KR20230013452A - Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments - Google Patents

Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments Download PDF

Info

Publication number
KR20230013452A
KR20230013452A KR1020210094224A KR20210094224A KR20230013452A KR 20230013452 A KR20230013452 A KR 20230013452A KR 1020210094224 A KR1020210094224 A KR 1020210094224A KR 20210094224 A KR20210094224 A KR 20210094224A KR 20230013452 A KR20230013452 A KR 20230013452A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
filaments
derived
light
protoplast
aphosphorus
Prior art date
Application number
KR1020210094224A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR102722034B1 (en
Inventor
조태오
아빌라 호세
최광철
권순경
Original Assignee
조선대학교산학협력단
경상국립대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 조선대학교산학협력단, 경상국립대학교산학협력단 filed Critical 조선대학교산학협력단
Priority to KR1020210094224A priority Critical patent/KR102722034B1/en
Priority claimed from KR1020210094224A external-priority patent/KR102722034B1/en
Publication of KR20230013452A publication Critical patent/KR20230013452A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102722034B1 publication Critical patent/KR102722034B1/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12Unicellular algae; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

The present invention relates to a method for maintaining the pluripotency of Undaria pinnatifida protoplast-derived aposporous filaments and a culture method for inducing the Undaria pinnatifida protoplast-derived aposporous filaments into sporophytes. The culturing method of the present invention can be used as a control switch for determining whether or not to proceed with the development of Undaria pinnatifida by applying a light source of a specific wavelength.

Description

미역의 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트 배양 방법 {Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments}Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments derived from seaweed protoplasts {Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments}

본 발명은 미역의 원형질체-유래 아포스포러스 필라멘트의 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 원형질체-유래 아포스포러스 필라멘트의 전분화능을 유지하는 방법 및 이를 포자체로 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for culturing protoplast-derived aphosphorus filaments of seaweed, and specifically, to a method for maintaining the pluripotency of protoplast-derived aphosphorus filaments and a method for inducing them into sporophytes.

미역(Undaria pinnatifida)은 전 세계적으로 가장 중요한 양식 해조류 중 하나이다. 그것은 일반적으로 "다시마"로 알려진 갈조류의 그룹인 Laminariales목에 속한다. 이 Laminariales목의 다른 구성원들 처럼, 미역은 미세한 실모양의 암,수 식물체인 배우자체와 거시적 식물체인 포자체 가 이형적 생활주기를 나타낸다. 미역은 주로 중국, 일본 및 한국에서 재배되지만 아시아 이외 지역에서도 양식재배를 확립하려는 노력이 이루어지고 있다.Seaweed ( Undaria pinnatifida ) is one of the most important aquaculture seaweeds worldwide. It belongs to the order Laminariales, a group of brown algae commonly known as "kelp". Like other members of this order Laminariales, wakame exhibits a dimorphic life cycle, consisting of gametes, which are fine filamentous female and male plants, and sporophytes, which are macroscopic plants. Seaweed is mainly grown in China, Japan and Korea, but efforts are being made to establish aquaculture outside Asia.

미역의 재배는 유성 생식, 즉 사상체의 암,수 식물에서 생산 된 배우자의 수정에 의존한다. 그러나 이것은 유전자 재조합을 통한 재배열로 인해 유전자형의 불안정한 전달을 초래하여 새로운 방식으로 보완하는 것이 필요하다.Cultivation of wakame relies on sexual reproduction, that is, fertilization of gametes produced from filamentous female and male plants. However, this results in unstable transmission of the genotype due to rearrangement through genetic recombination, which requires supplementation in a new way.

클론 증식은 체세포 조직이나 기관에서 재생되는 무성 생식 방법에 의해 유전적으로 동일한 개체의 증식이다. 그것은 고등 식물에 널리 적용되었으며, 선택된 유전자형 또는 품종의 바람직한 특성을 보존하는데 사용된다. "다시마"에서, 감수 분열 포자를 형성하지 않고 포자체를 생산하는 apospory는 클론 식물을 생산할 수 있는 잠재적인 방법으로 인식된다. 현재까지 다시마류에서는 Laminaria digitat에서만 조직 재생을 통한 클론 증식이 보고되고 있다.Clonal propagation is the multiplication of genetically identical individuals by means of asexual reproduction in somatic tissues or organs. It has been widely applied in higher plants and is used to preserve desirable traits of selected genotypes or cultivars. In “kelp,” apospory, which produces sporophytes without forming meiotic spores, is recognized as a potential method to produce clonal plants. So far, clonal proliferation through tissue regeneration has been reported only in Laminaria digitat in kelp.

Matsumara 등(2001)은 미역의 원형질체 재생실험에서 파생된 배우자체와 유사한 필라멘트가 계대배양에 의해 무한정 번식 될 수 있다고 언급하였지만, 이 새로운 방식을 테스트하기 위한 더 이상의 연구는 수행되지 않았다. 아직 미역에서는 아포스포러스 필라멘트를 통한 클론 증식이 보고 된 바 없다.Matsumara et al. (2001) stated that gametophyte-like filaments derived from seaweed protoplast regeneration experiments could be propagated indefinitely by subculture, but no further studies were conducted to test this new method. Clonal proliferation through aphosphorus filaments has not yet been reported in sea mustard.

한국 공개특허 제 10-2020-0066577호Korean Patent Publication No. 10-2020-0066577

본 발명은 특정 파장의 광원을 이용한 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트의 전분화능을 장기간 유지하는 방법 및 미역 클론 포자체로의 발달을 유도하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide a method for maintaining the pluripotency of protoplast-derived aphosphorus filaments for a long period of time using a light source of a specific wavelength and a method for inducing the development of seaweed clonal sporophytes.

1. 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 495 nm 내지 570 nm 파장의 광을 조사하는 제1 단계를 포함하는 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트의 배양 방법.1. A method for culturing Undaria protoplast-derived aphosphorus filaments comprising a first step of irradiating light of a wavelength of 495 nm to 570 nm to the aphosphorus filaments derived from Undaria protoplasts.

2. 위 1에 있어서, 미역 원형질체로부터 상기 아포스포러스 필라멘트를 얻는 단계를 더 포함하는 배양 방법.2. The method according to 1 above, further comprising obtaining the aphosphorus filaments from the protoplasts of Undaria.

3. 위 2에 있어서, 상기 아포스포러스 필라멘트를 얻는 단계는 미역 원형질체에 495 nm 내지 570 nm 파장의 광 조사 하에 수행되는 것인 배양 방법.3. The method according to 2 above, wherein the step of obtaining the aphosphorus filaments is performed under light irradiation with a wavelength of 495 nm to 570 nm to Undaria protoplasts.

4. 위 1에 있어서, 상기 광을 조사한 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 630 nm 내지 750 nm 파장 및 450 nm 내지 495 nm 파장의 광을 조사하여 포자체 식물로 유도하는 제2 단계를 더 포함하는 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트의 배양방법.4. The seaweed according to 1 above, further comprising a second step of inducing a sporophytic plant by irradiating light of 630 nm to 750 nm wavelength and 450 nm to 495 nm wavelength to the aphosphorus filament derived from the light-irradiated wakame protoplast. A method for culturing protoplast-derived aphosphorus filaments.

5. 위 4에 있어서, 상기 제2 단계는 630 nm 내지 750 nm 파장 및 450 nm 내지 495 nm 파장의 광을 1 : 1 내지 5의 광량 비율로 조사하여 수행되는 것인 배양 방법.5. The method according to 4 above, wherein the second step is performed by irradiating light with a wavelength of 630 nm to 750 nm and a wavelength of 450 nm to 495 nm in a ratio of 1: 1 to 5.

6. 위 4에 있어서, 상기 제2 단계는 밀도는 500 내지 750 필라멘트 mL-1의 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 광을 조사하는 것인 배양 방법.6. The culture method according to 4 above, wherein the second step is to irradiate light to the aphosphorus filaments derived from the protoplasts of seaweed having a density of 500 to 750 filaments mL-1.

7. 위 4에 있어서, 상기 제2 단계는 6주 내지 14주의 계대배양된 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 광을 조사하는 것인 배양 방법.7. The culture method according to 4 above, wherein the second step is to irradiate light to the aphosphorus filaments derived from subcultured Undaria protoplasts of 6 to 14 weeks.

본 발명의 미역의 원형질체-유래 아포스포러스 필라멘트의 배양 방법은 특정 파장의 광을 조사하여 원형질체에서 유래한 아포스포러스 필라멘트의 전분화능을 유지시키면서 배양하거나, 이를 포자체로 유도시킬 수 있다. 특정 파장의 광원을 통해 미역의 발달 진행여부를 결정하는 것이 가능하므로, 이러한 특정 파장을 제어 스위치로 활용하여 원하는 시기에 포자체 상태의 미역을 생산할 수 있다.In the method for culturing the protoplast-derived aphosphorus filaments of Undaria of the present invention, the protoplast-derived aphosphorus filaments may be cultured while maintaining their pluripotency by irradiating light of a specific wavelength, or may be induced into sporophytes. Since it is possible to determine whether development of seaweed is progressing through a light source of a specific wavelength, it is possible to produce seaweed in a sporozoite state at a desired time by using this specific wavelength as a control switch.

도 1은 미역 포자체식물의 원형질체 유래 클론 증식을 위한 주요 단계들을 나타낸 것으로, 이 중 분홍색 박스는 아포스포러스 필라멘트 (PDAF)를 특별한 LED 광원을 통해 지속적인 유지 방법과 엽체로의 발달유도에 관한 요약을 보여준다.
도 2는 PDAF와 Red+Blue LEDs (RB LED = 660nm + 460nm) 조명 하에서 10 일간 유도된 이후의 PDAF 필라멘트 및 RB LED 조명 하에서 3주간 유도된 이후 가근을 형성한 어린 포자체 식물을 나타낸다.
도 3은 아포스포러스 필라멘트 (PDAF)의 조직체 유지를 위한 각기 다른 LED 광원에 대한 반응 결과 및 포자체 식물체로 발달시키기 위한 유도자극에 대한 LED 광원에 대한 반응 실험 결과를 나타낸다.
도 4는 녹색 LED에서 유지되는 미역의 PDAF의 포자체 생산에 대한 청색 및 RB LED의 효과를 나타낸다.
도 5는 RB LED 광원 하에서, 포자체 식물을 배양할 때의 적정한 식물체 밀도, 적정 아포스포러스 필라멘트 (PDAF) 조직체의 세대(age) 및 적적 계대배양 시간을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 RB LED 조명의 유도로 아포스포러스 필라멘트 (PDAF)가 미역 포자체 식물로의 발달한 식물체들을 시간대별로 보여 준다.
도 7은 RB LED 광원의 유도로 발달한 식물체들의 핵상을 형광현미경으로 측정한 결과를 나타낸 것으로, 모두 정상적인 포자체의 핵상인 2n으로 확인된다.
도 8은 RB LED 광원의 유도로 발달한 식물체들의 유전적 특성이 아포스포러스 필라멘트 (PDAF) 조직체와 동일한지를 확인한 것으로, 미세부수체 유전자 분석 결과, 동일한 것으로 확인된다.
Figure 1 shows the main steps for the protoplast-derived clone growth of the seaweed sporophyte plant. Among them, the pink box shows a summary of the continuous maintenance method of the aphosphorus filament (PDAF) through a special LED light source and the induction of development into the thallus. show
Fig. 2 shows PDAF filaments after 10 days induction under PDAF and Red+Blue LEDs (RB LED = 660 nm + 460 nm) illumination and young sporozoite plants forming rhizomes after 3 weeks induction under RB LED illumination.
Figure 3 shows the response test results for the LED light source for the induced stimulation for the development of a sporophyte plant and the reaction results for each different LED light source for maintaining the structure of a phosphorus filament (PDAF).
Figure 4 shows the effect of blue and RB LEDs on the sporophyte production of PDAF of wakame maintained in green LED.
Figure 5 shows the results of confirming the appropriate plant density, appropriate apophorus filament (PDAF) tissue generation (age) and appropriate subculture time when culturing sporophyte plants under the RB LED light source.
Figure 6 shows the development of plants with a phosphorus filament (PDAF) into seaweed sporophyte plants over time with the induction of RB LED lighting.
Figure 7 shows the results of measuring the nuclear phase of plants developed by the induction of the RB LED light source with a fluorescence microscope, and all are confirmed to be 2n, which is the nuclear phase of a normal sporophyte.
8 confirms whether the genetic characteristics of the plants developed by the induction of the RB LED light source are the same as those of the PDAF tissue, and as a result of microsatellite gene analysis, it is confirmed that they are the same.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트의 배양 방법을 제공할 수 있다.The present invention can provide a method for culturing the aphosphorus filaments derived from Undaria protoplasts.

상기 배양 방법은 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 495 nm 내지 570 nm 파장의 광을 조사하는 제1 단계를 포함한다.The culturing method includes a first step of irradiating light with a wavelength of 495 nm to 570 nm to the aphosphorus filaments derived from Undaria protoplasts.

“원형질체”는 세포벽이 완전히 또는 부분적으로 제거되어 지질 이중층 막이 노출된 식물세포를 말하며, 일반적으로 세포 배양 또는 전체 식물로 재생하는 능력을 가진 세포벽이 없는 단리된 식물 세포를 의미한다. 또한 상기 원형질체는 부분적으로 제거된 세포벽을 갖는 스페로플라스트(spheroplast)를 포함할 수 있다. "Protoplast" refers to a plant cell in which the cell wall has been completely or partially removed to expose the lipid bilayer membrane, and generally refers to an isolated plant cell without a cell wall that has the ability to regenerate into a cell culture or whole plant. In addition, the protoplast may include a spheroplast having a partially removed cell wall.

“원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트(protoplast-derived aposporous filament, PDAF)”는 엽상 형태의 미역 포자체 식물의 세포벽을 녹여서 수득한 원형질체가 스스로 세포벽을 만들고 재생과정을 거치면서 발생되는 것으로, 실 형태의 사상세포가 뭉쳐져 있는 덩어리 상태를 의미하는 것으로, 이를 작은 입자로 세절하거나 분쇄하여 배양시키면 하나의 입자가 하나의 식물체로 성장하는 전분화능을 나타낸다."Protoplast-derived aposporous filament (PDAF)" is generated when protoplasts obtained by melting the cell wall of a filamentous seaweed sporophyte plant make their own cell wall and undergo a regeneration process. It means a lump state in which is agglomerated, and when it is cut or pulverized into small particles and cultured, one particle shows the pluripotency to grow into one plant.

“포자체”는 세대교번 생활사에서 배수체(2n) 세대의 개체를 의미하며, 배우체의 두 반수체(n) 생식세포의 수정으로 형성된 접합자의 체세포분열로 형성된다. 포자체는 감수분열을 통해 반수체의 포자를 만들고, 포자는 체세포분열을 통해 새로운 배우체 개체로 자라난다. “Spophyte” refers to an individual of the polyploid (2n) generation in the life cycle of generational alternation, and is formed by mitosis of a zygote formed by fertilization of two haploid (n) germ cells of a gametophyte. The sporophyte produces haploid spores through meiosis, and the spores grow into new gametophytes through mitosis.

상기 제1 단계는 PDAF에 녹색광을 조사하여 수행될 수 있는 것으로, 상기 녹색광은 그 파장대가 통상의 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 520 내지 620 ㎚, 540 내지 620 ㎚, 560 내지 620 ㎚, 520 내지 600 ㎚, 540 내지 600 ㎚, 560 내지 600 ㎚, 520 내지 590 ㎚, 540 내지 590 ㎚ 또는 560 내지 590 ㎚ 파장대일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The first step can be performed by irradiating green light to the PDAF, and the wavelength range of the green light is well known in the art, for example, 520 to 620 nm, 540 to 620 nm, 560 to 620 nm, It may be 520 to 600 nm, 540 to 600 nm, 560 to 600 nm, 520 to 590 nm, 540 to 590 nm, or 560 to 590 nm wavelength band, but is not limited thereto.

광원은 상기 파장대의 광을 발생시킬 수 있는 물체라면 그 종류는 제한되지 않는 것으로, 그 종류는 예를 들면 수은 램프, 형광 램프, 백열전구, 할로겐 전구, 발광다이오드, 네온관, 케미컬라이트 또는 레이저 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The type of light source is not limited as long as it is an object capable of generating light in the above wavelength range, and the type may be, for example, a mercury lamp, a fluorescent lamp, an incandescent lamp, a halogen lamp, a light emitting diode, a neon tube, a chemical light, or a laser. but is not limited thereto.

광자극이 없을 경우의 PDAF는 스스로 새포벽을 만들고 재생과정을 거쳐 정상적인 식물체로 성장할 수 있으나, PDAF에 상기 파장의 녹색광을 조사하여 배양할 경우에는 전분화능이 유지될 수 있으므로 본래 포자체 식물로 발달하는 겨울이 아닌 다른 시기까지 전분화능을 유지시켰다가 원하는 시기에 포자체로 발달시킬 수 있는 장점을 갖는다. In the absence of light stimulation, PDAF can grow into a normal plant through a regeneration process by making a cell wall by itself. It has the advantage of maintaining pluripotency until other times than winter and developing into sporophytes at a desired time.

본 발명의 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트의 배양방법은 미역 원형질체로부터 상기 아포스포러스 필라멘트를 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. The method of culturing the aphosphorus filaments derived from Undaria protoplasts of the present invention may further include obtaining the aphosphorus filaments from Undaria protoplasts.

상기 아포스포러스 필라멘트를 얻는 단계는 전술한 바와 같이, 엽상 형태의 미역 포자체 식물의 세포벽을 녹여서 원형질체를 수득하는 단계; 및 수득한 원형질체가 스스로 세포벽을 만들고 재생과정을 거치도록 하는 단계를 포함할 수 있다.Obtaining the aphosphorus filaments may include, as described above, obtaining protoplasts by dissolving the cell wall of the leaf-shaped seaweed sporozoite plant; and allowing the obtained protoplasts to make their own cell walls and undergo a regeneration process.

상기 원형질체가 스스로 세포벽을 만들고 재생과정을 거치도록 하는 단계는 원형질체에 광자극 없이 또는 녹색광을 조사하여 수행되는 것일 수 있으며, 녹색광의 파장 및 이를 발생시키는 광원은 전술한 바와 같다.The step of causing the protoplasts to self-build cell walls and undergo a regeneration process may be performed without light stimulation or by irradiating green light to the protoplasts, and the wavelength of the green light and the light source generating the green light are as described above.

상기 녹색광에 노출된 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트는 다른 파장의 광자극에 비해 지속적으로 많은 수의 포자체 생산하는데 유리할 수 있다.The protoplast-derived aphosphorus filaments exposed to the green light may be advantageous in continuously producing a large number of sporophytes compared to light stimuli of other wavelengths.

본 발명의 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트의 배양방법은 상기 제1 단계를 수행한 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 적색광 및 청색광을 조사하여 포자체 식물로 유도하는 제2 단계를 더 포함할 수 있다.The method of culturing the aphosphorus filaments derived from the protoplasts of the seaweed of the present invention may further include a second step of inducing a sporophytic plant by irradiating the aphosphorus filaments derived from the protoplasts of the wakame seaweed with red light and blue light having performed the first step.

상기 제2 단계는 PDAF에 적색광 및 청색광을 조사하여 수행될 수 있는 것으로, 상기 적색광 및 청색광은 그 파장대가 통상의 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 적색광은 600 내지 700 ㎚, 620 내지 700 ㎚, 640 내지 700 ㎚, 600 내지 680 ㎚, 620 내지 680 ㎚, 640 내지 680 ㎚, 600 내지 660 ㎚, 620 내지 660 ㎚ 또는 640 내지 660 ㎚일 수 있고, 청색광은 400 내지 500 ㎚, 420 내지 500 ㎚, 440 내지 500 ㎚, 400 내지 480 ㎚, 420 내지 480 ㎚, 440 내지 480 ㎚, 400 내지 470 ㎚, 420 내지 470 ㎚ 또는 440 내지 470 ㎚일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The second step can be performed by irradiating red light and blue light to the PDAF, and the wavelength bands of the red light and blue light are well known in the art, for example, red light is 600 to 700 nm, 620 to 700 nm , 640 to 700 nm, 600 to 680 nm, 620 to 680 nm, 640 to 680 nm, 600 to 660 nm, 620 to 660 nm, or 640 to 660 nm, and blue light may be 400 to 500 nm, 420 to 500 nm , 440 to 500 nm, 400 to 480 nm, 420 to 480 nm, 440 to 480 nm, 400 to 470 nm, 420 to 470 nm, or 440 to 470 nm, but is not limited thereto.

백색, 청색 또는 적색과 청색이 혼합된 광자극에 따라 유도된 포자체의 총 수를 비교한 결과, 적색과 청색이 혼합된 광자극에 노출된 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트가 가장 많은 수의 포자체를 생산하였다.As a result of comparing the total number of sporophytes induced by white, blue, or mixed red and blue light stimuli, the protoplast-derived aphosphorus filaments exposed to the mixed red and blue light stimuli produced the largest number of sporophytes. did

상기 제2 단계의 적색광 및 청색광은 특정 비율의 광량으로 조사되는 것일 수 있고, 그 비율은 예를 들면 1 : 1 내지 5, 1 : 1 내지 2 또는 1 : 1 내지 3일 수 있고, 바람직하게는 1:2 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The red light and the blue light of the second step may be irradiated with light amounts at a specific ratio, and the ratio may be, for example, 1:1 to 5, 1:1 to 2, or 1:1 to 3, preferably. It may be 1:2, but is not limited thereto.

상기 제2 단계는 특정 밀도의 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 광을 조사하는 것일 수 있으며, 특정 밀도는 예를 들면 200 내지 1000 필라멘트 mL-1 , 300 내지 800 필라멘트 mL-1 또는 400 내지 600 필라멘트 mL-1 있으며, 바람직하게는 500 내지 750 필라멘트 mL-1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The second step may be to irradiate light to a phosphorus filaments derived from Undaria protoplasts of a specific density, and the specific density is, for example, 200 to 1000 filaments mL -1 , 300 to 800 filaments mL -1 or 400 to 600 filaments mL -1 and, preferably, 500 to 750 filament mL -1 but may be, but is not limited thereto.

상기 제2 단계는 특정 기간동안 계대배양된 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 광을 조사하는 것일 수 있으며, 그 기간은 예를 들면 3 내지 14주, 4 내지 12주, 6 내지 12주 또는 8 내지 14주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The second step may be to irradiate light to the aphosphorus filaments derived from subcultured wakame protoplasts for a specific period of time, for example, 3 to 14 weeks, 4 to 12 weeks, 6 to 12 weeks, or 8 to 12 weeks. It may be 14 weeks, but is not limited thereto.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. The following examples are intended to illustrate the present invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example

1. 실험 방법1. Experiment method

(1) 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트 (PDAF) 제조방법(1) Protoplast-derived aphosphorus filament (PDAF) manufacturing method

본 발명에서 사용된 미역(Undaria pinnatifida)은 조선대학교 해양갈조식물자원기탁등록보존기관에서 분양 받아 배양하였다 (자원고유번호: MBRB0049TC17136 및 MBRB0049TC17223).Seaweed ( Undaria pinnatifida ) used in the present invention was distributed and cultured at the Marine Brown Algae Plant Resource Deposit Registration and Preservation Institute of Chosun University (resource identification numbers: MBRB0049TC17136 and MBRB0049TC17223).

미역 원형질체를 2 mL의 재생 PES배지(285 mM NaCl and 5 mM CaCl2)와 항생제 (50 mg L-1 페니실린-G, 25 mg L-1 스트렙토마이신과 5 mg L-1 크로로페니콜) 혼합액이 있는 12웰 조직 배양 플레이트에 분배한다. 초기 원형질체 밀도 9x103 mL-1로 하여20 ℃의 암기로 배양한다. 삼투압은 PES 배지를 사용하여 암실에서 3일 후 천천히 감소시킨다. 삼투압 감소가 끝날 때까지 원형질체가 10 μmol 광자 m-2 s-1 의 녹색(Green) LED에 노출되도록 한다. 10일 후 광도를 20 μmol 광자 m-2 s-1의 녹색(Green) LED 광량으로 증가시킨다. PES 배지는 배양 첫 달 동안 2-3일 마다 그 다음에는 일주일에 한번씩 갈아 준다. 아포스포러스 필라멘트(PDAFs)는 배양 3개월 후에 발생되었다.Seaweed protoplasts were mixed with 2 mL of regenerated PES medium (285 mM NaCl and 5 mM CaCl 2 ) and antibiotics (50 mg L -1 penicillin-G, 25 mg L -1 streptomycin and 5 mg L -1 chlorophenicol). Dispense into 12-well tissue culture plates. The initial protoplast density is 9x10 3 mL -1 and cultured in the dark at 20 °C. The osmotic pressure decreases slowly after 3 days in the dark using PES medium. The protoplasts are exposed to a green LED of 10 μmol photons m -2 s -1 until the osmotic pressure decreases. After 10 days, the light intensity is increased to a green LED light amount of 20 μmol photons m −2 s −1 . The PES medium is changed every 2-3 days during the first month of culture and then once a week. Aphosphorus filaments (PDAFs) developed after 3 months of culture.

(2) 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트 (PDAF) 배양 및 포자체 유도(2) Cultivation of protoplast-derived aphosphorus filaments (PDAF) and induction of sporophytes

1) 원형질체-유래 아포스포러스 필라멘트 (PDAFs) 배양1) Cultivation of protoplast-derived aphosphorus filaments (PDAFs)

녹색(Green) LED 조명 (파장: 530 nm) 하에서 배양된 원형질체-유래 아포스포러스 필라멘트 (PDAF) 조직 덩어리를 약 500 μm 길이 크기로 세절한다. mL당 500개 절편들을 PES 배지 2 mL를 포함하는 12 웰 조직 배양 플레이트에 접종한 후, 각각 660nm와 460nm의 피크 파장을 가진 적색(Red)과 청색(Blue) (1:2, RB) LED광을 1:2로 섞은 핑크(R+B) LED조명에 노출시킨다. 배양은 20 μmol 광자 m-2 s-1, 14 : 10-h 명/암 광기 20 ℃에서 유지하며 매주 PES배양액을 교환해 준다.A protoplast-derived aphosphorus filament (PDAF) tissue mass cultured under green LED light (wavelength: 530 nm) is cut into pieces with a length of about 500 μm. After inoculating 500 sections per mL into a 12-well tissue culture plate containing 2 mL of PES medium, red and blue (1:2, RB) LED lights with peak wavelengths of 660 nm and 460 nm, respectively is exposed to pink (R+B) LED lighting mixed in a ratio of 1:2. The culture was maintained at 20 °C with 20 μmol photons m -2 s -1 , 14 : 10-h light/dark light, and the PES culture medium was exchanged weekly.

배양 1 개월 후에 1-well당 56-91 개의 포자체 식물들이 발달한다. 배양 1.5 개월까지는 육안 (길이 약 0.5cm)으로 어린 엽체가 관찰될 때까지 웰-플레이트에서 배양하며 동일한 LED광조건을 유지한다. 식물체가 약 0.5cm까지 자랐을 때 PES 배지가 들어있는 더 큰 용기 (예: 1-L 평평한 바닥 둥근 플라스크)로 옮기고 12 ℃ 및 40-60 μmol 광자 m-2s-1의 백색 형광등에서 폭기 하에 배양할 수 있다.After 1 month of culture, 56-91 sporophyte plants per well develop. Until 1.5 months of culture, young thallus (length of about 0.5 cm) is observed with the naked eye - culture in the well-plate and maintain the same LED light conditions. When the plants have grown to about 0.5 cm, transfer them to a larger container (e.g., a 1-L flat-bottom round flask) containing PES medium and incubate under aeration at 12 °C and a white fluorescent light with 40-60 μmol photons m s -1 can do.

2) 포자체 식물 유도 광원 파악을 위한 아포스포러스 샘플준비2) Preparation of Aphosphorus Samples for Identification of Sporophyte Induced Light Source

미역 원형질체로부터 포자체 생산을 위한 아포스포러스 필라멘트 (PDAFs)는 백색 형광등 (PDAFs-W), 청색 (PDAFs-B), 핑크(PDAFs-RB), 적색 (PDAFs-R) 및 녹색 (PDAFs-G) LED 조명 하에서 생산되었다. 이때 백색 형광등 (PDAFs-W)은 대조 실험군으로 이용하였다. 각기 조명 하에서 배양된 아포스포로 필라멘트 (PDAFs)들을 100x40 mm 페트리 접시로 옮기고 동일한 조명 하에서 20 ℃ 조건에서 유지하였다. 백색 형광등 (PDAFs-W), 청색 (PDAFs-B), 핑크(PDAFs-RB) LED 조명 하에서 배양된 원형질체들은 곧 바로 포자체로 발달하는 반면, 적색 (PDAFs-R) 및 녹색(PDAFs-G)의 경우, 이러한 빛 조건에서 포자체로 바로 발달하지 않고 아포스포러스 필라멘트 (PDAFs) 상태를 유지 하였다. 따라서, 아포스포러스 필라멘트 (PDAFs)를 유지가 가능한 적색 (PDAFs-R) 및 녹색(PDAFs-G) 조명 하의 아포스포러스 필라멘트(PDAFs)가 다음단계의 실험에 이용되었다. 이들은 한 번 계대배양되고, 그 다음 1 개월의 재성장 후 실험에 사용되었다. 백색 아포스포러스 필라멘트 (PDAFs-W)의 경우, 포자체 생산능을 잃을 때까지 1 년에 걸쳐 5 번 계대배양되었고, 다음 실험을 위해 5 차 계대배양 샘플이 사용되었다. Aphosphorus filaments (PDAFs) for sporophyte production from Undaria protoplasts were white fluorescent (PDAFs-W), blue (PDAFs-B), pink (PDAFs-RB), red (PDAFs-R) and green (PDAFs-G) Produced under LED lighting. At this time, white fluorescent light (PDAFs-W) was used as a control experimental group. Aphosphoro filaments (PDAFs) cultured under each light were transferred to a 100x40 mm Petri dish and maintained at 20 °C under the same light. Protoplasts cultured under white fluorescent (PDAFs-W), blue (PDAFs-B), and pink (PDAFs-RB) LED lights immediately developed into sporophytes, while red (PDAFs-R) and green (PDAFs-G) In this case, it did not develop directly into a sporophyte under these light conditions and maintained the state of a phosphorus filament (PDAFs). Therefore, PDAFs under red (PDAFs-R) and green (PDAFs-G) illumination capable of maintaining PDAFs were used in the next step of the experiment. They were subcultured once and then used for experiments after 1 month of regrowth. In the case of white aphosphorus filaments (PDAFs-W), they were subcultured 5 times over 1 year until they lost the ability to produce sporophytes, and samples from the 5th subculture were used for the next experiment.

(3) 포자체 식물 형성 유도를 위한 LED 광원파악(3) Identification of LED light sources for inducing sporophyte formation

백색 형광등 (PDAFs-W), 적색 (PDAFs-R) 및 녹색(PDAFs-G) 조명에서 생산된 아포스포러스 필라멘트 (PDAFs)들을 면도날을 사용하여 작은 필라멘트 (최대 10 개의 세포 길이)로 절단하고 PES 배지를 포함하는 12-웰 조직 배양의 적어도 4 개의 웰 내 500 필라멘트 mL-1에서 배양되었다. 웰 플레이트는 개별적으로 포자체 유도를 위해 백색, 청색 또는 적색과 청색 (1:2, RB) LED를 사용하여 조사되었다(irradiated). 배양 배지는 매주 교체되었다. 유도 1개월 후 웰당 포자체 총 수를 카운팅하였고, 다음 실험에서는 최적의 조명 조건하에 유지 및 유도를 위해 PDAF가 사용되었다.Aphosphorus filaments (PDAFs) produced under white fluorescent (PDAFs-W), red (PDAFs-R), and green (PDAFs-G) lights were cut into small filaments (up to 10 cells in length) using a razor blade and PES. Cultured in 500 filaments mL-1 in at least 4 wells of a 12-well tissue culture containing medium. Well plates were individually irradiated using white, blue or red and blue (1:2, RB) LEDs for sporophyte induction. Culture medium was changed weekly. The total number of sporozoites per well was counted after 1 month of induction, and PDAF was used for maintenance and induction under optimal lighting conditions in the following experiments.

(4) 포자체 생산에 대한 초기 필라멘트 밀도 조건(4) Initial filament density conditions for sporophyte production

배양물이 생산할 수 있는 포자체의 최대 양을 조사하기 위해, PDAF를 8 가지 다른 초기 필라멘트 밀도 (25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 및 1500 필라멘트 mL-1)로 접종했다. 배양 조건은 이전에 설명한 것과 같다. 유도 2 주 후 웰당 포자체의 총 수를 카운팅하였다. 후속 실험을 위해 최상의 초기 필라멘트 밀도가 선택되었다.To investigate the maximum amount of sporophytes that the cultures could produce, PDAFs were inoculated with 8 different initial filament densities (25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 and 1500 filaments mL -1 ). Culture conditions were as previously described. The total number of sporozoites per well was counted 2 weeks after induction. The best initial filament density was chosen for subsequent experiments.

(5) 포자체 생산에 대한 계대배양 조건(5) Subculture conditions for sporophyte production

지속적인 포자체 생산을 위한 최상의 조건을 결정하기 위해, 1차 계대배양 세대(age) 및 계대배양의 포자체 생산에 대한 효과를 조사하였다.To determine the best conditions for continuous sporophyte production, the effect of the primary subculture age and subculture on sporophyte production was investigated.

세대의 효과를 위해, 1 차 계대배양의 PDAF는 배양 2,3,4 및 5개월 후에 포자체를 형성하도록 유도되었다. 배양 조건은 이전에 설명한 바와 같다. 웰당 포자체의 총 수는 유도 2주 후에 카운팅되었다. 계대배양의 효과를 위해, 4 이상의 계대배양이 확립되었다 (2, 3, 4 및 5차 계대배양). 이것들은 유도 전 2 또는 6주간 재성장하도록 허용되었다. 배양 조건은 이전에 설명한 바와 같다. 웰당 포자체의 총 수는 유도 2주 후에 카운팅되었다.For the effect of generation, PDAFs of the first subculture were induced to form sporophytes after 2, 3, 4 and 5 months of culture. Culture conditions were as previously described. The total number of sporozoites per well was counted 2 weeks after induction. For the effect of subculture, 4 or more passages were established (2nd, 3rd, 4th and 5th passages). They were allowed to regrow for 2 or 6 weeks prior to induction. Culture conditions were as previously described. The total number of sporozoites per well was counted 2 weeks after induction.

(6) 배수성 분석을 위한 DAPI 염색(6) DAPI staining for ploidy analysis

PDAF 및 재생된 포자체의 배수성 수준을 결정하기 위해, DAPI로 염색된 샘플의 보정된 핵 형광은 정량화되었다. 유지를 위한 최상의 조명 조건 하에서 PDAF의 1개월 배양물과 3개의 재생된 포자체 (길이 1.5-2 cm)는 배수성 분석을 위해 선택되었다. 필드-수집 포자체 (배수체) 및 수컷 및 암컷 배우자 배양물 (반수체)는 참조로 사용되었다. 더 나은 이미징을 위해, 절간 분열조직(intercalary meristem)의 절편은 매트릭스 (OCT, CellPath, Ltd.)에 포매되고, 냉동 마이크로톰 (Shandon Cryotome FSE, Thermo Shandon, Ltd)을 사용하여 절편화 (10-12μm 두께) 되었다. 샘플은 50분간 증류수 내 0.5μg /ml 농도로 DAPI(4′,6-diamidino-2- phenylindole)로 염색되었다. 관찰 및 이미지 획득은 Leica DFC450C 카메라와 형광을 위한 Leica EL6000 외부 광원이 장착 된 Leica 도립 현미경(DMi8; Leica)으로 이루어졌다. DAPI-염색된 핵은 425nm 방출 필터와 함께 360/nm 레이저 파장 여기에서 관찰되었다. 엽촉체 자가형광은 470/40 nm 방출 필터 및 515 nm 억제 필터로 관찰되었다. 밝은 필드의 이미지도 참조로 캡쳐되었다. 배수성 정량화는 ImageJ 소프트웨어(공개1.50)를 사용하여 수행되었다. 핵 형광 이미지를 디지털화하고 8 비트로 300kB로 축소하여 형광 도트를 정량화하였다. 핵 형광의 이중성을 피하기 위해 하나의 평면에서만 캡쳐되었다. 보정된 핵 형광은 McCloy et al. (2014)에 따라 계산되었다. 각 샘플에 대해 세 번의 기술 반복이 수행되었고 반복당 100 개의 핵 영역이 측정되었다. 값은 95 % 신뢰 구간의 평균으로 표시되었다.To determine the ploidy levels of PDAF and regenerated sporophytes, corrected nuclear fluorescence of samples stained with DAPI was quantified. A 1-month-old culture of PDAF and three regenerated sporozoites (1.5–2 cm in length) under the best lighting conditions for maintenance were selected for ploidy analysis. Field-collected sporophytes (diploids) and male and female gametophyte cultures (haploids) were used as reference. For better imaging, sections of the intercalary meristem were embedded in a matrix (OCT, CellPath, Ltd.) and sectioned (10-12 μm) using a cryomicrotome (Shandon Cryotome FSE, Thermo Shandon, Ltd). thickness). Samples were stained with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) at a concentration of 0.5 μg/ml in distilled water for 50 min. Observation and image acquisition were performed with a Leica inverted microscope (DMi8; Leica) equipped with a Leica DFC450C camera and a Leica EL6000 external light source for fluorescence. DAPI-stained nuclei were observed at 360/nm laser wavelength excitation with a 425 nm emission filter. Mesophyll autofluorescence was observed with a 470/40 nm emission filter and a 515 nm suppression filter. A bright field image was also captured for reference. Ploidy quantification was performed using ImageJ software (published 1.50). Nuclear fluorescence images were digitized and downscaled to 300 kB in 8 bits to quantify fluorescent dots. Only one plane was captured to avoid duality of nuclear fluorescence. Corrected nuclear fluorescence was performed by McCloy et al. (2014). Three technical repetitions were performed for each sample and 100 nuclear areas were measured per repetition. Values were expressed as the mean of 95% confidence intervals.

(7) 미세부수체를 이용한 유전형 분석(7) Genotype analysis using microsatellites

배양물의 클론 정확도를 확인하기 위해, PDAF 배양물 및 이 배양물로부터 재생된 10개의 개별 포자체의 유전형은 미역 다형성 미세부수체를 사용하여 조사되었다. DNA 추출은 Bustamante et al. (2016)에 따라 수행되었으며, Daguin et al. 2005에 의해 개발된 20개 미세부수체 마커 중 6개 (Up-AC-1B2, -1B5, -1C1, -1C9, -1G2, -2B2)가 유전형 분석에 사용되었다. 이 마커들은 배양된 미역의 포자체 자손 및 야생 개체군의 유전적 정체성을 분석하는 데 사용되었기 때문에 선택되었다.To confirm the clonal accuracy of the cultures, the PDAF cultures and the genotypes of 10 individual sporozoites regenerated from these cultures were investigated using Undaria polymorphic microsatellites. DNA extraction was performed according to Bustamante et al. (2016), Daguin et al. Six of the 20 microsatellite markers developed by 2005 (Up-AC-1B2, -1B5, -1C1, -1C9, -1G2, -2B2) were used for genotyping. These markers were selected because they have been used to analyze the genetic identity of sporophytic progeny and wild populations of cultured wakame.

(8) 통계 분석(8) Statistical analysis

실험 (2), (3) 및 (4)에서 웰당 총 포자체 수는 음이항 및 포아송 회귀 모델을 사용하여 분석되었다. 우도비 검정은 사용할 카운트 회귀 모델을 결정하는데 사용되었다. 0이 있는 경우, 제로-팽창 회귀가 필요한지 확인하기 위해 중첩되지 않는 데이터에 대한 Voung 테스트가 수행되었다. 유의한 결과의 경우 효과 크기로 Pseudo-R2가 선택되었다. 분석은 R에서 "pscl" 및 "MASS" 패키지를 사용하여 수행되었다.In experiments (2), (3) and (4) the total number of sporozoites per well was analyzed using negative binomial and Poisson regression models. A likelihood ratio test was used to determine which count regression model to use. In the presence of 0, a Voung test was performed on non-overlapping data to determine if a zero-dilation regression was required. For significant results, Pseudo-R2 was selected as the effect size. Analysis was performed using the "pscl" and "MASS" packages in R.

베타 분포는 구간 (0, 1)으로 제한된 연속 변수에 대해 유연한 모델을 제공하기 때문에 실험 (6)의 해동-후 생존율 (%)은 베타 회귀가 있는 비율로 분석되었다. 분석은 R에서 "betareg" 패키지를 사용하여 수행되었다. 비례 오차 감소 (PRE) 통계는 전체 모델 효과 크기로 사용되었다. 결과가 유의미할 때, Tukey 사후 검정이 사용되었다. 사후-비교는 R에서 "multcomp" 또는 "userfriendlyscience" 패키지를 사용하여 수행되었다.Since the beta distribution provides a flexible model for continuous variables bounded by the interval (0, 1), the post-thaw survival (%) in experiment (6) was analyzed as a proportion with beta regression. Analysis was performed using the "betareg" package in R. The proportional error reduction (PRE) statistic was used as the overall model effect size. When results were significant, Tukey's post hoc test was used. Post-comparisons were performed using the “multcomp” or “userfriendlyscience” packages in R.

2. 실험 결과2. Experimental results

(1) 포자체 식물 형성 유도를 위한 LED 광원파악(1) Identification of LED light sources for inducing sporophyte formation

포자체는 백색(White) LED에서 PDAFs-W를 제외하고 모든 조건에서 유도되었다 (도 3B). 포자체의 생산은 필라멘트 성장을 감소시키는 작은 알갱이들의 형성이 선행되었다 (도 2B). 포자체가 관찰되지 않은 조건에서, PDAF는 작은 알갱이를 형성하지 않고 계속 아포스포러스 필라멘트(PDAFs)로 성장했다 (도 2C). 아포스포러스 필라멘트 (PDAFs) 유지 및 포자체 유도를 위한 조명 조건뿐만 아니라, 이들의 상호 작용은 총 포자체 수에 상당한 영향을 미쳤습니다 (p <0.001; pseudo-R2 = 0.31). PDAFs-G의 핑크(RB) LED에 비해 PDAFs-G의 청색(Blue) LED (91±19)에서 포자체의 양이 더 많은 경향이 있었다. 그러나 이것은 통계적으로 유의하지는 않았다(p = 0.95). 전반적으로, 청색(Blue) 및 핑크(RB) LED 아래의 PDAFs-G는 PDAFs-W 및 PDAFs-R 보다 각각 3.4 배 및 6.2 배 더 높았다 (도 3B). 추가적인 매개 변수는 PDAFs-G에서 청색 및 핑크(RB) 조건에 대해 조사되었다.Sporophytes were induced in all conditions except PDAFs-W under white LED (Fig. 3B). The production of sporophytes was preceded by the formation of small grains that reduced filament growth (Fig. 2B). Under conditions where no sporophytes were observed, PDAF continued to grow as aphosphorus filaments (PDAFs) without forming small granules (Fig. 2C). Light conditions for retention of aphosphorus filaments (PDAFs) and sporophyte induction, as well as their interactions, had a significant effect on the total number of sporophytes (p < 0.001; pseudo-R2 = 0.31). The amount of sporophytes tended to be higher in the blue LED (91±19) of PDAFs-G compared to the pink (RB) LED of PDAFs-G. However, this was not statistically significant (p = 0.95). Overall, PDAFs-G under blue and pink (RB) LEDs were 3.4- and 6.2-fold higher than PDAFs-W and PDAFs-R, respectively (Fig. 3B). Additional parameters were investigated for blue and pink (RB) conditions in PDAFs-G.

청색(Blue) 및 핑크(RB) 두 조명 모두 최종 포자체 길이나 정상적인 포자체 형성에는 영향을 미치지 않았다 (p> 0.01; 도 4). 그러나 극성이 없는 어린 엽체는 핑크(RB) LED보다 청색(Blue) LED에서 통계적으로 더 많은 양이 발견되었다 (p <0.001; pseudo-R2 = 0.49; 도 4). 다음 실험에서, 아포스포러스 (PDAF) 유지 및 포자체 유도 실험에 PDAFs-G 및 RB LED이 각각 사용되었다.Both blue (Blue) and pink (RB) illumination did not affect final sporophyte length or normal sporophyte formation (p > 0.01; Fig. 4). However, non-polarized juvenile thallus was found in a statistically greater amount in the blue LED than in the pink (RB) LED (p < 0.001; pseudo-R2 = 0.49; Fig. 4). In the following experiments, PDAFs-G and RB LEDs were used for apoptosis (PDAF) maintenance and sporophyte induction experiments, respectively.

(2) 포자체 생산에 대한 초기 필라멘트 밀도의 영향(2) Influence of initial filament density on sporophyte production

초기 필라멘트 밀도는 생성된 포자체의 양에 상당한 영향을 미쳤다 (p <0.001, pseudo-R2 = 0.58). 포자체의 총 수는 필라멘트 밀도가 25에서 500 필라멘트 mL-1로 증가함에 따라 처음에 증가했다. 필라멘트 밀도의 추가적 증가는 더 많은 양의 포자체로 이어지지는 않았다. 500-750 필라멘트 mL-1이 가장 높은 밀도 (1000-1500 필라멘트 mL-1)에 비해 적은 변수 값을 나타내었기 때문에 생성된 포자체의 양에 대한 통계적 차이가 없어 최상의 밀도로 선택되었다 (도 5a).Initial filament density had a significant effect on the amount of sporophytes produced (p < 0.001, pseudo-R2 = 0.58). The total number of sporophytes initially increased as the filament density increased from 25 to 500 filaments mL. Further increases in filament density did not lead to higher amounts of sporophytes. Since 500–750 filaments mL −1 showed fewer parameter values compared to the highest density (1000–1500 filaments mL −1 ), it was selected as the best density as there was no statistical difference in the amount of sporophytes produced (Fig. 5a).

(3) 포자체 생산에 대한 계대배양의 효과(3) Effect of subculture on sporophyte production

계대배양 지속시간(age)은 생산된 포자체의 양에 부정적인 영향을 미쳤다 (p <0.001; pseudo-R2 = 0.26). 2 및 3 개월-배양물은 동일한 수의 포자체를 생성했지만, 4 및 5 개월-배양물은 각각 2.3 배 및 4.7 배 적은 포자체를 나타냈다 (도 5b). 녹색(Green) LED조명 하에서 2 주간의 재성장으로 계대배양할 때, 포자체 생산은 유지될 수 없었다 (p <0.001; pseudo-R2 = 0.52; 도 5c). 그러나, 녹색(Green) LED조명 하에서 6 주간의 재성장 후에는 모든 계대배양에서 포자체 수가 유사하게 유지되었다 (p = 0.04; 도 5d). 따라서, 6주의 재성장 및 3 개월 미만의 계대배양은 지속적인 포자체 생산을 위해 권장된다.The duration of subculture (age) had a negative effect on the amount of sporozoites produced (p < 0.001; pseudo-R2 = 0.26). 2 and 3 month-cultures produced the same number of sporophytes, but 4 and 5 month-cultures showed 2.3- and 4.7-fold fewer sporophytes, respectively (Fig. 5b). When subcultured with 2 weeks of regrowth under green LED light, sporophyte production could not be maintained (p < 0.001; pseudo-R2 = 0.52; Fig. 5c). However, after regrowth for 6 weeks under green LED light, the number of spores remained similar in all subcultures (p = 0.04; Fig. 5d). Thus, 6 weeks of regrowth and subcultures of less than 3 months are recommended for continued sporophyte production.

유지 [녹색(Green) LED], 유도 [핑크(RB) LED] 및 지속적인 클론 증식 (재성장 6 주 및 3 개월 미만의 계대배양)을 위한 최상의 조건 하 포자체 발달은 도 6에 표시되었다.Sporophyte development under the best conditions for maintenance (Green LED), induction (Pink (RB) LED) and continued clonal growth (regrowth 6 weeks and subcultures less than 3 months) is shown in FIG. 6 .

(4) DAPI 염색을 이용한 배수성 분석(4) Ploidy analysis using DAPI staining

연구 샘플간에 정확한 핵 형광의 차이가 관찰되었다. 암.수 배우체들은필드-수집 포자체 (FS) 값의 49-51 %를 그리고 재생된 포자체에서의 핵 형광 값의 44-49 %를 나타냈다 (도 7). 필드-수집 포자체 (FS), PDAF 및 재생된 포자체의 결과는 이배체 배수성 수준(2n)과 일치하였다. Differences in precise nuclear fluorescence were observed between study samples. Female and male gametophytes showed 49-51% of field-collected sporophyte (FS) values and 44-49% of nuclear fluorescence values in regenerated sporophytes (Fig. 7). The results of field-collected sporophytes (FS), PDAF and regenerated sporophytes were consistent with the level of diploid ploidy (2n).

(5) 미세부수체를 이용한 유전형 분석(5) Genotype analysis using microsatellites

기존에 보고된 20 개의 미세부수체 유전자좌 중 6 개 부위가 아포스포러스 필라멘트(PDAF) 및 이들로부터 재생된 10개의 포자체에 대한 유전형 분석을 위해 사용되었다. 모든 유전자좌는 증폭된 생성물의 전기 영동에서 동일한 밴드 패턴을 나타냈다. PCR 증폭 패턴은 조사중인 두 유전자좌에 대해 도 8에 표시되었다. 이 두 유전자좌와 분석된 세 가지 다른 마커를 기반으로, 재생된 모든 포자체는 모체 PDAF 배양물과 동일한 미세부수체 프로파일을 나타냈다.Six of the previously reported 20 microsatellite loci were used for genotyping of PDAF and 10 sporophytes regenerated from them. All loci showed identical band patterns in electrophoresis of amplified products. PCR amplification patterns are displayed in Figure 8 for the two loci under investigation. Based on these two loci and the three other markers analyzed, all regenerated sporophytes exhibited the same microsatellite profile as the parental PDAF culture.

Claims (7)

미역 원형질체 유래 아포포러스 필라멘트에 495 nm 내지 570 nm 파장의 광을 조사하는 제1 단계를 포함하는 미역 원형질체 유래 아포포러스 필라멘트의 배양 방법.
A method for culturing Undaria protoplast-derived apoporous filaments comprising a first step of irradiating light of a wavelength of 495 nm to 570 nm to the apoporous filaments derived from Undaria protoplasts.
청구항 1에 있어서, 미역 원형질체로부터 상기 아포포러스 필라멘트를 얻는 단계를 더 포함하는 배양 방법.
The method according to claim 1, further comprising the step of obtaining the apophorus filaments from Undaria protoplasts.
청구항 2에 있어서, 상기 아포포러스 필라멘트를 얻는 단계는 미역 원형질체에 495 nm 내지 570 nm 파장의 광 조사 하에 수행되는 것인 배양 방법.
The method according to claim 2, wherein the step of obtaining the apophorus filaments is performed under light irradiation with a wavelength of 495 nm to 570 nm to Undaria protoplasts.
청구항 1에 있어서, 상기 광을 조사한 미역 원형질체 유래 아포포러스 필라멘트에 630 nm 내지 750 nm 파장 및 450 nm 내지 495 nm 파장의 광을 조사하여 포자체 식물로 유도하는 제2 단계를 더 포함하는 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트의 배양방법.
The method according to claim 1, further comprising a second step of inducing a sporophyte plant by irradiating light of 630 nm to 750 nm and 450 nm to 495 nm to the light-irradiated apophorus filament derived from the protoplast of the seaweed. A method for culturing phosphorus filaments.
청구항 4에 있어서, 상기 제2 단계는 630 nm 내지 750 nm 파장 및 450 nm 내지 495 nm 파장의 광을 1 : 1 내지 5의 광량 비율로 조사하여 수행되는 것인 배양 방법.
The method according to claim 4, wherein the second step is 630 nm to 750 nm wavelength and 450 nm to 495 nm wavelength of light 1: 1 to the culture method that is carried out by irradiating light at a ratio of 1 to 5.
청구항 4에 있어서, 상기 제2 단계는 밀도는 500 내지 750 필라멘트 mL-1의 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 광을 조사하는 것인 배양 방법.
The method according to claim 4, wherein the second step is a density of 500 to 750 filaments mL -1 of the protoplast derived from seaweed is irradiated with light.
청구항 4에 있어서, 상기 제2 단계는 6주 내지 14주의 계대배양된 미역 원형질체 유래 아포스포러스 필라멘트에 광을 조사하는 것인 배양 방법.
The method according to claim 4, wherein the second step is to irradiate light to the aphosphorus filaments derived from subcultured Undaria protoplasts of 6 to 14 weeks.
KR1020210094224A 2021-07-19 Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments KR102722034B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210094224A KR102722034B1 (en) 2021-07-19 Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210094224A KR102722034B1 (en) 2021-07-19 Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230013452A true KR20230013452A (en) 2023-01-26
KR102722034B1 KR102722034B1 (en) 2024-10-25

Family

ID=

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200066577A (en) 2018-11-30 2020-06-10 순천향대학교 산학협력단 A Method for mars production of gametophyte of brown seaweed

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200066577A (en) 2018-11-30 2020-06-10 순천향대학교 산학협력단 A Method for mars production of gametophyte of brown seaweed

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Camus et al. Overview of 3 year precommercial seafarming of Macrocystis pyrifera along the Chilean coast
Nikolov et al. The big, the bad, and the beautiful: Biology of the world's largest flowers
Orlinska et al. In vitro plant regeneration of 4 Capsicum spp. genotypes using different explant types
Jahangir et al. Various hormonal supplementations activate sugarcane regeneration in-vitro
Müller et al. Reproductive strategies of Lessonia berteroana (Laminariales, Phaeophyceae) gametophytes from Chile: Apogamy, parthenogenesis and cross-fertility with L. spicata
Gauci et al. Cold thermal priming of Laminaria digitata (Laminariales, Phaeophyceae) gametophytes enhances gametogenesis and thermal performance of sporophytes
Ramlov et al. Effects of temperature, salinity, irradiance, and nutrients on the development of carposporelings and tetrasporophytes in Gracilaria domingensis (Kütz.) Sonder ex Dickie (Rhodophyta, Gracilariales)
Xiaodong et al. Mitochondrial genome of callus protoplast has a role in mesophyll protoplast regeneration in Citrus: evidence from transgenic GFP somatic homo-fusion
CN102369879A (en) Succeeding preservation method for embryogenic callus of China fir and subculture medium used therein
KR20230013452A (en) Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments
KR102722034B1 (en) Method of culturing protoplast-derived aposporous filaments
Mir et al. In vitro development and regeneration of microcorms in saffron (Crocus sativus L)
Prakash et al. Plant regeneration from protoplasts of Capsicum annuum L. cv. California Wonder
CRISTEA The influence of pH on microspore embryogenesis of white cabbage (Brassica oleracea L.)
KR20180045225A (en) Method for microspore culturing of Cabbage
Zakizadeh et al. Micropropagation of two near threatened orchid. Part 1
Kanchanapoom et al. The effect of chitosan on regeneration of lily (Lilium longiflorum Thunb.‘Ester Lily’) from bulb scale explants cultured in vitro
Van Minh Micropropagation of Rhynchostylis gigantea orchid by somatic embryogenic cultures
KR20110056056A (en) Preparing method of somatic embryo production in liriodendron tulipifera
CN110771495B (en) Method for reducing aberration rate of parthenogenesis sporophyte of kelp germplasm
CN106718878A (en) A kind of fan fern quick breeding by group culture method with young sporangiorus as explant
CN112913678A (en) A method for preparing permanent F from Undaria Pinnatifida2Methods of sporozoite population
CN105660390B (en) A kind of method that utilization ultraviolet mutagenesis cultivates sea-tangle strain
CN113678764A (en) Method for producing tetraploid oysters and interspecific hybridization triploid oysters
Motallebi-Azar et al. Effects of colchicine and cold duration pretreatments on androgenesis responses of tomato (Lycopersicon esculentum Mill) via anther culture

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal