KR20230010668A - 인공 항원 제시 세포 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230010668A
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체-밍 잭 후
정-첸 린
청-야오 슈
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셀텍, 인크.
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Abstract

하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포 및 하나 이상의 사이토카인을 방출할 수 있는 제어 방출 시스템을 포함하는 인공 항원 제시 세포 시스템(artificial antigen presenting cell system). 또한 겔화된 인간 수지상 세포를 생성하는 방법 및 면역 세포를 활성화하기 위한 상기 인공 항원 제시 세포 시스템의 용도가 본원에 제공된다.

Description

인공 항원 제시 세포 시스템 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 5월 8일자로 출원된 미국 가출원 번호 63/022,289의 35 U.S.C. § 119(e) 하에서의 혜택을 주장하며, 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
자연 발생 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC) 또는 인공 APC(aAPC)를 포함하는 APC를 통한 T 세포 및 이의 기능의 직접 조절은 암, 바이러스 감염 및 자가면역 질환에 이르는 질환에 대한 매력적인 치료 전략이다. Constantino 등, Transl Res 2016, 168, 74-95; 및 Palucka 등, Nat Rev Cancer 2012, 12(4), 265-77. T 세포 기반 입양 세포 요법의 최근 임상적 관심과 발전은 생체 외 T 세포 조절을 위한 APC의 추가 채택으로 이어졌으며, 이는 신생항원 특이적 T 세포, 종양 침윤 림프구, 바이러스 표적 T 세포의 확대뿐만 아니라 후속 유전자 변형을 위한 일반적인 T 세포 확대를 가능하게 한다. Constantino 등, 2016; 및 Fucikova 등, Front Immunol 2019, 10, 2393.
인공 APC의 개발은 유지 관리, 보관 및 무균 요건 고려로 인해 관심이 있었다. Sunshine 등, Nanomedicine (Lond) 2013, 8(7), 1173-89; Turtle 등, Cancer J 2010, 16(4), 374-81; Durai 등 Cancer Immunol Immunother 2009, 58(2), 209-20; Latouche 등, Nat Biotechnol 2000, 18(4), 405-9; 및 Sasawatari 등, Immunol Cell Biol 2006, 84(6), 512-21. 그러나 살아있는 수지상 세포(DC)와 같은 자연 발생 APC를 크게 모방할 수 있는 APC를 구성하는 것은 여전히 어려운 일이다.
본 개시내용은 (a) T 세포에 항원 펩티드를 제시할 수 있는 겔화된 인간 수지상 세포(dendritic cell) 및 (b) 하나 이상의 사이토카인을 분비할 수 있는 제어 방출 시스템(controlled release system)을 포함하는 효율적인 인공 항원 제시 세포(artificial antigen presenting cell, aAPC) 시스템의 개발에 적어도 부분적으로 기초한다. 인간 수지상 세포는 유전적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 인간 수지상 세포는 자연 발생적일 수 있다. 본원에 개시된 aAPC 시스템은 T 세포 수용체와 MHC/펩티드 복합체의 결합에 의해 촉발되는 1차 신호전달 경로, T 세포의 공동자극 수용체와 이의 리간드 간의 상호작용에 의해 촉발되는 공동자극 신호전달 경로 및 자극성 사이토카인이 면역 세포에서의 이의 수용체에 결합함으로써 촉발되는 신호전달 경로를 포함하는 3개의 신호전달 경로를 통해 T 세포와 같은 면역 세포를 완전히 활성화할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은 (a) 하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포; 및 (b) 하나 이상의 사이토카인과 회합된 제어 방출 시스템을 포함하는 인공 항원 제시 세포 복합체를 제공한다. 하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포는 제어 방출 시스템에 부착되어 인공 항원 제시 세포 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 인공 항원 제시 세포 복합체는 하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포의 표면에 표시되는 항원성 펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제어 방출 시스템은 하나 이상의 사이토카인을 캡슐화할 수 있는 마이크로입자를 포함한다. 예시적인 사이토카인은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL21, IL-23, IL-10, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFNλ 및/또는 과립구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자는 하나 이상의 분해성 중합체, 예를 들어, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원성 펩티드는 겔화된 인간 수지상 세포의 주조직적합성복합체 I형(major histocompatibility complex class I) 분자에 의해 표시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 겔화된 인간 세포는 세포 내 가교된 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(polyethylene glycol diacrylate, PEG-DA)를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 인간 수지상 세포 군을 제공하는 단계; (b) 광개시제, 중합체 또는 중합성 단량체, 및 디메틸 설폭사이드를 포함하는 겔화 버퍼(gelation buffer)를 인간 수지상 세포에 침투시키는 단계; 및 (c) 겔화 버퍼가 침투된 인간 수지상 세포를 빛에 노출시켜 중합체를 가교시켜 겔화된 인간 수지상 세포를 형성하는 단계를 포함하는, 겔화된 인간 수지상 세포의 제조 방법을 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 (d) 겔화된 인간 수지상 세포를 하나 이상의 사이토카인과 회합된 제어 방출 시스템에 커플링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 겔화 버퍼 중 중합체는 아크릴 중합체, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEG-DA)일 수 있다. 일부 예에서, 아크릴 중합체는 평균 분자량이 약 250 내지 약 2,000 달톤(dalton)일 수 있는 PEG-DA이다. 다른 예에서, PEG-DA는 평균 분자량이 약 600 내지 약 800 달톤일 수 있다. 일부 실시양태에서, 겔화 버퍼는 중합성 단량체, 예를 들어, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, (하이드록시에틸)메타크릴레이트, 아크릴산, 나트륨 아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 광개시제는 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논이다.
또한 본 개시내용의 범위 내에는 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성된 임의의 인공 항원 제시 인간 수지상 세포가 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (ⅰ) 본원에 개시된 임의의 인공 항원 제시 세포 복합체를 제공하는 단계; (ⅱ) 인공 항원 제시 세포 복합체를 항원성 펩티드로 프라이밍하여 인공 항원 제시 세포 복합체에서 겔화된 인간 수지상 세포의 표면에 펩티드를 표시하는 단계; 및 (ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 생성된 인공 항원 제시 세포 복합체를 면역 세포를 포함하는 세포 군과 접촉시켜 면역 세포를 활성화하는 단계를 포함하는, 면역 세포 활성화 방법을 제공한다. 선택적으로, 상기 방법은 단계 (ⅲ)에서 생성된 활성화 면역 세포를 이것이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 암 항원, 또는 자가면역 질환과 관련된 자가 항원에서 유래한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 아래의 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 다음 도면과 여러 실시양태의 상세한 설명으로부터, 및 첨부된 청구범위로부터도 명백할 것이다.
도 1a-1d는 DMSO 매개 단량체 및 광개시제 침투를 통한 겔화된 수지상 세포(G-DC)의 제조 및 특성화를 나타내는 다이어그램이다. 도 1a는 DMSO의 존재 하에 하이드로겔 단량체 및 광개시제를 세포의 세포 내 도메인으로 직접 침투시키는 것에 따른 겔화된 수지상 세포의 제조를 나타내는 개략도이다. UV 가교제는 광활성화 가교에 사용된다. 도 1b: 10중량%의 PEG-DA 겔화 버퍼에서 배양한 후 세포의 PEG 정량화는 세포 내 PEG-DA 단량체 농도가 배양 5분 후 포화에 접근함을 나타낸다. 도 1c: 플루오레세인(fluorescein)-DA로 제조된 겔화된 수지상 세포의 형광 및 명시야 현미경 관찰은 겔화된 수지상 세포가 PBS 및 물에서 현탁될 때 구조적 무결성을 유지함을 나타낸다. 도 1d: G-DC의 안정성은 PBS에서 현탁 21일 후에 평가한다.
도 2a-2f는 G-DC 항원 제시가 세포 내 하이드로겔화 후 펩티드 펄싱에 의해 조절될 수 있음을 나타내는 다이어그램이다. 도 2a: 세포 내 하이드로겔화 후 펩티드 항원이 JAWSII 세포에 첨가될 수 있음을 나타내는 개략도. 도 2b-2c: JAWSII 세포를 LPS로 처리한 다음 광활성화 하이드로겔 시스템을 이용해 겔화하였다. 비활성화 G-DC 그룹에서, 겔화를 위해 펩티드 및 LPS 활성화가 없는 대조군 JAWSII 세포를 준비하였다. 활성화 G-DC 그룹에서 SIINFEKL 펩티드를 세포 내 하이드로겔화 전에 JAWSII의 LPS 활성화 동안 첨가하였다. LPS 처리 G-DC 그룹에서, JAWSII는 SIINFEKL 펩티드의 부재 하에 활성화되었고 SIINFEKL 펩티드는 세포 내 하이드로겔화 후 LPS 처리 G-DC add OT-I 펩티드 그룹에 첨가되었다. 모든 그룹의 표면에 있는 H-2Kb/SIINFEKL 복합체를 유세포분석으로 관찰하였다. 비활성화, 활성화 및 LPS 처리 세포를 포함하는 대조군도 표면 마커 비교를 위해 겔화하였다. 히스토그램(도 2b) 및 막대 그래프(도 2c)는 수확된 CD8+ 세포 군에서 H-2Kb/SIINFEKL 복합체의 %를 나타낸다. 염색되지 않은 T 세포 그룹(회색으로 채워진 단색 히스토그램으로 표시)을 음성 대조군 유세포분석으로서 사용하였다. 오차 막대는 평균±SEM, n = 3을 나타낸다. (도 2d-2f) 펩티드 교환된 G-DC 및 이의 대조군과 CFSE 염색된 OT-I 특이적 CD8+ T 세포의 공동배양은 펩티드 교환된 G-DC 및 활성화 G-DC에 의해서는 T 세포 확대가 나타나지만 비활성화 G-DC 및 LPS 처리 G-DC는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 히스토그램은 CFSE 증식 프로파일을 나타내고 CFSE 희석 피크는 세포 분열 정도를 나타낸다(도 2d). 막대 그래프는 여러 세대의 분열에서 세포의 백분율을 나타낸다(도 2e). 상이한 G-DC와의 공동배양 후의 세포 수 및 상대적 배수 변화가 (도 2f)에 제시된다. 각 배양 조건은 3:1의 T 세포/G-DC 비율로 웰당 8 × 104개의 고정된 수의 DC를 포함하였다. 막대 그래프의 막대 배열은 왼쪽에서 오른쪽으로 비활성, LPS 처리 및 OTI 펄스, LPS 처리만, 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스이다.
도 3a-3f는 G-DC가 동결 및 동결건조 둘 다에 의해 저장된 후 펩티드 교환된 G-DC의 표면에 CD80이 제시됨을 나타내는 도식이다. 10중량%의 PEG-DA로 제조된 겔화된 JAWSII 세포를 -20℃에서 10% 수크로스 중에서 동결(도 3c 및 3d)하거나 동결건조(도 3e 및 3f)시켰다. 72시간의 저장 후, 해동할 때 또는 물에서 재현탁시킬 때 G-DC가 관찰되었다. 세포 표면에서 MHC Ⅰ형/SIINFEKL 복합체의 발현은 유세포분석으로 검출하였다. 히스토그램(도 3a, 3c 및 3e) 및 막대 그래프(도 3b, 3d 및 3f)는 수확된 세포 군에서의 최대값 %를 나타낸다. 도 3a 및 3b는 대조군인 동결되지 않은 또는 동결건조되지 않은 세포이다. LPS 처리 및 OTI 펄스, LPS 처리, 및 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스 G-DC에서 유사한 패턴이 관찰되었다. 막대 그래프의 막대 배열은 왼쪽에서 오른쪽으로 비활성화, LPS 처리 및 OTI 펄스, LPS 처리만, 및 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스이다.
도 4a-4g는 동결 또는 동결건조시켰을 때 저장 후 G-DC 기능이 유지됨을 나타내는 다이어그램이다. 도 4a: 겔화된 JAWSII의 동결 또는 동결건조에 의한 저장을 나타내는 개략도. 비활성화 G-DC 그룹에서, 겔화를 위해 펩티드 및 LPS 활성화가 없는 대조군 JAWSII 세포를 준비하였다. 활성화 G-DC 그룹에서, SIINFEKL 펩티드를 세포 내 하이드로겔화 전에 JAWSII의 LPS 활성화 동안 첨가하였다. LPS 처리 G-DC 그룹에서, JAWSII는 SIINFEKL 펩티드의 부재하에 활성화되었고 SIINFEKL 펩티드는 세포 내 하이드로겔화 후 LPS 처리 G-DC에 첨가되었다. PBS에 현탁된 대조군 세포 및 상이한 G-DC의 명시야 현미경관찰. 상이한 저장 및 재현탁에 따른 G-DC의 구형도를 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 도 4b-4d: 상이한 G-DC를 -80C에서 동결시키고 T 세포 확대를 위해 해동시켰다. CFSE로 염색된 OT-I 특이적 CD8+ T 세포와 모든 그룹의 공동배양은 활성화 G-DC 및 펄싱 후 그룹에 의한 T 세포 확대를 나타내었지만 비활성화 G-DC 및 LPS 처리 G-DC에서는 그렇지 않았다. 히스토그램은 CFSE 증식 프로파일을 나타내고 CFSE 희석 피크는 분할 시간을 나타낸다. 막대 그래프는 모든 그룹의 세대 및 세포 수 백분율을 나타낸다. 각 배양 조건은 3:1의 T 세포/G-DC 비율로 웰당 8 × 104개의 고정된 수의 DC를 함유하였다. 염색된 대조군 T 세포는 기준으로 검은색으로 표시된다. 도 4e-4g: 다른 G-DC를 동결건조시킨 다음 T 세포 확대를 위한 배지에서 재구성하였다. 오차 막대는 평균±SEM, n = 3을 나타낸다. 막대 그래프의 막대 배열은 왼쪽에서 오른쪽으로 비활성, LPS 처리 및 OTI 펄스, LPS 처리만, 및 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스이다.
도 5a-5d는 G-DC가 동결 및 동결건조 둘 다에 의해 저장된 후 펩티드 교환된 G-DC의 표면에 MHC Ⅰ형/SIINFEKL 복합체가 제시된다는 것을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 10중량%의 PEG-DA로 제조된 겔화된 JAWSII 세포를 -20℃에서 동결시키거나 10% 수크로스에서 동결건조시켰다. 72시간의 저장 후, 해동할 때 또는 물에서 재현탁시킬 때 G-DC가 관찰되었다. 세포 표면에서 MHC Ⅰ형/SIINFEKL 복합체의 발현은 유세포분석으로 검출하였다. 히스토그램(도 5a 및 5c) 및 막대 그래프(도 5b 및 5d)는 수확된 세포 집단에서의 최대값 %를 나타낸다. LPS 처리 및 OTI 펄스 G-DC와 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스 G-DC 간에 유사한 패턴이 관찰되었다. 막대 그래프의 막대 배열은 왼쪽에서 오른쪽으로 비활성, LPS 처리 및 OTI 펄스, LPS 처리만, 및 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스이다.
도 6은 G-DC가 동결 및 동결건조에 의해 성공적으로 저장될 수 있음을 나타내는 사진을 포함한다. 10중량%의 PEG-DA가 주입된 겔화된 JAWSII 세포를 -20℃에서 10% 수크로스에서 동결시키거나 10% 수크로스에서 동결건조시켰다. 72시간 보관 후, 해동할 때 또는 H2O에서 재현탁시킬 때 G-DC가 관찰되었다. 다른 보관 조건 하에 G-DC에서 형태의 식별 가능한 변화가 관찰되지 않았다. 스케일 바 = 100μm.
도 7a-7e는 동결 또는 동결건조 보관 후 G-hDC의 제조 및 특성화를 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 7a: 광활성화 가교에 따른 G-hDC의 제조를 나타내는 개략도. 도 7b: G-hDC를 동결 또는 동결건조시켜 저장한 후 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 도 7c: 플루오레세인-DA로 제조된 G-hDC의 형광 및 명시야 현미경 관찰은 G-hDC가 PBS 및 물에서 현탁될 때 구조적 무결성을 유지함을 나타낸다. 도 7d-7e: 광활성화 하이드로겔 시스템에 의해 hDC가 겔화되었다. 세포 표면에서의 표면 마커의 발현은 유세포분석으로 검출하였다. 히스토그램 및 막대 그래프는 수확된 CD8+ 세포 군에서 인간 MHC Ⅰ형 및 MHC Ⅱ형(도 7d) 뿐만 아니라 CD80 및 CD86(도 7e) 복합체 %를 나타낸다. 염색되지 않은 T 세포 그룹(회색으로 채워진 단색 히스토그램으로 표시)을 음성 대조군 유세포분석으로서 사용하였다. 오차 막대는 평균±SEM, n = 3을 나타낸다.
도 8a-8e는 G-DC가 사이토카인 방출 항원 제시 스페로이드(spheroid)의 제조에 적합하다는 것을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 8a: G-DC를 사이토카인 로딩된 마이크로입자(GC-MP)와 통합함으로써 인공 항원 제시 세포의 구성을 나타내는 개략도. 도 8b: 대표적인 GC-MP가 공초점 현미경으로 관찰되었다. PLGA 기반 MP는 이중 유화 공정을 사용하여 PLGA와 설포-cy5를 혼합하여 합성하였다. MP는 형광 현미경을 사용하여 이미지화하였다. MP를 폴리-L-리신으로 코팅한 후 GC와 혼합한 다음 카르보시아닌 막 염료(carbocyanine membrane dye)인 DiO로 염색하였다. GC-MP는 공초점 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 도 8c: GC-MP의 크기 분포는 현미경 이미지의 ImageJ 분석을 통해 측정되었다. 도 8d: GC-MP는 매우 안정적이며 30일차 관찰 시에 구조적 무결성을 유지한다. 도 8e: GC-MP의 시험관 내 방출 프로파일은 4℃ 및 37℃에서 수행하였다.
도 9는 37 및 4C에서 상이한 조성의 마이크로입자에 의한 방출 동역학을 나타내는 차트이다.
도 10a-10e는 항종양 요법을 위한 GC-MP에 의한 항원 특이적 T 세포의 증식을 나타내는 다이어그램을 포함한다. JAWSII 세포를 활성화를 위해 LPS 및 OTI 펩티드 펄스로 처리한 다음 광활성화 하이드로겔 시스템에 의해 겔화하였다. 도 10a-10c: CFSE 염색된 OT-I 특이적 CD8+ T 세포와 배지 단독, IL2 로딩된 마이크로입자(MP-IL-2, GC 코팅 없음), GC-MP(IL-2 없음) 또는 GC-MP-IL-2의 공동배양은 GC-MP와 GC-MP-IL-2에 의한 T 세포 확대를 나타냈다. 도 10a: 히스토그램은 CFSE 증식 프로파일을 나타내고 CFSE 희석 피크는 분할 수준을 나타낸다. 도 10b: 막대 그래프는 상이한 세대의 세포에서 세포 백분율을 나타낸다. 도 10c: 상이한 aAPC 시스템과의 공동배양 3일 및 6일 후 모든 그룹에서 CD8+ T 세포의 상대적 배수 변화. 도 10d: EG7-OVA 종양 치료를 위한 T 세포 확대 및 투여 계획을 나타내는 개략도. 도 10e: E.G7-OVA 세포(5 × 105개의 세포)를 등쪽 측면 영역의 피부 아래에 피하 이식하고 확대된 항원 특이적 CD8+ T 세포를 0일에 정맥주사로 투여하였다. 종양 크기를 모니터링하고 (W2 × L)/2로 계산했으며, 여기서 W는 너비이고 L은 길이다. 각 배양 조건은 3:1의 T 세포/G-DC 비율로 웰당 8 × 104개의 고정된 수의 DC를 포함하였다. 오차 막대는 평균±SEM, n = 3을 나타낸다.
인공 항원 제시 세포(aAPC)를 만들기 위한 통상적인 합성 접근법과 대조적으로, 본 개시내용은 세포 내 겔화를 통해 살아있는 인간 수지상 세포를 aAPC로 전환하는 접근법에 관한 것이다. 겔화된 인간 수지상 세포는 사이토카인을 분비할 수 있는 제어 방출 시스템과 회합되어 인공 항원 제시 세포 복합체를 형성할 수 있으며, 이는 본원에 개시된 바와 같이 면역 세포를 완전히 활성화할 수 있다. 겔화된 세포를 만드는 방법은 JAWSII 뮤린 DC 세포주와 인간 1차 DC를 동결 또는 동결건조를 통해 저장할 수 있는 강력한 aAPC로 성공적으로 형질전환하였다. JAWSII 유래 aAPC를 사용하여 펩티드 항원 교환 및 마이크로입자 커플링을 통해 사이토카인 방출을 지속할 수 있는 겔화된 세포 스페로이드의 제조를 통해 구성의 모듈화(modularity)를 입증하였다. DC 유래 aAPC는 항원 특이적 T 세포의 확대를 성공적으로 촉발하고 마우스에서 입양(adoptive) T 세포 요법의 항암 효능을 개선하였다.
따라서, 살아있는 인간 수지상 세포로부터 전환될 수 있는 겔화된 인간 수지상 세포, 및 임의로 사이토카인을 분비하기 위한 제어 방출 시스템을 포함하는 인공 항원 제시 세포 시스템; 살아있는 인간 수지상 세포로부터 겔화된 인간 수지상 세포를 생성하는 방법; 및 본원에 개시된 aAPC 시스템을 사용하여 T 세포와 같은 면역 세포를 활성화하는 방법이 본원에 개시된다.
I. 인공 항원 제시 세포 복합체
일부 측면에서, 본 개시내용은 살아있는 인간 수지상 세포에서 유래한 하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포와 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 제어 방출 시스템을 포함하는 인공 항원 제시 세포(aAPC) 복합체를 제공한다. 개시된 aAPC 복합체는 면역 세포를 완전히 활성화할 수 있다.
(ⅰ) 겔화된 인간 수지상 세포
본원에 개시된 겔화된 인간 수지상 세포는 세포 내 겔화를 통해 살아있는 인간 수지상 세포로부터 전환될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 겔화된 인간 수지상 세포는 자연 발생 인간 수지상 세포에 고유하지 않은 세포 내 가교 중합체(즉, 겔화)를 포함하는 인간 수지상 세포를 지칭한다. 겔화된 인간 수지상 세포는 인간 공여자로부터 수득된 인간 수지상 세포로부터 전환될 수 있다. 대안적으로, 겔화된 인간 수지상 세포는 시험관 내 배양된 인간 수지상 세포주로부터 전환될 수 있다.
바람직하게는, 겔화된 인간 수지상 세포의 가교 중합체는 생체적합성이다. 당업계에 공지된 임의의 생체적합성 중합체를 겔화된 인간 수지상 세포를 제조하는 데 사용할 수 있다. 한 예는 작용기, 예를 들어, 아크릴 작용기를 포함할 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 또 다른 예는 N(2-하이드로프로필)메타크릴아미드(HPMA)이다.
일부 실시양태에서, 겔화된 인간 수지상 세포는 수지상 세포의 표면에 발현된 MHC 분자와 복합체화된 항원성 펩티드를 포함한다. 일부 예에서, 항원성 펩티드는 MHC Ⅰ형 분자에 의해 겔화된 수지상 세포의 표면에 표시된다. 다른 예에서, 항원성 펩티드는 MHC Ⅱ형 분자에 의해 겔화된 수지상 세포의 표면에 표시된다. 항원성 펩티드는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 암 항원, 또는 자가면역 질환과 관련된 자가 항원의 단편일 수 있다. 일부 경우에, 항원성 펩티드는 MHC Ⅰ형 제한된 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩티드는 HLA-A(예를 들어, A*0201 또는 A*2402), HLA-B 또는 HLA-C로 제한될 수 있다. 다른 경우에, 항원성 펩티드는 MHC Ⅱ형 제한된 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩티드는 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 또는 HLA-DRB1로 제한될 수 있다. 하나 이상의 특이적 MHC Ⅰ형 및/또는 MHC Ⅱ형 분자를 발현하는 겔화된 인간 수지상 세포는 필요한 MHC 분자를 갖는 인간 공여자로부터 얻을 수 있다.
(ⅱ) 사이토카인 분비를 위한 제어 방출 시스템
본원에 개시된 인공 항원 제시 세포 복합체는 본원에 개시된 겔화된 인간 수지상 세포 중 하나 이상과 회합된 제어 방출 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 제어 방출 시스템은 하나 이상의 사이토카인과 회합되며, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인을 캡슐화한다. 제어 방출 시스템은 하나 이상의 사이토카인이 장기간에 걸쳐 방출될 수 있도록 제어된 속도로 관련 사이토카인을 방출할 수 있는 전달 시스템이다. 일부 실시양태에서, 제어 방출 시스템은 하나 이상의 사이토카인이 미리 설계된 방식으로 방출될 수 있는 방식으로 하나 이상의 사이토카인과 현명하게 조합된 하나 이상의 생체적합성 중합체(예를 들어, 천연 또는 합성)를 포함한다. 사이토카인의 방출은 장기간에 걸쳐 일정할 수 있다. 대안적으로, 사이토카인의 방출은 장기간에 걸쳐 주기적이거나 환경 또는 기타 외부 사건에 의해 촉발될 수 있다. 제어 방출 시스템은 공유 또는 비공유 상호작용(예를 들어, 정전기 상호작용 또는 수소 결합)을 통해 사이토카인이 결합될 수 있는 하나 이상의 생체적합성 물질을 포함할 수 있다. 생체적합성 물질은 중합체, 예를 들어, 하이드로겔을 형성하는 친수성 중합체일 수 있다. 하이드로겔은 친수성인 중합체 쇄의 네트워크이다. 하이드로겔 네트워크에서 친수성 중합체는 중합체의 가교에 의해 3차원 구조를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제어 방출 시스템은 하나 이상의 사이토카인과 회합된 마이크로입자 또는 나노입자를 포함한다. 일부 경우에, 마이크로입자는 사이토카인을 캡슐화할 수 있다. 다른 경우에, 사이토카인은 마이크로입자에 부착될 수 있다. 마이크로입자는 제어 방출 약물 전달 시스템에서 흔히 사용되는 중합체를 포함하는 하나 이상의 적합한 중합체로 제조될 수 있다. 일부 예에서, 마이크로입자를 제조하기 위한 중합체는 생분해성이다. 예로는 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
마이크로입자는 겔화된 인간 수지상 세포 중 하나 이상이 그것에 부착되도록 하는 적절한 크기일 수 있다. 예를 들어, 마이크로입자는 평균 크기가 약 1 내지 약 1,000 마이크로, 예를 들어, 약 10-100, 약 100-200, 약 200-400, 약 400-600, 약 600-800 또는 약 800-1,000 마이크론일 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 마이크로입자의 평균 크기는 약 50-100 마이크론, 예를 들어, 약 75 마이크론일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 개시된 제어 방출 시스템은 리포솜 또는 사이토카인과 회합된 평면 기질을 포함할 수 있다.
제어 방출 시스템에 함유된 사이토카인은 T 세포와 같은 면역 세포를 활성화할 수 있는 것들을 포함할 수 있다. 예에는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL21, IL-23, IL-10, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-λ, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 임의의 제어 방출 시스템, 예를 들어, 미립자는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 아래 실시예 2 참조. 제어 방출 시스템은 직접적으로 또는 링커, 예를 들어, 폴리-리신 분자를 통해 겔화된 인간 수지상 세포 중 임의의 것과 커플링될 수 있다.
Ⅱ. 겔화된 인간 수지상 세포의 생성 방법
또한, 본원에 개시된 것과 같은 겔화된 인간 수지상 세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 생체적합성 중합체의 세포 내 가교가 있는 겔화된 세포를 만들기 위해, 생성된 겔화된 세포가 세포 형태 및 특정 기능, 예를 들어, 항원 제시를 유지하도록 세포막 구조를 파괴하지 않고 제자리 중합을 위해 중합체를 세포 내로 전달할 필요가 있다. 전통적으로, 세포에 중합체를 주입하기 위해 동결-해동 접근법이 사용되었다. 예를 들어 WO2018/026644 참조. 이 접근법은 취약한 세포에 적합하지 않고 확장성(scalability) 문제가 발생할 수 있으므로 한계가 있다. 이와는 달리, 본원에 개시된 방법은 DMSO 매개 중합체 주입 접근법의 사용을 포함한다. 놀랍게도, DMSO의 존재 하에 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEG-DA)가 살아있는 인간 수지상 세포의 원형질막을 고효율로 성공적으로 침투한다는 것이 본원에서 밝혀졌다. 생성된 겔화된 수지상 세포는 항원 제시 활성을 보여 DMSO 매개 주입 접근법이 겔화된 세포의 막 구조의 무결성을 유지했음을 나타낸다.
따라서, (a) 인간 수지상 세포 군을 제공하는 단계; (b) 광개시제, 중합체 및 디메틸 설폭사이드를 포함하는 겔화 버퍼를 인간 수지상 세포에 침투시키는 단계; 및 (c) 겔화 버퍼가 침투된 인간 수지상 세포를 빛에 노출시켜 중합체 또는 중합성 단량체를 가교시켜 겔화된 인간 수지상 세포를 형성하는 단계를 포함하는, 겔화된 인간 수지상 세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 겔화된 인간 수지상 세포를 하나 이상의 사이토카인과 회합된 제어 방출 시스템에 커플링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
인간 수지상 세포 군은 체액 기증자에서 유래할 수 있다. 예를 들어, 인간 수지상 세포는 인간 혈액 세포 또는 인간 골수 세포로부터 분리되거나 농축될 수 있다. 대안적으로, 인간 수지상 세포 군은 시험관 내 배양된 DC 세포주일 수 있다.
겔화 버퍼는 광개시제, 중합체 또는 중합성 단량체, 및 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 겔화 버퍼는 가교 모이어티를 포함하는 중합체를 포함하는데, 이는 활성화 시에 중합체의 가교를 유도하기 위해 서로 반응할 수 있다. 겔을 형성하기 위해 자유 라디칼과 같은 반응성 종의 존재 하에 가교될 수 있는 임의의 생체적합성 중합체는 본원에 개시된 겔화된 인간 수지상 세포를 만들기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 중합체는 열, 광, 특정 pH 조건 또는 화학물질에 의해 촉발된 가교를 형성할 수 있다. 일부 경우에, 상기 중합체는 가교 모이어티, 예를 들어, 아크릴 중합체를 포함한다. 일부 예에서, 아크릴 중합체는 디아크릴레이트 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 아크릴 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEG-DA), 예를 들어, 평균 분자량이 약 250-2,000 달톤인 PEG-DA이다. 일부 예에서, 본원에 사용된 PEG-DA는 평균 분자량이 약 600 내지 약 800 달톤(예를 들어, 약 700 달톤)일 수 있다. 겔화된 인간 수지상 세포를 만드는데 사용하기 위한 다른 예시적인 중합체는 폴리아크릴아미드 유도체, 예컨대 PEG-PLGA-PEG 삼블록 공중합체, 하이드록시 에틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(HEMA-MMA), 폴리아크릴로니트릴-폴리 비닐 클로라이드(PAN-PVC), 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)(폴리NIPAM), 폴리(N-비닐카프로락탐), 셀룰로오스 유도체, 에틸렌 옥사이드-프로필렌 또는 Matrigel을 포함한다.
다른 실시양태에서, 겔화 버퍼는, 예를 들어, 자유 라디칼과 같은 반응성 종의 존재 하의 활성화 시에 중합체 또는 하이드로겔을 형성할 수 있는 임의의 단량체인 중합성 단량체를 포함할 수 있다. 중합성 단량체의 예는 아크릴레이트 또는 디아크릴레이트 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예로는 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, (하이드록시에틸)메타크릴레이트, 아크릴산, 나트륨 아크릴레이트 및 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 활성화 시에, 이러한 중합성 단량체는 상응하는 중합체, 예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리(아크릴산) 또는 폴리(에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트)를 형성할 수 있다.
광개시제는 에너지원(예를 들어, 가시광선 또는 자외선과 같은 광, 열 등)에 노출될 때 활성 종, 예를 들어, 자유 라디칼, 양이온 또는 음이온을 생성하는 분자이다. 임의의 광개시제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 광개시제의 예는 양이온성 광개시제(예를 들어, 오늄 염, 유기금속 및 피리디늄 염) 및 자유 라디칼 광개시제(예를 들어, 벤조페논, 크산톤, 퀴논, 벤조인 에테르, 아세토페논, 벤조일 옥심 및 아실포스핀)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 특정 예에서, 광개시제는 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논일 수 있다. 다른 광개시제는, 예를 들어, sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Aldrich/General_Information/photoinitiators.pdf에서 찾을 수 있으며, 이의 관련 개시내용은 본원에 언급된 목적 및 주제를 위해 참고로 포함된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 허용 가능한 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 더욱 바람직하게는 최대 ±5%, 더욱 더 바람직하게는 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 바람직하게는 값의 2배 이내의 크기 정도 내를 의미할 수 있다. 특정 값이 명세서 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이며 이 문맥에서 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미한다.
광개시제, 중합체 또는 중합성 단량체가 인간 수지상 세포에 들어갈 때 상기 세포는 에너지원에 노출될 수 있으며, 이 에너지원 하에 광개시제는 자유 라디칼과 같은 반응성 종을 방출하여 중합체의 가교를 촉발함으로써 겔화된 인간 수지상 세포가 생성된다. 가교 모이어티를 포함하는 중합체가 사용되는 경우, 가교는 가교 모이어티를 통해 일어날 수 있다. 대안적으로, 가교제가 사용되는 경우, 가교제는 중합체의 가교를 매개할 수 있다. 에너지원은 자외선 또는 가시광선과 같은 광일 수 있다.
본원에 개시된 방법에 의해 생성된 임의의 겔화된 인간 수지상 세포도 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 겔화된 인간 수지상 세포는 겔화된 세포를 제어 방출 시스템과 복합체화하여 본원에 개시된 인공 항원 제시 세포 복합체를 생성할 수 있도록 적절한 기간 동안 적합한 조건 하에 개시된 임의의 제어 방출 시스템과 함께 배양될 수 있다. 이 커플링 과정은 폴리-리신 분자의 존재 하에 수행될 수 있다.
Ⅲ. 면역 세포 활성화를 위한 인공 항원 제시 세포 복합체의 사용
본원에 개시된 임의의 인공 항원 제시 세포 복합체를 사용하여 T 세포와 같은 면역 세포를 활성화할 수 있다. 따라서, (ⅰ) 본원에 개시된 임의의 인공 항원 제시 세포 복합체를 제공하는 단계; (ⅱ) 인공 항원 제시 세포 복합체를 항원성 펩티드로 프라이밍하여 인공 항원 제시 세포 복합체에서 겔화된 인간 수지상 세포의 표면에 펩티드를 표시하는 단계; 및 (ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 생성된 인공 항원 제시 세포 복합체를 면역 세포를 포함하는 세포 군과 접촉시켜 면역 세포를 활성화하는 단계를 포함하는, 면역 세포 활성화 방법도 본원에 제공된다.
aAPC 복합체를 프라이밍하기 위한 펩티드의 선택은 활성화될 T 세포와 같은 면역 세포의 특이성에 의존할 것이다. 예를 들어, 항종양 T 세포가 활성화되어야 한다면, 종양 항원에서 유래한 항원성 펩티드를 사용하여 aAPC를 프라이밍할 수 있다. 표적 펩티드가 결정되면, 적합한 aAPC를 사용하여 활성화를 위해 표적 펩티드를 T 세포에 제시할 수 있다. 적합한 aAPC 복합체는 항원 제시를 위한 MHC/펩티드 복합체를 형성할 수 있는 적합한 MHC Ⅰ형 또는 MHC Ⅱ형 분자를 갖는 겔화된 인간 수지상 세포를 포함할 것이다. 표적 펩티드 및 활성화를 위해 표적 펩티드 및 면역 세포에 기초한 적합한 aAPC 복합체를 선택하는 것은 당업자의 지식 범위 내에 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 종양 항원에서 유래한 항원성 펩티드는 항종양 T 세포를 활성화하기 위한 aAPC 복합체를 프라이밍하기 위해 사용된다. 생성된 활성화 항종양 T 세포는 종양 항원을 보유하는 종양을 치료하는 데 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 병원체 항원(예를 들어, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원 또는 기생충 항원)에서 유래한 항원성 펩티드를 병원체에 특이적인 T 세포를 활성화하기 위해 aAPC 복합체를 프라이밍하는 데 사용할 수 있다. 생성된 활성화 T 세포는 병원체에 의한 감염을 치료하는 데 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 자가면역 질환과 관련된 자가 항원에서 유래한 항원성 펩티드는 자극성 자가반응성 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포를 억제할 수 있는 조절 T 세포(예를 들어, FoxP3+ 조절 T 세포)와 같은 T 세포를 활성화하기 위해 aAPC 복합체를 프라이밍하는 데 사용될 수 있다. aAPC 복합체는 표면에 표시된 MHC-Ⅱ/펩티드 복합체를 통해 이러한 조절 T 세포를 활성화하고 선택적으로 면역 억제 사이토카인, 예를 들어, IL10 및 TGF-베타를 방출하는 데 사용될 수 있다.
일반 기술
본 개시내용의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, 등, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather 및 P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, 및 D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vector for Mammalian Cells (J. M. Miller 및 M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel, 등 eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, 등, eds. 1994); Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway 및 P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd 및 C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow 및 D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999), The Antibodies(M. Zanetti 및 J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995), DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I 및 II(D.N. Glover ed. 1985), Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds.(1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986); 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel 등 (eds.)과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
추가 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 다음의 특정 실시양태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며 어떠한 방식으로든 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것이 아니다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.
실시예
본 개시내용은 이의 특정 실시양태를 참조하여 설명하였지만, 본 개시내용의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들은 본 개시내용의 목적, 사상 및 범위에 적응시키기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 수정은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
실시예 1. 세포 내 하이드로겔화를 통한 겔화된 수지상 세포의 제조 및 겔화된 수지상 세포의 특성화
면역요법 및 입양 세포 요법의 개발은 T 세포 활성화 및 확대를 위해 천연 항원 제시 세포를 모방한 생체물질(biomaterial) 개발에 대한 관심 증가를 촉발하였다. T 세포 활성화 신호로 합성 기질을 적층하는 것을 목표로 하는 기존의 상향식(bottom-up) 접근 방식과 달리, 본 연구는 살아있는 수지상 세포(DC)를 인공 항원 제시 세포(aAPC)로 직접 변환하는 손쉬운 하이드로겔화 기술을 입증한다. DMSO 매개 세포 내 하이드로겔 단량체 침투 및 UV 활성화 라디칼 중합을 통해 세포 내 하이드로겔화가 DC에서 빠르게 발생하여 동결 및 동결건조에 의해 저장 가능한, 펩티드 항원 교환이 가능한 매우 강력한 모듈식(modular) 세포-겔 하이브리드 구조를 생성한다.
재료 및 방법
(ⅰ) 세포 내 겔화
1.5g/mL의 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(Irgacure D-2959; Sigma-Aldrich) 20μL를 디메틸 설폭사이드("DMSO")에 용해시키고 Sigma-Aldrich에서 상업적으로 입수 가능한 폴리(에틸렌 글리콜)-디아크릴레이트("PEG-DA") 200μL와 혼합하여 겔화 버퍼를 제조하였다. PEG-DA의 평균 분자량(Mn)은 700Da이다. 5 × 106개의 JAWSII 세포를 수집하고 1X 프로테아제 억제제를 함유하는 페놀-레드 비함유 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)("DMEM") 1mL에 현탁시켰다. DMEM은 번호 CA21063-029로 ThermoFisher Scientific에서 상업적으로 입수 가능하였다. 상기 세포 현탁액에 겔화 버퍼를 1:10 부피비로 첨가하여 세포 현탁액에서 10중량%의 PEG-DA 농도에 도달하도록 하였다. 실온에서 5분간 배양한 후, 세포를 펠렛화하고 겔화 버퍼 없는 페노-레드 비함유 DMEM 500μl에 재현탁시키고 UV 오븐(UVP Crosslinker, Analytik Jena, US)에서 5분 동안 청색광 충격(blue-light bombardment)을 가하였다. 생성된 겔화된 세포("GC")를 추가 실험 전에 인산염 완충 식염수("PBS")로 세척하였다.
하이드로겔의 형광 표지화를 위해 Sigma-Aldrich에서 구입할 수 있는 18mg/mL의 플루오레세인 O,O'-디아크릴레이트 100μL를 DMSO에 용해시키고 위와 같이 PEG-DA와 혼합한 다음 Irgacure D-2959를 혼합하였다. 형광 겔화 버퍼를 페놀-레드 비함유 DMEM과 혼합하고 세포 겔화를 위해 상층액을 수집하였다.
(ⅱ) 세포 내 PEG-DA의 정량
세포 내 PEG-DA 농도의 정량은 요오드 기반 정량법을 사용하여 수행하였다. G-DC를 생성하기 위해 4 × 105개의 JAWSII 세포를 표시된 시간에 10중량%의 겔화 버퍼를 함유하는 페놀-레드 비함유 DMEM 1mL로 현탁시켰다. G-DC를 PBS로 세척한 후, 1mL의 증류수 처리를 사용하여 세포 내 PEG-DA를 G-DC로부터 방출하고 동결-해동 과정을 거쳤다. 세포 파편을 5분 동안 3000×g에서 원심분리를 통해 스핀 다운하였다. 상층액을 수집하고 BaCl2 및 요오드 용액과 8:2:1 비율로 혼합하여 15분 동안 발색시켰다. 샘플의 PEG-DA 농도는 535nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 표준 곡선은 연속 희석된 PEG-DA로 작성하였다. 측정된 PEG-DA 함량을 JAWSII 세포의 총 부피로 나누어 세포 내 PEG-DA 농도를 결정하였다.
(ⅲ) T 세포 분리 및 형광 표지화
OT-I 세포(H2-Kb 맥락에서 OVA257-264 펩티드에 특이적인 CD8+ T 세포)를 OT-I 형질전환 마우스에서 분리하였다. 마우스를 희생시킨 후, 비장을 꺼내 10% FBS가 있는 RPMI1640 완전 배지에 넣었다. 단일 비장세포를 수확하기 위해, 비장을 분쇄하고 멸균된 40μm 나일론 세포 스트레이너(strainer)(BD Biosciences Falcon, #352340)에 대해 5ml 주사기로 변형(strain)시켰다. RBC 고갈을 위해 비장세포를 BD Pharm Lyse 용해 버퍼(BD Biosciences, # 555899)와 함께 3분 동안 배양하였다. OT-I 세포는 마우스 CD8a+ T 세포 분리 키트(BD Biosciences, #19853 A)로 비장세포에서 후속적으로 분리하였다. OT-I 세포의 표지화를 위해, OT-I T 세포를 37℃에서 5분 동안 5μM의 CFSE(Sigma-Aldrich, #21888)를 함유하는 PBS와 배양하여 상기 세포를 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 염색하였다. 상기 세포를 완전 배지로 3회 세척하였다. CFSE로 표지된 OT-I 세포를 다음 실험 연구를 위해 수확하였다.
결과
(ⅰ) DMSO 매개 하이드로겔 주입을 통한 손쉬운 세포 내 하이드로겔화
DMSO 매개 2-하이드록실-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논 광개시제(I2959) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 단량체(PEG-DA; Mn 700)를 함유한 겔화 버퍼를 직접 침투시킨 후 아이스 플레이트에서 하이드로겔 가교를 위해 일시적으로 UV에 노출하여 겔화된 세포(GC)를 제조하였다(도 1a). 세포 고정을 위한 세포 내 겔화의 가능성을 평가하기 위해, JAWSII 뮤린 DC를 사용하여 10중량%의 겔화된 수지상 세포(G-DC)를 제조하였다. 세포는 단 5분의 배양 후에 PEG-DA로 이론적인 총 세포 내 부피까지 거의 완전히 침윤시켰다(도 1b). 세포 내부의 하이드로겔을 시각화하기 위해, 하이드로겔에 녹색 형광을 공유적으로 부여하는 플루오레세인-디아크릴레이트(F-DA)를 함유하는 겔화 버퍼로 G-GC를 제조하였다. F-DA를 이용한 막 염색에 따르면, GC는 내부에 하이드로겔 성분이 있다(도 1c). 살아있는 DC와 비교하여 광학 현미경(light microscope)하의 G-DC에서 현저한 형태학적 변화는 없다(도 1c). 또한, G-DC는 낮은 삼투압 하에 물에서 안정했지만 살아있는 DC는 한 번에 파열되었고, 이는 G-GC의 구조적 무결성이 내부의 하이드로겔 네트워크 형성에 의해 보존될 수 있음을 나타낸다(도 1c). 더욱이, G-DC는 PBS에서 현탁 30일 후에 구조적 무결성 및 형태를 유지했지만 살아있는 DC는 분해되었고, 이는 G-DC가 살아있는 DC보다 더 안정적임을 나타낸다(도 1d).
요약하면, 이러한 결과는 본원의 겔화 접근법 개시내용이 가혹한 조건 하에서 안정하고 항원 제시와 같은 의도된 생물활성을 위한 세포막 완전성을 유지하는 G-GC를 생성하는 효과적인 방법임을 나타낸다.
(ⅱ) G-DC 세포는 세포 내 하이드로겔화 후 펩티드 교체를 통해 표면에 항원을 성공적으로 제시하였다.
살아있는 수지상 세포는 본원에 개시된 절차에 따라 겔화된 수지상 세포(G-DC)로 성공적으로 형질전환되었다(예를 들어, 도 1 참조). 세포 내 하이드로겔화 후 MHC Ⅰ형-펩티드 복합체 형성을 통한 G-DC에 의한 항원 제시를 조사하였다. G-DC는 하이드로겔화 후 배지, LPS 단독 및 LPS-OTI 펩티드로 처리하였다. LPS에 의한 처리 후, DC를 세포 내 하이드로겔화 후 OTI 펩티드에 노출시켰다. 이 그룹은 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스 그룹으로 지정된다.
유세포분석을 사용하여, LPS 처리 G-DC 그룹, LPS 처리/OTI 펄스 G-DC 그룹뿐만 아니라 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스 그룹에서 CD80 발현(신호 2)이 관찰되었다(도 3). 이 결과는 하이드로겔화와 펩티드 교체가 모두 DC 표면 마커 발현에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, LPS 처리/OTI 펄스 G-DC의 98.1%, 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스 G-DC의 99.5%가 MHC-Ⅰ-SIINFEKL 복합체(신호 1)를 발현하는 것으로 밝혀진 반면, LPS 처리 G-DC의 2.1%만이 MHC-Ⅰ-SIINFEKL 복합체(신호 1)를 발현하는 것으로 밝혀졌다(도 2b 및 2c). 이러한 결과는 G-DC가 세포 내 겔화 후 펩티드 항원으로 성공적으로 로딩될 수 있고 하이드로겔화 후 펩티드 교체가 G-DC에서 발견되는 막 결합된 림프구 활성화 신호를 손상시키지 않았음을 입증한다.
다음으로, MHC Ⅰ형-펩티드-복합체/TCR 상호작용을 통해 T 세포 확대를 촉발하는 펩티드 항원 제시 G-DC의 활성을 G-DC와 함께 OT-I 형질전환 마우스에서 유래한 CFSE 표지된 CD8+ T 세포를 배양함으로써 조사하였다. 펩티드 항원 제시 G-DC는 표적 T 림프구의 확대를 효과적으로 촉발하여 LPS 처리 및 OTI 펄스 G-DC와 유사한 수준의 증식, 생성 및 세포 수를 나타낸다(도 2d 및 2e). 증가된 T 세포 수는 또한 시간 의존적 방식으로 관찰하였고(도 2f), 이는 세포 내 하이드로겔화 과정 후 펩티드 펄싱이 항원 특이적 T 세포 반응을 조절하는 G-DC의 기능에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
종합하면, 이러한 데이터는 항원 제시가 하이드로겔화 후 G-DC에서 교체 및 조절될 수 있음을 나타낸다.
(ⅲ) 동결 및 동결건조 공정은 G-DC 기능성에 영향을 미치지 않았다.
다음으로, 동결 또는 동결건조에 의한 본원에 개시된 G-DC의 저장을 조사하였다. G-DC를 도 4a에 예시된 바와 같이 동결 또는 lymphilization 후 형태, 표면 마커 및 기능성의 보유에 대해 조사하였다. 위에서 언급한 다양한 그룹의 G-DC는 먼저 10% 수크로스에서 동결 또는 동결건조된 다음 물에서 재구성되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, G-DC는 동결 또는 동결건조 후에도 형태를 유지하였다. 대조군 세포, LPS 처리 G-DC, LPS 처리/OTI 펄스 G-DC뿐만 아니라 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스 G-DC에서 구조적 변화가 관찰되지 않았으며(도 6), 이는 G-DC의 세포 형태가 동결 및/또는 동결건조 공정 후에 효과적으로 보존되었음을 나타낸다.
동결된 샘플 및 동결건조된 샘플의 기능을 추가로 평가하였다. 동결 또는 동결건조 공정이 상이한 G-DC의 생물학적 기능에 영향을 미치는지를 조사하기 위해 다양한 그룹의 G-DC를 본원에 개시된 바와 같이 표면 마커 검출 검정(도 3 및 6) 및 T 세포 증식 검정(도 3b-3g)으로 조사하였다. 흥미롭게도, 신호 1(도 6) 및 신호 2(도 3b 및 3c)의 유사한 발현 패턴은 동결되지 않은/동결건조되지 않은 G-DC(도 3b 및 3c)와 비교하여 동결된 또는 동결건조된 G-DC에서 여전히 유지되었다. 겔화 후 LPS 처리 및 OTI 펄스된 동결된 G-DC 및 동결건조된 G-DC는 둘 다 T 세포 증식을 촉발하여 OT-I T 세포의 수를 증가시켰다(도 4b-4g). 이러한 결과는 동결 또는 동결건조 후에도 G-DC가 T 세포 활성화와 같은 생물활성(bioactivity)을 여전히 유지함을 나타낸다.
(ⅳ) 겔화된 인간 수지상 세포(G-hDC)는 동결 또는 동결건조되어 보관된 후 표면에 MHC-항원 복합체 및 공동자극 리간드를 보유하였다.
또한, 본원에 개시된 방법으로 제조된 겔화된 인간 수지상 세포는 동결 또는 동결건조 후에도 T 세포 활성화에 안정성 및 생물활성을 나타냄을 입증하였다.
예시적인 실험 절차가 도 7a에 도시되어 있다. 명시야 이미지 및 형광 신호는 10%의 PEGDA에서 겔화된 hDC 내의 하이드로겔 네트워크 구조를 보여주었다. 도 7b 및 7c. 이것은 hDC가 성공적으로 겔화되었음을 나타낸다. 흥미롭게도, hG-DC에서 세포막 무결성의 성공적인 유지로 인해, 10중량%의 GC(10중량%의 PEG-DA를 사용하여 제조)는 세포질로 들어가는 물을 효과적으로 배제하여 구조를 유지하였다(도 7c). DC의 겔화 후 hDC에 림프구 활성화 신호 1/2가 적절하게 표시될 수 있는지를 추가로 조사하기 위해 인간 1차 수지상 세포를 모델 세포로 사용하였다. 유세포분석을 사용하여 MHC Ⅰ형, MHC Ⅱ형, CD80 및 CD80을 포함한 모든 표면 마커가 겔화된 인간 DC에서 높은 수준으로 발현(각각 99.6%, 98.9%, 95.5% 및 94.8%)되는 것으로 관찰되었으며, 이는 살아있는 인간 DC에서 이러한 표면 마커의 발현 수준과 유사하다. 도 7d 및 7e. 놀랍게도, 표면 마커의 유사한 발현 수준이 G-hDC, 동결된 G-hDC 및 동결건조된 G-hDC에서 관찰되었으며, 이는 동결 및 동결건조 공정이 처리된 G-hDC의 표면 마커에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다(도 7d 및 7e).
이러한 결과는 임상 적용에 사용될 수 있는 인공 항원 제시 세포(aAPC)로서 겔화된 인간 1차 DC의 제조 가능성을 입증한다.
실시예 2: 겔화된 수지상 세포 및 마이크로입자를 포함하는 사이토카인 방출 시스템
본 실시예는 사이토카인을 캡슐화하는 마이크로입자와 회합된, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 겔화된 수지상 세포(G-DC)를 포함하는 사이토카인 방출 시스템을 설명한다.
방법
(ⅰ) PLGA 마이크로입자의 합성
염료를 함유하는 PLGA 마이크로입자(MP)를 이중 유화 방법에 이어 용매 증발로 합성하였다. 점도가 상이한 PLGA를 사용하였으며, 고유 점도가 0.15-0.25dL/g인 PLGA를 PLGA(A)로, 점도가 0.55-0.75dL/g인 PLGA를 PLGA(B)로 나타낸다. 일련의 중합체 중량비를 수행하였다:
PLGA(A):PLGA(B)=100:0, 65:35, 50:50, 35:65 또는 20:80.
간단히 말해서, PLGA를 디클로로메탄(DCM)(100mg/ml)에 용해시켜 오일상을 형성하고 적색 염료를 100mM pH 8 Na2HPO4에 용해시켜 수상을 형성하였다. 이어서 상기 오일상 250uL 및 상기 수상 10uL(부피비 = 25:1)를 40% 진폭의 펄스 모드 및 1분 동안 1초 및 2초의 온-오프 기간 하에 얼음에서 프로브 초음파분쇄기(sonicator)로 유화하였다. 이어서 상기 유화액을 빙욕에서 5mL 부피의 급속 교반 버퍼(10mM pH8 Na2HPO4, 1000rpm에서 교반)에 적가하여 DCM 증발을 방지하면서 마이크로액적을 분산시켰다. 상기 유화액을 1000rpm에서 5분 동안 교반하였다. 그 후, 상기 유화액을 35℃에서 35분 동안 가열하여 DCM을 증발시키고 가열 과정 동안 교반 속도를 중합체 비율에 따라 조절하였다. PLGA(B)≥50%(PLGA(A):PLGA(B)=50:50, 35:65 또는 20:80)의 경우, 교반 속도는 1000rpm으로 유지하였다. 중합체 B < 50%(PLGA(A):PLGA(B)=100:0 또는 65:35)의 경우, 교반 속도는 500rpm까지 낮췄다. 그 후, DCM 증발 동안 입자의 파괴를 방지하기 위해 모든 그룹의 교반 속도를 200rpm으로 낮추고 20분 동안 유지하였다. DCM이 완전히 증발된 후, 마이크로입자를 500rpm에서 3분 동안 원심분리하여 2회 세척한 후 pH 7 PBS 1mL에 펠렛을 재현탁시켰다. 마지막으로, 상기 입자를 pH7 인산염 버퍼에 보존하였다.
(ⅱ) 캡슐화 효율 결정
캡슐화 효율(encapsulation efficiency, EE)은 아래 공식을 사용하여 계산하였다:
EE = 입자 내 염료(mg)/전체 염료(mg).
입자를 80% 아세톤으로 분해한 후 용매를 증발시켰다. 용매를 증발시킨 후, 물을 첨가하여 염료를 용해시켰다. 30,000g에서 원심분리하여 PLGA의 부서진 조각을 제거하였다. 상층액을 수집하고 광 스펙트럼(512nm)으로 검출하여 염료 농도를 평가하고 입자 내 염료의 양을 수득하였다.
(ⅲ) 방출 연구
염료의 방출을 37℃ 및 4℃에서 연구하였다. 인체 내 방출을 연구하기 위해 MP 3mg을 150rpm의 교반 속도로 37℃ 수조에서 pH7.4 PBS 10ml에 현탁시켰다. 방출된 염료의 양을 결정하기 위해 MP를 10분 동안 침전시키고 PBS 상층액을 특정 시간에 수집하였다. PBS는 512nm의 파장에서 광 스펙트럼으로 분석하였다. 4℃ 방출 연구는 pH7 인산염 버퍼 2ml에 입자 2mg을 유지하여 수행하였다. 유사하게, PBS 상층액을 광흡수 분석을 위해 수집하였다. 두 연구에서 버퍼는 pH 값의 일관성을 보장하기 위해 12시간 이내에 새로 바꿨다.
결과
(ⅰ) GC-MP 복합체는 사이토카인을 방출하는 겔화된 세포 스페로이드로서 제공되었다.
살아있는 항원 제시 세포(APC)는 T 세포 활성화에 중요한 역할을 하는 림프구 활성화 사이토카인을 분비한다. 살아있는 APC를 모방하기 위해 사이토카인을 캡슐화하는 마이크로입자(예로서 IL2 사용)와 복합체화된 겔화된 수지상 세포를 포함하는 사이토카인 방출 시스템(GC-MP)을 본원에 보고하였다. 도 8a에 도시된 바와 같이, PLGA 기반 MP 및 G-DC로 구성된 GC-MP는 T 세포 활성화를 위한 세 가지 림프구 활성화 신호, 즉 1차 신호전달, 2차 신호전달 및 사이토카인 신호전달을 모두 촉발하기 위한 구성요소를 보유할 것이다.
MP는 상기 개시된 이중 유화 유화 공정으로 제조하였다. 친수성 설포-Cy5 염료는 성공적인 카고(cargo) 캡슐화 및 방출을 검증하기 위한 예시적인 카고로서 사용되었다. 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같이, MP로의 카고 로딩은 명시야(도 4a) 및 형광 현미경 모두에 의해 관찰되었다. G-DC와 카고 로딩된 MP의 복합체화는 폴리-리신을 사용하여 조정하였다. 공초점 현미경을 사용하여 성공적인 복합체화를 관찰하였다. 도 8a. G-DC, MP 및 GC-MP의 크기 분포는 각각 20, 75 및 125um였다(도 8c). 특히, G-DC는 30일간 저장하는 동안 MP 표면에 단단히 부착된 상태로 유지되었다(도 8d). GC-MP의 시험관 내 방출 프로파일에서, IL-2는 37℃에서 천천히 방출됐지만 4℃에서는 방출되지 않았다.
IL-2 방출 키네틱은 도 9에 제공되어 있다. 아래에서 볼 수 있듯이, GC-MP로부터 IL-2의 방출은 T 세포의 완전한 활성화에 기여하였다.
종합하면, 상기 결과는 T 세포의 완전한 활성화를 위한 세 가지 활성화 신호전달 경로를 촉발하는 데 필요한 모든 구성요소를 포함하는 인공 APC 시스템의 성공적인 구축을 나타냈다. 이러한 인공 APC 시스템은 사이토카인 분비를 위한 조절된 방출 능력도 갖는다.
(ⅱ) GC-MP는 CD8 T 세포 활성화 및 증식을 성공적으로 유도하는 aAPC 모방 생체물질로서 작용하였다.
CD8+ T 세포를 활성화하기 위한 본원에 개시된 GC-MP 시스템의 활성을 조사하였다. 먼저, GC-MP가 CD8 T 세포를 완전히 활성화할 수 있는지를 조사하였다. CFSE 표지된 OT-I T 세포를 MP-IL-2, GC-MP 또는 GC-MP-IL-2와 공동배양한 후 CD8 T 세포 증식을 유세포분석으로 검출하였다. GC-MP 및 GC-MP-IL-2 그룹에서 T 세포의 증식 및 수의 증가가 관찰되었지만, MP-IL-2 그룹에서는 그렇지 않았다. 도 10a-10c. 이는 GC-MP 구조가 G-DC의 면역 조절 기능에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 특히, GC-MP-IL-2(세 가지 신호전달 경로 모두를 촉발)는 GC-MP(1차 및 공동자극 신호전달 경로만 촉발)에 비해 더 높은 T 세포 확대를 초래하였다. 도 10a-10c. 이러한 차이는 GC-MP의 사이토카인 방출 기능이 면역 세포를 활성화하는 데 중요하다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 G-DC는 면역 반응을 조절하기 위해 다른 적합한 플랫폼과 조합하여 사용될 수 있다.
입양 T 세포 요법을 개선하는데 있어서 GC-MP의 효능을 추가로 조사하기 위해, GC-MP 확대된 OTI 특이적 CD8 T 세포를 EG7-OVA가 이식된 마우스에서 생체 내에서 추가로 평가하였다(도 10d). 결과는 GC-MP-IL-2 aAPC 시스템에 의해 활성화 CD8 T 세포가 다른 그룹과 비교하여 생체 내에서 종양 크기를 유의하게 감소시켰음을 나타냈다. 도 10e.
기타 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대체 특징으로 교체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.
이상의 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 다양하게 변경 및 수정할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 청구범위 내에 포함된다.
등가물
몇 가지 본 발명의 실시양태를 본원에서 설명하고 예시하였지만, 당업자는 본원에 기술된 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이며, 이러한 변형 및/또는 수정 각각은 본원에 기술된 본 발명의 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 당업자는 본원에 기술된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시임을 의미하고 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성이 본 발명의 교시가 사용되는 특정 적용 또는 적용들에 좌우됨을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시양태는 단지 예로서 제시되고 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범위 내에서 본 발명의 실시양태가 구체적으로 기술되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시양태는 본원에 기술된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 그러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 상호 일관성이 없는 경우 두 개 이상의 그러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 조합은 본 개시내용의 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전 정의, 참고로 포함된 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미에 걸쳐 조절되는 것으로 이해해야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참고로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 부정관사 "a" 및 "an"은 명백하게 반대로 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 "및/또는"이라는 문구는 그렇게 결합된 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두", 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해해야 한다. "및/또는"으로 나열된 여러 요소는 동일한 방식으로 해석해야 하는데, 즉 그렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석해야 한다. 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 실시양태에서는 A만(선택적으로 B 이외의 요소를 포함함), 다른 실시양태에서는 B만(선택적으로 A 이외의 요소를 포함함), 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 모두(선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 "또는"은 위에서 정의된 "및/또는"과 동일한 의미인 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때 "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석해야 하는데, 즉 하나 초과도 포함하는 적어도 하나의 요소 또는 요소 목록 및 선택적으로 추가 목록에 없는 항목을 포함한다. "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나" 또는 청구범위에서 사용될 때 "~로 이루어진"과 같이 명확하게 반대로 표시되는 용어만이 정확히 하나의 요소 또는 요소 목록을 포함하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 "둘 중 하나", " ~ 중 하나", "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배타적 용어가 앞에 오는 경우에만 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 것이지만 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로 해석해야 한다. 청구범위에서 사용될 때 "본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소 목록과 관련하여 "적어도 하나"라는 문구는 요소 목록에서 임의의 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것이지만, 요소 목록에 구체적으로 나열된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함해야 하는 것은 아니며 요소 목록에서 요소의 임의의 조합을 제외하는 것도 아닌 것으로 이해해야 한다. 이 정의는 또한 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든 "적어도 하나"라는 문구가 언급된 요소 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외의 요소가 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게는 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서는 B가 존재하지 않고 하나 초과의 A를 선택적으로 포함하는 적어도 하나(선택적으로 B 이외의 요소를 포함)를; 또 다른 실시양태에서는 A가 존재하지 않고 하나 초과의 B를 선택적으로 포함하는 적어도 하나(선택적으로 A 이외의 요소를 포함)를; 또 다른 실시양태에서는 하나 초과의 A를 선택적으로 포함하는 적어도 하나와 하나 초과의 B를 선택적으로 포함하는 적어도 하나(선택적으로 다른 요소들을 포함)를 지칭할 수 있다.
또한 명백히 반대로 표시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 이 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 상기 방법의 해당 단계 또는 행위가 언급된 순서로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.

Claims (22)

  1. 인공 항원 제시 세포 복합체(artificial antigen presenting cell complex)로서,
    (a) 하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포(human dendritic cell); 및
    (b) 하나 이상의 사이토카인과 회합된 제어 방출 시스템(controlled release system)을 포함하고;
    하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포는 제어 방출 시스템에 부착되어 있는 인공 항원 제시 세포 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 겔화된 인간 수지상 세포의 표면에 표시되는 항원성 펩티드를 추가로 포함하는 인공 항원 제시 세포 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제어 방출 시스템이 하나 이상의 사이토카인을 캡슐화하는 마이크로입자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 사이토카인이 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL21, IL-23, IL-10, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFNλ, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 인공 항원 제시 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로입자가 하나 이상의 분해성 중합체를 포함하는 인공 항원 제시 세포 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 하나 이상의 분해성 중합체가 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트 또는 이들의 조합을 포함하는 인공 항원 제시 세포 복합체.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 펩티드가 겔화된 인간 수지상 세포의 주조직적합성복합체 Ⅰ형(major histocompatibility complex class Ⅰ) 분자에 의해 표시되는 인공 항원 제시 세포 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 겔화된 인간 세포가 세포 내 가교된 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(polyethylene glycol diacrylate, PEG-DA)를 포함하는 인공 항원 제시 세포 복합체.
  9. 겔화된 인간 수지상 세포의 제조 방법으로서,
    (a) 인간 수지상 세포 군을 제공하는 단계;
    (b) 광개시제, 중합체 또는 중합성 단량체, 및 디메틸 설폭사이드를 포함하는 겔화 버퍼(gelation buffer)를 인간 수지상 세포에 침투시키는 단계; 및
    (c) 겔화 버퍼가 침투된 인간 수지상 세포를 빛에 노출시켜 중합체를 가교시켜 겔화된 인간 수지상 세포를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (d) 겔화된 인간 수지상 세포를 하나 이상의 사이토카인과 회합된 제어 방출 시스템에 커플링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 겔화 버퍼가 아크릴 중합체인 중합체를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 아크릴 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEG-DA)를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 아크릴 중합체가 평균 분자량이 약 250 내지 약 2,000 달톤(dalton)인 PEG-DA인 방법.
  14. 제13항에 있어서, PEG-DA가 평균 분자량이 약 600 내지 약 800 달톤인 방법.
  15. 제9항 또는 제10항에 있어서, 겔화 버퍼가 중합성 단량체를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 중합성 단량체가 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, (하이드록시에틸)메타크릴레이트, 아크릴산, 나트륨 아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 또는 이들의 조합인 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 광개시제가 2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논인 방법.
  18. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 인공 항원 제시 인간 수지상 세포.
  19. 면역 세포 활성화 방법으로서,
    (ⅰ) 제1항 내지 제8항 및 제18항 중 어느 한 항의 인공 항원 제시 세포 복합체를 제공하는 단계;
    (ⅱ) 인공 항원 제시 세포 복합체를 항원성 펩티드로 프라이밍하여 인공 항원 제시 세포 복합체에서 겔화된 인간 수지상 세포의 표면에 펩티드를 표시하는 단계; 및
    (ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 생성된 인공 항원 제시 세포 복합체를, 면역 세포를 포함하는 세포 군과 접촉시켜 면역 세포를 활성화하는 단계를 포함하는, 면역 세포 활성화 방법.
  20. 제19항에 있어서, 면역 세포가 T 세포를 포함하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 펩티드가 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 암 항원, 또는 자가면역 질환과 관련된 자가 항원에서 유래하는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서 생성된 활성화 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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