 활액 내의 세포 외 히스톤 단백질의 활성 또는 발현량의 측정수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 단백질을 측정하는 제제는 상기 세포 외 히스톤 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 세포 외 히스톤 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 세포 외 히스톤 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 관절염 발생 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 세포 외 히스톤 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석함으로써, 관절염의 발생 여부를 예측할 수 있다. 즉, 개체의 시료에서 세포 외 히스톤 단백질에 대한 시그널이 정상 시료보다 강하게 나오는 경우에는 개체에서 관절염이 진행되었거나 향후 진행될 가능성이 높은 것으로 판단된다.

본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, “특이적으로 결합(specifically binding)” 은 “특이적으로 인식(specifically recognizing)”과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.

본 발명은 항체 대신 세포 외 히스톤 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 관절염은 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis, RA)이다.

본 명세서에서 용어 “류마티스관절염”은 주로 관절에 영향을 미치는 장기적인 자가 면역 질환으로써, 일반적인 증상으로 열감, 부풀어오름 또는 관절의 통증 및 뻣뻣함을 수반하며, 통증과 뻣뻣함은 시간이 시간 지난 후 악화되는 경우가 많다. 해당 질병은 관절 외에도 피부, 눈, 폐, 심장, 신경 및 혈액을 포함한 신체의 다른 부위에도 영향을 미칠 수 있으며, 적혈구 수 감소, 폐 또는 심장 주변 염증을 유발할 수도 있다. 질병의 원인으로는 다양한 유전적·환경적인 요인에 의하여 신체의 면역 시스템이 관절을 공격하게 되어 발생하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 서브유닛은 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 히스톤 단백질이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Aα1, H2Bα1, H3α1 및 H4α1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 절편이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Bα1를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 가진다.

본 명세서에서 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열은 H2A-α1, H2B-α1, cit-H2B-α1, H3-α1 또는 H4-α1 히스톤 펩타이드 절편의 서열들이며, 자세한 서열은 다음과 같다.

서열번호 1 (H2A-α1) : KTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYSERVGAGAP

서열번호 2 (H2B-α1) : QKKDGKKRKRSRKESYSIYVYKVLKQVHPDTGIS

서열번호 3 (cit-H2B-α1) :

QKKDGKK-Cit-K-Cit-S-Cit-KESYSIYVYKVLKQVHPDTGIS

서열번호 4 (H3-α1) : LIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQ

서열번호 5 (H4-α1) : RHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLI

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포외 히스톤 펩타이드 절편은 활막세포(Synoviocytes) 또는 대식세포(Macrophages)에 대하여 세포독성을 가진다.

본 명세서에서 용어 “활막세포(synoviocyte)”는 관절강의 내면을 덮고 있는 활막(synovium)의 세포를 의미하며, 활막세포는 대식세포 모양이며 식작용을 하는 A형 세포와 섬유아세포인 B형 세포로 나뉜다. 이 중 B형 세포는 섬유아세포-유사 활막세포(Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS)라고도 불리며, 류마티스관절염에서 관절을 손상시키는 사이토카인 등의 물질을 분비하는 가장 흔한 세포이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)의 활성 또는 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함한다.

본 명세서에서 용어 “LPS”는 지질 다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 의미하고, 리포 다당; 리포 다당류; 지질다당질; 지다당류; 당지방질 또는 내독소(endotoxin)라고도 지칭되며, 지질과 다당류(공유결합에 의해 결합되는 O-항원, 외핵, 내핵으로 구성됨)로 구성되는 커다란 분자를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 세포 외 히스톤 단백질, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 관절염(Arthritis)의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 활액의 세포 외 히스톤 단백질과 관절에서의 염증반응이 양의 상관 관계를 가진다는 사실을 최초로 발견하였다. 이에, 개체 내 활액에서 세포 외 히스톤 단백질이 증가된 경우 관절염이 발생하였거나 향후 발생할 가능성이 높은 것으로 판단한다.

본 명세서에서 “히스톤 단백질이 증가되었다”함은 상기 단백질의 발현량, 농도 또는 활성이 관절염이 발생하지 않은 대조군에 비하여 유의하게 높은 경우를 의미하며, 구체적으로는 그 발현량이 대조군의 130% 이상인 경우를, 보다 구체적으로는 150% 이상인 경우를, 가장 구체적으로는 170% 이상인 경우를 의미한다.

본 명세서에서 용어“개체”는 활액의 세포 외 히스톤 단백질의 농도를 측정하기 위한 시료를 제공하고, 궁극적으로 관절염 발생 여부의 분석 대상이 되는 개체를 의미한다. 개체는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하며, 구체적으로는 인간이다. 본 발명의 조성물은 현재 관절염 발생 여부 뿐 아니라 향후 관절염 발생을 예측하기 위한 정보도 제공하기 때문에, 본 발명의 개체는 관절염 환자일 수도 있고 아직 관절염이 발생하지 않은 개체일 수도 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 활액(Synovial Fluid)을 포함하는 시료이다.

본 발명의 류마티스관절염 및 활액에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 이를 생략한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Aα1, H2Bα1, cit-H2B-α1, H3α1 및 H4α1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 절편이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Bα1를 포함하며, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 히스톤 서브유닛, 히스톤 펩타이드 절편, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 이를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 활액(synovial fluid)내의 세포 외 히스톤 단백질, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염(Arthritis)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어“억제제”는 타겟 단백질의 활성 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 타겟 단백질의 활성이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 타겟 단백질의 생물학적 기능이 유의하게 저하될 수 있을 정도로 활성 또는 발현을 저하시키는 물질을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 세포 외 히스톤 단백질 억제제는 해당 단백질의 활성을 저해하는 특이적 항체일 수 있다. 목적 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명에서 이용될 수 있는 항체 또는 앱타머에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 방지하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 세포 외 히스톤 단백질의 활성이 낮아짐으로써, 세포 외 히스톤 단백질이 가지는 세포독성이 저해되어 과도한 염증반응을 억제, 제거 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 억제제는 히스톤-유도 세포독성(Histone-Induced Cytotoxicity)을 억제한다.

본 발명에 따르면, 세포 외 히스톤을 억제할 경우 세포 외 히스톤이 강한 양전하를 통하여 세포막에 달라붙어서 세포막을 손상시킴으로써 나타내는 세포독성을 억제할 수 있다. 이러한 억제는 예를 들어 황산 콘드로이틴(Chondroitin sulfate) 또는 히알루론산(Hyaluronic acid)에 의하여 달성될 수 있으나, 이에 국한되지 않고 세포 외 히스톤의 세포독성을 억제할 수 있는 모든 수단을 포함한다.

또한, 본 발명에 따르면 세포 외 히스톤 단백질의 아미노산 중 아르기닌을 시트룰린으로 변경하는 경우, 세포 외 히스톤의 양전하가 감소하여 세포 외 히스톤으로 인한 세포독성이 감소하므로, 세포 외 히스톤의 양전하를 감소시킬 수 있는 수단을 관절염의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 관절염(Arthritis)의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) H2A, H2B, H3 및 H4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 외 히스톤 서브유닛; 세포 외 히스톤 펩타이드 절편; 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 생물학적 시료 내 상기 세포 외 히스톤 서브유닛 또는 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계,

상기 생물학적 시료 내 상기 세포 외 히스톤 서브유닛 또는 상기 세포 외 히스톤 펩타이드의 활성 또는 발현량이 감소하는 경우, 상기 시험물질은 관절염의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.

본 발명에서 사용되는 세포 외 히스톤 및 이들의 활성 조절을 통해 예방 또는 치료할 수 있는 질병들에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, 상술한 세포 외 히스톤 단백질을 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 활액일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 세포 외 히스톤 단백질을 포함하는 시료에 첨가되어 해당 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 상기 단백질의 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 활액(Synovial Fluid)이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Aα1, H2Bα1, H3α1 및 H4α1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 절편이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 서열번호 1 내지 5로 표시되는 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 관절염을 일으키는 염증반응의 원인이 되는 세포 외 히스톤의 활성 또는 발현량을 측정하여 해당 질환을 진단하는 방법 및 세포 외 히스톤의 활성 또는 발현을 조절함으로써 해당 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 심한 통증과 삶의 질 저하를 유발하는 관절염, 특히 류마티스관절염의 발생을 세포 외 히스톤 단백질을 측정함으로써 높은 신뢰도로 예측할 수 있는 방법을 제공함과 동시에, 궁극적으로는 세포 외 히스톤 단백질의 활성 또는 발현량을 억제함으로써 관절염의 병인을 제거하는 근원적인 치료제 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 골관절염(OA)(n = 13) 및 류마티스관절염(RA)(n = 19) 환자의 활액에서 각 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4) 수준을 도시한 그래프이다. 도 1b는 복강 내 히스톤 또는 인산완충식염수(PBS) 주사를 사용한 마우스(그룹당 n = 10)의 STA 중증도 및 발 두께를 도시한 그래프로써, 0일과 2일에는 K/BxN 혈청을 투여하고 1일과 3일에는 히스톤 또는 PBS 200㎍을 투여하였다. 도 1c는 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색된 발목 관절 단면의 대표 이미지(배율 20배)이다. 도 1d는 활액막염(Synovitis), 판누스 형성(Pannus formation) 및 발목 관절 미란(erosion)의 조직학적 점수를 도시한 그래프이다.
도 2a는 SYTOX 그린에 의해 검출된 MH7A 및 THP-1 세포의 히스톤 유도 세포독성 결과를 나타낸 그림이다. 도 2b는 MH7A(왼쪽) 및 THP-1 세포(오른쪽)에서 SYTOX 그린으로 감지한 사멸 세포의 시간 경과 플롯을 도시한 그래프로써, Operetta 세포 이미징 시스템을 이용하였다. 도 2c는 1시간 동안 히스톤으로 처리된 MH7A 및 THP-1 세포의 세포외 ATP 수준을 도시한 그래프이다. 도 2d는 1시간 동안 히스톤으로 처리한 MH7A 및 THP-1 세포의 세포외 IL-1β 수준을 도시한 그래프이다. 도 2e는 3시간 또는 24시간 동안 히스톤으로 처리한 THP-1 세포의 HMGB1 수준을 도시한 그래프이다. 도 2f는 24시간 동안 히스톤 및/또는 지질다당류(LPS)(10ng/mL)로 처리한 THP-1 세포의 TNF-α 수준을 도시한 그래프이다.
도 3a는 LDH 방출 분석을 통하여 황산 콘드로이틴에 의한 히스톤 유도 세포독성의 감소를 모니터링한 결과를 도시한 그래프이다. 도 3b는 HMGB1 수준을 통하여 황산 콘드로이틴에 의한 히스톤 유도 세포독성의 감소를 모니터링한 결과를 도시한 그래프이다. 도 3c는 SYTOX 그린으로 감지한 사멸 세포의 시간 경과 플롯을 통하여 LPS(50ng/mL)가 히스톤-유도 세포독성을 증가시킴을 도시한 그래프로써, Operetta 세포 이미징 시스템을 이용하였다. 도 3d는 LPS로 자극된 THP-1 세포에서 폴리-L-리신의 세포에의 결합 정도를 도시한 그래프이다. 도 3e는 과염소산나트륨(10mM/mL)과 함께, 히스톤(100μg/mL) 및 LPS (200ng/mL)를 처리한 경우에서 SYTOX 그린으로 감지한 사멸 세포의 시간 경과 플롯을 도시한 그래프로써, Operetta 세포 이미징 시스템을 이용하였다.
도 4a는 각 종류의 재조합 히스톤 단백질(4μM)에 대한 히스톤 유도 세포독성(3시간)을 LDH 방출 분석을 통하여 확인한 결과를 도시한 그래프이다. 도 4b는 각 종류의 재조합 히스톤 단백질(4μM)에 대한 히스톤 유도 세포독성(3시간)을 루시퍼레이즈 분석을 통한 HMGB1 방출량 측정을 통하여 확인한 결과를 도시한 그래프이다. 도 4c는 히스톤 α1 단백질의 각 클래스에 대한 히스톤 유도 세포독성(24시간)을 LDH 방출 분석을 통하여 확인한 결과를 도시한 그래프이다. 도 4d는 히스톤 α1 단백질의 각 클래스에 대한 히스톤 유도 세포독성(24시간)을 루시퍼레이즈 분석을 통한 HMGB1 방출량 측정을 통하여 확인한 결과를 도시한 그래프이다. 도 4e는 천연 또는 시트룰린화(cit) H2B-α1 펩타이드(50μM)에 대한 히스톤 유도 세포독성(24시간)을 LDH 방출 분석을 통하여 확인한 결과를 도시한 그래프이다. 도 4f는 천연 또는 시트룰린화(cit) H2B-α1 펩타이드(50μM)에 대한 히스톤 유도 세포독성(24시간)을 루시퍼레이즈 분석을 통한 HMGB1 방출량 측정을 통하여 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
도 5a는 3시간 동안 H2B-α1 펩티드 또는 cit-H2B-α1 펩티드로 처리된 THP-1 세포의 RNA-seq 데이터의 발현 클러스터링을 도시한 그림이다. 도 5b는 차등적으로 발현된 유전자(DEG)에 대한 주성분 분석(PCA) 결과를 도시한 그래프이다. 도 5c는 DEG들에 대한 벤 다이어그램을 도시한 그림이다. 도 5d는 DEG의 중요한 유전자 온톨로지 경로를 도시한 그림이다. 도 5e는 케모카인 경로에서 상위 DEG들을 도시한 그림이다. 도 5f는 THP-1 세포에서 히스톤 자극에 의한 CCL4의 수준을 도시한 그래프이다.
도 6은 MH7A 세포(왼쪽 패널) 및 THP-1 세포(오른쪽 패널)에서 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 염색을 사용한 죽은 세포의 분석결과를 도시한 그림이다.
도 7a 내지 7k는 각 중요 경로에서의 상위 차별 발현 유전자(differentially expressed genes, DEG)들을 도시한 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 분석방법

활액 샘플에서 세포외 히스톤의 측정(determination)

인간 활액 샘플은 동의가 필요하지 않은, 스탠포드 대학교 의과대학 기관 검토 위원회 (Stanford University School of Medicine Institutional Review Boards)에서 승인한 폐기 표본에 대한 프로토콜에 의거하여 수득하였다. 샘플은 분석 시점까지 -80℃에서 냉동 보관하였다. 류마티스관절염 환자는 질병에 대한 미국류마티즘학회(American College of Rheumatology) 기준을 충족하였다. 무릎 골관절염(Knee OA) 환자는 45세 이상이었으며, 방사선학적 켈그렌/로렌스 분류법(Kellgren/Lawrence) 등급 ≥ 3의 변화가 있었다. H2A, H2B, H3 및 H4의 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 각 히스톤(antibodies-online, Aachen, Germany)에 대한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 사용하여 결정하였다.

K/BxN 혈청 전달 관절염(Serum-Transfer Arthritis, STA) 마우스 모델

8주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Koatech, Pyeongtaek, Korea)는 12시간의 명암 주기로 23±2 ℃ 및 50±10 % 습도의 통제된 조건하에 수용되었으며 표준 먹이식단(standard chow diet)과 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. STA는 0일 및 2일에 C57BL/6 마우스에 150μL의 K/BxN 혈청을 복강 내 주사하여 유도하였다. 마우스는 1일차와 3일차에 200μg의 송아지 히스톤(Roche, Basel, Switzerland)을 복강 내 주사하였다. 임상 관절염 점수는 다음과 같은 기준으로 결정하였다: 0, 부기 또는 홍반 없음; 1, 경미한 부기 및 홍반 또는 손가락 염증; 2, 중간 발(mid-paw)의 원위부(region distal)에 국한된 중간 정도의 부종 및 홍반; 3, 발목까지 확장된 뚜렷한 부기 및 홍반; 4, 발목, 발 및 손가락의 심한 부기, 홍반 및 관절 강직. 각 사지의 관절염의 중증도는 0-4의 척도로 등급을 매겼다(각 마우스에 대해 가능한 최대 점수는 16). 뒷발의 발 두께는 다이얼 두께 게이지(dial thickness gauge)로 측정하였다. 마우스 관절 조직은 10% 포르말린으로 고정하고 5% 포름산으로 탈회(decalcified)시킨 후 파라핀에 포매하였다. 파라핀 포매 조직의 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 전술한 채점 시스템을 기반으로 활액막염, 판누스 형성 및 뼈 및/또는 연골의 미란(erosion)에 대해 맹검 검사자(blinded examiner)가 채점하였다. 각 실험 조건에 대해 10마리 마우스의 관절을 평가하고 점수를 매겼다. 모든 동물 실험 및 프로토콜은 부산대학교(밀양, 한국)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 제도 및 국가 지침에 따라 수행하였다.

세포 배양 및 시약

인간 활막 섬유아세포주 MH7A(가톨릭대학교 류마티스내과 김완욱 박사로부터 활막 세포주 제공받음)를 25mM HEPES 및 L-글루타민(Hyclone)을 함유하고, 열 불활성화 10% 소 태아 혈청(FBS; Hyclone), 100 units/mL 페니실린(Hyclone) 및 100μg/mL 스트렙토마이신(Hyclone)으로 보충한 RPMI-1640(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. THP1-HMGB1-Lucia^TM 세포 (THP-1 세포, InvivoGen, San Diego, CA, USA)는 25mM HEPES, L-글루타메이트, 열 활성화 10% FBS, 100 units/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 100μg/mL Normocin^TM(InvivoGen)으로 보충한 RPMI-1640에서 성장시켰다. 모든 분석을 위해 THP-1 세포를 96웰 플레이트에 1 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 시딩하였고, 25ng/mL의 포볼 2-미리스테이트 13-아세트산(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA, Sigma-Aldrich, MO)와 함께 부탁성 대식세포로 밤새 분화시켰다. 세포에는 송아지 흉선 히스톤(Abnova, Taipei, Taiwan); 재조합 히스톤, H2A, H2B, H3 및 H4(New England BioLabs, Cambridge, MA, USA); 또는 히스톤 펩타이드(Peptron, 대전, 한국, 표 1)를 처리하였다.

히스톤 펩타이드의 서열

Histone peptides	Sequence
H2A-α1	KTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNYSERVGAGAP
H2B-α1	QKKDGKKRKRSRKESYSIYVYKVLKQVHPDTGIS
cit-H2B-α1	QKKDGKK-Cit-K-Cit-S-Cit-KESYSIYVYKVLKQVHPDTGIS
H3-α1	LIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQ
H4-α1	RHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLI

젖산탈수소효소 방출분석 (Lactate dehydrogenase (LDH) release assay)

LDH 분석 키트(EZ-LDH, DoGenBio, Seoul, Korea)를 이용하여 세포에서 배지로 방출되는 LDH의 양을 측정하였다. 해당 키트는 수용성 테트라졸륨염(water-soluble tetrazolium salt, WST)의 양을 측정하여 세포의 세포독성을 결정하는데 사용되었다. 세포를 무혈청 배지에서 1 x 10⁵세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 다양한 농도의 히스톤으로 3시간 동안 배양한 후, 각 시료의 상층액 10μL와 LDH Reaction Mix(WST 기질 믹스, LDH assay buffer) 100μL를 25℃에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션하였고, 수용성 WST의 광학 밀도를 FlexStation3 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 측정하였다.

SYTOX ^TM 그린 사멸 세포 염색(SYTOXTM Green dead cell stain)을 이용한 형광 이미징

MH7A 세포와 THP-1 세포를 각각 1×10⁵ 세포/웰 및 5×10⁵ 세포/웰의 밀도로 24시간 동안 배양하였다. 세포를 5μM 회흐스트(Hoechst) 33342 염색약(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 1시간 동안 처리한 다음, 다양한 농도의 히스톤 및/또는 지질다당류(LPS, Sigma-Aldrich)로 처리하고 , 제조업체의 프로토콜에 따라 무혈청 조건에서 원형질막 불투과성 염색약인 SYTOX GREEN(Invitrogen)으로 염색하였다. 히스톤을 첨가하기 전에, 세포를 24시간 동안 10mM 과염소산나트륨(Sigma-Aldrich)으로 처리하거나 처리하지 않았다. 세포의 라이브 이미지는 형광 현미경(Eclipse Ti2, Nikon Instruments, Tokyo, Japan) 또는 자동 세포 이미징 시스템(Operetta CLSTM, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)으로 얻었다. Operetta 세포 이미징 시스템에서 얻은 이미지의 경우 Harmony^® 소프트웨어(PerkinElmer)를 사용하여 제조업체의 분석 프로토콜에 따라 이미지 분석 및 세포 계수를 수행하였다.

루시퍼레이즈 분석(Luciferase Assay)를 통한 HMGB1의 정량

THP-1 세포에서 방출된 HMGB1::Lucia luciferase의 수준을 luciferin을 이용한 luminometer(FlexStation3)로 측정하였다. 각 웰의 샘플을 제조사의 지침에 따라 QUANTI-Luc^TM(InvivoGen)과 혼합하고 루시페라아제 수치를 측정하였다.

아데노신 삼인산(ATP)-모니터링 발광 분석 (ATP-monitoring luminescence assay)

ATP는 모든 대사 활성 세포에 존재하기 때문에 세포 생존 능력의 마커이고, ATP 농도는 세포가 괴사 또는 세포자멸사를 겪을 때 급격히 감소한다. ATPlite(PerkinElmer, Waltham MA, USA)는 세포 증식 및 세포 독성의 정량적 평가를 위한 루시페라제 기반 분석으로, 해당 분석을 위하여 세포를 5 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 다양한 농도의 히스톤으로 1시간 동안 처리하였고, 그 다음, ATPlite 완충액과 동결건조된 기질 용액을 혼합하였다. 마지막으로, 각 웰의 세포를 상기 혼합물 50μL와 함께 10분 동안 인큐베이션한 후 발광성을 측정하였다.

폴리-L-라이신(Poly-L-Lysine)을 측정하기 위한 형광 이미징(Fluorescence imaging)

FITC로 표지된 폴리-L-리신(Sigma-Aldrich)의 세포 결합을 측정하기 위해 THP-1 세포를 2 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 시딩하고 24시간 동안 100ng/mL LPS로 처리하였다. 그런 다음, 10μg/mL 폴리-L-리신-FITC를 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 형광 현미경(Eclipse Ti2)으로 세포를 관찰하여 형광 이미지를 얻었다. 이미지의 형광 강도의 정량화는 ImageJ(https://imagej.nih.gov)를 사용하여 수행하였다.

7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 유세포분석을 이용한 세포 생존율의 측정

유세포 분석에서 세포막 손상을 감지하기 위해 DNA 염색 형광 마커 7-AAD(Invitrogen)를 사용하였다. MH7A 및 THP-1 세포를 5 × 10⁵ 세포/웰의 밀도로 시딩하고 1시간 동안 다양한 농도의 히스톤으로 처리하였다. 그런 다음, 1㎍/mL 7-AAD를 세포에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 7-AAD를 검출하기 위해 BD LSRII SORP(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 세포를 분석하였다.

ELISA를 통한 인터류킨-1베타(Interleukin-1β,IL-1β), 종양 괴사 인자-알파(Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α) 및 C-C 모티프 케모카인 리간드 4 (C-C Motif Chemokine Ligand 4, CCL4)의 측정

IL-1β(eBioscience, San Diego, CA, USA), TNF-α(Invitrogen, San Diego, CA, USA) 및 CCL4(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 수준은 ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.

RNA 염기서열 분석(RNA-seq) 및 차등 발현 유전자(DEGs)의 분석

H2B-α1 펩타이드 또는 cit-H2B-α1 펩타이드를 처리한 THP-1 세포에서 TRIzol^TM 시약(Invitrogen)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 각 조건에서 총 3 μg의 총 RNA 샘플을 3개의 실험 복제(experimental replicates)로 준비하였고, QuantSeq 3' mRNA-Seq 서비스(Ebiogen, Seoul, Korea)를 사용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다. Bioanalyzer 2100 system(Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 품질을 확인한 후, 5' 말단에 Illumina 호환 서열을 포함하는 oligo-dT 프라이머 세트를 준비된 RNA에 혼성화하고 역전사를 수행하였다. 고처리량 시퀀싱은 Illumina NextSeq 500(San Diego, CA, USA)을 사용하여 단일 말단 시퀀싱(single-end sequencing)으로 수행하였다. 결과 판독은 인간 참조 게놈 hg19와 Bowtie2(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2)를 사용하여 정렬하였다. DEG는 Bedtools(https://bedtools.readthedocs.io)의 적용 범위를 사용하여 정렬(alignments)의 계수(count)를 기반으로 결정하였다. 리드 카운트 데이터(read count data)는 EdgeR(https://bioconductor.org)을 사용한 분위수 정규화 방법(quantile normalization method)에 따라 처리하였다. 유전자 농축 분석(Gene enrichment analysis)은 Reactome 경로 데이터베이스 (https://reactome.org) 및 유전자 온톨로지 컨소시엄(Gene Ontology Consortium) 데이터베이스(http://geneontology.org)를 사용하여 MATLAB(MathWorks, Natick, MA, USA)을 통해 수행하였다.

통계분석

Prism 9 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차로 표시하였다. 또한 두 그룹 간의 통계적 차이를 분석하기 위해 unpaired t-test를 수행하였다. Tukey-Kramer 다중 비교 테스트를 사용한 일원 또는 이원 ANOVA를 여러 그룹 간의 비교에 사용하였다. 통계적 유의 수준은 P < 0.05로 설정하였다.

실험결과

RA 활액(Synovial Fluid)에서 히스톤의 증가 및 세포외 히스톤으로 인한 관절염의 악화를 관찰하였다.

히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4의 수준은 골관절염(OA) 환자에 비해 류마티스관절염(RA) 활액에서 유의하게 상승함을 관찰하였다(도 1a). 다음으로 세포 외 히스톤이 염증성 관절염을 악화시킬 수 있는지 여부를 테스트하였다. 마우스에 STA를 유도하였을 때, 히스톤의 공동 주입은 관절염을 악화함을 확인하였다(도 1b). 또한, 조직병리학적 분석을 통하여 히스톤이 활액막염(synovitis), 판누스 형성(pannus formation) 및 뼈와 연골의 미란(erosion)을 증가시킴을 알 수 있었다(도 1c 및 1d). 이러한 결과를 통하여, 히스톤이 관절염에 해로운 영향을 미친다는 결론을 얻을 수 있었다.

히스톤은 활액세포(Sinoviocytes) 및 대식세포(Macrophage)에서 세포독성을 유도한다.

실험을 통하여 세포외 히스톤이 활액막과 대식세포에서 세포 손상 및 세포 사멸을 유발할 수 있는지 조사하였다. 실험 결과, SYTOX 그린 사멸 세포 염색(도 2a 및 2b)에 의해 시각화된 바와 같이 히스톤이 MH7A(활막 세포) 및 PMA로 분화된 THP-1(대식세포) 세포에서 세포 독성을 증가시키는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 히스톤 유도 용해성 세포 사멸은 MH7A 세포보다 THP-1 세포에서 더 빠르고 두드러졌다.

히스톤은 DAMP와 사이토카인의 방출을 유도한다.

활막 대식세포는 RA 환자의 활막에서 가장 풍부한 염증 세포 유형 중 하나이며 활성화된 대식세포는 염증을 유발하기 위해 추가 면역 세포를 모집하기 위해 다양한 사이토카인을 생성하는데, 히스톤에 의해 유발된 세포독성의 메커니즘과 이로인한 염증이 관절에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포 손상에 의해 방출되는 분자 중 하나인 ATP의 수준을 측정하였다. 손상 관련 분자 패턴(damage-associated molecular pattern, DAMP)으로 작용할 수 있는 세포외 ATP(Extracellular ATP)는 MH7A 세포와 THP-1 세포 모두에서 히스톤에 의해 증가됨을 관찰할 수 있었다(도 2c). 대조적으로, IL-1β은 MH7A 세포가 아닌 THP-1 세포에서만 히스톤에 의해 유도되었다(도 2d). 알려진 DAMP인 HMGB1의 수준도 THP-1 세포의 히스톤에 의해 증가됨을 확인하였다(도 2e). 또한 THP-1 세포에 LPS가 있거나 없는 환경에서 히스톤을 처리한 경우 TNF-α의 수준을 측정하였는데, 히스톤 처리 조건에서 TNF-α가 증가됨을 관찰할 수 있었고, 이를 통해 히스톤이 LPS와 함께 염증 반응에 있어서 상승효과가 있음을 확인하였다(도 2f).

황산 콘드로이틴은 히스톤 유발 세포 독성을 억제한다.

히스톤은 강한 양전하를 통하여 세포에 결합함으로써 세포독성을 나타내는데, 음이온성 다당류와 펩타이드가 히스톤의 세포독성을 중화시키기 때문에 활액의 하전 분자 중 하나인 황산 콘드로이틴이 히스톤 유도 세포독성을 약화시킬 수 있는지 테스트하였다. 그 결과, 히스톤 유발 세포독성 및 HMGB1 생성은 콘드로이틴 설페이트에 의해 강력하게 억제됨을 확인하였다(도 3a 및 3b).

LPS는 세포 독성을 유도하는 히스톤의 능력을 증가시킨다.

LPS로 처리된 세포에 대한 히스톤의 영향을 분석하기 위하여 THP-1 세포의 SYTOX 그린 염색을 통해 분석한 결과, 세포가 히스톤 단독보다, LPS 및 히스톤이 함께 처리될 때 히스톤 유도 세포독성이 증가하는 됨을 관찰하였다(도 3c). THP-1 세포의 염증 과정에서 정전기적 상호작용을 확인하기 위해, LPS에 의해 자극을 받을 때 양전하를 띤 폴리-L-라이신의 세포에 대한 결합도를 측정하였다. LPS로 처리한 경우, 폴리-L-리신 결합이 증가되는 것을 관찰하였고(도 3d), 황산화(sulfation) 억제제인 과염소산나트륨(sodium perchlorate)으로 처리하는 경우 세포독성이 감소함을 관찰할 수 있었다(도 3e).

H2B-α1 펩타이드는 세포 독성을 유도한다.

다음으로, 어떤 종류의 히스톤이 세포독성을 유발하는지 조사하였다. THP-1 세포를 각 히스톤으로 처리했을 때, 모든 히스톤은 세포독성을 유도하였고(도 4a), H4를 제외한 모든 히스톤은 HMGB1 생산을 유의하게 증가시킴을 관찰할 수 있었다(도 4b). 표 1에 나타난 히스톤 구조를 통하여 각 히스톤 단백질 H2A, H2B, H3 및 H4의 α1 도메인의 세포독성을 시험하여 히스톤 및 그 변형의 효과를 실험적으로 확인하였다. 히스톤은 DNA-결합 α1 나선을 사용하여 인지질-포스포디에스테르 결합(phospholipid-phosphodiester bonds)에 부착하고 막 투과성을 변경하여 세포 손상 및 사멸을 유발한다. 세포를 각 히스톤의 α1 도메인 펩타이드로 처리했을 때, H2B-α1 펩타이드는 THP-1 세포에서 세포독성과 HMGB1 생성을 강력하게 유도하였다(도 4c 및 4d). 또한, 히스톤의 결합은 양전하의 변형에 의해 변경될 수 있기 때문에 H2B-α1의 양전하를 띤 아르기닌을 시트룰린으로 대체하여 보았는데(표 1), H2B-α1의 시트룰린화에 의하여 H2B-α1에 의해 유도된 세포독성과 HMGB1 생산이 억제됨을 관찰할 수 있었다(도 4e 및 4f).

H2B-α1 펩타이드는 케모카인 활성화를 유도하고 시트룰린화는 이 과정을 완화한다.

히스톤의 세포 효과(celluar effect)를 조사하기 위해 천연 또는 시트룰린화 H2B-α1 펩타이드를 처리한 THP-1 세포의 RNA-seq 데이터를 분석하였다. DEG의 정규화된 발현을 나타내는 클러스터그램을 도 5a에 표시하였다(도 5a). H2B-α1 펩타이드를 처리한 THP-1 세포와 비교하여, 시트룰린화 H2B-α1 펩타이드를 처리한 세포의 전사체(transcriptome)는 비처리 대조군 세포의 발현 패턴에서 더 적은 변화를 보였다. 1,420 DEGs에 주축 분석(principal axis analysis, principal component analysism, 주성분분석, PCA)을 적용하여 각각 분산의 76.9% 및 14.5%를 설명하는 두 개의 주성분 PC1(Principal Component 1) 및 PC2(Principal Component 2)를 확인하였다(도 5b). 2차원 PC 공간에서 각 처리 그룹의 3개 반복(replicate)이 배타적으로 분포되고(exclusively distributed), 완전히 분리되었다(completely separated). 전사체 데이터는 벤 다이어그램을 통하여 요약하였다(도 5c). 유전자 온톨로지 및 경로 분석을 수행하여 천연 히스톤의 효과와 관련된 분자 경로를 조사하였다. 가장 풍부한 리엑톰 경로(Reactome pathway)를 도 5d에 나열하였으며, 도 5e에 각 경로에 대해 FDR(False Discover Rate) 및 발현 배수 변화(expression fold change)를 기반으로 상위 DEG를 표시하였다. H2B-α1 펩티드 자극은 THP-1 세포에서 케모카인, IL-1, -4, -10, -13 신호전달 및 TLR 신호전달 경로를 포함하는 유전자 발현 패턴의 변화를 초래하였다. 또한, 세포독성 H2B-α1 펩타이드에서 양전하를 띤 아르기닌의 시트룰린화는 히스톤 유발 염증유발 유전자 발현을 감소시켰다. DEG 중 가장 큰 배수 변화를 갖는 DEG인 CCL4의 히스톤 유도 발현 역시 THP-1 세포을 통하여 입증할 수 있었다(도 5f). 이러한 결과를 통하여 히스톤 독성이 염증 및 세포 사멸 경로와 관련이 있으며, H2B-α1 펩타이드의 아르기닌 잔기가 히스톤 독성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Yonsei University Industry Academic Cooperation Foundation Institute for Research & Industry Cooperation, PNU <120> A Composition for Diagnosing Arthritis Comprising Histone Peptide as Active Ingredients <130> PDPB214171k01 <150> KR 10-2021-0101570 <151> 2021-08-02 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2A-alpha 1 <400> 1 Lys Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val 1 5 10 15 His Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Pro <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H2B-alpha 1 <400> 2 Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Ile Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly 20 25 30 Ile Ser <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cit-H2B-alpha 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa represents Citrulline. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa represents Citrulline. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa represents Citrulline. <400> 3 Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Xaa Lys Xaa Ser Xaa Lys Glu Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Ile Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly 20 25 30 Ile Ser <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H3-alpha 1 <400> 4 Leu Ile Arg Lys Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln 1 5 10 15 Asp Phe Lys Thr Asp Leu Arg Phe Gln 20 25 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H4-alpha 1 <400> 5 Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys Pro 1 5 10 15 Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser Gly 20 25 30 Leu Ile

Claims

활액(synovial fluid) 내의 세포 외 히스톤(Extracellular Histone) 단백질, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 활성 또는 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 관절염(Arthritis)의 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis, RA)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 서브유닛은 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 히스톤 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Aα1, H2Bα1, H3α1, cit-H2B-α1 및 H4α1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 절편인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Bα1를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 활막세포(Synoviocytes) 또는 대식세포(Macrophages)에 대하여 세포독성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)의 활성 또는 발현량을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
개체로부터 분리된 생물학적 시료 내의 세포 외 히스톤 단백질, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 관절염(Arthritis)의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis, RA)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 활액(Synovial Fluid)을 포함하는 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 서브유닛은 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 히스톤 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Aα1, H2Bα1, cit-H2B-α1, H3α1 및 H4α1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
활액(synovial fluid) 내의 세포 외 히스톤 단백질, 세포 외 히스톤 서브유닛(subunit) 또는 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염(Arthritis)의 예방 또는 치료용 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis, RA)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 서브유닛은 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 히스톤 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Aα1, H2Bα1, cit-H2B-α1, H3α1 및 H4α1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 절편인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Bα1를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 억제제는 히스톤-유도 세포독성(Histone-Induced Cytotoxicity)을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 단계를 포함하는 관절염(Arthritis)의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법:
(a) H2A, H2B, H3 및 H4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 외 히스톤 서브유닛; 세포 외 히스톤 펩타이드 절편; 또는 이들을 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료 내 상기 세포 외 히스톤 서브유닛 또는 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계,
상기 생물학적 시료 내 상기 세포 외 히스톤 서브유닛 또는 상기 세포 외 히스톤 펩타이드의 활성 또는 발현량이 감소하는 경우, 상기 시험물질은 관절염의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
제 21 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis, RA)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 활액(Synovial Fluid)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Aα1, H2Bα1, cit-H2B-α1, H3α1 및 H4α1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 H2Bα1를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 세포 외 히스톤 펩타이드 절편은 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.