KR20230012545A - 레이저-소결 탄수화물 재료 및 조성물의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

레이저-소결 탄수화물 재료 및 조성물의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230012545A
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조던 에스. 밀러
이안 에스. 킨스틀링거
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윌리엄 마쉬 라이스 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크 형태의 구조를 형성하는데 유용한 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제를 포함하는 분말을 포함하며, 상기 분말은 과립 형태를 갖고, 밀리리터 당 6 밀리줄(mJ/mL) 미만의 비에너지를 갖는다.

Description

레이저-소결 탄수화물 재료 및 조성물의 제조 방법 및 이의 용도
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 미국에서 2020년 5월 22일에 출원된 출원번호 제63/029,241호의 우선권을 주장한다.
연방 정부가 후원하는 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원(NIH: National Institutes of Health)이 수여하는 보조금 번호 제HL140905호 하에 국립 연구 서비스 어워드(NRSA: National Research Service Award) F31 박사 전 연구원 장학금을 통해 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가질 수 있다.
조직 공학 분야의 궁극적인 목표는 질병에 걸리거나 부상을 입은 환자의 기능을 회복시키는 환자-특이적 인공 장기를 만드는 것이다. 지난 20년 동안, 생체 재료 및 세포/조직 생물학의 중대한 발전으로 이 분야에서 몇 가지 주요 임상 성공이 이루어졌다. 피부, 각막, 방광과 같은 조작(engineered)된 얇은 무혈관 조직이 기능 회복이 우수한 환자에게 이식되었다. 그러나 대규모 고형 장기는 정교하게 복잡한 내부 유체 네트워크(즉, 맥관구조(vasculature))로 인해 조작에 훨씬 더 큰 어려움을 보인다. 맥관구조를 통한 산소와 영양분의 대류 수송(Convective transport)은 조작된 큰 조직의 내부를 차지하는 세포의 생존과 기능에 필수적이다. 맥관구조를 통한 영양분 수송이 없을 경우, 수백 마이크론 이상의 두꺼운 조직은 빠르게 괴사 성핵(core)을 발달시킬 것이다. 따라서, 많은 연구자들은 대류 수송을 용이하게 하기 위해 개방된 내부 공극 또는 채널을 함유하는 인공 조직 구조물을 조작하는데 상당한 노력을 기울여 왔다.
대류 수송에 대한 잠재력이 향상된 조직 스캐폴드의 생성을 위한 여러 패러다임이 등장했다. 널리 사용되는 전략에서, 관심 세포는 하이드로겔(예컨대 염)에서 선택적으로 제거될 수 있는 임시 입자 또는 용해된 가스와 함께 고분자 생체재료로 구성된 하이드로겔에 시딩된다. 임시 재료를 제거하면(예컨대, 염 침출 또는 가스 발포에 의해) 상호 연결된 기공 네트워크가 생성된다. 이러한 상호 연결된 기공 네트워크는 또한 임계점 건조 및 전기방사 중합체에 의해 형성되었다. 이러한 다공성 네트워크는 산소와 영양분을 조직으로 대류 수송시키는 것을 가능하게 하고 세포가 채워진 하이드로겔로 확산될 수 있는 넓은 표면적을 제공한다. 그러나, 이러한 제조 전략은 스캐폴드 구조를 제어할 수 없으며 종종 가혹한 세포독성 조건이나 시약을 사용한다. 또한, 구조화되지 않은 다공성 네트워크는 동물 모델에 이식된 경우 숙주 맥관구조에 직접 연결될 수 없다.
별도로, 하이드로겔 내에서 정의된 패턴으로 직선 채널을 생성하기 위해 바늘-성형 기술이 도입되었다. 중합체 용액은 일련의 바늘 주위에 분배된 다음 가교되어 고체 겔을 형성한다. 겔이 고형화되어 채널이 열린 후 바늘을 빼낸다. 이러한 바늘-성형된 하이드로겔은 맥관 채널에서 수송을 연구하는데 유용한 도구가 되어왔지만, 생리학적 맥관구조의 복잡하고 분기된 아키텍처를 완전히 재현할 수는 없었다. 맥관구조를 패턴화하는 또 다른 접근 방식인, 소프트 리소그래피는 포토리소그래피 기술을 활용하여, 마이크론 규모의 해상도에서 채널 아키텍처를 제어할 수 있다. 그러나, 이러한 프로세스에는 값비싼 장비가 필요하며 일반적으로 실제 맥관 네트워크를 반영하지 못하는 선형 x-, y-, 또는 z-벡터로만 미세유체 혈관(vessel)을 생성한다. 전반적으로, 소프트 리소그래피나 바늘-성형은 생체 내 맥관구조의 아키텍처 특징을 포착하는 복잡한 3차원 미세유체 네트워크를 생성할 수 없다.
적층 제조(AM: Additive manufacturing, 3차원 인쇄 또는 3D 인쇄라고도 함)는 생체재료 내에 유체 네트워크를 제조하는데 사용되어왔다. 이를 위해, 희생 템플릿(희생 템플레이팅)은 유망한 제조 방법 중 하나이다. 이 기술을 사용하여, 유체 채널의 정의된 패턴은 벌크 재료 내에 제거가능한 템플릿을 넣어 벌크 재료 내에서 제조될 수 있다. 도 1a 내지 1d는 간단한 맥관 네트워크를 형성하기 위한 희생 템플레이팅을 묘사하는 단계적 일련의 개략도이다. 도 1a는 기존 AM 방법으로 제조된 템플릿(101)을 나타낸다. 도 1b에서, 템플릿(101)은 벌크 재료(103)에 싸여 있다. 템플릿(101)이 벌크 재료(103) 내에서 선택적으로 제거된 후, 도 1c는 벌크 재료(103)에 의해 정의된 템플릿(101)의 아키텍처를 반영하는 단순한 맥관 네트워크(105)를 도시한다. 도 1d는 벌크 재료(103) 내의 단순한 맥관 네트워크(105)를 통한 유체 흐름을 나타낸다. 제조 후, 도 1d의 화살표(107)는 벌크 재료(103) 내의 단순한 맥관 네트워크(105)를 통한 유체 흐름을 나타낸다.
제거 가능한 템플릿을 형성하는 첫 번째 방법에서, 수용성 탄수화물 유리는 먼저 자체-지지 격자로 압출되고 Miller 및 Bellan에서와 같이 생체재료 하이드로겔에 캡슐화된다. 문헌[J. S. Miller, et al. Rapid Casting of Patterned Vascular Networks for Perfusable Engineered Three-Dimensional Tissues, 11(9), Nat. Mater. 768-774 (2012)] 및 문헌[L. M. Bellan, et al. Fabrication of an Artificial 3-Dimensional Vascular Network Using Sacrificial Sugar Structures, Soft Matter. 5(7), 1354. (2009)]을 참조한다. 3D-인쇄된 탄수화물 유리 격자가 벌크 하이드로겔 내에서 용해되었을 때, 격자의 기하학은 하이드로겔 매트릭스에서 열린 채널로 유지되었다. 이러한 방법은 다양한 2차원 관 네트워크를 생성할 수 있지만, 결과적으로 압출된 당 구조는 부서지기 쉬웠으며, 다양한 3차원 아키텍처를 생성하기 위해 이러한 방법을 완전히 확장할 수는 없다. 또한, 최종 네트워크 기하학의 재현성과 인쇄된 필라멘트의 해상도는 모두 탄수화물 유리 네트워크를 형성하기 위해 압출을 사용함으로써 제한된다.
제거가능한 템플릿을 형성하는 두 번째 방법은 예를 들어 Bertassoni 및 Kolesky에서 하나 이상의 중합체 스캐폴드 재료와 함께 압출되는 임시 가변성(fugitive) 잉크를 사용한다. 문헌[L. E. Bertassoni, et al. Hydrogel Bioprinted Microchannel Networks for Vascularization of Tissue Engineering Constructs, 14(13), Lab Chip, 2202-2211 (2014)]. 문헌[D. B. Kolesky, 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs, 26(19), Adv. Mater. 3124-3130 (2014)]. 문헌[D. B. Kolesky, et al. Three-Dimensional Bioprinting of Thick Vascularized Tissues, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 201521342 (2016)]을 참조한다. 가변성 잉크의 후속 제거는 벌크 재료에 상응하는 빈 공간을 생성한다. 탄수화물 유리 인쇄와 마찬가지로, 다양한 2D 네트워크를 생성할 수 있지만, 가변성 잉크 압출 기술을 사용하여 복잡하고 임의의 3차원 아키텍처를 인쇄할 수는 없다.
일부 실시형태는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크 형태의 구조를 형성하는데 유용한 조성물에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제(anti-caking agent)를 포함하는 분말을 포함할 수 있으며, 상기 분말은 과립 형태를 갖고, 밀리리터 당 6 밀리줄(mJ/mL) 미만의 비에너지를 갖는다.
일부 실시형태에서, 탄수화물 분말은 덱스트란 또는 이소말트 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 케이킹 방지제는 옥수수전분, 이산화 규소, 또는 잔탄검 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 자유-유동 분말이 되도록 구성될 수 있고 분말은 250 마이크로미터(μm) 미만의 최대 입자 크기를 가질 수 있다.
일부 실시형태는 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제를 포함하는 분말 시스템을 포함하는 3차원 구조에 관한 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 3차원 구조는 소수성 중합체를 포함하는 표면 코팅을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말 시스템은 레이저를 사용하여 고체의 연속 필라멘트로 함께 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말 시스템은 레이저를 사용하여 고체의 필라멘트 네트워크로 함께 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 구조는 평활화 용액(smoothing solution)을 사용하여 표면 평활화를 거칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 평활화된 구조는 소수성 중합체로 차후에 코팅될 수 있다.
일부 실시형태는 구조 재료가 배치되는 매트릭스 재료를 포함하는, 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 포함하는 구조에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 구조 재료는 물에 용해되거나 분해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 구조 재료는 에너지 빔으로 조사될 때 고체에 융합되는 분말로부터 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말 시스템은 과립 형태를 가질 수 있고, 6 mJ/mL 미만의 비에너지를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 레이저를 사용하여 고체의 연속 필라멘트로 함께 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 레이저를 사용하여 고체의 연속 3차원 필라멘트 네트워크로 함께 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 구조 표면은 평활 토포그래피를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 케이킹 방지제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 구조 재료는 적어도 하나의 탄수화물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 구조 재료는 덱스트란 또는 이소말트 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 구조 재료는 포토레지스트, 아가로스, 젤라틴, 탄수화물, 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 이소말트, 덱스트란, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리(락트산), 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 케이킹 방지제는 구조 재료의 유동, 마찰 특성, 또는 입자 패킹 중 적어도 하나를 향상시키는 하나 이상의 재료를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 케이킹 방지제는 옥수수전분, 이산화 규소, 또는 잔탄검 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말의 입자 크기는 250 μm 이하의 직경일 수 있다.
일부 실시형태에서, 구조의 표면은 소수성 코팅을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 소수성 코팅은 폴리카프로락톤, 폴리(L-락타이드), 폴리락트산, 폴리(락트 co-글리콜산), 콜라겐, 젤라틴, 제인, 셸락, 전분, 왁스, 또는 바셀린(petroleum jelly) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 폴리아미드, 폴리(2-히드록시 에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리우레탄, 콜라겐, 아가로스, 알부민, 알지네이트, 키토산, 전분, 히알루론산, 젤라틴, 피브린, 마트리겔, 글리세롤, 글리콜, 만니톨, 이노시톨, 자일리톨, 아도니톨, 글리신, 아르기닌, 생물학적 중합체 분자, 또는 펩티드 양친매성체, 또는 이들의 단량체, 이량체, 또는 올리고머 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 자유-유동 분말이 되도록 구성될 수 있다.
일부 실시형태는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하는 방법에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다: 에너지 빔으로 융합하여 분말을 고형화하여 필라멘트 네트워크를 형성하는 단계; 필라멘트 네트워크의 빈 공간을 매트릭스 재료로 다시 채우는 단계; 및 필라멘트를 제거하여 유동성 채널을 포함하는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하는 단계. 일부 실시형태에서, 필라멘트 네트워크는 복수의 필라멘트를 포함할 수 있고 빈 공간을 한정할 수 있고, 복수의 필라멘트는 물에서 용해되거나 분해될 수 있다.
일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 생체재료를 포함하는 수용액일 수 있다.
상기 방법의 일부 실시형태는 생체재료를 가교 결합하여 빈 공간에 하이드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말은 과립 형태를 가질 수 있고, 6 mJ/mL 미만의 비에너지를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 에너지 빔은 레이저일 수 있다.
상기 방법의 일부 실시형태는 복수의 필라멘트를 평활화 용액으로 표면 평활화하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 표면 평활화는 필라멘트의 아키텍처를 달리 변경하지 않는다.
일부 실시형태에서, 평활화 용액은 이소말트, 덱스트란, 수크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스, 메이플 시럽, 또는 사탕수수 시럽 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 방법의 일부 실시형태는 복수의 필라멘트를 표면 코팅 재료로 표면 코팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 표면 코팅 재료는 빈 공간을 다시 채우지 않으며 상기 매트릭스 재료 및 표면 코팅 재료는 상이한 재료일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표면 코팅 재료는 폴리카프로락톤, 폴리(L-락타이드), 폴리락트산, 폴리(락트 co-글리콜산), 콜라겐, 젤라틴, 제인, 셸락, 전분, 왁스, 또는 바셀린 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 필라멘트 네트워크는 3차원적으로 분지된 패턴으로 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 필라멘트 네트워크는 상호 침투하는(interpenetrating) 기하학으로 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 필라멘트는 제조 동안 지지되지 않는 기하학으로 구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 필라멘트를 제거하는 단계는 용해 또는 분해에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 수용액은 살아있는 세포의 현탁액을 추가로 포함할 수 있으며 상기 필라멘트를 제거하는 단계는 살아있는 세포를 손상시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 가교 결합된 생체재료일 수 있으며, 생체재료는 폴리아미드, 폴리(2-히드록시 에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리우레탄, 콜라겐, 아가로스, 알부민, 알지네이트, 키토산, 전분, 히알루론산, 젤라틴, 피브린, 마트리겔, 글리세롤, 글리콜, 만니톨, 이노시톨, 자일리톨, 아도니톨, 글리신, 아르기닌, 생물학적 중합체 분자, 또는 펩티드 양친매성체, 또는 이들의 단량체, 이량체, 또는 올리고머 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 분말은 자유-유동 분말이 되도록 구성될 수 있으며, 분말은 250 μm 이하의 최대 입자 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 양태 및 장점은 다음의 설명 및 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a 내지 1d는 종래 기술의 방법의 개략도이다.
도 2a 내지 2f는 일부 실시형태에 따른 방법의 개략도이다.
도 3은 본 개시내용의 실시형태에 따른, 분말의 비에너지의 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 본 개시내용의 실시형태에 따른, 분말의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 5a 내지 5d는 본 개시내용의 실시형태에 따른, 선택적 레이저 소결의 개략도이다.
도 6은 하나 이상의 실시형태에 따른, 필라멘트 네트워크의 사진이다.
도 7은 하나 이상의 실시형태에 따른, 필라멘트 폭 대 레이저 출력을 나타내는 그래프이다.
도 8a 및 8b는 하나 이상의 실시형태에 따른, 필라멘트 네트워크의 사진이다.
도 9는 하나 이상의 실시형태에 따른, 구조 재료에 대한 응력(stress) 대 변형률(strain) 그래프이다.
도 10a 및 10b는 하나 이상의 실시형태에 따른, 필라멘트 네트워크 표면의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 11a 내지 11d는 하나 이상의 실시형태에 따른, 표면 평활화의 영향의 그래프이다.
도 12a 내지 12f는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크의 사진이다.
도 13a 내지 13e는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도 14a 내지 14e는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도 15a 내지 15f는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도 16a 내지 16f는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도 17a 내지 17f는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도 18a 및 18b는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도 19a 및 19b는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도 20a 내지 20d는 상호 트리 유인 방법(mutual tree attraction method)의 실시형태를 도시한다.
도 21a 내지 21g는 하나 이상의 실시형태에 따른, 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다.
도면 전체에서 유사한 구성요소에 대해 유사한 번호가 일반적으로 사용된다.
기존 AM 방법의 주요 한계는 재료 범위 내에서 모든 3차원에서 복잡한 네트워크를 구축할 수 없다는 것이다. 상기 AM 방법에 사용된 것과 같이, 압출을 통해 증착된 액상(liquid-phase) 재료는 자체 무게로 인해 변형되거나 붕괴될 수 있다. 또한, 액체의 점성으로 인해 작은 부피를 정확하게 분배하기가 매우 어렵다(층별 방식으로 전방향 구조를 형성하는데 필요할 수 있음). 이러한 본질적인 유변학적 한계는 위에서 설명한 것과 같은 압출-기반 AM 기술이 포유동물 맥관구조의 특징인 지지되지 않는 오버행, 언더행 및/또는 임의의 3차원 분지를 포함하는 아키텍처를 형성하는 것을 금지한다. 또한, 돌출된 직선 네트워크의 결과로 형성된, 90도 채널 접합부는 자연에서 발견되는 구조와 현저히 다른 유체 역학을 가지고 있다. 기존 AM 기술을 사용하여 형성된 네트워크의 변경된 유체 역학은 혈역학, 내피 세포가 경험하는 전단 응력, 및 네트워크의 전반적인 유체 저항에 바람직하지 않은 영향을 미친다.
대조적으로, 당 알코올 이소말트는 선택적 레이저 소결(SLS: selective laser sintering)과 호환될 수 있고 연속적으로 융합된 고체 필라멘트를 형성하기 위해 안정적인 용융 전이를 겪는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본원에 기술된 실시형태는 다양한 탄수화물 분말로부터 3차원 구조를 완전히 자동으로 제조하기 위한 작업 흐름을 포함하여, 패턴화된 SLS를 생성하기 위해 사용될 수 있는 재료의 조성 및 방법론에 관한 것일 수 있다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 탄수화물의 SLS는 이러한 부류의 재료를 적층 제조하는 데 대한 새로운 접근법이다. 본원의 실시형태에 개시된 방법은 개선된 해상도(resolution), 구조적 복잡성, 재현성, 및 처리량과 같은, 탄수화물 구조를 제조하는 이전 방법에 비해 상당한 개선을 제공한다.
이를 위해, 일부 실시형태는 고체의 연속 필라멘트 또는 고체의 연속 3차원 구조, 예컨대 3차원 수지상 탄수화물 격자 또는 고체의 연속 필라멘트 네트워크 형태의 SLS 패턴화된 구조에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴화된 구조는 매트릭스 재료를 템플레이팅하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 패턴화된 구조는 맥관화된 조작된 조직을 캐스팅하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 구조는 매립된 관류성 맥관 네트워크를 갖는 매트릭스로 기술될 수 있음). 또한, 본 개시내용의 일부 실시형태는 재료의 조성 및 상기 기술된 것과 같은 기존 압출 인쇄 기술의 제한에 의해 제한되지 않는 조작된 맥관 네트워크를 제조하는 방법에 관한 것일 수 있다. 재료 조성물의 실시형태는 SLS와 호환될 수 있으며 연속적으로 융합된 고체 필라멘트를 형성하기 위해 안정적인 용융 전이를 겪을 수 있다. 또한, 본원에 기술된 실시형태는 다양한 탄수화물 분말로부터 3차원 구조를 완전히 자동으로 제조하기 위한 작업 흐름을 포함할 수 있다. 마지막으로, 하나 이상의 실시형태는 수지상의 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 계산적으로 생성하기 위한 상호 트리 유인(Mutual Tree Attraction)이라 불리는 방법에 관한 것이다.
대체로, 도 2a 내지 2f는 상기 방법의 실시형태에서 사용될 수 있는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하기 위한 단계를 간략하게 묘사한다. 도 2a 내지 2f에 도시된 바와 같이, 상기 방법의 실시형태는 다음의 단계를 포함할 수 있다: 분말 과립을 에너지 빔으로 소결하거나 용융시켜 3차원 구조를 형성하여 템플릿으로 사용하는 단계; 평활화 용액으로 템플릿을 표면 평활화하는 단계; 템플릿을 표면 코팅 재료로 표면 코팅하는 단계; 매트릭스 재료로 템플릿의 빈 공간을 다시 채우는 단계; 매트릭스 재료를 가교 결합시키는 단계; 및 템플릿을 제거하여 템플릿과 유사한 형상의 채널을 갖는 패턴화된 구조를 형성하는 단계. 이러한 방법은 선택적으로 레이저 소결된-탄수화물 희생 템플레이팅(SLS-CaST: Selectively Laser Sintered-Carbohydrate Sacrificial Templating)으로 지칭된다. 또한, 도 2a 내지 2f에 간략하게 묘사된 각 단계는 또한 아래에서 더 자세히 논의될 것이다.
일부 실시형태에서, SLS는 분말 층에 집중된 에너지 빔으로 2D 패턴을 추적함으로써 3차원 구조를 형성하는데 사용될 수 있다. 분말의 실시형태는 하나 이상의 탄수화물 분말을 포함할 수 있고 함께 융합하여 구조 재료를 형성할 수 있다. 도 2a는 필라멘트 네트워크(5)를 형성하기 위해 레이저(3)로 소결 또는 용융을 통해 SLS 시스템(2)을 사용하여 함께 융합되는 분말(1)의 과립을 도시한다. 레이저(3)에 의해 그려진 형상은 스테이지(6)의 이동, 레이저(3)의 이동, 또는 둘 모두에 의해 제어될 수 있다.
일부 실시형태에서, SLS를 통해 구조 재료로 형성된 3차원 구조가 템플릿으로 사용될 수 있다. 초기 형성 후, 3차원 구조의 표면은 거칠 수 있다. 도 2b는 3D 인쇄 시스템으로부터 제거된 후의 필라멘트 네트워크(5)를 도시한다. 빈 공간(7)은 필라멘트 사이(9)를 포함하여 필라멘트 네트워크(5)를 둘러싸는 것을 볼 수 있다. 따라서, 필라멘트 네트워크(5)는 빈 공간(7)을 한정한다. 필라멘트 네트워크(5)의 표면(11)은 거칠다.
일부 실시형태에서, 필라멘트 네트워크의 표면은 평활화 용액으로 평활화될 수 있다. 도 2c는 표면(11)의 거칠기를 감소시키기 위해 표면 평활화를 거친 후의 필라멘트 네트워크(5)를 도시한다. 표면 평활화는 필라멘트 네트워크(5)가 평활화된 구조가 되도록 하였다.
일부 실시형태에서, 필라멘트 네트워크의 표면은 표면 코팅 재료로 표면 코팅될 수 있다. 도 2d는 표면 코팅 재료가 필라멘트 네트워크(5)의 표면(9) 상에 코팅(13)을 형성한 후의 필라멘트 네트워크(5)를 도시한다. 그러나, 코팅(13)은 빈 공간(7)을 다시 채우지 않는다.
일부 실시형태에서, 필라멘트 네트워크를 둘러싸는 빈 공간은 매트릭스 재료로 다시 채워진다. 도 2e는 필라멘트 네트워크(5)를 둘러싸는 매트릭스 재료(15) 및 빈 공간(7)을 다시 채우는 것을 도시한다. 필라멘트 네트워크 주위에 도입된 후, 매트릭스 재료의 일부 실시형태는 빈 공간 내에서 고형화시키기 위해 가교 결합 또는 다른 중합체 처리가 필요할 수 있다.
일부 실시형태에서, 필라멘트 네트워크는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하기 위해 제거될 수 있다. 최종 맥관 네트워크의 형태는 필라멘트 네트워크의 기하학을 반영하는 매트릭스 재료를 통한 유체 채널을 포함할 수 있다. 도 2f는 코팅(13) 및 매트릭스 재료(15)에 의해 한정된 유체 채널(19)을 포함하는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크(17)를 도시한다. 화살표(21)는 맥관 네트워크(17)를 통한 하나의 잠재적인 유체 흐름 방향을 나타낸다.
하나 이상의 실시형태에 따른, 분말
분말의 실시형태는 하나 이상의 탄수화물 분말을 포함할 수 있다. 분말의 실시형태는 안료, 케이킹 방지제, 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. 분말의 일부 실시형태는 비에너지를 사용하여 정량화될 수 있는 바와 같이 흐르는 능력을 가질 수 있다. 분말의 실시형태는 특정 기하학적 특성(예를 들어, 평균 직경)을 갖는 다수의 분말 과립을 갖는 과립 형태일 수 있다. 분말의 이러한 각 요소는 아래에 자세히 설명되어 있다.
분말의 실시형태는 하나의 탄수화물 분말 또는 둘 이상의 탄수화물 분말의 혼합물을 포함할 수 있다. 탄수화물 분말은 예를 들어 다음을 포함할 수 있거나 다음으로 이루어질 수 있다: 포토레지스트, 아가로스, 젤라틴, 탄수화물, 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 이소말트, 덱스트란, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리(락트산), 및/또는 폴리(에틸렌 글리콜).
위에서 논의된 바와 같이, 이전 작업은 희생 템플레이팅을 위해 용융 압출을 통해 형성된 당을 사용하였다; 그러나 결과는 부서지기 쉬웠고 최종 3차원 형상은 제한적이었다. 대조적으로, 이소말트(인공 당 대용품으로 자주 사용되는 당 알코올) 및 덱스트란은 SLS와 호환될 수 있고 연속적으로 융합된 고체 필라멘트를 형성하기 위해 안정적인 용융 전이를 겪는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이소말트 및 덱스트란은 맥관 아키텍처와 같은 복잡한 3차원 구조를 포함하는, 3차원 구조를 형성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 분말은 이소말트 및 덱스트란 분말 중 하나 또는 모두를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 SLS 동안 분배를 위해 흐르는 능력을 가질 수 있다. 비에너지는 분말 유동성의 한 척도이다. 이를 위해, 본 개시내용의 일부 실시형태는, 케이킹 방지제와 함께 또는 케이킹 방지제 없이, 밀리리터 당 6 밀리줄(mJ/mL) 미만(예컨대, 5 mJ/mL 미만 또는 4 mJ/mL 미만)의 비에너지를 갖는 분말을 이용한다. 다른 방식으로, 본 개시내용의 일부 실시형태는, 케이킹 방지제와 함께 또는 케이킹 방지제 없이, 6 mJ/mL 내지 0.1 mJ/mL(예를 들어, 5 mJ/mL 내지 0.1 mJ/mL, 4 mJ/mL 내지 0.1 mJ/mL, 또는 2 mJ/mL 내지 0.1 mJ/mL)의 비에너지를 갖는 분말을 이용한다.
케이킹 방지제의 첨가는 소결 품질을 유지하면서 분말 유동을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 이를 위해, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 케이킹 방지제는 케이킹 방지제가 결여된 유사한 분말과 비교하여 분말의 특성, 예를 들어 유동, 유동성, 마찰 특성, 및/또는 구조 재료의 입자 패킹을 개선할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에 따르면, SLS용 분말은 하나 이상의 탄수화물 분말과 하나 이상의 케이킹 방지제의 혼합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 케이킹 방지제는 비제한적으로 옥수수전분, 이산화 규소, 또는 잔탄검 또는 두개 이상의 케이킹 방지제의 혼합물 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
나일론은 바람직한 분말 유변학적 특성을 갖기 때문에 SLS에 대한 표준 물질이다; 그러나 나일론은 예를 들어 생체적합성이 불충분하거나 쉽게 용해되지 않거나 다른 이유로 인해 특정 적용에 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 도 3은 본 개시내용의 하나 이상의 실시형태에 따라, 나일론의 비에너지를 이소말트 및 이소말트에 30 질량%(wt%) 옥수수전분을 포함하는 혼합물(이하 "이소말트 + 옥수수전분"으로 지칭됨)의 비에너지와 비교한다. 도시된 바와 같이, 이소말트 분말 과립은 더 높은 비에너지를 가지므로 나일론과 같은 표준 SLS 재료보다 훨씬 더 응집력이 있어 불량한 분말 분포 또는 불균일한 층으로 나타날 수 있다. 도 3은 또한 이소말트 + 옥수수전분 혼합물이 나일론에 필적하는 유동성을 가짐을 보여준다. 따라서, 이소말트 + 옥수수전분은 나일론처럼 자유롭게 흐를 수 있다. 이소말트 및 이소말트 + 옥수수전분에 대한 데이터는 샘플 크기(n), n=3인 t-검정에 대해 p < 0.05의 확률 값(p-값)을 갖는다.
도 4a 내지 4c는 다양한 분말 형태학을 예시하고 분말 유동성의 차이를 설명하는데 도움이 되는 나일론(도 4a), 이소말트(도 4b), 및 옥수수전분(도 4c)의 주사 전자 현미경 사진이다. 나일론은 기존의 중합체 SLS 과정에 사용되는 매우 자유-유동성인 분말이다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 나일론은 상대적으로 작고 부드러우며 규칙적인 형태를 가지고 있다. 대조적으로, 이소말트 분말은 도 4b에 도시된 바와 같이 불규칙하고, 다분산적이며 들쭉날쭉하다. 결과적으로, 이소말트 분말은 나일론에 비해 분말 응집력이 높고 유동성이 상대적으로 떨어진다. 위에서 논의한 바와 같이, 옥수수전분을 첨가하면 분말 이소말트의 유동성이 크게 향상된다. 도 4c는 분말 옥수수전분을 보여준다. 작고 부드러운 옥수수전분 입자는 크고 들쭉날쭉한 이소말트 알갱이 사이에 삽입되어 마찰과 흐름에 대한 저항을 줄이는 것으로 가정된다.
안료의 포함은 분말이 SLS 동안 에너지 빔(예를 들어, 레이저)으로부터 방사선을 보다 효율적으로 흡수하도록 할 수 있다. 또한, 안료를 포함하면 가시 스펙트럼 에너지 빔을 사용하여 성공적인 제조가 가능할 수도 있다. 따라서, 분말의 일부 실시형태는 하나 이상의 안료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안료는 생체적합성 안료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체적합성 안료는 타르트라진, 안토시아닌, 및 알루라 레드 AC(Red 40) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 위에서 논의한 케이킹 방지제와 마찬가지로, 안료는 SLS 시 최종 3차원 구조에 통합될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기술된 입자 크기는 평균(average) 입자 직경, 평균(mean) 입자 직경, 중앙 입자 직경, 입자 직경의 모드, 입자 직경의 가중 평균, 평균 Feret 직경, Sauter 평균 직경, 입자 직경의 최대 확률 밀도 함수(로그 정규 분포, Weibull 분포, Rosin-Rammler 분포, 로그 쌍곡선 분포, 스큐 로그-라플라스 모델 분포, 및 그 안에서 유도된 추가 모델과 같은 임의의 적용가능한 수학적 모델을 사용하여), 또는 입자의 직경을 측정하고/하거나 정의하는데 사용될 수 있는 일부 다른 통계학적 매트릭으로서 정의될 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 분말의 입자 크기(예를 들어, 평균 Feret 직경 또는 상기 논의된 다른 방식으로 측정됨)는 250 마이크로미터(μm) 직경(예를 들어, 200 μm 미만, 100 μm 미만, 50 μm 미만, 10 μm 미만, 등)일 수 있다. 달리 말하면, 본 개시내용의 일부 실시형태는 250 μm 내지 0.01 μm(예를 들어, 200 μm 내지 0.01 μm, 100 μm 내지 0.01 μm, 50 μm 내지 0.01 μm, 또는 10 μm 내지 0.01 μm)의 입자 크기를 갖는 분말을 이용한다.
일부 실시형태에서, 분말이 의도된 입자 크기 및/또는 입자 크기 분포를 갖도록 밀링, 그라인딩, 기계적 분리, 및/또는 체질이 수행될 수 있다. 이러한 입자 크기 조작은 분말의 하나 이상의 성분을 분리한 후(즉, 혼합 전), 분말의 2개 이상의 성분을 조합한 후, 또는 둘 다의 경우에 대해 수행될 수 있다. 또한, 일부 실시형태에서, 분말은 케이킹 방지제를 포함하거나 포함하지 않는 탄수화물의 분말 알갱이의 혼합물일 수 있으며, 이는 밀링 및/또는 그라인딩되어 소결 전에 알갱이 크기 및/또는 입자 측면이 감소된다.
일부 실시형태에서, 분말은 또한 역치 크기 미만의 분말 알갱이를 선택하기 위해 기계적 또는 다른 수단에 의해 분리될 수 있다. 크기에 따라 분말을 분리하는 이러한 방법 중 하나는 체질일 수 있지만, 대안적인 방법도 또한 사용될 수 있다. 분말이 2개 이상의 성분 분말(즉, 탄수화물 분말 및/또는 케이킹 방지제)을 포함하는 경우, 이들 입자 처리 방법은 성분 분말을 혼합하기 전 및/또는 후에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말 중의 입자 크기는 단일 층의 분말 층 높이에 영향을 미칠 수 있으며, 분말 층 높이는 3차원 구조의 최종 해상도에 영향을 미칠 수 있다. 비-소결된 분말의 각각의 추가 층의 분말 층 높이가 너무 두꺼운 경우(즉, 분말을 너무 많이 함유하는 경우), 분말은 완전히 융합되지 않을 수 있다. 완전히 융합되지 않은 분말은 성장함에 따라 3차원 구조에 적절하게 첨가되지 않을 수 있으며, 따라서 연속적인 3차원 구조를 형성하는 과정이 실패할 수 있다. 대조적으로, 새로 추가된 각 층이 너무 얇은 경우(즉, 분말이 충분하지 않은 경우), 레이저가 이전 층을 과도하게 소결할 수 있으며, 이는 최종 기하학을 바람직하지 않게 변경할 수 있다.
분말은 자유 유동하여 하나 이상의 실시형태에 따라 소결을 통해 구조 재료로 성공적으로 형성될 수 있는 분말 층 높이(과립 형태일 때)를 갖는 층을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말 층 높이는 250 μm 미만(예를 들어, 225 μm 미만, 210 μm 미만, 200 μm 미만, 175 μm 미만, 150 μm 미만, 등)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말 층 높이는 또한 100 μm 초과(예를 들어, 110　μm 초과, 120　μm 초과, 125　μm 초과, 150　μm 초과)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말 층 높이는 100 μm 내지 250 μm의 범위(예를 들어, 100 μm 내지 225 μm의 범위; 125 μm 내지 225 μm의 범위; 125 μm 내지 200　μm의 범위; 100 μm 내지 200 μm의 범위; 100 μm 내지 175 μm의 범위, 등)일 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따른, 소결 또는 용융에 의한 분말 고형화
SLS는 일부 실시형태에서 사용될 수 있는 분말 층에 집중된 에너지 빔으로 2차원 패턴을 추적함으로써 구조 재료를 형성하는데 사용될 수 있는 다용도 형태의 3D 인쇄이다. 상기 방법의 일부 실시형태는 분말, 예를 들어 위에서 논의된 분말을 고형화시키기 위해 SLS를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말은 3차원 구조의 형태일 수 있는 구조 재료의 고체를 형성하기 위해 소결되거나 용융될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 3차원 구조는 템플릿으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, SLS에 사용되는 에너지 빔은 레이저 빔일 수 있다. 생성된 구조 재료의 SLS 과정 및 특성이 아래에 자세히 설명되어 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 에너지 빔을 통해 전송되는 전자기 방사선을 흡수함에 따라 구조 재료를 형성하기 위해 SLS 동안 융합(예를 들어, 열로 인해 용융 또는 소결)될 수 있다. 이를 위해, 일부 실시형태에서, 구조 재료는 분말이 에너지 빔으로 조사될 때 형성된다. 따라서, 2차원 에너지 빔의 경로는 분말 영역을 융합시켜 구조 재료를 형성할 수 있다. 제3 차원에서 순차적인 층을 패턴화하면 3차원 구조를 형성하기 위해 모든 3차원에서 구조 재료를 함께 융합할 수 있다. 따라서, 3차원 구조는 층별 방식으로 이러한 과정을 반복함으로써 제조될 수 있으며, 이에 의해 전력 시스템의 소결되지 않은 층이 이전에 융합된 층 위에 펼쳐질 수 있고 3차원 구조에 추가하기 위해 에너지 빔에 노출됨으로써 패턴화될 수 있다.
도 5a 내지 5d는 하나 이상의 실시형태에 따른, SLS를 통한 3차원 인쇄 과정의 개략도를 도시한다. 이러한 각 단계는 아래에서 간략하게 설명하고 추가로 자세히 설명된다.
도 5a는 인쇄될 3차원 구조의 컴퓨터(25)에 의해 수행되는 디지털 렌더링(23)을 도시한다.
도 5b는 3개의 2차원 디지털 슬라이스(27)로 변환되는 컴퓨터(25)의 디지털 렌더링(23)을 도시한다. 이러한 디지털 슬라이스(27)는 레이저가 SLS 동안 분말을 3차원 구조로 고형화시킬 수 있는 위치에 대응한다.
도 5c는 SLS를 통한 필라멘트 네트워크의 층별 제조의 일부로서 분말 분배를 도시한다.
여기서, SLS 시스템(2)은 스테이지(6), 분말 저장소(29), 및 체(31)를 갖는다. SLS 시스템(2)은 부분적으로 필라멘트 네트워크(5)를 형성한다. 분말 저장소(29)는 분말(1)을 저장한다. 체(31)는 에너지 빔에 의한 융합/용융에 대비하여 스테이지(6) 상에 분말(1)의 분말 층(33)을 분배한다. 스테이지(6)는 z-스테이지, x-y 스테이지, 또는 x-y-z 스테이지일 수 있다(여기서 z-방향은 체(31)로부터 분말 저장소(29)의 유동 방향으로 정의됨).
여기에 도시되지는 않았지만, 체(31), 스테이지(6), 또는 둘 모두는 마이크로전자 제어기에 의해 제어될 수 있다. 마이크로전자 제어기는 SLS(2)의 하나 이상의 양태, 예를 들어 분말(1)의 스테이지(6)로의 유속 또는 위치 분말(1)이 스테이지(6)로 분배되는 것을 제어할 수 있다. 이러한 마이크로전자 제어기는 분말 층(33)의 하나 이상의 양태, 예를 들어, 분말 층(33) 두께를 제어할 수 있다. SLS 시스템(2) 내의 마이크로제어기에 대한 추가 세부사항이 추가로 논의된다.
도 5d는 SLS를 통한 필라멘트 네트워크의 층별 제조의 일부로서 레이저 패턴화를 도시한다.
여기서, SLS 시스템(2)은 또한 레이저(3)를 포함한다. 레이저(3)는 분말 층(33)을 소결/융합하여 필라멘트 네트워크(5)에 추가한다.
여기에 도시되지는 않았지만, 레이저(3), 스테이지(6), 또는 둘 모두는 마이크로전자 제어기에 의해 제어될 수 있다. 마이크로전자 제어기는 SLS(2)의 하나 이상의 양태, 예를 들어 레이저(3)의 다양한 특성 또는 위치 레이저(3)가 분말 층(33)을 소결하는 것과 같은 것을 제어할 수 있다. 이러한 마이크로전자 제어기는 분말 층(33)의 하나 이상의 양태, 예를 들어 분말 층(33) 두께를 제어할 수 있다. SLS 시스템(2) 내의 마이크로제어기에 대한 추가 세부사항이 추가로 논의된다.
SLS 제조를 시작하기 전에, 3D 모델은 일부 실시형태에서 컴퓨터-지원 설계(CAD: computer-aided design) 소프트웨어를 사용하여 디지털 방식으로 렌더링될 수 있다. 그런 다음 이러한 렌더링은 예를 들어 SLS 시스템이라고 하는 컴퓨터-지원 3D 인쇄 플랫폼과 호환되는 ".STL" 파일과 같은 파일로 내보내질 수 있다. 이 SLS 파일은 위에서 설명한 SLS 시스템의 다양한 작업에 필요한 정확한 지침으로 CAD의 3D 모델을 변환하는데 도움이 될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 그러한 하나의 포맷은 스테레오리소그래피(.stl) 포맷일 수 있다.
SLS 파일은 또한 3D 모델을 일련의 2D 단면 슬라이스로 슬라이싱하여 변환할 수 있는 추가 소프트웨어에 의해 처리될 수 있으며, 각각은 예를 들어 분말의 한 층을 패턴화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 소결 동안 SLS 시스템의 거동을 지배하는 이러한 슬라이싱 과정 동안 파라미터가 지정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 에너지 빔의 속도 및/또는 전력 및/또는 각 층의 높이는 하나 이상의 소프트웨어 프로그램에 의해 설정되고/되거나 맞춤화될 수 있다. 일련의 2D 슬라이스는 일부 실시형태에서 G-코드 언어일 수 있는 최종 형식으로 표현되는 SLS 시스템에 대한 일련의 명령으로 표현될 수 있다. 일련의 명령은 일부 실시형태에서 임의의 다른 명령과 함께 에너지 빔을 특정 지점으로 또는 특정 경로를 따라 이동시키고, 인쇄 플랫폼을 낮추고/낮추거나 분말 분배기를 이동시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, SLS 시스템에 대한 일련의 명령은 SLS 시스템에 의한 적절한 해석을 보장하기 위해 탄수화물 분말의 SLS에 대해 특별히 명령을 최적화할 수 있고/있거나 에너지 빔 출력 밀도/에너지 빔 스캔 속도 설정을 지정할 수 있도록 하는 맞춤형-개발 프로그램에 의해 추가로 수정될 수 있다.
본 개시내용의 실시형태에 따라, 탄수화물 분말을 포함하는 분말로부터 구조 재료로 만들어진 3차원 구조의 생산은 SLS 시스템으로 수행될 수 있다. 이러한 SLS 시스템은 적층 제조를 사용하여 일련의 명령에 따라 층별 방식으로 분말에서 3차원 구조를 생성하는 자동화된 컴퓨터-지원 3D 인쇄 플랫폼일 수 있다. 에너지 빔의 공간 위치화를 정밀하게 제어하기 위해, SLS 시스템의 에너지 빔이 갠트리(gantry) 또는 기타 메커니즘에 장착될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, SLS 시스템은 또한 z-방향으로 자유롭게 이동하는 인쇄 플랫폼을 포함할 수 있으므로, 예를 들어 분말 층이 소결된 후 아래쪽으로 진행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분말 호퍼(hopper)로부터 계량된 양의 소결되지 않은 분말을 증착시킨 다음 분배기를 사용하여 상기 계량된 양의 소결되지 않은 분말을 평활화함으로써 분말의 다음 층이 인쇄 플랫폼 위에 형성될 수 있다.
SLS 과정은 다양한 작업을 담당하는 모터, 밸브, 메커니즘 등을 제어하는 SLS 시스템의 마이크로전자 제어기에 의해 조정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 작업은 예를 들어 다음 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 에너지 빔의 출력을 위치 지정, 조준, 및 제어; 인쇄 플랫폼 위치 지정 및 이동; 분말 호퍼의 메커니즘 위치 지정 및 제어, 분배기 위치 지정 및 결합; 및 분말을 고체로 융합시키는 기타 작업.
일부 실시형태에서, SLS 세트를 사용하는 고형화는 인쇄 플랫폼 상에 수동으로 증착되고 사용자에 의해 레벨링되는 분말의 제1 층으로 시작될 수 있다. 일단 분말의 제1 층이 인쇄 플랫폼 상에 있으면, 분말의 제1 층이 에너지 빔(예를 들어, 레이저)에 의해 패턴화될 수 있고, 이어서 호퍼로부터 증착될 수 있는 분말의 제2 층 등이 뒤따를 수 있도록 일련의 명령이 연속적으로 실행될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 제1 층은 제1 층을 분배하는 것이 일련의 명령 중 제1 명령이 되도록 SLS 시스템에 의해 기계적으로 계량되고 분배될 수 있다.
일부 실시형태에서, 분말은 스테이지 위에 매달린 분말 저장소에 연결된 체를 흔들어 후속 층에 추가될 수 있다. 일부 실시형태는 분말을 분배하기 위해 (예를 들어, 체의) 흔들기 동작을 사용할 수 있다. 이러한 흔들림 운동은 분말을 통기시키고/시키거나 분말의 압축을 감소시킬 수 있다. 부유된 저장소로부터 분말을 분배한 후, 일부 실시형태에서, 분말의 분배된 양은 대략 동일한 층 두께를 갖는 분말 층으로 확산될 수 있다. 분말의 분배된 양의 분배는 예를 들어 역회전 롤러에 의해 수행될 수 있다. 마지막으로, 일부 실시형태에서, 과잉 분말(즉, 분말 층을 형성하는데 필요한 것보다 더 많은 것을 의미함)이 제거되고(예를 들어, 플로우(plow) 메커니즘에 의해) 재분배를 위해 수집될 수 있다. 과잉 분말은 눈에 띄는 인쇄 품질 저하 없이 여러 번(예를 들어, 수십에서 수백 번) 재분배될 수 있다.
SLS 시스템은 최종 기하학이 소결될 때까지 분말의 마지막 층을 패턴화하는 것과 분말의 다음 층을 증착하는 것 사이를 교대로 수행할 수 있다.
SLS를 통해 형성된 3차원 구조의 외관 및 품질은 레이저 출력 밀도, 레이저 스캐닝 속도 및/또는 분말 층 높이를 포함하는 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 하나 이상의 실시형태에 따르면, 이러한 설정을 적절하게 제어하면 분말을 일관되게 소결하여 3차원 구조를 생성시킬 수 있다. 이와 같은 요소의 부적절한 값(또는 값의 조합)은 특성의 해상도를 낮추고, 의도하지 않은 특성을 추가하고, 의도한 특성을 빼고, 분말을 완전히 융합하지 못하고, 볼링 결함(balling defect)을 생성하고, 최종 3차원 구조를 왜곡시키고, 공동(cavity) 및/또는 의도한 최종 기하학에 대한 기타 원치 않는 변경을 추가함으로써 의도된 3차원 구조와 상이한 최종 기하학을 생성할 수 있다.
당업자는 레이저 출력 밀도와 레이저 스캐닝 속도가 서로 연관될 수 있음을 깨달을 것이다. 예를 들어, 느린 스캐닝 속도로 움직이는 저출력 레이저는 여전히 영역에 과도한 출력을 부여할 수 있다. 과도한 출력은 의도한 최종 기하학에 대한과도한 소결, 왜곡, 공동, 및/또는 기타 원치 않는 변경을 유발할 수 있다.
과-소결은 의도된 패턴 외부에 있는 입자가 의도된 최종 기하학을 형성하기 위해 융합되는 의도된 패턴 내의 입자와 함께 융합되는 경우이다. 과도한 소결은 z-축(즉, 빌드 축) 및/또는 x-축/y-축(즉, 평면 축)에서 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 과-소결은 연속적인 분말 층 사이에 과도한 융합을 야기할 수 있으며, 이는 빌드 축을 따라 최종 기하학의 해상도를 낮출 수 있고/있거나 빌드 및/또는 평면 축에 의도하지 않은 특징을 추가할 수 있다.
레이저 출력 밀도가 너무 높고/높거나 레이저 스캐닝 속도가 너무 낮을 경우, 과-소결과 같은 최종 기하학에 대한 바람직하지 않은 변경이 발생할 수 있다. 또한, 낮은 레이저 스캐닝 속도는 분말이 소결되는 동안 불규칙한 용융 풀을 유발할 수 있다. 불규칙한 용융 풀은 왜곡 및/또는 공동과 같은 의도된 최종 기하학에 원하지 않는 추가 변경을 초래할 수 있다.
대안적으로, 레이저 출력 밀도가 너무 낮고/낮거나 레이저 스캔 속도가 너무 빠른 경우, 분말은 연속적으로 융합된 최종 3차원 구조를 형성하지 못할 수 있다. 이러한 환경은 일부 실시형태에서 때때로 SLS에서 볼 수 있는 볼링 결함을 유발할 수 있다: 불충분하게 용융되면, 일부 분말이 최종 3차원 구조를 형성하는 대신 연결되지 않은 구로 볼링(ball up)될 수 있다.
일부 실시형태에서, 주어진 분말에 대해, 필라멘트의 폭은 레이저 출력, 병진 속도(translation speed), 또는 둘 모두의 함수일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태는 필라멘트 치수를 제어하기 위해 레이저 출력, 병진 속도, 또는 둘 모두를 제어할 수 있다.
일부 실시형태에서, 병진 속도와 필라멘트 직경 사이의 음의 상관관계와 대략적인 선형 관계가 있을 수 있다. 도 6 및 7은 병진 속도와 필라멘트 직경 사이의 관계가 음의 상관관계를 갖는 대략적으로 선형인 실시형태를 입증한다. 음의 상관관계는 레이저 속도가 증가함에 따라 필라멘트 폭이 감소한다는 점에서 도 6 및 7에서 명백하다. 도 6은 45 와트/평방 밀리미터(W mm-2)의 고정된 출력 밀도로 제조된 다중 필라멘트를 포함하는 3차원 구조의 사진이다. 각각의 연속 필라멘트의 병진 속도를 500 내지 2,750 밀리미터/분(mm 분-1)으로 증가시키면, 필라멘트의 직경이 800 μm에서 400 μm로 감소하였다(스케일 바 = 1 mm). 도 6은 각각의 3차원 구조를 제조한 후 캡쳐한 5개의 이미지를 대표 이미지로 나타낸 것이다. 도 7은 이들 5개의 3차원 구조(도 6 포함)에 대한 필라멘트 폭 대 레이저 속도를 수치적으로 나타낸 그래프이다. 이러한 그래프는 45 Wmm-2의 고정된 출력 밀도에서 400 내지 800 μm에 이르는 영역(regime)에서 병진 속도와 필라멘트 직경 사이의 음의 상관관계와 대략적인 선형 관계를 보여준다. 그래프는 평균 필라멘트 폭과 n = 5 인쇄 실행에 대한 표준 편차를 보여준다.
일부 실시형태에서, 레이저 출력 밀도는 20 내지 100　W/mm, 예컨대 40 내지 60　W/mm2의 범위(예를 들어, 45　W/mm2 내지 60　W/mm2의 범위, 40　W/mm2 내지 55　W/mm2의 범위, 45　W/mm2 내지 55　W/mm2의 범위, 40　W/mm2 내지 50　W/mm2의 범위, 또는 50　W/mm2 내지 60　W/mm2의 범위)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 레이저 스캐닝 속도는 200 내지 4000 mm/분, 예컨데 1000 mm/분 내지 2000 mm/분의 범위(예를 들어, 1250 mm/분 내지 2000 mm/분의 범위, 1250　mm/분 내지 1750 mm/분의 범위, 1000 mm/분 내지 1750 mm/분의 범위, 1250 mm/분 내지 2000 mm/분의 범위, 1500 mm/분 내지 2000 mm/분의 범위, 또는 1000 mm/분 내지 1500 mm/분의 범위)일 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따른 SLS 시스템을 사용하여, 이질적인 3차원 분기, 매끄러운 곡률, 및 지지되지 않는 기하학적 구조를 나타내는 3차원 구조가 제조될 수 있다. 예를 들어, 도 8a 및 8b(스케일 바 = 10 mm)는, 하나 이상의 실시형태에 따른, 이소말트 및 30 질량 퍼센트(w%) 옥수수전분 재료의 혼합물을 포함하는 분말의 SLS를 사용하여 제조된 구조 재료로 형성된 3차원 구조의 사진이다. 도 8a 및 8b의 구조는 매끄러운 곡률, 계층적 분기 및 지지되지 않는 오버행을 나타내며, 이들 모두는 포유동물 맥관구조의 아키텍처 모티프이다.
본원에 기술된 하나 이상의 실시형태를 통해 생성된 상호 연결된 맥관 네트워크와 같은 3차원 구조의 최종 기하학의 해상도는 SLS 시스템의 해상도에 의해 제한될 수 있다. SLS 시스템의 해상도는 하나 이상의 실시형태에 따라 형성된 소결 필라멘트의 대략적인 최소 직경을 정의할 수 있는, 에너지 빔의 광학(optics)(예를 들어, 레이저 스폿 크기)과 같은 인자에 의해 제한될 수 있다. 일부 실시형태에 따라 더 작은 필라멘트를 포함하는 최종 기하학을 생성할 수 있는 레이저 스폿 크기를 줄이기 위해 대안적인 광학장치가 활용될 수 있다. 추가적으로, SLS 시스템의 해상도는 분말 층의 두께에 의해 제한될 수 있으며, 이는 분말의 직경에 의해 제한될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에 따르면, 더 얇은 분말 층, 및 그에 따라 더 미세하게 분쇄된 분말은 더 작은 필라멘트를 포함하는 최종 기하학을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 필라멘트는 300 μm(예를 들어, 200 μm, 100 μm, 50 μm, 10 μm, 또는 1 μm)의 최소 직경을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 필라멘트(에너지 빔의 단일 패스(pass)에 의해 형성됨)는 1 mm(예를 들어, 5 mm, 10 mm, 50 mm, 100 mm, 또는 500 mm)의 최대 직경을 가질 수 있다.
도 8a 및 도 8b에 묘사된 실시형태에서와 같이, 케이킹 방지제를 함유하는 분말로부터 형성된 3차원 구조는 최종 구조에서 케이킹 방지제 및 탄수화물 분말을 모두 포함할 수 있다. 달리 말하면, 일부 실시형태에서, 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제를 포함하는 분말의 SLS 동안 발생하는 에너지 빔 조사는 최종 3차원 구조로 고형화하는 동안 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제 둘 모두를 소결하고/소결하거나 용융시킬 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따라, 본원에 묘사된 바와 같은 이소말트 또는 이소말트 + 옥수수전분으로 제조된 소결 구조 재료는 강성이고 부서지기 쉬우며, 압출된 탄수화물 유리와 동일한 정도의 영률(Young's modulus)을 갖는다. 이러한 구조 재료는 자체 무게를 지지하고 여러 후처리 단계를 견디고/견디거나, 실험실 간에 운송될 수 있을 만큼 충분히 견고할 수 있다.
도 9에 도시되고 아래 표에 요약된 바와 같이, 소결된 탄수화물은 압축 하에 강성이고 부서지기 쉬우므로, 자가-지지되게 하고 광범위한 취급, 다중 코팅 단계, 및 점성 예비-중합체 용액 내부 캐스팅에 적합하다.
도 9는 이러한 방법의 실시형태에 따른 고체 탄수화물 실린더 및 거대다공성 탄수화물 실린더의 일축 압축 동안 수집된 응력(메가파스칼(MPa) 단위) 대 변형률(연신율(%) 단위)의 그래프를 도시한다. 도 9는 또한 상응하는 응력 대 변형률 곡선에 인접하게 위치된 인셋으로서 각각의 기하학의 개략도를 도시한다. 영률(MPa 단위)은 선형 영역에서 응력-변형률 곡선의 기울기로 측정되었고, 항복 응력(MPa 단위)은 파손 전 피크 응력 값으로 측정되었으며, 항복 변형률(%)은 해당 변형률로 측정되었다. 표 1에서 첨부된 결과는 n=11개의 고체 실린더와 3개의 독립적인 인쇄 실행에 걸쳐 제조된 9개의 실린더형 격자를 요약한 것이다.
고체 실린더 실린더형 격자
영률(MPa) 580±200 640±280
항복 응력(MPa) 19±9.0 30±4.9
항복 변형률(%) 6.9±1.4 2.9±0.7
하나 이상의 실시형태에 따라 고형화된 3차원 구조는 자체 중량을 지지할 수 있고 부서지기 쉽고 강성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 구조 재료로 제조된 3차원 구조는 200 MPa 내지 1000 MPa의 범위(예를 들어, 500 MPa 내지 1000 MPa의 범위, 500 MPa 내지 700 MPa의 범위), 예를 들어 약 600 MPa인 영률을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 구조 재료로 형성된 3차원 구조는 복수의 필라멘트로 형성될 수 있는 필라멘트 네트워크, 3차원적으로 분지된 패턴, 상호 침투하는 기하학, 및/또는 지지되지 않는 기하학으로 형성될 수 있는 필라멘트 네트워크의 형태를 취할 수 있다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시형태에 따른 재료 및/또는 방법은 3차원 구조 및 따라서 다양한 자유형태 구조 및/또는 패턴화된 유체 네트워크를 포함할 수 있는 최종 기하학을 제조하기 위해 적용될 수 있다.
구조 재료는 하나 이상의 실시형태에 따라 액체와의 상호작용 시 용해되고/되거나 분해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 액체는 비제한적으로 물, 식염수, 또는 인산염 완충 식염수(PBS: phosphate buffered saline) 중 하나 이상을 포함할 수 있거나 이를 이용할 수 있다. 고형화 후, 3차원 구조는 아래에서 논의되는 하나 이상의 실시형태에 따라, 희생 템플레이팅을 위한 템플릿으로 사용할 준비가 될 수 있다.
3차원 구조는 하나 이상의 실시형태에서 희생 템플레이팅에 사용하기 전에 여러 주 동안 저장될 수 있도록 환경적으로 안정적일 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따른, 표면 평활화
본 개시내용의 실시형태에 따른 SLS 후, 3차원 구조의 표면은 처음에 높은 표면 거칠기를 가질 수 있다. 이러한 표면 거칠기는 부분적으로 분말의 과립이 느슨하게 부착된 3차원 구조의 장식으로 인한 것일 수 있다. 이러한 느슨하게 부착된 과립을 제거하고/하거나 표면 거칠기를 줄이기 위해, 3차원 구조는 평활화 용액으로 표면 평활화를 거칠 수 있다. 평활화 용액은 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 평활화 용액은 용매를 포함할 수 있다. 평활화 용액과 3차원 표면 사이의 접촉은 조정될 수 있다. 일부 실시형태에 따른 표면 평활화 후, 3차원 구조의 표면 거칠기는 더 평활한 표면 토포그래피로 인해 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 평활화는 3차원 구조의 크기 및/또는 질량을 변경할 수 있다. 표면 평활화의 일부 실시형태는 3차원 구조의 외부에 추가적인 탄수화물 코팅을 증착할 수 있다. 평활화 용액의 양태는 아래에 자세히 설명되어 있다.
일부 실시형태에서, 평활화 용액은 탄수화물을 포함할 수 있다. 평활화 용액에 사용되는 탄수화물은 비제한적으로 일부 실시형태에서, 이소말트, 덱스트란, 수크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스, 메이플 시럽, 및/또는 사탕수수 시럽을 포함할 수 있다. 또한, 평활화 용액의 일부 실시형태는 2개 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 평활화 용액에서 사용되는 탄수화물은 처리될 3차원 구조를 제조하는데 사용되는 분말에 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
일부 실시형태에 따른 평활화 용액은 하나 이상의 용매를 포함할 수 있다. 용매는, 하나 이상의 실시형태에서, 비제한적으로 물 및/또는 유기 용매를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 평활화 용액은 평활화 용액이 용해되지 않거나 3차원 구조를 바람직하지 않게 변경하지 않도록 평활화 용액에 포함된 하나 이상의 탄수화물의 충분히 높은 농도를 가질 수 있다.
3차원 구조는 일부 실시형태에서 세척, 분무, 또는 침지 방법을 통해 평활화 용액과 접촉될 수 있다. 3차원 구조와 평활화 용액 사이의 접촉은 접촉 시간 동안 계속될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉 시간 및/또는 접촉 방법은 느슨한 과립을 제거하고 3차원 구조의 표면을 평활화하기에 접촉이 충분하도록 조정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉 시간 및/또는 접촉 방법은 접촉이 용해되지 않거나 3차원 구조를 바람직하지 않게 변경하지 않도록 조정될 수 있다.
예를 들어, 도 10a 및 10b는 본원에서 실시형태에 따른 표면 평활화 전(도 10a) 및 표면 평활화 후(도 10b) SLS를 통해 형성된 3차원 구조의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 10a는 전술한 하나 이상의 실시형태에 따른 분말의 SLS를 통해 형성된 필라멘트의 형상을 갖는 3차원 구조의 주사 전자 현미경 사진이다. 육안 검사 시, 도 10a는 현저한 표면 거칠기를 나타낸다. 이러한 표면 거칠기는 표면을 장식하는 부분적으로 융합된 분말 과립 때문일 수 있다. 스케일 바는 200 μm(확대 보기) 및 1 mm(삽입)이다.
도 10b는 평활화 용액으로 표면 평활화 후 동일한 필라멘트의 주사 전자 현미경 사진이다. 구체적으로, 도 10a에 도시된 필라멘트는 본 개시내용의 실시형태에 따라 농축된 이소말트 용액(수중 60 중량%(wt%) 이소말트)으로 구성된 평활화 용액으로 처리되었다. 표면 평활화 후, 필라멘트는 도 10b와 같이 재이미지화되었다. 육안 검사 시, 도 10b는 낮거나 중간 정도의 표면 거칠기를 나타낸다. 도 10a에서와 같이, 도 10b에 대한 스케일 바는 200 μm(확대 보기) 및 1 mm(삽입)이다.
하나 이상의 실시형태에서, 표면 평활화는 3차원 구조를 대체로 그대로 둘 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 표면 평활화는 전체 아키텍처를 크게 변경하지 않을 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 표면 평활화는 3차원 구조의 영역을 크게 가교하지 않을 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 표면 평활화는 표면 거칠기를 감소시킬 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 표면 평활화는 3차원 구조로부터 분말의 느슨한 과립을 제거할 수 있다. 상기 특징은 일부 실시형태에 따른 표면 평활화 이전(도 10a) 및 이후(도 10b)에 취한 필라멘트의 현미경 사진을 비교함으로써 입증된다. 구체적으로, 도 10a 및 10b의 비교는 전체 아키텍처를 크게 변경하거나 필라멘트를 가로질러 가교하지 않고도 표면 거칠기를 감소시키는 표면 평활화를 나타낸다.
도 10a 및 도 10b에 도시된 필라멘트 표면 거칠기의 시각적으로 명백한 개선 외에, 표면 평활화의 일부 실시형태는 하기 정량화가능한 방식 중 하나 이상으로 필라멘트를 변경할 수 있다: 표면 거칠기 감소, 필라멘트 폭 감소, 또는 필라멘트 질량 증가. 도 11a 내지 11d는 본 개시내용의 실시형태에 따라 표면 거칠기(Ra)(도 11a), 필라멘트 폭(도 11b 및 11c) 및 필라멘트 질량(도 11d)에 대한 표면 평활화의 영향을 수치적으로 도시한다. 도 11a, 11b 및 11d에 도시된 데이터는 n=9(도 11a), n=24(도 11b), 및 n=7(도 11d)에 대한 평균 ± 표준 편차이다. 도 11a 및 11b의 경우, 짝비교 t-검정에 대해 p<0.001이다. 도 11c의 경우, 대응 t-검정에 대해 p<0.01이다.
표면 평활화의 일부 실시형태는 감소된 평균 표면 거칠기를 초래할 수 있다. 이를 위해, 도 11a는 본 개시내용의 실시형태에 따른 표면 평활화 후 필라멘트에 대한 Ra의 거의 2배 감소를 나타낸다.
표면 평활화의 일부 실시형태는 3차원 구조의 감소된 크기를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 도 11b에서와 같이, 이러한 크기 변화는 표면 평활화 전후의 필라멘트 폭의 측정치를 반영할 수 있다. 이를 위해, 도 11b는 본 개시내용의 실시형태에 따른 표면 평활화 후 100 μm 내지 200 μm의 필라멘트 폭의 감소를 나타낸다. 일부 실시형태는 3차원 구조의 기하학에 의존할 수 있는 크기 변화를 정량화하기 위해 대안적인 메트릭을 전개할 수 있다. 또한, 도 11c는 레이저 속도(mm/분 단위)의 함수로서 표면 평활화로부터의 필라멘트 폭(μm 단위)의 변화 그래프이다. 도 11c는 표면 평활화가 필라멘트의 직경을 거의 일정한 양, 대략 100 μm만큼 감소시킨다는 것을 보여준다.
표면 평활화의 일부 실시형태는 3차원 구조의 증가된 질량을 초래할 수 있다. 이를 위해, 도 11d는 본 개시내용의 실시형태에 따른 표면 평활화 후 필라멘트 질량이 10% 내지 20% 증가한 것을 보여준다.
일부 실시형태에서, 표면 평활화는 3차원 구조의 외부에 추가적인 탄수화물 코팅을 증착할 수 있다. 이러한 추가된 탄수화물 코팅은 표면 평활화 이전의 3차원 구조와 비교하여 동일하거나 상이한 조성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 3차원 구조는 추가 단계를 거치기 전에 위에서 논의된 바와 같이 평활화 용액에 대한 노출을 통해 표면 평활화를 겪을 수 있다. 다른 실시형태에서, 3차원 구조는 추가 단계를 거치기 전에 표면 평활화를 겪지 않았을 수 있다. 하나 이상의 실시형태에 따른 3차원 구조는 전술한 바와 같이 평활화된 표면을 더 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따른, 표면 코팅
3차원 구조의 조기 용해를 방지하고/하거나 3차원 구조와 매트릭스 재료에 포함될 수 있는 세포 사이에 장벽을 설정하기 위해, 상기 방법의 하나 이상의 실시형태는 3차원 구조를 표면 코팅 재료로 표면 코팅하는 단계를 포함한다. 따라서, 하나 이상의 실시형태에 따르면, 3차원 구조는 표면 코팅 재료를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 표면 코팅 재료는 3차원 구조의 영역 사이의 공간을 다시 채우지 않고/않거나 3차원 구조의 모양을 실질적으로 변경하지 않고 표면을 코팅할 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 표면 코팅 재료는 빈 공간을 크게 다시 채우지 않을 수 있다. 표면 코팅의 양태는 하기 자세히 설명되어 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 표면 코팅 재료는 중합체 용액을 포함할 수 있다. 중합체 용액은 비제한적으로, 폴리카프로락톤, 폴리(L-락타이드), 폴리락트산, 폴리(락트 co-글리콜산), 플루로닉 패밀리의 구성원을 포함하는 양친매성 공-중합체, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 에스터- 또는 에터- 유도체를 포함하는 양친매성 공-중합체, 콜라겐, 젤라틴, 제인, 기(ghee), 셸락, 전분, 왁스, 또는 바셀린을 포함할 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 표면 코팅 재료는 하나 이상의 중합체 용액을 포함할 수 있다.
표면 코팅 재료의 일부 실시형태는 하나 이상의 용매를 포함할 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 표면 코팅 재료는 디클로로메탄 및/또는 클로로폼을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표면 코팅은 예를 들어 다른 코팅 기술 중에서, 침지 방법(침지 + 용매 증발)에 의해 적용될 수 있다.
표면 코팅 재료의 일부 실시형태는 소수성 재료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 코팅 재료는 소수성 중합체를 표면 코팅으로서 포함할 수 있다. 소수성 중합체는 비제한적으로, 폴리카프로락톤, 폴리(l-락타이드), 폴리락트산, 폴리(락트 co-글리콜산), 콜라겐, 젤라틴, 제인, 셸락, 전분, 왁스, 또는 바셀린을 포함할 수 있다. 표면 코팅은 하나 이상의 소수성 중합체를 포함할 수 있다. 소수성 중합체는 하나 이상의 용매, 예컨대 디클로로메탄 및/또는 클로로폼 중에 용해될 수 있다.
다른 실시형태에서, 표면 코팅 재료는 친수성 및 소수성 작용기 둘 모두를 비롯하여, 양친매성 재료일 수 있다. 양친매성 재료는 비제한적으로, 상기 포함된 양친매성 재료, 예컨대 플루로닉(폴리(프로필렌 옥시드)와 폴리(에틸렌 옥시드)의 블록 공-중합체) 및 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)에 접합된 소수성 분자, 예컨대 PEG-스테아레이트, PEG-올리에이트, PEG-라우레이트, PEG-캐스터유, 또는 PEG-미리스테이트를 포함할 수 있다. 표면 코팅은 하나 이상의 양친매성 재료를 포함할 수 있다. 양친매성 재료는 하나 이상의 용매, 예컨대 디클로로메탄(DCM) 및/또는 클로로폼 중에 용해될 수 있다. 이러한 용매는 예를 들어, 딥 코팅의 경우 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 3차원 구조는 추가 단계를 거치기 전에 상기 논의된 바와 같이 표면 코팅 재료에 대한 노출을 통해 표면 코팅을 거칠 수 있다. 다른 실시형태에서, 3차원 구조는 추가 단계를 거치기 전에 표면 코팅을 거치지 않을 수 있다. 하나 이상의 실시형태에 따른 3차원 구조는 전술한 바와 같은 표면 코팅을 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따라, 고형화된, (선택적으로) 표면 평활화된, 그리고 (선택적으로) 표면 코팅된 3차원 구조는 부서지기 쉽고 강성일 수 있으며, 따라서 자체 중량을 계속 지지할 수 있을 수 있다. 3차원 구조는 하나 이상의 실시형태에서 사용하기 전에 여러 주 동안 저장하기에 충분히 환경적으로 안정할 수 있다. 고형화, (선택적인) 표면 평활화, 및 (선택적인) 표면 코팅 후에, 3차원 구조는 하기 논의되는 하나 이상의 실시형태에 따라 희생 템플레이팅을 위한 템플릿으로 사용될 수 있다.
실시형태에 따른, 빈 공간의 다시 채우기
다음으로, 3차원 구조는 3차원 구조를 매트릭스 재료로 둘러싸서 매트릭스 재료가 고형화되도록 함으로써 매트릭스 재료로 둘러싸일 수 있다. 따라서, 3차원 구조의 빈 공간은 매트릭스 재료로 다시 채워질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 3차원 구조는 SLS-CaST 방법을 위한 템플릿 역할을 할 수 있다. 다시 채우기의 양태는 아래에 자세히 설명되어 있으며, 예는 도 12a 내지 12f에 추가로 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 직교 벌크 재료일 수 있다. 일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 임의의 생체재료, 엘라스토머, 플라스틱, 하이드로겔, 생체재료, 실리콘, 또는 일부 다른 경화성 재료, 또는 하나 이상의 이러한 재료의 혼합물일 수 있다.
매트릭스 재료의 일부 실시형태는 엘라스토머 및/또는 플라스틱일 수 있으며, 일부 실시형태에 따라, 이는 폴리디메틸실록산, 폴리카프로락톤 발포체, 에폭시-기반 매트릭스, 또는 임의의 이러한 재료의 단량체, 이량체, 또는 올리고머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 엘라스토머 및/또는 플라스틱은 이러한 엘라스토머 및/또는 플라스틱 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
매트릭스 재료의 일부 실시형태는 생체재료일 수 있으며, 일부 실시형태에 따라, 이는 폴리아미드, 폴리(2-히드록시 에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리우레탄, 콜라겐, 아가로스, 알부민, 알지네이트, 키토산, 전분, 히알루론산, 젤라틴, 피브린, 마트리겔, 글리세롤, 글리콜, 만니톨, 이노시톨, 자일리톨, 아도니톨, 글리신, 아르기닌, 생물학적 중합체 분자, 알부민, 펩티드 양친매성체, 또는 이들의 단량체, 이량체, 또는 올리고머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 생체재료는 이러한 생체재료 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 생체재료의 일부 실시형태는 고형화 후 가교 결합된 생체재료일 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 생체재료는 용액 중에 있을 수 있으므로 매트릭스 재료는 용매를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 용매는 물 또는 식염수일 수 있다.
일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 적어도 하나의 생체재료의 수용액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 수용액은 살아있는 세포의 현탁액을 추가로 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 맥관 네트워크는 2개 이상의 매트릭스 재료로 형성될 수 있으며, 각각의 매트릭스 재료는 빈 공간의 별개의 영역을 차지한다. 예를 들어, 서로 다른 재료의 층들이 서로 위에 캐스팅될 수 있다. 이러한 실시형태의 예가 더 상세히 설명된다.
하나 이상의 실시형태에서, 맥관 네트워크는 2개 이상의 유형의 살아있는 세포를 포함하는 매트릭스 재료로부터 형성될 수 있으며, 각각의 세포 유형은 빈 공간의 별개의 영역을 차지한다. 이러한 실시형태의 예가 더 상세히 설명된다.
하나 이상의 실시형태에서, 매트릭스 재료 및 표면 코팅 재료는 상이한 재료일 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 매트릭스 재료 및 표면 코팅 재료는 유사한 재료 또는 동일한 재료일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 캡슐화된 세포의 생존력(viability)에 악영향을 미치지 않으면서 세포-함유 재료와 호환될 수 있다. 따라서, 상기 방법의 일부 실시형태는 하나 이상의 실시형태에서 세포독성 시약 또는 조건을 사용하지 않고 사용될 수 있다. 또한, 일부 실시형태에서, 매트릭스 재료, 구조 재료, (선택적인) 평활화 용액, 및 (선택적인) 표면 코팅 재료는 캡슐화된 세포의 생존력에 악영향을 미치지 않으면서 세포-함유 재료와 호환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 매트릭스 재료 및/또는 표면 코팅 재료는 살아있는 세포를 포함할 수 있다. 아래에 설명된 실험은 세포가 본 개시내용의 실시형태를 통해 형성된 패턴화된 혈관 근처에서 대사적으로 활성일 뿐만 아니라 세포가 시간이 지남에 따라 혈관 근처 영역에서 증식한다는 것을 보여주었다.
실시형태에 따른, 매트릭스 재료의 고형화
일부 실시형태는 단지 시간 경과에 따라 고형화되는 매트릭스 재료를 사용할 수 있고 따라서 추가적인 처리 단계를 필요로 하지 않을 수 있지만, 다른 실시형태는 추가적인 고형화 처리 후에 고형화되는 매트릭스 재료를 이용할 수 있다. 추가적인 고형화 처리는 비제한적으로 촉매 첨가, 광 경화, 열 경화, 및 효소 경화 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 추가적인 고형화 처리는 매트릭스 재료를 가교, 분지, 네트워크화하거나, 화학적으로 또는 물리적으로 변경하여 매트릭스 재료를 고형화시키고/시키거나 강성(stiffness), 강도(strength), 인성(toughness), 경도(hardness), 탄력성(resilience), 및/또는 내구성(durability)을 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 매트릭스 재료의 고형화(임의의 추가적인 고형화 처리 포함)는 매트릭스 재료가 내부에 배치되거나 내장된 구조 재료로 형성된 템플릿을 갖는 경우 성공적으로 완료될 수 있다. 매트릭스 고형화의 양태는 하기 보다 상세히 기술된다.
일부 실시형태는 단지 시간 경과에 따라 고형화되는 매트릭스 재료를 사용할 수 있다. 이러한 일부 실시형태는 매트릭스 재료를 고형화시키기 위한 추가적인 처리 단계를 필요로 하지 않을 수 있다. 이러한 실시형태의 정확한 고형화 메커니즘은 비제한적으로 매트릭스 재료 내의 하나 이상의 화학 반응 및 용매 증발을 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 매트릭스 재료의 고형화를 위해 촉매 첨가를 사용할 수 있다. 이러한 일부 실시형태는 경화 전에 촉매를 매트릭스 재료와 혼합해야 할 수도 있다.
일부 실시형태는 매트릭스 재료의 고형화를 위해 광 경화(광중합이라고도 함)를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 광 경화에 사용되는 전자기 방사선은 가시광선 또는 자외선(UV: ultraviolet light)을 포함할 수 있다. 구조 재료로 형성된 템플릿의 불투명함에도 불구하고, 전술한 하나 이상의 실시형태에 따르면, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA: Polyethylene glycol diacrylate)와 같은 광중합을 통해 매트릭스 재료를 고형화시키기 위해 템플릿 주위에서 광경화가 성공적으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태는 매트릭스 재료의 고형화를 위해 열 경화(열중합이라고도 함)를 사용할 수 있다. 하나 이상의 실시형태에 따르면, 아가로스와 같은 열적으로 가교 결합된 매트릭스 재료는 SLS-CaST와 호환될 수 있다.
일부 실시형태는 매트릭스 재료의 고형화를 위해 효소 경화를 사용할 수 있다. 이러한 일부 실시형태는 경화 전에 효소를 매트릭스 재료와 혼합해야 할 수도 있다. 이전 작업에서는 효소 중합된 실크 피브로인과 피브린 겔이 압출을 사용하여 패턴화하기 어렵다는 것을 보여주었다. 그러나, 실크 피브로인 및 피브린과 같은 효소 중합을 필요로 하는 매트릭스 재료는 본 개시내용의 하나 이상의 실시형태에 따라 SLS-CaST 방법과 완전히 호환될 수 있다.
매트릭스 재료를 고형화 및/또는 가교 결합하기 위한 다른 추가적인 고형화 처리가 또한 SLS-CaST 방법과 호환될 수 있다.
실시형태에 따른 템플릿 제거
구조 재료로 형성될 수 있는 3차원 구조 주위의 매트릭스 재료의 고형화 후에, 하나 이상의 실시형태에서, 3차원 구조는 매트릭스 재료 내에서 제거될 수 있다. 이러한 제거는 3차원 구조의 형태로 매트릭스 재료 내에 열린 공동을 생성하여 매트릭스 재료 내에 관류성 구획을 형성할 수 있다. 이러한 경우, 여기서의 3차원 구조는 템플릿 역할을 할 수 있다. 구조 재료는 전술한 바와 같이 SLS 방법의 실시형태를 통해 형성될 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따라, 매트릭스 재료 내로부터 템플릿의 제거는 액체로 구조 재료의 용해 및/또는 분해에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 액체는 비제한적으로 물, 식염수, 또는 인산염 완충 식염수(PBS) 중 하나 이상을 포함할 수 있거나 이를 이용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 템플릿을 제거하는 단계는 매트릭스 재료 내의 살아있는 세포를 손상시키지 않을 수 있다.
실시형태에 따른, 희생적으로 템플레이팅된 매트릭스 재료 내에 세포의 혼입
희생 템플레이팅의 패러다임은 3차원 인쇄를 세포 처리로부터 분리한다. 따라서 레이저-소결 필라멘트 네트워크는 내강(lumenal)(즉, 혈관의 내부 표면을 따라)과 실질(parenchymal)(즉, 혈관 외부, 대부분의 조직 포함) 공간 모두에서 세포를 지지할 수 있는, 천연 및 합성 유래 생체적합성 하이드로겔을 포함한 다양한 매트릭스 재료에서 관류성 맥관 네트워크를 패턴화하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 실질 세포는 상호 연결된 맥관 네트워크에 균질하게 통합될 수 있다. 이러한 일부 실시형태는 고형화 전에 세포를 매트릭스 재료에 혼합함으로써, 예를 들어 세포를 예비-하이드로겔 용액에 혼합함으로써 형성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 흐름 경로에 근접한 맥관 네트워크의 영역에 내피 세포가 시딩될 수 있다. 이러한 일부 실시형태는 조밀한 세포 현탁액(예를 들어, ml 당 30 × 106개 세포)을 상호 연결된 맥관 네트워크에 주입함으로써 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상호 연결된 맥관 네트워크는 세포 현탁액이 상호 연결된 맥관 네트워크에 주입된 후에 모든 흐름 경로를 코팅하기 위해 회전될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 내피 세포(예를 들어, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)는 맥관 네트워크의 내강 표면에 부착될 수 있고 각각의 흐름 경로를 따라 단층을 형성할 수 있다.
신체의 건강한 조직과 질병에 걸린 신체 조직 모두는 공간적으로 정의된 세포 영역과 세포외 기질(ECM: extracellular matrix)을 특징으로 한다. 예를 들어, 근골격계는 뼈, 연골, 및 힘줄 손상 조직 사이의 경계면을 함유하며 힘줄 손상 조직은 섬유성 반흔 조직 영역을 가질 수 있고 조직 내의 종양은 세포와 ECM의 독특한 미세 환경을 가지고 있다. 내강 내피 세포와 함께 실질 섬유아세포 배양은 내재적(putative) 모세관 네트워크와 같은 고차-구조로 내피 세포의 자가-조립을 안정화시키는 간질 세포에 의해 수행되는 중요한 역할 때문에 관련 모델이다. 따라서, 일부 실시형태는 세포 및 매트릭스 재료의 공간적으로 이질적인 구성을 갖는 상호 연결된 맥관 네트워크를 포함할 수 있다.
일부 실시형태는 실질 및 내피 세포를 모두 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 실질 세포는 고형화 전에 세포를 매트릭스 재료에 혼합하고 이어서 형성 후에 맥관 네트워크를 통해 세포 함유 유체를 유동시켜 내피 세포를 혼입함으로써 균질하게 혼입될 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 맥관 네트워크는 2개 이상의 매트릭스 재료로부터 형성될 수 있으며, 각각의 매트릭스 재료는 빈 공간의 별개의 영역을 점유한다. 각각의 매트릭스 재료는 하나 이상의 유형의 실질 세포로 시딩되거나 시딩되지 않을 수 있다.
실시예에서, 내강(HUVEC(GFP)) 및 실질(IMR-90 섬유아세포(히스톤 2B(H2B)-mOrange2), 세포 집단 밀리리터(mL-1) 당 2.5 × 106)의 독립적인 시딩이 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA; 10 wt%) 매트릭스 재료 내에서 패턴화된 수지상 맥관 네트워크에 대해 입증되었다.
11일의 관류 배양(증가되는(ramped) 유속 사용) 후, 내피 층은 안정되었고, 잘 유지되었고, 섬유아세포-함유 실질 구획 내로 추정의(putative) 내피 싹(sprout) 성장의 형성을 보여주었다. 또한, IMR-90 섬유아세포의 균일한 간질(interstitial) 시딩이 관찰되었다. 부분 공초점 형광 현미경 검사는 수지상 네트워크에서 일련의 채널 분기(bifurcation)에 걸쳐 HUVEC 시딩을 추가로 입증하였다. HUVEC는 네트워크의 중앙 채널과 개별 채널 주변에 잘 분산되어 있다. 따라서, 내피화된 채널은 네트워크의 다양한 분지와 채널의 전체 둘레에 걸쳐 내피 세포의 균일한 적용 범위를 입증하였다.
실질 구역에서 세포를 균질하게 시딩하는 것 외에도, 실시형태는 전략적으로 순차적인 겔 중합, 개별 세포 집단, 및 개별 매트릭스 재료의 조합을 포함하여 단일의, 공간적으로 패턴화된 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성할 수 있다. 세포 및 재료의 공간적으로 이질적인 구성과 이러한 상호 연결된 맥관 네트워크는 관류 배양 하에서 수행되는 계면 조직 공학 또는 스크리닝 분석과 같은 응용 분야에 유용할 수 있다.
예를 들어, 혈관외 조직의 전이 구역을 공유 맥관 네트워크를 따라 캐스팅하여 모놀리식(monolithic) 및 관류성 구조를 형성하였다. 광중합된 GelMA(10 wt%) 중의 암 응집체(344SQ(H2B-mVenus)); 섬유아세포(IMR-90(H2B-mOrange2); 5 × 106 ml-1)가 있는 15,000 응집체 ml-1)를 함유하는 바닥 구역, 피브린(10 mg ml-1)과 혼합된 GelMA(7.5 wt%) 중의 내피 세포(HUVEC(GFP); 5 × 106 ml-1)를 따라 섬유아세포(10 × 106 ml-1)를 함유하는 중앙 구역, 및 효소적으로 중합된 피브린(20 mg ml-1) 중의 지지 섬유아세포(5 × 106 ml-1)와 함께 내피 세포(15 × 106 ml-1)를 함유하는 상부 구역을 시딩함으로써 공간 조직 패턴화에 대한 제어가 입증되었다. 개별 형광 채널의 이미지는 구역들 사이의 잘 정의된 인터페이스를 보여주고 분지된 맥관 네트워크를 통한 여러 날의 관류(multiday perfusion)는 채널 개통성과 층 사이의 견고한 라미네이션을 나타낸다.
실시형태에 따른, SLS-CaST의 매트릭스 재료의 실시예
도 12a 내지 12f 사진은 하나 이상의 실시형태에 따른 SLS-CaST 방법을 사용하여 형성된 다양한 조성물, 강성, 및/또는 고형화 메커니즘의 다중 매트릭스 재료 내의 유사한 형태의 채널을 묘사한다. 여기서, SLS-CaST 절차는 이러한 각 매트릭스 재료를 통해 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하는 채널을 형성하기 위해 필라멘트 네트워크 모양의 단일 템플릿 디자인을 사용하였다. 전술한 실시형태에 따라 각각의 매트릭스 재료를 다시 채우고 템플릿 주위에서 고형화시킨 후 템플릿을 용해시켰다. 도 12a 내지 12f는 상호 연결된 맥관 네트워크를 청색 염료로 관류함으로써 각각의 매트릭스 재료를 통해 상호 연결된 맥관 네트워크를 강조한다. 도 12a 내지 12f에 나타난 바와 같이, 패턴화된 채널 네트워크를 통한 관류는 각각의 매트릭스 재료 내에서 상호 연결된 맥관 네트워크의 채널 개방성 및 연결성을 입증할 수 있다. 또한, 도 12a 내지 12f는 다양한 고형화 방법을 갖는 다양한 고형화된 매트릭스 재료를 도시한다. 샘플 제조 세부 사항에 대해 추가로 논의된다.
도 12a 및 12b는 하나 이상의 실시형태에 따른, 강성 엘라스토머 또는 플라스틱, 구체적으로 도 12a의 폴리카프로락톤(PCL) 발포체 및 도 12b의 폴리디메틸실록산(PDMS) 내의 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다(스케일 바 = 5mm). 따라서, 강성 엘라스토머 또는 플라스틱은 본 개시내용의 실시형태에 따라 SLS-CaST 방법을 위한 매트릭스 재료로서 사용될 수 있다. 강성 엘라스토머 또는 플라스틱 내에 패턴화된 채널은 하나 이상의 실시형태에 따라 이미징 팬텀, 미세유체 장치 또는 뼈 조직 공학을 위한 스캐폴드로 적용할 수 있다.
도 12c 내지 12f는 하나 이상의 실시형태에 따라, 다양한 강성 및 고형화 메커니즘의 천연 및 합성-유래 하이드로겔(예를 들어, 생체재료)의 어레이를 포함하는 매트릭스 재료 내의 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다. 따라서, 천연 또는 합성-유래 하이드로겔은 본 개시내용의 실시형태에 따라, SLS-CaST 방법을 위한 매트릭스 재료로서 사용될 수 있다. 이러한 실시형태는 다양한 가교 결합 메커니즘, 기계적 특성, 및 세포-매트릭스 상호작용을 갖는 매트릭스 재료로부터 상호 연결된 맥관 네트워크를 제조하기 위한 SLS-CaST의 다양성을 강조한다. 구체적으로, 본 개시내용의 실시형태에 따라, 도 12c에서 이용된 하이드로겔은 PEGDA이고, 도 12d에서는 아가로스이고, 도 12e에서는 실크 피브로인이고, 도 12f에서는 피브린이다.
일부 실시형태에 따르면, 생체재료 내의 상호 연결된 맥관 네트워크는 관류성 모델 조직으로서 사용될 수 있다. 따라서, 도 12c 내지 도 12f에 도시된 각각의 상호 연결된 맥관 네트워크는 세포독성 시약 또는 조건을 사용하지 않고 생체재료 내에서 형성되었다. 하나 이상의 실시형태에서, 상호 연결된 맥관 네트워크가 형성될 수 있는 생체재료는 살아있는 세포의 현탁액을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 도 12a 내지 12f는 본원의 실시형태에 따른 상이한 추가적인 고형화 처리를 사용한 매트릭스 재료를 도시한다. 도 12a는 매트릭스 재료(폴리카프로락톤(PCL))가 주로 용매 증발을 통해 밤새 경화되는 동안 고형화되는 용매(클로로폼)를 포함하도록 초기에 제조된 본 개시내용의 실시형태이다. 도 12b에서, 매트릭스 재료(PDMS)는 포함된 촉매로 초기에 제조되었고 본 개시내용의 실시형태에 따라 48시간 경화 동안 고형화되었다. 도 12c는 다양한 각도로부터의 입사광을 사용하는 광중합을 통해 PEGDA를 가교 결합하기 위해 광중합이 성공적으로 수행된 본 개시내용의 실시형태를 나타낸다. 도 12d는 증가된 온도에 대한 노출을 통해 아가로스를 가교 결합시키기 위해 열 경화가 성공적으로 사용된 본 개시내용의 실시형태를 나타낸다. 마지막으로, 도 12e 및 12f는 실크 피브로인 및 피브린 내에 형성된 패턴화된 채널을 도시하며, 이에 따라 본 개시내용의 실시형태에 따라, 템플릿 주위를 다시 채우는 매트릭스 재료에 대한 성공적인 효소 중합을 예시한다. 매트릭스 재료가 불투명하기 때문에, PCL을 사용하여 맥관 네트워크를 형성하였다. 도 12a는 마이크로-컴퓨터 단층촬영(μCT)으로 이미지화되었다. 대조적으로, 다양한 투명 매트릭스 재료로 형성된 맥관 네트워크는 청색 액체로 관류되어 촬영되었다(도 12b 내지 12f).
실시형태에 따른, SLS-CaST를 통해 제조된 복합 채널 아키텍처
본원의 하나 이상의 실시형태는 또한 천연 포유동물의 맥관 네트워크의 두드러진 아키텍처 모티프 중 일부를 포함하는 보다 복잡한 채널 구성을 패턴화할 수 있다. 이제 도 13 내지 도 16을 참조하면, 계층적으로 분지되고 상호 연결된 맥관 네트워크가 하나 이상의 실시형태에 따라 도시된다. 도 13 내지 16 각각은 하나 이상의 실시형태에 따라 2 wt% 저융점 아가로스의 매트릭스 재료로부터 상기 논의된 SLS-CaST 방법을 사용하여 형성되었다. 또한, 일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 유체적으로 독립적인 다수의 흐름 경로를 갖는 상호 연결된 맥관 네트워크를 한정할 수 있다. 도 17a 내지 17d는 2개의 흐름 경로를 갖는 이러한 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다. 도 13 내지 17의 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크에 대한 제조 방법의 추가 세부사항이 추가로 논의된다.
채널의 축방향 테이퍼링은 압출-기반 인쇄에 대해 사소하지 않지만, 하나 이상의 실시형태에 따르면, 소결된 탄수화물 템플릿에 쉽게 통합될 수 있고 따라서 매트릭스 재료 내에 형성된 상호 연결된 맥관 네트워크에서 하류에서 실현될 수 있다. 이를 위해, 도 13a 내지 13e는 테이퍼링되는 채널과 매끄러운 곡률을 갖는 매트릭스 재료 내의 상호 연결된 맥관 네트워크의 실시형태를 도시한다. 도 13a는 2개의 단면의 위치를 나타내는 2개의 평면을 포함하는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시 개략도를 도시한다. 상호 연결된 맥관 네트워크는 10 mm x 20 mm x 4 mm이며 부피는 800 마이크로리터(μL)이다. 단면 평면 A와 B도 또한 표시된다. 도 13b는 템플릿으로서 사용하기 위해 SLS를 통해 제조된 필라멘트 네트워크의 투시도 사진이다. 도 13c는 스케일 바 = 2 mm를 나타내는 생성된 상호 연결된 맥관 네트워크의 평면도 사진이다. 도 13d는 평면 A에서 촬영한 단면 사진이고 도 13e는 평면 B에서 촬영한 단면의 사진이다. 도 13c 및 13d에 표시된 평면에서 매트릭스 재료의 단면은 원형 프로파일을 가진 채널을 도시한다. 표시된 평면에서 매트릭스 재료의 단면은 매트릭스 재료의 중심에 접근함에 따라 직경이 더 작아지는 원형 프로파일이 있는 채널을 보여준다. 이러한 변화는 매트릭스 재료의 중심에 더 가깝게 시작되는 단면(도 13d)과 매트릭스 재료의 중심에 접근함에 따라 직경이 작아지는 매트릭스 재료의 중심에서 더 멀리 시작되는 단면(도 13c)을 비교함으로써 알 수 있다.
기존의 압출된 희생 템플릿으로, 필라멘트 교차점은 하나의 필라멘트를 다른 것 위에 증착해야 한다(즉, 별도의 평면에서, 중복 재료 분배를 필요로 함). 따라서, 돌출된 템플릿으로 패턴화된 혈관-간 접합부는 이러한 쌓인 통나무집 형태를 유지하며, 이는 천연 혈관-간 접합부와 현저하게 다르다. 대조적으로, 하나 이상의 실시형태에 따르면, SLS 템플릿은 많은 인접한 채널 사이의 접합부에 대해서도 원활한 분지 전이를 제공할 수 있다. 따라서, 도 14a 내지 14e는 단일 유입구 및 단일 배출구로부터 4개의 딸 가지로의 매끄러운 전이를 입증하는 3차원 상호 연결된 맥관 네트워크의 실시형태를 도시한다. 도 14a는 이러한 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시 개략도를 도시한다. 상호 연결된 맥관 네트워크는 7 mm × 13 mm × 7 mm이며 부피는 650 μL이다. 도 14b는 템플릿으로서 우리를 위해 SLS를 통해 제조된 필라멘트 네트워크의 평면도 사진이다. 도 14c는 스케일 바 = 5 mm를 나타내는 생성된 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시도 사진이다. 도 14d는 동일한 맥관 네트워크의 평면도를 도시하는 사진이다. 도 14e는 맥관 네트워크 중심 부근의 4개의 딸 분지를 통해 촬영한 단면 사진이다. 도 14e는 4개의 딸 분지 각각에 대한 별도의 원형 채널을 명확하게 나타낸다.
일부 실시형태에서, SLS-CaST는 도 15a 내지 15f 및 도 16a 내지 16f에 도시된 바와 같이 모든 3차원에서 계층적 채널 분지를 갖는 상호 연결된 맥관 네트워크를 생성하는데 사용될 수 있다. 대조적으로, 다중 분지 반복이나 매달린 오버행 기하학은 기존 압출 인쇄 공정을 통해 쉽게 생성되지 않는다. 이러한 실시형태는 예를 들어 포유동물의 맥관구조를 복제하는데 유용할 수 있다. 이러한 실시형태의 경우, 이들 예의 아키텍처를 생성하기 위한 탄수화물 템플릿은 다음 중 하나 이상을 요구할 수 있다: 지지되지 않은 오버행 및/또는 언더행, 분기, 또는 템플릿의 x-, y- 및 z-축에 대해 비스듬히 향하는 곡선형 채널.
이를 위해, 도 15a 내지 15f는 하나 이상의 실시형태에 따라, 다중 분지 반복 및 매달린 오버행 기하학을 포함하는 3차원 계층적 네트워크 형태의 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다. 따라서, 도 15a 내지 15f는 매달린 오버행 기하학을 갖는 8개의 딸 분지 반복을 나타내는 3차원 상호 연결된 맥관 네트워크의 실시형태를 도시한다. 도 15a는 이러한 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시 개략도를 도시한다. 상호 연결된 맥관 네트워크는 16 mm × 25 mm × 8 mm이고 부피는 3.2 밀리리터(mL)이다. 도 15b 및 15c는 템플릿으로서 우리를 위해 SLS를 통해 제조된 필라멘트 네트워크의 투시도 및 평면도를 각각 묘사하는 사진이다. 도 15d는 스케일 바 = 10 mm를 나타내는 생성된 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시도 사진이다. 도 15f 및 15f는 각각 동일한 맥관 네트워크의 평면도 및 측면도를 도시하는 사진이다.
또한, 도 16a 내지 16f는 하나 이상의 실시형태에 따른, 꼬인(twisted) 3차원 계층적 네트워크의 형상을 갖는 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다. 또한, 도 16a 내지 16f의 맥관 네트워크는 도 15a 내지 15d와 비교하여 모든 3차원에 걸쳐 매끄러운 이질적인 분지 테이퍼링 및 더 높은 정도의 채널 비틀림(tortuosity)을 갖는다. 도 16a는 이러한 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시 개략도를 도시한다. 상호 연결된 맥관 네트워크는 16 mm × 25 mm × 10 mm이고 부피는 4 mL이다. 도 16b 및 16c는 템플릿으로서 우리를 위해 SLS를 통해 제조된 필라멘트 네트워크의 투시도 및 평면도를 각각 묘사하는 사진이다. 도 16d는 스케일 바 = 10 mm를 나타내는 생성된 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시도 사진이다. 도 16e 및 16f는 각각 동일한 맥관 네트워크의 평면도 및 측면도를 묘사하는 사진이다.
일부 실시형태에서, 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크는 매트릭스 재료를 통과하는 다수의 독립적인 흐름 경로를 포함할 수 있다. 달리 말하면, 일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 2개 이상의 유동적으로 분리된 유체 경로를 갖는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 한정할 수 있다. 이러한 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크는 다수의 독립적인 흐름 경로에 대한 템플릿 역할을 하는 복수의 필라멘트를 포함하는 필라멘트 네트워크를 사용하여 형성될 수 있다.
이러한 맥관 네트워크의 일부 실시형태는 얽히지 않은 다수의 독립적인 흐름 경로를 한정하는 복수의 필라멘트를 포함할 수 있다. 달리 말하면, 이러한 맥관 네트워크는 다수의 독립적인 흐름 경로를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 흐름 경로는 필라멘트 네트워크에 의해 한정되며, 여기서 필라멘트 네트워크는 임의의 필라멘트 네트워크를 파괴하지 않고 분리될 수 있다. 이러한 실시형태는 SLS를 통해 다중 필라멘트 네트워크를 개별적으로 제조하고 매트릭스 재료의 고형화 직전에 필라멘트 네트워크를 근접하게 위치시킴으로써 형성될 수 있다.
이러한 맥관 네트워크의 일부 실시형태는 필라멘트 네트워크가 기하학적으로 연결되어 필라멘트 네트워크 중 적어도 하나를 파괴하지 않고는 분리될 수 없음을 의미하는 "얽힌" 다수의 독립적인 흐름 경로를 한정하는 다중 필라멘트 네트워크를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하는 것은 SLS를 통해 다수의 얽힌 필라멘트 네트워크를 제조하는 것과 매트릭스 재료에 맥관 네트워크를 캐스팅하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 얽힌 필라멘트 네트워크는 매트릭스 재료의 도입 전에 상호 연결된 맥관 네트워크에서 그들의 최종 배열을 반영하도록 제조될 수 있다.
도 17a는 2개의 필라멘트 네트워크를 갖는 이러한 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시 개략도를 도시한다. 상호 연결된 맥관 네트워크는 18 mm x 30 mm x 8 mm이며 부피는 4.3 mL이다. 도 17b 및 17c는 템플릿으로서 우리를 위해 SLS를 통해 제조된 필라멘트 네트워크의 투시도 및 평면도를 각각 묘사하는 사진이다. 도 17d는 스케일 바 = 5 mm를 나타내는 생성된 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크의 투시도 사진이다. 도 17e 및 17f는 각각 스케일 바 = 5 mm인 동일한 맥관 네트워크의 평면도 및 측면도를 묘사하는 사진이다.
면밀한 검사 시, 도 17a 내지 17f의 2개의 얽힌 필라멘트 네트워크는 SLS를 통해 개별적으로 제조될 수 없었고 매트릭스 재료의 고형화 직전에 얽혔음을 분명히 알 수 있다. 대신에, 도 17a 내지 17f의 2개의 얽힌 필라멘트 네트워크는 고체 매트릭스 재료 내에서 그들의 최종 형태와 거의 동일한 형태로 SLS를 통해 공동 제조되었다. 특히, 도 17b는 본 개시내용의 실시형태에 따라 SLS를 통해 동시에 제조된 2개의 얽힌 필라멘트 네트워크를 도시한다. 도 17b의 이와 같이 제조된 필라멘트 네트워크는 매트릭스 재료의 도입 또는 고형화 이전에 상호 연결된 맥관 네트워크의 최종 배열을 반영한다.
실시형태에 따라, STS-CaST를 통해 제조된 모델 조직
도 18a 및 18b와 19a 및 19b는 본 개시내용의 하나 이상의 실시형태에 따라, 살아있는 세포를 함유하는 세포외 매트릭스(ECM: extra cellular matrix) 재료로부터 SLS-CaST를 통해 제조된 상호 연결된 맥관 네트워크를 도시한다. 이러한 실시형태는 희생적으로 템플레이팅된 모델 조직 내의 세포의 대사 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
도 18a는 맥관 네트워크를 개략적으로 도시하고 도 18b는 염색 및 이미지화를 위해 단면화한 후의 맥관 네트워크를 개략적으로 도시한다. 상호 연결된 맥관 네트워크는 6 mm × 15 mm × 6 mm이다. 광학 이미지화 전에, 도 19a 및 19b에 도시된 바와 같이 맥관 네트워크를 y-방향(유동 방향과 평행)으로 300 μm 두께의 슬라이스로 단면화하고, 염색하고, 광학 현미경을 통해 이미지화한다. 세포 염색은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 사용하여 수행하였고 핵 염색은 Nuclear GreenTM LCS1을 사용하여 수행하였다.
도 19a 및 19b는 본 개시내용의 실시형태에 따른, 밀리리터 당 10e6 세포(세포/mL)(도 19a) 및 60e6 세포/mL(도 19b)의 세포 밀도를 갖는 ECM 매트릭스 재료를 사용하여 제조된 2개의 세포-함유 맥관 네트워크의 광학 현미경 사진이다.
각 샘플은 0일차, 3일차, 및 7일차에 세포 배지로 관류한 후의 이미지이다. 따라서, 시간이 경과함에 따라, 도 19a 및 19b는 채널 근처에서 높은 활성의 세포의 특징적인 환형 영역의 발달을 보여준다. 0일차의 삽입은 확대된 영역의 위치를 나타내는 파선으로 전체 단면을 보여준다.
각 도면에 표시된 자주색 신호는 살아있는 세포가 화합물 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 능동적으로 대사할 때 형성된 포르마잔 침전물을 반영한다.
위의 관점에서 볼 때, 본 개시내용의 실시형태에 기술된 바와 같이 SLS-CaST를 통한 전체 ECM의 1단계 캐스팅은 시간 집약적인 세포/ECM 인쇄에 대한 필요성을 제거할 수 있고, 조직 제작의 비전문가가 패턴화된 맥관 네트워크로 실험을 수행하게 할 수 있고, 더 넓은 범위의 세포, 응집체, 및 오가노이드로 실험을 용이하게 한다. 실제로, 압출에 내성이 없는 세포 및/또는 응집체 배양으로부터 이익을 얻는 세포는 본원에 기술된 하나 이상의 실시형태에 따라 SLS-CaST를 사용하여 맥관화된 모델 조직에 성공적으로 통합될 수 있다. 더욱이, 본원의 하나 이상의 실시형태는 실험 설계로부터 맥관 아키텍처의 제조를 분리할 수 있고 지난 수십 년 동안 개발된 생체재료의 전체의 놀라운 팔레트(palette)에 대한 무제한 접근을 사용자에게 제공할 수 있다.
실시형태에 따른, 인공 맥관구조의 컴퓨터 설계
조정가능한 혈관 토폴로지를 갖는 생체모방 맥관 네트워크를 설계하기 위해, 본원에 개시된 바와 같이 분지형 맥관 네트워크를 계산적으로 성장시키기 위해 잎맥의 수학적 모델을 사용할 수 있다. 이렇게 모델링된 네트워크는 이제 하나 이상의 실시형태에 따라 SLS-CaST 방법을 통해 생성될 수 있다. 잎맥 형성에 대한 주요 가설은 호르몬 옥신의 흐름과 정맥의 발현 사이의 피드백 루프로서 정맥의 분화를 설명하는 옥신 발생세분화(auxin canalization) 이론이다. 옥신 발생세분화에서 영감을 받은 공간 콜로니화 알고리즘은 이전에 파라메트릭 트리 성장(parametric tree growth)을 위해 정교하게 만들어졌다. 자연 맥관 구조를 더 잘 모델링하기 위해, 상호 트리 유인(Mutual Tree Attraction)이라는 모델링 프레임워크를 개발하여 단일 유입구와 단일 배출구가 있는 분지화된 3차원 네트워크를 생성하였다. 도 20a 내지 20d는 하나 이상의 실시형태에 따라 계산적으로 성장하는 수지상 맥관 네트워크를 위한 상호 트리 유인을 도시한다. 구체적으로, 도 20a 내지 20d는 본 개시내용의 하나 이상의 실시형태에 따라 상호 트리 유인을 통한 2D 아키텍처를 갖는 수지상 맥관 네트워크의 알고리즘 성장의 개략도를 도시한다.
하나 이상의 실시형태에서, 도 20a 내지 20d에 개략적으로 도시된 바와 같은 상호 트리 유인 방법은 다음을 포함할 수 있다: 수지상 네트워크가 생성될 2차원 또는 3차원 성장 도메인을 인스턴스화하고, 연결된 노드 시퀀스를 생성하기 위한 시작점 역할을 하는 2개 이상의 시드 노드를 인스턴스화하는 단계; 시드 노드부터 시작하여, 생체모방의 분지화된 트리형 형태로 연결되도록 일련의 노드 및 에지의 위치를 계산하는 단계; 각 노드 트리로부터 말단 노드들의 연결에 의해 폐쇄형 분지된 네트워크(수지상 네트워크)를 형성하는 단계; 및 노드 트리를 따르는 원통형 필라멘트를 생성함으로써 수지상 맥관 네트워크의 3차원 모델을 형성하는 단계. 일부 실시형태에서, 본원에서 논의된 수지상 맥관 네트워크를 계산적으로 생성하는 방법은 위에서 논의된 바와 같이 SLS-CaST 방법을 통해 형성된 상호 연결된 맥관 네트워크를 위한 수지상 네트워크의 아키텍처를 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 가상 호르몬 공급원은 확률적으로 2차원 또는 3차원 성장 도메인 내에 배치될 수 있고 유입구 및 배출구에서 발생하는 일련의 노드의 성장 경로 및 분지화 거동에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 하나 이상의 실시형태에 따르면, 각각의 시드 노드는 분지화된 노드 트리의 루트가 될 수 있다. 일련의 불연속적인 시간 단계를 통해, 유입구 또는 배출구를 나타내는 각 시드 포인트는 다른 곳에서 설명한 대로 성장 도메인을 채우는 노드의 분지화된 트리의 루트(root)가 된다. 일부 실시형태에서, 분지형 형태는 호르몬 공급원 밀도 및 거리에 따라 쇠퇴하는 호르몬 공급원의 인력 영향을 조정함으로써 조정될 수 있다. 도 20a에서, 2개의 시드 노드(51)는 타원형 성장 도메인(53) 내에 위치한다. 첫 번째 삽입 개략도는 성장 도메인(53) 내의 가상 호르몬 공급원(55)의 유인 필드를 보여준다. 두 번째 삽입 개략도에서, 루트(57)는 노드(51)(여기서, 시드 노드)와 가상 호르몬 공급원(55) 사이의 평균 벡터를 따라 연장되어, 제2 노드(59)를 형성한다. 노드(59)는 다수의 노드가 각각의 근접 호르몬 공급원(55)에 차등적으로 유인됨으로써 형성된 분기점이다.
폐쇄된 아키텍처를 형성하기 위해, 각 트리의 활발하게 성장하는 가지 말단(tip)은 반대 트리의 가지를 유인하는 추가 호르몬 공급원으로서 거동할 수 있다. 따라서, 각 노드 트리의 전진하는 말단은 추가 호르몬 공급원으로 거동할 수 있으므로, 성장하는 두 트리가 성장 도메인의 중심에 접근함에 따라, 말단 가지가 서로 유인된다. 도 20b는 본 개시내용의 일부 실시형태에 따라, 각각의 트리가 성장하여 다른 트리에 접근하는 이러한 중간 단계를 도시한다. 각 노드 트리는 전진 말단(69)으로 끝나는 가지(67)를 포함한다. 각 노드는 반대쪽 트리의 노드에 대한 호르몬 공급원 역할을 한다. 따라서 말단 수렴은 연속 분지를 생성한다.
일부 실시형태에서, 성장 도메인의 호르몬 공급원은 두 가지 전진하는 트리 모두에 영향을 미칠 수 있지만, 말단 호르몬 공급원은 반대쪽 트리에 영향을 미칠 수 있다(즉, 자기-유인은 트리 내에서 금지될 수 있음). 이를 위해, 도 20c는 2개의 트리가 폐쇄형 네트워크를 형성하기 위해 수렴한 네트워크(71)의 상태를 도시한다.
마지막으로, 일부 실시형태에 따라 맥관 네트워크를 나타내는 노드 및 에지 세트에 혈관 직경이 할당될 수 있다. 또한, 유입구와 배출구가 추가될 수 있다. 따라서, 일반적인 디지털 제작 도구체인과 호환되는 아키텍처의 3차원 모델이 형성될 수 있다. 여기서, 도 20d는 혈관 두께가 할당되고 유입구(75)와 배출구(77)가 추가되면 이 방법을 통해 생성된 최종 네트워크(73)의 예를 보여준다.
혈관 두께는 하나 이상의 실시형태에 따라, 네트워크 성장 단계와 독립적으로 할당될 수 있고 머레이의 법칙 또는 다른 이론적 관계로부터 유도될 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 필라멘트의 치수는 비제한적으로 머레이의 법칙을 포함하는 수학적 관계를 통해 결정될 수 있다. 완성된 아키텍처는 생물학과 그 이상에서 어디에나 있는 자연 흐름 시스템을 연상시키는 나무와 같은 형태를 인식하여 수지상 네트워크라고 지칭될 수 있다.
실시형태에 따른, SLS-CaST를 사용하는 모델 포유동물 맥관구조의 제조
이제 도 21a 내지 21g를 참조하면, 하나 이상의 실시형태에 따라, SLS-CaST에 따라 매트릭스 재료 내에 채널을 형성하기 위해 SLS를 통해 형성된 템플릿을 사용하여 복수의 필라멘트로 이루어진 필라멘트 네트워크 형태의 상호 연결된 맥관 네트워크의 제조가 예시된다. 여기서, 21a 내지 21f는 광범위한 지지되지 않는 분지화 및 필라멘트 테이퍼링을 갖는 생성적 수지상 아키텍처를 나타낸다. 생성된 천공 또는 패턴화된 매트릭스에서, 모든 채널은 손상되지 않고 연속적이다.
상호 연결된 맥관 네트워크의 투시 개략도는 도 21a에서 볼 수 있다. 도 21b는 평면 C 및 D를 나타내는 동일한 맥관 네트워크의 평면도 개략도이며, 여기서 평면 C는 유입구에 더 가깝고 평면 D는 맥관 네트워크의 중심에 더 가깝다. 상호 연결된 맥관 네트워크는 하나 이상의 실시형태에 따라 3차원 타원체 도메인 내에서 계산적으로 모델링되었다.
도 21c는 도 21a 및 도 21b에 도시된 필라멘트 네트워크 또는 수지상 맥관 네트워크 개략도 형태의 상호 연결된 맥관 네트워크에 대한 템플릿의 사진이다(스케일 바 = 10 mm). 도 21a에 대해 모델링된 상호 연결된 맥관 네트워크는, 하나 이상의 실시형태에 따라, 분말로부터 SLS를 사용하여 제조 시 도 21c에 도시되어 있다. 상호 연결된 맥관 네트워크의 템플릿은 총 33개의 딸 혈관으로의 단일 유입구와 단일 배출구 사이의 계층적 분기를 특징으로 한다.
도 21d는 도 21c에 도시된 템플릿의 마이크로-컴퓨터 단층촬영(μCT) 단면이다. 도 21d는 33개의 딸 혈관의 온전한 특성을 보여준다.
도 21e 내지 21g는 하나 이상의 실시형태에 따라 도 21a 내지 21d의 수지상 탄수화물 템플릿의 희생 템플레이팅을 통해 형성된 최종 상호 연결된 맥관 네트워크의 사진이다. 본 개시내용의 실시형태에 따라 아가로스 하이드로겔(2 wt%)에서 SLS-CaST를 통해 형성된 후, 도 21e에서 촬영된 상호 연결된 맥관 네트워크(스케일 바 = 10 mm)는 투명했고 청색 액체로 완전히 관류되었다. 도 21e 및 21f에 도시된 완성된 맥관 네트워크의 단면(각각 평면 C 및 D로서 도 21b에 개략적으로 도시됨)은 아가로스 하이드로겔 매트릭스 재료 내에 대략적인 원형 단면을 갖는 완전히 관류된 채널을 예시한다.
도 21e 및 21f의 최종 상호 연결된 맥관 네트워크를 통한 유체 대류의 이론적 및 경험적 평가는 이러한 네트워크가 일정 범위의 유속(Q)에 걸쳐 모든 채널 세그먼트에 걸쳐 흐름을 효과적으로 분배할 수 있음을 입증하였다. 아가로스 겔에서 희생적으로 템플레이팅된 평면 수지상 네트워크의 관류는 모든 가지를 통한 유체 흐름을 생성하였다. 분기하는 유체 흐름은 딸 가지에서 더 낮은 속도를 보인 반면, 수렴하는 흐름은 병합하면서 속도를 얻었다. 포물선형 속도 프로파일은 뉴턴 유체의 층류(laminar)에 대해 예상되는 것처럼 적용된 유속에 정비례하여 증가하였다. 또한, 표준 전산 유체 역학(CFD: computational fluid dynamics)을 사용하여 이러한 맥관 네트워크를 통한 대류 시뮬레이션은 실험적으로 관찰된 속도 프로파일을 동일한 크기로 요약하여, 이러한 시뮬레이션이 수지상 아키텍처에서 발달할 속도 프로파일 및 크기에 대한 의미 있는 예측 통찰력을 제공할 수 있음을 나타낸다.
3개의 개별 입자 이미지 유속계(PIV: particle image velocimetry) 실험 결과를 검토한 결과, 독립적인 겔 복제는 재현가능한 최대 속도 크기(vmax)와 벽 전단 응력(WSS)을 나타냈으며, 이는 적용된 유속(
Figure pct00001
)에 정비례하여 예상대로 증가하였다. 계산적으로 예측된 값은 실험 값보다 약간 더 큰 크기로 동일한 경향을 따랐으며, 이는 실험에 사용된 마이크로보어 튜빙(microbore tubing)의 마찰 손실로 설명될 수 있다. 속도 값과 비교하여 전단 응력 값 사이의 상대적으로 큰 편차는 전단 응력 값이 채널 에지에서 계산된다는 사실에 의해 설명될 수 있으며, 여기서 물리적 입자는 더 희박하고 정량화 인공물에 더 취약하다. 최대 속도와 벽 전단 응력은 동일한 축 방향 거리에서 채널 전체에 걸쳐 일관되었으며, 이는 네트워크 전체에 균일하게 분포된 유체 흐름을 나타낸다. 또한, 네트워크의 특정 세그먼트를 통한 체적 유속(및 따라서 속도 프로파일)은 로컬 반경(
Figure pct00002
)에 따라 크게 달라지며, 이는 템플릿 네트워크에서 속도를 기록할 때 원래 탄수화물 템플릿의 작은 차이가 증폭될 수 있음을 의미한다. 마지막으로, PIV는 상대적으로 낮은 유속 영역에서만 다루기 쉬운 반면, 이러한 네트워크는 분 당 수십 또는 수백 밀리리터 정도의 훨씬 더 높은 유속을 견딜 수 있다(아마도 재료에 따라 다름). 예를 들어, 맥관 네트워크의 중심 근처에서 연구된 영역의 경우 분 당 120 밀리리터(mL 분-1)의 유속은 이론적으로 분 당 vmax = 1.3 × 106 마이크로리터(μL 분-1) 및 제곱 센티미터 당 WSS = 148 다인(dyn cm-2)에 해당하는 이러한 아키텍처에 의해 잘 견딘다. 이러한 빠르게 캐스팅된 겔의 모놀리식 특성은 전단되거나 박리될 수 있는 겔의 개별 층 또는 압출된 필라멘트가 없기 때문에 높은 유속을 견딜 수 있는 이러한 관찰된 능력과 직접적으로 관련될 수 있다. 3개의 독립적인 겔에서 복제 PIV 실험은 재현가능한 유체 대류(즉, vmax) 및 벽 전단 응력을 입증하였으며 유속과 이론적으로 예측된 직접 비례성을 따랐다.
도 21a 내지 21f보다 더 크고 더 복잡한 수지상 네트워크는 상호 트리 유인을 통해 생성되었고, 탄수화물 템플릿으로서 제조되었으며, 세포-함유 아가로스 겔(25e6 세포 mL-1, 2wt%)로 캐스팅되었다. 겔 중앙에서 섹션(두께 500 μm)의 MTT 염색은 0일차에 투명한 채널과 균일하게 분포된 대사 활성 세포를 보여준다. 이러한 수지상 아키텍처의 중심에서 맥관 근접성은 MTT로 염색된 조직 섹션을 분할하고 실질 공간의 각 지점에서 가장 가까운 맥관 채널 또는 외부 표면까지의 거리 맵을 생성함으로써 정량화되었다. 맵을 히스토그램 및 해당 누적 분포 함수로 표시함으로써, 이러한 아키텍처의 중심에 있는 조직 부피의 65%가 혈관의 1 mm 내에 있고 부피의 88%가 1.5 mm 내에 있음을 보여주었으며, 이는 이러한 아키텍처가 다른 곳에서 논의된 약 1 mm의 실행가능한 거리 내에서 세포를 성공적으로 지지할 수 있음을 시사한다. 더 작은 혈관과 혈관간 거리는 SLS-CaST를 통해 쉽게 제조될 수 있지만, 이러한 예는 맥관 근접성을 설명하기 위한 새로운 메트릭을 도입할 뿐만 아니라 조직 부피에 따라 확장하기 위한 맥관 네트워크 복잡성의 필요성을 강조하였다.
하나 이상의 실시형태에 따른, 수지상 맥관 네트워크를 위한 희생 템플릿
특히, 전술한 하나 이상의 실시형태에 따른 탄수화물의 SLS는 광범위한 3차원 분지 및/또는 지지되지 않는 기하 구조를 포함하여 이전에 접근할 수 없었던 아키텍처를 갖는 템플릿의 제조를 가능하게 한다. 따라서, 하나 이상의 실시형태에 따른 탄수화물의 SLS에 대한 하나의 적용은 생체적합성 매트릭스 내에 상호 연결된 맥관 네트워크를 생성하기 위한 희생 템플릿을 형성하는 것일 수 있다. 따라서, 생체적합성 매트릭스 내에서 SLS-CaST를 통해 형성된 상호 연결된 맥관 네트워크는 수지상 맥관 아키텍처(예를 들어, 위에서 설명되고 도 20a 내지 20d 및 도 21a 내지 21g에 도시된 것과 같은 것들)의 형태를 취할 수 있으며, 이는 생물학적 구조를 보다 정확하게 모방하기 위한 새롭게 접근가능한 이러한 아키텍처 특징을 포함할 수 있다. 위의 관점에서, SLS-CaST는 천연 생리학을 모방할 수 있는 조작된 모델 조직을 형성하기 위한 우수한 방법론일 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 수지상 맥관 네트워크의 3차원 모델은 전술한 상호 트리 유인 알고리즘을 사용하여 계산적으로 생성될 수 있다. 따라서 혈관 직경은 하나 이상의 실시형태에 따라 머레이의 법칙 또는 다른 수학적 관계에 의해 제공될 수 있다. 또한, 하나 이상의 실시형태에 따라 SLS-CaST를 통해 생체적합성 매트릭스 재료 내에 계산적으로 생성된 수지상 맥관 네트워크의 형태를 갖는 상호 연결된 맥관 네트워크가 형성될 수 있다. 본원에서 기술된 SLS-CaST 방법은 선택적으로 표면 평활화 및/또는 표면 코팅을 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에 따른, 소결된 탄수화물을 사용한 모델 조직 맥관구조의 희생 템플레이팅
하나 이상의 실시형태에서, 맥관 네트워크는 레이저-소결 탄수화물의 템플릿 주위에 조작된 조직을 형성한 다음 조작된 조직 내에서 템플릿을 선택적으로 제거함으로써 조작된 조직에서 생성될 수 있다. 하나 이상의 실시형태에서, 템플릿은 소결을 통해 원하는 상호 연결된 맥관 네트워크(예를 들어, 수지상 네트워크 아키텍처, 상기 약술된 하나 이상의 실시형태에 따른 수지상 맥관 네트워크에 대한 희생 템플릿 참조)의 형상으로 고형화될 수 있고, 그 다음 매트릭스 재료에 둘러싸이고 용해되어 상호 연결된 맥관 네트워크가 매트릭스 재료의 빈 공간으로 유지될 수 있다. 사용된 매트릭스 재료는 하나 이상의 실시형태에 따라 임의의 생체적합성 하이드로겔 또는 가변 조성의 다른 생체재료일 수 있다. 소결 직후, 템플릿은 물에 대한 용해성으로 인해 추가 처리의 이점을 얻을 수 있다. 하나 이상의 실시형태에 따라, 템플릿을 소수성 예비-중합체(예컨대, 폴리카프로락톤 또는 폴리(락트산))로 코팅함으로써 수성 성분, 예컨대 수성 예비-중합체를 갖는 매트릭스 재료에서 템플릿의 급속한 용해를 피할 수 있다. 하나 이상의 실시형태에 따르면, 소수성 중합체를 코팅하기 전에, 평활화 용액으로 처리하여 또한 템플릿의 표면을 평활화할 수 있다. 표면 코팅 및/또는 표면 처리 및 템플릿을 매트릭스 재료로 다시 채운 후, 하나 이상의 실시형태에 따라 템플릿은 매트릭스 재료로부터 용해될 수 있다. 일부 실시형태에서, 매트릭스 재료는 세포를 함유하는 하이드로겔(가교 결합이 있거나 없는)일 수 있다. 본 명세서에 기술된 하나 이상의 실시형태에 따라 형성된 시스템은 조작된 조직 구조물 또는 모델 조직일 수 있다.
또한, 본 개시내용의 실시형태는 임의의 하이드로겔을 함유하는 매트릭스 재료에서 맥관 네트워크를 생성하기 위해 적용될 수 있으며, 상기 하이드로겔은 임의의 세포 유형 또는 세포 유형의 조합을 함유할 수 있다. 일부 실시형태는 생체적합성 재료로 맥관 토폴로지를 제조하는 주요 문제를 해결할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 실시형태는 신장, 간, 췌장 또는 폐의 내부 아키텍처를 요약하고/하거나 적절한 세포 유형을 포함하는 조작된 조직 구조물을 생성할 수 있다.
추가로, 실시형태는 과학 연구, 예를 들어 맥관 기능 및/또는 질환 연구를 위한 모델 시스템을 제작하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 실시형태를 사용하여 형성된 단순한 맥관 네트워크는 과학적 연구 실험을 위한 플랫폼 역할을 할 수 있다. 이러한 실험은 혈관 형성 및 리모델링; 혈관신생; 종양 내유출 및 유출; 및 죽상동맥경화증과 같은 것을 조사할 수 있다.
또한, 본 개시내용의 하나 이상의 실시형태에 따라 형성된 다양한 유형의 모델 조직은 신규 약제를 포함하는 약제의 평가에 도움이 될 수 있다.
생물제조 분야 밖에서, 본 개시내용의 하나 이상의 실시형태는 미세유체 장치의 생성을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 실리콘 매트릭스는 위에서 논의된 생체모방 예에서 사용된 하이드로겔을 대체할 수 있다. 강성의 오래 지속되는 재료에 채널을 형성하는 본 개시내용의 실시형태에 따른 실리콘 매트릭스를 사용한 미세유체 장치의 형성. 일부 실시형태에 따라 생성된 실리콘-기반 미세유체 장치에 대한 하나의 적용은 이미지화 연구를 위한 유동 팬텀의 형성일 수 있다.
실시형태에 따른, 오픈-소스 SLS 하드웨어의 개발
OpenSLS 프린터(다른 곳에서 설명됨)를 탄수화물 재료와의 호환성을 위해 수정하였다. 간단히 말해서, 커팅 베드를 맞춤형 분말-처리 모듈로 교체하고 온보드 전자 장치를 오픈-소스 Marlin 펌웨어(https://github.com/MarlinFirmware)의 맞춤형 버전을 실행하는 오픈-소스 3D 프린터 마더보드(RAMBo v.3.1, Ultimachine)로 재정의하여 상업용 CO2 레이저 커터를 수정하였다. 분말-처리 모듈은 11 × 13 × 9 cm 빌드 볼륨으로 설계하였으며 주로 레이저-절단 아크릴 및 3D-인쇄된 폴리(락트산)(Ultimachine) 필라멘트를 사용하여 제조하였다. 분말-처리 모듈 구성요소에 대한 자세한 설계는 재료 명세서, 배선 다이어그램, 및 맞춤형 펌웨어와 함께 OpenSLS 저장소(https://github.com/MillerLabFTW/OpenSLS)에서 사용할 수 있다.
실시형태에 따른, 3D 모델 설계 및 처리
3D 모델을 OpenSCAD(http://openscad.org), Blender(https://blender.org) 또는 맞춤형 생성 알고리즘을 사용하여 설계하였다. Blender용 맞춤형 Python 추가 기능은 자연스러운 장중첩(intussusception) 과정에서 혈관 분기에서 영감을 얻은 계층적으로 분지화된 아키텍처를 대화식으로 매개변수 방식으로 생성하도록 개발되었다(https://github.com/MillerLabFTW/IntussusceptionAddon). 도 8a의 DNA 나선 모델은 jharris(https://www.thingiverse.com/thing:412973)에 의해 생성하였으며 도 8b의 애쉬 트리 모델은 dutchmogul(https://www.thingiverse.com/thing:1079821)에 의해 생성하였다. 오픈-소스 Slic3r 소프트웨어(Slic3r.org)를 사용하여 3차원 모델을 G-코드로 슬라이싱하였다. 모델의 다른 영역에 상이한 레이저 속도 및 출력 설정을 할당하기 위해, 각 영역에 Slic3r 내의 다른 압출기를 할당하였다. 슬라이싱 후, 맞춤형 Python 스크립트를 사용하여 G-코드를 수정하여 OpenSLS 모터 축 할당과 호환되도록 하고 원하는 속도 및 출력 파라미터를 통합하였다. G-코드를 오픈-소스 Pronterface 콘솔(github.com/Kliment/Printrun)을 통해 프린터로 전송하였다.
실시형태에 따른, 탄수화물의 제조 및 레이저 소결
이소말트(Decomalt, Paris Gourmet)를 블레이드 커피 그라인더(Krups® F203)에서 분쇄한 다음, 35호 및 60호 메쉬 체(60 메쉬 = 250 μm 그리드 간격)를 통해 걸러냈다.
체질된 이소말트 분말을 식품 등급 옥수수 전분(Argo®)과 7:3 질량비로 혼합하고, 주변 습기에 대한 예방책으로서 동결건조기(Labconco®)에 놓고, 밀폐 용기에 실온에서 보관하였다.
제조를 위해, 분말화된 탄수화물 혼합물의 얇은 층을 페인터 테이프 층 위에 구축 플랫폼 전체에 수동으로 도포하였다.
계층별 제조를 시작하기 위해 Pronterface에서 적절한 G-코드 파일을 시작하였다.
프린트의 각 층에 대해, 탄수화물 분말을 레이저로 선택적으로 용융함으로써 고체 기하학을 패턴화하였다.
이러한 패턴화 단계에 이어, 빌드 볼륨 위에 매달린 체 저장소를 흔들어 후속 층에 신선한 분말을 추가하였다. 흔들기 동작은 공기를 주입하고 다짐(compaction)을 방지하면서 분말을 빌드 플랫폼의 더미(heap)로 떨어뜨린다. 매달린 저장소에서 신선한 분말이 분배된 후, 역회전 롤러에 의해 분말 더미가 균일한 층으로 퍼진다. 마지막으로, 과잉 분말은 플로(plow) 메커니즘에 의해 제거되고 분말 처리 모듈 아래에 수집된다. 분말은 눈에 띄는 인쇄 품질 저하없이 수십에서 수백 번 재활용될 수 있다.
일반적인 프린트는 1,000 내지 2,000 mm 분-1(초 당 16 내지 32 밀리미터(mm s-1))의 레이저 병진 속도와 40 와트(W) 레이저 튜브(LightObject)에서 40 내지 60 W mm-2의 전력 밀도를 사용하였다.
250 μm 층 높이로 제조한 도 8a 및 8b에 도시된 것을 제외하고, 모든 탄수화물 구조를 150 μm 층 높이로 제조하였다.
제조 동안, 레이저 노즈피스(nosepiece)를 통해 질소 가스를 부드럽게 흐르게 하여 레이저 광학 장치 상에 탄수화물 잔류물이 축적되는 것을 방지하고 레이저 커터를 일정한 질소 스트림으로 계속해서 플러싱하였다.
제조 후, 브러시 또는 압축 공기로 과도한 느슨한 분말을 제거하고 개별 필라멘트를 바늘로 청소하였다.
실시형태에 따른, 탄수화물 분말 및 제조 부품의 특성분석
안정성 및 가변 유속 테스트 프로토콜을 사용하여 분말 레오미터(FT4, Freeman Technology®)를 사용하여 분말화된 탄수화물의 유동 특성을 조사하였다. 순수한 이소말트 분말을 이소말트 + 옥수수 전분 분말 및 상업용 나일론 분말(PA650, Advanced Laser Materials)과 비교하였다. 제조업체의 권장 프로토콜을 사용하여 분말 사전-컨디셔닝 후, 흐름에 대한 저항을 100 mm s-1의 블레이드 팁 속도로 제한되지 않은 기하학에서 7주기에 걸쳐 측정하여 비에너지를 측정하였다. 재료 간의 흐름 특성을 비교하기 위해, 비에너지(mJ g-1 단위)에 각 분말의 컨디셔닝된 벌크 밀도(밀리리터 당 그램(g ml-1) 단위)를 곱하고 mJ ml-1로 보고하였다.
주사 전자 현미경을 수행하여 분말화된 재료의 형태를 분석하고 소결된 부품의 표면 특성을 분석하였다. 분말 알갱이 또는 소결된 부품 조각을 10 나노미터(nm) 금(Desk V Sputter Coater; Denton Vacuum®)으로 스퍼터 코팅하고 Quanta 400 환경 주사 전자 현미경(ESEM: environmental scanning electron microscope)(FEI Company®)에서 이미지화하였다.
소결된 탄수화물의 표면 거칠기를 측정하기 위해, 주사 전자 현미경 현미경 사진을 역치화하고 맞춤형 MATLAB® 함수를 사용하여 각 에지의 프로파일을 추출하였다. 평균 표면 거칠기(Ra)를 다음 공식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00003
,
상기 식에서 Z(x)는 에지 프로파일이고 L은 에지의 길이이다. 소결된 필라멘트의 폭은 디지털 일안 반사식(DSLR: digital single-lens reflex) 카메라(EOS 5DSR, Canon®)가 장착된 입체 현미경(SteREO Discovery.V8, Zeiss®)에서 획득한 사진을 사용하여 Fiji ImageJ(미국국립보건원)에서 측정하였다.
50 킬로볼트(kV), 200 마이크로암(μA) x-선 공급원, 및 424 밀리초(ms)의 노출 지속시간을 사용하여, SkyScan™ 1272 x-선 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캐너(Bruker®)에서 소결된 탄수화물 및 PCL 발포체의 체적 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 스캔을 획득하였다. 180도 스캔을 0.3° 단위로 수행하였다. 볼륨 재구성 및 시각화는 각각 NRecon 및 CTVox(Bruker®) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
일축 압축 시험을 ASTM 표준 D695-02a의 수정된 버전에 따라 수행하였다. 샘플에 10 킬로뉴튼(kN) 로드 셀이 장착된 기계적 테스트 시스템(858 Mini Bionix, MTS)에서 압축 하중을 적용하였다. 샘플을 25 뉴턴(N) 예압을 적용한 후 분 당 0.5 밀리미터(mm 분-1)의 크로스-헤드 변위 속도로 장축(즉, 축 방향)을 따라 압축하였다.
실시형태에 따른, 탄수화물 후처리 및 희생 템플레이팅
농축된 이소말트 용액으로 처리함으로써 소결된 탄수화물을 후처리하였다. 이소말트를 끓는 탈이온수(물 100 밀리리터(ml)에 이소말트 60 그램(g))에 용해하고, 실온으로 냉각하고, 여과(Steriflip®, 0.22 μm 폴리에테르설폰)하고 실온에 보관하였다. 소결된 탄수화물을 이러한 용액에 10 내지 20초 동안 담그고 빼낸 다음, 가압 질소 가스 스트림을 사용하거나 Kimwipe™로 위킹(wicking)하여 과도한 액체를 제거하였다.
일부 실시형태에서, 벌크 매트릭스 재료가 고형화되는 동안 탄수화물 아키텍처를 보존하기 위해 추가의 소수성 코팅을 탄수화물 템플릿에 추가하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어, 따뜻한 아가로스 용액은 완전히 고형화되기 전에 탄수화물 필라멘트를 변형시킬 수 있음, 특히, 대용량 겔에서). 소수성 코팅을 아가로스 겔(도 12d, 13 내지 17 및 21)뿐만 아니라 데모 겔(도 12a 내지 12c 및 12e 내지 12f)을 사용한 모든 예시적 실시형태에 대해 사용하였다. 소수성 코팅을 클로로포름(Alfa AesarTM; 10 내지 25 mg ml-1)에 용해된 PCL(CAPATM 6500, Perstorp AB®) 또는 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)(AP062, Akina, Inc.) 용액에 템플릿을 침지하여 수행하였다. 가압 질소 가스로 과도한 코팅을 제거하고 코팅된 템플릿을 5분 동안 건조시켰다.
일부 실시형태에서, 탄수화물 템플릿에 대한 소수성 코팅을 배제하는 것이 바람직할 수 있다. 코팅되지 않은 템플릿은 내피 세포 시딩 및 공간 패턴화를 사용한 실험에 사용하였다(도 18a 내지 19b 및 19a 내지 19b).
템플릿과 유리 사이의 계면을 따라 추가 PCL 용액(클로로포름 중 100 mg ml-1)을 분배하고 용매를 증발시켜 희생 템플레이팅 용으로 지정된 탄수화물 템플릿을 유리 슬라이드에 부착하였다.
전형적인 희생 템플레이팅 실험에서, 전술한 바와 같이 후처리 후 탄수화물 템플릿 주위에 피펫을 통해 예비-중합체를 분배하였다.
도 12a에서, PCL 용액(클로로포름 중 40 wt%)에서 염화나트륨 결정의 슬러리를 형성한 다음, 이 슬러리를 탄수화물 템플릿 주위에 분배하고 밤새 용매를 증발시켜 PCL 발포체를 제조하였다. 도 12b에서, PDMS(SylgardTM 184, Dow Corning®)를 10:1 염기:촉매 혼합물을 탄수화물 템플릿 주위에 분배하고 48시간(h) 동안 경화시켜 제조하였다.
도 12c에서, PEGDA(6 kDa, 20 wt%; 다른 곳에서 보고된 바와 같이 합성함) 또는 GelMA(10 wt%; 다른 곳에서 보고된 바와 같이 합성함) 및 광개시제(Irgacure® 2959, 0.05 wt%; Ciba®)의 혼합물을 탄수화물 템플릿 주위에 분배하고 30 내지 60초 동안 광중합(제곱 센티미터당 100 메가와트(mW cm-2), 320 내지 500nm; Omnicure® S2000)하여 광중합된 PEGDA 및 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 하이드로겔을 제조하였다.
도 12d에서, 저융점 아가로스(2 wt%; Gold Biotechnology®) 용액을 분배하고, 60℃로 가열한 다음 탄수화물 템플릿 주위에서, 37 내지 42℃로 냉각하고, 이어서 4℃로 냉각하여 아가로스 하이드로겔을 제조하였다.
도 12e에서, 수성 실크 용액(4 내지 8 wt%; David L. Kaplan 박사 제공, 다른 곳에서 보고된 바와 같이 제조함)을 밀리리터 당 10단위(U ml-1)의 양고추냉이 과산화효소 및 밀리리터 당 10 마이크로리터(μL mL-1) 과산화수소(165 밀리몰(mM); VWR Chemicals BDH®)을 혼합하고, 탄수화물 템플릿 주위에 분배하고, 37℃에서 10분(min) 동안 중합하여 실크 피브로인 하이드로겔을 제조하였다.
도 12f에서, 피브리노겐(밀리리터 당 20 밀리그램(mg ml-1); Sigma-Aldrich®) 및 트롬빈(50 U ml-1; Sigma-Aldrich®)의 혼합물을 탄수화물 템플릿 주위에 분배하고 37℃에서 10분 동안 중합하여 피브린 하이드로겔을 제조하였다.
모든 벌크 재료에 대해, 탈이온수 또는 PBS에서 인큐베이션하여 탄수화물 템플릿을 희생(용해 제거)하고 주사기로 채널을 통해 부드럽게 플러싱하도록 하였다.
PCL 발포체를 후속적으로 동결시키고 동결건조하였다.
Microfil® 실리콘 주입 화합물 또는 겔에 현탁된 콜로이드 잉크를 사용한 관류에 의해 희생적으로 템플릿화된 채널을 시각화하였다. 색상 베이스, 희석제 및 경화제(각각 4, 5 및 0.45 ml)를 혼합하고 30분 동안 사전-경화한 다음 주사기 펌프를 사용하여 충분히 경화될 때까지 10분 동안 채널을 통해 관류하여 Microfil®(Flow Tech)을 제조하였다. 잉크 현탁액은 인도 잉크(10 내지 100 μL mL-1)를 PEGDA(3.4kDa, 20 wt%) 및 광개시제(Irgacure 2959; 0.05 wt%) 또는 아가로스(2 wt%)와 혼합하여 형성하였다. 이러한 현탁액을 주사기를 이용하여 채널을 통해 관류하고 광중합(다양한 회전 각도에서 60 내지 120초, 100 mW cm-2)하거나 채널 내부에서 냉각시켰다. 탄수화물 템플릿 및 희생 템플릿 재료를 DSLR 카메라를 사용하여, 사진촬영을 위해 물에 잠긴 하이드로겔과 함께 사진 촬영하였다.
실시형태에 따른 세포-함유 겔의 제조
실시형태에 따른, HepG2 세포를 갖는 아가로스 겔
HepG2 간모세포종 세포(ATCC)를 10% 태아 소 혈청(FBS: fetal bovine serum)(Atlanta BiologicalsTM), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Life TechnologiesTM), 및 1x 비-필수 아미노산(Caisson Laboratories, Inc.)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium, 4.5 g L-1 글루코스; Corning®)에서 성장시켰다.
원하는 겔 부피의 절반이 되도록 완전한 배지에 적절한 수의 세포를 재현탁하여 세포-함유 아가로스 겔을 제조하였다.
이러한 세포 현탁액을 동일한 부피의 멸균 저융점 아가로스(PBS 중 4 wt%, 60℃로 가열한 다음, 세포와 혼합하기 전에 37 내지 42℃로 냉각시킴)와 합하였다.
세포 현탁액 및 아가로스를 양변위 피펫(Microman® E, GilsonTM)을 사용하여 약 60초 동안 격렬하게 혼합한 후 탄수화물 템플릿 주위에 분배하고 5 내지 10분 동안 4℃로 냉각시켰다.
탄수화물 템플릿을 10 내지 15분 동안 배지에서 인큐베이션하여 제거하고, 주사기를 통해 배지를 사용하여 채널을 통해 부드럽게 플러싱하도록 하였다.
실시형태에 따른, 1차 간세포 응집체가 있는 아가로스 겔
간세포/정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF) 응집체를 수확하고, 아가로스 겔에 캡슐화하고, HepG2 세포에 대해 상기 기재된 바와 같이 관류 챔버에서 카테터를 삽입하였다. 모든 실험은 대략 10e6 간세포 mL-1 및 5e6 NHDF mL-1의 최종 세포 밀도를 사용하였고, 무세포 아가로스 겔("blank")을 알부민 측정을 위한 음성 대조군으로 캐스팅하였다.
정적 및 관류 겔의 비교를 위해, 한 세트의 겔을 다채널 연동 펌프를 사용하여 20 μL 분-1에서 간세포 배양 배지로 관류하였다.
겔의 두 번째 세트를 동일하게 카테터에 삽입하고 간세포 배지의 1 mL 주사기를 유입구와 배출구에 연결하여 영양소가 겔로 확산 수송되도록 하였다.
종방향 알부민 측정을 위해, 관류된 겔로부터 유출 배지를 각각 수집하고, 축적된 알부민을 포획하기 위해 정적 겔을 새로운 배지를 통해 플러싱하였다.
고밀도 수지상 겔을 1 mL 분-1에서 맞춤 설계된 연동 펌프를 사용하여 연속적으로 재순환되는 50 mL 간세포 배양 배지와 흐름 루프 구성으로 연결하였다. 매일, 알부민 측정을 위해 흐름 루프에서 10 내지 20 mL 배지를 무균 상태로 제거하고 동일한 부피의 새 배지로 교체하였다.
실시형태에 따른, 내피화된 GelMA 겔
녹색-형광 페인트(GFP)-표지된 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC); (Angio-Proteomie; 4 내지 7회 계대)를 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 완전한 Vasculife® 배지(Lifeline® Cell Technologies)에서 성장시켰다. IMR-90 폐 섬유모세포(미국미생물기탁소(American Type Culture Collection))를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 F-12K 배지(미국미생물기탁소)에서 성장시켰다.
캡슐화된 IMR-90 섬유아세포(2.5e6 세포 mL-1)를 포함하거나 포함하지 않고 희생적으로 템플레이팅된 GelMA 겔(10 wt%; 평면 수지상 아키텍처)을 제조하고 HUVEC 주사 전에 맞춤형 관류 챔버 내부에 카테터를 삽입하였다(주요 방법 섹션에 설명된 바와 같음).
HUVEC를 시딩을 위해 30e6 mL-1의 밀도로 재현탁하고 카테터를 통해 채널에 천천히 주입하였다. 균일한 HUVEC 접착을 촉진하기 위해, 겔을 37℃에서 6시간 동안 시딩하고 15분마다 90도 회전시켰다.
시딩 기간 후, 겔을 완전한 VascuLife® 배지(HUVEC-단독 겔) 또는 VascuLife®:F12-K(IMR-90을 갖는 HUVEC 겔) 배지의 1:1 혼합물로 관류시켰다. 유속은 처음 24시간 동안 5 μL 분-1, 다음 24시간 동안 10 μL 분-1, 그 이후에는 20 μL 분-1으로 설정하였다.
실시형태에 따른, 공간적으로 패턴화된 겔
GFP-HUVEC 및 IMR-90 섬유모세포 세포를 상기 기재된 바와 같이 배양하였다. 344SQ 뮤린 전이성 폐 선암종 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지(Corning®)에서 성장시켰다.
IMR-90 및 344SQ를 프로토콜 662023에 대한 Rice University Institutional Biosafety Committee 감독에 따라 2세대 렌티바이러스를 사용하여 각각 H2B-mOrange2 및 H2B-mVenus를 코딩하는 플라스미드로 안정적으로 형질도입하였다.
344SQ 응집체를 다른 곳에서 상술한 바와 같이 형성하였다; 간략하게, 레이저-제거된 PDMS 마이크로웰을 Pluronic F-127 용액(5 wt%)으로 부동태화하고 부드러운 원심분리(200 X g)를 사용하여 웰 당 200개의 세포를 시딩하였다. 37℃에서 밤새 응집한 후, 부드러운 피펫팅으로 응집체를 수확하고 느슨한 세포를 40 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 폐기하였다.
하나의 열린 면을 유리 슬라이드에 부착하고 반대쪽 열린 면 위로 Parafilm®을 늘려 예비 중합체가 피펫팅될 수 있는 작은 간격을 남겨둠으로써 공간적으로 패턴화된 겔을 캐스팅하기 위해 탄수화물 템플릿을 제조하였다. 세포 또는 비드(10μm 녹색, 적색, 및 청색 형광 폴리스티렌 비드; MagSphere)의 적절한 조합을 적절한 하이드로겔 예비-중합체에 현탁하고 순차적으로 탄수화물 템플릿의 부피로 피펫팅하였다.
피펫팅 직후 GelMA-함유 겔 영역을 부분적으로 광중합(5초 광 노출)시켰고 전체 구조물을 캐스팅한 후 광중합을 완료(각 면에 30초 노출)하였다.
광중합 후, 겔을 37℃에서 인큐베이션하여 피브린 겔을 완전히 가교 결합시켰다. 겔은 위에서 설명한 관류 챔버에 카테터를 삽입하고 완전한 VascuLife® 배지(5 μL 분-1)로 관류하였다.
실시형태에 따른, 세포-함유 겔의 제조 및 관류
전술한 바와 같이 희생적으로 템플레이팅된 겔을 맞춤 설계된 관류 챔버 카세트 내부에 카테터를 삽입하여 수일 관류 배양을 위해 제조하였다.
일반적으로, 관류 챔버의 용적은 맞춤형 공압 압출 프린터(https://github.com/MillerLabFTW/ShopBot-PDMS-Printer)를 사용하여 유리 슬라이드에 직접 압출된 비-유동 PDMS(SE 1700; Dow Corning®)로부터 또는 모델링된 PDMS 가스켓 인서트가 있는 3D-인쇄된 폴리(락트산)으로부터 형성하였다.
각각의 겔을 관류 챔버 내부에 배치하고 정맥 캐뉼라 카테터(맥관 네트워크 아키텍처에 따라 14 및 22 게이지 사이) 또는 15 내지 20 게이지 사이의 유연한 무딘 루어 팁(Nordson Electron Fusion Devices)으로 카테터를 삽입하였다.
아가로스 겔을 사용한 실험에서, 카테터가 손상되거나 채널 밖으로 미끄러지는 것을 방지하기 위해, 전체 관류 챔버를 채우기 위해 추가적인 무세포 아가로스를 분배함으로써 겔을 고정화하였다. 이러한 추가적인 아가로스 고형화 후, 챔버를 유리 슬라이드로 덮고 나사를 조여 어셈블리를 고정함으로써 관류 카세트를 조립하였다.
내피화된 겔 및 단순 맥관 네트워크를 갖는 겔을 완전한 배지가 주사기 또는 배지 백으로부터 멸균 필터(0.22 μm 폴리에터설폰)를 통해 겔을 통해 폐기물 용기로 펌핑되는 직선 흐름 경로로 연결하였다. 흐름 경로의 다양한 구성요소를 실리콘 마이크로보어 튜빙(Tygon®, Cole-Parmer®)을 사용하여 연결하였다.
주사기 펌프(NE-300; New Era Pump SystemsTM) 또는 다중채널 연동 펌프(IsmatecTM, Cole-Parmer®)를 사용하여 배지를 25 L 분-1의 유속으로 펌핑하였다.
수지상 세포-함유 겔을 흐름 루프 구성으로 연결하였다. HepG2 흐름 루프 관류(도 6)의 경우, 150 ml의 완전 배지를 연동 펌프(IsmatecTM)로 겔과 공기로 채워진 PYREX® 병 사이에서 500 L 분-1으로 연속적으로 순환시켰다.
종방향 기능 모니터링을 통한 흐름 루프 관류를 위해, 재순환 배지가 샘플링되고 보충될 수 있도록 하는 흐름 루프 설계를 채택하였다. 맞춤형 연동 펌프를 사용하여 약 50 mL의 일정한 부피를 재순환시켰다; 일방향 샘플링 밸브를 통해 매일 20 mL을 제거하고 이 양을 연결된 정맥주사 백에서 보충하였다.
실시형태에 따른, 수지상 맥관 네트워크로 패턴화된 겔의 유동-루프 관류
약 500 μL 분-1의 유속으로 연동 펌프를 사용하여 흐름 루프에서 수지상 네트워크를 갖는 겔을 관류시켰다. 겔을 수직으로 배향하여 수평으로 배향된 겔에 비해 아키텍처 전체에 걸쳐 채널의 관류를 향상시켰다. 겔 전체에 걸친 페놀 레드 색상의 구배는 겔 전체에서 이용가능한 상대적인 대사산물 교환을 나타낸다. 겔은 처음에 페놀 레드가 없는 배지를 사용하여 캐스팅하였고 페놀 레드가 함유된 배지로 관류하였다. 관류를 시작한 직후, 관류 배지는 채널에서 보였지만 간질 공간으로의 영양분과 페놀 레드의 확산은 무시할 수 있다. 2일 후, 관류 배지의 구성요소는 전체 겔에 걸쳐 확산될 수 있다.
대사 활성 세포가 있는 겔에서, CO2가 채널로 교환되어 운반될 수 있는 관류 채널 부근에서 적색이 관찰되었다. 대조적으로, CO2와 대사 폐기물은 채널에서 멀리 떨어져 축적되어 겔이 산성화되어 노란색을 나타냈다. 살아있는 세포를 함유하지 않는 겔은 관류 배지가 2일 후에 겔의 모든 곳으로 확산될 것임을 확인시켜주었으며, 이는 페놀 레드 구배가 페놀 레드의 불완전한 확산이 아니라 차등 대사산물 교환으로 인한 것임을 확인시켜주었다.
종방향 배지 샘플링을 사용한 흐름 루프 관류를 위해, 일방향 샘플링 밸브 및 영양분을 보충하기 위해 흐름 루프에 추가될 수 있는 배지를 함유하는 IV 백을 갖는 보다 진보된 장치를 설계하였다.
실시형태예에 따른, 면역염색 및 형광 이미지화
대면적 스캔을 획득하기 위해 전동 스테이지를 사용하여, ZylaTM 4.2 sCMOS 카메라(Andor® Technology Limited)가 장착된 Ti-E 도립 현미경(Nikon®)에서 내피화되고 공간적으로 패턴화된 겔의 광시야 형광 이미지화를 수행하였다.
실시형태에 따른, 겔 절편화 및 영상화
염색 전에, 겔을 배양물로부터 제거하고 진동 마이크로톰(VT1000S, LeicaTM)에서 슬라이스로 생절단(live section)하였다. 절편화를 위해, 겔을 시아노아크릴레이트 접착제로 금속 스테이지에 부착하고 실온 DMEM(절편화 배지: 무혈청, 페놀 레드 무함유, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 담갔다. 절편화 직후, 겔 조각을 MTT 용액으로 염색하여 대사량을 측정하였다.
MTT 저장 용액을 제조하기 위해, MTT(Bio Basic)를 PBS(5 mg ml-1)에 용해하고, 멸균 여과하고 -20℃에서 보관하였다. 동일한 부피의 해동된 저장 용액을 절편화 배지와 혼합하여 MTT 염색 용액을 제조하고 완전히 잠길 때까지 겔 조각에 첨가하였다.
30분(또는 저체온 관류 실험의 경우 60분) 후, MTT 염색 용액을 흡인하고 겔 슬라이스를 파라포름알데히드(4%; Electron Microscopy Sciences, Inc.)에 30분 동안 고정하였다.
고정 후, 슬라이스를 핵 염색(3 μL mL-1) Nuclear GreenTM LCS1; Abcam)에서 인큐베이션한 후, 이미지화 전에 PBS(3 × 30분)로 세척하였다.
염색된 겔 슬라이스를 DSLR 카메라(EOS 5DSR; Canon®)가 장착된 입체 현미경(SteREO Discovery.V8; ZeissTM)에서 이미지화하였다.
본 발명은 제한된 수의 실시형태에 대해 설명되었지만, 본 개시내용의 이점을 갖는 당업자는 본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다른 실시형태가 고안될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.

Claims (40)

  1. 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 포함하는 구조를 형성하는데 유용한 조성물로서,
    상기 조성물은 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제를 포함하며, 상기 분말은
    과립 형태를 갖고,
    밀리리터 당 6 밀리줄(mJ/mL) 미만의 비에너지(specific energy)를 갖는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    탄수화물 분말은 덱스트란 또는 이소말트 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    케이킹 방지제는 옥수수전분, 이산화 규소, 또는 잔탄검 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말은 자유-유동(free-flowing) 분말이 되도록 구성되고,
    분말은 250 마이크로미터(μm) 이하의 최대 입자 크기를 갖는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 3차원 구조.
  6. 제4항에 있어서,
    소수성 중합체를 포함하는 표면 코팅을 추가로 포함하는, 3차원 구조.
  7. 제4항에 있어서,
    분말은 레이저를 사용한 견고하고 근접한 필라멘트(solid, contiguous filament)로 함께 융합되는, 3차원 구조.
  8. 제4항에 있어서,
    분말은 레이저를 사용한 견고한(solid) 필라멘트 네트워크로 함께 융합되는, 3차원 구조.
  9. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    구조는 평활화 용액을 사용하는 표면 평활화가 수행된, 3차원 구조.
  10. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    평활화된 구조는 이후에 소수성 중합체로 코팅되는, 3차원 구조.
  11. 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 포함하는 구조로서,
    구조 재료가 배치되는 것을 통한 매트릭스 재료를 포함하고;
    상기 구조 재료는 물에서 용해되거나 분해될 수 있고,
    상기 구조 재료는 에너지 빔으로 조사될 때 고체로 융합되는 분말로부터 형성되며,
    상기 분말은 과립 형태를 갖고, 6 mJ/mL 미만의 비에너지를 갖는, 구조.
  12. 제11항에 있어서,
    분말은 레이저를 사용하는 견고하고 근접한(solid, contiguous) 필라멘트로 함께 융합되는, 구조.
  13. 제11항에 있어서,
    분말은 레이저를 사용하는 견고하고 근접한(solid, contiguous) 3차원 필라멘트 네트워크로 함께 융합되는, 구조.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    구조의 표면은 평활 토포그래피를 갖는, 구조.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말은 케이킹 방지제를 추가로 포함하는, 구조.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    구조 재료는 적어도 하나의 탄수화물을 포함하는, 구조.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    구조 재료는 덱스트란 또는 이소말트 중 적어도 하나를 포함하는, 구조.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    구조 재료는 포토레지스트, 아가로스, 젤라틴, 탄수화물, 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 이소말트, 덱스트란, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리(락트산), 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 중 적어도 하나를 포함하는, 구조.
  19. 제15항에 있어서,
    케이킹 방지제는 구조 재료의 흐름, 마찰 특성, 또는 입자 패킹 중 적어도 하나를 개선하는 하나 이상의 재료를 포함하는, 구조.
  20. 제15항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    케이킹 방지제는 옥수수전분, 이산화 규소, 또는 잔탄검 중 적어도 하나를 포함하는, 구조.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말의 입자 크기는 250 μm 이하의 직경인, 구조.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    구조의 표면은 소수성 코팅을 갖는, 구조.
  23. 제22항에 있어서,
    소수성 코팅은 폴리카프로락톤, 폴리(L-락타이드), 폴리락트산, 폴리(락트 co-글리콜산), 콜라겐, 젤라틴, 제인(zein), 셸락, 전분, 왁스, 또는 바셀린 중 적어도 하나를 포함하는, 구조.
  24. 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    매트릭스 재료는 폴리아미드, 폴리(2-히드록시 에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리우레탄, 콜라겐, 아가로스, 알부민, 알지네이트, 키토산, 전분, 히알루론산, 젤라틴, 피브린, 마트리겔, 글리세롤, 글리콜, 만니톨, 이노시톨, 자일리톨, 아도니톨, 글리신, 아르기닌, 생물학적 중합체 분자, 또는 펩티드 양친매성체, 또는 이들의 단량체, 이량체, 또는 올리고머 중 적어도 하나를 포함하는, 구조.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말은 자유-유동(free-flowing) 분말이 되도록 구성되는, 구조.
  26. 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하는 방법으로서,
    에너지 빔으로 융합하여 분말을 고형화하여 필라멘트 네트워크를 형성하는 단계로서;
    상기 필라멘트 네트워크는 복수의 필라멘트를 포함하고 빈 공간을 한정하고, 그리고
    복수의 필라멘트는 물에서 용해되거나 분해될 수 있는 단계;
    필라멘트 네트워크의 빈 공간을 매트릭스 재료로 다시 채우는 단계; 및
    필라멘트를 제거하여 유동성 채널을 포함하는 실질적으로 상호 연결된 맥관 네트워크를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    매트릭스 재료는 생체재료를 포함하는 수용액인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    생체재료를 가교 결합하여 빈 공간에 하이드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말은 탄수화물 분말 및 케이킹 방지제를 포함하며, 상기 분말은
    과립 형태를 갖고,
    6 mJ/mL 미만의 비에너지(specific energy)를 갖고, 그리고
    에너지 빔은 레이저인, 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 필라멘트를 평활화 용액으로 표면 평활화하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 표면 평활화는 필라멘트의 아키텍처를 달리 변경하지 않는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    평활화 용액은 이소말트, 덱스트란, 수크로스, 글루코스, 락토스, 트레할로스, 메이플 시럽, 또는 사탕수수 시럽 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 필라멘트를 표면 코팅 재료로 표면 코팅하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서,
    상기 표면 코팅 재료는 빈 공간을 다시 채우지 않고,
    매트릭스 재료 및 표면 코팅 재료는 상이한 재료인, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    표면 코팅 재료는 폴리카프로락톤, 폴리(L-락타이드), 폴리락트산, 폴리(락트 co-글리콜산), 콜라겐, 젤라틴, 제인(zein), 셸락, 전분, 왁스, 또는 바셀린 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    필라멘트 네트워크는 3차원적으로 분지된 패턴으로 배치되는, 방법.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    필라멘트 네트워크는 상호 침투하는 기하학으로 배치되는, 방법.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    필라멘트는 제조 동안 지지되지 않은 기하학으로 구성되는, 방법.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    필라멘트 제거는 용해 또는 분해에 의해 수행되는, 방법.
  38. 제27항에 있어서,
    수용액은 살아있는 세포의 현탁액을 추가로 포함하고, 상기 필라멘트를 제거하는 단계는 살아있는 세포를 손상시키지 않는, 방법.
  39. 제27항에 있어서,
    매트릭스 재료는 가교 결합된 생체재료이고, 생체재료는 폴리아미드, 폴리(2-히드록시 에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리우레탄, 콜라겐, 아가로스, 알부민, 알지네이트, 키토산, 전분, 히알루론산, 젤라틴, 피브린, 마트리겔, 글리세롤, 글리콜, 만니톨, 이노시톨, 자일리톨, 아도니톨, 글리신, 아르기닌, 생물학적 중합체 분자, 또는 펩티드 양친매성체, 또는 이들의 단량체, 이량체, 또는 올리고머 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말은 자유-유동(free-flowing) 분말이 되도록 구성되고, 분말은 250 μm 이하의 최대 입자 크기를 갖는, 방법.
KR1020227043825A 2020-05-22 2021-05-21 레이저-소결 탄수화물 재료 및 조성물의 제조 방법 및 이의 용도 KR20230012545A (ko)

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