KR20230017713A

KR20230017713A - Amphipathic cell penetrating peptides and the use thereof

Info

Publication number: KR20230017713A
Application number: KR1020220037451A
Authority: KR
Inventors: 오창규; 이재호; 박순익; 박정호; 박원진; 조윤주
Original assignee: (주)쎌트로이
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2023-02-06
Also published as: KR102584294B1

Abstract

A cell-penetrating peptide, according to the present invention, is a novel cell-penetrating peptide that can effectively transmit biologically active molecules into cells by passing through the cell membrane even when biologically active molecules are bound. Compared to previously known cell-penetrating peptides, the cell-penetrating peptide has a significantly superior cell-penetrating ability to transport biologically active molecules into cells, and the transported biologically active molecules can effectively maintain activity within the cell. Therefore, the cell-penetrating peptide of the present invention can be very useful in various fields such as cosmetics, diagnosis, drug delivery systems, recombinant protein vaccines, DNA/RNA therapeutics, gene and protein therapy, and the like.

Description

Amphipathic cell penetrating peptides and the use thereof {Amphipathic cell penetrating peptides and the use thereof}

본 발명은 생물학적 활성 분자를 세포 내로 전달하기 위한 세포내 전달 기술에 관한 것으로, 구체적으로는 기존의 세포 투과성 펩타이드와 비교하여 세포 투과성이 더욱 향상된 신규한 양친매성 세포 투과성 펩타이드, 및 이의 용도 등에 관한 것이다.The present invention relates to an intracellular delivery technology for delivering biologically active molecules into cells, and specifically, to novel amphiphilic cell-penetrating peptides with improved cell permeability compared to existing cell-penetrating peptides, and uses thereof. .

세포막은 특유의 불투과성으로 인해 단백질, 핵산, 펩타이드 및 난용성 화합 물질들의 세포 내로의 투과에 장벽이 되고 있다. 약물의 세포내 전달은 질병 치료 및 예방, 진단 등의 분야에서 반드시 해결되어야 하는 문제이다. 일반적으로 생물학적 활성 거대 분자들을 세포막 내로 투과시키는 방법에는, 전기충격 (electroporation), 리포좀을 이용한 막 융합, Cationic polymer인 polyethyleneimine (PEI), DEAE-덱스트란 등을 이용한 트렌스펙션 (transfection), 바이러스 핵산 감염, 단일 세포 미세주입 방법들이 있다. 또한, 최근에는 효과적인 세포내 약물 전달을 위해 나노입자 (nanoparticle)와 같은 약물 전달체의 내포작용 (endocytosis)을 응용한 기술이 활용되어 왔지만, 독성, 면역계에서의 빠른 소실로 인한 전달 효율 저하 또는 세포와의 상호 작용으로 인한 입체 장애 (steric hindrance) 등의 문제로 더 많은 연구가 필요한 실정이다. 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 최근에는 세포 투과성 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP)를 이용하려는 시도가 많이 진행되고 있다.The cell membrane is a barrier to the permeation of proteins, nucleic acids, peptides, and poorly soluble compounds into cells due to its unique impermeability. Intracellular delivery of drugs is a problem that must be solved in the fields of disease treatment and prevention, diagnosis, and the like. In general, methods for permeating biologically active macromolecules into cell membranes include electroporation, membrane fusion using liposomes, transfection using cationic polymers such as polyethyleneimine (PEI), DEAE-dextran, and viral nucleic acid infection. , there are single cell microinjection methods. In addition, recently, technologies that apply endocytosis of drug carriers such as nanoparticles have been utilized for effective intracellular drug delivery, but toxicity, reduced delivery efficiency due to rapid loss in the immune system, or cell and cell Further research is needed due to problems such as steric hindrance due to the interaction of . In order to solve this problem, many attempts have recently been made to use a cell penetrating peptide (CPP).

세포 투과성 펩타이드는 일반적으로 5 내지 30 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로서 특별한 수용체 없이 리포좀, 핵산, 단백질, 화합물 등의 생물학적 활성 분자를 세포 내로 전송하는 기능을 가지고 있다. 세포 투과성 펩타이드는 1988년 HIV (human immunodeficiency virus)의 전사 인자인 TAT가 세포 내로 전송되는 것이 확인되어 처음 알려졌으며, 이후, penetratin, VP22, MTS 등이 다양한 세포 투과성 펩타이드가 개발되고 있다. 그러나 기존의 세포 투과성 펩타이드는 전달 물질 (cargo)인 생물학적 활성 거대분자를 결합시키면, 펩타이드의 세포 투과성, 패턴, 용해도, 구조 등이 변화되어 펩타이드가 세포막을 통과하지 못하거나, 생물학적 활성 분자의 활성이 유지되지 않는 등의 문제가 있어, 실질적으로 산업화하여 이용될 수 있는 세포 투과성 펩타이드의 수는 부족한 실정이다. 따라서, 생물학적 활성 거대분자가 결합되어도 세포막을 통과하여 전달 물질을 효과적으로 세포 내로 전송할 수 있는 신규한 세포 투과성 펩타이드가 개발된다면 미용, 진단, 의료 등 다양한 분야에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 기대된다.Cell-penetrating peptides are peptides generally composed of 5 to 30 amino acids and have a function of transporting biologically active molecules such as liposomes, nucleic acids, proteins, and compounds into cells without a specific receptor. Cell-penetrating peptides were first known in 1988 when TAT, a transcription factor of HIV (human immunodeficiency virus), was confirmed to be transmitted into cells. Since then, various cell-penetrating peptides such as penetratin, VP22, and MTS have been developed. However, when conventional cell-penetrating peptides are bound to a biologically active macromolecule, which is a cargo, the cell permeability, pattern, solubility, and structure of the peptide change, so that the peptide cannot pass through the cell membrane or the activity of the biologically active molecule is reduced. Due to problems such as not being maintained, the number of cell-penetrating peptides that can be practically industrialized and used is insufficient. Therefore, if a novel cell-penetrating peptide capable of effectively transporting a substance into a cell through a cell membrane even when bound to a biologically active macromolecule is developed, it is expected to be effectively applied to various fields such as beauty, diagnosis, and medicine.

국내등록특허 10-1971021Domestic registered patent 10-1971021

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 생물학적 활성 분자가 결합되어도 세포막을 통과하여 생물학적 활성 분자를 효과적으로 세포 내로 전송할 수 있는 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.The present invention was made to solve the above problems in the prior art, and provides a novel cell-permeable peptide capable of effectively transporting biologically active molecules into cells through cell membranes even when bound to biologically active molecules, and uses thereof, etc. for that purpose

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.

본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 세포 투과성 펩타이드로서,The present invention is a cell-permeable peptide consisting of an amino acid sequence represented by the following general formula,

[일반식][general meal]

A'-KIITILI-B'A'-KIITILI-B'

상기 일반식에서, A'는 존재하지 않거나 1 내지 8개 아미노산이 연결된 것이고,In the above general formula, A' does not exist or 1 to 8 amino acids are linked,

B'는 존재하지 않거나 1 내지 15개 아미노산이 연결된 것이며,B' is absent or 1 to 15 amino acids are linked,

상기 펩타이드는 7 내지 25개 아미노산으로 이루어진 것인, 세포 투과성 펩타이드를 제공한다.The peptide provides a cell-permeable peptide consisting of 7 to 25 amino acids.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 알파-헬릭스 구조를 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the cell-penetrating peptide may have an alpha-helix structure, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 양친매성 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the cell-permeable peptide may be an amphipathic peptide, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 A'를 구성하는 1 내지 8개의 아미노산은 각각 독립적으로 라이신, 알라닌, 아이소류신, 또는 타이로신일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the 1 to 8 amino acids constituting A' may each independently be lysine, alanine, isoleucine, or tyrosine, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 B'를 구성하는 1 내지 15개의 아미노산은 각각 독립적으로 라이신, 류신, 또는 아이소류신일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the 1 to 15 amino acids constituting B' may each independently be lysine, leucine, or isoleucine, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the cell-penetrating peptide may consist of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 이에 결합된 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 운반을 매개할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the cell-penetrating peptide may mediate transport of biologically active molecules bound thereto into cells, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 뇌혈관장벽 내피세포, 암세포, 혈액세포, 표피세포, 림프구, 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, T 세포, B 세포, 자연살해세포, 대식세포, 미세아교세포, 신경세포, 신경아교세포, 성상세포, 및 근육세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the cells are blood-brain barrier endothelial cells, cancer cells, blood cells, epidermal cells, lymphocytes, immune cells, stem cells, induced pluripotent stem cells, neural stem cells, T cells, B cells, natural killer cells It may be at least one selected from the group consisting of cells, macrophages, microglia, neurons, glial cells, astrocytes, and muscle cells, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.In addition, the present invention provides a polynucleotide encoding the cell-penetrating peptide according to the present invention.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 복합체를 제공한다.In addition, the present invention provides a complex comprising the cell-penetrating peptide and the biologically active molecule according to the present invention.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 생물학적 활성 분자의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the cell-penetrating peptide may be bound to one end or both ends of the biologically active molecule, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 복합체는 1 내지 5개가 연결된 세포 투과성 펩타이드가 상기 생물학적 활성 분자의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the complex may be a cell-penetrating peptide of 1 to 5 linked to one end or both ends of the biologically active molecule, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 결합은 화학적 결합, 링커를 이용한 결합, 또는 펩타이드 결합일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the bond may be a chemical bond, a bond using a linker, or a peptide bond, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합, 카르복시-아민 결합, 에스테르 결합, 디셀레나이드 결합, 말레이미드 결합, 티오에스테르 결합, 및 티오에테르 결합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the chemical bond is a disulfide bond, a diamine bond, a sulfide-amine bond, a carboxy-amine bond, an ester bond, a diselenide bond, a maleimide bond, a thioester bond, and a thioether bond. It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome), 및 독소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the biologically active molecule is a peptide, protein, glycoprotein, nucleic acid, carbohydrate, lipid, glycolipid, compound, natural product, semi-synthetic drug, microparticle, nanoparticle, liposome, It may be at least one selected from the group consisting of viruses, quantum dots, fluorochromes, and toxins, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질은 성장인자, 효소, 핵산분해효소, 전사인자, 항원성 펩타이드, 항체, 항체 단편, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호 (signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단 (transmembrane) 단백질, 내부 (internal) 단백질, 외부 (external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 및 프리온 (prions)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the protein is a growth factor, enzyme, nuclease, transcription factor, antigenic peptide, antibody, antibody fragment, hormone, carrier protein, immunoglobulin, structural protein, motor function protein, receptor, Signaling proteins, storage proteins, membrane proteins, transmembrane proteins, internal proteins, external proteins, secreted proteins, viral proteins, protein complexes, chemically modified proteins, and prions ), but may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 핵산은 DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA (microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA (small interfering RNA; siRNA), 앱타머 (aptamer), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), 및 모폴리노 (morpholino)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the nucleic acid is DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), aptamer (aptamer), LNA (locked nucleic acid), peptide nucleic acid (PNA), and morpholino, but may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 치료 약물, 독성 화합물, 및 화학적 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the compound may be at least one selected from the group consisting of therapeutic drugs, toxic compounds, and chemical compounds, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 펩타이드 또는 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는, 생물학적 활성 분자 전달용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for delivery of a biologically active molecule comprising the cell-penetrating peptide or the complex as an active ingredient.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 복합체를 이를 필요로 하는 개체 또는 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 또는 세포 내로 생물학적 활성 분자를 전달하는 방법을 제공한다,The present invention also provides a method of delivering a biologically active molecule into a subject or cell comprising administering a complex according to the present invention to a subject or cell in need thereof,

또한, 본 발명은 생물학적 활성 분자를 세포 내로 전달하기 위한 상기 세포 투과성 펩타이드의 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides the use of the cell-penetrating peptide for delivering biologically active molecules into cells.

또한, 본 발명은 생물학적 활성 분자 전달용 약제를 제조하기 위한 상기 세포 투과성 펩타이드의 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides the use of the cell-penetrating peptide for preparing a drug for delivery of a biologically active molecule.

또한, 본 발명은 세포 투과성이 향상된 약제를 제조하기 위한 상기 세포 투과성 펩타이드의 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of the cell-permeable peptide for preparing a drug having improved cell-permeability.

본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 생물학적 활성 분자가 결합되어도 세포막을 통과하여 생물학적 활성 분자를 효과적으로 세포 내로 전송할 수 있는 신규한 세포 투과성 펩타이드로서, 기존에 알려져 있는 세포 투과성 펩타이드와 비교하여 생물학적 활성 분자를 세포 내로 운반할 수 있는 세포 투과능이 현저히 우수하고, 운반된 생물학적 활성 분자가 세포 내에서 효과적으로 활성을 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 투과성 펩타이드는 미용, 진단, 약물 전달 시스템, 재조합 단백질 백신, DNA/RNA 치료제, 유전자 및 단백질 치료법 등에 다양한 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.The cell-permeable peptide according to the present invention is a novel cell-permeable peptide capable of effectively transporting biologically active molecules into cells through cell membranes even when biologically active molecules are bound thereto. The cell permeability that can be transported into the cell is remarkably excellent, and the transported biologically active molecules can effectively maintain their activity in the cell. Therefore, the cell-permeable peptide of the present invention can be very usefully used in various fields such as beauty, diagnosis, drug delivery system, recombinant protein vaccine, DNA/RNA therapy, and gene and protein therapy.

도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신규한 양친매성 세포 투과성 펩타이드 및 대조군의 세포 투과성을 비교한 결과를 나타낸다. 도 1a는 유세포 분석을 수행한 결과를, 도 1b는 이를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 Amp.96 펩타이드의 세포 투과 효율을 인간 표피 세포를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 2a는 유세포 분석을 수행한 결과를, 도 2b는 이를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 Amp.96 펩타이드의 세포 투과 효율을 인간 신경모세포종 세포주를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 3a는 유세포 분석을 수행한 결과를, 도 3b는 이를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Amp.96 펩타이드가 실질적으로 펩타이드에 부착된 생물학적 활성 분자를 세포 내로 전달하는지 형광 현미경을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 Amp.96 펩타이드의 세포 투과능을 위한 최소 활성 서열을 확인하기 위해 다양한 후보 펩타이드들을 제작하여 인간 표피 세포에서 세포 투과 효율을 비교한 결과를 나타낸다. 도 5a는 유세포 분석을 수행한 결과를, 도 5b는 이를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 상기 후보 펩타이드들의 세포 투과 효율을 인간 신경모세포종 세포주를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 6a는 유세포 분석을 수행한 결과를, 도 6b는 이를 정량화한 결과를 나타낸다.
도 7은 상기 후보 펩타이드들의 세포 내로의 생물학적 활성 분자 전달 효과를 형광 현미경을 이용하여 비교한 결과를 나타낸다.1a and 1b show the result of comparing the cell permeability of a novel amphiphilic cell penetrating peptide according to an embodiment of the present invention and a control group. Figure 1a shows the result of performing flow cytometry, and Figure 1b shows the result of quantification.
Figures 2a and 2b show the results of confirming the cell penetration efficiency of the Amp.96 peptide according to an embodiment of the present invention using human epidermal cells. Figure 2a shows the result of performing flow cytometry, and Figure 2b shows the result of quantification thereof.
Figures 3a and 3b show the results of confirming the cell penetration efficiency of the Amp.96 peptide according to an embodiment of the present invention using a human neuroblastoma cell line. Figure 3a shows the result of performing flow cytometry, and Figure 3b shows the result of quantification thereof.
Figure 4 shows the results of confirming using a fluorescence microscope whether the Amp.96 peptide according to an embodiment of the present invention substantially delivers biologically active molecules attached to the peptide into cells.
5a and 5b show the results of comparison of cell penetration efficiency in human epidermal cells by preparing various candidate peptides to confirm the minimum active sequence for the cell penetration ability of the Amp.96 peptide. Figure 5a shows the result of performing flow cytometry, and Figure 5b shows the result of quantifying it.
6a and 6b show the result of confirming the cell penetration efficiency of the candidate peptides using a human neuroblastoma cell line. Figure 6a shows the result of performing flow cytometry, and Figure 6b shows the result of quantification.
FIG. 7 shows the result of comparing the delivery effect of biologically active molecules of the candidate peptides into cells using a fluorescence microscope.

본 발명은 생물학적 활성 분자가 결합되어도 세포막을 통과하여 생물학적 활성 분자를 효과적으로 세포 내로 전송할 수 있는 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a novel cell-penetrating peptide capable of effectively transporting a biologically active molecule into a cell through a cell membrane even when bound to the biologically active molecule, and uses thereof.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 공지된 인간 및 바이러스 단백질들을 전체적으로 스크리닝하고, 길이 및 성질 등의 특정 조건을 만족하는 펩타이드들의 세포 투과성을 확인하여 종래 알려진 세포 투과성 펩타이드에 비해 더욱 높은 세포 투과성을 갖는 신규한 펩타이드 (Amp.96)들을 선별하였다 (실시예 1).Specifically, in one embodiment of the present invention, known human and viral proteins are screened as a whole, and cell permeability of peptides satisfying specific conditions such as length and property is confirmed, resulting in higher cell permeability than previously known cell penetrating peptides A novel peptide (Amp.96) having the same was selected (Example 1).

본 발명의 다른 실시예에서는 생물학적 활성 물질이 결합된 Amp.96의 세포 투과 효율을 다양한 세포주에서 평가한 결과, Amp.96의 세포 투과 효율이 종래의 세포 투과성 펩타이드에 비해 현저하게 높은 것을 확인하였다 (실시예 2).In another embodiment of the present invention, as a result of evaluating the cell penetration efficiency of Amp.96 bound with biologically active substances in various cell lines, it was confirmed that the cell penetration efficiency of Amp.96 was significantly higher than that of conventional cell penetrating peptides ( Example 2).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 Amp.96이 생물학적 활성 분자를 실질적으로 세포 내로 전달하는지 확인한 결과, Amp.96이 다양한 세포주에서 종래의 세포 투과성 펩타이드에 비해 더욱 효과적으로 생물학적 활성 분자를 세포 내로 전달하는 것을 확인하였다 (실시예 3).In another embodiment of the present invention, as a result of confirming whether Amp.96 actually delivers biologically active molecules into cells, it was found that Amp.96 delivers biologically active molecules into cells more effectively than conventional cell-penetrating peptides in various cell lines. confirmed (Example 3).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 Amp.96이 세포 투과능을 발휘하게 하는, Amp.96 펩타이드 내의 최소 활성 부위를 확인하기 위하여, Amp.96 펩타이드의 일부가 결실된 후보군 펩타이드들을 제작한 후 이들의 세포 투과능 및 생물학적 활성 분자 전달 효능을 비교한 결과, Amp.96 내부의 7개 아미노산 서열이 Amp.96의 최소 활성 서열임을 확인하였다 (실시예 4).In another embodiment of the present invention, in order to identify the minimum active site in the Amp.96 peptide, which allows Amp.96 to exhibit cell penetrating ability, candidate peptides in which a part of the Amp.96 peptide is deleted are prepared, and then their As a result of comparing cell penetrability and biologically active molecule delivery efficiency, it was confirmed that the 7 amino acid sequence inside Amp.96 is the least active sequence of Amp.96 (Example 4).

따라서, 본 발명에 따른 신규한 세포 투과성 펩타이드는 최소 7개 아미노산만으로 구성되어 생물학적 활성 분자의 효과적인 세포 내 전달이 가능한 바, 미용, 진단, 백신, 치료 등 다양한 산업 분야에서 유용히 활용될 것으로 기대된다.Therefore, the novel cell-permeable peptide according to the present invention is composed of at least 7 amino acids and can effectively deliver biologically active molecules into cells, so it is expected to be usefully used in various industrial fields such as beauty, diagnosis, vaccine, and treatment.

이하, 본 발명에 대해 구체적으로 서술한다.Hereinafter, the present invention is specifically described.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자 (삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A (Ala), 알라닌; C (Cys), 시스테인; D (Asp), 아스파르트산; E (Glu), 글루탐산; F (Phe), 페닐알라닌; G (Gly), 글라이신; H (His), 히스티딘; I (IIe), 아이소류신; K (Lys), 라이신; L (Leu), 류신; M (Met), 메티오닌; N (Asn), 아스파라진; O (Ply), 피롤라이신; P (Pro), 프롤린; Q (Gln), 글루타민; R (Arg), 아르지닌; S (Ser), 세린; T (Thr), 트레오닌; U (Sec), 셀레노시스테인; V (Val), 발린; W (Trp), 트립토판; 및 Y (Tyr), 타이로신. As used herein, the first letter (three letter) of an amino acid refers to the following amino acids according to standard abbreviation conventions in the field of biochemistry: A (Ala), alanine; C (Cys), cysteine; D (Asp), aspartic acid; E (Glu), glutamic acid; F (Phe), phenylalanine; G (Gly), glycine; H (His), histidine; I (IIe), isoleucine; K (Lys), lysine; L (Leu), leucine; M (Met), methionine; N (Asn), asparagine; O (Ply), pyrrolysine; P (Pro), proline; Q (Gln), glutamine; R (Arg), arginine; S (Ser), serine; T (Thr), threonine; U (Sec), selenocysteine; V (Val), valine; W (Trp), tryptophan; and Y (Tyr), Tyrosine.

[일반식][general meal]

A'-KIITILI-B'A'-KIITILI-B'

본 발명에 있어서, “세포 투과성”이란, 물질이 세포 (막)를 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미한다. 본 명세서에 있어서, “세포막 (cell membrane)”이란 세포외 공간으로부터 세포 또는 세포 집단을 분리하는 지질-함유 장벽 (lipid-containing barrier)을 지칭한다. 세포막은 원형질막, 세포벽, 세포내 소기관 (organelle) 막, 예컨대 미토콘드리아막, 핵막 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, “cell permeability” means the ability or property of a substance to permeate a cell (membrane) and penetrate into the cell. As used herein, “cell membrane” refers to a lipid-containing barrier that separates a cell or cell population from the extracellular space. Cell membranes include, but are not limited to, plasma membranes, cell walls, organelle membranes such as mitochondrial membranes, nuclear membranes, and the like.

본 발명에 있어서, “펩타이드 (peptide)”란 아미노산의 중합체로서, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩타이드라 하며, 많은 아미노산이 연결되면 단백질이라 부른다. 펩타이드 또는 단백질 구조에서 아미노산 간의 연결은 아미드 (amide) 결합 또는 펩타이드 결합으로 이루어져 있다. 펩타이드 결합이란 카르복실기 (-COOH)와 아미노기(-NH₂) 사이에 물(H₂O)이 빠져나가고 -CO-NH- 형태를 이루는 결합을 지칭한다.In the present invention, a “peptide” is a polymer of amino acids, and a form in which a small number of amino acids are linked is usually called a peptide, and a form in which many amino acids are linked is called a protein. The linkage between amino acids in a peptide or protein structure is composed of an amide bond or a peptide bond. A peptide bond refers to a bond between a carboxyl group (-COOH) and an amino group (-NH ₂ ) in which water (H ₂ O) escapes and forms a -CO-NH- form.

본 발명에 있어서, “세포 투과성 펩타이드 (cell penetrating peptide, CPP)”란 세포 투과성을 갖는 펩타이드로서, in vitro 및/또는 in vivo 에서 운반 대상 (cargo)을 세포 내로 전달하는 능력을 가진 펩타이드를 의미한다. In the present invention, "cell penetrating peptide (CPP)" is a peptide having cell penetrability, and means a peptide having the ability to deliver a cargo into cells in vitro and/or in vivo . .

본 명세서에서, "운반 대상 (cargo)"은 세포 투과성 펩타이드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하며, 모든 종류의 생물학적 활성 분자가 포함될 수 있다. 상기 운반 대상은, 예를 들어 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질, 구체적으로 약물, 화장품 또는 건강 식품의 유효 물질, 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질, 보다 더 구체적으로 단백질, 핵산, 펩타이드, 미네랄, 포도당을 예로 들 수 있는 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 바이러스, 조영물질 또는 기타 화학 물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present specification, "cargo" includes all substances that can be transported into cells by binding to cell-penetrating peptides, and may include all kinds of biologically active molecules. The transport target is, for example, any substance desired to increase cell permeation efficiency, specifically an effective substance for drugs, cosmetics or health food, more specifically a substance that is not easily moved into cells through a general route, and more specifically Examples include proteins, nucleic acids, peptides, minerals, sugars such as glucose, nanoparticles, biological agents, viruses, contrast materials, or other chemical substances, but are not limited thereto.

본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 (KIITILI)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 KIITILI의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 달리 언급이 없는 한, 본 명세서 전반에 있어서 아미노산 서열은 N-으로부터 C-말단의 방향으로 기재된 것이다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 최소 활성 서열로서, 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 종래의 세포 투과성 펩타이드에 비해 우수한 세포 투과능 및 물질의 세포 내 전달능을 갖는 것을 확인하였다. The cell-penetrating peptide according to the present invention is characterized by comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (KIITILI). Preferably, the cell-penetrating peptide according to the present invention is characterized in that it consists of the amino acid sequence of KIITILI. Unless otherwise indicated, amino acid sequences throughout this specification are written in the direction from the N- to the C-terminus. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the least active sequence of the cell-permeable peptide according to the present invention, and in a specific embodiment, the present inventors found that the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has superior cell-penetrating ability compared to conventional cell-permeable peptides. And it was confirmed that it has the intracellular delivery ability of the substance.

본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 다양한 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N-말단에 다양한 아미노산 (바람직하게는, A' 펩타이드)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 C-말단에 다양한 아미노산 (바람직하게는, B' 펩타이드)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 일측 말단 또는 양측 말단에 라이신을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.The cell-permeable peptide according to the present invention may further include various amino acids at the N-terminus and/or C-terminus of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In one embodiment of the present invention, the cell-permeable peptide may further include various amino acids (preferably, A' peptide) at the N-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In another embodiment of the present invention, the cell-permeable peptide may further include various amino acids (preferably, B' peptide) at the C-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In one embodiment of the present invention, the cell-penetrating peptide may be characterized in that it contains lysine at one end or both ends.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 일반식의 A'는 존재하지 않거나 1 내지 8개 아미노산이 추가로 연결된 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 1 내지 8개 아미노산이 추가로 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 일반식의 A'는 존재하지 않거나 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 2 내지 8개, 3 내지 8개, 4 내지 8개, 5 내지 8개, 6 내지 8개, 7 내지 8개, 2 내지 7개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 또는 2 내지 3개의 아미노산이 연결된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, A' of the general formula may not exist or may be additionally linked with 1 to 8 amino acids. That is, the cell-permeable peptide according to the present invention may be one in which 1 to 8 amino acids are additionally bound to the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Preferably, A' in the above general formula does not exist or is 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 2 to 8, 3 to 8, 4 to 8, 5 to 8, 6 to 8, 7 to 8, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3 amino acids may be connected.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 일반식의 B'는 존재하지 않거나 1 내지 15개의 아미노산이 추가로 연결된 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단에 1 내지 15개 아미노산이 추가로 결합된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 일반식의 B'는 존재하지 않거나 1 내지 15개, 1 내지 14개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 2 내지 15개, 2 내지 14개, 2 내지 13개, 2 내지 12개, 2 내지 11개, 2 내지 10개, 2 내지 9개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 7개의 아미노산이 연결된 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, B' of the general formula may not exist or may be additionally linked with 1 to 15 amino acids. That is, the cell-permeable peptide according to the present invention may be one in which 1 to 15 amino acids are additionally bound to the C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Preferably, B' of the above general formula does not exist or is 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9, 1 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 2 to 15, 2 to 14, 2 to 13, 2 to 12, 2 to 11, 2 to 10, 2 to 9, 2 to 8, or 2 to 7 amino acids may be linked.

바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 전체로서 7 내지 25개 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 7 내지 25개, 7 내지 24개, 7 내지 23개, 7 내지 22개, 7 내지 21개, 7 내지 20개, 7 내지 19개, 7 내지 18개, 7 내지 17개, 7 내지 16개, 7 내지 15개, 7 내지 14개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 7 내지 11개, 7 내지 10개, 7 내지 9개, 9 내지 24개, 9 내지 22개, 9 내지 20개, 9 내지 19개, 9 내지 18개, 9 내지 17개, 9 내지 16개, 9 내지 15개, 9 내지 14개, 9 내지 13개, 9 내지 12개, 9 내지 11개, 11 내지 24개, 11 내지 22개, 11 내지 20개, 11 내지 19개, 11 내지 18개, 11 내지 17개, 11 내지 16개, 11 내지 15개, 11 내지 14개, 또는 11 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.Preferably, the cell-penetrating peptide according to the present invention may consist of 7 to 25 amino acids as a whole. That is, 7 to 25, 7 to 24, 7 to 23, 7 to 22, 7 to 21, 7 to 20, 7 to 19, 7 to 18, 7 to 17, 7 to 16, 7 to 15, 7 to 14, 7 to 13, 7 to 12, 7 to 11, 7 to 10, 7 to 9, 9 to 24, 9 to 22, 9 to 20, 9 to 19, 9 to 18, 9 to 17, 9 to 16, 9 to 15, 9 to 14, 9 to 13, 9 to 12, 9 to 11, 11 to 24, 11 to 22, 11 to 20, 11 to 19, 11 to 18, 11 to 17, 11 to 16, 11 to 15, 11 to 14, Or it may consist of 11 to 13 amino acids.

또한, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 그 일부 또는 전부가 알파-헬릭스 구조를 취하는 것일 수 있다.In addition, some or all of the cell-penetrating peptide according to the present invention may have an alpha-helix structure.

또한, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 양친매성 (amphipathic) 펩타이드일 수 있다. 본 발명에 있어서, 양친매성 펩타이드란 친수성 잔기 및 소수성 잔기를 포함하여 극성 및 비극성의 특성을 모두 보유하는 펩타이드를 의미한다. In addition, the cell penetrating peptide according to the present invention may be an amphipathic peptide. In the present invention, an amphiphilic peptide refers to a peptide having both polar and non-polar characteristics including a hydrophilic moiety and a hydrophobic moiety.

본 발명의 범위에는 상기 세포 투과성 펩타이드의 유도체 및 유사물 (mimetics, 또는 peptidomimetics)가 포함된다. 본 명세서에 있어서, “유도체 (derivative)”란, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 세포 투과성 펩타이드의 일부를 변화시켜 얻어지는 유사한 펩타이드를 총칭하며, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것, 하나 이상의 아미노산이 추가된 것, 하나 이상의 아미노산이 결실된 것, 또는 펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등)을 융합시키는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 유도체는 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드의 기능 또는 특성 (예를 들어, 세포 투과성)이 유지되거나, 증가하거나, 또는 감소될 수 있다. Derivatives and analogues (mimetics, or peptidomimetics) of the cell-penetrating peptide are included within the scope of the present invention. As used herein, “derivative” refers to a generic term for similar peptides obtained by changing a part of the cell-penetrating peptide composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, and preferably one or more amino acids are different from each other. It may be substituted with an amino acid, added with one or more amino acids, deleted with one or more amino acids, or fused with a compound that increases the half-life of the peptide (eg, polyethylene glycol, etc.). In the present invention, the derivative may maintain, increase, or decrease the function or characteristic (eg, cell permeability) of the cell-permeable peptide according to the present invention.

보다 구체적으로, 상기 유도체는 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드로서의 특성을 유지하면서 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 상기 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 (amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 보전성 또는 반-보전성 치환으로서, 지방족 측쇄를 가지는 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신이 서로에 대하여 치환될 수 있으며; 비교적 짧은 측쇄를 가지고 있는 글라이신 및 알라닌이 서로에 대하여 치환될 수 있으며; 소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 가지고 있는 발린, 류신, 및 아이소류신이 서로에 대하여 치환될 수 있으며; 방향족 측쇄를 가지는 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이 서로 치환될 수 있으며; 염기성 측쇄를 가지는 라이신, 아르지닌, 및 히스티딘이 서로 치환될 수 있으며; 산성 측쇄를 가지는 아스파테이트 및 글루타메이트가 서로 치환될 수 있으며; 황 함유 측쇄를 가지는 시스테인 및 메티오닌이 서로 치환될 수 있다.More specifically, the derivative may have one or more amino acid substitutions while maintaining properties as a cell penetrating peptide according to the present invention. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. For example, as a conservative or semi-conservative substitution, glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine having aliphatic side chains may be substituted for each other; Glycine and alanine, which have relatively short side chains, may be substituted for each other; Valine, leucine, and isoleucine, which have larger aliphatic side chains that are hydrophobic, may be substituted for each other; Phenylalanine, tyrosine, and tryptophan having aromatic side chains may be substituted for each other; Lysine, arginine, and histidine having basic side chains may be substituted for each other; Aspartate and glutamate having acidic side chains may be substituted for each other; Cysteine and methionine having sulfur-containing side chains may be substituted for each other.

따라서, 상기 일반식에서 상기 A'를 구성하는 1 내지 8개의 아미노산은 각각 독립적으로 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 글라이신, 발린, 류신, 아이소류신, 타이로신, 페닐알라닌, 또는 트립토판일 수 있고, 가장 바람직하게는 각각 독립적으로 라이신, 알라닌, 아이소류신, 또는 타이로신일 수 있다.Accordingly, 1 to 8 amino acids constituting A' in the general formula may each independently be lysine, arginine, histidine, alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, or tryptophan, and most preferably Each may independently be lysine, alanine, isoleucine, or tyrosine.

보다 바람직하게는, 상기 일반식에서 상기 A'는 존재하지 않거나 1 내지 4개 아미노산이 연결된 것이고, 상기 1 내지 4개의 아미노산은 각각 독립적으로 라이신, 알라닌, 아이소류신, 또는 타이로신이되, 상기 A'는 동일한 아미노산을 2개 이상 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, A'는 4개 아미노산으로 이루어진 것으로서 라이신, 알라닌, 아이소류신, 및 타이로신을 모두 포함하는 것; 3개 아미노산으로 이루어진 것으로서 알라닌, 아이소류신, 및 타이로신을 모두 포함하는 것; 2개 아미노산으로 이루어진 것으로서 아이로류신 및 타이로신을 포함하는 것; 또는 라이신, 알라닌, 아이소류신, 및 타이로신 중 어느 하나의 아미노산만으로 이루어진 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, A'는 KAIY, AIY, IY, 및 Y로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. More preferably, in the general formula, A' does not exist or 1 to 4 amino acids are linked, and the 1 to 4 amino acids are each independently lysine, alanine, isoleucine, or tyrosine, but A' is It may be characterized in that it does not contain two or more identical amino acids. More preferably, A' is composed of 4 amino acids and includes all of lysine, alanine, isoleucine, and tyrosine; Consisting of three amino acids, including all of alanine, isoleucine, and tyrosine; consisting of two amino acids, including airoleucine and tyrosine; Or it may consist of only any one amino acid of lysine, alanine, isoleucine, and tyrosine. Most preferably, A' may be selected from the group consisting of KAIY, AIY, IY, and Y.

또한, 상기 일반식에서 상기 B'를 구성하는 1 내지 15개의 아미노산은 각각 독립적으로 아이소류신, 발린, 류신, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 류신, 글라이신, 발린, 알라닌, 트레오닌, 타이로신, 페닐알라닌, 또는 트립토판일 수 있고, 가장 바람직하게는 각각 독립적으로 라이신, 류신, 또는 아이소류신일 수 있다.In addition, 1 to 15 amino acids constituting B' in the general formula are each independently isoleucine, valine, leucine, lysine, arginine, histidine, leucine, glycine, valine, alanine, threonine, tyrosine, phenylalanine, or tryptophanyl It may be, and most preferably each independently may be lysine, leucine, or isoleucine.

보다 바람직하게는, 상기 일반식에서 B'는 존재하지 않거나 1 내지 7개 아미노산이 연결된 것이고, 상기 1 내지 7개 아미노산은 각각 독립적으로 라이신, 류신, 또는 아이소류신이되, B'를 구성하는 전체 아미노산 대비 라이신의 비율은 50% 내지 70%, 50% 내지 65%, 50% 내지 60%, 또는 50% 내지 55% 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, B'를 구성하는 전체 아미노산 대비 류신의 비율은 20% 내지 55%, 20% 내지 50%, 20% 내지 45%, 20% 내지 40%, 또는 20% 내지 35% 일 수 있다. More preferably, B' in the general formula does not exist or 1 to 7 amino acids are linked, and the 1 to 7 amino acids are each independently lysine, leucine, or isoleucine, but all amino acids constituting B' The ratio of lysine to lysine may be 50% to 70%, 50% to 65%, 50% to 60%, or 50% to 55%. More preferably, the ratio of leucine to all amino acids constituting B' may be 20% to 55%, 20% to 50%, 20% to 45%, 20% to 40%, or 20% to 35%. .

또는, 상기 일반식에서 B'는 7개 아미노산으로 이루어진 것으로서 라이신, 류신, 및 아이소류신을 모두 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 B'는 7개 아미노산으로 이루어진 것으로서 라이신, 류신, 및 아이소류신을 모두 포함하되, 4개의 라이신을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2개의 류신을 포함하는 것일 수 있다. 또는, B'는 5개 아미노산으로 이루어진 것으로서 라이신 및 류신을 포함하되 3개의 라이신을 포함하는 것일 수 있다. 또는, B'는 2개 아미노산으로 이루어진 것으로서 라이신 및 류신을 포함하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는 B'는 KLKKLIK, KLKKLI, KLKKL, KLKK, KLK, KL, 및 K로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.Alternatively, in the general formula, B' may be composed of 7 amino acids and include all of lysine, leucine, and isoleucine, preferably, B' may be composed of 7 amino acids and include all of lysine, leucine, and isoleucine. However, it may contain 4 lysines, and more preferably may contain 2 leucines. Alternatively, B' may be composed of 5 amino acids, including lysine and leucine, but including 3 lysines. Alternatively, B' may be composed of two amino acids and include lysine and leucine. Most preferably B' may be selected from the group consisting of KLKKLIK, KLKKLI, KLKKL, KLKK, KLK, KL, and K.

바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 아미노산 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 이를 구성하는 폴리펩타이드의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 상기 폴리펩타이드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리펩타이드의 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.Preferably, the cell-permeable peptide according to the present invention comprises any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12, or more preferably any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12 It may consist of, but is not limited thereto, and variants of the amino acid sequence are included within the scope of the present invention. That is, the cell-penetrating peptide according to the present invention is a functional equivalent of the polypeptide constituting it, for example, although some amino acid sequences of the polypeptide have been modified by deletion, substitution or insertion, It is a concept including variants capable of functionally the same action as the polypeptide. For example, the cell-permeable peptide according to the present invention is 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, most of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12 Preferably, it may include an amino acid sequence having 95% or more sequence homology. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence homology It includes a polypeptide having. The “percentage of sequence homology” for a polypeptide is determined by comparing two optimally aligned sequences with a region of comparison, wherein a portion of the sequence of the polypeptide in the region of comparison is a reference sequence (additional or may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to not including deletions).

본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 그 자체가 세포 투과능이 있어, 상기 펩타이드에 결합된 임의의 물질을 세포 내로 효과적으로 유입시킬 수 있는 전달체로 활용될 수 있다.The cell-penetrating peptide according to the present invention itself has cell-penetrating ability, so it can be used as a delivery system that can effectively introduce any substance bound to the peptide into cells.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 구체적인 종류에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 뇌혈관장벽 내피세포, 암세포, 혈액세포, 표피세포, 림프구, 면역세포, 줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포, T 세포, B 세포, 자연살해세포, 대식세포, 미세아교세포, 신경세포, 신경아교세포, 성상세포, 및 근육세포 등으로부터 선택될 수 있다.In the present invention, the cell is not limited to a specific type, but for example, blood-brain barrier endothelial cells, cancer cells, blood cells, epidermal cells, lymphocytes, immune cells, stem cells, induced pluripotent stem cells, neural stem cells, T cells, B cells, natural killer cells, macrophages, microglia, neurons, glial cells, astrocytes, and muscle cells.

본 발명에 있어서 상기 “암 (cancer)”은 포유동물에서 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 생리적 상태를 의미하거나 그러한 생리적 상태를 설명하는 것으로 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하는 악성 종양을 제한 없이 포함할 수 있다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 암의 보다 구체적인 예로는 유방암, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 폐암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 간암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 전립선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장골반암, 혈액암, 뇌암, 중추신경계 종양, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 신경모세포종, 및 뇌하수체 선종 등이 있다.In the present invention, the "cancer" means or describes a physiological state characterized by unregulated cell growth in mammals, which rapidly grows while infiltrating surrounding tissues and spreads to various parts of the body. It may include, without limitation, a malignant tumor that has become or metastasized and is life-threatening. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancy. More specific examples of cancer include breast cancer, chronic myelogenous leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head cancer, head and neck cancer, melanoma, cervical cancer, ovarian cancer Cancer, colorectal cancer, small intestine cancer, rectal cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial cancer, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, Hodgkin's disease, esophageal cancer, liver cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine cancer , prostate cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, lymphocytic lymphoma, kidney cancer, ureteral cancer, renal pelvic cancer, hematological cancer, brain cancer, central nervous system tumor, spinal cord tumor, brainstem glioma, neuroblastoma, and pituitary gland There are adenomas, etc.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. In addition, the present invention provides a polynucleotide encoding the cell-penetrating peptide according to the present invention and a recombinant vector containing the polynucleotide.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 내지 37로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 상기 어느 하나의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기 서열은 본 발명의 바람직한 일 구현예에 지나지 않으며, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 전사 및 번역의 과정을 거쳐 결과적으로 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드를 생성할 수 있는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다.In the present invention, the polynucleotide may include or consist of any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14 to 37, but is not limited thereto. That is, the above sequence is only one preferred embodiment of the present invention, and the polynucleotide according to the present invention can be included without limitation as long as it can produce the cell-permeable peptide according to the present invention as a result through the process of transcription and translation. .

본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성 (degeneracy) 또는 중복성 (redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩티드를 인코딩한다. In the present invention, the polynucleotide may be in the form of RNA or DNA, and the DNA includes cDNA and synthetic DNA. DNA can be single-stranded or double-stranded. If single-stranded, it may be the coding strand or the non-coding (antisense) strand, wherein the coding sequence encodes the same polypeptide as a result of degeneracy or redundancy of the genetic code.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 상기에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립 (allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 코딩 (암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대 (alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.The polynucleotides of the present invention may also include variants of the polynucleotides described above, which variants of the polynucleotides are naturally occurring allelic variants of the polynucleotide or non-naturally occurring variants of the polynucleotide. can be An allelic variant is an alternating form of a polynucleotide sequence that may have a substitution, deletion, or addition of one or more nucleotides that does not substantially alter the function of the polynucleotide being encoded (encoding). It is well known in the art that a single amino acid can be encoded by more than one nucleotide codon and that the polynucleotide can be readily modified to produce alternating polynucleotides encoding the same peptide.

예를 들어, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 내지 37로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.For example, the polynucleotide according to the present invention is 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, most preferably, any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14 to 37 Preferably, it may include nucleic acid sequences having 95% or more sequence homology. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence homology It includes a polynucleotide having.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 복합체를 제공한다. In addition, the present invention provides a complex comprising the cell-penetrating peptide and the biologically active molecule according to the present invention.

또한, 본 발명은 생물학적 활성 분자에 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드를 부착 (결합)시키는 단계를 포함하는, 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a biologically active molecule having cell permeability, comprising the step of attaching (binding) the cell permeable peptide according to the present invention to the biologically active molecule.

본 명세서에 있어서, “생물학적 활성 분자”란 바람직하게는 생물학적 또는 약학적 활성을 가지는 물질들을 총칭하며, 이는 세포 내(세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서도 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 이러한 생물학적 활성 분자는 용어 “거대분자”와 호환적으로 사용될 수 있다. In the present specification, "biologically active molecules" preferably collectively refer to substances having biological or pharmacological activity, which penetrate into cells (cytoplasm or nucleus) to be involved in physiological activity regulation or to express pharmacological effects. It means a substance that has biological activity in various parts of the body such as cells, tissues, interstitial cells, blood, etc. that are present or transported to act. Such biologically active molecules may be used interchangeably with the term "macromolecule".

상기 생물학적 활성 분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome), 독소, 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The biologically active molecules are peptides, proteins, glycoproteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, glycolipids, compounds, natural products, semi-synthetic drugs, microparticles, nanoparticles, liposomes, viruses, quantum dots, fluorescence It may be selected from the group consisting of a fluorochrome, a toxin, and a complex thereof.

상기 단백질의 비-제한적인 예시에는 성장인자, 효소, 핵산분해효소, 전사인자, 항원성 펩타이드, 항체 (예컨대, 단일클론, 키메라 (chimeric), 인간화 (humanized) 항체 등), 항체 단편, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호 (signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단 (transmembrane) 단백질, 내부 (internal) 단백질, 외부 (external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 및 프리온 (prions) 등이 포함된다. 상기 핵산분해효소에는 CAS9 (CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS variants, Cfp1 (CxxCfinger protein-1), ZEN (Zinc-finger nucleases), 및 TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) 등이 포함된다.Non-limiting examples of the protein include growth factors, enzymes, nucleases, transcription factors, antigenic peptides, antibodies (eg, monoclonal, chimeric, humanized antibodies, etc.), antibody fragments, hormones, Transport proteins, immunoglobulins, structural proteins, motor function proteins, receptors, signaling proteins, storage proteins, membrane proteins, transmembrane proteins, internal proteins, external proteins, secreted proteins, viruses Included are proteins, protein complexes, chemically modified proteins, and prions, and the like. The nucleases include CAS9 (CRISPR associated protein 9), CAS12, CAS13, CAS14, CAS variants, Cfp1 (CxxCfinger protein-1), ZEN (zinc-finger nucleases), and TALEN (Transcription activator-like effector nuclease). included

상기 핵산의 비-제한적인 예시에는 DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA (microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA (small interfering RNA; siRNA), 앱타머 (aptamer), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), 및 모폴리노 (morpholino) 등이 포함된다. Non-limiting examples of the nucleic acid include DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), aptamer, LNA (locked nucleic acid) , PNA (peptide nucleic acid), and morpholino, and the like.

상기 화합물의 비-제한적인 예시에는 치료 약물, 독성 화합물, 및 화학적 화합물 등이 포함된다. 상기 "약물"은 질병, 상처 또는 특정 증상을 완화, 예방, 치료 또는 진단하기 위한 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 전달체로 사용될 수 있다.Non-limiting examples of such compounds include therapeutic drugs, toxic compounds, chemical compounds, and the like. The "drug" is a broad concept that includes substances for alleviating, preventing, treating, or diagnosing a disease, injury, or specific symptom. That is, the cell-penetrating peptide according to the present invention can be used as a drug delivery system for preventing or treating diseases.

이 밖에도, 본 발명의 생물학적 활성 분자에는 콜레스테롤, 화학요법제 (chemotherapeutics), 비타민, 보조인자 (co-factors), 2,5-A 키메라 (chimeras), 알로자임 (allozymes), 앱타머 (aptamers), 폴리아민 (polyamines), 폴리아미드 (polyamides), 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에테르와 같은 중합체의 약물동태학 (pharmacokinetics) 및/또는 약동학 (pharmacodynamics)을 조절할 수 있는 분자 등이 포함될 수 있다. In addition, the biologically active molecules of the present invention include cholesterol, chemotherapeutics, vitamins, co-factors, 2,5-A chimeras, allozymes, aptamers, , molecules capable of modulating the pharmacokinetics and/or pharmacodynamics of polymers such as polyamines, polyamides, polyethylene glycols, and polyethers.

본 발명에 따른 복합체는 펩타이드와 물질이 단순히 혼합 (mixing)된 것, 펩타이드와 물질이 혼합되어 형성된 것, 또는 이들이 화학적 결합 등에 의해 연결되거나 컨쥬게이션되어 생성된 것을 모두 포함한다. 또한, 복합체는 물리적 결합, 화학적 결합, 공유 결합, 비공유 결합, 펩타이드 결합, 또는 자기조립화로 연결되거나, 매개체 (예를 들어, 링커)를 이용하여 통합된 또는 융합된 형태로 연결될 수 있다.Complexes according to the present invention include those formed by simply mixing a peptide and a substance, those formed by mixing a peptide and a substance, or those formed by linking or conjugating these by chemical bonds or the like. In addition, the complex may be connected by physical bond, chemical bond, covalent bond, non-covalent bond, peptide bond, or self-assembly, or may be connected in an integrated or fused form using a mediator (eg, linker).

바람직하게는, 상기 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합, 카르복시-아민 결합, 에스테르 결합, 디셀레나이드 결합, 말레이미드 결합, 티오에스테르 결합, 및 티오에테르 결합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Preferably, the chemical bond is selected from the group consisting of a disulfide bond, a diamine bond, a sulfide-amine bond, a carboxy-amine bond, an ester bond, a diselenide bond, a maleimide bond, a thioester bond, and a thioether bond. may, but is not limited thereto.

또한, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 상기 생물학적 활성 분자의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합될 수 있다. 또한, 상기 복합체는 단일 또는 복수개의 세포 투과성 펩타이드가 상기 생물학적 활성 분자의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합된 것일 수 있다. 즉, 상기 복합체는 1 내지 5개, 1 내지 4개, 2 내지 3개, 1 내지 2개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개, 3 내지 5개, 또는 3 내지 4개의 세포 투과성 펩타이드가 서로 연결되어 상기 생물학적 활성 분자의 일측 말단 또는 양측 말단에 결합될 수 있다.In addition, the cell-penetrating peptide according to the present invention may be bound to one end or both ends of the biologically active molecule. In addition, the complex may be a single or a plurality of cell-penetrating peptides bound to one end or both ends of the biologically active molecule. That is, the complex is 1 to 5, 1 to 4, 2 to 3, 1 to 2, 2 to 5, 2 to 4, 2 to 3, 3 to 5, or 3 to 4 Cell penetrating peptides may be linked to one end or both ends of the biologically active molecule.

상기 복합체는 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 서로 융합 (fusion)된 상태로 발현되어 생성된 복합체일 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 내에 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질을 발현하는 유전자를 삽입한 후, 상기 벡터로 생물을 형질전환시켜 벡터에 삽입된 유전자를 발현하도록 하면, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질이 융합 단백질 (fusion protein)로서 발현될 수 있다. 융합 단백질로 발현될 때, 상기 펩타이드와 생물학적 활성 물질 간에 임의의 링커가 포함되도록 할 수 있다.The complex may be a complex produced by expressing the peptide and the biologically active material in a fused state. For example, when a gene expressing the peptide and a biologically active substance is inserted into one vector, and then an organism is transformed with the vector to express the gene inserted into the vector, the peptide and the biologically active substance form a fusion protein (fusion protein). When expressed as a fusion protein, an optional linker may be incorporated between the peptide and the biologically active substance.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는, 생물학적 활성 분자 전달용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물, 및/또는 사료 조성물을 포함한다. In addition, the present invention provides a composition for delivery of biologically active molecules comprising the complex according to the present invention as an active ingredient. The composition includes a pharmaceutical composition, food composition, health functional food composition, cosmetic composition, and / or feed composition.

본 발명에 따른 조성물은 상기 세포 투과성 펩타이드의 약학적으로, 식품학적으로, 또는 수의학적으로 허용 가능한 염 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 복합체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 투과성 펩타이드의 범위에는 약학적/식품학적/수의학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 이성질체, 수화물 및 용매화물이 모두 포함될 수 있다.The composition according to the present invention may contain, as an active ingredient, a complex comprising a pharmaceutically, food-wise, or veterinarily-acceptable salt of the cell-penetrating peptide and a biologically active molecule. That is, the scope of the cell-penetrating peptide of the present invention may include all isomers, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods as well as pharmaceutically/food/veterinarily acceptable salts.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.Examples of suitable acids are hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, gluconic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like. Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving a compound in an aqueous solution of excess acid and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. It can also be prepared by heating equimolar amounts of the compound and an acid or alcohol in water and then evaporating the mixture to dryness, or suction filtering the precipitated salt.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.Salts derived from suitable bases may include, but are not limited to, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium. An alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. At this time, as the metal salt, it is particularly suitable for pharmaceutical purposes to prepare a sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).

본 발명의 펩타이드의 범위에는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 이성질체, 수화물 및 용매화물이 모두 포함될 수 있다.The scope of the peptide of the present invention may include not only pharmaceutically acceptable salts, but also all isomers, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods.

본 발명의 조성물 내의 상기 펩타이드 또는 상기 복합체의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.The content of the peptide or the complex in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight, or 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition. It may be % by weight, but is not limited thereto. The content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. The excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a moisturizer, a film-coating material, and a controlled release additive.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다. The pharmaceutical compositions according to the present invention are powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, solutions, eye drops, elsilic agents, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese, respectively, according to conventional methods. , tablets, sustained-release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusate, It can be formulated and used in the form of an external agent such as a warning agent, lotion, pasta agent, spray, inhalant, patch, sterile injection solution, or aerosol, and the external agent is a cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent , lotion, liniment, pasta, or cataplasma may have formulations such as the like.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal insertion, vaginal It can be administered by intraoral insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.The pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, weight and severity of the disease of the patient.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.In the present invention, "individual" means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, etc. of mammals.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.In the present invention, "administration" means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, “prevention” refers to any action that suppresses or delays the onset of a desired disease, and “treatment” means that the desired disease and its resulting metabolic abnormality are improved or improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. All actions that are advantageously altered are meant, and "improvement" means any action that reduces a parameter related to a target disease, for example, the severity of a symptom, by administration of the composition according to the present invention.

본 발명의 복합체를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 복합체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 복합체는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.When the complex of the present invention is used as a food additive, the complex may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The mixing amount of active ingredients may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, when preparing food or beverage, the composite of the present invention may be added in an amount of 15% by weight or less, or 10% by weight or less based on the raw material. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount greater than the above range.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the type of food. Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice creams, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in a conventional sense.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 미스트, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 핸드로션, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 클렌징오일, 클렌징밤, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.The formulation of the cosmetic composition according to the present invention is skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutrient lotion, massage cream, nutrient cream, mist, moisture cream, hand cream, hand lotion, foundation, It may be in the form of essence, nutritional essence, pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, cleansing oil, cleansing balm, body lotion, or body cleanser.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may further include a composition selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, high-molecular peptides, high-molecular polysaccharides, and sphingolipids.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 신규한 양친매성 세포 투과성 펩타이드의 선별Example 1. Screening of Novel Amphiphilic Cell Penetrating Peptides

신규한 양친매성 세포 투과성 펩타이드 (amphipathic cell penetrating peptides; CPP)를 선별하기 위하여, UniProt에 등록되어 있는 인간 (homo sapiens) 및 바이러스 (virus) 단백질들을 모두 검색하였으며, 총 494,889개의 단백질 서열을 획득하였다. 획득된 단백질 서열들을 길이 (window size)가 18mer가 되도록 추출하고, 획득된 18mer의 펩타이드 중에서 알파-헬릭스 (alpha helix) 구조를 가지는 펩타이드들을 1차적으로 선별하였다. 이후 1차 선별된 펩타이드 서열들을 C3pred 프로그램 (iGEM Tuebingen)을 이용하여 세포 투과 활성을 측정하였으며, 상위 1,000개의 펩타이드를 2차 선별하였다. 2차 선별된 1,000개의 펩타이드는 Helixvis (HELIQUEST server)를 이용하여 Helical Wheel Projection으로 나타내었으며, 양친매성을 갖는 펩타이드 서열 15개를 선별하였다.In order to select novel amphipathic cell penetrating peptides (CPPs), all human (homo sapiens) and virus proteins registered in UniProt were searched, and a total of 494,889 protein sequences were obtained. The obtained protein sequences were extracted so that the length (window size) was 18mer, and among the obtained 18mer peptides, peptides having an alpha-helix structure were primarily selected. Thereafter, the cell permeation activity of the firstly selected peptide sequences was measured using the C3pred program (iGEM Tuebingen), and the top 1,000 peptides were secondarily selected. The secondly selected 1,000 peptides were displayed by Helical Wheel Projection using Helixvis (HELIQUEST server), and 15 peptide sequences having amphiphilicity were selected.

선별된 15개의 펩타이드 서열을 기초로 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드의 합성은 일반적으로 알려진 Fmoc SPPS (Solid Phase Peptide Synthesis) 방법을 이용하여 C 말단부터 하나씩 커플링 (coupling)하여 제작하였다. 그리고 펩타이드에 생물학적 활성 분자 중 하나인 FITC (Fluorescein isothiocyanate, iSpyBio)를 결합시키기 위하여, 펩타이드 합성 과정 중에서 마지막으로 라이신 (K, Lysine)을 추가하고, 라이신의 free-amine 잔기에 FITC를 결합시켰다. FITC가 결합된 펩타이드들은 HPLC를 이용하여 정제하고, 질량분석기를 이용하여 펩타이드들의 분자량을 확인한 후 동결건조하여 사용 전까지 냉동보관하였다.Peptides were synthesized based on the selected 15 peptide sequences. The synthesis of peptides was prepared by coupling one by one from the C-terminus using the generally known Fmoc SPPS (Solid Phase Peptide Synthesis) method. In addition, in order to bind FITC (Fluorescein isothiocyanate, iSpyBio), one of the biologically active molecules, to the peptide, lysine (K, Lysine) was added last during the peptide synthesis process, and FITC was bound to the free-amine residue of lysine. The FITC-conjugated peptides were purified using HPLC, and the molecular weight of the peptides was confirmed using a mass spectrometer, and then lyophilized and stored frozen until use.

제작된 15개 펩타이드들의 세포 투과성을 직접적으로 확인하기 위하여, 펩타이드들을 0.125, 0.25, 0.5, 및 1μM의 농도로 각각 준비하고, 인간 표피 세포주인 HaCAT 세포주에 각각의 펩타이드들을 처리하였다. 보다 자세하게는, 24-웰 플레이트에 HaCAT 세포를 1 X 10⁷ cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 24 시간 동안 배양한 후에, 각각의 펩타이드들을 처리하고 다시 한 시간 동안 배양하였다. 대조 군으로는 FITC가 결합된 TAT을 이용하였다. 배양이 종결된 후에는 0.25% 트립신을 이용하여 세포를 멸균 튜브로 옮겨 담고, 원심분리하여 배지를 제거하였다. 그리고 D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) 500μL를 이용하여 2회 세척하여 배지를 완전히 제거하고, 최종적으로 400μL의 D-PBS를 이용하여 재부유시킨 후 유세포 분석기 (Flow cytometry, FACS machine, BD science FACSCanto II)를 이용하여 세포내 형광을 측정하였다. 그 결과는 도 1a 및 1b에 나타내었다.In order to directly confirm the cell permeability of the prepared 15 peptides, the peptides were prepared at concentrations of 0.125, 0.25, 0.5, and 1 μM, respectively, and the HaCAT cell line, a human epidermal cell line, was treated with each peptide. More specifically, HaCAT cells were dispensed to 1 X 10 ⁷ cells/well in a 24-well plate, and DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) was maintained at 37°C and 5% CO ₂ conditions. After incubation for 24 hours, each peptide was treated and incubated for another hour. As a control group, FITC-conjugated TAT was used. After the culture was terminated, the cells were transferred to a sterile tube using 0.25% trypsin, and the medium was removed by centrifugation. Then, the medium was completely removed by washing twice with 500 μL of D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline), and finally resuspended using 400 μL of D-PBS, followed by flow cytometry (FACS machine, BD science). Intracellular fluorescence was measured using FACSCanto II). The results are shown in Figures 1a and 1b.

도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, 제작된 15개의 펩타이드들 중에서 Amp.96 펩타이드가 대조군인 TAT과 비교하여 증가된 세포 투과성을 나타내는 것을 확인하였다. 보다 자세하게는, Amp.96 펩타이드를 가장 저농도인 0.125μM로 처리한 경우에도 TAT과 비교하여 2배 이상 증가된 세포 투과성을 나타내었으며, 1μM에서는 TAT에 비해 약 20배 정도 증가된 세포 투과성을 나타내는 것을 확인하였다.As shown in Figures 1a and 1b, it was confirmed that among the 15 peptides prepared, the Amp.96 peptide showed increased cell permeability compared to the control, TAT. More specifically, even when the Amp.96 peptide was treated at the lowest concentration of 0.125 μM, cell permeability was increased by more than 2 times compared to TAT, and at 1 μM, cell permeability was increased by about 20 times compared to TAT. Confirmed.

실시예 2. A96 펩타이드의 세포 투과 효율 평가Example 2. Evaluation of cell penetration efficiency of A96 peptide

2-1. 인간 표피 세포를 이용한 세포 투과 효율 평가2-1. Evaluation of cell permeation efficiency using human epidermal cells

실시예 1에서 선별된 Amp.96 펩타이드의 세포 투과 효율을 평가하기 위하여, 인간 표피 세포를 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 24-웰 플레이트에 인간 표피 세포주인 HaCAT 세포를 1 × 10⁷ cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그리고 FITC가 결합된 Amp.96 펩타이드와 FITC가 결합된 TAT을 각각 4μM 처리한 후에 한 시간 동안 배양하였다. 배양이 종결된 후에는 0.25% 트립신을 이용하여 세포를 멸균 튜브로 옮겨 담고, 원심분리하여 배지를 제거하였다. 그리고 D-PBS 500μL를 이용하여 2회 세척하여 배지를 완전히 제거하고, 최종적으로 400μL의 D-PBS를 이용하여 재부유시킨 후 유세포 분석기 (FACSCanto II)를 이용하여 세포내 형광을 측정하였다. 그 결과는 도 2a 및 2b에 나타내었다.In order to evaluate the cell penetration efficiency of the Amp.96 peptide selected in Example 1, experiments were conducted using human epidermal cells. More specifically, HaCAT cells, a human epidermal cell line, were dispensed to 1 × 10 ⁷ cells/well in a 24-well plate, and cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum at 37°C and 5% CO ₂ for 24 hours. cultured for a while. Then, FITC-coupled Amp.96 peptide and FITC-coupled TAT were treated with 4 μM each, followed by incubation for one hour. After the culture was terminated, the cells were transferred to a sterile tube using 0.25% trypsin, and the medium was removed by centrifugation. Then, the medium was completely removed by washing twice with 500 μL of D-PBS, and finally resuspended with 400 μL of D-PBS, and intracellular fluorescence was measured using a flow cytometer (FACSCanto II). The results are shown in Figures 2a and 2b.

도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, Amp.96 펩타이드는 인간 표피 세포에서 기존에 알려진 세포 투과성 펩타이드인 TAT과 비교하여 63배 이상 증가된 세포 투과성을 갖는 것으로 확인되었다.As shown in Figures 2a and 2b, it was confirmed that the Amp.96 peptide has cell permeability increased 63 times or more in human epidermal cells compared to TAT, a previously known cell penetrating peptide.

2-2. 인간 신경모세포종 세포주를 이용한 세포 투과 효율 평가2-2. Evaluation of cell permeation efficiency using human neuroblastoma cell lines

실시예 1에서 선별된 Amp.96 펩타이드의 세포 투과 효율을 평가하기 위하여, 인간 신경모세포종 (neuroblastoma)을 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 24-웰 플레이트에 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y 세포를 1 × 10⁷ cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그리고 FITC가 결합된 Amp.96 펩타이드와 FITC가 결합된 TAT을 각각 4μM 처리한 후에 한 시간 동안 배양하였다. 배양이 종결된 후에는 0.25% 트립신을 이용하여 세포를 멸균 튜브로 옮겨 담고, 원심분리하여 배지를 제거하였다. 그리고 D-PBS 500μL를 이용하여 2회 세척하여 배지를 완전히 제거하고, 최종적으로 400μL의 D-PBS를 이용하여 재부유시킨 후 유세포 분석기 (FACSCanto II)를 이용하여 세포내 형광을 측정하였다. 그 결과는 도 3a 및 3b에 나타내었다.In order to evaluate the cell penetration efficiency of the Amp.96 peptide selected in Example 1, experiments were conducted using human neuroblastoma. More specifically, SH-SY5Y cells, a human neuroblastoma cell line, were dispensed to 1 × 10 ⁷ cells/well in a 24-well plate, and 10% fetal bovine serum was added to DMEM medium at 37° C. and 5% CO ₂ conditions. incubated for 24 hours. Then, FITC-coupled Amp.96 peptide and FITC-coupled TAT were treated with 4 μM each, followed by incubation for one hour. After the culture was terminated, the cells were transferred to a sterile tube using 0.25% trypsin, and the medium was removed by centrifugation. Then, the medium was completely removed by washing twice with 500 μL of D-PBS, and finally resuspended with 400 μL of D-PBS, and intracellular fluorescence was measured using a flow cytometer (FACSCanto II). The results are shown in Figures 3a and 3b.

도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, Amp.96 펩타이드는 TAT과 비교하여 40배 이상 증가된 세포 투과성을 나타내는 것을 확인하였다.As shown in FIGS. 3a and 3b , it was confirmed that the Amp.96 peptide exhibited 40-fold or more increased cell permeability compared to TAT.

상기 결과들을 통하여, Amp.96 펩타이드는 생물학적 활성 분자가 결합된 상태에서도 다양한 세포 종에서 기존의 세포 투과성 펩타이드에 비해 현저히 높은 세포 투과성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.Through the above results, it was confirmed that the Amp.96 peptide exhibits significantly higher cell permeability compared to conventional cell penetrating peptides in various cell types even in the state in which biologically active molecules are bound thereto.

실시예 3. A96 펩타이드의 세포 내로의 생물학적 활성 분자 전달 효과 확인Example 3. Confirmation of the delivery effect of biologically active molecules of the A96 peptide into cells

실시예 1에서 선별된 Amp.96 펩타이드가 실질적으로 생물학적 활성 분자를 세포 내로 전달하는지 확인하기 위하여, 형광 현미경을 이용하여 생물학적 활성 분자의 위치를 확인하였다. 보다 자세하게는, 24-웰 플레이트에 현미경용 원형 커버글라스 (Microscope Cover Glasses, 12mm Φ)를 깔고 HaCAT 세포 또는 SH-SY5Y 세포를 5 × 10⁴ cells/well이 되도록 분주하고, 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 18시간 동안 배양하여 커버 글라스에 세포가 부착되도록 하였다. 이후 배지를 제거하고, 500μL의 D-PBS 및 Amp.96 펩타이드가 4μM의 농도로 첨가된 DMEM 300μL를 세포에 첨가한 뒤, 한 시간 동안 배양하였다. 배양이 종결된 후에는 세포 외부의 단백질을 제거하기 위하여 1mL의 D-PBS를 이용하여 3회 세척하였다. 세척된 세포는 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)를 이용하여 고정시키고, 다시 1mL의 D-PBS를 이용하여 1회 세척하였다. 그리고 고정시킨 세포는 Mounting medium with DAPI Aqueous (Fluoroshield; abcam)를 이용하여 마운팅한 후에 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.In order to confirm whether the Amp.96 peptide selected in Example 1 substantially delivers biologically active molecules into cells, the location of the biologically active molecules was confirmed using a fluorescence microscope. More specifically, a circular cover glass for a microscope (Microscope Cover Glasses, 12mm Φ) was laid on a 24-well plate, and HaCAT cells or SH-SY5Y cells were dispensed to be 5 × 10 ⁴ cells/well, and 10% fetal bovine serum was added. The cells were adhered to the cover glass by culturing for 18 hours at 37° C. and 5% CO ₂ in the added DMEM medium. Then, the medium was removed, and 500 μL of D-PBS and 300 μL of DMEM supplemented with Amp.96 peptide at a concentration of 4 μM were added to the cells, followed by incubation for one hour. After the culture was terminated, the cells were washed three times with 1 mL of D-PBS to remove extracellular proteins. The washed cells were fixed using 4% paraformaldehyde and washed once again using 1 mL of D-PBS. And the fixed cells were observed using a fluorescence microscope after mounting using Mounting medium with DAPI Aqueous (Fluoroshield; abcam). The results are shown in FIG. 4 .

도 4에 나타난 바와 같이, Amp.96 (A96) 펩타이드는 인간 표피 세포와 인간 신경모세포종 세포에서 세포막을 효과적으로 통과하여 세포 내로 펩타이드에 결합된 생물학적 분자를 효과적으로 전달하였으며, 이와 같은 A96 펩타이드의 생물학적 분자 전달 효과는 종래의 세포 투과성 펩타이드 (TAT)보다 뛰어난 것으로 나타난다.As shown in FIG. 4, the Amp.96 (A96) peptide effectively passed through the cell membrane in human epidermal cells and human neuroblastoma cells and effectively delivered the biological molecules bound to the peptide into the cells, and the biological molecule delivery of the A96 peptide The effect appears to be superior to conventional cell penetrating peptide (TAT).

실시예 4. A96 펩타이드의 세포 투과능을 위한 최소 활성 서열의 확인Example 4. Identification of the minimum active sequence for the cell penetrating ability of the A96 peptide

Amp.96 펩타이드가 세포 투과능을 발휘하게 하는, Amp.96 펩타이드 내의 최소 활성 서열을 확인하기 위하여, Amp.96 펩타이드의 일부가 결실된 후보군 펩타이드 8종을 합성하였다. 펩타이드 합성은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 합성된 8종의 펩타이드 후보군의 서열은 아래 표 1에 나타냈다. 하기 최소 활성 서열 후보군 중 Amp.96-1, 2, 3, 4, 및 10은 Amp.96 펩타이드와 비교하여 일부 N-말단 아미노산이 결실된 것이다. 또한, 하기 서열 후보군 중 Amp.96-5, 6, 및 8은 Amp.96 펩타이드와 비교하여 일부 C-말단 아미노산이 결실된 것이다.In order to confirm the minimum active sequence in the Amp.96 peptide, which allows the Amp.96 peptide to exhibit cell penetrating ability, 8 candidate peptides in which a part of the Amp.96 peptide was deleted were synthesized. Peptide synthesis was performed in the same manner as in Example 1, and the sequences of 8 synthesized peptide candidates are shown in Table 1 below. Among the minimally active sequence candidates below, Amp.96-1, 2, 3, 4, and 10 have some N-terminal amino acids deleted compared to the Amp.96 peptide. In addition, among the sequence candidates below, Amp.96-5, 6, and 8 have some C-terminal amino acids deleted compared to the Amp.96 peptide.

세포 투과성 펩타이드cell penetrating peptide 서열order 서열번호sequence number Core peptideCore peptide KIITILIKIITILI 1One Amp.96Amp.96 KAIYKIITILIKLKKLIKKAIYKIITILIKLKKLIK 44 Amp.96-1Amp.96-1 AIYKIITILIKLKKLIKAIYKIITILIKLKKLIK 55 Amp.96-2Amp.96-2 IYKIITILIKLKKLIKIYKIITILIKLKKLIK 66 Amp.96-3Amp.96-3 YKIITILIKLKKLIKYKIITILIKLKKLIK 77 Amp.96-4Amp.96-4 KIITILIKLKKLIKKIITILILKLKKLIK 88 Amp.96-5Amp.96-5 KAIYKIITILIKLKKLKAIYKIITILIKLKKL 99 Amp.96-6Amp.96-6 KAIYKIITILIKLKAIYKIITILIKL 1010 Amp.96-8Amp.96-8 KAIYKIITILIKAIYKIITILI 1111 Amp.96-10Amp.96-10 KLKKLIKKLKKLIK 1212

4-1. 최소 활성 서열 후보군의 세포막 투과 효율 평가4-1. Evaluation of cell membrane penetration efficiency of minimum active sequence candidates

(1) 인간 표피 세포를 이용한 세포 투과 효율 평가(1) Evaluation of cell penetration efficiency using human epidermal cells

합성된 8종의 후보 펩타이드군의 세포막 투과능을 비교하기 위해, 인간 표피 세포인 HaCAT 세포주를 준비하고, 유세포 분석기 (Flow cytometry)를 이용하여 FITC-CPP의 펩타이드 종류에 따른 세포막 투과 효율을 분석하였다. 구체적으로, 24-웰 플레이트에 HaCAT 세포를 웰당 1 × 10⁷개씩 분주한 다음, 세포 배양액에서 24시간 배양하였다. 그 다음, FITC로 형광 라벨된 Amp.96 최소 활성 서열 후보군 (Amp.96-1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 및 10번), 및 TAT 펩타이드 1μM을 각각 HaCAT 세포 주에 1시간 동안 처리하였다. 배양이 종결된 후, 0.25% 트립신 (trypsin)을 처리해 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고, 원심분리를 이용해 상층액을 제거하였다. HaCAT 세포 표면에 묻어있거나 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록, D-PBS 500μL를 이용해 재부유시키고 원심분리하는 세척 과정을 거쳤으며, 차가운 D-PBS로 2회 반복하였다. 상기와 같은 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 최종적으로 400μL의 D-PBS로 재부유시켜 유세포 분석기 (Flow cytometry, FACS machine, BD science FACSCanto II)로 세포 내 형광을 측정하여 세포 투과 효율을 측정하였다. 그 결과는 도 5a 및 5b에 나타내었다.In order to compare the cell membrane penetrating ability of the synthesized 8 candidate peptide groups, a HaCAT cell line, a human epidermal cell, was prepared, and the cell membrane penetrating efficiency according to the peptide type of FITC-CPP was analyzed using flow cytometry. . Specifically, 1 × 10 ⁷ HaCAT cells were dispensed per well in a 24-well plate, and then cultured in a cell culture medium for 24 hours. Then, FITC-labeled Amp.96 minimally active sequence candidates (Amp.96-1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, and 10) and 1 μM of TAT peptide were each injected into HaCAT cell lines. treated over time. After the culture was terminated, all the cells were collected by treatment with 0.25% trypsin, transferred to a tube, and the supernatant was removed by centrifugation. In order not to affect the efficiency measurement by remaining on the HaCAT cell surface or remaining medium, a washing process of re-suspension and centrifugation was performed using 500 μL of D-PBS and repeated twice with cold D-PBS. The cells obtained after washing twice as described above were finally resuspended in 400 μL of D-PBS, and intracellular fluorescence was measured using a flow cytometry (Flow cytometry, FACS machine, BD science FACSCanto II) to measure cell permeation efficiency. The results are shown in Figures 5a and 5b.

5a 및 5b에서 확인 가능한 바와 같이, Amp.96-10을 제외한 7종의 후보 펩타이드 모두 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT과 비교하여 더 우수한 세포 투과 효율을 갖는 것으로 나타났다.As can be seen in 5a and 5b, all seven candidate peptides except for Amp.96-10 showed better cell penetration efficiency compared to TAT, a conventional cell membrane penetration domain.

(2) 인간 신경모세포종 세포주를 이용한 세포 투과 효율 평가(2) Evaluation of cell penetration efficiency using human neuroblastoma cell lines

이어서, 동일한 방식으로 인간 신경모세포종 세포인 SH-SY5Y 세포를 이용해 FITC-CPP 후보군의 세포막 투과 효율을 분석하였다. 구체적으로, 24-웰 플레이트에 SH-SY5Y 세포를 웰당 1 × 10⁷개씩 분주한 다음, 세포 배양액에서 24시간 배양하였다. 그 다음, FITC로 형광 라벨된 Amp.96 최소 활성 서열 후보군 (Amp.96-1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 및 10번), 및 TAT 펩타이드 1μM을 각각 SH-SY5Y 세포 주에 1시간 동안 처리하였다. 배양이 종결된 후, 0.25% 트립신 (trypsin)을 처리하여 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고, 원심분리를 이용해 상층액을 제거하였다. SH-SY5Y 세포 표면에 묻어있거나 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 500μL를 이용해 재부유시키고 원심분리하는 세척 과정을 거쳤으며, 차가운 D-PBS로 2회 반복하였다. 상기와 같은 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 최종적으로 400μL의 D-PBS로 재부유시켜 유세포 분석기 (Flow cytometry, FACS machine, BD science FACSCanto II)로 세포 내 형광을 측정하여 세포 내 도입 효율을 측정하였다. 그 결과는 도 6a 및 6b에 나타내었다.Next, the cell membrane penetration efficiency of the FITC-CPP candidate group was analyzed using SH-SY5Y cells, which are human neuroblastoma cells, in the same manner. Specifically, 1 × 10 ⁷ SH-SY5Y cells were dispensed per well in a 24-well plate, and then cultured in a cell culture medium for 24 hours. Then, FITC-labeled Amp.96 minimally active sequence candidates (Amp.96-1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, and 10), and 1 μM of the TAT peptide, respectively, were added to the SH-SY5Y cell line. treated for 1 hour. After the culture was terminated, all the cells were collected by treatment with 0.25% trypsin, transferred to a tube, and the supernatant was removed by centrifugation. In order not to affect the efficiency measurement by remaining on the surface of SH-SY5Y cells or remaining medium, a washing process of re-suspension and centrifugation was performed using 500 μL of D-PBS and repeated twice with cold D-PBS. Cells obtained after washing twice as described above were finally resuspended in 400 μL of D-PBS, and intracellular fluorescence was measured using a flow cytometry (Flow cytometry, FACS machine, BD science FACSCanto II) to measure transduction efficiency. . The results are shown in Figures 6a and 6b.

도 6a 및 6b에서 확인 가능한 바와 같이, 인간 표피 세포를 이용한 실험에서와 마찬가지로 Amp.96-10을 제외한 7종의 후보 펩타이드 모두 인간 신경모세포종 세포주에서 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT과 비교하여 5배 이상 우수한 세포 투과 효율을 갖는 것으로 나타났다. As can be seen in Figures 6a and 6b, as in the experiment using human epidermal cells, all seven candidate peptides except for Amp. It has been shown to have excellent cell penetration efficiency.

4-2. 최소 활성 서열 후보군의 세포 내로의 생물학적 활성 분자 전달 효과 확인4-2. Confirmation of the effect of delivering biologically active molecules into cells of the minimum active sequence candidates

최소 활성 서열 후보들이 실제로 세포 내로 생물학적 활성 분자를 전달할 수 있는지 확인하기 위해, 각 후보 펩타이드에 FITC를 부착시킨 후, 인간 표피 세포 (HaCAT) 또는 인간 신경교모세포종 세포주 (SH-SY5Y)에 처리하고, 형광 현미경으로 관찰하여 세포 내 FITC 전달 효율을 분석하였다.In order to confirm that the minimally active sequence candidates can actually deliver biologically active molecules into cells, FITC is attached to each candidate peptide, then treated with human epidermal cells (HaCAT) or human glioblastoma cell line (SH-SY5Y), and fluorescence Intracellular FITC delivery efficiency was analyzed by observing under a microscope.

구체적으로, 24-well 세포 배양용 플레이트 (Corning Incorporated Costar)의 각 웰에 미리 현미경용 원형 커버글라스 (Microscope Cover Glasses, 12mm Φ)를 깔아두고 세포를 5 × 10⁴으로 분주한 후, 18시간 동안 DMEM 배지 (HyClone)에서 배양하여 세포가 커버글라스에 부착되게 하였다. 이후 배지를 모두 흡입 (suction)하여 버린 후 D-PBS (WELGENE) 500μL를 넣어준 뒤, FITC-CPP가 1μM의 농도로 첨가된 DMEM (FBS를 함유하지 않음) 300μL를 처리하였다. 그리고 37℃ 및 5% CO₂의 조건으로 1시간 동안 배양했다. 배양을 마친 뒤, 세포 외부의 단백질을 제거하기 위해 배지를 모두 흡입 후 1mL의 D-PBS로 3회 세척하였다. 그리고 FITC-CPP가 처리된 세포에 4% 파라포름알데히드 (PFA, Biosesang) 1mL를 처리하여 실온에서 고정하였다. 이렇게 준비된 샘플은 Mounting medium with DAPI Aqueous (Fluoroshield; abcam)를 이용해 마운팅하였으며, 형광현미경 ECLIPSE Ts2-FL (Fluorescence microscope, Nikon)으로 관찰했다. Specifically, in each well of a 24-well cell culture plate (Corning Incorporated Costar), a circular cover glass for a microscope (Microscope Cover Glasses, 12mm Φ) was laid in advance, and cells were dispensed at 5 × 10 ⁴ and then maintained for 18 hours. Cultured in DMEM medium (HyClone) to allow the cells to adhere to the cover glass. Then, after discarding all the medium by suction, 500 μL of D-PBS (WELGENE) was added thereto, followed by treatment with 300 μL of DMEM (not containing FBS) to which FITC-CPP was added at a concentration of 1 μM. And incubated for 1 hour under conditions of 37°C and 5% CO ₂ . After the culture was completed, all the medium was aspirated to remove extracellular proteins, and then washed three times with 1 mL of D-PBS. Then, 1 mL of 4% paraformaldehyde (PFA, Biosesang) was applied to the cells treated with FITC-CPP, and the cells were fixed at room temperature. The prepared sample was mounted using Mounting medium with DAPI Aqueous (Fluoroshield; abcam) and observed with a fluorescence microscope ECLIPSE Ts2-FL (Fluorescence microscope, Nikon).

결과는 도 7에 나타냈다. 인간 표피 세포 및 신경교모세포종 세포주 각각에서 녹색 형광 단백질 (FITC)의 위치를 확인한 결과, Amp.96-10을 제외한 7종의 후보 펩타이드 모두 TAT과 비교하여 세포 내로의 FITC 전달 효율이 더 높은 것으로 나타났다.The results are shown in FIG. 7 . As a result of confirming the location of green fluorescent protein (FITC) in human epidermal cells and glioblastoma cell lines, respectively, all seven candidate peptides except Amp.96-10 showed higher efficiency of FITC delivery into cells compared to TAT.

상기 결과들을 통하여, 본 발명자들이 새롭게 발굴한 세포 투과성 펩타이드는 생물학적 활성 분자를 세포 내로 운반할 수 있는 세포 투과능이 현저히 우수하고, 세포 내로 운반된 생물학적 활성 분자가 세포 내에서 효과적으로 활성을 유지할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 세포 투과성 펩타이드에 다양한 활성을 나타내는 물질들을 결합시켜 표적 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 바, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 미용, 진단, 백신, 치료 분야 등 다양한 분야에 적용이 가능한 것을 확인할 수 있었다.Through the above results, the cell-penetrating peptide newly discovered by the present inventors has a remarkably excellent cell-penetrating ability to transport biologically active molecules into cells, and the biologically active molecules transported into cells can effectively maintain their activity in cells. Confirmed. That is, substances exhibiting various activities can be bound to the cell-permeable peptide of the present invention and effectively delivered into target cells, and the cell-permeable peptide according to the present invention can be applied to various fields such as beauty, diagnosis, vaccine, and treatment. I was able to confirm.

특히, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 N-말단에서 최대 4개 아미노산이 결실되거나 (Amp.96-4) 또는 C-말단에서 최대 7개 아미노산이 결실된 경우에도 (Amp.96-8) 종래 세포 투과성 펩타이드에 비해 10배 이상 뛰어난 세포 투과능을 유지할 수 있음이 확인되었다.In particular, the cell-permeable peptide according to the present invention can be deleted even when up to 4 amino acids are deleted from the N-terminus (Amp.96-4) or up to 7 amino acids from the C-terminus are deleted (Amp.96-8). It was confirmed that the cell penetrating ability can be maintained at least 10 times higher than that of the cell penetrating peptide.

상기 결과는 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드 내부의 7개 아미노산 (KIITILI)이 최소 활성 서열이며, 상기 최소 활성 서열을 포함하는 펩타이드는 우수한 세포 투과능 및 생물학적 물질 전달능을 갖는다는 것을 보여준다.The above results show that the 7 amino acids (KIITILI) inside the cell penetrating peptide according to the present invention are the minimally active sequence, and the peptides including the minimally active sequence have excellent cell penetrating ability and biological substance delivery ability.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다. The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

<110> CELLTORY CO. LTD. <120> Amphipathic cell penetrating peptides and the use thereof <130> MP21-117P1 <150> KR 10-2021-0099104 <151> 2021-07-28 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_1 <400> 1 Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile 1 5 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_2 <400> 2 Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_3 <400> 3 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96 <400> 4 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Lys <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-1 <400> 5 Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile 1 5 10 15 Lys <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-2 <400> 6 Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-3 <400> 7 Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-4 <400> 8 Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-5 <400> 9 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-6 <400> 10 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-8 <400> 11 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-10 <400> 12 Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 13 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_1-(1) <400> 14 aaaatcatta ccatcctgat c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_1-(2) <400> 15 aaaataatca ccattctgat c 21 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_2-(1) <400> 16 aaaatcatta ccatcctgat caaactgaaa aaactgatta aa 42 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_2-(2) <400> 17 aaaataatca ccattctgat caagttgaag aagctgatca aa 42 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_3-(1) <400> 18 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atc 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core peptide_3-(2) <400> 19 aaagctatct ataaaataat caccattctg atc 33 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-(1) <400> 20 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atcaaactga aaaaactgat taaa 54 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-(2) <400> 21 aaagctatct ataaaataat caccattctg atcaagttga agaagctgat caaa 54 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-1-(1) <400> 22 gctatctaca aaatcattac catcctgatc aaactgaaaa aactgattaa a 51 <210> 23 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-1-(2) <400> 23 gctatctata aaataatcac cattctgatc aagttgaaga agctgatcaa a 51 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-2-(1) <400> 24 atctacaaaa tcattaccat cctgatcaaa ctgaaaaaac tgattaaa 48 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-2-(2) <400> 25 atctataaaa taatcaccat tctgatcaag ttgaagaagc tgatcaaa 48 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-3-(1) <400> 26 tacaaaatca ttaccatcct gatcaaactg aaaaaactga ttaaa 45 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-3-(2) <400> 27 tataaaataa tcaccattct gatcaagttg aagaagctga tcaaa 45 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-4-(1) <400> 28 aaaatcatta ccatcctgat caaactgaaa aaactgatta aa 42 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-4-(2) <400> 29 aaaataatca ccattctgat caagttgaag aagctgatca aa 42 <210> 30 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-5-(1) <400> 30 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atcaaactga aaaaactg 48 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-5-(2) <400> 31 aaagctatct ataaaataat caccattctg atcaagttga agaagctg 48 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-6-(1) <400> 32 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atcaaactg 39 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-6-(2) <400> 33 aaagctatct ataaaataat caccattctg atcaagttg 39 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-8-(1) <400> 34 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atc 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-8-(2) <400> 35 aaagctatct ataaaataat caccattctg atc 33 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-10-(1) <400> 36 aaactgaaaa aactgattaa a 21 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amp.96-10-(2) <400> 37 aagttgaaga agctgatcaa aaagttgaag aagctgatca aa 42 <110> CELLTORY CO. LTD. <120> Amphipathic cell penetrating peptides and the use thereof <130> MP21-117P1 <150> KR 10-2021-0099104 <151> 2021-07-28 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_1 <400> 1 Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile 1 5 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide 2 <400> 2 Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_3 <400> 3 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp. 96 <400> 4 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Lys <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-1 <400> 5 Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile 1 5 10 15 Lys <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-2 <400> 6 Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-3 <400> 7 Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-4 <400> 8 Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-5 <400> 9 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-6 <400> 10 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile Lys Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-8 <400> 11 Lys Ala Ile Tyr Lys Ile Ile Thr Ile Leu Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-10 <400> 12 Lys Leu Lys Lys Leu Ile Lys 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TAT <400> 13 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_1-(1) <400> 14 aaaatcatta ccatcctgat c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_1-(2) <400> 15 aaaataatca ccattctgat c 21 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_2-(1) <400> 16 aaaatcatta ccatcctgat caaactgaaa aaactgatta aa 42 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_2-(2) <400> 17 aaaataatca ccattctgat caagttgaag aagctgatca aa 42 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_3-(1) <400> 18 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atc 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Core peptide_3-(2) <400> 19 aaagctatct ataaaataat caccattctg atc 33 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-(1) <400> 20 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atcaaactga aaaaactgat taaa 54 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-(2) <400> 21 aaagctatct ataaaataat caccattctg atcaagttga agaagctgat caaa 54 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-1-(1) <400> 22 gctatctaca aaatcattac catcctgatc aaactgaaaa aactgattaa a 51 <210> 23 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-1-(2) <400> 23 gctatctata aaataatcac cattctgatc aagttgaaga agctgatcaa a 51 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-2-(1) <400> 24 atctacaaaa tcattaccat cctgatcaaa ctgaaaaaac tgattaaa 48 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-2-(2) <400> 25 atctataaaa taatcaccat tctgatcaag ttgaagaagc tgatcaaa 48 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-3-(1) <400> 26 tacaaaatca ttaccatcct gatcaaactg aaaaaactga ttaaa 45 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-3-(2) <400> 27 tataaaataa tcaccattct gatcaagttg aagaagctga tcaaa 45 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-4-(1) <400> 28 aaaatcatta ccatcctgat caaactgaaa aaactgatta aa 42 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-4-(2) <400> 29 aaaataatca ccattctgat caagttgaag aagctgatca aa 42 <210> 30 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-5-(1) <400> 30 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atcaaactga aaaaactg 48 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-5-(2) <400> 31 aaagctatct ataaaataat caccattctg atcaagttga agaagctg 48 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-6-(1) <400> 32 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atcaaactg 39 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-6-(2) <400> 33 aaagctatct ataaaataat caccattctg atcaagttg 39 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-8-(1) <400> 34 aaagctatct acaaaatcat taccatcctg atc 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-8-(2) <400> 35 aaagctatct ataaaataat caccattctg atc 33 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-10-(1) <400> 36 aaactgaaaa aactgattaa a 21 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Amp.96-10-(2) <400> 37 aagttgaaga agctgatcaa aaagttgaag aagctgatca aa 42

Claims

As a cell-permeable peptide consisting of an amino acid sequence represented by the following general formula,
[general meal]
A'-KIITILI-B'
In the above general formula, A' does not exist or 1 to 8 amino acids are linked,
B' is absent or 1 to 15 amino acids are linked,
The peptide is a cell-permeable peptide consisting of 7 to 25 amino acids.

According to claim 1,
Characterized in that the cell-permeable peptide has an alpha-helix structure, the cell-permeable peptide.

According to claim 1,
The cell-permeable peptide is characterized in that the amphipathic, cell-permeable peptide.

According to claim 1,
1 to 8 amino acids constituting the A' are each independently lysine, alanine, isoleucine, or tyrosine, characterized in that, the cell-permeable peptide.

According to claim 1,
1 to 15 amino acids constituting the B' are each independently lysine, leucine, or isoleucine, characterized in that, the cell-permeable peptide.

According to claim 1,
The cell-permeable peptide is a cell-permeable peptide, characterized in that consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 12.

According to claim 1,
The cell-permeable peptide is characterized in that the cell-permeable peptide mediates the transport of the biologically active molecule bound thereto into the cell.

According to claim 1,
The cells include blood-brain barrier endothelial cells, cancer cells, blood cells, epidermal cells, lymphocytes, immune cells, stem cells, induced pluripotent stem cells, neural stem cells, T cells, B cells, natural killer cells, macrophages, microglia, A cell-permeable peptide, characterized in that at least one selected from the group consisting of neurons, glial cells, astrocytes, and muscle cells.

A polynucleotide encoding the cell-permeable peptide of any one of claims 1 to 8.

A complex comprising the cell penetrating peptide of claim 1 and a biologically active molecule.

According to claim 10,
The cell-penetrating peptide is characterized in that bound to one end or both ends of the biologically active molecule, the complex.

According to claim 11,
The complex is characterized in that 1 to 5 cell-penetrating peptides linked to one end or both ends of the biologically active molecule.

According to claim 11,
The complex, characterized in that the bond is a chemical bond, a bond using a linker, or a peptide bond.

According to claim 13,
The chemical bond is at least one selected from the group consisting of a disulfide bond, a diamine bond, a sulfide-amine bond, a carboxy-amine bond, an ester bond, a diselenide bond, a maleimide bond, a thioester bond, and a thioether bond. Do, complex.

According to claim 10,
The biologically active molecules are peptides, proteins, glycoproteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, glycolipids, compounds, natural products, semi-synthetic drugs, microparticles, nanoparticles, liposomes, viruses, quantum dots, fluorescence A complex, characterized in that at least one selected from the group consisting of a pigment (fluorochrome) and a toxin.

According to claim 15,
The proteins include growth factors, enzymes, nucleases, transcription factors, antigenic peptides, antibodies, antibody fragments, hormones, carrier proteins, immunoglobulins, structural proteins, motor function proteins, receptors, signaling proteins, storage proteins, At least one selected from the group consisting of membrane proteins, transmembrane proteins, internal proteins, external proteins, secreted proteins, viral proteins, protein complexes, chemically modified proteins, and prions. characterized by a complex.

According to claim 15,
The nucleic acid is DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), aptamer, LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid) ), and morpholino (morpholino) characterized in that at least one selected from the group consisting of, complex.

According to claim 15,
The compound is characterized in that at least one selected from the group consisting of therapeutic drugs, toxic compounds, and chemical compounds, the complex.

A composition for delivery of biologically active molecules comprising the cell-permeable peptide of any one of claims 1 to 8 or the complex of claim 10 as an active ingredient.