KR20230019059A - 연전초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 완화 및 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

연전초 추출물, 이의 분획물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 바이러스성 질환의 조절, 억제, 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 인간면역결핍 바이러스에 대하여 항 바이러스 효능으로 감염된 세포의 생존율 향상, HIV-1 역전사효소 (HIV-1 Reverse transcriptase)의 활성 억제, HIV-1 nucleocapsid 단백질의 cTAR destabilization 활성 억제 및 HIV-1 nucleocapsid 단백질의 dimerization 활성 억제능을 가지고 있어, 바이러스성 질환을 예방 또는 치료 효과를 가지고 있다.

Description

연전초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 완화 및 개선용 조성물 {COMPOSITION FOR TREATING AND IMPROVING VIRAL DISEASE COMPRISING GLECHOMA GRANDIS (A.Gray) KUPRIAN. EXTRACT AS AN EFFECTIVE INGREDIENT}

본 발명은 연전초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 완화 및 개선용 조성물에 관한 것이다.

연전초(Glechoma grandis (A.Gray) Kuprian.)는 다양한 약리작용이 있어 전통적으로 담석증, 요로 결석 제거, 담낭염, 황달 등의 질환의 한방치료 및 민간치료에 이용되어 온 생약소재로 알려져 있으며, 그 효능에 대한 현대적 의약 학적 응용도 주목되고 있다. 또한, 현재까지도 다양한 추출물 상태의 소재로서 음료차 및 한약조성물 등의 재료로 전통적인 방법으로 널리 이용되고 있다.

레트로비리다에 과를 포함하는 양성-단일 가닥 RNA 바이러스는 많은 인간 및 동물 질환을 유발하는 오르토레트로비리나에(Orthoretrovirinae) 아과, 및 알파레트로바이러스(Alpharetrovirus), 베타레트로바이러스 (Betaretrovirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 엡실론레트 로바이러스(Epsilonretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus) 및 스푸마바이러스(Spumavirus) 속의 것들을 포함 한다. 이들은 숙주를 감염시키면 자신의 RNA를 역전사 효소(reverse transcriptase: RT)를 사용해 상보적 DNA로 역전사하고 이러한 DNA를 숙주에 삽입(integration)한다. 이 역전사 과정은 상기 바이러스들의 복제를 위해 매우 중요한 단계이며 이러한 단계를 담당하는 역전사 효소(RT)의 활성을 저해하는 물질은 뚜렷한 항 바이러스 효능을 나타낸다. 구체적으로 알파바이러스 중에서 ALV(Avian leucosis virus), RSV(Rous sarcoma virus)는 조류백혈증 (ASL)을 일으키며, 베타바이러스 중에서 MMTV(Mouse mammary tumor virus)는 마우스 종양을 일으키며, 감마바이러스 중에서 MLV(Murane leukemia virus)는 뮤린 백혈병 및 아벨손 뮤린 백혈병을 일으키며, 델타바이러스 중에서,가축에서의 BLV(Bovine leukemia virus)는 소백혈병을 일으키며, 인간에서의 HTLV(human T-lymphotropic virus)는 골수 장애 및 백혈병을 일으키며, 렌티바이러스 중에서, 인간에서의 HIV 감염은 T 헬퍼 세포의 고갈 및 면역 기능장애를 유도하여 면역 결핍 및 기회 감염에 대한 취약성을 일으킨다.이와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2020-0131351호에서는 HIV 바이러스 감염의 예방적 또는 치유적 치료에 유용한 치료 화합물을 개시하나, HIV 감염증은 잠복 감염(latency)을 특징으로 한다. 그에 따라 약물의 평생 사용을 요구하기 때문에 장기 복용에 따른 약물 내성 및 부작용이 심각함에 따라 여전히 HIV 감염의 예방적 또는 치유적 치료에 유용한 새로운 계열의 치료제 개발의 필요가 존재한다.

따라서 부작용과 내성 등의 이슈가 완화되고 안전하게 사용될 수 있는 천연물 유래 추출물을 연구하던 중 연전초 추출물이 HIV 감염 세포에서 바이러스 감염에 의한 세포 사멸을 저해하고 바이러스 복제를 효율적으로 억제하며 Reverse transcriptase, integrase, nucleocapsid 단백질 등 HIV-1의 다양한 단백질의 활성을 저해 할 수 있는 우수한 항 바이러스 활성을 가짐을 발견하였다.

이에 본 발명자들은 전술한 바이러스성 질환 예방 또는 치료를 위한 물질에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

1. KR 10-2020-0131351A

본 발명의 일 목적은 연전초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 목적은 연전초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 연전초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 "연전초 (Glechoma grandis (A.Gray) Kuprian.)"는 꿀풀(Labiatae)과의 식물로서 우리말로는 긴병꽃풀이라 하며, 우리나라 어디에서나 자라는데 대개 물기가 많고 햇볕이 잘 드는 양지쪽에 흔한 식물로서, 활혈단, 금전초 등의 다른 이름으로도 불린다. 본 발명에서 연전초는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취된 것을 사용할 수 있다.

상기 "연전초 추출물"은 연전초를 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 추출물은 연전초를 추출 처리에 의하여 얻어지는 모든 결과물을 의미하는 것으로서, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물, 분획물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

상기 연전초 추출물은 건조 연전초 중량의 약 2 내지 50 구체적으로는, 약 10 내지 40배에 달하는 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합용매, 구체적으로 상기 저급 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 부탄올인 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매를 용출 용매로써 사용할 수 있다. 상기 용출 용매는 구체적으로는 물, 30 내지 95% 에탄올, 30 내지 90% 에탄올 또는 30 내지 80% 에탄올일 수 있으며, 가장 구체적으로는 물 또는 70% 에탄올을 사용할 수 있다.

상기 추출은 20 내지 100℃ 구체적으로 실온 또는 95℃에서, 추출 기간은 약 3-17시간 내지 1-5일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있다. 구체적으로는, 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃ 더 구체적으로는 60℃에서 감압 농축하여 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 연전초 추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 바이러스성 질환 개선, 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다. 상기 연전초 추출물은 천연, 잡종, 변종식물로부터 추출될 수 있으며, 단독으로 또는 타 약학적 활성 추출물, 분획물 또는 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예는 연전초에 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매를 넣고 추출하였다(실시예 1).

상기 연전초 추출물은 농도가 0.01 내지 100μg/ml, 구체적으로 0.15 내지 20μg/ml 일 수 있다. 상기 '유효 농도'는 세포독성이 없으면서도 본 발명이 목적하는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있는 농도를 의미한다.

또한, 상기 분획물은 연전초 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말 헥산(Normal hexane), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 및 부탄올(Butanol)으로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 바이러스성 질환의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 바이러스성 질환에 의한 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 바이러스는 알파레트로바이러스(Alpharetrovirus), 베타레트로바이러스 (Betaretrovirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 엡실론레트로바이러스(Epsilonretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus) 및 스푸마바이러스(Spumavirus) 속 바이러스중 어느 하나, 구체적으로 인간면역결핍 바이러스 (HIV) 일 수 있다. 또한, 본 발명의 추출물 또는 분획물에 의해 예방 또는 치료되는 상기 바이러스성 질환은 후천성 면역 결핍증 (AIDS), 조류백혈증 (ASL), 마우스 유방 종양 (MMTV), 소백혈병 바이러스, 인간 T 림프종, 소 백혈병, 뮤린 백혈병 및 아벨손 뮤린 백혈병 중 어느 하나, 구체적으로 후천성 면역 결핍증 (AIDS)일 수 있다. 본 발명의 연전초 추출물 또는 분획물은 인간면역결핍 바이러스에 대하여 항 바이러스 효능으로 감염된 세포의 생존율 향상 (도 1), 항 바이러스 효력(도 2, 도 3), HIV-1 역전사효소 (HIV-1 Reverse transcriptase)의 활성 억제 (도 5), HIV-1 통합효소 (HIV-1 Integrase)의 활성 억제 (도 6), HIV-1 nucleocapsid 단백질의 cTAR destabilization 활성 억제 (도 7) 및 HIV-1 nucleocapsid 단백질의 dimerization 활성 억제능 (도 8)을 가지고 있어, 이를 통해 후천성 면역 결핍증 (AIDS)의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 연전초 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는, 0.001 내지 1 중량% 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함할 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 연전초 추출물을 포함하여 한가지 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당될 수 있는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 연전초 추출물은 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 1000mg/kg으로 투여될 수 있고, 보다 구체적으로는, 30 내지 120mg/kg, 더욱 구체적으로는 50 내지 100mg/kg, 가장 구체적으로는 50 또는 100mg/kg 이 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상은 연전초 추출물, 이의 분획물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 건강기능식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다.

본 발명의 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 연전초 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 하므로 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.

본 발명의 용어, "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 또한, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.

본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 연전초 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품 (예: 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예: 스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(예: 각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예: 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 연전초 추출물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.

본 발명의 연전초 추출물을 유효성분으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 분획물이나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.

본 발명의 연전초 추출물, 이의 분획물 또는 이들의 혼합물은 인간면역결핍 바이러스에 대하여 항 바이러스 효능으로 감염된 세포의 생존율 향상, HIV-1 역전사효소 (HIV-1 Reverse transcriptase)의 활성 억제, HIV-1 인테그레이즈 (HIV-1 Integrase)바이러스 생성 억제, HIV-1 nucleocapsid 단백질의 cTAR destabilization 활성 억제 및 HIV-1 nucleocapsid 단백질의 dimerization 활성 억제능을 가지고 있어, 이를 통해 바이러스성 질환을 예방 또는 치료 효과를 가지고 있다.

도 2은 연전초 추출물의 바이러스 복제 저해 능력을 바이러스 유전자-GFP 발현 분석으로 확인한 결과이다.
도 3는 연전초 추출물의 바이러스 생성 억제능을 P24 ELISA로 확인한 결과이다.
도 4는 연전초 추출물의 세포독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 연전초 추출물의 HIV-1 Reverse transcriptase의 활성 억제능을 확인한 결과이다.
도 6은 연전초 추출물의 HIV-1 Integrase의 활성 억제능을 확인한 결과이다.
도 7는 연전초 추출물의 HIV-1 nucleocapsid 단백질의 cTAR destabilization 활성 억제능을 확인한 결과이다.
도 8는 연전초 추출물의 HIV-1 nucleocapsid 단백질의 dimerization 활성 억제능을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 연전초 추출물 제조

건조된 연전초와 중량 대비 30배에 해당하는 추출 용매를 추출 용기에 담아 상온 또는 가온 조건(95℃)에서 추출을 수행하였다. 추출이 완료된 추출물을 여과 후 여과하고 남은 연전초에 대하여 1회 더 추출을 진행하였다. 여과한 추출물을 감압회전농축기를 이용하여 농축하고, 농축된 추출물을 증류수에 녹여 -85℃에서 동결 건조를 실시하여 연전초 추출물을 얻었다.

실험예 1: 연전초 추출물 및 분획물의 항 바이러스 효력 확인

1-1. 세포배양 조건

MT4 세포(T 세포주의 일종)는 10% FBS와 1% 항생제 페니실린, 스트렙토마이신이 포함된 RPMI에서 배양되었다. 293FT세포는 10% FBS와 1% 항생제 페니실린, 스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 배양되었다. 세포들은 2일마다 계대 배양되었다.

1-2. 항 바이러스 효력 확인 실험 (CPE assay)

10⁴개 MT4 T cell에 pNL4-3 strain의 HIV-1를 0.05 MOI로 감염하고, 감염과 동시에 DMSO(음성대조군, vehicle) 및 연전초 추출물 (CH-A-HW0(열수 추출물), CH-A-RE0(70% 에탄올 침지 추출물), CH-A-RE0(30%)(30% 에탄올 침지 추출물))을 다양한 농도로 각각 처리하였다. 감염 5일 째, Cell viability를 측정하여 바이러스 감염에 의해 유도된 세포 병변 효과 (CPE:Cell cytopathic effect) 억제에 대한 각 약물의 EC50을 도출하였다. Cell viability는 CellTiter-Glo kit(Promega사)를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 연전초 추출물은 농도의존적으로 바이러스 감염에 의한 세포병변을 억제하는 것을 알 수 있었다.

1-3. 항 바이러스 효력 확인 실험 (Antiviral-GFP, P24 ELISA)

감염에 이용된 모든 바이러스는 GFP유전자를 포함하는 NL43 유래 HIV-1이다. Antiviral assay를 위해서 MT4 세포는 0.5MOI의 HIV-1로 감염하고 감염과 동시에 연전초 추출물 (CH-A-HW0(열수 추출물), CH-A-RE0(70% 에탄올 침지 추출물), CH-A-RE0(30%)(30% 에탄올 침지 추출물))이 처리되었다. 감염 3일 후에 형광현미경으로 GFP발현 관찰함으로써 바이러스의 증식 정도를 확인한 후, 바이러스 상층액을 모아서 세포 잔여물을 제거 후 P24 ELISA assay (XpressBio, XB-1000)를 진행하여 virus를 정량 분석하였다.

그 결과, 도 2 및 3에서 확인되는 바와 같이, 연전초 추출물은 농도에 따른 형광 정도가 줄어드는 것을 확인하여 바이러스 억제능이 있음을 알 수 있고 (도 2), 바이러스 정량 결과 (P24 ELISA) 또한 연전초 추출물 및 분획물은 농도에 따른 바이러스 생성 정도가 줄어드는 것을 확인하여 바이러스 억제능이 있음을 알 수 있다 (도 3).

실험예 2: 연전초 추출물 및 분획물의 세포독성 확인

10³개 293T 세포를 다양한 농도의 연전초 추출물 및 분획물 (CH-A-HW0)과 혼합하여 100μl volume으로 96 well white plate에 접종하였다. 5일 후에 Cell viability를 측정하여 추출물에 의한 세포 독성을 확인였다. Cell viability는 CellTiter-Glo kit(Promega사)를 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 4에서 확인되는 바와 같이, 연전초 추출물은 100μg/ml 수준까지 세포독성이 크지 않은 것을 확인하였다.

실험예 3: 연전초 추출물 및 분획물의 HIV-1 활성 억제능 확인

3-1. HIV-1 Reverse transcriptase의 활성 억제능 확인

역전사효소 활성 측정은 Invitrogen사의 EnzChek Reverse Transcriptase Assay Kit에서 제공하는 oligo(dT) 프라이머와 poly(A)기질을 이용하여 in vitro에서 진행되었다. 선행 테스트 실험을 통해 사용될 역전사효소 (Abcam사)의 농도는 0.5 unit으로 결정하였으며 반응 시 연전초 추출물 및 분획물 (CH-A-HW0) 이 동시에 처리되었다. 1시간 반응 후 RT 활성에 따라 합성된 oligo(dT)/poly(A)heteroduplex를 인지하는 표지자의 signal 세기로 RT 활성이 계산되었다. 대조군으로는 Etravirien을 사용하였다.

그 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이, 연전초 추출물 (CH-A-HW0(열수 추출물), CH-A-RE0(70% 에탄올 침지 추출물), CH-A-RE0(30%)(30% 에탄올 침지 추출물)) 모두 농도의존적으로 HIV-1 Reverse transcriptase의 활성 수준이 줄어드는 것을 확인하여 HIV-1 Reverse transcriptase의 활성 억제능이 있음을 알 수 있다.

3-2. HIV-1 Integrase의 활성 억제능 확인

HIV-1 Integrase의 활성 측정은 XpressBio사 에서 제공하는 HIV-1 integrase assay kit을 이용하여 진행되었다. 대조군으로는 Elvitegravir를 사용하였다.

그 결과 도 6에서 확인되는 바와 같이, 연전초 추출물 (CH-A-HW0(열수 추출물), CH-A-RE0(70% 에탄올 침지 추출물), CH-A-RE0(30%)(30% 에탄올 침지 추출물)) 모두 농도의존적으로 HIV-1 Integrase의 활성능을 저해하는 것을 확인하였고, 이를 통해 HIV-1 Integrase의 활성 억제능이 있음을 알 수 있다.

3-3. HIV-1 nucleocapsid 단백질의 cTAR destabilization 활성 억제능 확인

실험에 사용된 cTAR DNA는 55mer로서 sequence는 5’ GGTTCCTTGCTAGCCAGAGAGCTCCCG GGCTCGACCTGGTCTAACAAGAGAGACC 3’이다. cTAR DNA oligonucleotide는 5’ 및 3’ 말단에 Rhodamine6G(Fluorescence) 및 DABCYL(Quancher)로써 각각 표지 되어 합성 후 정제되었다 (Bioneer, Inc). 모든 실험은 실온에서 25mM Tris HCl (pH 7.5), 30mM NaCl 및 0.2mM MgCl₂ 를 포함하는 버퍼에서 수행되었다. 연전초 추출물의 억제 효과를 확인하기 위해 추출물 (CH-A-HW0) 과 Nucleocapsid(NC) 단백질을 10분간 선 반응하였다. 추출물과 선 반응한 NC 단백질은 10 : 1의 몰비로 이중 표지 된 cTAR DNA와 함께 배양되었다. 형광은 spectraMax fluorescence microplate reader (Molecular Device)를 이용하여 측정하였으며 exitation과 emission 파장은 각각 520 및 560nm이다.

그 결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이 연전초 추출물의 농도 의존적으로 형광수준의 감소를 확인하여, 연전초 추출물의 HIV-1 nucleocapsid 단백질의 cTAR destabilization 활성 억제능을 확인하였다.

3-4. HIV-1 nucleocapsid 단백질의 dimerization 활성 억제능 확인

Psi RNA는 in vitro transcription 방법을 이용하여 합성하였다. pcDNA/psi/EGFP 플라스미드를 BamHI 제한 효소로 절단하여 template로 이용하였다. Promega사의RiboMAX^TM Large Scale RNA Production T7 Systems을 이용하였다. 10μg DNA template, 20 μl T7 Transcription 5× buffer, 30μl each 25mM rNTP, and 10μl Enzyme Mix를 37°C에서 2시간 반응 시킨 후, RNase-free DNase를 처리해서 template DNA를 제거한다. 합성된 Psi RNA는 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)으로 extraction되었다.

상기 합성된 1μM psi RNA는 105°C에서 10분간 denaturation하고 ice에서 5분간 chilling하였다. 연전초 추출물의 dimerization 억제 효과를 확인하기 위해 추출물과 0.4μM NC 단백질을 실온에서 30분간 선 반응시켰다. denaturation된 psi RNA와 추출물과 반응한 NC단백질을 100 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250mM NaCl, 25 mM dithiothreitol, 1mM MgCl를 포함하는 버퍼에서 30분간 실온 반응 하였다. Psi RNA dimerization 분석을 위해, NC단백질과 반응한 psi RNA는 8% non-denaturing polyacrylamide gel에서 100V 속도로 40분간 러닝된 후, Molecular probes 사의 SYBR^®Green I nucleic acid gel-stain solution을 이용하여 염색하고 UV transmitter 이용하여 관찰되었다.

그 결과 도 8에서 확인되는 바와 같이, 연전초 추출물의 농도 의존적으로 nucleocapsid 단백질에 의한 psi RNA dimerization 저해를 확인(psi RNA dimer가 줄어들고 monomer가 늘어남)하여, 연전초 추출물의 HIV-1 nucleocapsid 활성 억제능을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 연전초 추출물, 이의 분획물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것인, 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 부탄올인 것인, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 30 내지 95% 에탄올로 추출되는 것인, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 연전초 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말 헥산(Normal hexane), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 및 부탄올(Butanol)으로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 중 어느 하나의 분획물인, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 인간면역결핍 바이러스 (HIV), 알파레트로바이러스(Alpharetrovirus), 베타레트로바이러스 (Betaretrovirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 엡실론레트로바이러스(Epsilonretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus) 및 스푸마바이러스(Spumavirus) 속 바이러스중 어느 하나인, 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 바이러스성 질환은 후천성 면역 결핍증 (AIDS), 조류백혈증 (ASL), 마우스 유방 종양 (MMTV), 소백혈병 바이러스, 인간 T 림프종, 소 백혈병, 뮤린 백혈병 및 아벨손 뮤린 백혈병 중 어느 하나인, 약학적 조성물.
   
8. 연전초 추출물, 이의 분획물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는, 바이러스성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   

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