KR20230001736A - Pharmaceutical composition containing Calpastatin for preventing or treating post-burn hypertrophic scar formation - Google Patents
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- A61K31/27—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbamic or thiocarbamic acids, meprobamate, carbachol, neostigmine
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
Abstract
Description
본 발명은 칼파스타틴을 함유하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns containing calpastatin.
화상 후 비후성 반흔은 화상 이후 상처가 회복되는 과정에서 흉터가 위로 불거져 나오는 것을 말한다. 화상 후 비후성 반흔의 발생비율은 화상 환자의 60%~90%로 발생 빈도가 매우 높아 화상 환자들의 육체적, 정신적 고통과 경제적 피해는 매우 크고 심각한 사회적 문제이다. 비후성 반흔은 화상 상처가 치유되면서 1~2주 경부터 생겨나기 시작해, 대부분 4~6개월, 길게는 2년까지 자라며 다양한 증상을 동반하는데, 치료를 하지 않으면 영구적으로 남아 이차적인 피부 구축 (contraction)과 관절 구축을 초래한다. 또한, 정상 피부와 달리 땀샘이나, 지방샘, 모발, 모낭 등 피부 부속기를 포함하지 않아 경미한 자극에도 쉽게 상처가 생기고 잘 아물지 않는다. 화상 후 비후성 반흔은 보기에 흉할 뿐만 아니라 통증과 가려움증 등 다양한 감각 이상을 동반하며 부위에 따라 심각한 기능 장애를 초래한다.Hypertrophic scars after burns refer to scars that bulge upward during the process of healing wounds after burns. The incidence of hypertrophic scars after burns is 60% to 90% of burn patients, and the incidence is very high. The physical and mental pain and economic damage of burn victims is a very large and serious social problem. Hypertrophic scars begin to appear around 1 to 2 weeks as the burn wound heals, and usually grow for 4 to 6 months, up to 2 years, accompanied by various symptoms. If not treated, they remain permanently and cause secondary skin contraction and joint contracture. In addition, unlike normal skin, it does not contain skin appendages such as sweat glands, fat glands, hair, and hair follicles, so it is easily damaged and does not heal well even with minor irritation. Hypertrophic scars after burns not only look ugly, but also accompany various sensory abnormalities such as pain and itching, and cause serious functional disorders depending on the site.
화상 후 비후성 반흔은 화상 환자들에게서 나타나는 매우 흔하고 심각한 문제이지만 아직까지 정확한 발병 기전과 정립된 효과적인 치료방법이 없어 명확한 병태생리학적 발생기전 규명과 그 기전에 근거한 병증 특이적 치료제 개발이 시급한 실정이다.Post-burn hypertrophic scar is a very common and serious problem that occurs in burn patients, but there is no clear pathogenesis and effective treatment method established yet. There is an urgent need to identify pathophysiological mechanisms and develop disease-specific treatments based on the mechanisms.
칼파인 (Calpain)은 세포 증식 및 분화, 조직 재형성 및 섬유증을 포함한 다양한 세포 기능에 관여하는 Ca2+ 의존성 프로테아제이다 [6-8]. 이들의 기능은 주로 칼파인-1과 칼파인-2로 알려진 두 가지 주요 이형체에 기인하며, 이는 각각 Ca2+의 마이크로몰 및 밀리몰 농도에 반응하여 활성화된다 [9]. 칼파인의 병리학적 과잉 활성화는 심장 섬유증 및 특발성 폐 섬유증을 포함한 일부 섬유성 질환의 발생과 관련이 있다 [10-12]. 칼파인은 전사 및 번역 후 수준 모두에서 TGF-β1을 상향 조절하여 Smad2/3 및 비-Smad (Akt) 신호 전달을 통해 섬유아세포 증식 및 세포외 기질 (extracellular matrix: ECM) 합성을 포함한 친섬유성 (profibrotic) 활동을 유도한다. 동시에 TGF-β1 또한 칼파인의 활성 및 발현을 증가시킨다 [12-14]. 이같은 상호작용 메커니즘은 섬유아세포와 ECM의 병리학적 축적을 유도하여 조직 섬유증을 유발할 수 있다. 칼파인의 해로운 영향을 억제하기 위해 인체는 생리적으로 선택적 내인성 억제제인 칼파스타틴 (calpastatin)을 이용한다 [9].Calpain is a Ca 2+ -dependent protease involved in various cellular functions including cell proliferation and differentiation, tissue remodeling and fibrosis [6-8]. Their functions are mainly attributed to two major isoforms, known as calpain-1 and calpain-2, which are activated in response to micromolar and millimolar concentrations of Ca 2+ , respectively [9]. Pathological overactivation of calpain has been associated with the development of some fibrotic diseases including cardiac fibrosis and idiopathic pulmonary fibrosis [10-12]. Calpain upregulates TGF-β1 at both the transcriptional and post-translational level, thereby promoting fibroblast proliferation and pro-fibrosis including extracellular matrix (ECM) synthesis through Smad2/3 and non-Smad (Akt) signaling. (profibrotic) activity. At the same time, TGF-β1 also increases the activity and expression of calpain [12-14]. This interaction mechanism can lead to the pathological accumulation of fibroblasts and ECM, leading to tissue fibrosis. To suppress the detrimental effects of calpain, the human body uses calpastatin, a physiologically selective endogenous inhibitor [9].
칼파스타틴의 형질 전환 과발현은 심근 비대, 섬유증 및 기능 장애를 감소시키는 것으로 보고된 바 있다 [15-17]. 칼파스타틴은 세포 내뿐만 아니라 세포 외 경로를 통해서도 세포 기능에 영향을 미칠 수 있다 [18]. 예를 들어, 폐동맥 평활근 세포의 증식과 이동은 비 세포 투과성 칼파스타틴을 외부에서 투여함으로써 감소된 바 있다 [19].Transgenic overexpression of calpastatin has been reported to reduce myocardial hypertrophy, fibrosis and dysfunction [15-17]. Calpastatin can affect cellular functions not only through intracellular but also extracellular pathways [18]. For example, proliferation and migration of pulmonary artery smooth muscle cells have been reduced by exogenous administration of non-cell-permeable calpastatin [19].
화상에 의한 비후성 반흔은 다른 원인에 의한 비후성 반흔 및 기타 섬유성 질환과는 형성 기전과 증상, 예후, 치료에 대한 반응 등에서 매우 큰 차이가 있다 [25, 26]. 화상 후 비후성 반흔은 매우 심한 중증 화상에 의해 발생하기 때문에 병변의 범위가 넓고 그 정도가 심하며, 통증과 소양감 등 동반 증상이 매우 심하고, 이차적인 기능적 손상의 정도가 매우 심하다. 그러나 화상 환자에서 가장 흔하고 심각한 합병증인 화상 후 비후성 반흔에서의 칼파인의 역할과 칼파스타틴의 효과는 아직까지 알려진 바 없다.Hypertrophic scars caused by burns differ greatly from hypertrophic scars caused by other causes and other fibrotic diseases in their formation mechanism, symptoms, prognosis, and response to treatment [25, 26]. Since hypertrophic scars after burns are caused by very severe burns, the range of lesions is wide and the extent is severe, accompanying symptoms such as pain and itching are very severe, and the degree of secondary functional damage is very severe. However, the role of calpain and the effect of calpastatin in hypertrophic scarring after burns, the most common and serious complication in burn patients, have not been known yet.
본 발명은 좀 더 효과적인 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a more effective preventive or therapeutic agent for post-burn hypertrophic scar formation.
본 발명자들은 다양한 칼파인 저해제에 대하여 화상 후 비후성 반흔 형성 억제효과를 시험해본 결과, 칼파인에 대한 천연 저해제인 칼파스타틴이 현저한 억제효과를 나타냄을 밝혔다. 본 발명은 이 결과를 이용해 화상 후 비후성 반흔 형성 억제용 약제를 제공하려는 것을 목적으로 한다.As a result of testing the inhibitory effect of various calpain inhibitors on post-burn hypertrophic scar formation, the present inventors found that calpastatin, a natural inhibitor for calpain, exhibited a remarkable inhibitory effect. An object of the present invention is to provide a drug for inhibiting hypertrophic scar formation after burns using this result.
대부분의 3도 화상 환자를 포함하여 화상 환자의 약 70%에서 비후성 반흔이 발생하며, 이는 화상 환자들에서 매우 심각한 미용적, 기능적, 심리적 문제를 야기한다. 화상 후 비후성 반흔은 화상 환자들에게 나타나는 가장 흔하고 심각한 합병증이지만 아직까지 효과적인 치료 방법이 없는 실정이다 [1-3]. 상처 치유는 염증, 증식 및 리모델링이라는 세 가지 단계에서 일어난다. 염증 단계에서는 수많은 사이토카인 및 기타 염증 유발 인자가 상처 부위로 방출되어 조직 완전성을 회복한다. 증식 단계는 손상 며칠 후 섬유아세포 침윤 및 증식과 함께 시작되며, 그 후 비후성 반흔 형성에 중요한 콜라겐이 상처 부위에 침착된다 [3]. 화상 후 비후성 반흔 형성의 초기 단계 발병기전을 조사하기 위해, 본 발명자들은 3도 화상이 발생한 후 1 ~ 2 주 이내에 화상 환자들의 화상 부위 조직으로부터 직접 섬유아세포를 확보했다. 이후 진행한 연구로부터 화상 환자의 화상 조직내 섬유아세포는 정상 조직 세포와 비교하여 세포 증식이 유의하게 증가하고 세포 내 비후성 마커들의 발현이 현저히 증가함을 확인했다. 이러한 결과는 3도 화상을 입은 섬유아세포가 활성화되어 과도한 증식과 ECM 발현을 통해 화상 후 비후성 반흔 형성을 일으킴을 시사하는 것으로 기존에 보고된 바 없는 사실이다. 또한, 본 발명자들은 3도 화상을 입은 섬유아세포에서 칼파인 (calpain)의 증가된 활성과 발현을 처음으로 확인했다.Hypertrophic scarring occurs in about 70% of burn patients, including most third-degree burn patients, which causes very serious cosmetic, functional, and psychological problems in burn patients. Hypertrophic scarring after burns is the most common and serious complication of burn patients, but there is no effective treatment method yet [1-3]. Wound healing occurs in three phases: inflammation, proliferation and remodeling. In the inflammatory phase, numerous cytokines and other proinflammatory factors are released into the wound site to restore tissue integrity. The proliferative phase begins with fibroblast infiltration and proliferation a few days after injury, after which collagen, which is important for hypertrophic scar formation, is deposited at the wound site [3]. To investigate the pathogenesis of the early stage of post-burn hypertrophic scar formation, the present inventors obtained fibroblasts directly from burn tissue of burn patients within 1 to 2 weeks after third-degree burns occurred. From subsequent studies, it was confirmed that fibroblasts in burn tissue of burn patients significantly increased cell proliferation and significantly increased the expression of intracellular hypertrophic markers compared to normal tissue cells. These results suggest that fibroblasts with third-degree burns are activated and cause hypertrophic scar formation after burns through excessive proliferation and ECM expression, a fact that has not been previously reported. In addition, the present inventors confirmed for the first time increased activity and expression of calpain in fibroblasts with third-degree burns.
이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 화상 후 비후성 반흔 형성에서 칼파인의 역할과 칼파인 저해제의 항 섬유화 가능성을 추가로 조사하였으며, 이로부터 칼파인 저해제 중 하나인 칼파스타틴에 의한 칼파인 억제가 화상 환자의 섬유아세포에서 세포 증식과 콜라겐을 포함한 비후성 마커의 발현을 현저하게 감소시킴을 확인했다. 또한, 칼파스타틴의 항섬유화 효과를 마우스 화상 동물 모델을 이용해 분자생물학적, 조직학적, 시각적 분석 방법으로 추가로 확인 검증했다. 본 발명에서 칼파스타틴 처리는 화상 환자의 섬유아세포와 화상 동물 모델의 화상 상처에서 TGF-β1의 발현을 감소시켜 TGF-β1 신호 전달을 억제시킴으로써 항 섬유화 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다.Based on these results, the present inventors further investigated the role of calpain in hypertrophic scar formation after burns and the anti-fibrotic potential of calpain inhibitors. It was confirmed that the expression of hypertrophic markers, including cell proliferation and collagen, was significantly reduced in fibroblasts. In addition, the antifibrotic effect of calpastatin was further confirmed and verified by molecular biological, histological, and visual analysis methods using a mouse burn animal model. In the present invention, it was confirmed that calpastatin treatment exerts an anti-fibrotic effect by inhibiting TGF-β1 signal transduction by reducing the expression of TGF-β1 in fibroblasts of burn patients and in burn wounds of burn animal models.
기존의 비후성 반흔 치료는 반흔 형성 이후에 사용되기 때문에 재발이 흔하며 치료 효과가 낮다. 화상 후 3 주 이내의 상처 치유는 비후성 반흔 형성의 중요한 예측 인자이다 [21]. 3주 이내에 정상적인 치유가 이루어지지 않을 경우 비후성 반흔이 형성된다. 따라서 본 발명에서 밝혀낸 칼파인 관련 흉터 형성 기전을 바탕으로, 화상 직후 비후성 반흔 형성 이전에 칼파스타틴을 이용한 조기 치료는 비후성 반흔 발생 자체를 예방할 수 있다. 본 발명으로부터 칼파스타틴을 처리하더라도 화상 조직 섬유아세포의 증식은 정상 조직 섬유아세포의 증식 수준 이하로 감소되지 않는 것을 확인했다. 이는 화상 동물 모델 실험에서 확인된 바와 같이 칼파스타틴이 정상 세포에서 나타나는 상처 치유 능력을 감소시키지 않고 화상에 의한 흉터 형성만을 억제함을 나타낸다.Existing hypertrophic scar treatment is used after scar formation, so recurrence is common and the treatment effect is low. Wound healing within 3 weeks after burn is an important predictor of hypertrophic scar formation [21]. If normal healing does not occur within 3 weeks, hypertrophic scars are formed. Therefore, based on the calpain-related scar formation mechanism identified in the present invention, early treatment using calpastatin immediately after burns and prior to hypertrophic scar formation can prevent hypertrophic scar formation itself. From the present invention, it was confirmed that the proliferation of burned tissue fibroblasts was not reduced below the proliferation level of normal tissue fibroblasts even when calpastatin was treated. This indicates that calpastatin inhibits only scar formation caused by burns without reducing the ability of normal cells to heal wounds, as confirmed in burn animal model experiments.
요약하면, 우리는 화상 환자의 섬유아세포와 마우스 화상 동물 모델 각각을 사용하여 화상 손상 후 피부 섬유아세포에서 칼파인의 활성 및 발현 증가를 확인하였고 칼파스타틴의 항섬유 효과를 처음으로 확인했다. 본 발명은 칼파스타틴에 의한 칼파인 억제가 화상 손상 후 비후성 반흔 형성을 예방하는 데 유용할 수 있음을 나타낸다.In summary, we confirmed the increased activity and expression of calpain in dermal fibroblasts after burn injury using fibroblasts from burn patients and mouse burn animal models, respectively, and confirmed the antifibrotic effect of calpastatin for the first time. The present invention indicates that calpain inhibition by calpastatin may be useful in preventing hypertrophic scar formation after burn injury.
칼파인 저해제는 대략 다섯 가지로 분류할 수 있다. 첫째는 폴리펩타이드 칼파인 저해제로서 천연 단백질 저해제인 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드, 키니노젠 중쇄 (kininogen heavy chain) 유사체 등, 둘째로는 가역적 펩타이드 알데하이드, 케톤 또는 케토아마이드로서 Boc-Leu-Nle-H, Z-Leu-Abu-CONHEt 등, 셋째, E64 유사체, 넷째, Z-Leu-Val-Gly-CHN2, Z-Gly-Leu-Phe-CH2Cl 등의 활성부위 알킬레이팅 펩타이드 할로케톤 및 디아조케톤, 다섯째, 비펩타이드 저해제로서 아이소쿠마린 유도체 등을 들 수 있다 (Wang K. et al., TiPS(1994) Vol. 15, PP 412-419). 본 발명자들은 이들 다양한 칼파인 저해제 중 대표적인 12종의 칼파인 저해제에 대하여 실험을 수행한 결과, 칼파스타틴을 포함한 3종의 칼파인 저해제를 투여한 경우에만 유의한 비후성 반흔 형성 억제 효과를 관찰할 수 있었다.Calpain inhibitors can be roughly classified into five types. The first is a polypeptide calpain inhibitor, which is a natural protein inhibitor, such as a calpastatin-like polypeptide, a kininogen heavy chain analog, etc., and the second is a reversible peptide aldehyde, ketone or ketoamide, Boc-Leu-Nle-H, Z-Leu-Abu-CONHEt, etc., 3rd, E64 analogues, 4th, Z-Leu-Val-Gly-CHN2, Z-Gly-Leu-Phe-CH2Cl, etc. Active site alkylating peptides Haloketones and diazoketones, 5th , Non-peptide inhibitors include isocoumarin derivatives and the like (Wang K. et al., TiPS (1994) Vol. 15, PP 412-419). The present inventors conducted experiments on 12 representative calpain inhibitors among these various calpain inhibitors, and as a result, a significant hypertrophic scar formation inhibitory effect could be observed only when 3 calpain inhibitors, including calpastatin, were administered. there was.
본 발명은 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 (예컨대 유럽특허 EP 0395309 B1에 개시된 것과 같은 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 등) 또는 이의 활성 단편을 함유하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 (calpastatin-like polypeptide)는 칼파스타틴의 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. The present invention relates to a pharmaceutical for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns containing calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide (eg, a calpastatin-like polypeptide as disclosed in European Patent EP 0395309 B1, etc.) or an active fragment thereof. It's about the composition. The calpastatin-like polypeptide refers to a polypeptide exhibiting the activity of calpastatin.
인간 칼파스타틴에 대한 cDNA 클로닝을 통해 칼파스타틴 아미노산의 1차 구조가 확인되었고, 각각 약 140개 아미노산 잔기의 4개의 반복 기능 단위 (도메인 1-4)와 N-말단 쪽의 L 도메인이라는 이름의 비-동일성 서열로 구성되는 것으로 밝혀졌다 (일본 공개 특허 63-207283). 도메인 1-4는 각각 자체적으로 칼파스타틴 활성을 가지고 있지만, 도메인 1의 활성이 가장 강한 것으로 나타났다. 도메인 1에 있는 18개 아미노산의 폴리펩티드는 여전히 활성이있는 것으로 밝혀졌다 (유럽특허 EP 0395309 B1 참조). 이와 같이, 칼파스타틴 전장 단백질뿐만 아니라, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 및 칼파스타틴의 단편 또는 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드의 단편 중에도 칼페인 저해 활성을 가진 최소 18개 아미노산, 예컨대 시판되는 27개의 아미노산 단편을 포함하는 단편을 본 발명에 이용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.The primary structure of calpastatin amino acids was confirmed through cDNA cloning of human calpastatin, and four repeating functional units (
또한, 본 발명은 상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편이 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포의 증식을 저해하는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide, or an active fragment thereof inhibit proliferation of burn tissue fibroblasts of a burn patient.
또한, 본 발명은 상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편이 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 활성 및 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide or an active fragment thereof inhibits the activity and expression of calpain in burn tissue fibroblasts of a burn patient.
또한, 본 발명은 상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편이 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 섬유증 마커의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide or an active fragment thereof inhibits the expression of a fibrosis marker in burn tissue fibroblasts of a burn patient.
또한, 본 발명은 상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편을 0.1 내지 5 ㎍/kg/day로, 바람직하게는 0.5 내지 2.5 ㎍/kg/day로 투여하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention is characterized in that the calpastatin, active fragment thereof, calpastatin-like polypeptide or active fragment thereof is administered at 0.1 to 5 μg/kg/day, preferably 0.5 to 2.5 μg/kg/day. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns.
또한, 본 발명은 상기 조성물에 칼펩틴, PD150606 중 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns, characterized in that the composition further comprises at least one selected from calpeptin and PD150606.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 화상 상처 발생 후 0일 내지 180일, 바람직하게는 0일 내지 60일, 더욱 바람직하게는 0일 내지 30일에 투여하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention is a post-burn hypertrophic scar formation prevention or It relates to a pharmaceutical composition for treatment.
이뿐만 아니라, 본 발명은 포유류 동물의 화상 상처 발생 후 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편을 투여하여 화상 후 비후성 반흔 형성을 예방하는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for preventing hypertrophic scar formation after burns by administering calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide or an active fragment thereof after burn wounds in a mammal animal.
또한, 본 발명은 상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편을 0.1 내지 5 ㎍/kg/day로, 바람직하게는 0.5 내지 2.5 ㎍/kg/day로 투여하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성을 예방하는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention is characterized in that the calpastatin, active fragment thereof, calpastatin-like polypeptide or active fragment thereof is administered at 0.1 to 5 μg/kg/day, preferably 0.5 to 2.5 μg/kg/day. It relates to a method for preventing hypertrophic scar formation after burns.
나아가, 본 발명은 상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편을 화상 상처 발생 후 0일 내지 180일, 바람직하게는 0일 내지 60일, 더욱 바람직하게는 0일 내지 30일에 투여하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성을 예방하는 방법에 관한 것이다.Furthermore, the present invention provides the administration of the calpastatin, active fragment thereof, calpastatin-like polypeptide or active fragment thereof from 0 to 180 days, preferably from 0 to 60 days, more preferably from 0 to 30 days after the occurrence of burn wounds. It relates to a method for preventing hypertrophic scar formation after burns, characterized in that it is administered on a daily basis.
본 발명의 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.A pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation containing calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide, or an active fragment thereof of the present invention as an active ingredient includes 0.0001 to 50% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition. to include
본 발명의 조성물은 상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 함유하는 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분으로는 예컨대 칼펩틴, PD150606 중 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 조성물은 임상 투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.The composition of the present invention is an active ingredient exhibiting the same or similar function in addition to the pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation containing calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide, or an active fragment thereof as an active ingredient. One or more types may be included. Active ingredients exhibiting the same or similar functions may be, for example, at least one selected from calpeptin and PD150606. The composition of the present invention can be administered orally or parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations.
본 발명의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. The pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation of the present invention may be preferably formulated as a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
또한, 본 발명의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 기술자에게 잘 알려진 화학요법약제 (chemotherapeutic agent)를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation of the present invention may be used together with one or more pharmaceutical compositions for preventing or treating hypertrophic scar formation. The pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation of the present invention may further include a chemotherapeutic agent well known to those skilled in the art.
본 발명의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 가용화제 등이 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation of the present invention may include, in addition to the above active ingredients, pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvants, such adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents , expanding agents, lubricants, lubricants or solubilizers, and the like.
또한, 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition, the composition of the present invention may be preferably formulated as a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The pharmaceutical preparation prepared as described above may be parenterally administered, that is, subcutaneous administration, intramuscular administration, or topical application, depending on the purpose, and the dose may be 0.001 μg to 10 mg/kg per day in an amount of 1 to 10 mg/kg. It can be divided into several doses. The dosage level for a specific patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, administration time, administration method, severity of disease, and the like.
또한, 본 발명의 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 Kca3.1 채널 활성 저해제를 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.In addition, a coating agent containing calpastatin, an active fragment thereof, a polypeptide similar to calpastatin, or an active fragment thereof of the present invention as an active ingredient can be easily prepared in any form according to a conventional manufacturing method. As an example, in preparing a cream-type coating agent, the K ca 3.1 channel activity inhibitor of the present invention is contained in a general oil-in-water (O/W) or water-in-oil (W/O) cream base, and fragrances, chelating agents, pigments, While antioxidants and preservatives are used as needed, synthetic or natural materials such as proteins, minerals, and vitamins may be used in combination for the purpose of improving physical properties.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에서 허용되는 약제학적 담체로는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.Pharmaceutical carriers acceptable for compositions formulated as liquid solutions are sterile and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and these components. One or more of the components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added if necessary. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to prepare formulations for injections such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, pills, capsules, granules, or tablets. Furthermore, using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA as an appropriate method in the field, it can be preferably formulated according to each disease or component.
본 발명의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 약제 제제 형태는 연고, 크림제, 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.The pharmaceutical formulation form of the pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation of the present invention is ointment, cream, granule, powder, coated tablet, tablet, capsule, suppository, syrup, juice, suspension, emulsion, drops or injection Possible liquid formulations and sustained-release formulations of active compounds may be used.
본 발명의 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 비측 내, 흡입, 국소, 직장, 경구 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.The composition of the present invention can be administered in a conventional manner through intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalational, topical, rectal, oral or intradermal routes.
본 발명의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, "유효량"은 비후성 반흔 형성 및/또는 성장을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/㎏~10㎎/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 0.1 내지 7 ㎍/kg/day, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎍/kg/day로 투여할 수 있다.In the pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation of the present invention, "effective amount" means an amount required to achieve an effect of inhibiting hypertrophic scar formation and/or growth. Therefore, the "effective amount" of the active ingredient of the present invention refers to the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, weight, general health condition, gender and It can be adjusted according to various factors including diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, and concurrently used drugs. In the case of adults, when the inhibitor is administered once or several times a day, it is preferable to administer the compound at a dose of 0.1 ng/kg to 10 mg/kg. Preferably, it can be administered at 0.1 to 7 μg/kg/day, more preferably at 0.5 to 5 μg/kg/day.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 좀 더 명확해진다.Matters related to genetic engineering technology in the present invention are described in Sambrook et al. (Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)) and Frederick et al. M. Ausubel et al., Current protocols in
본 발명의 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 조성물은 단독으로, 또는 레이저 치료, 화학 치료 등과 병용하여 사용할 수 있다.The composition for preventing or treating hypertrophic scar formation of the present invention may be used alone or in combination with laser treatment, chemotherapy, and the like.
본 발명에 따르면, 환자에게서 얻은 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 활성과 발현은 증가하며, 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 섬유증 마커의 발현은 전사 및 번역 수준 모두에서 증가하며, 칼파스타틴은 환자의 화상 조직 섬유아세포의 인 비트로 증식을 저해할 뿐만 아니라, 환자 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 활성과 발현을 억제하고, 섬유증 마커의 발현을 억제하였다. 칼파스타틴은 마우스 화상 조직에서 섬유증 마커의 발현을 억제하고, 마우스에서 화상 후 비후성 반흔 형성을 저해한다.According to the present invention, the activity and expression of calpain are increased in burn tissue fibroblasts obtained from patients, and the expression of fibrosis markers in burn tissue fibroblasts from burn patients is increased at both transcriptional and translational levels, and calpastatin is It not only inhibited the proliferation of burn tissue fibroblasts in vitro, but also inhibited the activity and expression of calpain and the expression of fibrosis markers in patient burn tissue fibroblasts. Calpastatin inhibits expression of fibrosis markers in mouse burn tissue and inhibits post-burn hypertrophic scar formation in mice.
본 발명에 따르면, 칼파스타틴을 주요성분으로 함유하는 약학 조성물은 비후성 반흔 형성 예방제 및/또는 치료제, 특히 화상 후 비후성 반흔 형성 예방제 및/또는 치료제로 이용할 수 있다.According to the present invention, the pharmaceutical composition containing calpastatin as a main component can be used as an agent for preventing and/or treating hypertrophic scar formation, particularly as an agent for preventing and/or treating hypertrophic scar formation after burns.
도 1. 화상 환자로부터 얻은 섬유아세포에서 칼파인의 활성 및 발현. (a) 화상을 입은 섬유아세포 (BF) 및 정상 조직 섬유아세포 (NF)의 칼파인 활성, 화상을 입은 섬유아세포 (BF) 및 정상 조직 섬유아세포 (NF)의 (b, c) 칼파인-1 및 (d, e) 칼파인-2의 mRNA 및 단백질 수준. 화상 조직 섬유아세포 (BF)에서 칼파인 활성 및 모든 발현 수준은 각 환자의 정상 조직 섬유아세포 (NF)의 것과 비교하여 정규화했다. RLU, 상대 광 단위 (relative light units). *p <0.05 및 **p <0.01. 데이터는 평균±표준편차로 나타낸다. n = 34 (NF) 및 n = 34 (BF).
도 2. 섬유증 마커의 전사 및 번역 수준. (a, b) TGF-β1 (TGB1), (c, d) α-SMA (ACTA2), (e, f) 피브로넥틴 (FN1), (g, h) 콜라겐 I (COL1A1), (i, j) 콜라겐 III (COL3A1)의 mRNA 및 단백질 수준, 그리고 (k, l) 화상 상처 섬유아세포 (BF)의 비멘틴 (VIM)을 각 환자의 정상 조직 섬유아세포 (NF) 발현 수준과 비교하고 정규화했다. **p <0.01. 데이터는 평균±표준편차로 나타낸다. n = 34 (NF) 및 n = 34 (BF).
도 3. 화상 환자로부터 얻은 섬유아세포의 증식에 대한 칼파스타틴의 효과. (a) 정상 조직 섬유아세포 (NF), 화상 조직 섬유아세포 (BF), DPBS 처리된 BF (DPBS) 및 다양한 농도 (0.1, 1 및 10 μM)의 칼파스타틴으로 처리된 BF에서 48시간 동안 관찰된 증식 상황. (b) 정상 조직 섬유아세포 (NFs), DPBS 처리된 BF (DPBS) 및 칼파스타틴 (10 μM) 처리된 BF를 보여주는 세포 이미지 (10X). 척도 막대 = 50 ㎛. 칼파스타틴 처리시 BF의 증식을 NF 또는 DPBS와 비교하고 정규화했다. 각 환자에 대해 치료된 BF. †† p <0.01은 NF와 비교한 값이고; **p <0.01은 DPBS 처리된 BF와 비교한 값이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. n = 34 (각 군).
도 4. 환자의 화상 상처 섬유아세포 (BF)에서 칼파인의 활성 및 발현에 대한 칼파스타틴의 영향. 10 μM로 처리된 BF에서 칼파인의 활성 (a) , 칼파인-1의 mRNA 및 단백질 발현 (b, c) 칼파인-2의 mRNA 및 단백질 발현 (d, e)을 DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 48시간 동안 처리한 BF와 비교한 값. 활성 및 발현 수준은 각 환자에 대해 DPBS 처리된 BF의 수준으로 정규화되었다. DPBS, DPBS 처리된 BF; Calpastatin, 칼파스타틴 처리된 BF; RLU, 상대 광 단위. * p <0.05 및 ** p <0.01. 데이터는 평균±표준편차로 표현된다. n = 34 (각 군).
도 5. 환자의 화상 상처 섬유아세포 (BF)에서 섬유증 마커에 대한 칼파스타틴의 영향. (a, b) TGF-β1 (TGB1), (c, d) α-SMA (ACTA2), (e, f) 피브로넥틴 (FN1), (g, h) 콜라겐 I (COL1A1), (i, j) 콜라겐 III (COL3A1) 및 (k, l) 비멘틴 (VIM)의 mRNA 및 단백질 수준은 DPBS 처리 BFs (DPBS)와 비교하여 10 μM 칼파스타틴을 처리한 BFs에서 현저히 감소하였다. 모든 발현 수준은 각 환자의 DPBS 처리 BFs 수준으로 정규화되었다. **p < 0.01. 데이터는 평균±표준편차로 표현된다. n = 34 (각 군).
도 6. 화상 마우스에서 섬유증 마커 발현에 대한 칼파스타틴의 영향. 화상 손상 후 28일 동안 매일 1회 칼파스타틴을 투여한 마우스의 화상 조직 내 (a, b) TGF-β1 (TGB1), (c, d) α-SMA (ACTA2), (e, f) 피브로넥틴 (FN1), (g, h) 콜라겐 I (COL1A1), (i, j) 콜라겐 III (COL3A1) 및 (k, l) 비멘틴 (VIM)의 mRNA 및 단백질 수준을 담체 처리한 마우스와 비교하였다. 모든 발현 수준은 담체 처리 마우스 수준으로 정규화되었다. **p < 0.01. 데이터는 평균±표준편차로 표현된다. n = 36 (담체 처리 대조군) 및 n = 36 (칼파스타틴 처리군).
도 7. 마우스에서 화상 후 반흔 형성에 미치는 칼파스타틴의 영향. (a) 담체 처리 대조군 및 칼파스타틴 처리 마우스의 상처 이미지는 칼파스타틴 처리 후 상처 입은 화상 피부에서 변색과 불규칙한 두께가 덜함을 보여준다. 눈금자의 단위, 1mm. 스케일 바 = 2mm. (b) Masson의 trichrome 염색으로 얻은 칼파스타틴 처리 마우스의 화상 피부 상처의 조직학적 이미지는 표피 및 진피 두께가 감소했음을 보여준다. 스케일 바 = 10배 확대하여 100 ㎛. 화살표는 진피와 피하 조직 사이의 경계를 나타낸다. 화상 상처 마우스의 담체 처리 (vihicle) 및 칼파스타틴 처리 (calpastatin) (c) 표피 및 (d) 진피 두께의 정량 분석. 두께는 담체 처리 대조군의 평균값을 1로 설정하여 담체 처리 마우스의 두께로 정규화되었다. ** p <0.01. 데이터는 평균±표준편차로 표현된다. n = 36 (담체 처리 대조군) 및 n = 36 (칼파스타틴 처리군).
도 8. 연구에 참여한 화상 환자의 추적 절차 다이어그램. VAS, 시각적 아날로그 스케일 (visual analog scale); TEWL, 경피 수분 손실 (transepidermal water loss).Figure 1. Activity and expression of calpain in fibroblasts obtained from burn patients. (a) calpain activity in burnt fibroblasts (BF) and normal tissue fibroblasts (NF), (b, c) calpain-1 in burnt fibroblasts (BF) and normal tissue fibroblasts (NF) and (d, e) mRNA and protein levels of calpain-2. Calpain activity and all expression levels in burnt tissue fibroblasts (BF) were normalized compared to that of normal tissue fibroblasts (NF) from each patient. RLU, relative light units. *p < 0.05 and **p < 0.01. Data are presented as mean±standard deviation. n = 34 (NF) and n = 34 (BF).
Figure 2. Transcriptional and translational levels of fibrosis markers. (a, b) TGF-β1 ( TGB1 ), (c, d) α-SMA ( ACTA2 ), (e, f) fibronectin ( FN1 ), (g, h) collagen I ( COL1A1 ), (i, j) mRNA and protein levels of collagen III ( COL3A1 ) and (k, l) vimentin (VIM) in burn wound fibroblasts (BF) were compared and normalized to normal tissue fibroblast (NF) expression levels in each patient. **p < 0.01. Data are presented as mean±standard deviation. n = 34 (NF) and n = 34 (BF).
Figure 3. Effect of calpastatin on the proliferation of fibroblasts obtained from burn patients. (a) Normal tissue fibroblasts (NF), burned tissue fibroblasts (BF), DPBS-treated BF (DPBS) and BF treated with calpastatin at various concentrations (0.1, 1 and 10 μM) for 48 h. proliferative situation. (b) Cell images (10X) showing normal tissue fibroblasts (NFs), DPBS-treated BFs (DPBS) and calpastatin (10 μM)-treated BFs. Scale bar = 50 μm. Proliferation of BF upon calpastatin treatment was compared and normalized to that of NF or DPBS. BF treated for each patient. †† p <0.01 compared to NF; ** p <0.01 compared to DPBS treated BF. Data are presented as mean±standard deviation. n = 34 (each group).
Figure 4. The effect of calpastatin on the activity and expression of calpain in patient's burn wound fibroblasts (BF). Calpain activity (a), calpain-1 mRNA and protein expression (b, c) and calpain-2 mRNA and protein expression (d, e) in BF treated with 10 μM were measured in DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) compared to BF treated for 48 hours. Activity and expression levels were normalized to those of DPBS-treated BF for each patient. DPBS, DPBS-treated BF; Calpastatin, calpastatin-treated BF; RLU, relative light unit. *p < 0.05 and **p < 0.01. Data are expressed as mean±standard deviation. n = 34 (each group).
Figure 5. Effect of calpastatin on fibrosis markers in patient's burn wound fibroblasts (BF). (a, b) TGF-β1 ( TGB1 ), (c, d) α-SMA ( ACTA2 ), (e, f) fibronectin ( FN1 ), (g, h) collagen I ( COL1A1 ), (i, j) The mRNA and protein levels of collagen III ( COL3A1 ) and (k, l) vimentin ( VIM ) were significantly reduced in BFs treated with 10 μM calpastatin compared to DPBS-treated BFs (DPBS). All expression levels were normalized to the level of DPBS-treated BFs in each patient. ** p < 0.01. Data are expressed as mean±standard deviation. n = 34 (each group).
Figure 6. Effect of calpastatin on fibrosis marker expression in burn mice. (a, b) TGF-β1 ( TGB1 ), (c, d) α-SMA ( ACTA2 ), (e, f) fibronectin ( FN1 ), (g, h) collagen I ( COL1A1 ), (i, j) collagen III ( COL3A1 ) and (k, l) vimentin ( VIM ) mRNA and protein levels were compared with carrier-treated mice. All expression levels were normalized to those of carrier-treated mice. ** p < 0.01. Data are expressed as mean±standard deviation. n = 36 (carrier-treated control group) and n = 36 (calpastatin-treated group).
Figure 7. Effect of calpastatin on scar formation after burns in mice. (a) Wound images of carrier-treated control and calpastatin-treated mice show less discoloration and irregular thickness in wounded burn skin after calpastatin treatment. Ruler unit, 1 mm. Scale bar = 2 mm. (b) Histological images of burn skin wounds in calpastatin-treated mice obtained by Masson's trichrome staining, showing reduced epidermal and dermal thickness. Scale bar = 100 μm at 10x magnification. Arrows indicate the boundary between the dermis and subcutaneous tissue. Quantitative analysis of carrier-treated (vihicle) and calpastatin-treated (c) epidermal and (d) dermal thicknesses of burn-wound mice. The thickness was normalized to that of the carrier-treated mice by setting the mean value of the carrier-treated control group to 1. **p < 0.01. Data are expressed as mean±standard deviation. n = 36 (carrier-treated control group) and n = 36 (calpastatin-treated group).
Figure 8. Diagram of follow-up procedures for burn patients participating in the study. VAS, visual analog scale; TEWL, transepidermal water loss.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.In the following, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to specific embodiments. However, it is apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited only to the description of the examples.
1. 인간 시편1. Human Psalms
2018년 1월 10일부터 2019년 3월 28일까지 한림대학교 한강성심병원 화상 연구소에서 3도 화상 후 1 ~ 2주 사이에 중간층 피부 자가이식 (split-thickness skin autografting)을 받은 총 37명의 환자 각각으로부터 화상 피부 조직과 정상 조직을 채취했다 (도 8). 잠재적인 교란 요인을 줄이기 위해 각 환자는 신체의 손상되지 않은 부분에서 자가이식에 사용되는 정상적인 피부 조직의 일부를 제공함으로써 자신의 대조군 역할을 했다. 샘플 크기는 자금 지원 기관에서 규정한 연구 기간 동안 모집할 수 있는 환자 수로 결정되었다. 포함된 환자는 전체 신체 표면적 20% 이상의 3도 화상을 입었으며 연령 범위는 8-61세였다. 상처 치유에 영향을 미치는 혼동 변수를 줄이기 위한 제외 기준은 다음과 같다: 화상 전 6개월 이내 피부 알러지, 악성 종양, 갑상선 질환, 당뇨병, 임신 또는 수유, 약물 또는 알코올 남용, 화학 요법, 호르몬 요법 또는 기타 처방약 사용 병력. 환자의 화상후 비후성 반흔 발생은 1년간 매월 2명의 화상 외과의가 개별적으로 평가했으며, 화상 후 비후성 반흔이 발생하지 않은 환자의 실험 데이터는 최종적으로 제외하였다. 본 연구에 참여한 37명의 환자 중 34명의 환자에서 화상 후 비후성 반흔 형성이 발생했다.From January 10, 2018 to March 28, 2019, a total of 37 patients who underwent split-thickness skin autografting between 1 and 2 weeks after third-degree burns at the Burn Research Institute of Hangang Sacred Heart Hospital, Hallym University Burned skin tissue and normal tissue were taken from (Fig. 8). To reduce potential confounding factors, each patient served as their own control by providing a portion of normal skin tissue to be used for autografts from an undamaged part of the body. Sample size was determined by the number of patients that could be recruited during the study period stipulated by the funding agency. The patients included had third-degree burns over 20% of the total body surface area and ranged in age from 8 to 61 years. Exclusion criteria to reduce confounding variables affecting wound healing were: skin allergy within 6 months prior to burn, malignancy, thyroid disease, diabetes, pregnancy or lactation, drug or alcohol abuse, chemotherapy, hormone therapy, or other A history of prescription drug use. The occurrence of post-burn hypertrophic scarring was individually evaluated by two burn surgeons every month for 1 year, and the experimental data of patients without post-burn hypertrophic scarring were finally excluded. Hypertrophic scar formation after burns occurred in 34 of 37 patients who participated in this study.
표 1은 화상 후 비후성 반흔이 발생한 환자의 인구 통계 및 화상 특성을 보여준다. 조직을 기증한 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았으며,이 연구는 한강 성심 병원 기관 심의위원회의 지침에 따라 수행되었다 (HG2018-018).Table 1 shows the demographics and burn characteristics of patients with post-burn hypertrophic scarring. Written informed consent was obtained from all patients who donated tissues, and this study was conducted in accordance with the guidelines of the Institutional Review Board of Hangang Sacred Heart Hospital (HG2018-018).
2. 실험 동물2. Experimental animals
체중 20 ~ 25 g, 6주령 DBA/2NHsd 근친 교배 마우스를 경기도 평택 소재 코아텍 실험실 동물 주식회사에서 구입하였다. 마우스를 폴리카보네이트 케이지에 수용하고 표준 실험실 사료 및 여과수에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 실온 및 상대 습도는 각각 25 ± 2℃ 및 55 ± 5%였으며, 12시간 밝음/12시간 암흑 주기를 유지하였다. 모든 동물실험은 국립 보건원 실험 동물 관리 및 이용 가이드에 따라서 한림대학교 한강성심병원 동물 실험실에서 진행되었다. 본 연구는 한림대학교 동물 연구 윤리위원회의 승인을 받았다 (HMC2018-2-0222-2).DBA/2NHsd inbred mice weighing 20-25 g and 6 weeks old were purchased from Coretech Lab Animal Co., Ltd., Pyeongtaek, Gyeonggi-do. Mice were housed in polycarbonate cages and allowed free access to standard laboratory chow and filtered water. Room temperature and relative humidity were 25 ± 2 °C and 55 ± 5%, respectively, and a 12-hour light/12-hour dark cycle was maintained. All animal experiments were conducted in the animal laboratory of Hallym University Hangang Sacred Heart Hospital in accordance with the Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health. This study was approved by the Animal Research Ethics Committee of Hallym University (HMC2018-2-0222-2).
3. 섬유아세포 분리 및 배양3. Fibroblast isolation and culture
환자로부터 화상 상처 진피 섬유아세포의 분리 및 배양은 이전에 보고된 대로 수행하였다 [20]. 피부 조직 샘플을 70% 에탄올 및 DPBS (Biowest, Riverside, MO, USA)로 각각 세 번 세척했다. 그 후, 스트렙토마이신, 페니실린 및 암포테리신 B (Gibco, Grand Island, NY, USA)로 구성된 1% 항생제- 항진균제가 보충된 차가운 DPBS에 담갔다. 미세 핀셋과 메스를 사용하여 피하 지방과 느슨한 결합 조직을 제거했다. 조직을 약 1-2 mm 폭의 작은 조각으로 자르고, 10 mL Dispase II 용액 (1 U/mL) (Gibco)이 있는 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 멸균 집게를 사용하여 진피와 표피를 당기거나 벗겨냈다. 분리된 진피를 콜라게나제 IV 형 용액 (500 U/mL) (Gibco)을 사용하여 37 ℃에서 30분 동안 분해하였다. 그런 다음 샘플을 10% 소 태아 혈청 (FBS; Biowest)을 포함하는 15 mL DMEM 배지 (Biowest)에 담가 콜라게나제를 비활성화하고 100 ㎛ 세포 스트레이너 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 300×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 10% FBS를 함유하는 DMEM에 재현탁하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 확장된 섬유아세포는 모든 실험에서 1-2 계대의 것을 사용하였다.Isolation and culture of burn wound dermal fibroblasts from patients was performed as previously reported [20]. Skin tissue samples were washed three times each with 70% ethanol and DPBS (Biowest, Riverside, MO, USA). They were then soaked in cold DPBS supplemented with 1% antibiotic-antimycotic consisting of streptomycin, penicillin and amphotericin B (Gibco, Grand Island, NY, USA). Subcutaneous fat and loose connective tissue were removed using fine tweezers and a scalpel. The tissue was cut into small pieces about 1-2 mm wide, transferred to a 50 mL conical tube with 10 mL Dispase II solution (1 U/mL) (Gibco) and incubated overnight at 4 °C. The next day, the dermis and epidermis were pulled or peeled off using sterile forceps. The separated dermis was digested at 37° C. for 30 minutes using collagenase type IV solution (500 U/mL) (Gibco). Samples were then immersed in 15 mL DMEM medium (Biowest) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Biowest) to inactivate collagenase and filtered using a 100 μm cell strainer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Centrifuged at 300 x g for 5 minutes. The pellet was resuspended in DMEM containing 10% FBS and incubated at 37°C and 5% CO 2 . The expanded fibroblasts were used in all experiments of 1-2 passages.
4. 세포 증식 및 칼파스타틴 처리4. Cell Proliferation and Calpastatin Treatment
환자 샘플 유래 정상 조직 섬유아세포, 화상 조직 섬유아세포 및 칼파스타틴 처리된 화상 조직 섬유아세포의 증식은 CellTiter 96® AQueous One Solution 세포 증식 분석 키트 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 조사하였다. 정상 조직 섬유아세포 (NF)는 중간층 피부 자가이식에 사용된 비화상 피부에서 얻은 것이다. 세포를 10% FBS 및 1% 항생제-항진균제가 보충된 DMEM을 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다 (2 × 104 세포/웰). 다음날 배양액을 10% FBS가 함유된 DMEM으로 교체하고, 화상 조직 섬유아세포를 DPBS에 용해된 아세틸-칼파스타틴 (Tocris Bioscience, Bristol, UK) 0.1, 1 또는 10μM로 48시간 동안 처리하였다. 신선한 배양 배지 (100 ㎕ DMEM)와 20 ㎕의 CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent를 세포에 첨가하고 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 96- 웰 플레이트 리더 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식은 다음과 같이 계산하였다: 증식률 (%) = (샘플 흡광도-배경 흡광도)/(대조군 샘플 흡광도-배경 흡광도)×100. 칼파스타틴 처리 48시간 후, 광학 현미경 (IX 70, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포 이미지를 획득했다.Proliferation of normal tissue fibroblasts, burnt tissue fibroblasts and calpastatin-treated burnt tissue fibroblasts from patient samples was investigated using the CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA). Normal tissue fibroblasts (NF) were obtained from unburned skin used for interlayer skin autografts. Cells were seeded (2×10 4 cells/well) in 96-well tissue culture plates containing DMEM supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic-antimycotic. The next day, the culture medium was replaced with DMEM containing 10% FBS, and the burnt tissue fibroblasts were treated with 0.1, 1 or 10 µM of acetyl-calpastatin (Tocris Bioscience, Bristol, UK) dissolved in DPBS for 48 hours. Fresh culture medium (100 μl DMEM) and 20 μl of CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent were added to the cells and incubated at 37 °C for 2 hours. Then, absorbance was measured at 490 nm using a 96-well plate reader (BioTek, Winooski, VT, USA). Cell proliferation was calculated as follows: Proliferation (%) = (sample absorbance - background absorbance)/(control sample absorbance - background absorbance) x 100. After 48 hours of calpastatin treatment, cell images were acquired using an optical microscope (IX 70, Olympus, Tokyo, Japan).
그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA에 대해서도 위와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.Other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, quinolinecarboxamide and ATA were also tested in the same manner as above.
각 환자에 대해 칼파스타틴 처리한 BF의 증식을 NF 또는 DPBS로 처리한 BF와 비교하고 정규화했다. 실험은 세 번씩 수행하였다.Proliferation of BF treated with calpastatin was compared and normalized to BF treated with NF or DPBS for each patient. Experiments were performed three times.
5. 칼파인 활성 측정5. Measurement of calpain activity
세포를 100mm 접시 플레이트에서 성장시키고 DPBS로 두 번 헹구고 세포 분리 용액 AccutaseTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 수확했다. 세포를 계수한 다음 방사선 면역 침전 분석 (RIPA) 완충액 (에틸렌디아민테트라아세트산 무함유) (30 ㎕/L × 105 세포)으로 용해한 다음 30분 동안 원심 분리했다 (13000 × g, 4℃). 칼파인 활성은 제조업체의 프로토콜에 따라 Calpain-GloTM protease 분석 (Promega)을 사용하여 상층액에서 측정되었다. 발광은 멀티모드 검출기 (DTX880, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)에서 상대 광 단위로 측정되었다. Cells were grown in 100 mm dish plates, rinsed twice with DPBS and harvested using cell dissociation solution Accutase ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cells were counted and then lysed with radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (without ethylenediaminetetraacetic acid) (30 μl/L×10 5 cells) and centrifuged for 30 minutes (13000×g, 4° C.). Calpain activity was measured in the supernatant using the Calpain-Glo TM protease assay (Promega) according to the manufacturer's protocol. Luminescence was measured in relative light units on a multimode detector (DTX880, Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA에 대해서도 위와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.Other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, quinolinecarboxamide and ATA were also tested in the same manner as above.
각 세포군은 세 번씩 테스트하였다. 배경값을 빼고, 결과는 각 환자에 대한 NF 또는 DPBS 처리된 BF에 대한 배 변화 (fold-change)로 표현되었다.Each cell group was tested in triplicate. Subtracting background values, results were expressed as fold-change for NF or DPBS treated BF for each patient.
6. 쥐 화상 모델 및 칼파스타틴 처리6. Rat Burn Model and Calpastatin Treatment
마우스를 마취시키고 100% 산소와 2.5% 이소플루란 (하나팜 (주), 서울) 하에서 유지하였다. 각 마우스의 등을 면도하고 전기 가위와 70% 알코올로 각각 살균하였다. 직경 10mm의 깊은 3도 화상은 총 에너지 700 ± 10J의 레이저 조사로 생성되었다 (Sellas EvoTM, 서울, 대한민국). 3도 화상은 조직학적으로 확인되었다. 화상을 유발한 직후 식염수 (담체 대조군) 또는 식염수에 용해된 아세틸-칼파스타틴 (1.5㎍/kg) [22]을 각 마우스군 (테스트 : n = 36, 대조군 : n = 36)에 28일 동안 매일 1회 피하 주사하였다. 화상 상처는 고압 멸균된 바셀린 거즈로 매일 드레싱했다. 화상 손상 28일 후 마우스로부터 화상 피부 조직을 채취하였다.Mice were anesthetized and maintained under 100% oxygen and 2.5% isoflurane (Hana Farm Co., Ltd., Seoul). The back of each mouse was shaved and sterilized with electric scissors and 70% alcohol, respectively. Deep third-degree burns with a diameter of 10 mm were created with laser irradiation with a total energy of 700 ± 10 J (Sellas Evo TM , Seoul, Korea). Third-degree burns were confirmed histologically. Immediately after burn induction, saline (carrier control) or acetyl-calpastatin (1.5 μg/kg) dissolved in saline [22] was administered daily for 28 days to each mouse group (test: n = 36, control: n = 36). 1 subcutaneous injection. Burn wounds were dressed daily with autoclaved petrolatum gauze. Burn skin tissues were collected from
그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA에 대해서도 위와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.Other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, quinolinecarboxamide and ATA were also tested in the same manner as above.
7. qRT-PCR 분석7. qRT-PCR analysis
RNAzol (Cancer Rop Co., Seoul, Republic)의 샘플을 gentleMACSTM Dissociator (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)로 균질화한 후 제조업체의 지침에 따라 ReliaPrepTM RNA Miniprep 시스템 (Promega)을 이용하여 추출하여 섬유 아세포와 화상 조직에서 총 RNA를 얻었다. RNA 농도는 NanoDrop 분광 광도계 (BioTek)로 측정하였고, PrimeScriptTM RT 마스터 믹스 (Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 2㎍ RNA를 cDNA로 변환했다. qRT-PCR은 50ng cDNA 및 0.5μM 프라이머를 사용하여 LightCycler® 96 (Roche, Basel, Switzerland)에서 수행되었다. 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성, 95℃에서 10초와 60℃에서 30초를 40회 증폭 반복, 95℃에서 5초, 65℃에서 60초, 95℃에서 1초 동안 용융 곡선 분석. 각 유전자의 mRNA 발현은 2-△△Ct 방법을 통해 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)의 발현으로 정규화되었다 [23]. 칼파스타틴 처리 유무에 관계없이 각 환자의 BF의 mRNA 발현 수준을 NF 또는 DPBS 처리 BF와 비교하고 정규화했다. Samples of RNAzol (Cancer Rop Co., Seoul, Republic) were homogenized with a gentleMACS TM Dissociator (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany), and then extracted using the ReliaPrep TM RNA Miniprep system (Promega) according to the manufacturer's instructions to obtain fibers. Total RNA was obtained from blast cells and burn tissue. RNA concentration was measured with a NanoDrop spectrophotometer (BioTek), and 2 μg RNA was converted to cDNA using PrimeScript TM RT Master Mix (Takara, Shiga, Japan). qRT-PCR was performed on a LightCycler® 96 (Roche, Basel, Switzerland) using 50ng cDNA and 0.5 μM primers. The reaction conditions were as follows: initial denaturation at 95°C for 10 minutes, amplification repeated 40 times at 95°C for 10 seconds and 60°C for 30 seconds, 95°C for 5 seconds, 65°C for 60 seconds, and 95°C for 1 second. During melting curve analysis. The mRNA expression of each gene was normalized to that of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) using the 2 -ΔΔCt method [23]. The mRNA expression level of each patient's BF with or without calpastatin treatment was compared with NF- or DPBS-treated BF and normalized.
그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA에 대해서도 위와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.Other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, quinolinecarboxamide and ATA were also tested in the same manner as above.
쥐 화상 모델에서 모든 화상 조직 (n = 36)의 mRNA 발현 수준을 모든 담체 대조군 (n = 36)의 mRNA 발현 수준과 비교하고 정규화했으며, 담체 평균을 1로 설정했다. 각 샘플은 세 번 분석되었다.In the rat burn model, the mRNA expression levels of all burn tissues (n = 36) were compared and normalized to those of all carrier controls (n = 36), and the carrier mean was set as 1. Each sample was analyzed in triplicate.
8. 웨스턴 블롯 분석8. Western blot analysis
전체 단백질은 섬유 아세포 및 화상 상처로부터 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 gentleMACS® Dissociator (Miltenyi Biotec)를 사용하여 샘플을 균질화함으로써 얻었다. 웨스턴 블롯팅은 종래 기술에 설명한 대로 수행하였다 [24]. 샘플을 4℃에서 30분 동안 계속 교반하면서 배양한 다음 30분 (13000 Х g, 4℃) 동안 원심분리했다. 상층액의 단백질 농도는 Quick StartTM Bradford 단백질 분석 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 측정하였다. 용해물을 5Х 환원 완충액 (경기도 성남시 바이오세상)에 넣고 95℃에서 3분간 가열하여 변성시켰다. 샘플을 겔 전기 영동으로 분리하고, 폴리비닐리덴디플루오라이드 막 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)으로 전기 전달하고 0.1 % Tween-20을 함유하는 Tris 완충 식염수에서 5% (w/v) 탈지유로 25℃에서 1시간 동안 차단했다. 다음과 같은 1차 항체가 사용되었다: 염소 항-칼파인-1 폴리클론 항체 (1:500, Cat. No. sc-7531; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), 마우스 항-칼파인-2 모노클론 항체 (1:2000, Cat. No. NBP2-46063; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), 토끼 항-TGFβ-1 폴리클론 항체 (1:200, cat. no. sc-146, Santa Cruz Biotechnology), 마우스 항-α-SMA 폴리클론 항체 (1:500, Cat. No. ab1817; Abcam, Cambridge, UK), 항-=피브로넥틴 모노클론 항체 (1:2000, Cat. No. ab6328; Abcam), 토끼 항-콜라겐 I 폴리클론 항체 (1:1000, Cat. No. ab34710; Abcam), 항-콜라겐 III 모노클론 항체 (1:2000, Cat. No. ab7778; Abcam), 마우스 항-비멘틴 폴리클론 항체 (1:3000, Cat. No. ab92547; Abcam), 토끼 항-β-액틴 폴리클론 항체 (1:2000, Cat. No. 4967; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 마우스 항-β-액틴 모노클론 항체 (1:1000, Cat. No. SC1616; Santa Cruz Biotechnology). 이차 항체는 호스래디쉬 퍼옥시데이즈-결합 염소 항-토끼 IgG 항체 (1:1000, Cat. No. AP307P; EMD Millipore) 및 호스래디쉬 퍼옥시데이즈-결합 염소 항-마우스 IgG 항체 (1:1000, Cat. No. AP308P; EMD Millipore)를 포함한다. 이미지는 chemiluminescence imaging system (WSE-6100; ATTO, Tokyo, Japan)으로 얻었고, 밴드의 광학 밀도는 CS Analyzer 4 소프트웨어 (ATTO)를 이용하여 얻었다. 단백질 발현은 β-액틴의 값으로 정규화되었다. Total protein was obtained from fibroblasts and burn wounds by homogenizing samples using a gentleMACS® Dissociator (Miltenyi Biotec) in RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) containing protease and phosphatase inhibitors. Western blotting was performed as previously described [24]. Samples were incubated with continuous agitation for 30 minutes at 4°C and then centrifuged for 30 minutes (13000 Х g, 4°C). The protein concentration of the supernatant was measured with the Quick Start ™ Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The lysate was denatured by putting it in 5Х reduction buffer (Biocesang, Seongnam-si, Gyeonggi-do) and heating at 95°C for 3 minutes. Samples were separated by gel electrophoresis, electrotransferred to a polyvinylidenedifluoride membrane (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) and 5% (w/v) skim milk in Tris buffered saline containing 0.1% Tween-20. blocked for 1 hour at 25 °C. The following primary antibodies were used: goat anti-calpain-1 polyclonal antibody (1:500, Cat. No. sc-7531; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), mouse anti-calpain- 2 monoclonal antibody (1:2000, Cat. No. NBP2-46063; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), rabbit anti-TGFβ-1 polyclonal antibody (1:200, cat. no. sc-146, Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-α-SMA polyclonal antibody (1:500, Cat. No. ab1817; Abcam, Cambridge, UK), anti-fibronectin monoclonal antibody (1:2000, Cat. No. ab6328; Abcam ), rabbit anti-collagen I polyclonal antibody (1:1000, Cat. No. ab34710; Abcam), anti-collagen III monoclonal antibody (1:2000, Cat. No. ab7778; Abcam), mouse anti-vimentin Polyclonal antibody (1:3000, Cat. No. ab92547; Abcam), rabbit anti-β-actin polyclonal antibody (1:2000, Cat. No. 4967; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), mouse anti -β-actin monoclonal antibody (1:1000, Cat. No. SC1616; Santa Cruz Biotechnology). Secondary antibodies were horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (1:1000, Cat. No. AP307P; EMD Millipore) and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (1:1000 , Cat. No. AP308P; EMD Millipore). Images were obtained with a chemiluminescence imaging system (WSE-6100; ATTO, Tokyo, Japan), and optical densities of bands were obtained using CS Analyzer 4 software (ATTO). Protein expression was normalized to that of β-actin.
그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA에 대해서도 위와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.Other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, quinolinecarboxamide and ATA were also tested in the same manner as above.
칼파스타틴 처리 유무에 관계없이 각 환자에 대해 BF의 단백질 수준을 NF 또는 DPBS 처리 BF와 비교하고 정규화했다. 쥐 화상 모델에서 모든 화상 조직 (n = 36)의 단백질 수준을 모든 담체 대조군 (n = 36)의 단백질 수준과 비교하고 정규화했으며, 담체 대조군 평균을 1로 지정했다. 각 샘플은 세 번 분석했다.For each patient with or without calpastatin treatment, protein levels in BF were compared and normalized to NF- or DPBS-treated BF. In the murine burn model, protein levels in all burn tissues (n = 36) were compared and normalized to protein levels in all carrier controls (n = 36), and the carrier control average was designated as 1. Each sample was analyzed in triplicate.
9. 조직학적 평가9. Histological evaluation
화상 손상 후 28일째에 마취하에 CO2 가스를 흡입하도록 하여 마우스를 희생시켰다. 피부 밑 근육층 (panniculus carnosus muscle layer)을 포함한 화상 조직을 조심스럽게 절제하고 즉시 4% 중성 완충 포르말린에서 고정하고 25℃에서 밤새 배양했다. 그 후, 조직을 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 에탄올에서 연속적으로 탈수하고 벤젠으로 제거하고 파라핀 블록에 매립했다. 파라핀화된 조직 블록을 5μm 두께의 절편으로 자르고 실란 코팅 슬라이드 (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan)에 올려놓았다. 각 샘플에서 3 개의 절편이 무작위로 선택되었다. 절편은 제조업체의 지침에 따라 왁스 제거, 재수화하고, Masson 's trichrome (Abcam)으로 염색하였다. 절편을 탈수하고 장착하고 커버 슬립으로 덮었다. 절편의 이미지는 10× 및 20× 배율에서 광학 현미경 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)으로 획득했다. 표피 및 진피 두께는 ImageJ 1.53a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij)를 사용하여 각 절편에서 표피와 진피의 가장 높은 너비와 가장 낮은 너비를 측정하고 그런 다음 평균값을 계산한다. 칼파스타틴 처리 마우스의 화상 상처의 표피 두께와 진피 두께를 담체 처리 마우스와 비교하여 정규화하였으며, 담체 처리군 평균은 값 1로 지정하였다. 담체 및 칼파스타틴 처리 마우스의 동일한 수의 조직 절편을 사용하여 표피 두께 및 진피 두께를 측정했다 [108 절편 (각 군의 36마리 마우스에서 각각 3개의 절편을 얻음)].Mice were sacrificed on
10. 통계 분석10. Statistical Analysis
SPSS Statistics ver. 24.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)이 통계 분석에 사용되었다. 결과는 평균 ± 표준편차로 표시된다. 샘플 번호 (n)는 각 실험에서 독립적인 생물학적 샘플의 수를 나타낸다. 각 샘플은 3중으로 분석되었다. 비교는 Student's t- test 및 일원 분산 분석을 사용한 후 Tukey의 사후 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었으며, p <0.05 또는 p <0.01은 통계적 유의성을 나타낸다. 실험 마우스는 컴퓨터화 된 프로그램 Stata v9.0 (StataCorp LLC, College Station, TX, USA)을 사용하여 담체 또는 칼파스타틴을 투여하도록 무작위로 할당되었다.SPSS Statistics ver. 24.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) was used for statistical analysis. Results are expressed as mean ± standard deviation. Sample number (n) represents the number of independent biological samples in each experiment. Each sample was analyzed in triplicate. Comparisons were performed using Student's t-test and one-way analysis of variance followed by Tukey's post hoc multiple comparison test, p < 0.05 or p < 0.01 indicates statistical significance. Experimental mice were randomly assigned to receive either carrier or calpastatin using the computerized program Stata v9.0 (StataCorp LLC, College Station, TX, USA).
결과 1: 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 활성과 발현은 증가한다.Result 1: The activity and expression of calpain are increased in burn tissue fibroblasts of burn patients.
칼파인이 상처 치유에 관여하는 것으로 생각되기 때문에, 우리는 화상 환자에서 얻은 화상 조직 섬유아세포 (BF)와 정상 조직 섬유아세포 (NF)에서 칼파인의 활성과 발현을 확인했다. NF는 중간층 피부 자가이식 (split-thickness skin autografting)에 사용된, 화상을 입지 않은 피부 조직에서 유래하였다. 칼파인 활성은 NF보다 BF에서 현저하게 높았다 (2.53 ± 0.18배, p <0.01, NF n = 34, BF n = 34; 도 1a). 칼파인 활성은 주로 칼파인-1 및 칼파인-2에 의해 구동되므로 mRNA 및 단백질 발현 수준은 도 1b-e에 표시된 것처럼 각각 정량적 역전사-중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 및 웨스턴 블롯팅에 의해 추정되었다. BF는 NF에 비해 이들 단백질의 mRNA 및 단백질 발현이 유의하게 더 높았다 (칼파인-1 mRNA : 4.30 ± 0.41, 단백질: BF 대 NF에서 1.46 ± 0.07; 칼파인-2 mRNA : 3.9 ± 0.70, 단백질 : 1.54 ± 0.07); p <0.05; NF n = 34, BF n = 34; 도 1b-e). 각 실험은 세 번씩 수행하였다.Since calpain is thought to be involved in wound healing, we checked the activity and expression of calpain in burn tissue fibroblasts (BF) and normal tissue fibroblasts (NF) obtained from burn patients. NF was derived from unburned skin tissue used for split-thickness skin autografting. Calpain activity was significantly higher in BF than in NF (2.53 ± 0.18-fold, p < 0.01, NF n = 34, BF n = 34; Fig. 1a). As calpain activity is mainly driven by calpain-1 and calpain-2, mRNA and protein expression levels were measured by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR) and western blotting, respectively, as shown in Figure 1b–e. It was estimated. BF had significantly higher mRNA and protein expression of these proteins compared to NF (calpain-1 mRNA: 4.30 ± 0.41, protein: 1.46 ± 0.07 in BF vs NF; calpain-2 mRNA: 3.9 ± 0.70, protein: 1.54 ± 0.07); p < 0.05; NF n = 34, BF n = 34; Fig. 1b-e). Each experiment was performed in triplicate.
결과 2: 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 섬유증 마커의 발현은 전사 및 번역 수준 모두에서 증가한다.Result 2: Expression of fibrosis markers in burn tissue fibroblasts from burn patients is increased at both transcriptional and translational levels.
3도 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 섬유증 마커의 발현 프로파일을 조사하기 위해 TGF-β1 (TGB1), α-평활근 액틴 (α-SMA) (ACTA2), 피브로넥틴 (FN1), 콜라겐 I (COL1A1), 콜라겐 III (COL3A1) 및 비멘틴 (VIM)의 전사 수준 및 번역 수준을 각각 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다. 도 2a, c, e, g, i 및 k는 모든 화상 후 비후성 반흔 환자에서 TGF-β1, α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 III 및 비멘틴의 mRNA 발현이 화상 조직 섬유아세포에서 정상 조직 섬유아세포보다 현저히 높음을 보여준다 (각각 2.56 ± 0.32, 4.98 ± 0.98, 2.46 ± 0.21, 3.11 ± 0.36, 1.72 ± 0.21 및 2.05 ± 0.12배; p < 0.01; NF n = 34, BF n = 34). 도 2b-1은 TGF-β1, α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 III 및 비멘틴의 단백질 발현이 화상 조직 섬유아세포에서 정상 조직 섬유아세포보다 현저히 높음을 보여준다 (각각 1.89 ± 0.21, 3.36 ± 0.95, 3.13 ± 0.98, 3.38 ± 0.58, 3.12 ± 0.57 및 2.12 ± 0.13배; p < 0.01; NF n = 34, BF n = 34). 각 실험은 세 번씩 수행하였다.TGF-β1 ( TGB1 ), α-smooth muscle actin (α-SMA) ( ACTA2 ), fibronectin ( FN1 ), collagen I ( COL1A1 ), The transcriptional and translational levels of collagen III ( COL3A1 ) and vimentin ( VIM ) were measured by qRT-PCR and Western blotting, respectively. 2a, c, e, g, i and k show that the mRNA expression of TGF-β1, α-SMA, fibronectin, collagen I, collagen III and vimentin in burn tissue fibroblasts and normal tissue fibers in all post-burn patients with hypertrophic scars. significantly higher than blast cells (2.56 ± 0.32, 4.98 ± 0.98, 2.46 ± 0.21, 3.11 ± 0.36, 1.72 ± 0.21 and 2.05 ± 0.12 fold, respectively; p <0.01; NF n = 34, BF n = 34). 2B-1 shows that the protein expressions of TGF-β1, α-SMA, fibronectin, collagen I, collagen III, and vimentin were significantly higher in burned tissue fibroblasts than in normal tissue fibroblasts (1.89 ± 0.21, 3.36 ± 0.95, respectively). , 3.13 ± 0.98, 3.38 ± 0.58, 3.12 ± 0.57 and 2.12 ± 0.13 fold; p <0.01; NF n = 34, BF n = 34). Each experiment was performed in triplicate.
결과 3: 칼파스타틴은 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포 증식을 감소시킨다.Result 3: Calpastatin reduces burn tissue fibroblast proliferation in burn patients.
칼파인 억제제인 칼파스타틴이 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포의 증식에 미치는 효과를 조사했다. 첫째, 환자 BF 및 NF의 증식은 배양 48시간 후 비색 분석을 수행하여 평가되었으며 (도 3a 및 b), BF의 증식이 상당히 더 높은 증가 (1.51 ± 0.11 배, p <0.01)를 나타냈다. 그 후, 칼파스타틴의 효과는 도 3a 및 b와 같이 각각의 담체 대조군과 함께 다양한 농도의 일차 섬유아세포에 공급하고 증식의 차이를 정량화함으로써 추정되었다. 0.1 μM 또는 1 μM 칼파스타틴에 48시간 동안 노출된 화상 조직 섬유아세포는 DPBS 단독으로 처리한 것과 비교하여 증식에 유의한 변화가 없었다 (0.1 μM 및 1μM: 각각 0.97 ± 0.04 배 및 0.95 ± 0.05 배; p> 0.05). 10 μM 칼파스타틴으로 처리한 화상 조직 섬유아세포는 DPBS만 처리한 BF에 비해 BF의 증식을 유의하게 억제했다 (0.75 ± 0.06 배, p <0.01); 그러나, 10 μM 칼파스타틴으로 처리한 화상 조직 섬유아세포의 증식은 정상 조직 섬유아세포보다 높게 유지되었다 (1.13 ± 0.12 배, p <0.01). 각 세포군 (군당 n = 34)에 대한 실험은 세 번씩 수행되었다.The effect of calpastatin, a calpain inhibitor, on the proliferation of burn tissue fibroblasts in burn patients was investigated. First, the proliferation of patient BF and NF was evaluated by performing a colorimetric assay after 48 h of culture (Figure 3a and b), revealing a significantly higher increase in the proliferation of BF (1.51 ± 0.11 fold, p < 0.01). Then, the effect of calpastatin was estimated by supplying primary fibroblasts at various concentrations together with respective carrier controls and quantifying differences in proliferation, as shown in FIGS. 3A and B. Burn tissue fibroblasts exposed to 0.1 μM or 1 μM calpastatin for 48 h had no significant change in proliferation compared to those treated with DPBS alone (0.1 μM and 1 μM: 0.97 ± 0.04-fold and 0.95 ± 0.05-fold, respectively; p > 0.05). Burn tissue fibroblasts treated with 10 μM calpastatin significantly inhibited the proliferation of BF compared to DPBS-only treated BF (0.75 ± 0.06 fold, p < 0.01); However, the proliferation of burn tissue fibroblasts treated with 10 μM calpastatin remained higher than that of normal tissue fibroblasts (1.13 ± 0.12 fold, p < 0.01). Experiments for each cell group (n = 34 per group) were performed in triplicate.
그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA의 경우 임상적으로 사용 가능한 유효 농도 100μM 이하의 인 비트로 농도에서 화상 환자의 화상부위 섬유아세포 증식을 유의하게 감소시키지 못했다 (P > 0.05 vs. DPBS 처리 BFs, 각 군별 n = 34).In the case of other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, Quinolinecarboxamide and ATA, clinically usable effective concentrations of 100 μM or less In vitro concentrations did not significantly reduce the proliferation of fibroblasts in the burned area of burn patients (P > 0.05 vs. DPBS-treated BFs, n = 34 for each group).
결과 4: 칼파스타틴은 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 활성과 발현을 억제한다.Result 4: Calpastatin inhibits the activity and expression of calpain in burn tissue fibroblasts of burn patients.
칼파스타틴이 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 활성과 발현에 직접적인 영향을 미치는지 여부를 조사했다. 화상 조직 섬유아세포를 칼파스타틴으로 처리한 후 칼파인 활성을 평가했다. 도 4a에서 볼 수 있듯이, 10 μM 칼파스타틴으로 처리한 화상 조직 섬유아세포에서는 DPBS 처리한 화상 조직 섬유아세포와 비교하여 칼파인 활성이 크게 감소했다 (0.69 ± 0.05 배, p <0.01). 0.1 μM 또는 1 μM 칼파스타틴 처리는 유의한 억제 효과를 나타내지 않았다 (0.1 μM: 0.98 ± 0.04 배 및 1 μM: 0.96 ± 0.06 배, p> 0.05). 칼파인의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 대한 칼파스타틴의 효과를 측정하였다 (도 4b-e). 10 μM 칼파스타틴으로 48시간 동안 처리한 화상 조직 섬유아세포에서는 DPBS 처리한 화상 조직 섬유아세포와 비교하여 칼파인-1 및 칼파인-2 mRNA 및 단백질 발현 수준이 현저히 낮았다 (칼파인-1 mRNA: 0.51 ± 0.09, 단백질: 0.63 ± 0.11; 칼파인-2 mRNA: 0.61 ± 0.05, 단백질: 0.67 ± 0.09배; p < 0.05).We investigated whether calpastatin directly affects the activity and expression of calpain in burn tissue fibroblasts from burn patients. Calpain activity was evaluated after treatment of burn tissue fibroblasts with calpastatin. As shown in FIG. 4a , calpain activity was significantly reduced in burnt tissue fibroblasts treated with 10 μM calpastatin compared to burnt tissue fibroblasts treated with DPBS (0.69 ± 0.05 fold, p <0.01). Treatment with 0.1 μM or 1 μM calpastatin did not show a significant inhibitory effect (0.1 μM: 0.98 ± 0.04 fold and 1 μM: 0.96 ± 0.06 fold, p > 0.05). The effect of calpastatin on mRNA and protein expression levels of calpain was measured (FIG. 4b-e). In burnt tissue fibroblasts treated with 10 μM calpastatin for 48 hours, compared to DPBS-treated burnt tissue fibroblasts, expression levels of calpain-1 and calpain-2 mRNA and protein were significantly lower (calpain-1 mRNA: 0.51 ± 0.09, protein: 0.63 ± 0.11; calpain-2 mRNA: 0.61 ± 0.05, protein: 0.67 ± 0.09 fold; p < 0.05).
그밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA의 경우 임상적으로 사용 가능한 유효 농도 100μM 이하의 인 비트로 농도에서 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포 내 칼파인의 발현과 활성을 유의하게 감소시키지 못했다 (P > 0.05 vs. DPBS 처리 BFs, 각 군별 n = 34).In the case of other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, Quinolinecarboxamide and ATA, phosphorus at an effective concentration less than 100μM clinically usable In vitro concentrations did not significantly reduce the expression and activity of calpain in burn tissue fibroblasts from burn patients (P > 0.05 vs. DPBS-treated BFs, n = 34 for each group).
이러한 결과는 칼파스타틴이 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 발현과 활성을 억제함을 나타낸다. 각 세포군 (군당 n = 34)에 대한 실험은 세 번씩 수행하였다.These results indicate that calpastatin inhibits the expression and activity of calpain in burn tissue fibroblasts. Experiments for each cell group (n = 34 per group) were performed in triplicate.
결과 5: 칼파스타틴은 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 섬유증 마커의 발현을 억제한다.Result 5: Calpastatin suppresses expression of fibrosis markers in burn tissue fibroblasts of burn patients.
칼파스타틴이 칼파인 활성에 영향을 미치는 것으로 입증되었으므로 다음으로 화상 후 비후성 반흔이 생긴 모든 환자 (n = 34)에서 유래한 칼파스타틴 처리 BF와 담체 대조군 처리 BF에서의 TGF-β1, α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 III 및 비멘틴의 mRNA와 단백질 발현을 분석하여 섬유증 마커에 미치는 영향을 조사했다. 10 μM 칼파스타틴으로 48시간 동안 처리한 화상 조직 섬유아세포에서는 DPBS 처리한 화상 조직 섬유아세포와 비교하여 TGF-β1, α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 III 및 비멘틴의 mRNA와 단백질 발현이 현저히 낮아졌다: TGF-β1 (각각 0.38 ± 0.15 및 0.51 ± 0.16배; p < 0.01) (도 5a, 5b), α-SMA (각각 0.45 ± 0.08 및 0.61 ± 0.09배; p < 0.01) (도 5c, 5d), 피브로넥틴 (각각 0.42 ± 0.10 및 0.45 ± 0.11배; p < 0.01) (도 5e, 5f), 콜라겐 I (각각 0.29 ± 0.12 및 0.51 ± 0.09배; p < 0.01) (도 5g, 5h), 콜라겐 III (각각 0.33 ± 0.11 및 0.43 ± 0.08배; p < 0.01) (도 5i, 5j) 및 비멘틴 (각각 0.44 ± 0.11 및 0.67 ± 0.09배; p < 0.01) (도 5k, 5l). 그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA의 경우 임상적으로 사용 가능한 유효 농도 100μM 이하의 인 비트로 농도에서 화상 환자의 화상부위 섬유아세포 내 비후성 반흔 마커들의 발현을 유의하게 감소시키지 못했다 (P > 0.05 vs. DPBS 처리 BFs, 각 군별 n = 34). 각 세포군 (군당 n = 34)에 대한 실험은 세 번씩 수행하였다.Since calpastatin has been demonstrated to affect calpain activity, TGF-β1, α-SMA, The mRNA and protein expressions of fibronectin, collagen I, collagen III, and vimentin were analyzed to investigate their effects on fibrosis markers. In burnt tissue fibroblasts treated with 10 μM calpastatin for 48 hours, mRNA and protein expressions of TGF-β1, α-SMA, fibronectin, collagen I, collagen III, and vimentin were significantly higher than DPBS-treated burnt tissue fibroblasts. lowered: TGF-β1 (0.38 ± 0.15 and 0.51 ± 0.16 fold, respectively; p < 0.01) (FIG. 5A, 5B), α-SMA (0.45 ± 0.08 and 0.61 ± 0.09 fold, respectively; p < 0.01) (FIGS. 5C, 5D). ), fibronectin (0.42 ± 0.10 and 0.45 ± 0.11 fold, respectively; p < 0.01) (Fig. 5e, 5f), collagen I (0.29 ± 0.12 and 0.51 ± 0.09 fold, respectively; p < 0.01) (Fig. 5g, 5h), collagen III (0.33 ± 0.11 and 0.43 ± 0.08-fold, respectively; p < 0.01) (Figs. 5i, 5j) and vimentin (0.44 ± 0.11 and 0.67 ± 0.09-fold, respectively; p < 0.01) (Figs. 5k, 5l). In the case of other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, Quinolinecarboxamide and ATA, clinically usable effective concentrations of 100 μM or less In vitro concentrations did not significantly reduce the expression of hypertrophic scar markers in burn patient fibroblasts (P > 0.05 vs. DPBS-treated BFs, n = 34 for each group). Experiments for each cell group (n = 34 per group) were performed in triplicate.
결과 6: 칼파스타틴은 마우스 화상 조직에서 섬유증 마커의 발현을 억제한다.Result 6: Calpastatin inhibits the expression of fibrosis markers in mouse burn tissue.
칼파스타틴의 항 섬유화 효과르 동물 모델 이용해 생체 내에서 확인하기 위하여 마우스 화상 모델을 생성하고 마우스에게 칼파스타틴을 투여하여 도 6과 같이 생체 내 화상 조직 섬유아세포의 섬유증 마커에 미치는 영향을 확인했다. 36마리의 화상 동물 모델에 칼파스타틴 (1.5 ㎍/kg/day)을 28일 동안 매일 복강 내 주사한 결과, 담체 처리 대조군 (n=36)과 비교하여 동물 모델의 화상 조직 내 TGF-β1, α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 III 및 비멘틴의 mRNA와 단백질 발현이 현저히 낮아졌다: TGF-β1 (각각 0.42 ± 0.09 및 0.65 ± 0.07배; p < 0.01) (도 6c, 6d), 피브로넥틴 (각각 0.47 ± 0.09 및 0.69 ± 0.05배; p < 0.01) (도 6e, 6f), 콜라겐 I (각각 0.39 ± 0.09 및 0.66 ± 0.07배; p < 0.01) (도 6g, 6h), 콜라겐 III (각각 0.33 ± 0.11 및 0.52 ± 0.07배; p < 0.01) (도 6i, 6j), 비멘틴 (각각 0.43 ± 0.06 및 0.67 ± 0.07배; p < 0.01) (도 6k, 6l). 그 밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA의 경우 임상적으로 사용 가능한 유효 농도 10mg/kg/day 이하의 인 비보 농도에서 화상 동물모델의 화상조직 내 비후성 반흔 마커들의 발현을 유의하게 감소시키지 못했다 (P> 0.05 vs. 담체 처리 대조군, n = 36 (담체 처리 대조군), n= 36 (각 칼파인 저해제 처리군). 조직 샘플의 수는 각 군별로 36개씩이다. 각 실험은 세 번씩 수행하였다.In order to confirm the anti-fibrotic effect of calpastatin in vivo using an animal model, a mouse burn model was created and calpastatin was administered to the mouse to confirm the effect on fibrosis markers of burn tissue fibroblasts in vivo as shown in FIG. 6 . As a result of daily intraperitoneal injection of calpastatin (1.5 μg/kg/day) for 28 days in 36 burn animal models, TGF-β1, α in the burn tissue of the animal model compared to the carrier-treated control group (n=36) -The mRNA and protein expressions of SMA, fibronectin, collagen I, collagen III and vimentin were significantly lowered: TGF-β1 (0.42 ± 0.09 and 0.65 ± 0.07 fold, respectively; p < 0.01) (Fig. 6c, 6d), fibronectin (respectively 6c, 6d) 0.47 ± 0.09 and 0.69 ± 0.05 fold; p < 0.01) (Fig. 6e, 6f), collagen I (0.39 ± 0.09 and 0.66 ± 0.07 fold, respectively; p < 0.01) (Fig. 6g, 6h), collagen III (0.33 ± 0.33 ± 0.07, respectively) 0.11 and 0.52 ± 0.07 fold; p < 0.01) (Figs. 6i and 6j), vimentin (0.43 ± 0.06 and 0.67 ± 0.07 fold, respectively; p < 0.01) (Figs. 6k and 6l). In the case of other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, Quinolinecarboxamide and ATA, the clinically usable effective concentration is 10mg/kg /day or less in vivo concentration did not significantly reduce the expression of hypertrophic scar markers in burn tissue of burn animal models (P > 0.05 vs. carrier-treated control, n = 36 (carrier-treated control), n = 36 (each Calpain inhibitor treatment group) The number of tissue samples was 36 in each group, and each experiment was performed three times.
결과 7: 칼파스타틴은 마우스에서 화상 후 반흔 형성을 저해한다.Result 7: Calpastatin inhibits scar formation after burns in mice.
화상 상처에 대한 칼파스타틴의 중요성은 칼파인에 의한 화상 후 반흔 형성을 억제할 수 있는지 여부이다. 따라서 칼파스타틴이 화상 후 반흔 형성을 억제하는 역할을 하는지 확인하기 위해 칼파스타틴을 처리한 마우스의 화상 상처와 담체 대조군의 상처를 비교 분석하였다. 도 7a과 같이, 칼파스타틴 처리 마우스의 화상 상처는 화상 후 28일 후 붉고, 불규칙한 두꺼움과 강직성을 나타내는 담체 처리 마우스의 화상 상처보다 시각적으로 덜 붉고, 편평하며, 더 유연했다. Masson의 트리크롬 염색으로 얻은 조직학적 결과에서 28일 동안 칼파스타틴을 투여한 마우스의 화상 상처의 표피와 진피 두께는 담체 처리된 대조군보다 유의하게 감소했다 (각각 0.45 ± 0.10 및 0.42 ± 0.11배; p <0.01; 각 군에서 108 개의 조직 절편 (군당 36 마리 마우스에서 각각 3 개의 절편)) (도 7b-d). 칼파스타틴 처리 마우스와 담체 처리 마우스간에 화상 상처의 표피 두께와 진피 두께 사이에 상대적인 차이는 관찰되지 않았다.The importance of calpastatin for burn wounds is whether it can inhibit scar formation after burns by calpain. Therefore, in order to confirm whether calpastatin plays a role in suppressing scar formation after burns, the burn wounds of calpastatin-treated mice and those of the carrier control group were compared and analyzed. As shown in FIG. 7A , burn wounds of calpastatin-treated mice were visually less red, flat, and more flexible than burn wounds of carrier-treated mice, which displayed redness, irregular thickness and
그밖에 알려진 칼파인 저해제인 류펩틴 (Leupeptin), SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, 퀴놀린카복사마이드 (Quinolinecarboxamide) 및 ATA의 경우 임상적으로 사용 가능한 유효 농도 10mg/kg/day 이하의 인 비보 농도에서 화상 동물모델의 화상 후 반흔 형성을 유의하게 감소시키지 못했다 (P > 0.05 vs. 담체 처리 대조군, n = 36 (담체 처리 대조군), n= 36 (각 칼파인 저해제 처리군).In the case of other known calpain inhibitors such as Leupeptin, SJA-6017, MDL-28170, ALLN, ALLM, AK275, AK295, Quinolinecarboxamide and ATA, the clinically usable effective concentration is 10mg/kg/ Day or less in vivo concentration did not significantly reduce post-burn scar formation in burn animal models (P > 0.05 vs. carrier-treated control group, n = 36 (carrier-treated control group), n = 36 (each calpain inhibitor-treated group) ).
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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctgtacgcag gtgattggtg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cactggggaa tggagcaaaa c 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atcaggacca ccaatgtcat agg 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aaccgacact cctacaagat 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cagaaacaag ttggttggat ac 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cctccctcac tctcaacgac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ctccagaact cgttgccttc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgtagctaa ctggcccatc c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tggaaattcg ttcctttgcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aaagcgaagg attcagcaaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tcaaaagtca ccatccacca 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 catgagaagt atgacaacag cct 23 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 agtccttcca cgataccaaa gt 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cactcccgtg gcttctagtg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gtcttgcagg tggagagtcc 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cagatgtgga tcagcaaaca gga 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gacttagaag catttgcggt gga 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 atcatagtgg aggcactgca gaa 23 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggtcaaagca tgagtcatct gtagg 25 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gacatgttca gctttgtgga cctc 24 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gggaccctta ggccattgtg ta 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gcacagcagt ccaacgtaga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tctccaaatg ggatctctgg 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aaagcgtggc tgccaagaa 19 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 acctgtctcc ggtactcgtt tga 23 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 catggccttc cgtgttccta 20 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tgtcatcata cttggcaggt ttct 24 <110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition containing Calpastatin for preventing or treating hypertrophic scar formation <130> June-Bum_Kim_calpastatin <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 1 gttaaaagtg gagcagcacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 2 gaggtatcgc caggaattgt 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 3 ccgaccgaat gcagaagga 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 4 acagagtatt tgcgctccga a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 5 ccagtccaca gctattcctg 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 6 acaaccacgg atgagctg 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 7 atgttcagct ttgtggacct c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 8 ctgtacgcag gtgattggtg 20 <210> 9 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Claims (10)
A pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns containing calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide, or an active fragment thereof.
상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편은 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포의 증식을 저해하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
The method of claim 1,
The pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns, characterized in that the calpastatin, its active fragment, calpastatin-like polypeptide or its active fragment inhibits the proliferation of burn tissue fibroblasts of a burn patient.
상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편은 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 칼파인의 활성 및 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
The method of claim 1,
The calpastatin, active fragment thereof, calpastatin-like polypeptide or active fragment thereof inhibits the activity and expression of calpain in burn tissue fibroblasts of a burn patient, a pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns, characterized in that .
상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편은 화상 환자의 화상 조직 섬유아세포에서 섬유증 마커의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
The method of claim 1,
The calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide or an active fragment thereof inhibits the expression of a fibrosis marker in burn tissue fibroblasts of a burn patient. A pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns.
상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편은 0.5 내지 5 ㎍/kg/day로 투여하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
The method of claim 1,
A pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns, characterized in that the calpastatin, its active fragment, calpastatin-like polypeptide or its active fragment is administered at 0.5 to 5 μg/kg/day.
상기 조성물은 칼펩틴, PD150606 중 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
The method of claim 1,
The composition is a pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation after burns, characterized in that it further comprises at least one selected from calpeptin and PD150606.
상기 조성물은 화상 상처 발생 후 0 내지 60일에 투여하는 것을 특징으로 하는 비후성 반흔 형성 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
The method of claim 1,
The composition is a pharmaceutical composition for preventing or treating hypertrophic scar formation, characterized in that administered on 0 to 60 days after the occurrence of burn wounds.
A method for preventing hypertrophic scar formation after burns by administering calpastatin, an active fragment thereof, a calpastatin-like polypeptide, or an active fragment thereof after burn wounds in mammals other than humans.
상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편은 0.5 내지 5 ㎍/kg/day로 투여하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성을 예방하는 방법.
The method of claim 8,
The method for preventing hypertrophic scar formation after burns, characterized in that the calpastatin, its active fragment, calpastatin-like polypeptide or its active fragment is administered at 0.5 to 5 μg/kg/day.
상기 칼파스타틴, 이의 활성 단편, 칼파스타틴 유사 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편 투여는 화상 상처 발생 후 0 내지 60일에 투여하는 것을 특징으로 하는 화상 후 비후성 반흔 형성을 예방하는 방법.The method of claim 8,
The method for preventing hypertrophic scar formation after burns, characterized in that the administration of calpastatin, its active fragment, calpastatin-like polypeptide or its active fragment is administered 0 to 60 days after the occurrence of a burn wound.
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