KR20220166788A - 펜내 분석을 위한 방법, 시스템 및 키트 - Google Patents

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필립 제이 엠 엘름스
미첼 소킨
케빈 디 라우터백
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버클리 라잇츠, 인크.
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Abstract

분석의 결과들을 검출하는 방법들, 시스템들 및 키트들이 본원에서 설명된다.　 특히, 본 개시물의 방법들, 시스템들 및 디바이스들은 미세유체 디바이스에서의 분석물의 양을 정량화하기 위해 리포터 분자와 관심 분석물의 확산 레이트들 사이의 차이에 의존한다.　 분석물은 생물학적 마이크로-객체의 분비된 생성물일 수도 있다.

Description

펜내 분석을 위한 방법, 시스템 및 키트
본원에서 개시되는 실시형태들은 일반적으로, 정의된 영역 내에 한정된 마이크로-객체의 양 또는 품질 파라미터를 광학적으로 측정하는 시스템들, 장치들 및 방법들에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 미세유체 디바이스 내의 챔버 (예를 들어, 격리 챔버) 에 한정된 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 정확하게 결정할 수 있는 이미징 시스템들 및 방법들이 요구되고 있다.
일 양태에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 분석물의 양을 결정하는 시스템이 제공된다. 시스템은 이미지 획득 유닛을 포함할 수 있다. 이미지 획득 유닛은 미세유체 디바이스를 고정할 수 있는 미세유체 디바이스 홀더를 포함할 수 있으며, 여기서, 미세유체 디바이스는 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결된 복수의 챔버들을 포함한다. 복수의 챔버들의 각각은 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 수용할 수 있다. 이미지 획득 유닛은 미세유체 디바이스의 복수의 챔버들 및 유동 영역의 하나 이상의 분석 이미지들을 캡쳐하도록 구성된 이미징 엘리먼트를 더 포함할 수 있다. 시스템은 이미지 획득 유닛에 통신가능하게 접속된 이미지 프로세싱 유닛을 더 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛은 각각의 캡쳐된 분석시험 이미지를 수신하고 분석 이미지에 묘사된 각각의 챔버에 대한 관심 영역을 정의하도록 구성된 관심 영역 결정 엔진을 포함할 수 있다. 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며, 및/또는 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛은 각각의 챔버의 관심 영역 내 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성된 스코어링 엔진 (scoring engine) 을 더 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법이 제공된다. 본 방법은 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결된 복수의 챔버들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 스텝을 포함할 수 있다. 이미징 데이터는 분석물 분석시험 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함할 수 있다. 본 방법은 각각의 챔버에 대한 관심 영역을 정의하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며, 및/또는 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 챔버 내의 이미지 영역을 포함할 수 있다. 본 방법은 심지어 스코어들 (예를 들어, 칩에 걸친 챔버들의 상대적 랭킹을 제공하는 스코어들) 을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 스코어는 각각의 챔버에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시한다.
다른 양태에서, 컴퓨터로 하여금 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 이미지 프로세싱 방법을 수행하게 하는 프로그램이 저장되는 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체가 제공된다. 본 방법은 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결된 복수의 챔버들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 단계를 포함할 수 있다. 이미징 데이터는 분석물 분석시험 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함할 수 있다. 본 방법은 각각의 챔버에 대한 관심 영역을 정의하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며, 및/또는 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 챔버 내의 이미지 영역을 포함할 수 있다. 본 방법은 심지어, 각각의 챔버에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공되며, 본 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 그리고, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 분석물을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하며, 그리고, 각각의 가용성 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 복수의 가용성 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 가용성 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들 및/또는 가용성 RMSA 복합체들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 클론주 개발의 방법이 제공되며, 본 방법은, 개개의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버들의 각각으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 더 포함하며, 그리고 복수의 챔버들의 각각은 유동 영역에 유체 연결되며 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 복수의 격리 펜들의 각각으로 도입하는 단계; 각각의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 하여금, 분석물을 대응하는 챔버에 포함된 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 가용성 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 가용성 리포터 분자들의 부분으로 하여금 복수의 각각의 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물의 적어도 일부분에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 챔버들의 각각에서 복수의 가용성 리포터 분자:분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 복수의 각각의 챔버에 대해, 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계로서, 관심 영역은 대응하는 챔버의 적어도 일부분을 포함하며, 그리고 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 적어도 일부분은 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들 및/또는 가용성 RMSA 복합체들의 검출가능한 라벨로부터 방출되는, 상기 신호의 강도를 검출하는 단계; 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 검출된 신호 강도에 기초하여, 복수의 각각의 챔버에 대해, 스코어를 결정하는 단계; 복수의 챔버들 중에서 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각각의 챔버는 그 안에 포함된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자임을 표시하는 스코어를 가지는, 상기 격리 펜들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각각의 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 대응하는 반응 용기에서 클론 개체군을 형성하기 위해 선택된 챔버들의 세트의 각 챔버로부터 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 확장하는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비되는 분석물의 레벨을 결정하여 각각의 클론 개체군에 대한 분비물의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.
여전히, 다른 양태에서, 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 분석물의 분비 레벨들의 평가를 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는, 유동 영역을 가지는 인클로저 및 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스로서, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 그리고 유동 영역 및 챔버는 유체 배지를 포함하도록 구성되는, 상기 미세유체 디바이스; 및 검출가능한 라벨 및 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분을 포함하는 가용성 리포터 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 가용성 리포터 분자는 용액에서 제공된다. 다른 실시형태에서, 가용성 리포터 분자는 건조(예를 들어, 동결건조) 형태로 제공된다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공되며, 그 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 그리고, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 분석물을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하며, 그리고, 각각의 가용성 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 복수의 가용성 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 가용성 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 유동 영역으로 제 3 유체 배지를 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 임의의 가용성 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 제 3 유체 배지를 도입하는 단계; 비결합 리포터 분자들의 적어도 일부가 챔버 밖으로 확산하는 것을 허용하는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들 및/또는 가용성 RMSA 복합체들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 챔버의 스윕되지 않은 영역 내에 있는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비물의 레벨을 평가하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 제1 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계로서, 제1 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자를 포함하고, 각각의 가용성 리포터 분자는 분비된 분석물 및 검출 가능한 라벨에 결합하도록 구성된 결합 성분을 포함하는, 상기 제1 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 관심 영역 내에서 검출 가능한 신호의 강도를 측정하는 단계; 제2 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계로서, 제2 유체 배지는 임의의 가용성 리포터 분자를 포함하지 않는, 상기 제2 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버에 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 갖는 인클로저를 포함하고, 챔버는 유동 영역에 유체적으로 연결되는, 상기 제2 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군이 분석물을 챔버 내의 제1 유체 배지 내로 분비하도록 하는 단계; 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계로서, 제2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자를 포함하고, 각각의 가용성 리포터 분자는 분비된 분석물 및 검출가능한 라벨에 결합하도록 구성된 결합 성분을 포함하는, 상기 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 복수의 가용성 리포터 분자의 일부가 챔버 내로 확산되고 그 안에서 분비된 분석물에 결합하여 복수의 가용성 리포터 분자: 분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성하는 것을 허용하는 단계; 및 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치한 가용성 리포터 분자 및/또는 가용성 RMSA 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역이 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로의 확산 축을 따라서 정렬된 격리 펜의 적어도 일부분을 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역이 챔버의 스윕되지 않은 영역 내에 있는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계로서, 제3 유체 배지는 가용성 리포터 분자 중 어느 것도 포함하지 않는, 상기 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 및 비결합 가용성 리포터 분자의 적어도 일부가 챔버 외부로 확산되도록 하는 단계; 및 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치한 가용성 리포터 분자 및/또는 가용성 RMSA 복합체를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들을 검출하는 것이 챔버 밖으로 확산된 비결합 가용성 리포터 분자들의 양이 챔버 밖으로 확산된 가용성 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 그 방법은 분석물에서 분비물의 레벨을 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 갖는다. 다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 갖는다. 다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 갖는다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체이다.
여러 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체는 생물학적 세포이다.
다양한 실시형태들에서, 가용성 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 가용성 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 가용성 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 임의의 것의 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 가용성 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 가용성 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 가용성 리포터 분자의 검출가능한 라벨은 형광 라벨이고, 여기서 상기 가용성 리포터 분자 및/또는 가용성 RMSA를 검출하는 단계는 관심 영역 내의 가용성 리포터 분자 및/또는 가용성 RMSA 복합체의 형광 라벨로부터 형광 방출을 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 상기 형광 방출을 검출하는 단계는 제2 기간 후에 수행되고; 상기 형광 방출을 검출하는 단계는 제2 기간 동안 2회 이상 수행되고; 또는 상기 형광 방출을 검출하는 단계는 제2 기간 동안 실질적으로 연속적으로 수행된다.
다양한 실시형태에서, 제3 기간 동안, 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 일부를 가용성 리포터 분자의 형광 라벨을 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 제4 기간 동안, 유동 영역이 아닌 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 부분을 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 제4 기간은 챔버 내에 존재하는 임의의 가용성 리포터 분자들 및/또는 가용성 RMSA 복합체들의 형광 라벨을 광표백하기에 충분하다. 다양한 실시형태에서, 상기 제4 기간 동안의 노출하는 단계는 상기 관심 영역 내의 형광 방출을 검출하는 단계 전에 수행된다.
다양한 실시형태에서, 상기 관심 영역 내의 형광 방출을 검출하는 것은 상기 제4 기간 동안 노출하는 것 후 (예를 들어, 광표백되지 않은 형광 라벨을 포함하는 리포터 분자가 상기 챔버 내로 확산된 후) 약 5초 내지 약 20초 후에 발생한다.
다양한 실시형태들에서, 그 방법은 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 여기서, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입한 후, 그리고 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생한다.
다양한 실시형태들에서, 배양 배지는 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 2 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 기간은 약 30 분 내지 약 60 분이다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들 및/또는 가용성 RMSA 복합체들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들 및/또는 가용성 RMSA 복합체들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 가용성 포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화된다.
다양한 실시형태에서, 방법은 챔버에 대한 분비물 스코어를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 분비물 스코어는 실시형태 12 내지 25 중 어느 하나의 방법에 따라(즉, 선택된 실시형태의 인용으로부터) 결정된다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다.
다양한 실시형태에서, 방법은 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들의 챔버들에 대한 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 복수의 챔버 중 하나보다 많은 챔버의 분비물 스코어들을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 방법은 적어도 2개의 챔버들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및 선택된 챔버들의 각각으로부터 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스 밖으로 추가로 배출된다.
다양한 실시형태에서, 선택된 챔버들은 개별적으로 배출된다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 및/또는 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역은 측정에 가장 민감한 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어진다. 다양한 실시형태에서, 방법은 자동화된다.
다양한 실시형태에서, 클론 세포주 개발을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 상술된 방법들 중 임의의 방법을 수행하는 것, 복수의 챔버로부터 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각 챔버는 그 안에 포함된 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자라는 것을 나타내는 스코어를 갖는, 상기 챔버들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계; 대응하는 반응 용기에서 선택된 챔버들 세트의 각 챔버로부터 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 확장하는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비되는 분석물의 레벨을 결정하여, 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비물의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며, 및/또는 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 방법은 자동화된다.
다양한 실시형태들에서, 컴퓨터로 하여금, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 분석물의 양을 결정하는 방법을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체가 제공되며, 상기 방법은 상술된 방법들 중 임의의 방법이다.
다양한 실시형태들에서, 컴퓨터로 하여금, 클론주 개발을 위한 방법 중 적어도 일부분을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체가 제공되며, 상기 방법은 상기 청구항들의 임의의 청구항의 방법이며, 상기 시스템은 선택된 챔버들의 세트의 각각의 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계를 포함하여 배출하는 단계까지, 적어도 위의 단계들을 수행한다.
다양한 실시형태들에 따르면, 복수의 생물학적 마이크로-객체들에 걸친, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군들에 걸친 분석물의 분비물의 상대적 레벨을 평가하는 방법이 제공되며, 본 방법은, 복수의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 복수의 챔버들의 각 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 그리고, 복수의 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 도입하는 단계; 복수의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 가용성 분석물을 복수의 챔버 내의 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하며, 그리고, 각각의 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 복수의 가용성 리포터 분자들의 부분으로 하여금 복수의 챔버 내로 확산하게 하여 그 안에 분비된 가용성 분석물에 결합하게 하여, 복수의 가용성 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들 및/또는 가용성 RMSA 복합체들을 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 복수의 챔버의 각각의 챔버는 유동 영역에서 제2 유체 배지의 2차 유동으로부터 격리된 격리 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 복수의 챔버의 각각의 챔버는 유동 영역에서 제2 유체 배지의 직접 유동으로부터 격리된 연결 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 복수의 생물학적 마이크로-객체 중 개개의 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버 중 개개의 챔버에 배치된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 가용성 리포터 분자의 농도는 분석물에 대한 가용성 리포터 분자의 KD 의 약 1-10 배이다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 흐름 영역 내의 제2 유체 배지는 약 0.1-10초의 리프레시 레이트 (refresh rate) 로 리프레시되고, 리프레시 레이트는 유동 영역 내의 유체의 전체 체적을 교체하는 시간의 지속기간이다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 복수의 리포터 분자의 일부가 복수의 챔버 내로 확산되도록 하는 단계는 복수의 리포터 분자가 유동 영역 및 복수의 챔버에 걸쳐 평형 상태를 달성하도록 하는 것을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 평형 상태는 제2 유체 배지의 도입으로부터 3시간 이내에 달성된다.
다양한 실시형태에서, 복수의 챔버 각각에 대한 분비물의 레벨 또는 분비물 스코어를 획득하는 단계; 및 획득된 분비물 스코어에 기초하여 복수의 챔버의 순위를 매기는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 복수의 리포터 분자는 각각 상이한 라벨을 갖는 적어도 2개의 상이한 리포터 분자를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 각각의 챔버는 유동 영역에 대한 단일 개구를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 유동 영역은 미세유체 채널을 포함하고 각각의 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 미세유체 채널에 유체적으로 연결하는 연결 영역을 포함하고, 여기서 연결 영역은 미세유체 채널에 대한 근위 개구 및 격리 영역에 대한 원위 개구를 갖는다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 관심 영역은 챔버의 격리 영역 내에 적어도 부분적으로 존재한다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역이 챔버의 후크 (hook) 영역 내에 있는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역이 복수의 생물학적 마이크로-객체 중 생물학적 마이크로-객체가 위치하는 영역에 근접한 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역이 복수의 챔버와 흐름 영역 사이의 확산 축을 따라 (예를 들어, 복수의 챔버의 격리 영역과 미세유체 채널 사이의 확산 축을 따라, 예를 들어 연결 영역에 의해 정의된 확산 축을 따라) 존재하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역이 복수의 챔버와 흐름 영역 사이의 확산 축을 따라 (예를 들어, 복수의 챔버의 격리 영역과 미세 유체 채널 사이의 확산 축을 따라, 또는 연결 영역에 의해 정의된 확산 축을 따라) 존재하지 않는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태들에서, 방법이 제공되며, 여기서 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 및/또는 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 복수의 챔버의 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치한 리포터 분자를 검출하는 것은 리포터 분자의 복수의 챔버 내로의 확산 후에 수행되고 그 안에서 분비된 분석물에 대한 리포터 분자의 결합은 정상 상태 조건에 또는 근처에 있다.
다양한 실시형태에서, 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계로서, 제3 유체 배지는 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 및 비결합 가용성 리포터 분자들의 적어도 일부가 복수의 챔버 외부로 확산되도록 하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 제2 유체 배지로부터의 복수의 가용성 리포터 분자는 제1 복수의 가용성 리포터 분자이고, 복수의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버에 도입하기 전에, 방법은 제4 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계로서, 여기서 제4 유체 배지는 제2 복수의 가용성 리포터 분자를 포함하는, 상기 제4 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 미세유체 디바이스의 이미지를 획득하는 단계; 및 제5 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 제5 유체 배지는 가용성 리포터 분자를 포함하지 않는다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 이미지는 t = 0 에서 획득된 제1 이미지이고, 가용성 리포터 분자를 검출하는 단계는 t = 1에서 제2 이미지를 획득하는 것을 포함하며, 여기서 t = 1에서 유동 영역과 복수의 챔버 사이의 비결합 가용성 리포터 분자의 확산은 정상 상태에 도달했다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제2 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 적어도 일부를 포함하는 관심 영역에서 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양을 결정하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 관심 영역에서 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양은 가용성 RMSA 복합체의 양 변화에 대한 선형 근사화를 생성하는 데 사용되며, 선형 근사화의 슬로프 (slope) 를 사용하여 챔버 간 분비된 분석물의 생산을 비교한다.
다양한 실시형태에서, 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제2 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 후크 (hook) 영역이고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제2 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 후크 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 후크 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양은 챔버들에 걸친 가용성 분비 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제2 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 제1 복수 및 제2 복수의 가용성 리포터 분자가 동일한 라벨을 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 제1 복수 및 제 2 복수의 가용성 리포터 분자는 각각 상이한 라벨을 갖는 2개의 상이한 리포터 분자를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 이미지는 t = 0에서 획득된 제1 이미지이고, 방법은 제3 유체 배지를 유동 영역에 도입하기 전 및 복수의 가용성 리포터 분자의 일부가 복수의 챔버 내로 확산하고 그안에 분비된 가용성 분석물에 결합하도록 허용한 후, 미세유체 디바이스의 제2 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 리포터 분자의 검출은 미세유체 디바이스의 제3 이미지를 획득하는 것을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제3 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 복수의 서브 영역들 각각 내의 가용성 RMSA 복합체의 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 복수의 서브 영역들의 일부에서의 가용성 RMSA 복합체의 양은 챔버 사이의 분비된 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지, 제2 이미지, 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 후크 (hook) 영역이고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제3 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 후크 영역 내의 RMSA 복합체의 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 후크 영역 내의 RMSA 복합체의 양은 챔버들 사이의 분비된 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지, 제2 이미지, 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 제2 이미지는 흐름 영역과 복수의 챔버 사이의 비결합 리포터 분자의 확산이 정상 상태에 도달했는지 여부를 결정하는 데 사용된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 갖는다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 갖는다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 갖는다.
다양한 실시형태들에서, 방법이 제공되며, 여기서 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체이다.
다양한 실시형태에서, 리포터 분자의 결합 성분이 항체 중쇄 H1 도메인에 결합하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 리포터 분자의 결합 성분이 항체 경쇄(예를 들어, 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프)에 결합하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 리포트 분자의 결합 성분이 람다 경쇄(예를 들어, 람다 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프)에 결합하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 리포트 분자의 결합 성분이 카파 경쇄(예를 들어, 카파 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프)에 결합하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 방법이 제공되며, 여기서 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들 각각으로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다.
다양한 실시형태에서,
복수의 챔버 중 적어도 2개의 챔버의 챔버에 대한 분비물의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 복수의 챔버 중 하나보다 많은 챔버의 분비물 스코어들을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스의 복수의 챔버 내로 복수의 생물학적 마이크로-객체를 도입하는 단계가 생물학적 마이크로-객체를 선택하고 선택된 생물학적 마이크로-객체를 복수의 챔버 내로 선택적으로 이동시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 그 선택은 양성 선택인 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 그 선택은 음성 선택인 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 복수의 챔버로부터 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각 챔버는 그 안에 포함된 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자라는 것을 나타내는 스코어를 갖는, 상기 챔버들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계; 대응하는 반응 용기에서 선택된 챔버들 세트의 각 챔버로부터 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 확장하는 단계; 및 선택적으로, 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비되는 분석물의 레벨을 결정하여, 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비물의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는, 클론주 개발의 방법이 제공된다.
여기에 첨부된 청구범위에 추가 방법이 제공된다.
본원에서 개시된 원리들, 및 그의 이점들의 더 완전한 이해를 위해, 첨부 도면들을 함께 인용한, 다음 설명들을 참조한다.
도 1a 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와의 이용을 위한 시스템의 예를 예시한다.
도 1b 및 도 1c 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스를 예시한다.
도 2a 및 도 2b 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 챔버들 (예를 들어, 격리 챔버들) 을 예시한다.
도 2c 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 상세한 챔버를 예시한다.
도 2d 내지 도 2f 는 발명의 일부 다른 실시형태들에 따른 챔버들을 예시한다.
도 2g 는 본 개시의 실시형태에 따른 미세유체 디바이스를 예시한다.
도 2h 는 본 개시의 실시형태에 따른 미세유체 디바이스의 코팅된 표면을 예시한다.
도 3a 는 본 개시의 일부 다른 실시형태들에 따른 상세한 챔버를 예시한다.
도 3b 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와의 이용을 위한 시스템의 특정 예를 예시한다.
도 3c 는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 이미징 디바이스를 예시한다.
도 4a 내지 도 4c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 분석의 그래픽 표현들이다.
도 5a 내지 도 5c 는 본 개시물의 어떤 다른 실시형태들에 따른, 분석의 그래픽 예시들이다.
도 6 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 개략도이다.
도 7a 및 도 7b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 분자들의 계산된 확산 레이트들의 그래픽 표현들이다.
도 8a 및 도 8b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 계산되어 실험적으로 확인된 분자들의 확산 레이트들의 그래픽 표현들이다.
도 9a 및 도 9b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 그래픽 표현이다.
도 10a 및 도 10b 는 본 개시물의 어떤 다른 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 그래픽 표현이다.
도 11a 및 도 11b 는 본 개시물의 또 다른 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 내에서의 확산 특성들의 그래픽 표현이다.
도 12a 내지 도 12c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 챔버 및 생물학적 마이크로-객체로부터의 생성물의 분비의 레벨들을 평가하기 위한 관심 영역 내에서의 확산 특성들의 그래픽 및 사진 표현들이다.
도 13a 및 도 13b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 정규화 전후 미세유체 디바이스의 사진 이미지들을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 내 분석 이미지들 및 그의 관심 영역에 대한 분석 데이터의 그래픽 및 사진 표현들이다.
도 15 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 내 복수의 챔버들에 대한 중간 강도 값들의 오버레이의 그래픽 표현이다.
도 16a 및 도 16b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스 내에 배치된 생물학적 마이크로-객체들에 의한 분석물 분비의 그래픽 표현들이다.
도 17 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 챔버들에 존재하는 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 18 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 계산하기 위해 수행되는 스텝들의 시퀀스를 예시한다.
도 19 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 세포들의 클론 개체군에 의해 분비되는 분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 평가하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 20 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따라서 발생된 적정 곡선의 그래픽 표현이다.
도 21 은 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 펜 식별 및 분석 스코어들을 포함하는 미세유체 디바이스의 부분의 정규화된 분석 이미지의 사진 표현이다.
도 22 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 배양 및 분석 시퀀스의 진행의 사진 및 그래픽 표현이다.
도 23a 및 도 23b 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 모든 챔버들에 대한 분석 값들의 그래픽 표현이다.
도 24 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 미세유체 디바이스의 선택된 챔버들에서의 클론 개체군들 및 개별 스케일 업된 클론 개체군에 대한 분석 값들 사이의 상관 관계의 그래픽 표현이다.
도 25 는 다양한 실시형태들에 따른, 컴퓨터 시스템을 예시하는 블록도이다.
도 26 은 다양한 실시형태들에 따른, 분석물의 양을 평가하는 시스템의 개략도이다.
도 27 은 다양한 실시형태들에 따른, 분석물의 양을 평가하는 시스템의 개략도이다.
도 28 은 다양한 실시형태들에 따른, 마이크로-유체 디바이스의 챔버의 단면도이다.
도 29 및 도 30 은 다양한 실시형태들에 따른, 분석물의 양을 결정하는 방법을 나타내는 예시적인 플로우차트들이다.
도 31은 다양한 실시형태에 따른, 시간과 형광 사이의 관계를 도시하는 예시적인 그래프이다.
도 32는 다양한 실시형태들에 따른 광표백을 갖는 챔버들을 도시한다.
도 33a 내지 도 33c 는 다양한 실시형태에 따른, 소분자 분석물에 대한 예시적인 세포주 개발 분석을 예시한다.
도 34 은 다양한 실시형태들에 따른, 분석물의 양을 평가하는 시스템의 개략도이다.
도 35 은 다양한 실시형태들에 따른, 마이크로-유체 디바이스의 챔버의 단면도이다.
도 36 은 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따른, 챔버들에 존재하는 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 37 은 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따른, 챔버들에 존재하는 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 38 은 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따른, 챔버들에 존재하는 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 39 은 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따른, 복수의 챔버들에 존재하는 복수의 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비되는 분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 스텝들을 예시한다.
도 40a 내지 도 40g 는 미세유체 디바이스의 후크 영역에서 RMSA 복합체로부터 신호를 측정하기 위한 개선 사항을 평가하기 위해 수행된 시뮬레이션 실험의 양태들을 예시한다.
도 41a 내지 도 41b 는 플러시 분석을 평형 분석을 비교하는 예시적인 데이터를 도시한다.
도 42a 내지 도 42b 는 평형 분석을 위해 취한 평균 이미지로부터 신호의 개선을 나타내는 예시적인 데이터를 예시한다.
도면들은 반드시 축척대로 도시되는 것은 아니며 도면들 내 물체들이 반드시 서로에 대해 축척대로 도시되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 도면들은 본원에서 개시된 장치들, 시스템들, 및 방법들의 다양한 실시형태들에 대한 명료성 및 이해를 주도록 의도된 묘사들이다. 가능한 경우에는 언제나, 동일한 또는 유사한 부재들을 지칭하기 위해서 동일한 참조 번호들이 도면들 전반에 걸쳐서 사용된다. 더욱이, 도면들은 어떤 방법으로든 본 교시들의 범위를 한정하도록 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이 명세서는 본 개시의 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들을 설명한다. 그러나, 본 개시물은, 이들 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들에, 또는 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들이 동작하거나 또는 본원에서 설명되는 방법에 한정되지 않는다. 더욱이, 도면들은 단순화된 또는 부분 도들을 나타낼 수도 있으며, 도면들에서의 엘리먼트들의 치수들은 확대되거나 또는 아니면 비율대로 확대되지 않을 수도 있다. 또한, 용어들 "~ 상에 (on)", "~ 에 부착된 (attached to)", "~ 에 연결된 (connected to)", "~ 에 결합된 (coupled to)" 또는 유사한 단어들이 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나의 엘리먼트가 다른 엘리먼트 바로 위에 있고, 그것에 부착되거나, 그것에 연결되고 또는 그것에 결합되는지, 또는 하나의 엘리먼트와 다른 엘리먼트 사이에 하나 이상의 중간 엘리먼트들이 있는지 여부에 관계 없이, 하나의 엘리먼트 (예를 들어, 재료, 층, 기재 등) 는 다른 엘리먼트 "상에" 있을 수 있고, 그것에 "부착될" 수 있고, 그것에 "연결될" 수 있고, 또는 그것에 "결합될" 수 있다. 또한, 컨텍스트가 다르게 기술하지 않으면, 방향들 (예를 들어, 상방 (above), 하방 (below), 상단 (top), 저부 (bottom), 측면 (side), 상 (up), 하 (down), 아래에 (under), 위에 (over), 상부 (upper), 하부 (lower), 수평, 수직, "x", "y", "z" 등) 은, 제공된다면, 상대적이고, 한정이 아니라, 전적으로 예로서 그리고 예시 및 논의의 용이함을 위해 제공된다. 추가로, 엘리먼트들 (예를 들어, 엘리먼트들 a, b, c) 의 리스트에 대해 언급이 이루어지는 경우, 이러한 언급은 열거된 엘리먼트들 자체, 전부보다 적은 열거된 엘리먼트들의 임의의 조합, 및/또는 열거된 엘리먼트들의 전부의 조합 중의 임의의 하나를 포함하도록 의도된다. 명세서에서의 섹션 분할들은 단지 리뷰의 용이함을 위한 것이고 논의된 엘리먼트들의 임의의 조합을 한정하지 않는다.
미세유체 피쳐들의 치수들은 폭 또는 면적을 갖는 것으로 설명되는 경우, 치수는 일반적으로, 미세유체 디바이스의 기판 및/또는 커버에 평행한 평면 내에 놓인, x-축 및/또는 y-축 치수에 대해 설명된다. 미세유체 피쳐의 높이는 미세유체 디바이스의 기판 및/또는 커버에 평행한 평면에 수직한 z-축 방향에 대해 설명될 수도 있다. 일부의 경우, 채널 또는 통로와 같은, 마이크로유체 피쳐의 단면적은 x-축/z-축, y-축/z-축, 또는 x-축/y-축 영역을 기준으로 할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 (substantially)" 는 의도된 목적을 위해 작동하기에 충분하다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로" 는 따라서, 당업자에 의해 예상될 것이지만, 전체 성능에 인식가능하게 영향을 주지 않는 바와 같은, 절대적인 또는 완전한 상태, 치수, 측정, 결과 등으로부터의 소수의 중요하지 않은 변화들을 허용한다. 수치 값들 또는 수치 값들로서 표현될 수 있는 파라미터들 또는 특징들에 대하여 사용될 때, "실질적으로" 는 10 퍼센트 이내를 의미한다.
용어 "것들 (ones)" 은 하나보다 더 많은 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "복수" 는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "배치된" 은 그 의미 내에 "위치된" 을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "미세유체 디바이스" 또는 "미세유체 장치" 는 유체를 보유하도록 구성된 하나 이상의 별개의 미세유체 회로들을 포함하는 디바이스이고, 각각의 미세유체 회로는, 영역(들), 흐름 경로(들), 채널(들), 챔버(들), 및/또는 펜(들), 및 유체 (및, 옵션으로는, 유체에서 부유된 미세-객체들) 가 미세유체 디바이스의 안 및/또는 밖으로 흐르는 것을 허용하도록 구성된 적어도 하나의 포트를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 유체 상호연결된 회로 엘리먼트들로 구성된다. 통상적으로, 미세유체 디바이스의 미세유체 회로는 흐름 영역을 포함할 것이고, 이 흐름 영역은 미세유체 채널 및 적어도 하나의 챔버를 포함할 수도 있고, 그리고 약 1 mL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 μL 미만의 유체의 볼륨을 보유할 것이다. 소정의 실시형태들에서, 미세유체 회로는 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-8, 2-10, 2-12, 2-15, 2-20, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-50, 10-75, 10-100, 20-100, 20-150, 20-200, 50-200, 50-250, 또는 50-300 μL 를 보유한다. 미세유체 회로는 미세유체 디바이스 내의 제 1 포트 (예를 들어, 인렛) 와 유체 연결된 제 1 단부 및 미세유체 디바이스 내의 제 2 포트 (예를 들어, 아웃렛) 와 유체 연결된 제 2 단부를 갖도록 구성될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "나노유체 디바이스" 또는 "나노유체 장치" 는 약 1 μL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nL 미만, 또는 그 이하의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된 적어도 하나의 회로 엘리먼트를 포함하는 미세유체 회로를 갖는 미세유체 디바이스의 타입이다. 나노유체 디바이스는 복수의 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 그 이상) 을 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부) 은 약 100 pL 내지 1 nL, 100 pL 내지 2 nL, 100 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 2 nL, 250 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 5 nL, 500 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 10 nL, 750 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 20 nL, 1 내지 10 nL, 1 내지 15 nL, 1 내지 20 nL, 1 내지 25 nL, 또는 1 내지 50 nL 의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예컨대, 모두) 은 약 20 nL 내지 200nL, 100 내지 200 nL, 100 내지 300 nL, 100 내지 400 nL, 100 내지 500 nL, 200 내지 300 nL, 200 내지 400 nL, 200 내지 500 nL, 200 내지 600 nL, 200 내지 700 nL, 250 내지 400 nL, 250 내지 500 nL, 250 내지 600 nL, 또는 250 내지 750 nL 의 유체의 체적을 수용하도록 구성된다.
마이크로유체 디바이스 또는 나노유체 디바이스는 본원에서 "마이크로유체 칩" 또는 "칩"; 또는 "나노유체 칩" 또는 "칩"으로 지칭될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같은 "미세유체 채널" 또는 "유동 채널" 은 양자의 수평 및 수직 치수들보다 상당히 더 긴 길이를 가지는 미세유체 디바이스의 유동 영역을 지칭한다. 예를 들어, 흐름 채널은 수평 또는 수직 치수 중 어느 하나의 길이의 적어도 5 배, 예를 들어 그 길이의 적어도 10 배, 그 길이의 적어도 25 배, 그 길이의 적어도 100 배, 그 길이의 적어도 200 배, 그 길이의 적어도 500 배, 그 길이의 적어도 1,000 배, 그 길이의 적어도 5,000 배, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 유동 채널의 길이는 그 사이의 임의의 값을 포함하여, 약 100,000 마이크론 내지 약 500,000 마이크론이다. 일부 실시형태들에서, 수평 치수는 약 100 마이크론 내지 약 1000 마이크론 (예컨대, 약 150 마이크론 내지 약 500 마이크론) 이며, 수직 치수는 약 25 마이크론 내지 약 200 마이크론 (예컨대, 약 40 마이크론 내지 약 150 마이크론이다. 흐름 채널은 미세유체 디바이스에서 다양한 상이한 공간 구성들을 가질 수도 있고, 따라서 완벽히 선형 엘리먼트에 제한되지 않는다는 것에 주목한다. 예를 들어, 유동 채널은 다음 구성들: 곡선, 굴곡, 나선, 오름 경사, 내리막 경사, 포크 (예컨대, 다수의 상이한 유동 통로들), 및 이들의 임의의 조합을 가지는 하나 이상의 섹션들일 수도 있거나 또는 포함할 수도 있다. 게다가, 유동 채널은 그의 경로를 따라서 상이한 단면적들을 가질 수도 있으며, 그 내부에 원하는 유체 유동을 제공하기 위해 넓어지거나 수축될 수도 있다. 유동 채널은 밸브들을 포함할 수도 있으며, 밸브들은 마이크로 유체공학의 분야에 공지된 임의의 유형일 수도 있다. 밸브들을 포함하는 미세유체 채널들의 예들은 미국 특허들 제 6,408,878 호 및 제 9,227,200 호에 개시되어 있으며, 이들의 각각은 본원에서 그 전체가 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "장애물" 은 일반적으로 미세유체 디바이스에서의 2 개의 상이한 영역들 또는 회로 엘리먼트들 사이의 타겟 미세-객체들의 이동을 부분적으로 (그러나 완전히는 아님) 방해하기에 충분히 큰 범프 또는 유사한 타입의 구조를 지칭한다. 2개의 상이한 영역들/회로 엘리먼트들은 예를 들어, 마이크로유체 챔버의 연결 영역 및 격리 영역일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수축 (constriction)" 은 일반적으로 마이크로유체 디바이스에서 회로 엘리먼트 (또는 2 개의 회로 엘리먼트들 사이의 인터페이스) 의 폭을 좁히는 것을 지칭한다. 수축은 예를 들어, 본 개시물의 마이크로유체 챔버의 격리 영역과 연결 영역 사이의 인터페이스에 위치될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투명한" 은 가시 광이 통과될 때 가시 광이 광을 실질적으로 바꾸지 않고 통과하는 것을 허용하는 재료를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "명 시야 (brightfield)" 조명 및/또는 이미지는 넓은 스펙트럼 광원으로부터의 미세유체 시야의 백색 광 조명을 지칭하며, 여기서 콘트라스트는 시야 내의 물체에 의한 광의 흡수도에 의해 형성된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "마이크로-객체(micro-object)" 는 일반적으로, 본 개시에 따라 격리 및/또는 조작될 수도 있는 임의의 미세한 객체를 지칭한다. 미세-객체들의 비-한정적 예들은: 미세입자들; 미세비드들 (예를 들어, 폴리스티렌 비드들, Luminex™ 비드들 등); 자기 비드들; 미세로드들; 미세와이어들; 양자 점들 등과 같은 무생물의 미세-객체들; 세포들 등과 같은 생물학적 미세-객체들; 생물학적 세포기관들; 소낭들, 또는 착물들; 합성 소낭들; (예를 들어, 막 표본들로부터 유래된 또는 합성의) 리포솜들; 지질 나노래프트들 등; 또는 무생물의 미세-객체들 및 생물학적 미세-객체들의 조합 (예를 들어, 세포들에 부착된 미세비드들, 리포솜-코팅된 미세-비드들, 리포솜-코팅된 자기 비드들 등) 을 포함한다. 비드들은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착된 모이어티들/분자들, 이를 테면 형광 라벨들, 단백질들, 탄수화물들, 항원들, 소분자 시그널링 모이어티들, 또는 분석에서 사용 가능한 다른 화학적/생물학적 종들을 포함할 수도 있다. 지질 나노래프트들은 예를 들어 Ritchie 등 (2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs", Methods Enzymol., 464:211-231 에 기재되어 있다. 지질 나노라프트들은 예를 들어 Ritchie et al.(2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs", Methods Enzymol., 464:211-231에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 용어 "생물학적 세포"와 상호 교환 가능하게 사용된다. 생물학적 세포의 비 제한적인 예로는 진핵 세포, 식물 세포, 포유 동물 세포, 파충류 세포, 조류 세포, 물고기 세포 등과 같은 동물 세포, 원핵 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 원충 세포 등이 포함된다 근육, 연골, 지방, 피부, 간, 폐, 신경 조직 등과 같은 조직으로부터 해리된 세포, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 대 식세포 등의 면역 세포, 배아 (예를 들어 접합체), 난 모세포, 난자, 정자 세포, 하이 브리 도마, 배양된 세포, 세포주의 세포, 암세포, 감염된 세포, 프랜스펙션된 및/또는 형질 전환된 세포, 리포터 세포, 등을 포함한다. 포유류 세포는 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 말, 염소, 양, 소, 영장류 등일 수 있다.
콜로니에서 번식할 수 있는 모든 살아있는 세포들이 단일의 부모 세포에서 유래한 딸 세포라면, 생물학적 세포들의 콜로니는 "클론 (clonal)"이다. 어떤 실시양태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 단일 부모 세포로부터 10 번 이하의 분열들에 의해 유도된다. 다른 실시양태들에서, 클론 콜로니에서의 모든 딸 세포들은 단일 부모 세포로부터 14 번 이하의 분열들에 의해 유도된다. 다른 실시형태들에서, 클론성 군체에서의 모든 딸 세포들은 17 개를 초과하지 않는 분할들에 의해 단일의 부모 세포로부터 유도된다. [fuzzy][fuzzy][fuzzy]다른 실시형태들에서, 클론성 군체에서의 모든 딸 세포들은 20 개를 초과하지 않는 분할들에 의해 단일의 부모 세포로부터 유도된다. 용어 "클론 세포들" 은 동일한 클론 콜로니의 세포들을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 생물학적 세포들의 "군체" 는 2 개 이상의 세포들 (예컨대, 약 2 내 약 20, 약 4 내지 약 40, 약 6 내지 약 60, 약 8 내지 약 80, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 200, 약 40 내지 약 400, 약 60 내지 약 600, 약 80 내지 약 800, 약 100 내지 약 1000, 또는 1000 개 이상의 세포) 을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포(들)를 유지하는 것" 은 세포들을 생존가능하게 유지하고 및/또는 증식시키는데 필요한 조건들을 제공하는, 유체 및 기체 성분들 양자 모두, 및 옵션으로는 표면을 포함하는 환경을 제공하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포들을 언급할 때 용어 "팽창하는"은 세포 수의 증가를 지칭한다.
유체 배지의 "성분" 은, 용매 분자들, 이온들, 소분자들, 항생물질들, 뉴클레오티드들 및 뉴클레오시드들, 핵산들, 아미노산들, 펩티드들, 단백질들, 설탕들, 탄수화물들, 지질들, 지방산들, 콜레스테롤, 대사물들 등을 포함하는, 배지에 존재하는 임의의 화학적 또는 생물학적 분자이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "캡처 모이어티 (capture moiety)" 는 미세-객체를 위한 인식 부위를 제공하는 화학적 또는 생물학적 종, 기능부, 또는 모티프 (motif) 이다. 선택된 종류의 마이크로-오브젝트들은 원 위치에서 (in situ)-발생된 캡쳐 모이어티를 인식할 수도 있으며, 원 위치에서-발생된 캡쳐 모이어티에 결합하거나 또는 그에 대한 친화력을 가질 수도 있다. 비한정적인 예들은 항원들, 항체들, 및 세포 표면 결합 모티프들을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "유동가능한 폴리머" 는 유체 매질 (예를 들어, 프리-폴리머 용액) 내에서 용해가능하거나 분산가능한 폴리머 모노머 (monomer) 또는 매크로머 (macromer) 이다. 유동성 중합체는 마이크로유체 유동 영역으로 유입되어 그 안의 유체 배지의 다른 성분들과 함께 유동할 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "광개시된 폴리머" 는 광에 대한 노출 시에, 공유결합으로 교차연결 (crosslink) 할 수 있거나, 특정 공유 결합들을 형성할 수 있거나, 강성화된 화학적 모티프 주위의 위치화학 (regiochemistry) 을 변경할 수 있거나, 물리적 상태에 있어서의 변경을 야기시킴으로써, 폴리머 네트워크를 형성하는 이온 쌍들을 형성할 수 있는 폴리머 (또는 폴리머를 생성하기 위하여 이용될 수 있는 모노머 분자) 를 지칭한다.　 일부의 경우, 광개시 중합체는 공유결합으로 가교시키거나, 특정의 공유 결합들을 형성하거나, 경화된 화학적 모티프 주위에서 위치화학을 변경하거나, 또는 물리적 상태에서의 변화를 초래하는 이온 쌍들을 형성할 수 있는 하나 이상의 화학적 모이어티들에 결합된 중합체 세그먼트를 포함할 수도 있다. 일부의 경우, 광개시 중합체는 (예컨대, 중합체의 중합을 통해서) 중합체 네트워크의 형성을 개시하기 위해 광활성가능한 라디칼 개시제를 필요로 할 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "항체" 는 면역글로불린 (immunoglobulin) (Ig) 을 지칭하고, 양자의 다클론성 (polyclonal) 및 단클론성 (monoclonal) 항체들; 영장류화 (예컨대, 인간화); 쥐과 (murine); 생쥐-인간; 생쥐-영장류; 및 키메라 (chimeric) 를 포함하고; 손상되지 않은 분자, (scFv, Fv, Fd, Fab, Fab', 및 F(ab)'2 단편들과 같은) 그 단편, 또는 손상되지 않은 분자들 및/또는 단편들의 멀티머 (multimer) 들 또는 응집체 (aggregate) 들일 수도 있고; 천연적으로 발생할 수도 있거나, 예컨대, 면역법 (immunization), 합성, 또는 유전 공학 (genetic engineering) 에 의해 생성될 수도 있다. 본원에서 이용된 바와 같은 "항체 단편 (antibody fragment)" 은, 항원을 바인딩하고, 일부 실시형태들에서, 예컨대, 갈락토스 잔기 (galactose residue) 들의 편입에 의해 클리어런스 (clearance) 및 업테이크 (uptake) 를 용이하게 하는 구조적 특징부 (structural feature) 들을 나타내기 위하여 유도체화될 수도 있는, 항체로부터 유도되거나 항체에 관련된 단편들을 지칭한다. 이것은 예컨대, F(ab), F(ab)'2, scFv, 경쇄 가변 영역 (VL), 중쇄 가변 영역 (VH), 및 이들의 조합들을 포함한다.
유체 매질을 참조하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "확산시키다 (diffuse)" 및 "확산 (diffusion)" 은 농도 기울기 아래로의 유체 매질의 성분의 열역학적 이동을 지칭한다.
어구 "매질의 흐름" 은 주로 확산 이외의 임의의 메커니즘으로 인한 유체 매질의 벌크 이동을 의미한다. 예를 들어, 매질의 흐름은 지점들 사이의 압력 차이로 인한 유체 매질의 하나의 지점으로부터 다른 지점으로의 이동을 수반할 수 있다. 이러한 흐름은 액체의 연속적인, 펄싱된, 주기적인, 랜덤한, 간헐적인, 또는 왕복 흐름, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 유체 매질이 다른 유체 매질로 흐르는 경우, 매질의 터뷸런스 및 혼합이 초래될 수 있다.
어구 "실질적으로 흐르지 않음" 은, 시간 경과에 따라 평균화되면, 유체 매질로의 또는 유체 매질 내에서의 재료 (예를 들어, 관심 피분석물) 의 성분들의 확산의 레이트보다 더 작은 유체 매질의 흐름의 레이트를 지칭한다. 이러한 재료의 성분들의 확산의 레이트는, 예를 들어 온도, 성분들의 사이즈, 및 성분들과 유체 매질 사이의 상호작용들의 강도에 의존할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "직접 유동"은 미세유체 장치의 유동 영역에서 우세한 유동 방향의 유동을 지칭한다. 대부분의 경우 이 유동은 유입구를 통해 디바이스 내로 이동하고 유출구를 통해 디바이스 밖으로 이동하는 용액의 속도에 의해 결정되는 제어된 속도의 층류이다. 일반적으로 흐름 영역은 유입구와 유출구를 연결하는 채널과 같은 영역이다.　
본 명세서에 사용된 용어 "2차 흐름"은 흐름 영역에 유체적으로 연결된 챔버 영역에서의 유체 흐름을 말하며, 여기서 2차 흐름을 경험하는 챔버 영역의 유체 흐름 속도는 흐름 영역의 흐름 속도의 100% 내지 0.1% 이다.　 특정 실시예에서, 2차 흐름을 겪는 챔버의 영역에서 유체 흐름의 속도는 인접한 흐름 영역에서 흐름 속도의 100% 와 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 사이이다.　다양한 실시형태들에서, 유동 영역은 채널이다.　 특정 실시예에서, 2차 흐름은 격리 펜의 연결 영역에서 발생한다.　　일부 예에서, 2차 흐름은 흐름 영역과 흐름 영역에 대한 챔버의 개구 사이의 접합부에서 챔버 내로 확장되는 흐름 영역으로부터의 유체를 포함한다.　 다른 예에서, 2차 흐름은 흐름 영역에 근접한 챔버 영역에서 생성된 와류를 포함하며, 유체가 챔버의 개구를 지나서 챔버의 개구 내로 확장됨에 따라 흐름 영역에서 유체의 층류가 이러한 와류를 생성하는 책임이 있다. "2차 흐름"을 포함하는 이러한 와류의 존재는 인접한 흐름 영역과 "2차 흐름"이 배치될 수 있는 챔버 (예: 이러한 와류가 형성될 수도 있는 연결 영역을 포함하는 챔버) 사이의 유체 및 용질 교환 속도를 증가시킬 수 있으며, 흐름 영역에서 층류 속도가 증가함에 따라 그 교환 속도가 증가한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "격리 영역"은 미세유체 장치의 흐름 영역(예를 들어, 채널) 내의 유체의 직접 흐름으로부터 및 챔버의 다른 부분에 존재할 수도 있는 2차 흐름으로부터 격리되는 미세유체 장치의 챔버 내의 영역을 의미한다.　일반적으로, 격리 영역에서, 확산에 의한 용질의 이동 속도는 유체 흐름으로 인한 용질의 이동 속도보다 크므로 확산은 가용성 성분이 "격리 영역” 에 들어가거나 나가는 주요 수단이 된다.
마이크로유체 디바이스 내의 상이한 영역들을 참조하여 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "유체적으로 접속된" 은, 상이한 영역들이 유체 배지와 같은 유체로 실질적으로 채워지는 경우, 유체의 단일 바디를 형성하도록 영역들 각각에서의 유체가 접속되는 것을 의미한다. 이것은, 상이한 영역들에서의 유체들 (또는 유체 매질들) 이 반드시 조성이 동일하다는 것을 의미하지 않는다. 대신, 마이크로유체 디바이스의 상이한 유체 연결된 영역들에서의 유체들은 용질들이 그들의 개개의 농도 기울기들 아래로 이동하고 및/또는 유체들이 마이크로유체 디바이스를 통과하여 유동에 따라서 유입하는 상이한 조성들 (예컨대, 단백질들, 탄수화물들, 이온들, 또는 다른 분자들과 같은, 용질들의 상이한 농도들) 을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "흐름 경로" 는 매질의 흐름의 궤적을 정의하고, 그것에 종속되는 하나 이상의 유체 연결된 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널(들), 영역(들), 챔버(들) 등) 을 지칭한다. 흐름 경로는 따라서 미세유체 디바이스의 스윕된 영역의 예이다. 다른 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 비스윕된 영역들) 은 흐름 경로에서의 매질의 흐름에 종속됨 없이 흐름 경로를 포함하는 회로 엘리먼트들과 유체 연결될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "후크 영역"은 내부에 세포가 배치될 가능성이 낮고 흐름 영역 내의 직접 흐름 및/또는 2차 흐름 (예: 유동 영역 내의 직접 층류에 의해 생성된 와류에 의해 생성된 유동) 으로부터 격리되는 미세유체 장치의 관심 영역 또는 서브 영역을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "미세-객체를 격리시키는 것" 은 미세-객체를 미세유체 디바이스 내의 정의된 에어리어에 한정시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "리프레시 레이트"는 유동 영역의 부피를 유속으로 나눈 비율이다. 이 "리프레시 레이트"는 흐름 영역에서 전체 유체 부피를 교체하는 데 걸리는 시간의 양을 나타낸다.
미세유체 (또는 나노유체) 디바이스는 "스윕된" 영역들 및 "스윕되지 않은" 영역들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "스윕된 (swept)" 영역은, 미세유체 회로를 통하여 유체가 흐르고 있을 때 각각이 매질의 흐름을 경험하는, 미세유체 회로의 하나 이상의 유체 상호연결된 회로 엘리먼트들로 구성된다. 스윕된 영역의 회로 엘리먼트들은 예를 들어 영역들, 채널들, 및 챔버들의 전부 또는 부분들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비스윕된 (unswept)" 영역은, 미세유체 회로를 통하여 유체가 흐르고 있을 때 각각이 실질적으로 어떠한 유체의 플럭스도 경험하지 않는, 미세유체 회로의 하나 이상의 유체 상호연결된 회로 엘리먼트로 구성된다. 유체 연결들이 확산을 가능하게 하지만 실질적으로 스윕된 영역과 비스윕된 영역 사이에 어떠한 매질들의 흐름도 없도록 구조화되어 있다면, 비스윕된 영역은 스윕된 영역에 유체 연결될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스는 스윕된 영역과 비스윕된 영역 사이에서 실질적으로 확산 유체 연통만을 가능하게 하면서, 스윕된 영역에서의 매질의 흐름으로부터 비스윕된 영역을 실질적으로 고립시키도록 구조화될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스의 흐름 채널은 스윕 영역의 일 예인 한편, 미세유체 디바이스의 고립 영역(이하에서 더 상세히 설명됨)은 비스윕 영역의 예이다.
특정 생물학적 재료들 (예컨대, 항체들과 같은 단백질들) 을 생성하기 위한 생물학적 미세-물체들 (예컨대, 생물학적 세포들) 의 능력은 이러한 미세유체 디바이스에서 시험될 수 있다. 분석의 특정의 실시형태에서, 관심있는 분석물의 생성을 위해 분석될 생물학적 미세 물체들(예컨대, 세포들)을 포함하는 샘플 재료가 미세유체 디바이스의 스윕 영역으로 로딩될 수 있다. 생물학적 미세 물체들(예컨대, 인간 세포들과 같은 포유류 세포들)의 미세 물체들은 특정 특징들을 위해 선택되고 비스윕 영역들에 배치될 수 있다. 나머지 샘플 재료는 그 후 스윕 영역 밖으로 유동하고 분석 재료가 스윕 영역 안으로 유동할 수 있다. 선택된 생물학적 미세 물체들이 비스윕 영역들에 있기 때문에, 선택된 생물학적 미세 물체들은 나머지 샘플 재료의 유출 또는 분석 재료의 유입에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 선택된 생물학적 미세 물체들은 비스윕 영역으로부터 스윕 영역으로 확산할 수 있는 관심있는 분석물을 생성하도록 허용될 수 있으며, 여기서 관심있는 분석물은 각각이 특정 비스윕 영역과 상관될 수 있는 국부화된 검출가능 반응들을 생성하기 위해 분석 재료와 반응할 수 있다. 검출된 반응과 연관되는 임의의 비스윕된 영역이 비스윕된 영역에서의 생물학적 마이크로-오브젝트들 중 어느 것이, 있다면, 관심 분석물질의 충분한 생산자들인지를 평가하기 위해 분석될 수 있다.
이러한 디바이스를 조작하고 관찰하기 위한 마이크로유체 디바이스 및 시스템. 도 1a 는 생물학적 마이크로-객체들을 유지, 고립, 분석 또는 배양하기 위해 사용될 수 있는 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 예를 예시한다. 마이크로유체 디바이스 (100) 의 사시도는 마이크로유체 디바이스 (100) 안의 부분 뷰를 제공하도록 그 커버 (110) 의 부분 컷-어웨이를 갖고 도시된다. 미세유체 디바이스 (100) 는 일반적으로, 흐름 경로 (106) 를 포함하는 미세유체 회로 (120) 를 포함하고, 이 흐름 경로를 통해 유체 매질 (180) 이 흘러, 옵션으로 하나 이상의 미세-객체들 (미도시) 을 미세유체 회로 (120) 안으로 및/또는 미세유체 회로 (120) 를 통과하여 운반할 수 있다. 단일 미세유체 회로 (120) 가 도 1a 에 예시되지만, 적합한 미세유체 디바이스들은 복수 (예를 들어, 2 또는 3) 의 이러한 미세유체 회로들을 포함할 수 있다. 그것과는 관계없이, 미세유체 디바이스 (100) 는 나노유체 디바이스이도록 구성될 수 있다. 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 미세유체 챔버들 (124, 126, 128, 및 130) 을 포함할 수도 있고, 여기서 각각의 챔버들은 유동 경로 (106) 와 유체 연통하는 하나 이상의 개구들을 가질 수도 있다. 도 1a 의 디바이스의 일부 실시형태들에서, 챔버들은 유동 경로 (106) 와 유체 연통하는 단지 단일의 개구만을 가질 수도 있다. 이하에서 추가로 논의되는 바와 같이, 미세유체 챔버들은, 배지 (180) 가 흐름 경로 (106) 를 통해 흐르고 있을 때에도, 미세유체 디바이스 (100) 와 같은 미세유체 디바이스 내에 마이크로-객체들을 보유하기 위해 최적화되어 있는 다양한 피처들 및 구조들을 포함한다. 그러나, 전술한 것을 시작하기 전에, 마이크로유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 간단한 설명이 제공된다.
일반적으로 도 1a 에 예시된 바와 같이, 마이크로유체 회로 (120) 는 인클로저 (102) 에 의해 정의된다. 인클로저 (102) 는 상이한 구성들로 물리적으로 구조화될 수 있지만, 도 1a 에 도시된 예에서 인클로저 (102) 는 지지 구조 (104)(예를 들어, 베이스), 마이크로유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 를 포함하는 것으로 도시된다. 지지 구조 (104), 마이크로유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 는 서로 부착될 수 있다. 예를 들어, 마이크로유체 회로 구조 (108) 는 지지 구조 (104) 의 내측 면 (109) 상에 배치될 수 있고, 커버 (110) 는 마이크로유체 회로 구조 (108) 위에 배치될 수 있다. 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 와 함께, 마이크로유체 회로 구조 (108) 는 마이크로유체 회로 (120) 의 엘리먼트들을 정의할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 마이크로유체 회로 (120) 의 하단에 있고 커버 (110) 는 상단에 있을 수 있다. 대안으로, 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 는 다른 배향들에서 구성될 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 마이크로유체 회로 (120) 의 상단에 있을 수 있고 커버 (110) 는 하단에 있을 수 있다. 관계없이, 인클로저 (102) 안 또는 밖으로의 통로를 각각 포함하는 하나 이상의 포트들 (107) 이 존재할 수 있다. 통로의 예들은 밸브, 게이트, 관통 홀 (pass-through hole) 등을 포함한다. 예시된 바와 같이, 포트 (107) 는 미세유체 회로 구조 (108) 에 갭으로 생성된 관통 홀이다. 그러나, 포트 (107) 는 커버 (110) 와 같은, 인클로저 (102) 의 다른 컴포넌트들에 놓일 수 있다. 단지 하나의 포트 (107) 가 도 1a 에 예시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 2 개 이상의 포트들 (107) 을 가질 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 (120) 에 들어가는 유체에 대한 인렛으로서 기능하는 제 1 포트 (107) 가 존재할 수 있고, 미세유체 회로 (120) 에서 나가는 유체에 대한 아웃렛으로서 기능하는 제 2 포트 (107) 가 존재할 수 있다. 포트 (107) 가 인렛으로서 기능하는지 또는 아웃렛으로서 기능하는지는 유체가 흐름 경로 (106) 를 통해 흐르는 방향에 의존할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 하나 이상의 전극들 (미도시) 및 기판 또는 복수의 상호연결된 기판들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 하나 이상의 반도체 기판들을 포함할 수 있고, 이 기판들 각각은 전극에 전기적으로 연결된다 (예를 들어, 반도체 기판들의 전부 또는 서브세트는 단일 전극에 전기적으로 연결될 수 있다). 지지 구조 (104) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 ("PCBA") 를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 반도체 기판(들) 은 PCBA 상에 장착될 수 있다.
미세유체 회로 구조 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 회로 엘리먼트들을 정의할 수 있다. 이러한 회로 엘리먼트들은, 미세유체 회로 (120) 가 유체로 채워질 때 유체 상호연결될 수 있는 공간들 또는 영역들, 이를 테면 (하나 이상의 흐름 채널들을 포함하거나 또는 하나 이상의 흐름 채널들일 수도 있는) 흐름 영역들, 챔버들, 펜들, 트랩들 등을 포함할 수 있다. 도 1a 에 예시된 미세유체 회로 (120) 에서, 미세유체 회로 구조 (108) 는 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 를 포함한다. 프레임 (114) 은 미세유체 회로 재료 (116) 를 부분적으로 또는 완전히 인클로징할 수 있다. 프레임 (114) 은, 예를 들어 미세유체 회로 재료 (116) 를 실질적으로 에워싸는 상대적으로 강성 구조일 수 있다. 예를 들어, 프레임 (114) 은 금속 재료를 포함할 수 있다.
미세유체 회로 재료 (116) 는 미세유체 회로 (120) 의 상호연결들 및 회로 엘리먼트들을 정의하도록 캐비티들 등으로 패터닝될 수 있다. 마이크로유체 회로 재료 (116) 는, 기체 투과성일 수 있는 유연성 재료, 예컨대 유연성 폴리머 (예를 들어, 고무, 플라스틱, 엘라스토머, 실리콘, 폴리디메틸실록산 ("PDMS"), 등) 을 포함할 수 있다. 마이크로유체 회로 재료 (116) 를 구성할 수 있는 재료들의 다른 예들은 몰딩된 유리, 실리콘 (예를 들어, 포토-패턴 가능 실리콘 또는 "PPS") 과 같은 식각 가능 재료, 포토-레지스트 (예를 들어, SU8) 등을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 재료들 - 및 이에 따른 마이크로유체 회로 재료 (116) - 은 강성 및/또는 실질적으로 기체에 대해 불투과성일 수 있다. 관계없이, 마이크로유체 회로 재료 (116) 는 지지 구조 (104) 상에 그리고 프레임 (114) 안에 배치될 수 있다.
커버 (110) 는 마이크로유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 의 일체형 부품일 수 있다. 대안으로, 커버 (110) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 구조적으로 별개의 엘리먼트일 수 있다. 커버 (110) 는 마이크로유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 과 동일한 또는 상이한 재료들을 포함할 수 있다. 유사하게, 지지 구조 (104) 는 예시된 바와 같이 프레임 (114) 또는 마이크로유체 회로 재료 (116) 로부터 별개의 구조이거나, 또는 프레임 (114) 또는 마이크로유체 회로 재료 (116) 의 일체형 부품일 수 있다. 마찬가지로, 프레임 (114) 및 마이크로유체 회로 재료 (116) 는 도 1a 에 도시된 바와 같이 별개의 구조들이거나 또는 동일한 구조의 일체형 부분들일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 재료를 포함할 수 있다. 강성 재료는 유리 또는 유사한 속성들을 가진 재료일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 변형가능한 재료를 포함할 수 있다. 변형가능한 재료는 폴리머, 이를 테면 PDMS 일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 및 변형가능한 재료들 양자 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 커버 (110) 의 하나 이상의 부분들 (예를 들어, 챔버들 (124, 126, 128, 130) 위에 포지셔닝된 하나 이상의 부분들) 은 커버 (110) 의 강성 재료들과 인터페이스하는 변형가능한 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버(110)는 하나 이상의 전극들을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 전극들은 유리 또는 유사한 절연 재료 상에 코팅될 수도 있는, 전도성 산화물, 이를 테면 인듐-주석-산화물 (ITO) 을 포함할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 전극들은, 변형가능한 재료, 이를 테면 폴리머 (예를 들어, PDMS) 에 임베딩된, 가요성 전극들, 이를 테면 단일-벽 나노튜브들, 멀티-벽 나노튜브들, 나노와이어들, 전기 전도성 나노입자들의 클러스터들, 또는 이들의 조합들일 수 있다. 미세유체 디바이스들에서 사용될 수 있는 가요성 전극들은, 예를 들어, 미국 2012/0325665 (Chiou 등) 에 기재되어 있고, 그 내용들은 참조로 본 명세서에 통합된다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 세포 부착, 생존능력 및/또는 성장을 지원하도록 (예를 들어, 미세유체 회로 (120) 를 향해 내측으로 대면하는 표면의 전부 또는 일부를 컨디셔닝함으로써) 변경될 수 있다. 이 변경은 합성 또는 천연 폴리머의 코팅을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 커버 (110) 및/또는 지지 구조체 (104) 는 광에 대해 투명할 수 있다. 커버 (110) 는 또한 기체 투과성인 적어도 하나의 재료 (예를 들어, PDMS 또는 PPS) 를 포함할 수도 있다.
도 1a 는 또한, 미세유체 디바이스들, 이를 테면 미세유체 디바이스 (100) 를 동작 및 제어하기 위한 시스템 (150) 을 도시한다. 시스템 (150) 은 전기적 전원 (192), 이미징 디바이스 (194) (이미징 모듈 (164) 내에 편입되고, 여기서, 디바이스 (194) 는 그 자체로 도 1a 에서 예시되지 않음), 및 틸팅 디바이스 (190) (틸팅 모듈 (166) 의 일부, 여기서, 디바이스 (190) 는 도 1a 에서 예시되지 않음) 를 포함한다.
전기 전원 (192) 은, 필요에 따라 바이어싱 전압들 또는 전류들을 제공하는, 마이크로유체 디바이스 (100) 및/또는 틸팅 디바이스 (190) 에 전기 전력을 제공할 수 있다. 전원 (192) 은, 예를 들어, 하나 이상의 교류 (AC) 및/또는 직류 (DC) 전압 또는 전류 소스들을 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) (이하에 논의되는 이미징 모듈 (164) 의 일부) 는 미세유체 회로 (120) 내측의 이미지들을 캡처하기 위한 디바이스, 이를 테면 디지털 카메라를 포함할 수 있다. 일부 인스턴스들에서, 이미징 디바이스는 (194) 는 (예를 들어, 낮은 광 애플리케이션들에 대해) 빠른 프레임 레이트 및/또는 고 감도를 갖는 검출기를 더 포함한다. 이미징 디바이스 (194) 는 또한, 시뮬레이팅 방사선 및/또는 광 빔들을 미세유체 회로 (120) 로 지향시키고 미세유체 회로 (120) (또는 그 안에 포함된 미세-객체들) 로부터 반사 또는 방사된 방사선 및/또는 광 빔들을 수집하기 위한 메커니즘을 포함할 수 있다. 방사된 광 빔들은 가시 스펙트럼에 있을 수도 있고, 예를 들어, 형광 방출들을 포함할 수도 있다. 반사된 광 빔들은 LED 또는 광역 스펙트럼 램프, 이를 테면 수은 램프 (예를 들어, 고 압력 수은 램프) 또는 크세논 아크 램프에서 비롯되는 반사된 방출들을 포함할 수도 있다. 도 3b 에 대하여 논의된 바와 같이, 촬상 디바이스 (194) 는 아이피스를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있는 현미경 (또는 광학 트레인) 을 더 포함할 수도 있다.
시스템 (150) 은 하나 이상의 회전 축들을 중심으로 마이크로유체 디바이스 (100) 를 회전시키도록 구성된 틸팅 디바이스 (190) (이하에 논의되는 틸팅 모듈 (166) 의 부분) 를 더 포함한다. 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는, 마이크로유체 디바이스 (100)(및 이에 따른 마이크로유체 회로 (120)) 가 레벨 배향 (즉, x 및 y 축에 대해 0°), 수직 배향 (즉, x 축 및/또는 y 축에 대해 90°), 또는 그 사이의 임의의 배향에서 홀딩될 수 있도록 적어도 하나의 축을 중심으로 마이크로유체 회로 (120) 를 포함하는 인클로저 (102) 를 지지 및/또는 홀딩하도록 구성된다. 축에 대한 마이크로유체 디바이스 (100)(및 마이크로유체 회로 (120)) 의 배향은 마이크로유체 디바이스 (100)(및 마이크로유체 회로 (120)) 의 "틸트" 로서 본원에서 지칭된다. 예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 디바이스 (100) 를 x 축에 대하여 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.6°, 0.7°, 0.8°, 0.9°, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 90° 또는 그 사이의 임의의 각도로 틸팅할 수 있다. 레벨 배향 (및 따라서 x- 및 y-축들) 은 중력에 의해 정의된 수직 축에 대한 법선으로서 정의된다. 틸팅 디바이스는 또한 x-축 및/또는 y-축에 대해 90°초과의 임의의 각도로 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하거나, 또는 x-축 또는 y-축에 대해 180°로 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하여 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 를 완전히 뒤집을 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 또는 미세유체 회로 (120) 의 일부 다른 부분에 의해 정의된 회전 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅한다.
일부 경우들에서, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 하나 이상의 챔버들 위 또는 아래에 위치되도록 수직 배향으로 틸팅된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~위" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 챔버들보다 더 높이 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 위의 챔버에서의 객체는 흐름 영역/채널에서의 객체보다 더 높은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~아래" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 챔버들보다 더 낮게 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 아래의 챔버에서의 객체는 흐름 경로에서의 객체보다 더 낮은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다.
일부 예에서, 틸트 장치 (190) 는 유로 (106) 에 평행한 축을 중심으로 마이크로유체 디바이스 (100) 를 기울인다. 또한, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 챔버들 바로 위 또는 아래에 위치되지 않고 하나 이상의 챔버들 위 또는 아래에 위치되도록 90°미만의 각도로 틸팅될 수 있다. 다른 경우들에서, 틸팅 디바이스(190)는 흐름 경로(106)에 수직한 축을 중심으로 미세유체 디바이스(100)를 틸팅한다. 또 다른 인스턴스들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 평행하지도 수직이지도 않은 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다.
시스템 (150) 은 매질 소스 (178) 를 더 포함할 수 있다. 매질 소스 (178) (예를 들어, 컨테이너, 저장소 등) 는, 상이한 유체 매질 (180) 을 각각 보유하기 위한, 다수의 섹션들 또는 컨테이너들을 포함할 수 있다. 따라서, 매질 소스 (178) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 디바이스 (100) 밖에 있고 그와는 별개인 디바이스일 수 있다. 대안으로, 배지 공급원 (178) 은 마이크로유체 디바이스 (100) 의 인클로저 (102) 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 예를 들어, 배지 공급원 (178) 은 마이크로유체 디바이스 (100) 의 부분인 저장고들을 포함할 수 있다.
도 1a 는 또한, 시스템 (150) 의 부분을 구성하고 마이크로유체 디바이스 (100) 와 함께 이용될 수 있는 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들의 단순화된 블록도 도시들을 예시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 제어 및 모니터링 장비(152)의 예들은 매질 소스(178)를 제어하기 위한 매질 모듈(160), 미세유체 회로(120) 내의 미세 물체들(미도시) 및/또는 매질(예컨대, 매질의 액적들)의 이동 및/또는 선택을 제어하기 위한 동기 모듈(162), 이미지들(예컨대, 디지털 이미지들)을 캡처하는 이미징 디바이스(194)(예컨대, 카메라, 현미경, 광원 또는 이들의 임의의 조합)를 제어하기 위한 이미징 모듈(164), 및 틸팅 디바이스(190)를 제어하기 위한 틸팅 모듈(166)을 포함하는 마스터 제어기(154)를 포함한다. 제어 장비(152)는 미세유체 디바이스(100)에 대하여 제어, 모니터링, 또는 다른 기능들을 수행하기 위한 다른 모듈들(168)을 또한 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 장비(152)는 디스플레이 디바이스(170) 및 입/출력 디바이스(172)를 더 포함할 수 있다.
마스터 제어기(154)는 제어 모듈(156) 및 디지털 메모리(158)를 포함할 수 있다. 제어 모듈 (156) 은, 예를 들어 메모리 (158) 내에 비-일시적 데이터 또는 신호들로서 저장된 머신 실행가능 명령들 (예를 들어, 소프트웨어, 펌웨어, 소스 코드, 등) 에 따라 동작하도록 구성된 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 제어 모듈 (156) 은 하드웨어 디지털 회로부 및/또는 아날로그 회로부를 포함할 수 있다. 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 유사하게 구성될 수 있다. 따라서, 마이크로유체 디바이스 (100) 또는 임의의 다른 마이크로유체 장치에 대하여 수행되는 것으로서 본원에 설명된 기능들, 프로세스들, 액트들, 액션들, 또는 프로세스의 단계들은 위에서 논의된 바와 같이 구성된 마스터 제어기 (154), 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 중 임의의 하나 이상에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 마스터 제어기 (154), 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 본원에 논의된 임의의 기능, 프로세스, 액트, 액션 또는 단계에서 사용된 데이터를 송신 및 수신하도록 통신 가능하게 커플링될 수도 있다.
배지 모듈 (160) 은 배지 공급원 (178) 을 제어한다. 예를 들어, 배지 모듈 (160) 은 선택된 유체 배지 (180) 를 (예를 들어, 인렛 포트 (107) 를 통해) 인클로저 (102) 안으로 입력하도록 배지 공급원 (178) 을 제어할 수 있다. 또한, 배지 모듈 (160) 은 (예를 들어, 아웃렛 포트 (미도시) 를 통해) 인클로저 (102) 로부터 배지의 제거를 제어할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 배지는 선택적으로 마이크로유체 회로 (120) 안으로 입력되고 이로부터 제거될 수 있다. 또한, 매질 모듈 (160) 은 미세유체 회로 (120) 내측의 흐름 경로 (106) 에서의 유체 매질 (180) 의 흐름을 제어할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 매질 모듈 (160) 은 틸팅 모듈 (166) 이 틸팅 디바이스 (190) 로 하여금 원하는 경사 각도로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅하게 하기 이전에 흐름 경로 (106) 에서의 및 인클로저 (102) 를 통과한 매질 (180) 의 흐름을 정지시킨다.
동기 모듈 (162) 은 미세유체 회로 (120) 에서의 미세-객체들 (미도시) 의 선택, 트랩핑, 및 이동을 제어하도록 구성될 수 있다. 도 1b 및 도 1c 를 참조하여 이하에 논의된 바와 같이, 인클로저 (102) 는 유전영동 (DEP), 광전자 트위저들 (OET) 및/또는 광-전기습윤 (OEW) 구성 (도 1a 에 미도시) 을 포함할 수 있고, 동기 모듈 (162) 은 흐름 경로 (106) 및/또는 챔버들 (124, 126, 128, 130) 에서 배지 (미도시)의 액적 (droplet) 들 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택 및 이동시키도록 전극들 및/또는 트랜지스터들 (예를 들어, 포토트랜지스터들) 의 활성화를 제어할 수 있다.
촬상 모듈 (164) 은 촬상 디바이스 (194) 를 제어할 수 있다. 예를 들어, 이미징 모듈 (164) 은 이미징 디바이스 (194) 로부터 이미지 데이터를 수신 및 프로세싱할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 로부터의 이미지 데이터는 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 임의의 타입의 정보 (예를 들어, 미세-객체들의 존재 또는 부재, 매질의 액적들, 라벨, 이를 테면 형광 라벨의 축적 등) 를 포함할 수 있다. 이미징 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보를 사용하여, 이미징 모듈 (164) 은 객체들 (예를 들어, 미세-객체들, 매질의 액적들) 의 포지션 및/또는 미세유체 디바이스 (100) 내에서의 이러한 객체들의 모션의 레이트를 추가로 계산할 수 있다.
틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 디바이스 (190) 의 틸팅 모션들을 제어할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 속도 및 타이밍을 제어하여, 중력들을 통해 하나 이상의 챔버들로의 마이크로-객체들의 트랜스퍼를 최적화할 수 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 미세유체 회로 (120) 에서 매질의 액적들 및/또는 미세-객체들의 모션을 기술하는 데이터를 수신하도록 이미징 모듈 (164) 과 통신가능하게 커플링된다. 이 데이터를 사용하여, 틸팅 모듈 (166) 은, 미세유체 회로 (120) 에서의 미세-객체들 및/또는 매질의 액적들이 이동하는 레이트를 조정하기 위하여 미세유체 회로 (120) 의 틸트를 조정할 수도 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 또한 이 데이터를 사용하여 미세유체 회로 (120) 에서의 미세-객체 및/또는 매질의 액적의 포지션을 반복적으로 조정할 수도 있다.
도 1a 에 도시된 예들에서, 미세유체 회로 (120) 는 미세유체 채널 (122) 및 챔버들 (124, 126, 128, 130) 을 포함하는 것으로서 예시된다. 각각의 챔버는 채널 (122) 에 대한 개구를 포함하지만, 다르게는 챔버들이 채널 (122) 의 흐름 경로 (106) 내 또는 다른 챔버들 내에 마이크로-객체들을 및/또는 유체 매질 (180) 로부터 펜 안에 마이크로-객체들을 실질적으로 고립시킬 수 있도록 인클로징된다. 챔버의 벽들은 베이스의 내부 표면 (109) 로부터 커버 (110) 의 내측 표면까지 연장되어 인클로저를 제공한다. 미세유체 채널 (122) 로의 챔버의 개구부는 유동 (106) 이 챔버들로 지향되지 않도록, 유체 매질 (180) 의 유동 (106) 에 대한 각도로 배향된다. 그 흐름은 챔버의 개구부의 평면에 접하거나 또는 직교할 수도 있다. 일부 경우들에서, 챔버들 (124, 126, 128, 130) 은 미세유체 회로 (120) 내에 하나 이상의 마이크로-객체들을 물리적으로 몰아넣도록 구성된다. 본 발명에 따른 챔버들은, 이하에서 상세히 논의 및 도시되는 바와 같이, DEP, OET, OEW, 유체 흐름, 및/또는 중력들과의 사용을 위해 최적화되는 다양한 형상들, 표면들 및 피처들을 포함할 수 있다.
미세유체 회로 (120) 는 임의의 수의 미세유체 챔버들을 포함할 수도 있다. 5 개의 챔버들이 도시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 더 적거나 또는 더 많은 챔버들을 가질 수도 있다. 도시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 의 미세유체 챔버들 (124, 126, 128, 및 130) 은 각각 생리학적 미세-객체를 유지, 고립, 검증 또는 배양하는데 있어서 유용한 하나 이상의 이익들을 제공할 수도 있는 상이한 특징들 및 형상들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 동일한 미세유체 챔버들을 포함한다.
도 1a에 도시된 실시형태에서, 단일 채널 (122) 및 흐름 경로 (106) 가 도시되어 있다. 그러나, 다른 실시형태들은 다수의 채널들 (122) 을 포함할 수도 있고, 채널들 각각은 흐름 경로 (106) 를 포함하도록 구성된다. 미세유체 회로 (120) 는 유동 경로 (106) 및 유체 매질 (180) 과 유체 연통하는 인렛 밸브 또는 포트 (107) 를 더 포함하고, 그것에 의하여 유체 매질 (180) 은 인렛 포트 (107) 를 통해 채널 (122) 에 액세스할 수 있다. 일부 인스턴스들에서, 흐름 경로 (106) 는 단일 경로를 포함한다. 일부 인스턴스들에서, 그 단일 경로는 지그재그 패턴으로 배열되고, 그것에 의하여 흐름 경로 (106) 는 교번하는 방향들로 2 회 이상 미세유체 디바이스 (100) 를 가로질러 이동한다. 유동 경로 (106) 내의 유동은 입구에서 출구로 진행할 수도 있거나, 또는 역전되어 출구에서 입구로 진행할 수도 있다.
일부 경우들에서, 마이크로유체 회로 (120) 는 복수의 병렬 채널들 (122) 및 흐름 경로들 (106) 을 포함하며, 여기서 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 배지 (180) 는 동일한 방향으로 흐른다. 일부 인스턴스들에서, 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 매질은 순방향 또는 역방향 중 적어도 하나의 방향으로 흐른다. 일부 경우들에서, 복수의 챔버들은, 챔버들이 타겟 마이크로-객체들과 병렬로 로딩될 수 있도록 (예를 들어, 채널 (122) 에 대해) 구성된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 하나 이상의 미세-객체 트랩들 (132) 을 더 포함한다. 트랩들 (132) 은 일반적으로, 채널 (122) 의 경계를 형성하는 벽에 형성되고, 미세유체 챔버들 (124, 126, 128, 130) 중 하나 이상의 개구부 반대편에 포지셔닝될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 단일 미세-객체를 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 복수의 미세-객체들을 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 인스턴스들에서, 트랩들 (132) 은 단일 타겟 미세-객체의 볼륨과 대략 동일한 볼륨을 포함한다.
트랩들 (132) 은 타겟팅된 미세-객체들의 트랩들 (132) 안으로의 흐름을 돕도록 구성되는 개구부를 더 포함할 수도 있다. 일부 인스턴스들에서, 트랩들 (132) 은 단일 타겟 미세-객체의 치수들과 대략 동일한 높이 및 폭을 갖는 개구부를 포함하고, 그것에 의하여 더 큰 미세-객체들이 미세-객체 트랩 안으로 들어가는 것이 방지된다. 트랩들 (132) 은 트랩 (132) 내에 타겟팅된 미세-객체들의 유지를 돕도록 구성된 다른 피처들을 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 미세유체 채널 (122) 에 평행한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅할 때, 트랩된 마이크로-객체가, 마이크로-객체로 하여금 챔버의 개구 안으로 들어가게 하는 궤적에서 트랩 (132) 을 나가도록, 미세유체 챔버의 개구에 대해 채널 (122) 의 반대 측에 놓이고 이와 정렬된다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 트랩 (132) 을 통한 흐름을 용이하게 하고 이에 의해 트랩 (132) 에서 마이크로-객체를 캡처하는 가능성을 증가시키기 위해 타겟 마이크로-객체보다 더 작은 사이드 통로 (134) 를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유전영동 (DEP) 힘들이 하나 이상의 전극들 (미도시) 을 통해 (예를 들어, 흐름 경로에서 및/또는 챔버들에서) 유체 배지 (180) 를 가로질러 인가되어 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅한다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 단일의 마이크로-객체를 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 챔버 안으로 트랜스퍼하기 위해 미세유체 회로 (120) 의 하나 이상의 부분들에 DEP 힘들이 인가된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 챔버 (예를 들어, 챔버 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 마이크로-객체가 챔버로부터 변위되는 것을 방지하는데 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 마이크로-객체를 챔버로부터 선택적으로 제거하는데 사용된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 광전 트위저 (OET) 힘들을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 광전기습윤 (OEW) 힘들은 미세유체 회로 (120) 내에 위치된 액적들을 조작, 이송, 분리 및 소팅하기 위해 하나 이상의 전극들 (미도시) 을 통해 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 포지션들 (예를 들어, 흐름 경로 및/또는 챔버들을 정의하는 것을 돕는 포지션들) 에 인가된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 챔버 내로 단일의 액적을 이송하기 위해 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들에 인가된다. 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 챔버 (예를 들어, 챔버 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 액적이 그것으로부터 변위되는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 액적을 챔버로부터 선택적으로 제거하기 위해 사용된다.
일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 마이크로유체 회로 (120) 내의 액적들 및/또는 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅하도록, 다른 힘들, 예컨대 흐름 및/또는 중력과 결합된다. 예를 들어, 인클로저 (102) 는 흐름 경로 (106) 및 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 미세유체 챔버들 위에 위치시키도록 (예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 에 의해) 틸팅될 수 있고, 중력의 힘은 마이크로-객체들 및/또는 액적들을 펜들 안으로 이송할 수 있다. 일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 전에 인가될 수 있다. 다른 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 이후에 인가될 수 있다. 또 다른 인스턴스들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들과 동시에 또는 다른 힘들과 교번하는 방식으로 인가될 수 있다.
도 1b, 도 1c, 및 도 2a 내지 도 2h 는 본 개시의 실시형태들에서 이용될 수 있는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들을 예시한다. 도 1b 는 미세유체 디바이스 (200) 가 광학적으로 작동된 동전기적 디바이스로서 구성되는 실시형태를 묘사한다. 광전자 트위저 (OET) 구성을 갖는 디바이스들 및 광전기습윤 (OEW) 구성을 갖는 디바이스들을 포함하는 다양한 광학적으로 작동된 동전기적 디바이스들이 당업계에 알려져 있다. 적합한 OET 구성들의 예들은 각각이 전부 참조로 본 명세서에 통합되는, 다음의 미국 특허 문헌들에 예시된다: 미국 특허 번호 RE 44,711 (Wu 등) (US 특허 제 7,612,355 호로서 특허됨); 및 US 특허 제 7,956,339 호 (Ohta 등). OEW 구성들의 예들은 미국 특허 제 6,958,132(Chiou 등) 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0024708호(Chiou 등)에 예시되어 있으며, 이들 둘 다는 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스의 또 다른 예는 결합된 OET/OEW 구성을 포함하며, 이것의 예들은 미국 특허 공개 제 20150306598 호(Khandros 등) 및 제20150306599호(Khandros 등)와 그것들의 대응하는 PCT 공개들 WO2015/164846호 및 WO2015/164847호에서 보여지며, 이들 모두는 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
생물학적 마이크로-객체들이 배치, 배양, 및/또는 모니터될 수 있는 챔버들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어 US 2014/0116881 (2013년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/060,117 호), US 2015/0151298 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/520,568 호), 및 US 2015/0165436 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/521,447 호) 에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다. 미국 출원 번호들 제 14/520,568 호 및 제 14/521,447 호는 또한, 미세유체 디바이스에서 배양된 세포들의 분비들을 분석하는 예시적인 방법들을 설명한다. 전술한 출원들의 각각은 광전자 트위저들 (OET) 과 같은 유전영동 (DEP) 힘들을 생성하도록 구성되거나 또는 광-전기습윤 (OEW) 을 제공하도록 구성된 미세유체 디바이스들을 추가로 기재하고 있다. 예를 들어, US 2014/0116881 의 도 2 에 도시된 광전 트위저 디바이스는 개개의 생물학적 미세-객체 또는 생물학적 미세-객체들의 그룹을 선택하고 이동시키기 위해 본 개시의 실시형태들에서 이용될 수 있는 디바이스의 예이다.
미세유체 디바이스 동기 구성들. 상기 설명된 바와 같이, 시스템의 제어 및 모니터링 장비는 미세유체 디바이스의 미세유체 회로에서, 미세-객체들 또는 액적들과 같은 객체들을 선택 및 이동시키기 위한 동기 모듈을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는, 이동되고 있는 객체의 타입 및 다른 고려사항들에 의존하여, 다양한 동기 구성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 유전영동 (DEP) 구성은 미세유체 회로에서 미세-객체들을 선택 및 이동시키기 위해 활용될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 에서 유체 매질 (180) 내의 미세-객체들 상에 DEP 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 DEP 구성을 포함하고 그것에 의하여 개개의 미세-객체들 또는 미세-객체들의 그룹들을 선택, 캡처, 및/또는 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 에서 유체 매질 (180) 내의 액적들 상에 EW 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 전기습윤 (EW) 구성을 포함하고, 그것에 의하여 개개의 액적들 또는 액적들의 그룹들을 선택, 캡처, 및/또는 이동시킬 수 있다.
DEP 구성을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 의 하나의 예가 도 1b 및 도 1c 에 예시된다. 간단성의 목적으로, 도 1b 및 도 1c 는 영역/챔버 (202) 를 갖는 마이크로유체 디바이스 (200) 의 인클로저 (102) 의 부분의, 각각, 측단면도 및 평면 단면도를 도시하지만, 그 영역/챔버 (202) 는 성장 챔버, 챔버, 흐름 영역, 또는 흐름 채널과 같은 더 상세한 구조를 갖는 유체 회로 엘리먼트의 부분일 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 다른 유체 회로 엘리먼트들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스 (200) 는, 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 본원에 설명된 바와 같은, 복수의 성장 챔버들 또는 챔버들 및/또는 하나 이상의 흐름 영역들 또는 흐름 채널들을 포함할 수 있다. DEP 구성은 마이크로유체 디바이스 (200) 의 임의의 이러한 유체 회로 엘리먼트들 안에 통합되거나, 또는 그 부분들을 선택할 수도 있다. 위 또는 아래에 설명된 미세유체 디바이스 컴포넌트들 및 시스템 컴포넌트들 중 임의의 것은 미세유체 디바이스 (200) 에 통합되고 및/또는 그와 결합하여 사용될 수도 있다는 것이 추가로 인식되어야 한다. 예를 들어, 상기 설명된 제어 및 모니터링 장비 (152) 를 포함하는 시스템 (150) 은, 매질 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및 다른 모듈들 (168) 중 하나 이상을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 와 함께 사용될 수도 있다.
도 1b 에서 알 수 있는 바와 같이, 미세유체 디바이스 (200) 는 하단 전극 (204) 및 하단 전극 (204) 위에 있는 전극 활성화 기판 (206) 을 갖는 지지 구조 (104), 및 하단 전극 (204) 으로부터 이격된 상단 전극 (210) 을 갖는 커버 (110) 를 포함한다. 상단 전극 (210) 및 전극 활성화 기판 (206) 은 영역/챔버 (202) 의 대향 표면들을 정의한다. 영역/챔버 (202) 에 포함된 배지 (180) 는 따라서, 상단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 간의 저항성 접속을 제공한다. 하단 전극 (204) 및 상단 전극 (210) 에 접속되고 영역/챔버 (202) 에서 DEP 힘들의 생성에 필요한 바와 같은 전극들 간의 바이어싱 전압을 생성하도록 구성된 전원 (212) 이 또한 도시된다. 전원 (212) 은, 예를 들어 교류 (AC) 전원일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 도 1b 및 도 1c 에 예시된 마이크로유체 디바이스 (200) 는 광학적으로-작동된 DEP 구성을 가질 수 있다. 따라서, 동기 모듈 (162) 에 의해 제어될 수도 있는 광원 (216) 으로부터의 광 (218) 의 패턴들을 변경하는 것은 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 영역들 (214) 에서 DEP 전극들의 패턴들을 변경하는 것을 선택적으로 활성화 및 비활성화할 수 있다. (이하에서, DEP 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스의 영역들 (214) 은 "DEP 전극 영역들" 로서 지칭된다). 도 1c 에 예시된 바와 같이, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 위로 지향된 광 패턴 (218) 은 정사각형과 같은 패턴으로 DEP 전극 영역들 (214a)(화이트로 도시됨) 을 선택적으로 조명할 수 있다. 비-조명된 DEP 전극 영역들 (214)(십자-해칭됨) 은 "어두운" DEP 전극 영역들 (214) 로서 이하에서 지칭된다. DEP 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하부 전극 (204) 으로부터 흐름 영역 (106) 에서 배지 (180) 와 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적인 전기적 임피던스는 각각의 어두운 DEP 전극 영역 (214) 에서 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 를 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 전기적 임피던스보다 더 크다. 그러나, 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 은, 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 에서 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 를 통한 상대적 임피던스보다 작은 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 감소된 상대적 임피던스를 보인다.
전원 (212) 이 활성화됨에 따라, 상기 DEP 구성은 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 과 인접한 어두운 DEP 전극 영역들 (214) 사이의 유체 배지 (180) 에서 전계 구배를 생성하고, 이것은 이어서 유체 배지 (180) 에서 부근의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 로컬 DEP 힘들을 생성한다. 유체 배지 (180) 내의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광원 (216) 으로부터 마이크로유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 영역/챔버 (202) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 이러한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. DEP 힘들이 부근의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는지 여부는, 배지 (180) 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 파라미터들에 의존할 수 있다.
도 1c 에 예시된 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 의 정사각형 패턴 (220) 은 단지 일 예이다. DEP 전극 영역들 (214) 의 임의의 패턴이 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광의 패턴 (218) 에 의해 조명 (및 이에 의해 활성화) 될 수 있고, 조명된/활성화된 DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴은 광 패턴 (218) 을 변경 또는 이동시킴으로써 반복적으로 변경될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 광전도성 재료를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208) 은 피처리스 (featurelss) 일 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화된 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 약 8% 내지 40% 수소 (100 * 수소 원자들의 수 / 수소 및 실리콘 원자들의 총 수로서 계산됨) 를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛ 의 두께를 가질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, DEP 전극 영역들 (214) 은 광 패턴 (218) 에 따라, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 상에 임의의 패턴으로 그리고 어디든 생성될 수 있다. 따라서, DEP 전극 영역들 (214) 의 수 및 패턴은 고정될 필요가 없고, 광 패턴 (218) 에 대응할 수 있다. 상기 논의된 바와 같은 광전도성 층을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어, 미국 특허 RE 44,711 (Wu 등) (미국 특허 제 7,612,355 호로서 최초 발행됨) 에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
다른 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 복수의 도핑된 층들, 전기 절연 층들 (또는 영역들), 및 반도체 분야들에서 알려진 바와 같은 반도체 집적 회로들을 형성하는 전기 전도성 층들을 포함하는 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 예를 들어, 측방향 바이폴라 포토트랜지스터들을 포함하는 복수의 포토트랜지스터들을 포함할 수 있고, 각각의 포토트랜지스터는 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 대안으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들 (예를 들어, 전도성 금속 전극들) 을 포함할 수 있고, 각각의 이러한 전극은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 전극 활성화 기판 (206) 은 이러한 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은, 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같이 행들 및 열들로 배열된 실질적으로 정사각형의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 대안으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, 전기 회로 엘리먼트들은 하단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서의 DEP 전극 영역들 (214) 간의 전기적 접속들을 형성할 수 있고, 이들 전기적 접속들 (즉, 포토레지스터들 또는 전극들) 은 광 패턴 (218) 에 의해 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. 활성화되지 않은 경우, 각각의 전기적 접속은, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하단 전극 (204) 으로부터 영역/챔버 (202) 에서 배지 (180) 와 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적 임피던스가 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 배지 (180) 를 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 임피던스보다 더 크도록 높은 임피던스를 가질 수 있다. 그러나 광 패턴 (218) 에서 광에 의해 활성화되는 경우, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 상대적 임피던스는 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214) 에서 배지 (180) 를 통한 상대적 임피던스보다 더 작고, 이에 의해 위에서 논의된 바와 같이 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 DEP 전극을 활성화시킨다. 따라서, 배지 (180) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 광 패턴 (218) 에 의해 결정된 방식으로 영역/챔버 (202) 의 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다.
포토트랜지스터들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국 특허 제7,956,339 (Ohta 등) (예를 들어, 도 21 및 도 22 에 예시된 디바이스 (300), 및 그 설명들을 참조) 에 기재되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로 본 명세서에 통합된다. 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국 특허공개 제 2014/0124370 (Short 등) (예를 들어, 도면들 전체에 예시된 디바이스들 (200, 400, 500, 600, 및 900) 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
DEP 구성된 미세유체 디바이스의 일부 실시형태들에서, 상단 전극 (210) 은 인클로저 (102) 의 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 일부이고, 전극 활성화 기판 (206) 및 하단 전극 (204) 은 인클로저 (102) 의 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 일부이다. 영역/챔버 (202) 는 제 1 벽과 제 2 벽 사이에 있을 수 있다. 다른 실시형태들에서, 전극 (210) 은 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이고, 하나 또는 양자 모두의 전극 활성화 기판 (206) 및/또는 전극 (210) 은 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이다. 더욱이, 광원 (216) 은 대안적으로 아래로부터 인클로저 (102) 를 조명하는데 사용될 수 있다.
DEP 구성을 갖는 도 1b 및 도 1c 의 미세유체 디바이스 (200) 로, 동기 모듈 (162) 은, 마이크로-객체를 둘러싸고 캡처하는 패턴 (예를 들어, 정사각형 패턴 (220)) 에서 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 DEP 전극 영역들 (214a) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 1 세트를 활성화시키도록 광 패턴 (218) 을 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅함으로써 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 에서 마이크로-객체 (미도시) 를 선택할 수 있다. 동기 모듈 (162) 은 그 후, DEP 전극 영역들 (214) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 2 세트를 활성화시키도록 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 광 패턴 (218) 을 이동시킴으로써 인 시츄 생성된 캡처된 미세-객체를 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 디바이스 (200) 는 광 패턴 (218) 에 대해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스(200)는 전극 활성화 기판(206)의 내부 표면(208)에서 DEP 전극들의 광 활성화에 의존하지 않는 DEP 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판(206)은 적어도 하나의 전극을 포함하는 표면(예컨대, 커버(110))의 반대편에 위치된 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함할 수 있다. 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판에서의 트랜지스터 스위치들) 은 DEP 전극 영역들 (214) 에서 DEP 전극들을 활성화 또는 비활성화시키도록 선택적으로 개방 및 폐쇄될 수도 있고, 이에 의해 활성화된 DEP 전극들 근처에서 영역/챔버 (202) 내의 마이크로-객체 (미도시) 상에 순 (net) DEP 힘을 생성한다. 영역/챔버 (202) 에서 마이크로-객체들 및/또는 배지 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 특징들에 따라, DEP 힘은 부근의 마이크로-객체를 끌어당기거나 밀어낼 수 있다. (예를 들어, 정사각형 패턴 (220) 을 형성하는 DEP 전극 영역들 (214) 의 세트에서) DEP 전극들의 세트를 선택적으로 활성화 및 비활성화시킴으로써, 영역/챔버 (202) 내의 하나 이상의 마이크로-객체들은 영역/챔버 (202) 내에서 트랩 및 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 이러한 스위치들을 제어하고, 따라서 영역/챔버 (202) 주변의 특정한 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택, 트랩, 및 이동시키도록 DEP 전극들 중 개별의 전극들을 활성화 및 비활성화시킬 수 있다. 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 당해 분야에서 알려져 있고, 예를 들어 미국특허 제6,294,063호(Becker 등) 및 제6,942,776호(Medoro)에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로 본 명세서에 포함된다.
또 다른 예로서, 미세유체 디바이스(200)는 전기습윤(EW) 구성을 가질 수 있으며, 이것은 DEP 구성 대신일 수 있거나 또는 DEP 구성을 갖는 부분으로부터 분리된 미세유체 디바이스(200)의 부분에 위치될 수 있다. EW 구성은 광-전기습윤 구성 또는 유전체 상 전기습윤(electrowetting on dielectric, EWOD)구성일 수도 있으며, 이들 둘 다는 본 기술분야에서 알려져 있다. 일부 EW 구성들에서, 지지 구조(104)는 유전체층(미도시)과 하부 전극(204) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판(206)을 갖는다. 유전체 층은 이하에서 설명된 바와 같이, 소수성 재료 (hydrophobic material) 를 포함할 수 있고 및/또는 소수성 재료로 코팅될 수 있다. EW 구성을 갖는 미세유체 디바이스들(200)의 경우, 지지 구조(104)의 내부 표면(208)은 유전체층의 내부 표면 또는 그것의 소수성 코팅이다.
유전체층(미도시)은 하나 이상의 산화물 층들을 포함할 수 있고, 약 50 nm 내지 약 250 nm(예컨대, 약 125 nm 내지 약 175 nm)의 두께를 가질 수 있다. 특정 실시형태들에서, 유전체층은 금속 산화물 (예를 들어, 알루미늄 산화물 또는 하프늄 산화물) 과 같은 산화물의 층을 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 유전체층은 실리콘 산화물 또는 질화물과 같은, 금속 산화물 이외의 유전체 재료를 포함할 수 있다. 정확한 조성 및 두께에 관계 없이, 유전체층은 약 10 kOhms 내지 약 50 kOhms 의 임피던스를 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 영역/채널 (202) 를 향해 내부로 마주하는 유전체층의 표면은 소수성 재료로 코팅된다. 소수성 재료는 예를 들어 플루오리네이티드 카본 분자들을 포함할 수 있다. 플루오리네이티드 카본 분자들의 예들은 폴리테트라플루오로에틸렌 (예를 들어, TEFLON®) 또는 폴리(2,3-디플루오로메틸렌일-퍼플루오로테트라하이드로퓨란) (예를 들어, CYTOPTM) 과 같은 퍼플루오로-폴리머들을 포함한다. 소수성 재료를 구성하는 분자들은 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 예를 들어, 소수성 재료의 분자들은 실록산 기, 포스포닉 애시드 기, 또는 티올 기와 같은 연결자에 의해 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 소수성 재료는 알킬-종결된 실록산, 알킬-종결된 포스포닉 애시드, 또는 알킬-종결된 티올을 포함할 수 있다. 일킬 기는 (예컨대, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 16, 18, 20, 22 개 또는 그 이상의 탄소들의 사슬을 갖는) 긴-사슬 탄화수소들일 수 있다. 대안적으로, 플루오리네이티드 (또는, 퍼플루오리네이티드) 카본 사슬들이 알킬 기들을 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 소수성 재료는 플루오로알킬-말단 실록산, 플루오로알킬-말단 포스포닉 애시드, 또는 플루오로알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 소수성 코팅은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 소수성 코팅은 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 전기습윤 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스 (200) 의 커버 (110) 는 마찬가지로 소수성 재료 (미도시) 로 코팅된다. 소수성 재료는 지지 구조 (104) 의 유전체층을 코팅하기 위해 사용되는 동일한 소수성 재료일 수 있고, 소수성 코팅은 지지 구조 (104) 의 유전체층상의 소수성 코팅의 두께와 실질적으로 동일한 두께를 가질 수 있다. 게다가, 커버 (110) 는 지지 구조 (104) 의 방식으로, 유전체층과 상부 전극 (210) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206) 을 포함할 수 있다. 커버 (110) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층은 지지 구조 (104) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층과 동일한 조성 및/또는 치수들을 가질 수 있다. 따라서, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 2 개의 전기습윤 표면들을 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같은 광도전 재료를 포함할 수 있다. 이에 따라, 특정 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같이 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들 (예를 들어, 도전성 금속 전극들) 을 포함할 수 있다. 광-전기습윤 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 및/또는 본 기술에서 알려져 있는 전극 활성화 기판들로 구성될 수 있다. 예를 들어, 그 전체 내용들이 참조로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,958,132호(Chiou 등)는 a-Si:H 와 같은 광도전성 재료를 갖는 광-전기습윤 구성들을 개시하는 반면, 위에서 참조된 미국 특허 공개 제2014/0124370호(Short 등)는 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들을 갖는 전극 활성화 기판들을 개시한다.
따라서, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 광-전기습윤 구성을 가질 수 있고, 광 패턴들 (218) 은 전극 활성화 기판 (206) 에서의 광도전성 EW 영역들 또는 광응답성 EW 전극들을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 의 그러한 활성화된 EW 영역들 또는 EW 전극들은 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) (즉, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면) 에서 전기습윤력을 생성할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 상에 입사하는 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 (또는 광원 (216) 에 대해 마이크로유체 디바이스 (200) 를 이동시킴으로써), 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 (예를 들어, 수성 배지, 용액, 또는 용매를 포함하는) 액적들이 영역/챔버 (202) 에 존재하는 비혼성 유체 (예를 들어, 오일 배지) 를 통해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스들 (200) 은 EWOD 구성을 가질 수 있고, 전극 활성화 기판 (206) 은 활성화를 위해 광에 의존하지 않는 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 포함할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 은 따라서 그러한 전기습윤 (EW) 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 그 패턴은 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같은 열들 및 행들로 배열된 실질적으로 정사각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, EW 전극들은 전기 스위치들(예컨대, 반도체 기판 내의 트랜지스터 스위치들)에 의해 선택적으로 활성화(또는 비활성화)될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 내의 EW 전극들을 선택적으로 활성화 및 활성화해제함으로써, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 액적들 (미도시) 은 영역/챔버 (202) 내에서 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 그러한 스위치들을 제어할 수 있고 따라서 영역/챔버 (202) 주위의 특정의 액적들을 선택하고 이동시키기 위해 개개의 EW 전극들을 활성화 및 활성화해제할 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 갖는 EWOD 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 본 기술분야에서 알려져 있고 예를 들어 미국 특허 제 8,685,344 호(Sundarsan 등)에 기술되었으며, 이것의 전체 내용들은 참조로 본 명세서에 포함된다. 미세유체 디바이스(200)의 구성에 관계없이, 전원(212)은 미세유체 디바이스(200)의 전기 회로들에 전력을 공급하는 전위(예컨대, AC 전압 전위)를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 전원(212)은 도 1에서 참조되는 전원(192)과 동일하거나, 그 전원의 컴포넌트일 수 있다. 전원(212)은 상부 전극(210)및 하부 전극(204)에 AC 전압 및/또는 전류를 제공하도록 구성될 수 있다. AC 전압의 경우, 전원(212)은 위에서 논의된 바와 같이 영역/챔버(202) 내에서 개개의 미세 물체들(미도시)을 트랩하고 이동시키며, 및/또는 또한 위에서 논의된 바와 같이 영역/챔버(202)에서 지지 구조(104)(예컨대, 유전체층 및/또는 유전체층상의 소수성 코팅)의 내부 표면(208)의 습윤 특성들을 변경하기에 충분히 강한 네트 DEP 힘들(또는 습윤력들)을 발생시키기에 충분한 주파수 범위 및 평균 또는 피크 전력(예컨대, 전압 또는 전류) 범위를 제공할 수 있다. 그러한 주파수 범위들 및 평균 또는 피크 전력 범위들은 본 기술분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등), 미국 특허 제 RE44,711 호 (Wu 등.) (미국특허 제 7,612,355 호로서 최초 특허됨), 및 미국 특허 출원 공보 US2014/0124370 호 (Short 등), US2015/0306598 호 (Khandros 등) 및 US2015/0306599 호 (Khandros 등) 를 참조한다.
챔버 일반적인 챔버들 (224, 226, 및 228) 의 비-제한 예들은 도 2a 내지 도 2c 에 도시된 미세유체 디바이스 (230) 내에 도시된다. 각각의 챔버 (224, 226, 및 228) 는 고립 영역 (240) 및 고립 영역 (240) 을 미세유체 채널 (122) 에 유체적으로 접속시키는 접속 영역 (236) 을 정의하는 고립 구조 (232) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은 미세유체 채널 (122) 로의 근위 개구부 (234) 및 격리 영역 (240) 으로의 원위 개구부 (238) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은, 미세유체 채널 (122) 로부터 챔버 (224, 226, 228) 안으로 흐르는 유체 배지 (미도시) 의 흐름의 최대 침투 깊이가 고립 영역 (240) 안으로 확장하지 않도록 구성될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 채널 내의 흐름으로부터의 스트림라인은 분리 영역으로 진입하지 않는다. 따라서, 접속 영역 (236) 으로 인해, 챔버 (224, 226, 228) 의 고립 영역 (240) 에 배치된 마이크로-객체 (미도시) 또는 다른 재료 (미도시) 는 미세유체 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름으로부터 고립될 수 있고, 실질적으로 이에 의해 영향을 받지 않는다.
도 2a 내지 도 2c 의 챔버들 (224, 226, 및 228) 은 각각 미세유체 채널 (122) 에 대해 직접 개방하는 단일 개구를 갖는다. 챔버의 개구부는 미세유체 채널 (122) 로부터 횡방향으로 개방될 수도 있다. 전극 활성화 기판 (206) 은 미세유체 채널 (122) 및 챔버들 (224, 226, 및 228) 양자의 아래에 놓인다. 챔버의 바닥을 형성하는, 챔버의 인클로저 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면은 미세유체 디바이스의 흐름 채널 (또는 각각, 흐름 영역) 의 바닥을 형성하는, 미세유체 채널 (122) (또는 채널이 존재하지 않는 경우 흐름 영역) 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면의 동일한 레벨 또는 실질적으로 동일한 레벨에 배치된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 특징부가 없을 수도 있거나, 약 3 마이크론, 2.5 마이크론, 2 마이크론, 1.5 마이크론, 1 마이크론, 0.9 마이크론, 0.5 마이크론, 0.4 마이크론, 0.2 마이크론, 0.1 마이크론, 또는 그 미만의 것보다 더 작은 것만큼 그 최고 융기 (elevation) 로부터 그 최저 침하 (depression) 까지 변동되는 불규칙적인 또는 패턴화된 표면을 가질 수도 있다. 미세유체 채널 (122) (또는 유동 영역) 과 챔버들 양자 모두에 걸친 기판의 상부 표면에서의 상승부의 변동은 챔버의 벽들 또는 미세유체 디바이스의 벽들의 높이의 약 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.5%, 0.3% 또는 0.1% 미만일 수도 있다. 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 상세히 설명되지만, 이것은 또한 여기에 기술된 미세유체 디바이스들 (100, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 중 임의의 것에 적용된다.
미세유체 채널 (122) 은 따라서, 스윕 영역의 일 예일 수 있고, 챔버들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은 스윕되지 않은 영역들의 예들일 수 있다. 224, 226, 228 과 같은 챔버들은 분리 영역을 가질 수도 있으며, 여기서 각각의 분리 영역은 격리 펜의 연결 영역으로 개방되는 단지 하나의 개구를 갖는다. 이와 같이 구성된 분리 영역 내외에서의 유체 매질 교환은 오직 확산에 의해서만 실질적으로 발생하는 것으로 제한될 수 있다. 주목된 바와 같이, 미세유체 채널 (122) 및 챔버들 (224, 226, 228) 은 하나 이상의 유체 배지 (180) 를 포함하도록 구성될 수 있다. 도 2a 내지 도 2b 에서 도시된 예에서, 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 에 접속되고, 유체 매질 (180) 이 미세유체 디바이스 (230) 로 도입되거나 미세유체 디바이스 (230) 로부터 제거되는 것을 허용한다. 유체 매질 (180) 의 도입 전에, 미세유체 디바이스는 이산화탄소 기체와 같은 기체로 프라이밍될 수도 있다. 일단 미세유체 디바이스 (230) 가 유체 매질 (180) 을 함유하면, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 은 선택적으로 생성될 수 있고 정지될 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 의 상이한 로케이션들 (예를 들어, 반대편 단부들) 에 배치될 수 있고, 배지의 흐름 (242) 은 인렛로서 기능하는 하나의 포트 (222) 로부터 아웃렛으로서 기능하는 다른 포트 (222) 로 생성될 수 있다.
도 2c 는 본 개시에 따른 챔버 (224) 의 일 예의 상세 뷰를 예시한다. 또한, 마이크로-객체들 (246) 의 예들이 도시된다.
알려진 바와 같이, 챔버 (224) 의 근위 개구 (234) 를 지나 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 챔버 (224) 의 안 및/또는 밖으로의 배지 (180) 의 세컨더리 흐름 (244) 을 야기할 수 있다. 챔버 (224) 의 고립 영역 (240) 에서 마이크로-객체들 (246) 을 세컨더리 흐름 (244) 으로부터 고립시키기 위해, (즉, 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 로의) 챔버 (224) 의 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (244) 의 접속 영역 (236) 안으로의 침투 깊이 (Dp) 보다 커야 한다. 침투 깊이 (Dp) 는, 근위 개구 (234) 에서의 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon); 근위 개구 (234) 에서의 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch); 근위 개구 (234) 에서의 채널 (122) 의 높이 (Hch); 및 연결 영역 (236) 의 원위 개구 (238) 의 폭에 의해 정의될 수도 있는 미세유체 채널 (122) 의 형상을 포함하는 다수의 인자들에 의존한다. 이들 인자들 중에서, 근위 개구 (234) 에서의 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 및 근위 개구 (234) 에서의 채널 (122) 의 높이 (Hch) 가 가장 중요한 경향이 있다. 또한, 관통 깊이 (Dp) 는 채널 (122) 내의 유체 매질 (180) 의 속도 및 유체 매질 (180) 의 점도에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러나, 이러한 인자들 (즉, 속도 및 점도) 은 침투 깊이 (Dp) 의 극적인 변화 없이 광범위하게 변화할 수 있다. 예를 들어, 약 50 미크론의 근위 개구(234)에서의 연결 영역(236)의 폭 (Wcon), 약 40 미크론의 근위 개구(122)에서의 채널(122)의 높이 (Hch), 및 약 100 마이크론 내지 약 150 마이크론의 근위 개구(122)에서의 미세유체 채널(122)의 폭 (Wch) 을 갖는 미세유체 칩 (230) 의 경우, 2차 흐름(244)의 관통 깊이 (Dp) 는 0.1 마이크로리터/초의 유동 속도에서 Wcon 의 1.0 배 미만 (즉, 50 미크론 미만) 으로부터 20 마이크로리터/초의 유속에서 Wcon 의 약 2.0 배 (즉, 약 100 미크론) 까지의 범위이며, 이는 유체 매질(180)의 속도가 200배 증가하는 것에 비해 약 2.5배만의 Dp 의 증가를 나타낸다. 따라서, 각 챔버(224)에 대해, 2차 흐름(244)의 침투 깊이 (Dp) 가 연결 영역(236)의 길이 Lcon 을 초과하지 않는 것을 보장하는, 채널(122) 내의 유체 매체(180)의 흐름(242)에 대한 최대 속도 Vmax 가 식별될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 의 레이트가 최대 속도 Vmax 를 초과하지 않는 한, 결과적인 이차적인 유동 (244) 은 접속 영역 (236) 내에 전적으로 포함될 수 있고, 격리 영역 (240) 으로 진입하지 않는다. 미세유체 채널 (122) 에서 매질 (180) 의 흐름 (242) 은 따라서, 마이크로-객체들 (246) 을 분리 영역 (240) 밖으로 인출하지 않을 것이다. 차라리, 고립 영역 (240) 에 위치된 미세-객체들 (246) 은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 관계없이 고립 영역 (240) 에 머무를 것이다.
또한, 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동 (242) 의 레이트가 Vmax 를 초과하지 않는 한, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 매질 (180) 의 유동 (242) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 챔버 (224) 의 격리 영역 (240) 으로 잡다한 입자들 (예컨대, 미세입자들 및/또는 나노입자들) 을 이동시키지 않을 것이다. 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 가 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 큰 것은 따라서, 미세유체 채널 (122) 또는 다른 챔버 (예를 들어, 도 2d 에서의 챔버들 (226, 228)) 로부터의 잡다한 입자들로 하나의 챔버 (224) 의 오염을 방지할 수 있다.
미세유체 채널 (122) 및 챔버들 (224, 226, 228) 의 접속 영역들 (236) 이 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 유동 (242) 에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역들 (236) 은 미세유체 디바이스 (230) 의 스윕된 (또는 유동) 영역들로 간주될 수 있다. 한편, 챔버들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은, 스윕되지 않은 (또는 비-흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 유체 매질 (180) 에서의 컴포넌트들 (도시되지 않음) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 격리 영역 (240) 에서의 제 2 유체 매질 (248) 로의 제 1 매질 (180) 의 컴포넌트들의 확산에 의해 오직 실질적으로, 격리 영역 (240) 에서의 제 2 유체 매질 (248) 과 혼합할 수 있다. 유사하게, 분리 영역 (240) 에서의 제 2 매질 (248) 의 컴포넌트들 (도시되지 않음) 은 분리 영역 (240) 으로부터 연결 영역 (236) 을 통해 그리고 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 매질 (180) 로의 제 2 매질 (248) 의 컴포넌트들의 확산에 의해 오직 실질적으로, 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 매질 (180) 과 혼합할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 확산에 의한 챔버의 고립 영역과 흐름 영역 사이의 유체 배지 교환의 정도는 유체 교환의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 보다 더 크거나 약 99% 보다 더 크다. 제 1 배지 (180) 는 제 2 배지 (248) 와 동일한 배지이거나 상이한 배지일 수 있다. 또한, 제 1 배지 (180) 및 제 2 배지 (248) 는 동일하게 시작하고, 그 후 (예를 들어, 고립 영역 (240) 에서 하나 이상의 세포들에 의해 제 2 배지 (248) 의 컨디셔닝을 통해, 또는 미세유체 채널 (122) 을 통해 흐르는 배지 (180) 를 변경함으로써) 상이하게 될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 채널 (122) 및 챔버들 (224, 226, 228) 의 치수들은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 매질 (180) 의 흐름 (242) 의 벡터에 대하여 다음과 같이 배향될 수 있다: 미세유체 채널 폭 (Wch)(또는 미세유체 채널 (122) 의 단면적) 은 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다; 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적) 은 미세유체 채널 (122) 에서의 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 평행할 수 있다; 및/또는 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 미세유체 채널 (122) 에서 매질 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다. 상기는 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 및 챔버들 (224, 226, 228) 의 상대적 포지션은 서로에 대하여 다른 배향들에 있을 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 까지 균일할 수 있다. 따라서, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 값들 중 어느 하나일 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 클 수 있다.
도 2c에 예시된 바와 같이, 원위 개구부(238)에서의 고립 영역(240)의 폭은 근위 개구부(234)에서 연결 영역(236)의 폭(Wcon)과 실질적으로 동일할 수 있다. 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 따라서, 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 값들 중 어느 하나일 수 있다. 대안적으로, 원위 개구부(238)에서의 고립 영역(240)의 폭은 근위 개구부(234)에서의 연결 영역(236)의 폭(Wcon)보다 더 크거나 또는 더 작을 수 있다. 또한, 원위 개구 (238) 는 근위 개구 (234) 보다 더 작을 수도 있고, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 와 원위 개구 (238) 사이에서 좁아질 수도 있다. 예를 들어, 접속 영역 (236) 은 다양한 상이한 지오메트리들을 사용하여 (예를 들어, 접속 영역을 챔퍼링, 접속 영역을 베벨링), 근위 개구와 원위 개구 사이에서 좁아질 수도 있다. 또한, 접속 영역 (236) 의 임의의 부분 또는 하위부분 (예를 들어, 근위 개구 (234) 에 인접한 접속 영역의 부분) 이 좁아질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 는 도 1a 의 각각의 마이크로유체 디바이스 (100), 회로 (132) 및 채널 (134) 의 변형들인, 마이크로유체 회로 (262) 및 흐름 채널들 (264) 을 포함하는 마이크로유체 디바이스 (400) 의 다른 예시적인 실시형태를 도시한다. 미세유체 디바이스 (250) 는 또한, 전술된 챔버들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 의 추가적인 변형들인 복수의 챔버들 (266) 을 갖는다. 특히, 도 2d 내지 도 2f 에 도시된 디바이스 (250) 의 챔버들 (266) 은 전술된 디바이스들 (100, 200, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 내의 챔버들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 중 어느 하나를 대체할 수 있다. 마찬가지로, 미세유체 디바이스 (400) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 다른 변형이고, 또한 전술된 미세유체 디바이스 (100, 200, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200), 뿐만 아니라 본원에 설명된 다른 미세유체 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나와 동일한 또는 상이한 DEP 구성을 가질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 의 미세유체 디바이스 (250) 는 지지 구조 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수 있음), 미세유체 회로 구조 (256), 및 커버 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 커버 (122) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수도 있음) 를 포함한다. 미세유체 회로 구조 (256) 는, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있는 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 를 포함한다. 도 2d 에 나타낸 바와 같이, 미세유체 회로 재료 (260) 에 의해 정의된 미세유체 회로 (262) 는 다수의 챔버들 (266) 이 유체적으로 접속되는 다수의 채널들 (264)(2 개가 도시되지만 더 많이 존재할 수 있음) 을 포함할 수 있다.
각각의 챔버 (266) 는 고립 구조 (272), 고립 구조 (272) 내의 고립 영역 (270), 및 접속 영역 (268) 을 포함할 수 있다. 미세유체 채널 (264) 에서의 근위 개구부 (274) 로부터 격리 구조체 (272) 에서의 원위 개구부 (276) 까지, 접속 영역 (268) 은 미세유체 채널 (264) 을 격리 영역 (270) 에 유체적으로 접속시킨다. 일반적으로, 도 2b 및 도 2c 의 상기 논의에 따르면, 마이크로유체 채널 (264) 에서 제 1 유체 배지 (254) 의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 챔버들 (266) 의 각각의 접속 영역들 (268) 안으로 및/또는 밖으로 제 1 배지 (254) 의 세컨더리 흐름들 (282) 을 생성할 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 각각의 챔버 (266) 의 접속 영역 (268) 은 일반적으로, 미세유체 채널 (264) 로의 근위 개구 (274) 와 고립 구조 (272) 로의 원위 개구 (276) 사이에서 확장하는 영역을 포함한다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (282) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 클 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 (도 2d 에 도시된 바와 같이) 고립 영역 (270) 을 향해 재지향되지 않고 접속 영역 (268) 으로 확장할 것이다. 대안으로, 도 2f 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (268) 은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 작은 길이 (Lcon) 를 가질 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 접속 영역 (268) 을 통해 확장하고 고립 영역 (270) 을 향해 재지향될 것이다. 이 후자의 상황에서, 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 커서, 세컨더리 흐름 (282) 이 고립 영역 (270) 안으로 확장하지 않을 것이다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 가 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 또는 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합이 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 마이크로유체 채널 (264) 에서의 제 1 배지 (254) 의 흐름 (278) 은 침투 깊이 (Dp) 를 갖는 세컨더리 흐름을 생성할 것이고, 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 에서 마이크로-객체들 (도시되지 않지만, 도 2e 에 도시된 마이크로-객체들 (246) 과 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있음) 은 마이크로유체 채널 (264) 에서 제 1 배지 (254) 의 흐름 (278) 에 의해 고립 영역 (270) 밖으로 인출되지 않을 것이다. 또한, 미세유체 채널 (264) 에서의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 안으로 잡다한 재료들 (미도시) 을 인출하지도 않을 것이다. 이와 같이, 확산은, 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 배지 (254) 내의 성분들이 미세유체 채널 (264) 로부터 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 내의 제 2 배지 (258) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 마찬가지로, 확산은, 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 에서의 제 2 배지 (258) 내의 성분들이 고립 영역 (270) 으로부터 미세유체 채널 (264) 내의 제 1 배지 (254) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 제 1 배지 254 는 제 2 배지 258 와 동일한 배지일 수 있거나, 또는 제 1 배지 254 는 제 2 배지 258 와는 상이한 배지일 수 있다. 대안으로, 제 1 배지 (254) 및 제 2 배지 (258) 는 동일하게 시작할 수 있고, 그 후 예를 들어 고립 영역 (270) 내의 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 배지의 컨디셔닝을 통해, 또는 미세유체 채널 (264) 을 통해 흐르는 배지를 변경함으로써 상이하게 될 수 있다.
도 2e 에서 예시된 바와 같이, 미세유체 채널 (264) 에서의 (즉, 도 2d 에서 화살표들 (278) 에 의해 표시된 미세유체 채널을 통한 유체 매질 유동의 방향을 횡단하여 취해진) 미세유체 채널들 (264) 의 폭 Wch 은 근위 개구부 (274) 의 폭 Wcon1 에 대해 실질적으로 수직일 수 있고, 이에 따라, 원위 개구부 (276) 의 폭 Wcon2 에 대해 실질적으로 평행할 수 있다. 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 및 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 은 그러나, 서로 실질적으로 수직할 필요는 없다. 예를 들어, 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 이 배향되는 축 (미도시) 과 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 이 배향되는 다른 축 간의 각도는 수직 외 및 따라서 90°이외일 수 있다. 대안 적으로 배향 된 각도의 예는 다음의 각도를 포함한다 : 약 30° 내지 약 90°, 약 45° 내지 약 90°, 약 60° 내지 약 90° 등.
도 3a 는 채널 (322) 및 챔버 (324) 을 포함하는 미세유체 회로 구조 (308) 를 포함하는 미세유체 디바이스 (300) 의 다른 예시적인 실시형태를 도시하며, 이는 미세유체 디바이스 (100, 200, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 및 본 명세서에 설명된 임의의 다른 미세유체 디바이스에 대해 본 명세서에 설명된 챔버들 중 임의의 것과 같은 특징들 및 특성들을 갖는다.
도 3a 의 예시적인 미세유체 장치는 본 명세서에 기재된 바와 같이 폭 (Wch) 을 갖고 제 1 유체 매질 (302) 의 흐름 (310) 을 포함하는 미세유체 채널 (322) 및 하나 이상의 챔버들 (324) (도 3 에는 오직 하나만이 도시됨) 을 포함한다. 챔버들 (324) 은 각각 길이 (Ls), 연결 영역 (336), 및 분리 영역 (340) 을 가지며, 분리 영역 (340) 은 제 2 유체 매질 (304) 을 포함한다. 연결 영역 (336) 은 미세유체 채널 (322) 로 개방되는 폭 (Wcon1) 을 갖는 근위 개구 (334), 및 격리 영역 (340) 으로 개방되는 폭 (Wcon2) 을 갖는 원위 개구 (338) 를 갖는다. 폭 (Wcon1) 은 본 명세서에 설명된 바와 같이, Wcon2 와 동일하거나 동일하지 않을 수도 있다. 각각의 챔버 (324) 의 벽들은 미세유체 회로 재료 (316) 로 형성될 수도 있으며, 이는 연결 영역 벽 (330) 을 더 형성할 수도 있다. 연결 영역 벽 (330) 은 근위 개구 (334) 에 대해 측방향으로 위치되고 챔버 (324) 의 둘러싸인 부분 내로 적어도 부분적으로 연장되는 구조에 대응할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 연결 영역 (336) 의 길이 (Lcon) 는 연결 영역 벽 (330) 의 길이 (Lwall) 에 의해 적어도 부분적으로 정의된다. 연결 영역 벽 (330) 은 이차 흐름 (344) 의 침투 깊이 (Dp) 보다 크도록 선택된 길이 (Lwall) 를 가질 수도 있다. 따라서, 이차 흐름 (344) 은 분리 영역(340) 내로 연장되지 않고 연결 영역 내에 완전히 포함될 수 있다.
연결 영역 벽 (330) 은 챔버 (324) 의 분리 영역 (340) 의 서브영역인 후크 영역 (352) 을 정의할 수도 있다. "후크 영역"이라는 용어는 격리 영역(340)의 이 하위 영역을 나타내기 위해 사용되지만, "후크 영역"은 직접 및/또는 2차 흐름으로부터 격리되고 그 안에 세포가 없기 쉽거나 없는 미세유체 챔버의 임의의 영역으로서 보다 넓게 해석될 수 있다. 연결 영역 벽 (330) 이 챔버의 내부 공동 내로 연장되기 때문에, 연결 영역 벽 (330) 은 이차 흐름 (344) 으로부터 후크 영역(352) 을 차폐하기 위한 물리적 장벽으로서 작용할 수 있고, Lwall 의 길이의 선택은 후크 영역의 정도에 기여한다. 일부 실시형태에서, 연결 영역 벽 (330) 의 길이 (Lwall) 가 더 길수록, 후크 영역 (352) 이 더 은닉된다.
도 2a 내지 도 2g 및 도 3a 의 챔버들과 같이 구성된 챔버들에서, 분리 영역은 임의의 유형의 형상 및 크기를 가질 수도 있고, 예를 들어, 유동 영역 (또는 미세유체 채널) 에 대한 연결 영역의 근위 개구의 반대쪽에 있는 챔버의 먼 벽에 도달하도록 챔버 내로의 영양분, 시약 및/또는 배지의 확산을 조절하도록 선택될 수도 있다. 분리 영역의 크기 및 형상은 챔버의 연결 영역의 근위 개구를 통해 분리 영역으로부터 유동 영역으로의 생물학적 미세-물체의 폐기 생성물 및/또는 분비 생성물의 확산을 조절하도록 추가로 선택될 수도 있다. 일반적으로, 분리 영역의 형상은 유동 영역 내의 직접 흐름으로부터 미세 물체를 분리하는 챔버의 능력에 있어 중요하지 않다.
챔버들의 일부 다른 실시형태들에서, 분리 영역은 분리 영역을 미세유체 디바이스의 유동 영역과 유동적으로 연결하는 1 초과의 개구를 가질 수도 있다. 그러나, 분리 영역을 유동 영역 (또는 2 이상의 유동 영역들) 에 유동적으로 연결하는 다수의 n 개의 개구를 갖는 분리 영역에 대해, n-1 개의 개구가 밸브화될 수 있다. n-1 개의 밸브형 개구가 폐쇄될 때, 분리 영역은 단지 하나의 유효 개구를 가지며, 분리 영역 내외로의 재료의 교환은 오직 확산에 의해서만 일어난다.
미세유체 회로 엘리먼트 치수. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 격리 펜들 및 격리 펜들이 개방되는 미세유체 채널들의 다양한 치수들 및/또는 특징들은 유동 영역/마이크로유체 채널로부터 격리 펜의 분리 영역 내로의 오염물들 또는 원치않는 미세-물체들의 도입을 제한하고; 채널 또는 분리 영역으로부터 유체 매질 내의 성분들의 교환을 실질적으로 단지 확산 교환으로 제한하고; 격리 펜들 내외로 미세-물체들의 전달을 용이하게 하고; 및/또는 생물학적 세포들의 성장 또는 팽창을 용이하게 하도록 선택될 수도 있다. 본 명세서에 기술된 실시형태들들 중 임의의 실시형태에 대해, 미세유체 채널들 및 격리 펜들은 치수들의 임의의 적합한 조합을 가질 수도 있고, 본 개시의 교시들로부터 당업자에 의해 선택될 수도 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 미세유체 장치에 대해, 미세유체 채널은 길이를 따라 실질적으로 균일한 단면 높이인 균일한 단면 높이를 가질 수 있고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 단면 높이일 수 있다. 미세유체 채널을 따른 임의의 지점에서, 상부 표면은 커버의 내부 표면에 의해 정의되고 하부 표면은 베이스의 내부 표면에 의해 정의되는 채널의 실질적으로 균일한 단면 높이는 채널을 따른 임의의 다른 지점에서의 단면 높이와 실질적으로 동일하여, 예를 들어, 채널 내의 임의의 다른 위치의 단면 높이와 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 또는 그 미만 이하인 단면 높이를 가질 수 있다.
추가로, 본 명세서에 기재된 미세유체 장치의 챔버(들), 예를 들어 격리 펜(들)은 챔버(들)가 개방되는 미세유체 채널에 대해 실질적으로 동일 평면 배향으로 배치될 수 있다. 즉, 챔버(들)의 밀폐된 체적은 커버의 내부 표면에 의해 정의되는 상부 표면, 베이스의 내부 표면에 의해 정의되는 하부 표면 및 미세 유체 회로 재료에 의해 정의되는 벽에 의해 형성된다. 따라서, 챔버(들)의 하부 표면은 미세유체 채널의 하부 표면과 동일 평면, 예를 들어 실질적으로 동일 평면일 수 있다. 챔버의 상부 표면은 미세유체 채널의 상부 표면과 동일 평면에 있을 수 있으며, 예를 들어 실질적으로 동일 평면에 있을 수 있다. 따라서, 챔버(들)는 채널과 동일한, 예를 들어 실질적으로 동일한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 값을 가질 수 있는 단면 높이를 가질 수 있고, 미세유체 장치 내의 챔버(들) 및 미세유체 채널(들)은 미세 유체 장치의 유동 영역 전체에 걸쳐 실질적으로 균일한 단면 높이를 가질 수 있고, 미세 유체 장치 전체에 걸쳐 실질적으로 동일 평면에 있을 수 있다.
챔버(들)와 미세유체 채널(들)의 하부 표면들의 동일 평면성은 DEP 또는 자기력을 사용하여 미세유체 장치 내에서 미세 물체를 재위치시킬 때 뚜렷한 이점을 제공할 수 있다. 미세 물체의 페닝 및 언페닝, 특히 선택적 페닝/선택적 언페닝은 챔버(들)의 하부 표면과 챔버(들)가 열리는 미세유체 채널이 동일 평면 배향을 가질 때 크게 촉진될 수 있다.
격리 펜의 연결 영역의 근위 개구는 격리 펜이 의도되는 미세-물체 (예를 들어, 식물 원형질체와 같은 식물 세포일 수도 있는 생물학적 세포) 의 최대 치수만큼 적어도 큰 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 근위 개구부는 약 20 미크론, 약 40 미크론, 약 50 미크론, 약 60 미크론, 약 75 미크론, 약 100 미크론, 약 150 미크론, 약 200 미크론, 또는 약 300 미크론의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 을 갖는다. 전술한 것은 단지 예들이며, 근위 개구의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 은 상기 열거된 값들 중 임의의 값들 (예를 들어, 약 20-200 미크론, 약 20-150 미크론, 약 20-100 미크론, 약 20-75 미크론, 약 20-60 미크론, 약 50-300 미크론, 약 50-200 미크론, 약 50-150 미크론, 약 50-100 미크론, 약 50-75 미크론, 약 75-150 미크론, 약 75-100 미크론, 약 100-300 미크론, 약 100-200 미크론, 또는 약 200-300 미크론) 사이의 값이 되도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 격리 펜의 연결 영역은 격리 펜의 분리 영역의 근위 개구로부터 원위 개구까지의 길이 (예를 들어, Lcon) 가 근위 개구의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 의 적어도 0.5 배, 적어도 0.6 배, 적어도 0.7 배, 적어도 0.8 배, 적어도 0.9 배, 적어도 1.0 배, 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.75 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.25 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.75 배, 적어도 3.0 배, 적어도 3.5 배, 적어도 4.0 배, 적어도 4.5 배, 적어도 5.0 배, 적어도 6.0 배, 적어도 7.0 배, 적어도 8.0 배, 적어도 9.0 배, 또는 적어도 10.0 배일 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구는 약 20 미크론 내지 약 200 미크론 (예를 들어, 약 50 미크론 내지 약 150 미크론) 의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 을 가질 수도 있고, 연결 영역은 근위 개구의 폭의 적어도 1.0 배 (예를 들어, 적어도 1.5 배, 또는 적어도 2.0 배) 인 길이 (Lcon) 를 가질 수도 있다. 다른 예로서, 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구는 약 20 미크론 내지 약 100 미크론 (예를 들어, 약 20 미크론 내지 약 60 미크론) 의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 을 가질 수도 있고, 연결 영역은 근위 개구의 폭의 적어도 1.0 배 (예를 들어, 적어도 1.5 배, 또는 적어도 2.0 배) 인 길이 (Lcon) 를 가질 수도 있다.
격리 펜이 개방된 미세유체 디바이스의 미세유체 채널은 지정된 크기 (예를 들어, 폭 또는 높이) 를 가질 수도 있다. 일부 실시양태에서, 격리 펜의 연결 영역에 대한 근위 개구에서 미세유체 채널의 높이(예를 들어, Hch) 는 다음 범위 중 임의의 것 내일 수 있다: 20-100 마이크론, 20-90 마이크론, 20-80 마이크론, 20-70 마이크론, 20-60 마이크론, 20-50 마이크론, 30-100 마이크론, 30-90 마이크론, 30-80 마이크론, 30-70 마이크론, 30-60 마이크론, 30-50 마이크론, 40-100 마이크론, 40-90 마이크론, 40-80 마이크론, 40-70 마이크론, 40-60 마이크론, 또는 40-50 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (예를 들어, Hch) 는 위에서 열거된 임의의 값들 사이인 것으로 선택될 수 있다. 또한, 미세유체 채널 (122) 의 높이 (Hch) 는 격리 펜의 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 높이들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다.
격리 펜의 연결 영역에 대한 근위 개구에서 미세유체 채널의 폭 (예를 들어, Wch) 은 다음 범위들 중 임의의 범위 내에 있을 수 있다: 약 20-500 마이크론, 20-400 마이크론, 20-300 마이크론, 20-200 마이크론, 20-150 마이크론, 20-100 마이크론, 20-80 마이크론, 20-60 마이크론, 30-400 마이크론, 30-300 마이크론, 30-200 마이크론, 30-150 마이크론, 30-100 마이크론, 30-80 마이크론, 30-60 마이크론, 40-300 마이크론, 40-200 마이크론, 40-150 마이크론, 40-100 마이크론, 40-80 마이크론, 40-60 마이크론, 50-1000 마이크론, 50-500 마이크론, 50-400 마이크론, 50-300 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 50-80 마이크론, 60-300 마이크론, 60-200 마이크론, 60-150 마이크론, 60-100 마이크론, 60-80 마이크론, 70-500 마이크론, 70-400 마이크론, 70-300 마이크론, 70-250 마이크론, 70-200 마이크론, 70-150 마이크론, 70-100 마이크론, 80-100 마이크론, 90-400 마이크론, 90-300 마이크론, 90-250 마이크론, 90-200 마이크론, 90-150 마이크론, 100-300 마이크론, 100-250 마이크론, 100-200 마이크론, 100-150 마이크론, 100-120 마이크론, 200-800 마이크론, 200-700 마이크론 또는 200-600 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널의 폭 (예를 들어, Wch) 은 위에서 열거된 임의의 값들 사이인 것으로 선택될 수 있다. 또한, 미세유체 채널의 폭 (예를 들어, Wch) 은 격리 펜의 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 폭들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 격리 펜의 연결 영역에 대한 근위 개구에서의 미세유체 채널의 폭 (Wch) (예를 들어, 채널을 통한 유체의 벌크 흐름 방향에 대해 횡방향으로 취함) 은 근위 개구의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 에 실질적으로 수직일 수 있다.
격리 펜들의 연결 영역에 대한 근위 개구에서 미세유체 채널의 단면적은 약 500-50,000 제곱 마이크론, 500-40,000 제곱 마이크론, 500-30,000 제곱 마이크론, 500-25,000 제곱 마이크론, 500-20,000 제곱 마이크론, 500-15,000 제곱 마이크론, 500-10,000 제곱 마이크론, 500-7,500 제곱 마이크론, 500-5,000 제곱 마이크론, 1,000-25,000 제곱 마이크론, 1,000-20,000 제곱 마이크론, 1,000-15,000 제곱 마이크론, 1,000-10,000 제곱 마이크론, 1,000-7,500 제곱 마이크론, 1,000-5,000 제곱 마이크론, 2,000-20,000 제곱 마이크론, 2,000-15,000 제곱 마이크론, 2,000-10,000 제곱 마이크론, 2,000-7,500 제곱 마이크론, 2,000-6,000 제곱 마이크론, 3,000-20,000 제곱 마이크론, 3,000-15,000 제곱 마이크론, 3,000-10,000 제곱 마이크론, 3,000-7,500 제곱 마이크론, 또는 3,000 내지 6,000 제곱 마이크론일 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구에서 미세유체 채널의 단면적은 위에서 열거된 임의의 값들 사이인 것으로 선택될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역들에서의 미세유체 채널의 단면적은 또한 상기 열거된 값들 중 임의의 값 사이에 있도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 단면적은 미세유체 채널의 전체 길이에 대해 실질적으로 균일한 값이 되도록 선택된다.
일부 실시형태에서, 미세유체 칩은 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구 (예를 들어, 234 또는 334) 가 약 20 미크론 내지 약 200 미크론 (예를 들어, 약 50 미크론 내지 약 150 미크론) 의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 을 가질 수도 있고, 연결 영역이 근위 개구의 폭의 적어도 1.0 배 (예를 들어, 적어도 1.5 배, 또는 적어도 2.0 배) 인 길이 Lcon (예를 들어, 236 또는 336) 를 가질 수도 있고, 그리고 미세유체 채널이 약 30 미크론 내지 약 60 미크론의 근위 개구에서의 높이 (예를 들어, Hch) 를 가질 수도 있도록 구성된다. 다른 예에서, 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구 (예를 들어, 234 또는 334) 는 약 20 미크론 내지 약 100 미크론 (예를 들어, 약 20 미크론 내지 약 60 미크론) 의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 을 가질 수도 있고, 연결 영역이 근위 개구의 폭의 적어도 1.0 배 (예를 들어, 적어도 1.5 배, 또는 적어도 2.0 배) 인 길이 Lcon (예를 들어, 236 또는 336) 를 가질 수도 있고, 그리고 미세유체 채널이 약 30 미크론 내지 약 60 미크론의 근위 개구에서의 높이 (예를 들어, Hch) 를 가질 수도 있다. 전술한 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234 또는 274) 의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1), 연결 영역의 길이 (예를 들어, Lcon), 및/또는 미세유체 채널 (예를 들어, 122 또는 322) 의 폭 (예를 들어, Wch) 은 상기 열거된 값들 중 임의의 것 사이에 있도록 선택된 값일 수 있다. 그러나 일반적으로 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구부의 너비 (Wcon 또는 Wcon1) 는 미세 유체 채널의 너비(Wch)보다 작다. 일부 실시예에서, 근위 개구의 폭(Wcon 또는 Wcon1) 은 미세 유체 채널의 폭(Wch)의 약 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 22%, 24%, 25% 또는 30%이다. 즉, 미세유체 채널의 폭 (Wch) 은 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구의 폭 (Wcon 또는 Wcon1) 의 적어도 2.5 배, 3.0 배, 3.5 배, 4.0 배, 4.5 배, 5.0 배, 6.0 배, 7.0 배, 8.0 배, 9.0 배 또는 적어도 10.0 배일 수 있다.
일부 실시양태에서, 채널(122, 322, 618, 718)의 크기 WC (예: 단면 폭 Wch, 직경, 면적 등) 는 챔버 개구, 예를 들어 격리 펜 개구(234, 334) 등의 크기 WO (예: 단면 폭 Wcon, 직경, 면적 등) 의 약 1 과 1/4 (1.25), 약 1 과 1/2 (1.5), 약 2, 약 2 와 1/2 (2.5), 약 3, 또는 그 이상의 배일 수 있다. 이것은 (예를 들어, 도 2b 의 격리 펜(224, 226)과 같은) 선택된 챔버로부터 채널(122, 322, 618, 718)로 확산하고 (예: 격리 펜(228)과 같은) 하류 또는 인접 챔버로 후속적으로 재진입하는 물질에 대한 개구(234, 334)를 통한 2차 유동의 범위 및 확산의 레이트(또는 확산 플럭스)를 감소시킬 수 있다. 분자 (예컨대, 항체와 같은, 관심 있는 피분석물) 의 확산의 레이트는 온도, 매체의 점도, 및 분자의 확산의 계수 D0 를 (제한 없이) 포함하는 다수의 인자들에 종속적이다. 예를 들어, 약 20°C 에서의 수성 용액 내 IgG 항체에 대한 D0 는 약 4.4x10-7 cm2/sec 이며, 반면 세포 배양 배지의 운동학적인 점도는 약 9x10-4 m2/sec 이다. 따라서, 약 20°C 에서의 세포 배양 배지 내 항체는 약 0.5 마이크론/sec 의 확산의 레이트를 가질 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 채널 (122, 322, 618, 718) 로의 224, 226, 228, 324 와 같은 격리 펜에 내에 위치된 생물학적 미세-객체로부터의 확산에 대한 시간 주기는 약 10 분 이하 (예컨대, 약 9, 8, 7, 6, 5 분 이하) 일 수 있다. 확산에 대한 시간 주기는 확산의 레이트에 영향을 주는 파라미터들을 변경함으로써 조작될 수 있다. 예를 들어, 매체들의 온도는 (예컨대, 약 37 ℃ 와 같은 생리적인 온도로) 증가될 수 있거나 (예컨대, 약 15℃, 10℃, 또는 4℃ 로) 감소될 수 있음으로써, 확산의 레이트를 각각 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 배지 내 용질의 농도는 다른 업스트림 펜으로부터의 용질로부터 선택된 펜을 격리하기 위해 본 명세서에서 논의된 바와 같이 증가 또는 감소될 수 있다.
따라서 일부 변형에서, 격리 펜의 연결 영역에 대한 근위 개구에서의 미세유체 채널의 너비(예: Wch) 는 약 50 내지 500 마이크론, 약 50 내지 300 마이크론, 약 50 내지 200 마이크론, 약 70 내지 500 마이크론, 약 70 내지 300 마이크론, 약 70 내지 250 마이크론, 약 70 내지 200 마이크론, 약 70 내지 150 마이크론, 약 70 내지 100 마이크론, 약 80 내지 500 마이크론, 약 80 내지 300 마이크론, 약 80 내지 250 마이크론, 약 80 내지 약 200 마이크론, 약 80 내지 내지 150 미크론, 약 90 내지 500 미크론, 약 90 내지 300 미크론, 약 90 내지 250 미크론, 약 90 내지 200 미크론, 약 90 내지 150 미크론, 약 100 내지 500 미크론, 약 100 내지 300 미크론, 약 100 내지 250 미크론, 약 100 내지 200 미크론, 또는 약 100 내지 150 미크론일 수 있다. 일부 실시예에서, 격리 펜의 연결 영역에 대한 근위 개구에서의 미세유체 채널의 폭 (Wch) 는 약 70 내지 250미크론, 약 80 내지 200미크론, 또는 약 90 내지 150미크론일 수 있다. 챔버(예를 들어, 격리 펜)의 개구의 폭 (Wcon) 은 약 20 내지 100 미크론; 약 30 내지 90 미크론; 또는 약 20 내지 60 미크론일 수 있다. 일부 실시양태에서, Wch 은 약 70-250 미크론이고 Wcon 은 약 20 내지 100 마이크론이고; Wch 은 약 80 내지 200미크론이고 Wcon 은 약 30 내지 90미크론이고; Wch 은 약 90 내지 150 미크론이고, Wcon 은 약 20 내지 60 미크론이고; 또는 Wch 및 Wcon 의 폭들의 임의의 조합이다.
일부 실시형태들에서, 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구 (예를 들어, 234 또는 334) 는 근위 개구에서의 유동 영역/미세유체 채널의 높이 (예를 들어, Hch) 의 2.0 배 이하 (예를 들어, 2.0, 1.9, 1.8, 1.5, 1.3, 1.0, 0.8, 0.5 또는 0.1배) 인 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 을 갖거나, 또한 전술한 값들 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위 내에 있는 값을 갖는다.
일부 실시형태들에서, 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구 (예를 들어, 234 또는 334) 의 폭 (Wcon1) 은 그 분리 영역에 대한 원위 개구 (예를 들어, 238 또는 338) 의 폭 (Wcon2) 과 동일할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 근위 개구의 폭 (Wcon1) 은 원위 개구의 폭 (Wcon2) 과 상이할 수도 있고, Wcon1 및/또는 Wcon2 는 Wcon 또는 Wcon1 에 대해 설명된 값들 중 임의의 것으로부터 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 근위 개구 및 원위 개구를 한정하는 벽들 (연결 영역 벽을 포함함) 은 서로에 대해 실질적으로 평행할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 근위 개구 및 원위 개구를 한정하는 벽들은 서로에 대해 평행하지 않도록 선택될 수도 있다.
연결 영역의 길이 (예를 들어, Lcon) 는 약 1-600 미크론, 5-550 미크론, 10-500 미크론, 15-400 미크론, 20-300 미크론, 20-500 미크론, 40-400 미크론, 60-300 미크론, 80-200 미크론, 약 100-150 미크론, 약 20-300 미크론, 약 20-250 미크론, 약 20-200 미크론, 약 20-150 미크론, 약 20-100 미크론, 약 30-250 미크론, 약 30-200 미크론, 약 30-150 미크론, 약 30-80 미크론, 약 30-50 미크론, 약 45-250 미크론, 약 45-200 미크론, 약 45-100 미크론, 약 45-80 미크론, 약 45-60 미크론, 약 60-200 미크론, 약 60-150 미크론, 약 60-100 미크론 또는 약 60-80 미크론일 수 있다. 전술한 것은 단지 예들이며, 연결 영역의 길이 (예를 들어, Lcon) 는 위에 열거된 값들 중 임의의 값 사이의 값이 되도록 선택될 수 있다.
격리 펜의 연결 영역 벽은 격리 펜의 연결 영역의 근위 개구의 폭 (예를 들어, Wcon 또는 Wcon1) 의 적어도 0.5 배, 적어도 0.6 배, 적어도 0.7 배, 적어도 0.8 배, 적어도 0.9 배, 적어도 1.0 배, 적어도 1.1 배, 적어도 1.2 배, 적어도 1.3 배, 적어도 1.4 배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.75 배, 적어도 2.0 배, 적어도 2.25 배, 적어도 2.5 배, 적어도 2.75 배, 적어도 3.0 배, 또는 적어도 3.5 배인 길이(예를 들어, Lwall) 를 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 연결 영역 벽은 약 20-200 미크론, 약 20-150 미크론, 약 20-100 미크론, 약 20-80 미크론, 또는 약 20-50 미크론의 길이 (Lwall) 를 가질 수도 있다. 전술한 것은 단지 예들이며, 연결 영역 벽은 상기 열거된 값들 중 임의의 값 사이에 있도록 선택된 길이 (Lwall) 를 가질 수도 있다.
격리 펜은 약 40-600 미크론, 약 40-500 미크론, 약 40-400 미크론, 약 40-300 미크론, 약 40-200 미크론, 약 40-100 미크론 또는 약 40-80 미크론의 길이 (Ls) 를 가질 수도 있다. 전술한 것은 단지 예들이며, 격리 펜은 상기 열거된 값들 중 임의의 값 사이에 있도록 선택된 길이 (Ls) 를 가질 수도 있다.
일부 실시형태들에 따르면, 격리 펜은 지정된 높이 (예를 들어, Hs) 를 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 20 미크론 내지 약 200 미크론 (예를 들어, 약 20 미크론 내지 약 150 미크론, 약 20 미크론 내지 약 100 미크론, 약 20 미크론 내지 약 60 미크론, 약 30 미크론 내지 약 150 미크론, 약 30 미크론 내지 약 100 미크론, 약 30 미크론 내지 약 60 미크론, 약 40 미크론 내지 약 150 미크론, 약 40 미크론 내지 약 100 미크론, 또는 약 40 미크론 내지 약 60 미크론) 의 높이 (Hs) 를 갖는다. 전술한 것은 단지 예들이며, 격리 펜은 상기 열거된 값들 중 임의의 값 사이에 있도록 선택된 높이 (Hs) 를 가질 수도 있다.
격리 펜의 근위 개구에서의 연결 영역의 높이 (Hcon) 는 다음 높이 중 임의의 것 내의 높이일 수 있다: 20-100 마이크론, 20-90 마이크론, 20-80 마이크론, 20-70 마이크론, 20-60 마이크론, 20-50 마이크론, 30-100 마이크론, 30-90 마이크론, 30-80 마이크론, 30-70 마이크론, 30-60 마이크론, 30-50 마이크론, 40-100 마이크론, 40-90 마이크론, 40-80 마이크론, 40-70 마이크론, 40-60 마이크론, 또는 40-50 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 연결 영역의 높이 (Hcon) 는 위에서 열거된 임의의 값들 사이인 것으로 선택될 수 있다. 전형적으로, 연결 영역의 높이 (Hcon) 는 연결 영역의 근위 개구에서의 미세유체 채널의 높이 (Hch) 와 동일하도록 선택된다. 또한, 격리 펜의 높이 (Hs) 는 전형적으로 연결 영역의 높이 (Hcon) 및/또는 미세유체 채널의 높이 (Hch) 와 동일하도록 선택된다. 일부 실시형태들에서, Hs, Hcon, 및 Hch 는 선택된 미세유체 디바이스에 대해 상기 열거된 값들 중 임의의 것과 동일한 값이 되도록 선택될 수도 있다.
분리 영역은 단지 1, 2, 3, 4, 5, 또는 유사한 상대적으로 작은 수의 미세-물체들만을 포함하도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 분리 영역은 10 초과, 50 초과 또는 100 초과의 미세-물체들을 포함할 수도 있다. 따라서, 고립 영역의 체적은, 예를 들어, 적어도 1x104, 1x105, 5x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 6x106, 1x107, 3x107, 5x107, 1x108, 5x108, 또는 8x108 입방 미크론, 또는 그 이상일 수 있다. 전술한 것은 단지 예들이며, 분리 영역은 위에 열거된 값들 중 임의의 것 사이에 있도록 선택된 다수의 미세-물체들 및 부피들 (예를 들어, 1x105 입방 미크론과 5x105 입방 미크론 사이, 5x105 입방 미크론과 1x106 입방 미크론 사이, 1x106 입방 미크론과 2x106 입방 미크론 사이, 또는 2x106 입방 미크론과 1x107 입방 미크론 사이의 부피) 을 포함하도록 구성될 수 있다.
일부 실시형태들에 따르면, 미세유체 디바이스의 격리 펜은 지정된 부피를 가질 수도 있다. 격리 펜 (또는 격리 펜의 분리 영역) 의 특정 부피는 단일 세포 또는 소수의 세포들 (예를 들어, 2-10 또는 2-5) 이 매질을 신속하게 컨디셔닝할 수 있고 이에 의해 양호한 (또는 최적의) 성장 조건을 달성할 수 있도록 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 5x105, 6x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 8x106, 1x107, 3x107, 5x107, 또는 약 8x107 세제곱 마이크론, 또는 그 초과의 체적을 가진다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜의 부피는 약 1 나노리터 내지 약 50 나노리터, 2 나노리터 내지 약 25 나노리터, 2 나노리터 내지 약 20 나노리터, 약 2 나노리터 내지 약 15 나노리터, 또는 약 2 나노리터 내지 약 10 나노리터이다. 전술한 것은 단지 예들이며, 격리 펜은 상기 열거된 값들 중 임의의 값 사이인 임의의 값이 되도록 선택된 부피를 가질 수도 있다.
일부 실시형태들에 따르면, 미세유체 채널 (예를 들어, 122 또는 322) 내의 유체 매질의 흐름은 특정된 최대 속도 (예를 들어, Vmax) 를 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 최대 속도 (예를 들어, Vmax) 는 약 0.2, 0.5, 0.7, 1.0, 1.3, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.7, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 또는 25 마이크로리터/초로 설정될 수도 있다. 전술한 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 내의 유체 매질의 흐름은 상기 열거된 값들 중 임의의 값 사이의 값이 되도록 선택된 최대 속도 (예를 들어, Vmax) 를 가질 수 있다. 미세유체 채널 내의 유체 매체의 흐름은 일반적으로 Vmax 보다 낮은 속도로 흐를 수 있다. Vmax 는 채널 및 그에 대해 개방되는 격리 펜들의 특정 크기와 수에 따라 달라질 수 있으며, 유체 매체는 Vmax 를 초과하지 않고 약 0.1마이크로리터/초에서 약 20마이크로리터/초; 약 0.1 마이크로리터/초 내지 약 15 마이크로리터/초; 약 0.1 마이크로리터/초 내지 약 12 마이크로리터/초, 약 0.1 마이크로리터/초 내지 약 10 마이크로리터/초; 약 0.1 마이크로리터/초 내지 약 7 마이크로리터/초로 흐를 수 있습니다. 일반적인 작업 흐름의 일부에서, 유체 매체의 유속은 약 0.1마이크로리터/초; 약 0.5 마이크로리터/초; 약 1.0 마이크로리터/초; 약 2.0 마이크로리터/초; 약 3.0 마이크로리터/초; 약 4.0 마이크로리터/초; 약 5.0 마이크로리터/초; 약 6.0 마이크로리터/초; 약 7.0 마이크로리터/초; 약 8.0 마이크로리터/초; 약 9.0 마이크로리터/초; 약 10.0 마이크로리터/초; 약 11.0 마이크로리터/초; 또는 전술한 값 중 2개로 정의된 임의의 범위, 예를 들어 1-5 마이크로리터/초 또는 5-10 마이크로리터/초일 수도 있다. 미세유체 채널에서의 유체 매체의 유속은 약 12 마이크로리터/초; 약 10 마이크로리터/초; 약 8마이크로리터/초, 또는 약 6마이크로리터/초 이하일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스는 본 명세서에 논의된 임의의 실시형태에서와 같이 구성된 격리 펜들을 가지고, 여기서 미세유체 디바이스는 약 5 내지 약 10 개의 격리 펜, 약 10 내지 약 50 개의 격리 펜, 약 25 내지 약 200 개의 격리 펜, 약 100 내지 약 500 개의 격리 펜, 약 200 내지 약 1000 개의 격리 펜, 약 500 내지 약 1500 개의 격리 펜, 약 1000 내지 약 2500 개의 격리 펜, 약 2000 내지 약 5000 개의 격리 펜, 약 3500 내지 약 7000 개의 격리 펜, 약 5000 내지 약 10,000 개의 격리 펜, 약 7,500 내지 약 15,000 개의 격리 펜, 약 12,500 내지 약 20,000 개의 격리 펜, 약 15,000 내지 약 25,000 개의 격리 펜, 약 20,000 내지 약 30,000 개의 격리 펜, 약 25,000 내지 약 35,000 개의 격리 펜, 약 30,000 내지 약 40,000 개의 격리 펜, 약 35,000 내지 약 45,000 개의 격리 펜, 또는 약 40,000 내지 약 50,000 개의 격리 펜을 갖는다. 격리 펜은 모두 동일한 크기일 필요는 없으며 다양한 구성들 (예를 들어, 상이한 폭들, 격리 펜 내의 상이한 특징들) 을 포함할 수 있다.
도 2g 는 일 실시형태에 따른 마이크로유체 디바이스 (280) 를 예시한다. 도 2g 에서 예시된 미세유체 디바이스 (280) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 양식화된 다이어그램이다. 실제로, 미세유체 디바이스 (280) 및 그 구성 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널들 (122) 및 챔버들 (128)) 은 본원에 논의된 치수들을 가질 것이다. 도 2g에 예시된 미세유체 회로(120)는 2 개의 포트들(107), 4 개의 별개의 채널들(122)및 4 개의 별개의 흐름 영역들(106)을 갖는다. 미세유체 디바이스 (280) 는 각각의 미세유체 채널 (122) 에서 개방된 복수의 챔버들을 더 포함한다. 도 2g 에 예시된 미세유체 디바이스에서, 챔버들은 도 2c 에 예시된 챔버들과 유사한 지오메트리를 갖고, 따라서 양자의 접속 영역들 및 고립 영역들을 갖는다. 따라서, 마이크로유체 회로 (120) 는 스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내의 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 채널들 (122)) 및 비-스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내에 있지 않은 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 고립 영역들 (240)) 양자 모두를 포함한다.
도 3b 및 도 3c 는 본 개시에 따른 미세유체 디바이스들 (예를 들어, 100, 200, 230, 250, 280, 290, 300, 400, 500, 900, 1000, 1100, 1200) 을 동작 및 관측하는데 사용될 수 있는 시스템 (150) 의 다양한 실시형태들을 나타낸다. 도 3b 에 예시된 바와 같이, 시스템 (150) 은 미세유체 디바이스 (320), 또는 본 명세서에서 설명된 임의의 다른 미세유체 디바이스를 보유하도록 구성된 구조 ("네스트 (nest)") (305) 를 포함할 수 있다. 네스트 (305) 는 마이크로유체 디바이스 (320) (예를 들어, 광학적으로-작동된 동전기 디바이스 (100)) 와 인터페이스하고 전원 (192) 으로부터 마이크로유체 디바이스 (320) 로 전기적 접속들을 제공할 수 있는 소켓 (301) 을 포함할 수 있다. 네스트 (305) 는 집적된 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 더 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (303) 은, 바이어싱 전압이, 마이크로유체 디바이스가 소켓 (301) 에 의해 홀딩되는 경우 마이크로유체 디바이스 (320) 내의 전극들의 쌍 양단에 인가되도록 바이어싱 전압을 소켓 (301) 에 공급하도록 구성될 수 있다. 따라서, 전기적 신호 생성 서브시스템 (303) 은 전원 (192) 의 부분일 수 있다. 마이크로유체 디바이스 (320) 에 바이어싱 전압을 인가하는 능력은, 바이어싱 전압이, 마이크로유체 디바이스 (320) 가 소켓 (301) 에 의해 홀딩되는 경우 항상 인가될 것이라는 것을 의미하지는 않는다. 차라리, 대부분의 경우들에서, 바이어싱 전압은 간헐적으로, 예를 들어 마이크로유체 디바이스 (320) 에서 유전영동 또는 전기습윤과 같은 동전기적 힘들의 생성을 용이하게 하도록 필요할 때에만, 인가될 것이다.
도 3b 에 예시된 바와 같이, 네스트 (305) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCBA) (322) 를 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (303) 은 PCBA (322) 상에 장착되고 이 안에 전기적으로 집적될 수 있다. 예시적인 지지체는 PCBA (322) 상에 또한 장착된 소켓 (301) 을 포함한다.
통상적으로, 전기 신호 생성 서브시스템 (303) 은 파형 생성기 (미도시) 를 포함할 것이다. 전기 신호 생성 서브시스템 (303) 은 파형 생성기로부터 수신된 파형을 증폭시키도록 구성된 파형 증폭 회로 (미도시) 및/또는 오실로스코프 (미도시) 를 더 포함할 수 있다. 오실로스코프는, 존재하는 경우, 소켓 (301) 에 의해 보유된 미세유체 디바이스 (320) 에 적용된 파형을 측정하도록 구성될 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 오실로스코프는 미세유체 디바이스 (320) 에 근접한 (및 파형 생성기에 대해 먼) 위치에서 파형을 측정하고, 따라서 디바이스에 실제로 적용된 파형을 측정하는데 있어서 더 큰 정확도를 보장한다. 오실로스코프 측정으로부터 얻어진 데이터는, 예를 들어 파형 생성기에 피드백으로서 제공될 수 있고, 파형 생성기는 이러한 피드백에 기초하여 그의 출력을 조정하도록 구성될 수 있다. 적합한 결합된 파형 생성기 및 오실로스코프의 예는 Red Pitaya™ 이다.
특정 실시형태들에서, 네스트 (305) 는 제어기 (307), 예컨대 전기적 신호 생성 서브시스템 (303) 을 감지 및/또는 제어하는데 사용된 마이크로프로세서를 더 포함한다. 적합한 마이크로프로세서들의 예들은 Arduino™ 마이크로프로세서들, 예컨대 Arduino Nano™ 을 포함한다. 제어기 (307) 는 기능들 및 분석을 수행하는데 사용될 수도 있고, 또는 기능들 및 분석을 수행하도록 (도 1a 에 도시된) 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수도 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 제어기 (307) 는 인터페이스 (309)(예를 들어, 플러그 또는 커넥터) 를 통해 마스터 제어기 (154) 와 통신한다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (305) 는 Red Pitaya™ 파형 생성기/오실로스코프 유닛 ("Red Pitaya 유닛") 및 Red Pitaya 유닛에 의해 생성된 파형을 증폭시키고 증폭된 전압을 마이크로유체 디바이스 (320) 로 패스하는 파형 증폭 회로를 포함하는 전기적 신호 생성 서브시스템 (303) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, Red Pitaya 유닛은 마이크로유체 디바이스 (320) 에서 증폭된 전압을 측정하고, 그 후, 마이크로유체 디바이스 (320) 에서 측정된 전압이 원하는 값이도록 필요에 따라 그 자신의 출력 전압을 조정하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 파형 증폭 회로는, 마이크로유체 디바이스 (320) 에서 최대 13 Vpp 의 신호를 초래하는, PCBA (322) 상에 장착된 DC-DC 컨버터들의 쌍에 의해 생성된 +6.5V 내지 -6.5V 전력 공급을 가질 수 있다.
도 3b 에서 예시된 바와 같이, 지지 구조체 (305) (예컨대, 네스트) 는 열 제어 서브시스템 (306) 을 더 포함할 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 지지 구조 (305) 에 의해 보유된 미세유체 디바이스 (320) 의 온도를 조절하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 열 제어 서브시스템 (306) 은 펠티어 열전기 디바이스 (미도시) 및 냉각 유닛 (미도시) 을 포함할 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스는 마이크로유체 디바이스 (320) 의 적어도 하나의 표면과 인터페이스하도록 구성된 제 1 표면을 가질 수 있다. 냉각 유닛은, 예를 들어 냉각 블록 (미도시), 이를 테면 액냉식 (liquid-cooled) 알루미늄 블록일 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스의 제 2 표면 (예를 들어, 제 1 표면의 반대 표면) 은 이러한 냉각 블록의 표면과 인터페이스하도록 구성될 수 있다. 냉각 블록은 냉각 블록을 통해 냉각된 유체를 순환시키도록 구성된 유체 경로 (314) 에 접속될 수 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 지지 구조 (300) 는 인렛 (315) 및 아웃렛 (318) 를 포함하여, 외부 저장소 (미도시) 로부터 냉각된 유체를 수신하고, 냉각된 유체를 유체 경로 (314) 안으로 그리고 냉각 블록을 통해 도입하며, 그 후 냉각된 유체를 외부 저장소로 리턴한다. 일부 실시형태들에서, 펠티어 열전기 디바이스, 냉각 유닛, 및/또는 유체 경로(314)는 지지 구조(305)의 케이싱(312) 상에 장착될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 미세유체 디바이스 (320) 에 대한 타겟 온도를 달성하도록 펠티어 열전기 디바이스의 온도를 조절하도록 구성된다. 펠티어 열전기 디바이스의 온도 조절은, 예를 들어 Pololu™ 열전기 전력 공급기 (Pololu Robotics and Electronics Corp.) 와 같은 열전기 전력 공급기에 의해 달성될 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 아날로그 회로에 의해 제공된 온도 값과 같은 피드백 회로를 포함할 수 있다. 대안적으로, 피드백 회로는 디지털 회로에 의해 제공될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (305) 는 (예를 들어, 저항 1 kOhm+/-0.1 %, 온도 계수 +/-0.02 ppm/CO 를 갖는) 저항기 및 (예를 들어, 공칭 저항 1 kOhm+/-0.01 % 를 갖는) NTC 서미스터를 포함하는 아날로그 분압기 회로 (미도시) 인 피드백 회로를 갖는 열 제어 서브시스템 (306) 을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 피드백 회로로부터의 전압을 측정하고, 그 후 온-보드 PID 제어 루프 알고리즘에 대한 입력으로서 계산된 온도 값을 사용한다. PID 제어 루프 알고리즘으로부터의 출력은, 예를 들어 Pololu™ 모터 드라이브 (미도시) 상에서 방향성 및 펄스-폭-변조 신호 핀 양자 모두를 구동하여 열전기 전력 공급기를 작동시키고, 이에 의해 펠티어 열전기 디바이스를 제어할 수 있다.
네스트 (305) 는, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서가 인터페이스 (310) (도시되지 않음) 를 통해 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신하는 것을 허용하는 직렬 포트 (324) 를 포함할 수 있다. 또한, 제어기 (307) 의 마이크로프로세서는 전기적 신호 생성 서브시스템 (303) 및 열 제어 서브시스템 (306) 과 (예를 들어, Plink 툴 (미도시) 을 통해) 통신할 수 있다. 따라서, 제어기 (307), 인터페이스 (309), 및 직렬 포트 (324) 의 조합을 통해, 전기적 신호 생성 서브시스템 (303) 및 열 제어 서브시스템 (306) 은 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수 있다. 이 방식으로, 마스터 제어기 (154) 는, 다른 것들 중에서, 출력 전압 조정들을 위한 스케일링 계산들을 수행함으로써 전기 신호 생성 서브시스템 (304) 을 도울 수 있다. 외부 마스터 제어기 (154) 에 커플링된 디스플레이 디바이스 (170) 를 통해 제공된 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) (미도시) 는 열 제어 서브시스템 (306) 및 전기 신호 생성 서브시스템 (303) 각각으로부터 얻어진 온도 및 파형 데이터를 플롯 (plot) 하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, GUI 는 제어기 (307), 열 제어 서브시스템 (306), 및 전기 신호 생성 서브시스템 (303) 에 대한 업데이트들을 허용할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 시스템 (150) 은 촬상 디바이스 (194) 를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 촬상 디바이스 (194) 는 광 조절 서브시스템 (350) (도 3c 참조) 을 포함한다. 광 조절 서브시스템 (335) 은 디지털 미러 디바이스 (DMD) 또는 마이크로셔터 어레이 시스템 (MSA) 을 포함할 수 있고, 이들 중 어느 하나는 광원 (332) 으로부터 광을 수신하고 수신된 광의 서브세트를 현미경 (450) 의 광학 트레인으로 송신하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 광 조절 서브시스템 (335) 은 그 자신의 광을 생산하고 (따라서 광원 (332) 에 대한 필요성을 없애는) 디바이스, 예컨대 유기 발광 다이오드 디스플레이 (OLED), 액정 온 실리콘 (LCOS) 디바이스, 강유전성 액정 온 실리콘 디바이스 (FLCOS), 또는 투과형 액정 디스플레이 (LCD) 를 포함할 수 있다. 광 조절 서브시스템 (335) 은, 예를 들어 프로젝터일 수 있다. 따라서, 광 조절 서브시스템 (350) 은 구조화된 및 구조화되지 않은 광 양자 모두를 방출할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 시스템 (150) 의 촬상 모듈 (164) 및/또는 동기 모듈 (162) 은 광 조절 서브시스템 (330) 을 제어할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 촬상 디바이스 (194) 는 현미경 (350) 을 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 네스트 (305) 및 광 조절 서브시스템 (335) 은 현미경 (350) 상에 장착되도록 개별적으로 구성될 수 있다. 현미경 (350) 은, 예를 들어 표준 연구-등급 광 현미경 또는 형광 현미경일 수 있다. 따라서, 네스트(305)는 현미경(350)의 스테이지(344) 상에 장착되도록 구성될 수도 있고/있거나 광 변조 서브시스템(335)은 현미경(350)의 부분 상에 장착하도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 본원에 설명된 네스트 (305) 및 광 조절 서브시스템 (335) 은 현미경 (350) 의 일체형 컴포넌트들일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 현미경 (450) 은 하나 이상의 검출기들 (348) 을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 검출기 (348) 는 촬상 모듈 (164) 에 의해 제어된다. 검출기 (348) 는 아이 피스 (eye piece), 전하-결합 디바이스 (CCD), 카메라 (예를 들어, 디지털 카메라), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 2 개의 검출기들 (348) 이 존재하면, 하나의 검출기는 예를 들어, 고속-프레임율 (fast-frame-rate) 카메라일 수 있는 한편, 다른 검출기는 고 감도 카메라일 수 있다. 또한, 현미경 (350) 은 마이크로유체 디바이스 (320) 로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고, 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부분을 하나 이상의 검출기들 (348) 상에 포커싱하도록 구성된 광학 트레인을 포함할 수 있다. 현미경의 광학 트레인은 또한, 각각의 검출기 상의 최종 배율이 상이할 수 있도록, 상이한 검출기들에 대한 상이한 튜브 렌즈들 (미도시) 을 포함할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 촬상 디바이스 (194) 는 적어도 2 개의 광원들을 사용하도록 구성된다. 예를 들어, 제 1 광원 (332) 은 (예를 들어, 광 조절 서브시스템 (335) 을 통해) 구조화된 광을 생산하도록 사용될 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 제공하도록 사용될 수 있다. 제 1 광원 (332) 은 광학적으로-작동된 전기역학 및/또는 형광성 여기를 위해 구조화된 광을 생산할 수 있고, 제 2 광원 (333) 은 밝은 필드 조명을 제공하도록 사용될 수 있다. 이들 실시형태들에서, 동기 모듈 (164) 은 제 1 광원 (332) 을 제어하도록 사용될 수 있고, 촬상 모듈 (164) 은 제 2 광원 (333) 을 제어하도록 사용될 수 있다. 현미경 (350) 의 광학 트레인은 (1) 디바이스가 네스트 (305) 에 의해 홀딩되는 경우, 광 조절 서브시스템 (335) 으로부터 구조화된 광을 수신하고, 이 구조화된 광을 광학적으로-작동된 전기역학 디바이스와 같은 마이크로유체 디바이스에서의 적어도 제 1 영역에 포커싱하고, (2) 마이크로유체 디바이스로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고 이러한 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부를 검출기 (348) 로 포커싱하도록 구성될 수 있다. 광학 트레인은 또한, 디바이스가 네스트 (305) 에 의해 홀딩되는 경우, 제 2 광원으로부터 비구조화된 광을 수신하고, 이 비구조화된 광을 마이크로유체 디바이스의 적어도 제 2 영역 상에 포커싱하도록 구성될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스의 제 1 및 제 2 영역들은 오버랩하는 영역들일 수 있다. 예를 들어, 제 1 영역은 제 2 영역의 서브세트일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (333) 은 추가적으로 또는 대안적으로, 임의의 적합한 파장의 광을 가질 수 있는 레이저를 포함할 수 있다. 도 3c에 도시된 광학 시스템의 도시는 단지 개략적인 도시이며, 광학 시스템은 추가 필터들, 노치 필터들, 렌즈들 등을 포함할 수 있다. 제 2 광원 (333) 이 레이저 조명 이외에 브라이트필드 및/또는 형광성 여기를 위한 하나 이상의 광원(들)을 포함하는 경우, 광원(들)의 물리적 배열은 도 3c에 도시된 것과 달라질 수 있고, 그리고 광학 시스템 내의 임의의 적합한 물리적 위치에 레이저 조명이 도입될 수 있다. 광원 (333) 및 광원 (332)/광 변조 서브시스템 (335) 의 개략적인 위치가 인터체인징될 수 있음은 물론이다.
도 3c 에서, 제 1 광원 (332) 은, 시스템 (355)(미도시) 의 현미경 (350) 의 광학 트레인에 구조화된 광을 제공하는, 광 조절 서브시스템 (335) 에 광을 공급하는 것으로 도시된다. 제 2 광원(333)은 비구조화된 광을 빔 스플리터(335)를 통해 광학 트레인에 제공하는 것으로 도시된다. 광 조절 서브시스템 (335) 으로부터의 구조화된 광 및 제 2 광원 (333) 으로부터의 비구조화된 광은 빔 스플리터 (337) 로부터 광학 트레인을 통해 함께 이동하여 제 2 빔 스플리터 (또는 광 조절 서브시스템 (335) 에 의해 제공된 광에 따라, 이색성 필터 (339)) 에 도달하며, 여기서 광은 대물렌즈 (340) 를 통해 샘플 평면 (342) 으로 아래로 반사된다. 샘플 평면 (342) 으로부터 반사 및/또는 방출된 광은 그 후, 대물렌즈 (340) 를 통해, 빔 스플리터 및/또는 이색성 필터 (339) 를 통해, 이색성 필터 (346) 로 위로 다시 이동한다. 이색성 필터 (346) 에 도달하는 광의 일부 만이 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다.
일부 실시형태들에서, 제 2 광원 (333) 은 블루 광을 방출한다. 적합한 이색성 필터 (346) 로, 샘플 평면 (342) 으로부터 반사된 블루 광은 이색성 필터 (346) 를 통과하고 검출기 (348) 에 도달할 수 있다. 반대로, 광 조절 서브시스템 (335) 으로부터 오는 구조화된 광은 샘플 평면 (342) 으로부터 반사되지만, 이색성 필터 (346) 를 통과하지 않는다. 이 예에서, 이색성 필터 (346) 는 495 nm 보다 긴 파장을 갖는 가시 광을 필터링한다. 광 조절 서브시스템 (335) 으로부터의 광의 이러한 필터링은 단지, 광 조절 서브시스템으로부터 방출된 광이 495 nm 보다 짧은 임의의 파장을 포함하지 않는다면 (도시된 바와 같이) 완료될 것이다. 실제로, 광 조절 서브시스템 (335) 으로부터 오는 광이 495 nm 보다 짧은 파장들 (예를 들어, 블루 파장들) 을 포함하면, 광 조절 서브시스템으로부터의 광의 일부는 필터 (346) 를 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다. 이러한 실시형태에서, 필터 (346) 는 제 1 광원 (332) 및 제 2 광원 (333) 으로부터 검출기 (348) 에 도달하는 광의 양 간의 균형을 변화시키도록 작용한다. 이것은, 제 1 광원 (332) 이 제 2 광원 (333) 보다 상당히 더 강한 경우 유리할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (333) 은 레드 광을 방출할 수 있고, 이색성 필터 (346) 는 레드 광 외의 가시 광 (예를 들어, 650 nm 보다 짧은 파장을 갖는 가시 광) 을 필터링할 수 있다.
코팅 용액들 및 코팅제들. 이론에 의헤 제한되도록 의도하지 않고, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 및/또는 EW-구성된 미세유체 디바이스) 내에서의 생물학적 미세-객체 (예를 들어, 생물학적 세포) 의 유지보수는, 미세유체 디바이스와 그 안에 유지되는 생물학적 미세-객체(들) 사이의 일차 인터페이스를 제공하는 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 미세유체 디바이스의 적어도 하나 이상의 내부 표면들이 컨디셔닝 또는 코팅된 경우, 용이하게 될 수도 있다 (즉, 생물학적 미세-객체는 미세유체 디바이스 내에서 증가된 생존 능력, 더 큰 증식 및/또는 더 큰 운반가능성을 나타낸다). 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 내부 표면들 (예컨대, DEP-구성된 미세유체 디바이스의 전극 활성화 기판의 내부 표면, 미세유체 디바이스의 커버, 및/또는 회로 재료의 표면들) 중의 하나 이상은 유기 및/또는 친수성 분자들의 희망된 층을 생성하기 위하여 코팅 용액 및/또는 코팅제로 처리될 수도 있거나 코팅 용액 및/또는 코팅제에 의해 개질될 수도 있다.
코팅은 생물학적 미세-객체(들) 의 도입 전 또는 후에 도포될 수도 있거나, 생물학적 미세-객체(들) 과 동시에 도입될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 미세-물체(들) 은 하나 이상의 코팅제들을 포함하는 유체 매질에서 미세유체 디바이스 내로 들여와 질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 미세유체 디바이스) 의 내부 표면(들) 은 미세유체 디바이스 내로 생물학적 미세-객체(들) 의 도입 이전에 코팅제를 포함하는 코팅 용액으로 처리 또는 "프라이밍" 된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 적어도 하나의 표면은 생물학적 미세-객체(들) 의 유지 및/또는 증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 (예를 들어, 이하에 기술된 바와 같이 컨디셔닝된 표면을 제공하는) 코팅 재료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 마이크로유체 디바이스의 실질적으로 모든 내부 표면은 코팅 재료를 포함한다. 코팅된 내부 표면(들) 은 흐름 영역 (예를 들어, 채널), 챔버, 또는 챔버, 또는 이들의 조합의 표면을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 복수의 챔버들 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 다른 실시형태들에서, 복수의 흐름 영역 또는 채널들의 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 일부 실시형태들에서, 복수의 챔버들 각각 및 복수의 채널들 각각의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료들로 코팅된다.
코팅제/용액. 혈청 또는 혈청 인자들, 소 혈청 알부민(BSA), 폴리머들, 계면활성제들, 효소들, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 코팅제/코팅 용액이 사용될 수 있다.
폴리머 계 코팅 재료. 적어도 하나의 내부 표면은 폴리머를 포함하는 코팅 재료를 포함할 수도 있다. 폴리머는 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 적어도 하나의 표면에 바인딩될 수도 있다 (또는 비-구체적으로 유착 (adhere) 될 수도 있음). 폴리머는 블록 폴리머들(및 코폴리머들), 성형 폴리머들(성형 코폴리머들), 및 그래프트 또는 빗살모양 폴리머들(그래프트 코폴리머들)에서 발견되는 바와 같은 다양한 구조성 모티프들을 가질 수도 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 개시된 방법들에 적합할 수도 있다.
폴리머는 알킬렌 에테르 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 매우 다양한 알킬렌 에테르 함유 폴리머들이 여기에 기술된 미세유체 디바이스들에서의 사용을 위해 적합할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 비제한적인 예시의 클래스는 폴리머 사술 내에 상이한 비율들로 및 상이한 위치들에서 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 폴리프로필렌 옥사이드 (PPO) 서브유닛들의 블록들을 포함하는 양쪽 친매성 비이온 블록 코폴리머들이다. Pluronic® 폴리머들 (BASF) 은 이러한 타입의 블록 코폴리머들이고, 살아있는 세포들과 접촉할 때 사용하기에 적합한 것으로 본 기술에서 알려져 있다. 폴리머들은 평균 분자 질량 (MW) 에서 약 2000Da 로부터 약 20KDa 까지의 범위에 있을 수도 있다. 일부 실시형태에서, PEO-PPO 블록 코폴리머는 약 10 보다 큰 (예를 들어, 12-18) 친수성-친유성 균형 (HLB) 을 가질 수 있다. 코팅된 표면을 만드는데 유용한 특정 Pluronic® 폴리머는 Pluronic® L44, L64, P85 및 F127 (F127NF 포함) 을 포함한다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 다른 클래스는 폴리에틸렌 글리콜(PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에티렌 옥사이드(PEO, MW > 100,000)이다. 일부 실시형태에서, PEG는 Mw 가 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 일 수 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 카르복실릭 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 카르복실릭 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리락틱 애시드(PLA)이다. 다른 실시형태에서, 코팅 재료는 폴리머 백본의 말단 또는 폴리머 백본으로부터의 펜던트 중 어느 하나에서 인산염 모이어티를 함유하는 폴리머를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 술폰산 모이어티들을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 술포닉 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리스티렌 술포닉 애시드(PSSA) 또는 폴리아네톨 술포닉 애시드이다. 추가 실시형태에서, 코팅 재료는 아민 모이어티를 포함하는 폴리머를 포함할 수 있다. 폴리아미노 폴리머는 천연 폴리아민 폴리머 또는 합성 폴리아민 폴리머를 포함할 수 있다. 천연 폴리아민의 예에는 스페르민, 스페르미딘 및 퓨트레신을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 당류 모이어티를 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 비-제한적인 예에서, 잔탄검 또는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드들은 미세유체 디바이스에서의 세포 스티킹 (cell sticking) 을 감소시킬 수도 있거나 방지할 수도 있는 재료를 형성하기 위하여 적당할 수도 있다. 예를 들어, 약 3kDa 크기를 갖는 덱스트란 폴리머가 마이크로유체 디바이스 내의 표면을 위한 코팅 재료를 제공하는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 폴리전해질 표면을 제공하는, 리보뉴클레오티드 모이어티들 또는 디옥시리보뉴클레오티드 모이어티들을 가질 수도 있는 뉴클레오티드 모이어티들, 즉, 핵산을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 핵산은 천연 뉴클레오티드 모이어티들만을 포함할 수도 있거나 제한 없이 7-디아자아데닌, 펜토오스, 메틸 포스포네이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티들과 같은 핵염기, 리보오스 또는 포스페이트 모이어티 유사체들을 포함하는 비천연 뉴클레오티브 모이어티들을 포함할 수도 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 아미노산 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 아미노산 모이어티들을 포함하는 폴리머는 천연 아미노산 포함 폴리머 또는 비천연 아미노산 포함 폴리머를 포함할 수도 있으며, 이들 중 어느 것은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 하나의 비-제한적인 예에서, 단백질은 알부민 및/또는 하나 이상의 다른 유사한 단백질들을 코팅제들로서 포함하는 소혈청 알부민 (BSA) 및/또는 혈청 (또는 다수의 상이한 혈청들의 조합) 일 수도 있다. 혈청은 태아 송아지 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 말 혈청 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 편리한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 BSA 는 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 1 mg/mL 로부터 약 100 mg/mL 까지의 농도일 수 있다. 소정의 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 혈청은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 20% (v/v) 로부터 약 50% v/v 까지의 농도에서 존재할 수도 있다. 일부 실시형태들에서는, BSA 가 5 mg/mL 에서의 코팅 용액에서의 코팅제로서 존재할 수도 있는 반면, 다른 실시형태에서는, BSA 가 70 mg/mL 에서의 코팅 용액에서의 코팅제로서 존재할 수도 있다. 특정 실시형태에서, 혈청은 코팅 용액 중의 코팅제로서 30%로 존재한다. 일부 실시형태들에서, 세포외 기질 (ECM) 단백질은 세포 성장을 조성하기 위해 최적화된 세포 부착을 위해 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다. 코팅 재료에 포함될 수도 있는 세포 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, RGD-함유 펩티드 (예를 들어, 피브로넥틴), 또는 라미닌을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태들에서, 성장 인자들, 사이토킨들, 호르몬들 또는 다른 세포 시그널링 종이 마이크로유체 디바이스의 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 또는 아미노 애시드 모이어티들 중 2 이상을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 폴리머 컨디셔닝된 표면은 각각 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 및/또는 아미노 애시드 모이어티들을 갖는 2 이상의 폴리머의 혼합물을 포함할 수도 있으며, 그것은 코팅 재료 내로 독립적으로 또는 동시에 통합될 수도 있다.
공유 결합된 코팅 재료들. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 내부 표면은 이러한 세포들을 위한 컨디셔닝된 표면을 제공하는, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 공유결합으로 연결된 분자들을 포함한다.
공유결합으로 연결된 분자들은 연결 기 (linking group) 를 포함하고, 여기서, 연결 기는 이하에서 설명된 바와 같이, 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들에 공유결합으로 연결된다. 연결 기는 또한, 생물학적 마이크로-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공유결합으로 연결된다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 또는 (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 모이어티들; (덱스트란을 포함할 수도 있지만, 이것으로 제한되지는 않는) 모노- 또는 폴리사카라이드들; (프로파르길 알콜을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는) 알콜들; 폴리비닐 알콜을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 폴리알콜들; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 알킬렌 에테르들; (폴리아크릴산 또는 폴리비닐 포스폰산을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는) 폴리전해질들; (알킬화된 아민들, 히드록시알킬화된 아미노 기, 구아니디늄, 및 모르폴린일 또는 피페라지닐과 같은, 그러나 이것으로 제한되지는 않는 비방향족 질소 링 원자를 함유하는 헤테로사이클릭 기들과 같은, 그러나 이것으로 제한되지는 않는 그 유도체들을 포함하는) 아미노 기들; (카르복실레이트 음이온 표면을 제공할 수도 있는) 프로피올산을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 카르복실산들; (포스포네이트 음이온 표면을 제공할 수도 있는) 에틴일 포스폰산을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는 포스폰산들; 설포네이트 음이온들; 카르복시베타인들; 술포베타인들; 술팜산들; 또는 아미노산들을 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 모이어티, (퍼플루오로알킬을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는) 플루오로알킬 모이어티와 같은 치환된 알킬 모이어티, 아미노산 모이어티, 알콜 모이어티, 아미노 모이어티, 카르복실산 모이어티, 포스폰산 모이어티, 술폰산 모이어티, 술팜산 모이어티, 또는 당류 모이어티와 같은 비-폴리머 모이어티들을 포함할 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 모이어티는 위에서 설명된 모이어티들 중의 임의의 것일 수도 있는 폴리머성 모이어티들을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 알킬 모이어티는 선형 체인 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 14, 16, 18, 20, 22 개, 또는 그 이상의 탄소들의 선형 체인) 을 형성하는 탄소 원자들을 포함할 수도 있고, 비분기형 알킬 모이어티일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬기는 치환된 알킬기 (예를 들어, 알킬기에서의 탄소들의 일부는 플루오르화 또는 퍼플루오르화될 수 있음) 를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬기는 비-치환된 알킬기를 포함할 수도 있는 제 2 세그먼트에 결합된, 퍼플루오로알킬 기를 포함할 수도 있는 제 1 세그먼트를 포함할 수도 있고, 여기서 제 1 및 제 2 세그먼트들은 (예를 들어, 에테르 결합에 의해) 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수도 있다. 알킬기의 제 1 분절은 연결기에서 멀리 위치될 수도 있고, 알킬기의 제 2 분절은 연결기에 근접하여 위치될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티는 2 이상의 타입의 아미노산을 포함할 수도 있는 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수도 있다. 따라서, 공유 결합으로 연결된 모이어티는 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티는 세포 성장, 생존 능력, 운반가능성, 또는 이들의 임의의 조합을 지원하기 위해 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있는 아미노산을 포함할 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 적어도 하나의 알킬렌 옥사이드 모이어티를 포함할 수도 있고, 위에서 설명된 바와 같은 임의의 알킬렌 옥사이드 폴리머를 포함할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 유용한 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태에서, PEG는 Mw 가 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 일 수 있다.
공유 결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 당류를 포함할 수 있다. 공유 결합으로 연결된 당류는 단당류, 이당류, 또는 다당류일 수 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 표면에 대한 부착을 위해 커플링 또는 정교화 (elaboration) 를 허용하는 반응성 페어링 (pairing) 모이어티를 도입하기 위해 개질될 수도 있다. 예시적인 반응성 페어링 모이어티들은 알데히드, 알킨 또는 할로 모이어티들을 포함할 수도 있다. 다당류는 랜덤한 양식으로 개질될 수도 있으며, 여기서 당류 모노머들 각각이 개질될 수도 있거나 다당류 내의 당류 모노머들의 일부만이 표면에 직접 또는 간접으로 커플링될 수도 있는 반응성 페어링 모이어티를 제공하기 위해 개질된다. 하나의 예는 비분지형 연결자를 통해 표면에 간접적으로 커플링될 수도 있는 덱스트란 다당류를 포함할 수도 있다.
공유 결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 아미노기들을 포함할 수도 있다. 아미노기는 치환된 아민 모이어티, 구아니딘 모이어티, 질소 함유 헤테로시클릭 모이어티 또는 헤테로아릴 모이어티일 수도 있다. 아미노 함유 모이어티들은 미세유체 디바이스 내의, 및 선택적으로 챔버들 및/또는 흐름 영역들 (예를 들어, 채널들) 내의 환경의 pH 변경을 허용하는 구조들을 가질 수도 있다.
컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 오직 하나의 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있거나, 하나를 초과하는 상이한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있다. 예를 들어, (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 컨디셔닝된 표면들은 모두 동일한, 예를 들어, 표면에 대한 동일한 연결기 및 공유결합 부착, 동일한 전체 길이, 및 플루오로알킬 모이어티를 포함하는 동일한 수의 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 복수의 공유결합으로 연결된 모이어티들을 가질 수도 있다. 대안적으로, 코팅 재료는 표면에 부착된 2 이상의 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 가질 수도 있다. 예를 들어, 코팅 재료는 특정된 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 공유결합으로 연결된 알킬 또는 플루오로알킬 모이어티들을 가지는 분자들을 포함할 수도 있고, 코팅된 표면에서 더 대량의 모이어티들을 제공하기 위한 용량을 제공할 수도 있는 더 큰 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 알킬 또는 플루오로알킬 사슬에 공유결합으로 부착된 하전된 모이어티 (charged moiety) 들을 가지는 분자들의 추가의 세트를 더 포함할 수도 있다. 이 사례에서, 상이한 덜 입체적으로 요구하는 말단들 및 더 작은 백본 원자들을 가지는 분자들의 제 1 세트는 전체 기판 표면을 기능화하는 것을 도울 수 있음으로써, 기판 자체를 구성하는 실리콘/실리콘 옥사이드, 하프늄 옥사이드, 또는 알루미나와의 비희망된 부착 또는 접촉을 방지할 수 있다. 또 다른 예에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티들은 표면상에서 랜덤한 양식으로 교번하는 전하들을 제시하는 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있다.
컨디셔닝된 표면 특성들. 컨디셔닝된 표면의 조성을 제외하고, 소수성 재료의 물리적인 두께와 같은 다른 인자는 DEP 힘에 영향을 미칠 수 있다. 컨디셔닝된 표면이 기판상에 형성되는 방식(예컨대, 기상증착, 액상 증착, 스핀 코팅, 플러딩, 및 정전 코팅)과 같은 여러 인자들이 컨디셔닝된 표면의 물리적 두께를 변경할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 약 1 nm 내지 약 10 nm; 약 1 nm 내지 약 7 nm; 약 1 nm 내지 약 5 nm 또는 이들 사이의 임의의 개개의 값의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티에 의해 형성된 컨디셔닝된 표면은 약 10 nm 내지 약 50 nm의 두께를 가질 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 본원에서 설명된 바와 같이 준비된 컨디셔닝된 표면은 10 nm 미만의 두께를 가진다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면의 공유결합으로 연결된 모이어티들은 미세유체 디바이스의 표면 (예컨대, DEP 구성된 기판 표면) 에 공유결합으로 연결될 때에 단층을 형성할 수도 있고, 10 nm 미만 (예컨대, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 가질 수도 있다. 이들 값들은 약 30 nm 의 두께를 통상적으로 가질 수도 있는, 예를 들어, 스핀 코팅에 의해 준비된 표면의 값들과 대조적이다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 DEP-구성된 마이크로유체 디바이스 내에서의 동작에 적합하게 관능적이도록 완전하게 형성된 단층을 필요로 하지 않는다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 바람직한 전기적 성질들을 제공할 수도 있다. 이론에 의해 제한하려는 의도는 없지만, 특정 코팅 재료로 코팅된 표면의 강건성에 영향을 미치는 한 가지 요인은 고유 전하 트래핑 (intrinsic charge trapping) 이다. 코팅 재료가 다르면 전자들을 트래핑할 수 있고, 이것은 코팅 재료의 파손을 초래할 수 있다. 코팅 재료의 결함은 전하 트래핑을 증가시키고 코팅 재료의 추가 파괴를 초래할 수 있다. 유사하게, 상이한 코팅 재료들은 전하 트래핑에 영향을 줄 수 있는 상이한 유전 강도들 (즉, 절연 파괴를 일으키는 최소 적용 전계) 을 갖는다. 특정 실시형태들에서, 코팅 재료는 전하 트래핑의 양을 감소시키거나 제한하는 전체 구조 (예를 들어, 고밀도로 팩킹된 단층 구조) 를 가질 수 있다.
전기 특성에 추가하여, 컨디셔닝된 표면은 또한 생물학적 분자와 함께 사용하는데 유리한 특성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 플루오르화된 (또는 퍼플루오르화된) 탄소 사슬을 함유하는 컨디셔닝된 표면은 표면 파울링의 양을 감소시키는데 있어서 알킬 종결된 사슬에 비해 이점을 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 표면 파울링은 마이크로유체 디바이스의 표면상의 무분별한 재료 증착의 양을 지칭하며, 그것은 단백질 및 그것의 분해 생성물들, 핵산들 및 각각의 분해 생성물들 등과 같은 생체재료들의 영구적인 또는 반영구적인 증착을 포함할 수도 있다.
유니터리 (unitary) 또는 멀티-파트 컨디셔닝된 표면. 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 이하에서 설명되는 바와 같이, 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 이미 함유하는 분자의 반응에 의해 형성될 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를, 자체로 표면에 공유결합으로 연결되었던 표면 개질 리간드 (surface modifying ligand) 에 결합함으로써 2-파트 시퀀스로 형성될 수도 있다.
공유 결합으로 연결된 코팅 재료의 제조 방법. 일부 실시형태들에서, (예를 들어, 챔버들 및/또는 흐름 영역들의 적어도 하나의 표면을 포함하는) 미세유체 디바이스의 표면에 공유결합으로 연결되는 코팅 재료는 식 1 또는 식 2 의 구조를 갖는다. 코팅 재료가 하나의 단계에서 표면으로 도입될 때, 그것은 식 1 의 구조를 가지는 반면, 코팅 재료가 다수 단계 프로세스에서 도입될 때에는, 그것이 식 2 의 구조를 가진다.
Figure pct00001
식 1,
또는,
Figure pct00002
식 2
코팅 재료는 DEP-구성된 또는 EW-구성된 기판의 표면의 옥사이드들에 공유결합으로 연결될 수도 있다. DEP-구성된 또는 EW-구성된 기판은 실리콘, 실리콘 옥사이드, 알루미나, 또는 하프늄 옥사이드를 포함할 수도 있다. 옥사이드들은 기판의 타고난 화학적 구조의 일부로서 존재할 수도 있거나, 이하에서 논의된 바와 같이 도입될 수도 있다.
코팅 재료는 산화물들과 실록산 또는 포스포닉 애시드기의 반응으로부터 형성된 실록시 또는 포스포네이트 에스테르기일 수도 있는 연결기 ("LG") 를 통해 산화물들에 부착될 수도 있다. 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 본원에서 설명된 모이어티들 중의 임의의 것일 수 있다. 연결기 (LG) 는 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접속될 수도 있다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 직접 연결되는 경우, 선택적 연결자 ("L") 는 존재하지 않고 n 은 0 이다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 간접으로 연결되는 경우, 연결자 (L) 는 존재하고 n 은 1 이다. 연결기 (L) 는 선형 부분을 포함할 수도 있으며, 여기서 그 선형 부분의 백본은 본 기술에서 알려진 바와 같은 화학 결합 제한들을 받는, 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및/또는 인 원자들의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 200 개의 비수소 원자들을 포함할 수도 있다. 그것은 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도, 및/또는 포스포네이트 기들, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클릭 기들로부터 선택될 수도 있는 하나 이상의 모이어티들의 임의의 조합으로 차단될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 연결자 (L) 의 백본은 10 내지 20 개의 원자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 연결자 (L) 의 백본은 약 5 개의 원자들 내지 약 200 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 80 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 50 개의 원자들; 또는 약 10 개의 원자들 내지 약 40 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 골격 원자는 모두 탄소 원자이다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들)의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 멀티-단계 프로세스에서 기판의 표면에 추가될 수도 있고, 위에서 도시된 바와 같이, 식 2 의 구조를 가진다. 모이어티는 위에서 설명된 모이어티들 중의 임의의 것일 수도 있다.
일부 실시형태에서, 커플링기 (CG) 는 반응성 모이어티 (Rx) 및 반응성 쌍 부분 (Rpx) (즉, 반응성 모이어티 (Rx) 와 반응하도록 구성된 모이어티) 의 반응으로부터의 결과의 기를 나타낸다. 예를 들어, 하나의 통상적인 커플링기 (CG) 는 활성화된 에스테르, 애시드 클로라이드 등과 같은 카르복실릭 애시드의 유도체와 아미노기의 반응의 결과인 카로복사미딜기를 포함할 수도 있다. 다른 CG 는 트리아졸릴렌기, 카르복사미딜, 티오아미딜, 옥심, 메르캅틸, 디술피드, 에테르, 또는 알케닐기, 또는 반응성 모이어티의 그의 각각의 반응성 페어링 모이어티와의 반응 시에 형성될 수도 있는 임의의 다른 적합한 기를 포함할 수도 있다. 결합 기 (CG) 는 위에서 설명된 바와 같은 원소들의 임의의 조합을 포함할 수도 있는 연결자 (L) 의 제 2 단부 (즉, 미세유체 디바이스에서의 생물학적 미세-객체 (들) 의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 대한 근위부인 단부) 에서 위치될 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 커플링기CG 는 연결자 L 의 백본을 차단할 수있다. 결합 기 CG 가 트리아졸일렌일 때, 그것은 클릭 결합 반응 (Click coupling reaction) 으로부터 기인하는 산물일 수도 있고, 추가로 치환될 수도 있다 (예컨대, 디벤조사이클로옥테닐 융합된 트리아졸일렌 기).
일부 실시형태에서, 코팅 재료 (또는 표면 개질 리간드) 는 화학 기상 증착을 사용하여 마이크로유체 디바이스의 내부 표면 상에 증착된다. 기상 증착 프로세스는 예를 들어, 용매 배스 (solvent bath) 로의 노출, 음파처리 (sonication), 또는 그 조합에 의해, 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판 (예컨대, DEP-구성된 기판의 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208), 또는 EW-구성된 기판의 지지 구조체 (104) 의 유전체 층) 을 사전-세정함으로써 임의적으로 개선될 수도 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 그러한 예비 세정은 동시에 산화된 표면 (여기에 기술된 바와 같이 공유결합으로 개질될 수도 있는 표면에서의 산화물들) 을 도입하면서 여러 불순물들을 제거할 수 있는 산소 형질 클리너에서 커버 (110), 마이크로유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 하이드로클로릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 또는 설퓨릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 (예를 들어, 약 3:1 내지 약 7:1 의 설퓨릭 애시드 대 하이드로전 페록사이드의 비를 가질 수도 있는 피라냐 용액) 과 같은 액상 처리들은 산소 플라즈마 클리너 대신에 사용될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 기상 증착은 마이크로유체 디바이스 (200) 가 마이크로유체 회로 (120) 를 정의하는 인클로저 (102) 를 형성하기 위해 조립된 후 마이크로유체 디바이스 (200) 의 내부 표면을 코팅하기 위해 사용된다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 완전히 조립된 마이크로유체 회로 (120) 상에 그러한 코팅 재료를 증착하는 것은 마이크로유체 회로 재료 (116) 와 전극 활성화 기판 (206) 유전체층 및/또는 커버 (110) 사이의 약해진 결합에 의해 야기되는 박리를 방지하는데 유익할 수도 있다. 2-단계 프로세스가 채용되는 실시형태들에서는, 생물학적 마이크로-객체(들)의 유지/확장을 위하여 적당한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티의 후속 도입과 함께, 표면 개질 리간드는 위에서 설명된 바와 같은 기상 증착을 통해 도입될 수도 있다. 후속 반응은 표면 개질된 미세유체 디바이스를 용액에서의 적당한 결합 시약에 노출함으로써 수행될 수도 있다.
도 2h 는 컨디셔닝된 표면을 제공하는 예시적인 공유결합으로 연결된 코팅 재료를 가지는 미세유체 디바이스 (290) 의 단면도를 도시한다. 예시된 바와 같이, 코팅 재료들 (298) (개략적으로 도시됨) 은 미세유체 디바이스 (290) 의 DEP 기판일 수도 있는 기판 (286) 의 내부 표면 (294) 및 커버 (288) 의 내부 표면 (292) 의 양자에 공유결합으로 바인딩된 밀집-팩킹된 분자들의 단층을 포함할 수 있다. 코팅 재료 (298) 는 일부 실시형태들에서, 그리고 위에서 논의된 바와 같이, 미세유체 디바이스 (290) 내의 회로 엘리먼트들 및/또는 구조체들을 정의하기 위하여 이용된 미세유체 회로 재료 (도시되지 않음) 의 표면들을 포함하는, 미세유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 에 대한 근위부이며 미세유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 를 향해 내측으로 대면하는 실질적으로 모든 내부 표면들 (294, 292) 상에서 배치될 수 있다. 대안적인 실시형태들에서, 코팅 재료 (298) 는 마이크로유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들의 단지 하나 또는 일부에만 증착될 수 있다.
도 2h 에서 도시된 실시형태에서, 코팅 재료 (298) 는 유기실록산 분자들의 단층을 포함할 수 있고, 각각의 분자는 실록시 연결자 (296) 를 통해 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들 (292, 294) 에 공유 결합될 수 있다. 위에서 논의된 코팅 재료들 (298) 중의 임의의 것이 이용될 수 있고 (예컨대, 알킬-종단된, 플루오로알킬 종단된 모이어티, PEG-종단된 모이어티, 덱스트란 종단된 모이어티, 또는 유기실록시 모이어티들을 위한 포지티브 또는 네거티브 전하들을 함유하는 말단 모이어티), 여기서, 말단 모이어티는 그 인클로저-대면 말단 (즉, 내부 표면들 (292, 294) 에 바인딩되지 않고 인클로저 (284) 에 대한 근위부인 코팅 재료 (298) 의 단층의 부분) 에서 배치된다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면(들) (292, 294) 을 코팅하기 위하여 이용된 코팅 재료 (298) 는 음이온, 양이온, 또는 쌍성이온 모이어티들, 또는 그 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않으면서, 미세유체 회로 (120) 의 인클로저 (284) 의 내부 표면들에서 양이온 모이어티들, 음이온 모이어티들, 및/또는 쌍성이온 모이어티들을 제공함으로써, 수화의 결과적인 물이 비-생물학적 분자들 (예컨대, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 옥사이드) 와의 상호작용들로부터 생물학적 마이크로-객체들을 분리시키는 층 (또는 "차폐부") 으로서 작동하도록, 코팅 재료 (298) 는 물 분자들과의 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다. 게다가, 코팅 재료 (298) 가 코팅제들과 함께 이용되는 실시형태들에서는, 코팅 재료 (298) 의 음이온들, 양이온들, 및/또는 쌍성이온들이 인클로저 (284) 에서의 매질 (180) (예컨대, 코팅 용액) 에서 존재하는 비-공유 코팅제들 (예컨대, 용액에서의 단백질들) 의 하전된 부분들과의 이온 결합들을 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 그 인클로저-대면 말단에서 친수성 코팅제를 제공하도록 포함할 수도 있거나 화학적으로 개질될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 PEG 와 같은 알킬렌 에테르 함유 폴리머를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드를 포함할 수도 있다. 위에서 논의된 하전된 모이어티들 (예컨대, 음이온, 양이온, 및 쌍성이온 모이어티들) 과 같이, 수화의 결과적인 물이 비-생물학적 분자들 (예컨대, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 옥사이드) 와의 상호작용들로부터 생물학적 미세-객체들을 격리시키는 층 (또는 "차폐부") 으로서 작동하도록, 친수성 코팅제는 물 분자들과의 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다.
적절한 코팅 처리들 및 개질들의 추가의 세부사항들은 2016 년 4 월 22 일자로 출원된 미국 출원 제 15/135,707 호에서 발견될 수도 있고, 그 전체적으로 참조로 편입된다.
미세유체 디바이스의 챔버들 내에서 세포들의 생존성의 유지를 위한 추가적인 시스템 컴포넌트들. 세포 개체군들의 성장 및/또는 확장을 촉진하기 위하여, 기능적인 세포들을 유지하기 위하여 도움이 되는 환경 조건들은 시스템의 추가적인 컴포넌트들에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 추가적인 컴포넌트들은 영양분들, 세포 성장 시그널링 종들, pH 조절, 기체 교환, 온도 제어, 및 세포들로부터의 노폐물들의 제거를 제공할 수 있다.
생물학적 마이크로-오브젝트에 의해 분비된 분석물질을 분석시험하기. 일부 실시형태들에서, 본 개시물은 챔버들에 존재하는 생물학적 분자를 정량화하는 방법들, 시스템들 및 디바이스들을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 분자는 분비된 분석물질을 생성할 수 있는, 생물학적 세포 또는 임의의 다른 생물학적 마이크로-유기체의 분비된 분석물질이다.
생체생산 산업에서, 하나의 심각한 문제는 현재의 가용 기구조작 및 작업흐름들을 채용할 때 원하는 레벨들의 생산 및 성장 습성들을 가지는 클론 개체군들을 식별하는데 드는 비용, 시간 및 어려움이다. 예를 들어, 새로운 항체 생산 라인을 개발하는데는 수개월의 노력이 소요될 수 있으며, 인력, 장비 및 물질들에 수백만 달러의 비용이 들 수 있다. 본원에서 설명된 바와 같이, 개개의 기초 세포들 (founding cells) 을 파종한 후 3, 4, 5, 6, 또는 7 일과 같은 개체군들을 팽창시키는 아주 초기에, 마이크로유체 디바이스 내 유망한 클론들을 스크리닝하여 식별하는 능력은 상당한 시간 및 비용 이점들을 제공할 수 있다. 출원인은, 나노유체 환경, 특히, 본원에서 설명된 바와 같은, 챔버들에 기초한 나노유체 환경이 서로로부터의 클론 개체군들의 모범적인 분리를 제공함으로써, 마이크로유체 디바이스 내에 위치된 다른 클론 개체군들로부터의 오염없이 각각의 개개의 클론 개체군으로부터 분석 결과들을 얻는 능력을 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 또한, 본원에서 설명하는 방법들을 이용하여, 분비된 분석물질의 상대 또는 절대 량을 결정하는 분석들이, 심지어 클론 팽창의 초기 스테이지들에서 수행될 때에도, 더 전형적인 거대규모 스케일의 팽창 (예컨대, 쉐이크 플라스크들, 등) 에서의 원하는 분비된 분석물질의 생산과 상관될 수 있다는 것을 발견하였다. 또, 이러한 초기 스테이지들에서 개개의 클론들을 스크리닝하는 능력은 또한 생장률 및/또는 더 강건한 생산의 특정의 요건들을 만족시키는 원하는 클론들 (예를 들어, 대사 폐기물들 또는 소진된 영양소들과 같은 배양 환경에서 물질의 레벨들에 더 저항력이 있는 고 생산성 클론들) 의 식별을 가능하게 할 수 있다.
출원인에 의해 발견된 다른 이점은 본원에서 설명된 나노유체 챔버들 (예컨대, 챔버들) 이 최고 수천 개의 개개의 기초 세포들에 대해, 동시에 극 소량들로 동시적인 성장/분석을 가능하게 하기 때문에, 클론 개체군에 대한 잠재적인 기초 세포들로서의 복수의 세포들의 더 완전한 탐색이 과도한 리소스들의 사용 없이 이루어질 수 있다는 것이다.
추가적으로, 본원에서 설명되는 나노유체 환경은 반복된 분석시험들로부터의 피드백에 의해, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 가능하게 한다. 예를 들어, 세포의 분비된 생성물 (본원에서의 방법들에서는 분석물질) 의 대규모 생산과 더 밀접하게 관련된, 배양 배지와 같은, 조건들 및 물질들이 추가적인 검사에 가장 적합한 클론들을 발견하고 특성화하기 위해 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극에 대한 다양한 자극 프로토콜들은 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜에 대한 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교가능하게 평가하기 위해 분석될 수도 있다.
확산 프로파일들을 이용한 검출 및 정량화. 앞에서 설명한 바와 같이, 생물학적 마이크로-오브젝트의 분비된 분석물질의 양은 분비된 분석물질에 결합하는 리포터 분자를 이용하여 정량화될 수도 있다. 리포터 분자는 정량화될 분비된 분석물질을 결합하는 결합 성분, 및 리포터 분자의 양을 검출하는데 사용되는 신호 성분을 포함한다. 리포터 분자는 (예컨대, 분비된 분석물질의 하나 이상의 분자들에 결합된) 그의 결합된 상태에서보다 (예컨대, 분비된 분석물질에 결합되지 않은) 그의 비결합된 상태에서 더 높은 확산 레이트를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 비결합된 분자와 결합된 리포터 분자 사이의 확산 레이트에서의 차이는 리포터 분자가 결합하는 분비된 분석물질 분자(들) 의 사이즈의 함수일 것이다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 분비된 분석물질을 확산의 레이트를 늦추는 형태로 결합할 수도 있다. 예를 들어, 리포터 분자는 분비된 분석물질의 다수의 복제본들을, 분비된 분석물질이 집합되어 부분적으로 그의 형태로 인해 느리게 확산하는 형태로, 결합할 수도 있다. 본원에서 설명하는 방법들은 분비된 분석물질의 양을 정량화하기 위해 (비결합된) 리포터 분자와 결합된 리포터 분자:분석물질 복합체 (RMSA) 사이의 확산의 레이트에서의 차이들을 이용한다.
마이크로유체 채널에서의 유동 조건들 하에서의 확산 분석. 도 4a 내지 도 4c 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른 분석을 예시한다. 도 4a 에서, 검출가능한 라벨을 각각 가지는, 리포터 분자들 (412) 이, 유동 (242) 내 리포터 분자들 (412) 의 농축물을 포함하는 유체를 미세유체 디바이스 (400) 의 채널 (122) 로 유동시킴으로써 미세유체 채널 (122) 로 도입된다. 챔버들 424, 426, 428 은 생물학적 분석물질 410 을 분비하는 다수의 세포들 402, 404, 406 을 포함하는 마이크로유체 채널 122 에 각각 유체 연결된다. 챔버들 424, 426, 428 의 각각은 연결 영역 436 및 분리 영역 440 을 포함한다 (챔버 424 은 단지 명료성을 위해 그렇게 라벨링된 펜이다). 연결 영역 436 및 분리 영역 440 은 위에서 설명한 바와 같은 속성들을 가지며, 채널 122 로 도입되는 물질들의 접촉을 제한한다 (예컨대, 분리 영역 440 내에서, 채널 122 내에서 유동하는 물질들은 분리 영역으로의 직접 유동에 의하지 않고, 단지 확산에 의해 분리 영역으로 진입할 수도 있다.) 도 4a 에 예시된 시점에서, 분비된 피분석물 (410) 의 분자들은 세포들의 근위에 있다.
도 4b 는 후속 시점에서 도 4a 에서와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 리포터 분자들 412 은 리포터 분자들 412 의 농도가 채널 122 과 챔버들 424, 426, 428 의 내부들 사이에 평형이 되도록, 채널 122 및 챔버들 424, 426, 428 내에서 빨리 확산할 수 있다. 도 4b 에 예시된 바와 같이, 리포터 분자들 (412) 은 정상-상태 농도에 도달하여, 챔버들 (424, 426, 428) 내에서 실질적으로 균일해 진다. 리포터 분자 412 를 포함하는 배지의 유동 242 은 어떤 리포터 분자 412 도 포함하지 않는 배지의 유동 242 으로 대체되며, 채널 122 은 상당량들의 리포터 분자를 포함하지 않는다.
각각의 챔버 424, 426, 428 내 리포터 분자들 412 이 분비된 분석물질 410 의 분자들과 접촉함에 따라, 리포터 분자들 412 은 분석물질 410에 결합하여, 리포터 분자:분석물질 복합체 414 를 형성하고, 그리고 분비된 분석물질 410 의 양에 관련된 국부화된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 유동 242 이 계속됨에 따라, 리포터 분자들은 챔버로부터 확산하여, 채널 122 에 진입하고 마이크로유체 디바이스로부터 배출된다. 그러나, 도 4b 에 나타낸 바와 같이, 리포터 분자:피분석물 착체 (410) 의 확산은 그의 더 큰 분자량 (및 유효 사이즈) 으로 인해, 비결합된 리포터 분자 (412) 의 확산보다 더 느리며, 달리, 챔버들 (424, 426, 428) 로부터 급격하게 확산하지 않는다.
도 4c 는 분비된 피분석물 (410) 및 리포터 분자:피분석물 착체들 (414) 이 분비된 피분석물 (410) 의 소스 (예컨대, 세포들 (402, 404, 406)) 로부터 채널 (122) 로 확산하는 후속 시점에서, 도 4a 및 도 4b 에서와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 유동 242 은 채널 122 내에서 계속하며, 이에 의해 리포터 분자 412 가 각각의 챔버 424, 426, 428 으로부터 리포터 분자:분석물질 복합체 410 보다 더 빨리 확산가능하게 한다.
분비된 분석물질 분자들 410 이 리포터 분자들 412 보다 더 큰 분자량 (및 용액에서의 연관된 유효 사이즈) 을 가질 수도 있기 때문에, 리포터 분자: 분석물질 복합체는 더 느리게 확산한다. 분비된 분석물질이 항체이고 리포터 분자가 펩티드 또는 압타머인 실시형태들에서, 분자량에서의 차이가 상당하다. 어쨌든, 결합된 리포터 분자:분석물질 복합체 414 의 중량 (따라서, 사이즈) 은 비결합된 리포터 분자 412 의 중량보다 더 크며, 따라서, 리포터 분자:분석물질 복합체 414 가 비결합된 리포터 분자 412 보다 더 느리게 확산하여, 비결합된 리포터 분자들 412 에 의해 제공되는 균일한 신호에 비해, 명확한 확산 프로파일 및 연관된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 추가적으로, 생물학적 마이크로-오브젝트들 502, 504, 506 은 분석물질 410 을 계속 분비하여, 챔버들 524,526,528 내에 여전히 배치된 리포터 분자들 412 과 결합하기 위한 더 많은 타겟들을 제공한다. 챔버로부터 확산하거나 또는 이미 확산된 비결합된 리포터 분자들의 퍼센티지가 임계값을 초과함으로써, 실질적으로 또는 뚜렷하게 단지 각각의 챔버 424, 426, 428 내 리포터 분자:분석물질 복합체 414 로부터의 검출가능한 신호의 이미징을 가능하게 하는, 시점이 선택될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 분석시험 이미지는 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들 412 의 양이 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 전술한 값들 중 2개로 정의된 임의의 범위일 때 얻어진다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 실시형태들에서, 분석시험 이미지는 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들 412 의 양이 챔버로부터 확산되는 결합된 리포터 분자:분석물질 복합체들 414 의 양보다 더 큰 약 1.25X, 1.5X, 2.0X, 2.5X, 3.0X, 3.5X, 4.0X, 4.5X, 5.0X, 7.5X, 10X, 25X, 50X, 또는 100X 일 때 얻어진다.
분석시험 이미지에서 얻어진 검출가능한 신호들은 챔버들에서의 생물학적 마이크로-오브젝트들의 개수에 비례할 수도 있다. 챔버 424 은 6 개의 생물학적 마이크로-오브젝트들을 포함하는 것으로 예시되며, 챔버 426 은 4 개의 생물학적 마이크로-오브젝트들을 포함하는 것으로 예시되며, 챔버 428 은 2 개의 생물학적 마이크로-오브젝트들을 포함하는 것으로 예시되며, 그리고 일부 실시형태들에서, 개별 챔버들로부터의 분석 신호는 이들 세포들의 수들에 비례할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분석물질의 분비는 분석 신호 획득 시간에서의 세포 사이클 상태에 의존할 수도 있으며, 복수의 챔버들의 각각으로부터의 신호는 각각의 챔버 내 세포들의 수에 실질적으로 비례하지 않을 수도 있다. 추가적으로, 도 4c 에 예시된 바와 같이, 세포들 (402, 404, 406) 의 모두는 피분석물 (410) 을 분비하고 있는 동안, 세포들의 상이한 개체군들 (예컨대, 상이한 클론들) 은 생물학적 피분석물 (410) 을 다양한 레이트들로 분비할 수도 있다. 따라서, 발생된 분석물질 410 의 양 (및 리포터 분자:분석물질 복합체 414 로부터 검출된 결과적인 확산 프로파일 신호의 강도) 은 심지어, 각각의 챔버에 존재하는 세포들 402, 404, 406 의 개수에 대해 정규화되더라도, 챔버마다, 동일하지 않을 수도 있다. 이미지화된 챔버들 424, 426, 428 내에서의 분비된 분석물질 410 의 양을 특성화하는데 사용될 수도 있는 하나 이상의 분석시험 이미지들이 이 시간 기간 동안 얻어질 수도 있다. 생성된 분비된 분석물질 410 의 양의 상대 또는 절대 정량화에 도달하기 위해 수행되는 분석의 설명은 다음과 같다.
상술된 바와 같이, 분비된 분석물질 분자들이 리포터 분자들 보다 더 큰 분자량 (및 용액에서의 연관된 유효 사이즈) 을 가질 수도 있기 때문에, 리포터 분자: 분비된 분석물질 (RMSA) 복합체는 더 느리게 확산한다. 분비된 분석물질이 항체이고 리포터 분자가 펩티드 또는 압타머인 실시형태들에서, 분자량에서의 차이가 상당하다. 어쨌든, 결합된 RSMA 복합체의 중량 (따라서, 크기) 은 비결합된 리포터 분자의 중량보다 더 크며, 따라서, RSMA 복합체는 비결합된 리포터 분자보다 더 느리게 확산하여, 비결합된 리포터 분자들에 의해 제공되는 균일한 신호에 비해, 명확한 확산 프로파일 및 연관된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다.
결합되지 않은 리포터와 RMSA 복합체 간의 분자량 차이에 대한 키 입력은 소분자량 분자(소분자량의 분비된 분석물)의 생산을 포함하는 워크플로에 대해 여기에서 논의된 일부 분석 방법의 호환성에 영향을 미칠 수 있다. 확산 속도는 자연적으로 해당 컴포넌트의 무게/크기의 산물이고 뚜렷한 확산 프로파일은 가치 있는 검출 가능한 신호가 수집되는 것을 허용하기 때문에, 세포에 의해 분비되는 소분자량 분자와 결합할 때 분석 시약의 확산을 늦추는 방법이 분명하지 않은 것 같다. 따라서, 이것은 결합된 형광 종과 자유 형광 종 사이의 확산 속도에서의 식별 가능한 차이를 야기하지 않을 수도 있으며, 따라서 필요한 검출 가능한 신호를 수집하는 데 필요한 확산 프로파일을 얻는 명확한 경로를 야기하지 않는 것으로 보인다. 이러한 문제를 극복함으로써, 본 명세서에 개시된 다양한 실시예는 예를 들어, 작은 대사산물, 바이오연료, 또는 다른 관심 소분자의 분비와 관련하여 구현될 수 있다.
소분자의 생산량을 측정하는 것은, 예를 들어, 다양한 실시양태에 따른 세포주 발달 분석을 역전시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서 더 밝은 형광 챔버는 가장 높게 생산하는 세포주가 아니라 더 약하게 생산하는 세포주를 나타낼 것이다. 한 예에서, 소분자 표적에 결합하는 것으로 알려진 분자(예를 들어, "앵커(anchor)"로 지칭되는 큰 분자량 단백질 또는 단백질 복합체)는 먼저 관심 표적의 형광 버전으로 오프-칩(off-chip) 결합될 것이다. 이 형광 복합체(앵커 + 형광 표적)는 표적의 비형광 버전을 분비할 수 있는 세포를 포함하는 챔버 내를 포함하여 칩 전체에 걸쳐 평형을 이룰 것이다. 이러한 라벨링되지 않은 표적의 존재하에, 결합 역학은 챔버 내에서 훨씬 더 높은 농도에서 라벨링되지 않은 표적과 라벨링된 표적의 교환을 구동할 것이다. 일정 시간 동안 채널을 깨끗하게 플러싱한 후, 앵커에 의해 결합되지 않은 형광 표적은 챔버로부터 빠르게 확산할 것이다. 결과적으로, 이 플러시에 후속하는 형광 수준을 판독할 때, 조광기 관찰된 챔버는 더 작은 분자량 표적을 분비하는 챔버와 동일할 것이다.
도 33a 내지 도 33c 는 다양한 실시형태들에 따른, 이러한 방법의 예를 도시한다. 도 33a 에서, 결합된 형광 분자(3720)(라벨링된 표적)를 갖는 고-MW 앵커 단백질(3710)(예를 들어, 항체)은 세포(3760) 및 분비된 비라벨링 표적(3730)을 함유하는 챔버(3750)에 도입된다. 도 33b에서, 결합 역학은 라벨링된 표적(3720)과 표지되지 않은 표적(3730)의 교환을 구동한다. 예를 들어, 가장 많은 양의 FcIII 펩티드를 생산하는 세포를 찾는 것이 목표라고 가정한다. 이를 달성하기 위해, 상기 관점에서, 앵커 오프 칩에 미리 결합된 표지된 FcIII를 추가할 수 있다. 이 표지된 표적을 챔버에 도입한 후, 시간이 지남에 따라 세포에서 분비되는 표지되지 않은 FcIII와 앵커에 미리 평형화된 표지된 FcIII 사이의 챔버에서의 교환이 발생할 것이다. 마지막으로, 도 33c 에서, 교환이 완료되고 채널이 플러시되어 결합되지 않은 형광 표적이 펜 밖으로 확산되는 것을 허용한다. 거기에서부터, 표준 이미지 캡처 및 분석(여기에서 논의됨)을 사용하여 형광 수준을 관찰할 수 있다. 그러나 높은 분비 수준을 나타내는 더 밝은 챔버를 찾는 것과 달리, 결합되지 않은 형광 표적이 제거되기 때문에 조광기 챔버는 더 많은 소분자 표적을 분비한다.
미세유체 채널에서 비-유동 조건들 하에서의 확산 분석. 도 5a 내지 도 5c 는 본 개시물의 일 실시형태에 따른 분석을 예시한다. 도 5a 에서, 검출가능한 라벨을 각각 가지는 리포터 분자들 (412) 이 리포터 분자들 (412) 의 농축물을 포함하는 유체를 채널 (122) 로 유동시킴으로써 미세유체 디바이스 (500) 의 미세유체 채널 (122) 로 도입된다. 도 5a 는 또한 생물학적 피분석물 (410) 을 분비하는 다수의 세포들 (502, 504, 506) 을 포함하는 미세유체 채널 (122) 에 유체 흐름 가능하게 연결된 챔버들 (524, 526, 528) 을 나타낸다. 챔버들 524, 526, 528 의 각각은 연결 영역 536 및 분리 영역 540 을 포함한다 (챔버 524 은 단지 명료성을 위해 라벨링된 펜이다). 연결 영역 536 및 분리 영역 540 은 위에서 설명한 바와 같은 속성들을 가지며, 채널 122 에 도입된 물질들의 접촉을 제한한다 (예컨대, 분리 영역 540 내에서, 채널 122 내에서 유동하는 물질들은 분리 영역으로의 직접 유동이 아닌, 단지 확산에 의해, 분리 영역에 진입할 수도 있다.) 도 5a 에 예시된 시점에서, 분비된 피분석물 (410) 의 분자들은 세포들에 인접한다.
도 5b 는 추후 시점에서 도 5a 와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 리포터 분자들 412 은 리포터 분자들 412 의 농도가 채널 122 과 챔버들 524, 526, 528 의 내부들 사이에 평형이 되도록, 채널 122 및 챔버들 524, 526, 528 내에서 빨리 확산할 수 있다. 도 5b 에 예시된 바와 같이, 리포터 분자들 (412) 은 정상-상태 농도 평형에 도달하여, 비결합된 리포터 분자들 (412) 의 농도가 챔버들 (524, 526, 528) 및 채널 (122) 에서 실질적으로 균일할 수 있다. 채널에서의 유동은 리포터 분자들 412 의 농도가 챔버들 524, 526, 528 내로 평형될 때 중지된다. 리포터 분자들 412 이 분비된 분석물질 410 의 분자들과 접촉함에 따라, 리포터 분자들 412 은 분석물질 410 에 결합하여, 리포터 분자:분석물질 복합체 414 를 형성하고, 그리고 분비된 분석물질 410 의 양에 관련된 국부화된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다.
도 5c 는 분비된 피분석물 (410) 및 리포터 분자:피분석물 착체들 (414) 이 분비된 피분석물 (410) 의 소스 (예컨대, 세포들 (502, 504, 506)) 로부터 채널 (122) 로 확산하고 있는 또다른 추후 시점에서 도 5a 및 도 5b 에서와 동일한 미세유체 디바이스의 영역을 예시한다. 이 시점에서, 채널 122 에는 어떤 유동도 없다.
위와 같이, 분비된 분석물질 분자들 410 은 리포터 분자들 412 보다 큰 분자량 (및, 용액에서의 연관된 유효 사이즈) 을 가질 수도 있다. 따라서, 리포터 분자:분석물질 복합체 414 는 비결합된 리포터 분자 412 보다 더 느리게 확산하여, 비결합된 리포터 분자들 412 에 의해 제공되는 균일한 신호에 비해, 명확한 확산 프로파일 및 연관된 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 추가적으로, 생물학적 마이크로-오브젝트들 502, 504, 506 은 분석물질 410 을 계속 분비하여, 챔버들 524,526,528 내에 여전히 배치된 리포터 분자들 412 과 결합하기 위한 더 많은 타겟들을 제공한다.
확산 프로파일들 및/또는 연관된 신호들은 챔버들 내 생물학적 마이크로-오브젝트들의 개수에 비례할 수도 있다. 챔버 524 은 6 개의 생물학적 마이크로-오브젝트들을 포함하는 것으로 예시되며, 챔버 526 은 4 개의 생물학적 마이크로-오브젝트들을 포함하는 것으로 예시되며, 챔버 528 은 2 개의 생물학적 마이크로-오브젝트들을 포함하는 것으로 예시된다. 어떤 다른 실시형태들에서, 그러나, 개별 챔버들 524, 526, 528 에서의 세포들 502, 504, 506 은 분석물질 410 을 대략 동일한 레이트로 분비할 수도 있으며, 리포터 분자:분석물질 복합체들 414 로부터의 검출된 신호의 결과적인 강도는 각각의 챔버에 존재하는 세포들 502, 504, 506 의 개수에 비례할 수도 있다. 그러나, 분석물질의 분비는 분석 신호 획득 시간에서의 세포 사이클 상태에 의존할 수도 있다. 또, 도 5c 에 예시된 바와 같이, 세포들 (502, 504, 506) 의 모두는 피분석물을 분비하는 동안, 세포들의 상이한 개체군들 (예컨대, 상이한 클론들) 은 생물학적 피분석물 (410) 을 다양한 레이트들로 분비할 수도 있다. 따라서, 발생된 분석물질 410 의 양 (및 리포터 분자:분석물질 복합체 414 로부터 검출된 결과적인 확산 프로파일 신호의 강도) 은 심지어, 각각의 챔버에 존재하는 세포들 502, 504, 506 의 개수에 대해 정규화되더라도, 챔버마다, 동일하지 않을 수도 있다. 이미지화된 챔버들 524, 526, 528 내에서의 분비된 분석물질 410 의 양을 특성화하는데 사용될 수도 있는 하나 이상의 분석시험 이미지들이 이 시간 기간 동안 얻어질 수도 있다. 생성된 분비된 분석물질 410 의 양의 상대 또는 절대 정량화에 도달하기 위해 수행되는 분석의 설명은 다음과 같다.
분비된 분석물들. 생물학적 마이크로-오브젝트에 의해 분비된 분석물질은 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 가지는 유기 분자, 소포, 바이러스, 및 이들의 임의의 조합일 수도 있다. 분비된 분석물질은 자연적으로 발현된 분석물질일 수도 있거나 (예컨대, 자연적으로 발현될 수도 있거나) 또는 생체공학적 분석물질 (예컨대, 유전자 삽입, 결실, 변형 및 기타 등등에 기인하는 생성물) 일 수도 있다. 핵산인 분비된 분석물질은 리보 또는 디옥시 핵산일 수도 있으며, 천연 또는 비천연 뉴클레오티드들을 포함할 수도 있다. 바이러스인 분비된 분석물질은 바이러스 입자, 벡터 또는 파지일 수도 있다. 사카라이드인 분비된 분석물질은 모노-, 디- 또는 폴리사카라이드일 수도 있다. 사카라이드들의 비한정적인 예들은 글루코스, 트레할로스, 마노스, 아라비노오스, 프룩토오스, 리보오스, 잔탄 또는 키토산을 포함할 수도 있다. 분비된 작은, 유기 분자는 바이오연료들, 오일들, 중합체들, 또는 조제약들, 예컨대 매크로라이드 항생제들을 포함할 수도 있지만, 이에 한정되지 않는다. 단백질인 분비된 분석물질은 항체 또는 항체의 단편일 수 있다. 단백질인 분비된 분석물질은 혈액 단백질, 예컨대 알부민, 글로불린 (예컨대, 알파2-고분자글로불린, 감마 글로불린, 베타-2 저분자글로불린, 합토글로불린), 보충 단백질 (예컨대, 컴포넌트 3 또는 4), 트랜스페린, 프로트롬빈, 알파 1 항트립신, 및 기타 등등; 호르몬, 예컨대 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 성장 호르몬, 성장 인자들 (예컨대, FGF, HGF, NGF, EGF, PDGF, TGF, 에리스로포이에틴, IGF, TNF), 난포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 렙틴, 및 기타 등등; 섬유 단백질, 예컨대 실크 또는 세포외 기질 단백질 (예컨대, 파이브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 비트로넥틴, 테나신, 베르시칸, 골 시알로단백질); 효소, 예컨대 메탈로프로테아제 (예컨대, 기질 매트릭스 메탈로프로테나제 (MMP)) 또는 다른 유형의 프로테아제 (예컨대, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 아스파라긴 펩티드 리아제), 아밀라아제, 셀룰라아제, 카탈라아제, 펙티나아제, 및 기타 등등; 박테리아, 효모, 또는 원생동물 단백질; 식물 단백질; o 또는 바이러스 단백질, 예컨대 캡시드 또는 엔벨로프 단백질일 수 있다. 단백질인 분비된 분석물질은 항체, 항체의 단편, (단백질 분해 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는) 효소, 예를 들어, 알부민과 같은 조작된 (통상적으로는 세포내 단백질) 단백질, 및/또는 (누에 실크 또는 거미 실크를 포함하지만 이에 한정되지 않는) 구조 단백질일 수 있다. 이 리스트에는 제한이 없으며, 분비되도록 조작될 수도 있는 임의의 단백질이 이 방법들에 의해 평가될 수도 있다. 분비된 분석물질은 항체-약물 접합체일 수도 있다. 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 갖는 유기 분자, 및/또는 바이러스의 조합을 가질 수도 있는 분비된 분석물질의 비한정적인 예는 프로테오글리칸 또는 당단백질을 포함할 수 있다.
리포터 분자들 및 이들의 특성들. 리포터 분자는 분비된 분석물질에 결합하도록 설계된 결합 성분을 포함할 수도 있으며, 또한 검출가능한 라벨을 포함할 수도 있다. 결합 성분은 분비된 분석물질을 결합하도록 구성된 임의의 적합한 결합 파트너일 수도 있다. 결합 성분은 단백질, 펩티드, 핵산 또는 3Kd 미만인 분자량을 가지는 소형 유기 분자일 수도 있다. 예를 들어, 결합 성분은 다른 핵산 시퀀스를 특이적으로 결합하는 핵산 시퀀스, 또는 단백질 (예컨대, 특정의 항체를 인식하는 에피토프) 에 특이적으로 결합하는 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 결합 성분은 생물학적 마이크로-오브젝트의 분비된 분석물질들의 패밀리에 비특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 결합 성분은 IgG 도메인에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 핵산 시퀀스들의 패밀리에 존재하는 도메인에 결합하는 핵산일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 다가이며, 분비된 분석물질의 하나 보다 많은 복제본에 결합하기 위해 또는 분비된 분석물질들의 패밀리의 하나 보다 많은 멤버에 결합하기 위해 하나 보다 많은 결합 성분을 포함한다. 설명의 용이성을 위해, 용어 분비된 분석물질은, 본원에서 사용될 때, 특정의 분비된 분석물질 분자 또는 분비된 분석물질들의 패밀리를 지칭할 수 있다. 따라서, RMSA 복합체의 화학양론은 변할 수 있다. 예를 들어, 분비된 분석물질의 하나의 복제본을 결합하는 리포터 분자는 1:1 화학양론을 갖는 RMSA 복합체를 가질 수도 있다. 대안적으로, RMSA 복합체는 리포터 분자: 분비된 분석물질의 2:1, 3:1, 4:1, 2:2, 4:2, 또는 다른 화학양론을 가질 수도 있다. 리포터 분자는 분자량에 의존하는 리포터 분자:피분석물 착체의 확산 특성들에 의해 정의된 바와 같은, 겉보기 "사이즈" 가 비결합된 리포터 분자들과 RMSA 착체들 사이의 차동 확산을 관측하기 위해 리포터 분자 자체보다 충분히 "더 크다" 는 규정에 따라, 임의의 적합한 분자량을 가질 수도 있다. 리포터 분자는 분비된 분석물질의 분자량의 약 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 동일 분자량인 분자량을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 분자량은 분비된 분석물질의 분자량의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만이다. RMSA 복합체의 분자량은 리포터 분자의 분자량보다, 적어도 2X, 4X, 10X, 20X, 30X, 40X, 50X 또는 이들 사이의 임의의 수일 수도 있다. RMSA 복합체의 분자량은 비결합된 리포터 분자의 분자량보다 2 배, 4 배 또는 50 배 더 클 수도 있다.
분비된 분석물질들: 항체들의 하나의 클래스에 대한 리포터 분자들. 항체들에 결합하는데 적합한 리포터 분자들은 IgG 의 영역들을 결합하도록 구성된, 단백질들, 펩티드들 및 압타머들을 포함한다. 항체를 검출하기 위해 리포터 분자 내에서의 사용에 적합한 결합 성분들의 비한정적인 리스트가 테이블 1 에 나타내어진다.
표 1. 항체들을 검출하기 위한 리포터 분자의 결합 성분들로서의 화합물들.
CPD IgG 에 대한 친화도 분자량 (MW) 식별
1 나노몰 42kDa 단백질 A-AF594, 피어스TM 재조합 단백질 A (ThermoFisher Cat. # 77674)
2 나노몰 65kDa 단백질 G-AF594, 피어스TM 재조합 단백질 G (ThermoFisher Cat. # 21193)
3 NA (Fc) 약 2.4kDa SEQ ID NO. 9
4 100nM (Fc) 약 2.4kDa SEQ ID NO. 10
5 75 nm (hIgG 의 Fc) 약 .8kDa SEQ ID NO. 11압타머-AF594, Apta-IndexTM (Apt.8, ID#44, Aptagen, LLC.)
6 8.6 nm (Fc) 약 12kDa 압타머 IgG Fc C02 #369 (Base Pair Technologies ATW0018
7 NA, (Fc) ~2kDa 내지 약 4.5kDa SEQ ID. NO. 1
8 NA, (Fc) ~2kDa 내지 약 4.5kDa SEQ ID. NO. 2
9 NA, (Fc) ~2kDa 내지 약 4.5kDa SEQ ID. NO. 3
10 NA, (Fc) 2kDa 내지 약 4.5kDa SEQ ID. NO. 4
11 NA, (Fc) ~2kDa 내지 약 2.4kDa SEQ ID. NO. 5
12 NA, (Fc) ~2kDa 내지 약 2.4kDa SEQ ID. NO. 6
13 NA, (Fc) ~2kDa 내지 약 2.4kDa SEQ ID. NO. 7
14 NA, (Fc) ~2.4kDa SEQ ID. NO. 8
CPD들 1-14 중 임의의 것이 본원에서 설명되는 분석들에 사용될 수 있다. 위에 나열된 CPD 들 중 일부는 IgG의 Fc 도메인에 결합하는 것으로 알려진 작은 펩티드이다(CPD 4 및 7-14의 경우, DeLano WL, et al. (2000), Science 287:1279-1283, 및 미국 특허 제 7608681B2 호를 참조, 이들의 각각의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 전부 통합된다).
CPD 3 은 Asp Ser Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr (SEQ ID NO: 9) 의 구조를 갖는다.
CPD 4 는 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr (SEQ ID NO: 10) 의 구조를 갖는다.
CPD 7 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20, (SEQ ID NO: 1) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa2 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa3 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa4 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa6 은 임의의 아미노산이고; Xaa7 은 임의의 아미노산이고; Xaa8 은 임의의 아미노산이고; Xaa9 는 임의의 아미노산이고; Xaa10 은 임의의 아미노산이고; Xaa11 은 임의의 아미노산이고; Xaa16 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa17 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa18 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa19 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노산이거나 부재이다.
CPD 8 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20, (SEQ ID NO: 2) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa2 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa3 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa4 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa6 은 임의의 아미노산이고; Xaa7 은 임의의 아미노산이고; Xaa8 은 임의의 아미노산이고; Xaa9 는 임의의 아미노산이고; Xaa16 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa17은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa18 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa19 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노산이거나 부재이다.
CPD 9 는 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20, (SEQ ID NO: 3) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa2 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa3 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa4 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa6 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이고; Xaa7 은 Trp 또는 Tyr 이고; Xaa8 은 His 또는 Trp 이고; Xaa9 는 Leu 또는 Met 이고; Xaa16 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa17은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa18 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa19 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노산이거나 부재이다.
CPD 10 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20, (SEQ ID NO: 4) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa2 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa3 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa4 는 Ser, Arg, 또는 Asp 이고; Xaa5 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa6 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이고; Xaa7 은 Trp 또는 Tyr 이고; Xaa8 은 His 또는 Trp 이고; Xaa9 는 Leu 또는 Met 이고; Xaa16 은 Glu, Ser, Thr, 또는 Val 이고; Xaa17은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa18 은 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa19 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; 그리고 Xaa20 은 임의의 아미노산이거나 부재이다.
CPD 11 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6- Xaa7-Xaa8-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13, (SEQ ID NO: 5) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa3 은 임의의 아미노산이고; Xaa4 는 임의의 아미노산이고; Xaa5 는 임의의 아미노산이고; Xaa6 은 임의의 아미노산이고; Xaa7 은 임의의 아미노산이고; Xaa8 은 임의의 아미노산이고; 그리고 Xaa13 은 임의의 아미노산이거나 부재이다.
CPD 12 는 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13, (SEQ ID NO: 6) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa3 은 임의의 아미노산이고; Xaa4 는 임의의 아미노산이고; Xaa5 는 임의의 아미노산이고; Xaa6 은 임의의 아미노산이고; 그리고 Xaa13 은 임의의 아미노산이거나 부재이다.
CPD 13 은 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13, (SEQ ID NO: 7) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 임의의 아미노산이거나 부재이고; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa3 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이고; Xaa4 는 Trp 또는 Tyr 이고; Xaa5 는 His 또는 Trp 이고; Xaa6 은 Leu 또는 Met 이고; 그리고 Xaa13 은 임의의 아미노산이거나 부재이다.
CPD 14 는 Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa13, (SEQ ID NO: 8) 의 구조를 가지며, 여기서: Xaa1 는 Ser, Arg, 또는 Asp 이고; Xaa2 는 Cys 또는 Ser 이고; Xaa3 은 Ala, Ser, 또는 Thr 이고; Xaa4 는 Trp 또는 Tyr 이고; Xaa5 는 His 또는 Trp 이고; Xaa6 은 Leu 또는 Met 이고; 그리고 Xaa13 은 Glu, Ser, Thr, 또는 Val 이다.
결합 성분은 IgG 에 대해 높은 친화력 (예컨대, 테이블 1 의 CPD 1 및 CPD 2 에 대해 알려진 바와 같은 나노몰) 을 가지는 물질로 한정되지 않는다. 일부 실시형태들에서, 약 100 밀리몰 또는 1 마이크로몰보다 큰 친화력들을 가지는 결합 성분들이 항체들을 검출하기 위해 이 확산 기반의 분석에 성공적으로 사용될 수도 있다.
다른 유형들의 분비된 분석물질들에 대해, 리포터 분자들의 상이한 유형들의 결합 성분들이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 비가역성 프로테아제 억제제는 세린 또는 시스테인 프로테아제들에 대한 플루오로메틸 케톤 억제제와 같은, 단백질분해 효소를 검출하는데 사용될 수도 있다. 사카라이드들 또는 매크로라이드 항생제들과 같은 조작된 분석물질들에 대한 압타머들이 사용될 수도 있다. 항체들 또는 그의 단편들이 알부민들, 구조 단백질들, 또는 매크로라이드 항생제들을 검출하는데 사용될 수도 있다. 당업계에서 공지되어 있는 바와 같은, 분비된 분석물질에 대한 임의의 적합한 결합 성분이 사용될 수도 있다.
리포터 분자: 정제 태그. 현재의 세포주 개발 분석은 항체에 공통적인 Fc 영역의 존재에 의존할 수 있다. 그러나 합성 생물학 애플리케이션들을 위해 생산된 많은 치료 단백질 및 단백질은 이러한 모이어티가 부족하고, 따라서 특정 세포주 개발 분석과 호환되지 않을 수도 있다. 이러한 비항체 단백질 중 다수는 정제에 사용되는 짧은 아미노산 "태그들” 을 도입하는 유전적으로 인코딩된 잔기를 이미 포함하거나 포함하도록 설계될 수 있다.
다양한 실시양태에 따르면, 현재의 온-칩 역가 분석은 정제 태그(즉, 정제에 사용되는 짧은 아미노산 "태그")에 특이적인 형광 표지된 소분자를 사용하도록 수정될 수 있다. 이 수정은 현재 많은 세포주 개발 분석에 접근할 수 없는 많은 종류의 단백질에 대한 솔루션을 허용한다.
한 예에서, 헥사히스티딘(HIS6) 태그는 관심 있는 단백질의 N- 또는 C-말단으로 인코딩된다; 이 태그는 후속적으로 헥사히스티딘에 높은 친화력으로 특이적으로 결합하는 Ni-NTA (Nα,Nα-bis(카르복시메틸)-L-리신, 니켈(II) 착물) 컬럼을 사용하여 HIS6-라벨링된 단백질을 정제하는 데 사용된다. 이 화학적 상호작용을 활용하여 HIS6 태그를 예를 들어, 시그마로부터의 Ni-NTA-Atto 콘주게이트들과 같은 형광 표지된 종으로 라벨링할 수 있다. 업계에서 잘 알려진 바와 같이 Ni-NTA-Atto 콘주게이트는 HIS-태그된 융합 단백질의 특이적이고 매우 민감한 검출을 제공할 수 있다. Atto 염료에 콘주게이트된 Ni-NTA-Atto 복합체는 폴리히스티딘 태그에 특이적이며 최소 교차 반응성으로 수행할 수 있다. 구체적으로, 각 Ni-NTA 모이어티는 한 쌍의 히스티딘 측쇄들에 결합하고 각 Ni-NTA 는 형광단으로 라벨링될 수 있다. 더구나, 2개 또는 3개의 Ni-NTA 모이어티가 함께 가교되어 결합 친화도를 증가시킬 수 있다.
저분자량 분비물을 위한 리포터 복합체. 상술된 바와 같이, 소분자 (저분자량 분비물) 의 생산량을 측정하는 것은, 예를 들어, 다양한 실시양태에 따른 세포주 발달 분석을 역전시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서 더 밝은 형광 챔버는 가장 높게 생산하는 세포주가 아니라 더 약하게 생산하는 세포주를 나타낼 것이다. 이를 제공하기 위해, 소분자 표적에 결합하는 것으로 알려진 분자(예를 들어, "앵커(anchor)"로 지칭되는 큰 분자량 단백질 또는 단백질 복합체)는 먼저 관심 표적의 형광 버전으로 오프-칩(off-chip) 결합될 수 있다. 이 형광 리포터 복합체(앵커 + 형광 표적)는 표적의 비형광 버전을 분비할 수 있는 세포를 포함하는 챔버 내를 포함하여 칩 전체에 걸쳐 평형을 이룰 수 있다. 이러한 라벨링되지 않은 표적의 존재하에, 결합 역학은 챔버 내에서 훨씬 더 높은 농도에서 라벨링되지 않은 표적과 라벨링된 표적의 교환을 구동할 것이다. 일정 시간 동안 채널을 깨끗하게 플러싱한 후, 앵커에 의해 결합되지 않은 형광 표적은 챔버로부터 빠르게 확산할 것이다. 결과적으로, 이 플러시에 후속하는 형광 수준을 판독할 때, 조광기 관찰된 챔버는 더 작은 분자량 표적을 분비하는 챔버와 동일할 것이다.
검출가능한 라벨. 리포터 분자는 또한 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 검출가능한 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다. 형광물질, 로다민, 시아닌, 페난트렌 또는 임의의 다른 종류의 형광 염료 라벨을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 적합한 형광 라벨이 사용될 수도 있다. 유용한 형광 염료 라벨들의 일부 예들은 (리포터 분자의 결합 성분의 레벨링을 위한 티오이소시아네이트 활성 종으로서 이용가능한) 형광물질 Alexa Fluor® 594 ((AF594, ThermoFisher Scientific, Cat. No. A20004 (NHS 에스테르)) MW 819.8, Ex/Em590/617 nm) 또는 HiLyte FluorTM 555 (AnaSpec Inc., Cat. # AS-81250) MW 869, Ex/Em 550/566 nm (Cy3 필터) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자, 예컨대 압타머 또는 캡쳐 올리고뉴클레오티드는, 분자 비콘, 이중 혼성 프로브, Scorpion®, 또는 Eclipse® 프로브를 포함할 수도 있지만 이에 한정되지 않는, FRET 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. FRET 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프로브 쌍은 혼성 이벤트가 발생할 때까지 형광을 발하지 않는 형광 라벨들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 리포터 분자의 결합 성분에 직접 또는 간접적으로 공유결합으로 부착된다. 어떤 다른 실시형태들에서, 캡쳐 올리고뉴클레오티드는 리포터 분자의 결합 성분일 수도 있으며, 내재 또는 외래 형광 염료는 검출가능한 라벨일 수도 있으므로, 캡쳐 올리고뉴클레오티드가 분석물질, 예를 들어, 삽입 염료에 결합할 때까지 리포터 분자의 검출가능한 라벨이 검출불가능할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 검출가능한 라벨은, 검출가능한 신호가 결합하기 전에 존재하지 않는 새로운 파장으로 시프트되기 때문에, RMSA 복합체가 형성된 후까지 검출불가능할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분에 공유결합으로 부착된 삽입 염료. 다른 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 동위원소일 수도 있다.
또한 다른 실시형태들에서, 검출가능한 라벨 및 결합 성분은 단일 모이어티, 예를 들어, 검출가능한 신호를 제공하는 단백질 또는 핵산 (예컨대, 녹색 형광 단백질 (GFP) 와 같은 자가-검출가능한 단백질, 또는 GFP 와 동등한 RNA 인, "스피나치 (Spinach)" 와 같은 리보핵산 압타머) 이다. 스피나치는 3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴 이미다졸리논 (DFHBI) 을 형광 검출가능한 라벨로서 포함한다.
확산 모델링. 본원에서 설명하는 방법들은 챔버의 분리 영역으로부터 유동 영역 (예컨대, 마이크로유체 채널) 으로의 분비된 분석물질들의 차동 확산에 관련된 모델들 및 관측들을 이용한다. COMSOL®, MATLAB® 및/또는 다양한 수치 모델링 및 컴퓨터-지원 설계 툴들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 다수의 소프트웨어 프로그램들이 생물학적 마이크로-오브젝트의 분비된 분석물질들의 거동들을 모델링하는데 사용될 수도 있다.
도 6 은 고립 영역 (640) 내, 챔버 (624) 의 기부에, 채널 (122) 에 대한 챔버 (624) 의 개구에 대해 원위의 지점에, 위치된 하나의 생물학적 세포 (602) 를 가지는 챔버의 하나의 유형의 모델을 나타낸다. 확산 610 의 라인들은 분리 영역 640 으로부터 연결 영역 636 을 통해서 채널 122 까지의 세포 602 의 분비된 분석물질의 확산의 궤적을 나타낸다. 확산하는 물질들이 연결 영역을 통과함에 따라, 확산의 라인들이 집중되며 채널 122 로 선형적으로 유동한다는 것을 알 수 있다. 확산의 레이트는 분비된 피분석물의 확산 계수에 의해 정의되며, 다음과 같이 모델링될 수 있다.
특정의 분비된 분석물질에 대한 확산 계수 D 는 다음과 같이 정의된다:
D = (1/f) kT (식 1)
여기서, f 는 마찰 계수이며, k 는 볼츠만 상수이며, T 는 절대 온도이다. 마찰 계수 f 는 분비된 분석물질이 확산하고 있는 용매의 점도 ( 에, 그리고, 분비된 분석물질의 사이즈 및 형상에 의존한다. 구형 구를 갖는 분비된 분석물은 최소화된 마찰 계수를 갖지만, 정의된 구조적 제약을 갖는 항체 또는 다른 단백질과 같은 비대칭 모양은 더 큰 f 를 초래할 것이다. 또한 분비된 분석물이 수소 결합 또는 분비된 분석물과 관련된 수화의 물과 같은 용매와의 상호 작용을 갖는 경우, 마찰 계수도 증가될 것이다. 일부 일반화된 확산 계수들이 테이블 2 에 나타내어진다.
표 2. 예시적인 확산 계수들.
일반 재료 확산 계수
물 중의 소분자 (< 1kDa) 1-1.5 x 10-5 cm2 s-1
작은 단백질 ( < 20kDa 10-6 cm2 s-1
분비된 분석물질의 확산은 다음 수식으로 표현될 수 있다:
<x2> = qiDt (식 2)
여기서, <x2> 는 평균 제곱 변위이며, x 는 시간 t 에 걸친 선택된 이동의 시작 지점으로부터의 평균 거리이다. qi 의 값은 확산이 1, 2, 또는 3 개의 치수들에서 평가되고 있는지 여부에 의존한다.
이들 수식들에 의해, 리포터 분자가 정의된 구성의 챔버 안으로 그리고 밖으로 확산하는 시간 및 RMSA 착체에 대한 시간이 모델링될 수 있으며, 그리고, 약 150 kDa 의 범위의 분자량을 가지는 항체 분비된 피분석물에 대해, 도 7a 및 도 7b 에 도시된다. 도 7b 에서, 곡선 (712) 는 약 2.5kDa 의 분자량인, CPD 3 과 같은 작은 펩티드의 거동을 모델링하며, 여기서, 작은 펩티드는 채널로부터 챔버 (424, 524, 624) 및 기타 등등 (각각 도 4a 내지 도 4c, 도 5 및 도 6) 과 같이 구성된 챔버 내로 25-30 분 내에 확산하여 평형화될 수 있도록 계산된다. 대조적으로, 곡선 (714) 은 약 45 kDa 의 분자량을 갖는 훨씬 큰 CPD 1 의 거동을 모델링한다. 이러한 더 큰 분자는 용매와 상호작용할 더 많은 기회들을 제공하며, 45-50 분 사이의 어느 지점에서 완전 평형에 도달되지 않는다.
도 7b 에서, 424, 624 와 유사하게 구성된 챔버로부터의 확산에 대해 4개의 상이한 종 (species) 의 거동이 도시된다. 이 그래프에서, 곡선 716 은 작은 펩티드 CPD 3 에 대해, 챔버 424, 524, 624, 및 기타 등등과 유사하게 구성된 챔버로부터의 계산된 확산의 레이트를 나타낸다. 작은 펩타이드 CPD 3 은 약 25분 까지는 챔버에서 실질적으로 제거된다. 대조적으로, CPD 3 이 분비된 분석물 IgG (MS 150kDa) 에 결합된 경우, 곡선 722(삼각형 모양)는 CPD 3을 포함하는 RMSA 복합체에 대해 계산된 확산 거동을 보여주며, 여기서 60분 후에 소량의 RMSA 복합체가 유지된다. 곡선 718(다이아몬드 모양)은 CPD 1 (단백질 A, 45kDa 단백질)에 대해 계산된 확산 거동을 나타내며, 따라서 실질적으로 완전히 확산되는 데 50분이 넘게 걸린다. 이 단백질이 분비된 항체 (MW 150 kDa) 와 복합체를 형성할 때, 곡선 724 (점선 세그먼트) 은 CPD 3: IgG 복합체의 확산 레이트에 대해 유사하게 느린 확산 레이트를 나타내며, 60분 후에도 여전히 복합체가 남아 있음을 보여준다.
도 8a 는 리포터 분자의 2개의 상이한 결합 성분들의 각각에 대한, 리포터 분자와 RMSA 착체들 사이의 차이의 계산을 나타낸다. 곡선 826은 RMSA 복합체로부터 발생하는 최대 신호 및 비결합 리포터 분자에 기인한 최소 신호를 관찰하기 위해 CPD 3: CPD 3/IgG 페어링에 대한 챔버 내 농도의 최대 차이에 대한 분석 시간 최적화를 보여주며, 이는 임의의 확산 물질을 미세유체 디바이스로부터 배출하는 미세유체 채널에서의 약 15 분의 복원된 배지 유동에서인 것으로 보인다. 곡선 828 은 CPD 1 에 대한 차이 곡선을 나타내며, 비결합된 CDP-1 및 챔버 내에서 CPD 1 을 포함하는 RMSA 복합체 사이의 농도의 차이를 나타내며, 그리고 최대 차이가 추후 시점에, 25 분후 또는 더 긴 어느 시점에서, 나타난다는 것을 보여준다. 도 8b 는 비결합된 CPD 1 에 대한, 내측 확산 (상부 그래프) 및 외측 확산 (하부 그래프) 에 대한 실험 시간을 나타내며, 계산된 값들과의 적절한 상관 관계를 나타낸다. 이러한 일련의 모델링 및 실행된 실험들은 특정의 챔버 내에서 분석물질 분비의 레벨들을 평가하기 위해, 실질적으로 리포터 분자: 분비된 분석물질 복합체로부터의 검출가능한 신호의 관측을 위한 최적화된 시점들을 찾을 수 있음을 나타낸다.
확산 축을 따른 영역의 선택. 도 9a - 도 9b, 및 도 10a - 도 10b 는 분석 이미지들로부터 정량적 측정치들 (상대 또는 절대) 을 추출할 영역을 결정하는데 사용되는 모델링 실험들을 나타낸다. 도 9a 및 도 9b 에서, RMSA 착체로부터의 확산 유동 및 결과적인 형광 신호 강도의 모델링이 챔버 (424, 524, 624) 과 유사한 미세유체 디바이스 (900) 의 챔버 (924) 내에서의 생물학적 세포 (902, 904, 906) 의 위치의 효과를 고려하기 위해 수행되었다. 그 효과는 채널 (122) 에 대한 챔버 (924) 의 개구에 원위에 있는 챔버의 기부 (0 마이크론) 로부터 약 25 마이크론에서 세포 (902) 에 대한 위치를 이용하여 모델링되었으며; 세포 (904) 는 챔버 (924) 의 기부로부터 거리 약 100 마이크론에서 모델링되었으며; 세포 (906) 는 챔버 (924) 의 기부로부터 거리 약 180 마이크론에서 모델링되었다 (도 9a 및 도 9b 의 수평축 참조). 각각의 세포는 모델링 단순화를 위해, 라인 952 로 예시된, 챔버의 개구 측으로 확산 궤적의 중심 축을 따라서 있도록 모델링된다. 이들 위치들의 각각은 챔버의 분리 영역 940 내에, 그리고 챔버의 연결 영역 936 으로부터 멀리 떨어져 있으며, 따라서, 분리 영역 940 내 세포들 902, 904, 906 로부터 검출되는 신호 강도가 채널 122 에서의 유동 242 으로부터의 유동 효과들에 의해 영향을 받지 않도록 보장한다. 도 9a 의 y 축은 리포터 분자 (또는, 동등하게는, 이 실험이 단지 검출된 형광 강도들에만 의존하기 때문에, RMSA 착체) 의 정규화된 농도를 나타낸다. 도 9a 에 나타낸 바와 같이, 형광 신호의 강도 (모델링은 902, 904, 906 이 모두 분비된 피분석물을 동일한 레이트에서 생성하고 있다는 제약을 포함한다) 는, 형광으로 라벨링된 착체가 챔버 (924) 의 기부 근처의 그의 위치로 인해, 904, 906 의 것보다 더 단방향 방법으로 확산하기 때문에, 세포 (902) 에 대해 가장 높다. 세포들 904, 906 은 라벨링된 RMSA 복합체들을 모든 방향들로 확산시키기에 더 많은 용량을 갖는다. 이 모델에 의해 결정되는 것은 영역이 식별될 수 있다는 것이며, 여기서, 신호 강도는 라벨링된 종의 농도들 (예컨대, RMSA 착체) 에서의 변화들로 인해 형광 신호 강도에서의 변화들에 가장 민감하고, 도 9a 및 9b 양자에 표시된 바와 같이, 챔버 (924) 과 채널 (122) 사이의 확산 축을 따라서 있는, 영역 (944) 인, 세포 (902, 904, 906) 의 정확한 위치에 가장 적게 민감하다. 세포 위치 불감 영역 944 은 챔버 924 내 생물학적 마이크로-오브젝트의 분비된 분석물질의 상대 또는 절대 량을 평가하는데 사용되는 관심 영역 (AOI) 의 적어도 일부분이다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 챔버 924 및/또는 채널 122 의 추가적인 부분들을 포함할 수도 있다.
세포들의 큰 개체군들에 대해 최적화된 챔버. 도 10a 및 도 10b 는 상이하게 구성된 챔버 (1024) 에 대해 도 9a 및 도 9b 에 나타낸 바와 같이, 유사하게 구성된 모델링 실험을 예시한다. 마이크로유체 디바이스 1000 의 (챔버 224, 226, 228 과 유사한) 챔버 1024 내 생물학적 세포 1002, 1004, 1006 의 위치의 효과가 도시되어 있다. 그 효과는 채널 (122) 에 대한 챔버 (1024) 의 개구에 원위에 있는 챔버의 기부 (0 마이크론) 로부터 약 25 마이크론에서 세포 (1002) 에 대한 위치를 이용하여 모델링되었으며; 세포 (1004) 는 챔버 (1024) 의 기부로부터 거리 약 100 마이크론에서 모델링되었으며; 세포 (1006) 는 챔버 (1024) 의 기부로부터 거리 약 180 마이크론에서 모델링되었다 (도 10a 및 도 10b 의 수평축 참조). 각각의 세포는 모델링 단순화를 위해, 라인 1052 로 예시된, 챔버의 개구 측으로 확산 궤적의 중심 축을 따라서 있도록 모델링된다. 이들 위치들의 각각은 챔버의 분리 영역 1040 내에, 그리고 챔버의 연결 영역 1036 으로부터 멀리 떨어져 있으며, 따라서, 분리 영역 1040 내 세포들 1002, 1004, 1006 로부터 검출되는 신호 강도가 채널 122 에서의 유동 242 으로부터의 유동 효과들에 의해 영향을 받지 않도록 보장한다. 도 10a 의 y 축은 리포터 분자 (또는, 동등하게는, 이 실험이 단지 검출된 형광 강도들에만 의존하기 때문에, RMSA 착체) 의 정규화된 농도를 나타내며, 나타낸 농도들의 설명은 상기 도 9a 에 대한 것과 같다. 이 모델에 의해 결정되는 것은 영역이 식별될 수 있다는 것이며, 여기서, 신호 강도는 라벨링된 종의 농도들 (예컨대, RMSA 착체) 에서의 변화들로 인해 형광 신호 강도에서의 변화들에 가장 민감하고, 도 10a 및 도 10b 양자에 표시된 바와 같이, 챔버 (1024) 과 채널 (122) 사이의 확산 축을 따라서 있는, 영역 (1044) 인, 세포 (1002, 1004, 1006) 의 정확한 위치에 가장 적게 민감하다. 세포 위치 불감 영역 1044 은 챔버 1024 내 생물학적 마이크로-오브젝트의 분비된 분석물질의 상대 또는 절대 량을 평가하는데 사용되는 AOI 의 적어도 일부분이다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 챔버 1024 과 채널 사이의 확산 축을 따라서 위치되는 챔버 1024 및/또는 채널 122 의 추가적인 부분들을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 챔버의 기하학적 구조는 분비된 분석물질의 최적의 확산 프로파일을 제공하도록 변경될 수도 있다. 도 11a 는 최적화된 확산 프로파일을 제공하도록 설계된 채널 (122) 및 챔버들 (1124, 1126) 을 포함하는 미세유체 디바이스 (1100) 의 섹션을 예시한다. 구체적으로 설명하면, 챔버들 1124, 1126 은 세포들 1102 의 분비된 분석물질들의 (상대 또는 절대) 양을 평가할 때에 사용을 위해 더 큰 신호 강도를 제공하는데 유용할 수도 있는 다수의 생물학적 마이크로-오브젝트들 1102 을 수용할 수 있는 분리 영역들을 갖는다.
일부 실시형태들에서, 챔버 1124 의 분리 영역 1140 은 0.1 내지 100 nL 의 범위인 체적을 수용할 수도 있다. 특정의 실시형태에서, 도 11b 에 나타낸 바와 같이, 고립 영역 (1140) 은 6 nL 의 체적을 유지할 수도 있다. 챔버들 1124, 1126 은 무려 100, 200, 300, 400 또는 500 개나 되는 마이크로-오브젝트들을 수용할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 챔버들은 최대 300-400 개의 마이크로-오브젝트들을 수용할 수도 있다.
챔버들 1124, 1126 은, 각각 분리 영역 1140 에서 생물학적 마이크로-오브젝트들 1102 을 연결 영역 1136 으로부터 분리하도록 구성되는 연결 영역 1136 을 가지며, 분비된 분석물질이 그의 소스 (예컨대, 분석물질을 분비하는 생물학적 마이크로-오브젝트들 1102 중 하나) 로부터 멀리 확산되기에 충분한 거리를 생성한다. 이러한 분리는 예상된 확산 궤적 1130 의 라인을 따른 그의 확산 궤적을 가진 (예컨대, 자유롭게 확산되지 않는) 생물학적 마이크로-오브젝트 1102 에서 또는 상에서 여전히 연관되는 RMSA 복합체들로부터의 국부화된 신호의 간섭 또는 중첩을 감소시킨다. 이러한 중첩을 제거함으로써, AOI 의 적어도 일부분 또는 전체 AOI 로부터 발생된 농도 값들은 확산될 때 그 결합된 리포터 분자로부터의 신호를 나타낼 것이다. 일부 실시형태들에서, 연결 영역 1136 은 분리 영역 1140 에 대한 연결 영역 1136 의 수축에 의해 분리 영역 1140 으로부터 분리된다. 일부 실시형태들에서, 연결 영역 1136 은 10-30 마이크론의 범위인 폭 및 40 내지 200 마이크론의 범위인 길이를 가질 것이다. 특정의 실시형태에서, 연결 영역 1136 은 폭이 20 마이크론이며 길이가 100 내지 200 마이크론의 범위이다.
도 11b 는 챔버 (1124) 내로부터 접속 영역 (1136) 을 통과하여 채널 (122) 밖으로, 생물학적 마이크로-객체 (1102) 의 분비된 피분석물의 플럭스 라인들 (1120) 및 농도 기울기 라인들 (110) 을 도시한다. 연결 영역 1136 의 부분들은 AOI 의 적어도 일부분으로서 선택될 수도 있으며, 세포 위치에 민감하지 않고 분석시험 이미지에서 관측된 강도들에서의 변화에 민감한 영역의 부분일 수도 있다.
관심 영역 (AOI) 을 평가하기. 도 12a 는 데이터가 생물학적 마이크로-객체로부터의 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량의 결정을 위해 추출되는 AOI 의 개략도를 나타낸다. AOI 1250 는 (마이크로유체 디바이스 1200 에서의 챔버 1224 의) 분리 영역 1240 에서의 영역, 연결 영역 1236 에서의 영역; 및 채널 122 의 부분을 포괄하도록 선택되며, 이들 모두는 챔버 1224 으로부터 채널 122 까지 확산 축을 따라서 정렬된다. 이 실시형태에서, 유동 242 은 마이크로유체 채널 122 에 존재하며, AOI 에 통합된 채널의 부분 내에서의 임의의 검출가능한 신호를 감소시킨다. AOI 가 챔버 내에서 끝나는 지점의 선택이, 분석물질을 분비하고 검출가능한 신호가 방출되는 생물학적 오브젝트 1202 와의 중첩을 방지하기 위해 이루어진다. 도 12a 에 나타낸 바와 같이, 확산의 라인들 (1210) 은 접속 영역 (1236) 측으로 지향되며, 접속 영역 (1236) 으로 진입함에 따라 확산 축과 정렬되게 된다. 농도 기울기 라인들 1220 이 또한 도시되어 있다.
도 12b 는 미세유체 디바이스 (1200) 내 그의 위치를 표시하는, "327" 의 식별 번호 (1260) 를 가지는, 챔버 (1224) 에 대한 분석 이미지를 나타내는 사진이다. 식별 번호는 명시야 위치와 형광 이미지 위치를 상관시키는 것을 도우며, 또한 사용자들이 선택된 챔버로부터 세포들을 선택하고, 조작하고, 그리고 배출하는 것을 돕는다. 도 12b 의 챔버 (1224) 은 (비라벨링된) 고립 영역 내에 존재하는 하나의 생물학적 마이크로-객체 (1202) 를 갖는다. 분석시험 이미지는 생물학적 마이크로-오브젝트 1202 로부터 방출되는, 챔버 내 형광 신호의 광범위한 양을 명확하게 나타낸다. AOI 1250 는 사진적으로 올려 놓아진 것으로 도시되며, 확산 축을 따라서 정렬되며 확산 궤적 1252 의 라인을 따라서 중심에 위치한다. AOI 는 넓이가 20 픽셀들이며, 이는 (도 12b 에 라벨링되지 않은) 접속 영역 (126) 의 폭에 따라 선택되며 20 개의 서브-영역들로 분할된다. AOI 는 각각의 서브-영역에 대해 다른 픽셀 사이즈들을 가질 수도 있으며, 서브- 영역들의 개수는 약 1 개로부터 약 50 개까지 다양할 수도 있다. AOI 의 서브-영역 1254 은 AOI 의 모든 서브-영역들의 채널 122 로부터 가장 멀리 위치된 서브-영역이며, 그러나 생물학적 마이크로-오브젝트 1202 와 중첩하지 않도록 선택된다. AOI 의 제 2 단부에서의 서브-영역은 채널 122 내에 위치된 서브-영역 1258 이다. 중요하게는, 서브-영역들 (1256) 의 그룹은 검출된 형광이 챔버 내 생물학적 마이크로-객체의 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량을 평가하는데 사용되는, 도 9a - 도 9b 및 도 10a - 도 10b 의 세포 위치 불감 영역 (944, 1044) 이다.
도 12c 는 AOI 에서 검출된 형광의 그래픽 표현을 나타내며, 여기서, 수평축 상의 값들은 (도 12b 의 서브-영역 (1254) 에 대응하는) 서브-영역들 1, 즉, 생물학적 마이크로-객체 (1202) 에 대한 AOI 의 가장 근위의 단부에서의 서브-영역을 나타내며, 서브-영역 (20) 은 채널 (122) 에서의 AOI 의 가장 근위의 단부에서, 도 12b 의 서브-영역 (1258) 에 대응한다. AOI 에서의 검출된 형광의 양은 분비된 분석물질의 양에 비례한다. 다양한 수학적 연산들이 분비된 분석물질의 상대 또는 절대 량에 관한 정보를 추출하는데 사용될 수도 있으며 아래 섹션들에서 자세히 설명된다.
분석 이미지의 정규화. 분석시험 이미지를 프로세싱하여 분비된 분석물질의 상대 또는 절대 량들을 평가하기 전에, 미가공 분석시험 이미지는 정규화될 수도 있다. 도 13a 는 광 소스(들), 광 변조 서브시스템 (예컨대, DMD), 이미지 캡쳐 디바이스 (예컨대, 카메라) 와 같은 시스템 컴포넌트들의 변동 및 비-선형성과 같은 에러를 디스플레이하는 미가공 분석 이미지를 나타낸다.
유동 조건들 하에서 수행되는 분석들을 위한 방법 A. 일 실시형태에서, 미가공 분석시험 이미지는 다음 수식에서와 같이, 미가공 분석시험 이미지에서의 각각의 픽셀로부터 암 (Dark) 참조 이미지 및 신호 참조 이미지 양자의 보정치를 감산함으로써 정규화될 수도 있다:
Figure pct00003
(식3)
암 참조 이미지는 임의의 배지를 디바이스로 유동시키기 전에 마이크로유체 디바이스를 이미징함으로써 얻어질 수도 있다. 자발형광 에러들 및 다른 시스템 에러들은 각각의 픽셀에서의 암 참조 값을 감산함으로써 보정될 수 있다. 신호 참조 이미지는 롤 오프 (roll off), 포토블리칭 (photobleaching) 에러들 또는 카메라 에러들에 대해 보정될 수도 있으며, 리포터 분자, 또는 단지 리포터 분자를 마이크로유체 디바이스를 통해서 유동시켜 리포터 분자 또는 형광 라벨의 평형 농도에 도달함으로써 얻어진다. 미가공 분석시험 이미지에서의 각각의 픽셀은 정량 목적들을 위해 형광 데이터를 추출하기 전에 이러한 방식으로 보정될 수도 있다. 정규화된 분석 이미지가 도 13b 에 도시된다
비-유동 조건들 하에서 수행되는 분석들의 일부 실시형태들에 대한 방법 B. 정규화에서의 제 1 스텝으로서, 암 참조 이미지가, 위에서 설명한 바와 같이, "암 참조 감산된 이미지" 를 생성하기 위해, 존재하는 결합된 및 비결합된 리포터 분자들에 의한 미세유체 디바이스의 이미지로부터 감산되었다.
제 2 스텝으로서, 결합된 및 비결합된 리포터 분자들이 존재하지 않는 도 13a 의 미가공 분석 이미지의 부분들 (즉, 미세유체 디바이스에서의 챔버들 및 채널들을 정의하는 벽들) 이 "마스크된 암 참조 감산된 이미지" 를 생성하기 위해 자발-형광 감산된 이미지로부터 제거되거나 또는 "마스크되었다". 당업자들이 주지하고 있는 바와 같이, 이 스텝은 또한 자발-형광의 감산 전에 수행될 수 있다.
도 13a 의 정규화된 이미지를 발생시키는 제 3 스텝으로서, 마스크된, 자발-형광 감산된 이미지에서의 각각의 픽셀에 대한 강도 값은 마스크된, 자발-형광 감산된 이미지에서의 모든 픽셀들에 기초하여 계산된 전역 평균 강도로 나눠졌다. 각각의 픽셀에 대한 강도 값을 전역 평균 강도로 나눔으로써, 각각의 픽셀에 대한 이득 보정 인자를 포함하는 이미지 또는 유사한 데이터 구조 (예컨대, 매트릭스) 가 발생되며 ("이득 보정 이미지") 이미지의 각각의 픽셀에 대해 생성된다. 이득 보정 이미지를 발생시키는 다른 방법들은 당업자들에게 널리 공지되어 있다.
도 13a 에 도시된 정규화된 이미지를 발생시키는 제 4 스텝으로서, 이득-보정 이미지는 무작위 잡음을 감소시키기 위해 평활화 알고리즘을 겪었다. 이 스텝은 본 방법의 일부 실시형태들에서 채용되지 않을 수도 있다. 구체적으로 설명하면, 이득-보정 이미지는 각각의 픽셀에 대해 로컬 평균을 발생시킬 때에 이미지의 마스크된 부분들을 고려하는 9-픽셀 곱하기 9-픽셀 박스-필터를 사용하는 박스-필터 평활화 알고리즘을 겪었다. 당업자들이 알고 있는 바와 같이, 평균 필터링, 가우시안 필터링, 기울기 가중 필터링, 시퀀스 통계적 필터링, 강건한 평활화 필터링, Crimmins 잡음 제거 필터링, 에지 보존 필터링 및 자가-적응적 중간값 필터링과 같은, 다른 평활화 알고리즘들이 사용될 수도 있다.
도 13b 에 도시된 정규화된 사진을 발생시키는 제 5 스텝으로서, 평활된 이득-보정 이미지는 정규화된 이미지를 발생시키기 위해 자발-형광 감산된 이미지로 곱해질 수도 있다.
이들 방법들은 전술한 스텝들 및 방법들 중 임의의 것을 동일한 또는 상이한 시퀀스로 결합할 수도 있다.
비-유동 조건들 하에서 수행된 분석들의 일부 실시형태들에 대한 방법 C. 결합된 RMSA 복합체의 확산의 레이트보다 그의 더 큰 확산의 레이트로 인해, 채널 내 비결합된 리포터 분자의 실질적으로 균일한 농도에 따라서, 이미지를 정규화하는 다른 방법이 사용될 수도 있다. 채널들의 명도가 위에서 설명된 에러들을 보정하기 위해 이미지를 정규화하는데 사용될 수도 있다.
따라서, 대안 실시형태에서, 미세유체 디바이스의 영역들의 뷰를 가로지르는 명도의 양에서의 임의의 분산을 보정하기 위해, 도 13b 의 정규화된 이미지가 챔버들에 인접한 채널들에서의 명도를 이용하여 얻어질 수 있다. 이 정규화의 방법은 채널들이 임의의 존재하는 분석물질 (또는, 임의의 RMSA 복합체) 을 가질 것으로 예상되지 않으므로 존재하는 분석물질을 갖지 않는 마이크로유체 디바이스의 임의의 영역을 이용하여 수행될 수 있다는 사실에 의존한다.
채널 강도에 기초하여 정규화하기 위해, 제 1 스텝으로서, 그것 내에 존재하는 임의의 피분석물을 가질 것으로 예상되지 않는 채널의 영역 R 이 각각의 챔버에 대해 식별된다. 일부 실시형태들에서, 이 영역 R 은 챔버 위의 채널의 영역에 대응하는 사전-정의된 영역 R 일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 각각의 챔버에 대한 영역 R 은 다른 정보에 기초하여 식별되거나 또는 이미지에 기초하여 계산될 수 있다.
채널의 각각의 영역 R 에 대해, 명도 값 BR 은 영역 내 픽셀들에 기초하여 계산된다. 명도 값들을 계산하기 전에, 명도 값을 계산하는데 사용되는 이미지는 위에서 설명한 바와 같이, 감산되거나, 마스크되거나 또는 아니면 프로세싱될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, BR 은 영역 R 내 픽셀들의 평균 명도 값이다.
각각의 영역 R 에 대한 평균 명도 값 BR 이 계산된 후, 챔버들 및 채널들의 이미지는 일련의 영역들 A 로 파티션될 수도 있으며, 여기서, 각각의 영역 A 는 개별 영역 R 을 포괄한다. 이 영역은 영역 R 이 영역 A 의 중심에 있도록 계산될 수도 있다. 특정의 실시형태에서, 영역들 A 는 각각의 영역 R 의 도형 중심들의 Voronoi 다이어그램 또는 Delauney 삼각측량을 생성함으로써 계산될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 각각의 영역 R 은 그의 개별 영역 A 의 중심에 있을 필요가 없으며, 미세유체 디바이스를 세그먼트화하는 사전-정의된 영역들에 기초하여 계산될 수 있다. 각각의 영역 A 에 대해, 이득-보정 인자는 영역 A 와 연관된 영역 R 에 대한 명도 값 BR 로 나눈 가장 밝은 영역에 대해 계산된 최대 명도 값 BRmax 에 기초하여 계산된다. 이득-보정 인자는 정규화된 이미지를 생성하기 위해 다른 이미지 (예컨대, 자발-형광 감산된 이미지) 에 곱해질 수 있는 이득-보정 이미지를 발생시키는데 사용될 수도 있다. 이득-보정 인자 이미지는 또한 정규화에서의 사용 전에 위에서 설명한 바와 같이 평활화될 수도 있다.
분석 신호의 정량화. 일부 실시형태들에서, RMSA 의 확산 프로파일이 챔버에 존재하는 RMSA 의 양을 정량화하는데 사용될 수도 있다. 확산 프로파일은 그의 소스로부터 채널로 확산될 때 RMSA 복합체의 농도를 나타내는 일련의 값들 ("농도 값들") 을 제공한다.
AOI 의 식별 후, 다른 변환들이 적용될 수도 있다. 예를 들어, 각각의 라인에서의 픽셀들은 아웃라이어 (outlier) 및/또는 비정상적인 픽셀들을 폐기하는 것, 다른 형태들의 글로벌/로컬 정규화, 공간 변환, 및 픽셀의 공간을 (예컨대, 다-차원 공간으로부터 2차원 공간으로 또는 반대로) 변환하는 것에 의해 프로세싱될 수도 있다.
실시형태에 따라서, 강도 값들은 농도 값들을 계산하는데 상이한 방법들로 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 고정 소수점들에서의 강도 값들에 대응하는 농도 값들의 세트를 발생시키기 위해 고정 소수점들에서 샘플링될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, AOI 는 일련의 세그먼트들로 세그먼트화되며, 각각의 세그먼트의 중간 또는 평균 강도가 계산될 수도 있다. 실시형태 및 요구된 해상도의 정도에 기초하여, 계산된 농도 값들의 개수는 1 만큼 낮고 확산 궤적을 나타내는 라인 내 픽셀들의 개수 만큼 높을 수 있다.
실시형태에 따라서, 농도 값들은 존재하는 결합된 리포터 분자로부터의 신호의 양 (따라서, 분비된 분석물질의 양) 을 정량화하기 위해 상이한 방법들로 결합될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 농도 값들은 농도 값들이 확산 프로파일과 일관된 특성들을 나타내는지 여부를 평가하기 위해 플롯될 수도 있다. 실시형태에 따라서, 다수의 알고리즘들이 라인을 농도 값들에 피팅하고 그 라인과 연관된 기울기 및 에러와 같은 라인의 특성들을 계산하는데 사용될 수도 있다. 적합한 라인-피팅 알고리즘들은 최소제곱, 다항식 피트, 곡선-피팅, 및 erfc 피팅을 포함한다. 다른 알고리즘들은 당업자들에게 공지되어 있다. 농도 값들을 획득하기 위해 형광 강도 값들을 변환하는 방법들이 아래에서 더 충분히 설명된다.
도 14a 는 식별 번호 "1107" 을 가지는 하나의 챔버 (1424) 의 분석 이미지 (사진) 이며, 여기서, 예상된 확산 궤적 (1452) 의 라인이 도시된다. AOI 1450 는 분석시험 이미지 상에 투영되며, 이 예에서, 약 12 픽셀들의 폭을 가지며, 그것은 라인에 의해 정의된 축을 따른 20 개의 세그먼트들 (세그먼트들은 미도시됨) 로 세그먼트화되었다. 20 개의 동일한 세그먼트들의 각각에 대한 중간 강도가 계산되었으며 그후 도 14b 의 그래프에서 농도 값으로서 플롯된다. 그래프들의 수평축 상에서, 세그먼트 번호들 1-20 은 소스 (즉, 분비된 분석물질을 분비하는 세포들) 로부터의 이들의 거리에 따라서 넘버링되며, 여기서, 세그먼트 번호들은 채널로부터 가장 원위의 챔버의 영역에서의 세포들에 가장 가까운 AOI 의 세그먼트를 나타내는 낮은 번호를 가진다.
도 14b 는 이전 패러그라프 및 후속하는 다른 섹션들에서 설명되는 방법에 따라서 발생된 챔버들의 세트에 대한 농도 값들을 나타내는 일련의 곡선들을 도시한다. 도 14b 에 나타낸 일련의 곡선들을 발생시키기 위해, 각각의 챔버에 대해 발생된 농도 값들은 챔버에서의 세포들의 수에 기초하여 정규화되지 않았다. 그러나, 대안적인 실시형태들에서, 농도 값들 및 최종적인 곡선들은 각각의 챔버에서의 세포들의 수에 기초하여 정규화될 수도 있다. 도 14b 에 나타낸 바와 같이, 각각의 챔버에 대한 (농도 값들의) 곡선의 기울기가 각각의 챔버에 존재하는 분비된 피분석물의 상대 량을 평가하는데 사용될 수도 있다. 다시 말해서, 기울기는 챔버들이 서로에 대해 랭크 및 순위화될 수 있도록 스코어로서 사용될 수도 있으며, "기울기" 및 "스코어" 는, 본원에서의 일부 실시형태들에서는, 교환가능하게 사용될 수도 있다. 일부의 경우, 스코어는 분비 스코어로서 지칭될 수도 있다. 좀더 구체적으로, 분비된 분석물질이 챔버들에 존재하는 생물학적 마이크로-오브젝트 (예컨대, 세포) 에 의해 발생되는 경우들에서, 기울기들이 각각의 챔버에서의 세포들이 분비된 분석물질을 발생시키는 상대적인 능력 (예컨대, 세포들이 항체를 분비하는 상대적인 능력) 을 평가하는데 사용될 수도 있다. 아래에서 설명하는 바와 같이, 분비된 피분석물의 상대 또는 절대 량은, 챔버에서의 세포들의 위치들에 민감하지 않으며 관측된 형광 강도에서의 분산에 가장 민감한 AOI 의 서브-영역 (예컨대, 도 12b 의 영역들 (1256), 도 10a 내지 도 10b 의 1044, 및 도 9a 내지 도 9b 의 944) 에서의 모든 지점들을 합산하는 것을 포함한, 상이한 방법들을 이용하여 계산될 수도 있다.
게다가, 각각의 챔버에 대한 농도 값들이 예상된 파라미터들에 따르는지 또는 시스템 에러를 표시하는지 여부를 평가하기 위해 곡선의 형상이 평가될 수도 있다. 예를 들어, 도 14b 에서 "펜 (1497)" 로 라벨링된 곡선의 형상은 다른 챔버들에 대해 관측된 곡선들의 형상에 대응하지 않는 반면, "펜 (1107)" 로 라벨링된 곡선의 형상은 예상된 확산 프로파일에 대응하지 않는다. 도 14a 에 나타낸 바와 같이, 펜 (1107) 은 예상된 확산 프로파일에 대응하는 그의 곡선을 발생시킨, 그의 챔버로부터 채널까지 리포터 분자의 가시적인 기울기를 가졌다. 도 14c 에 나타낸 바와 같이, 식별 번호 펜 (1497) 을 가지는, 챔버 (1426) 은 예상된 확산 궤적 (1452) 및 AOI (1450) 의 라인을 갖는다. 그러나, 챔버 1426 은 거품을 포함하는 채널에 근위에 있으며, 여기서, 거품의 메니스커스 1401 가 이미지에 백색 타원으로서 나타난다. 거품의 존재는 도 14b 에 도시된 펜 (1497) 에 대한 비정상적인 곡선을 초래한다. 다양한 실시형태들에서, 선형 회귀가 적용될 수도 있는 세그먼트화된 AOI 의 영역은 세그먼트들 (서브-영역들) 9-13 로 선택될 수도 있는데, 이는 전술한 바와 같이 연결 영역의 부분들을 포괄하며 형광 강도 분산에 가장 민감하고 그리고 챔버 내 생물학적 마이크로-오브젝트들의 위치에 가장 민감하지 않은 것으로 식별되었다.
도 15 는 미세유체 디바이스 내 복수의 챔버들로부터 얻어진, 본원에서 설명하는 방법들 중 임의의 방법을 통해서 유도된 강도 값들 (및, 이에 따른 농도 값들) 을 나타내는 복수의 곡선들의 오버레이를 나타낸다. 그래프의 수직축에 대해 플롯된, 각각의 곡선에서의 각각의 지점의 강도 값들은 오버레이의 용이성을 위해 정규화되었다. 수평축을 따른 값들은 도 9a 및 도 9b, 도 10a 및 도 10b, 도 12a 및 도 12b, 및 도 14a 및 도 14c 에 나타낸 AOI들과 유사하게, (미세유체 디바이스의 채널 내에, 그리고 챔버의 외부에 물리적으로 위치되는) 각각의 AOI 의 y 치수에서의 제 1 픽셀을 나타내는, 제로와 동일한 "y" 의 값에서 시작한다. "200" 으로 표시된 수평축을 따른 지점들은 피분석물을 분비하는 세포들에 가장 가까운 AOI 의 경계, 따라서, RMSA 복합체로부터의 검출가능한 신호가 방출되는 소스인, 복수의 챔버들의 각각의 AOI 에서의 최종 픽셀에 대응한다. 챔버 내 세포들의 위치에 가장 적게 민감하고 형광 강도들에서의 분산에 가장 민감한 AOI 의 부분 1544 으로부터 얻어진 농도 값들은 나타낸 바와 같이, 약 90 과 약 130 사이의 y 값들과 연관된 곡선의 부분에 도시된다. 이 영역에서 선형 형상을 부과하며 그의 기울기를 추출하는 수학적 연산이 데이터의 상태를 가깝게 나타낸다는 것을 알 수 있다.
별개의 챔버에 배치된 단일 세포로부터 각각 유래되는 수천 개의 클론 개체군들을 포함하는 나노유체 디바이스에 걸쳐서 분석을 수행하는 것은, 클론 개체군들의 각각의 정량화를 제공할 수 있다. 도 16a 및 도 16b 에 나타낸 바와 같이, 희귀하게 높은 생산성 클론들을 발견할 수 있는 능력이 향상된다. 세포들의 무작위 분비 풀로부터의 역가들의 분포가 푸아송 통계들에 의해 잘 설명된다고 가정하면, 역가 분포는 감마 분포에 피트해야 한다. 도 16a 에서, (스코어들로부터 얻어져, 복수의 챔버들의 각각의 챔버에 존재하는 세포들의 수에 대해 정규화된) 역가들의 바 그래프 분포 상에 중첩되고 임의의 유닛들 (A.U.) 로 표현된 곡선은 우수한 일치를 나타낸다. 50 A.U. 미만 내지 100 A.U. 미만의 분석물질을 발현하는 대다수의 클론 개체군들이 있으며, 250 A.U. 이상의 높은 범위에서는 아주 적은 개개의 역가들이 나온다. (수평축을 따른) 성장의 레이트에 대한 상대 고유 생산성을 플롯한 동일한 데이터가 나타내어진다. 그래프 상에 중첩된 곡선들은 일정한 역가의 라인들을 나타내며, 이는 또한, 대부분의 클론들이, 이들이 빠른 성장 클론이든 또는 느린 성장 클론이든, 분석물질을 100 A.U. 미만에서 표현하며 세포주 개발에 대해 강구되는 바람직한 높은 생산성 클론들이 아니다는 것을 나타낸다. 영역들 1670, 1680, 및 1690 내에서 식별된 단지 약간의 클론들만이 희귀한 높은 생산자들이다. 그러나, 이들 클론들은 원래 파종된 단일 세포들로부터 발생하는 가장 빠른 생산성 클론들이 아니다. 이들 세포들이 웰 플레이트 또는 쉐이커 플라스크와 같은 더 큰 성장 환경의 부분으로서 다른 세포들과 혼합되면, 이들 희귀하고 높은 생산성 클론들은 더 빠르게 성장하며 덜 생산적인 클론들 만큼 과성장될 가능성이 가장 클 것이다. 이들 클론들을 식별하려고 시도하는 것은, 팽창을 위해 무작위 단일 세포 세트들의 선택을 시도하려고 하면, 그들을 볼 확률을 갖기 위해 요구되는 세포들의 수를 증가시키기 위해 리소스들의 대량의 입력과 함께 대량의 샘플링 노력을 필요로 할 것이다. 본원에서 제공되는 시스템에서, 역가 (또는, 스코어) 는 클론 개체군들의 모두에 대해 얻어질 수도 있으며, 생산성 클론들의 물리적인 위치는 알려져 있다 (아래, 도 21 참조). 또, 단지 선택된 클론들만이 선택되어 추가적인 팽창/서브클로닝을 위해 물리적으로 이동될 수도 있으며; 선택 및 이동은 다른 세포 개체군들에 의한 오염을 방지하기 위해 개별적으로 수행될 수도 있다. 원래 파종된 세포들로부터 발생하는 클론들의 모두를 스크리닝할 수 있는 기회는 원하는 분석물질을 분비하는 세포들을 스크리닝하여 선택하는데 크게 향상된 프로세스를 제공한다.
다양한 실시양태에 따르면, 광표백 후 형광 회복 (fluorescence recovery after photobleaching: FRAP) 은 분비된 분자의 온칩 농도 측정(즉, 분비 속도)을 행하기 위한 또 다른 기법일 수 있다. 특히, 세포에서 분비되는 표지되지 않은 분자의 농도 및/또는 결합 친화도는 광표백 후 형광 회복을 모니터링하여 검출할 수 있어야 한다. 이 기법은 예를 들어 칩에 걸쳐 균일한 시약 농도를 생성하기 위해 일반적으로 수행되는 평형 단계 동안과 같이 여기에서 논의된 다양한 세포주 개발 분석(CLD 분석)의 다양한 지점에 걸쳐 구현될 수 있다. FRAP는 이러한 단계 동안 수행될 수 있으며, 여기서 각 챔버에 자유 시약의 집단, 분비된 분자들의 집단, 관심 분비 분자(들)에 결합된 시약 집단이 존재한다. 예를 들어, 50-100 um 상자 또는 심지어 목 자체와 같은 챔버의 영역을 광표백함으로써, 해당 영역으로 재확산되는 자유 시약 및 결합된 개체군을 관찰할 수 있다. 자유 시약은 일반적으로 빠른 확산 속도 때문에 빠르게 회복되는 반면 결합된 복합체는 느린 확산 속도 때문에 천천히 회복된다. 빠른 회복 과정 크기(도 31의 h1) 대 느린 회복 과정 크기(도 31의 h2)의 비율은 농도(분비 속도)의 척도를 형성할 수 있으며, 회복 시간 상수는 각각 시약 및 결합된 복합체의 분자량에 의해 결정된다. 도 31의 파트 A는 낮은 분비 분자를 나타내고 도 31의 파트 B는 높은 분비 분자를 나타낸다. 또한 아래에서 자세히 설명하는 OEP(OptoElectroPositioning) 기술을 사용하여 더 많은 광 출력을 얻어 표백 시간을 줄이고, 덜 안정적인 염료를 사용할 수 있으며, 모니터링 단계 동안 더 낮은 프로젝터 출력으로 이미징할 수 있다.
따라서, 여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공된다. 그 방법은 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 흐름 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 매질을 포함한다. 방법은 생물학적 미세 물체 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군이 분석물을 챔버 내의 제1 유체 매질 내로 분비하도록 하는 단계, 및 제1 기간 동안 유동 영역 내로 제2 유체 매질을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 제2 유체 매질은 복수의 리포터 분자를 포함한다. 방법은 복수의 리포터 분자의 일부가 챔버 내로 확산되고 그 안에서 분비된 분석물에 결합하도록 하여 복수의 리포터 분자: 분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성하는 단계, 및 미세유체 장치 내의 관심 영역 내에 위치한 리포터 분자를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부를 포함한다. 리포터 분자(또는 각각의 리포터 분자)는 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분, 및 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에 따르면, 컴퓨터로 하여금, FRAP 기법들을 사용하여, 생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법을 수행하도록 시스템에 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체가 제공된다. 이를 위한 예시적인 컴퓨터 시스템은 본 교시들의 실시형태들이 구현될 수도 있는 컴퓨터 시스템 (3100) 을 예시하는 도 25 의 블록도에 의해 제공된다. 컴퓨터 시스템(3100)의 세부사항은 아래에 제공될 것이다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 검출가능한 표지는 가시, 발광, 인광 또는 형광 라벨을 포함할 수 있다. 리포터 분자의 검출가능한 표지는 형광 표지일 수 있고, 여기서 상기 리포터 분자를 검출하는 것은 관심 영역 내의 리포터 분자의 형광 표지로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다.
FRAP 기법을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 방법은 제2 기간 동안 리포터 분자의 형광 표지를 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 대해 챔버를 포함하는 미세유체 장치의 일부를 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 제2 기간 후에 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 제3 기간 동안 2회 이상 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 및/또는 관심 영역 내의 형광 방출이 제3 기간 동안 실질적으로 지속적으로 수행되는 것을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
FRAP 기법을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 방법은 제4 기간 동안 전자기 방사선에 대한 챔버의 적어도 일부를 포함하지만 유동 영역은 포함하지 않는 미세유체 장치의 일부를 노출시키는 단계로서, 여기서 제4 기간은 챔버의 일부에 존재하는 임의의 리포터 분자의 형광 표지를 광표백하기에 충분한, 상기 미세유체 장치의 일부를 노출시키는 단계; 및 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계는 제4 기간 후에 수행될 수 있고, 제5 기간 동안 2회 이상 수행될 수 있고; 및/또는 제5 기간 동안 실질적으로 연속적으로 수행될 수 있다. 또한, 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계는 상기 제4 기간 동안의 노출 후 약 5초 내지 약 20초 후에 발생할 수 있다. 더욱이, 제4 기간 동안 노출시키는 단계 및 챔버의 광표백된 부분에서 형광 방출을 검출하는 단계는 1회 이상 반복될 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 챔버의 광표백된 부분은 관심 영역에 의해 이루어진다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 챔버는 분리 영역 및 분리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가지며, 분리 영역 및 연결 영역은 분리 영역에서의 유체 배지의 성분들이 유동 영역에서의 유체 배지의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성되는, 생물학적 마이크로-오브젝트에 의해 분비된 분석물질, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-오브젝트들의 개체군의 레벨들의 평가를 위한 키트.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 생물학적 미세 물체는 생물학적 세포이고, 여기서 방법 챔버 내의 생물학적 세포를 생물학적 세포의 클론 개체군으로 확장하는 단계를 추가로 포함한다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 방법은 유동 영역을 배양 배지로 관류하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 관류하는 단계는 생물학적 미세 물체를 챔버에 도입한 후 및 두 번째 유체 매체를 유동 영역에 도입하기 전에 발생할 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 제1 기간은 약 30 분 내지 약 60 분이다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 방법들은 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 임의의 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 챔버로부터 확산시키는 단계로서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 챔버로부터 확산되는 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 상기 확산시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 관심 영역은 챔버 내로부터 밖으로 유동 영역으로 확산의 축을 따라 정렬된 챔버의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함할 수도 있으며, 여기서, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 관심 영역 내에 위치한 리포터 분자를 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 세기로부터 배경 신호의 세기를 감산함으로써 배경-감산된 신호 세기를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 생물학적 마이크로-오브젝트를 챔버로 도입하기 이전의 시간에, 관심 영역 내의 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화될 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 방법은 분석물의 분비의 수준을 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 챔버에 대한 분비물 스코어를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 분비물 스코어는 구현예 12 내지 25 중 어느 하나의 방법에 따라 (즉, 이하의 선택된 구현예의 인용으로부터) 결정될 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 임의의 것의 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함할 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체일 수 있다. 생물학적 마이크로-오브젝트에 의해 분비된 분석물질은 항체 이외의 단백질일 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다. 방법은 복수의 챔버 중 적어도 2개의 챔버의 챔버에 대한 분비물의 수준을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-오브젝트들의 위치에 가장 적게 민감하며, 및 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함할 수 있다.
이제 도 32를 참조하면, 다양한 실시예들에 따라, FRAP에 대한 방법이 제공된다. 그림 32의 파트 A 에서 시약은 챔버를 가로질러 평형을 이루도록 허용된다. 도 32의 파트 B에서, 예를 들어 구조광을 사용하여 국부화된 광표백이 유도된다. 이 도면에서 볼 수 있듯이 국부화된 영역은 상자 (3540) 이다. 그림 32의 파트 C에서, 표백되지 않은 자유 시약이 국부화된 영역(3550)으로 들어갈 때 부분적 회복이 관찰되었다. 위에서 논의한 바와 같이 자유 시약은 일반적으로 빠른 확산 속도 때문에 빠르게 회복된다. 도 32의 파트 D에서, 완전한 회복은 표백되지 않은 결합된 복합체가 (평형에 도달하여 관찰 가능한 국부화된 영역을 제거함에 따라 표시되지 않는) 국부화된 영역에 들어갈 때 관찰된다. 위에서 논의한 바와 같이, 결합된 복합체는 일반적으로 느린 확산 속도와 일반적으로 더 높은 분자량으로 인해 천천히(자유 시약보다 느림) 회복된다.
FRAP 는 많은 잠재적인 이점을 갖는다. 예를 들어 FRAP 는 반복된 분석을 허용할 수 있거나, 임의의 시간에 시약이 평형을 유지한다. FRAP 는 일반적인 확산 구배 기법보다 빠르게 수행될 수 있다. FRAP 사용자는 시간이 지남에 따라 생물학적 스파이크 노이즈를 해결하기 위해 반복되는 시계열 분비 측정을 획득할 수 있어서, 잠재적으로 더 적은 수의 세포와 더 짧은 배양 시간으로 개선된 생물학적 노이즈 통계로 이어질 수 있다. 이 기법은 챔버 내에서 빠르고 느린 회복 프로세스들의 상대적 크기를 측정하기 때문에 농도 측정은 시야들 내에서 및 시야들 사이에서 독립적이다. 이것은 챔버들이 이미지화되는 순서, 또는 챔버가 시야의 어느 부분에 있는지에 의해 영향을 받지 않아야 한다. 또한, 예를 들어 FRAP 는 위에서 설명한 비율이 또한 결합 친화도에 의해 강하게 영향을 받기 때문에, 결합 친화도를 측정하는데 사용될 수 있다.
따라서, 여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공된다. 그 방법은 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 흐름 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 매질을 포함한다. 방법은 생물학적 미세 물체 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군이 분석물을 챔버 내의 제1 유체 매질 내로 분비하도록 하는 단계, 및 제1 기간 동안 유동 영역 내로 제2 유체 매질을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 제2 유체 매질은 복수의 리포터 분자를 포함한다. 방법은 복수의 리포터 분자의 일부가 챔버 내로 확산되고 그 안에서 분비된 분석물에 결합하도록 하여 복수의 리포터 분자: 분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성하는 단계, 및 미세유체 장치 내의 관심 영역 내에 위치한 리포터 분자를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부를 포함한다. 리포터 분자(또는 각각의 리포터 분자)는 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분, 및 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에 따르면, 컴퓨터로 하여금, FRAP 기법들을 사용하여, 생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의해 생성되는 피분석물의 양을 결정하는 방법을 수행하도록 시스템에 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체가 제공된다. 이를 위한 예시적인 컴퓨터 시스템은 본 교시들의 실시형태들이 구현될 수도 있는 컴퓨터 시스템 (3100) 을 예시하는 도 25 의 블록도에 의해 제공된다. 컴퓨터 시스템(3100)의 세부사항은 아래에 제공될 것이다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 검출가능한 표지는 가시, 발광, 인광 또는 형광 라벨을 포함할 수 있다. 리포터 분자의 검출가능한 표지는 형광 표지일 수 있고, 여기서 상기 리포터 분자를 검출하는 것은 관심 영역 내의 리포터 분자의 형광 표지로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다.
FRAP 기법을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 방법은 제2 기간 동안 리포터 분자의 형광 표지를 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 대해 챔버를 포함하는 미세유체 장치의 일부를 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 제2 기간 후에 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 제3 기간 동안 2회 이상 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 및/또는 관심 영역 내의 형광 방출이 제3 기간 동안 실질적으로 지속적으로 수행되는 것을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
FRAP 기법을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 방법은 제4 기간 동안 전자기 방사선에 대한 챔버의 적어도 일부를 포함하지만 유동 영역은 포함하지 않는 미세유체 장치의 일부를 노출시키는 단계로서, 여기서 제4 기간은 챔버의 일부에 존재하는 임의의 리포터 분자의 형광 표지를 광표백하기에 충분한, 상기 미세유체 장치의 일부를 노출시키는 단계; 및 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계는 제4 기간 후에 수행될 수 있고, 제5 기간 동안 2회 이상 수행될 수 있고; 및/또는 제5 기간 동안 실질적으로 연속적으로 수행될 수 있다. 또한, 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계는 상기 제4 기간 동안의 노출 후 약 5초 내지 약 20초 후에 발생할 수 있다. 더욱이, 제4 기간 동안 노출시키는 단계 및 챔버의 광표백된 부분에서 형광 방출을 검출하는 단계는 1회 이상 반복될 수 있다.
FRAP 기법들을 사용하여 생물학적 미세 물체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 미세 물체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 수준을 평가하기 위한 다양한 실시양태에 따르면, 챔버의 광표백된 부분은 관심 영역에 의해 이루어진다.
방법들. 생물학적 마이크로-오브젝트들, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-오브젝트들의 개체군의 분석물질의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공되며, 본 방법은, 생물학적 마이크로-오브젝트를 마이크로유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계로서, 마이크로유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 마이크로유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-오브젝트, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-오브젝트들의 개체군으로 하여금 분석물질을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 분석물질을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물질에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 분석물질 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 마이크로유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유동 영역은 또한 제 1 유체 배지를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 유동 영역은 제 1 유체 배지와는 상이한 유체 배지를 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 분비된 분석물질을 결합함으로써, RMSA 복합체의 리포터 분자: 분비된 분석물질의 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 2:2, 4:2, 및 기타 등등의 화학양론을 가질 수도 있는 RMSA 복합체를 형성할 수도 있다.
분석물질의 분비의 레벨을 평가하는 방법의 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자들을 검출하는 단계는 비결합된 리포터 분자들을 검출하는 단계 뿐만 아니라, RMSA 복합체들의 부분인 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 챔버는 분리 영역 및 분리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가질 수도 있으며, 여기서, 분리 영역 및 연결 영역은 분리 영역에서의 유체 배지의 성분들이 실질적으로 단지 확산에 의해서만, 유동 영역에서의 유체 배지의 성분들과 교환되도록 구성된다.
분석물질의 분비의 레벨을 평가하는 방법의 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 챔버 내 생물학적 마이크로-오브젝트를 생물학적 마이크로-오브젝트들의 클론 개체군으로 팽창시키는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함할 수도 있으며, 여기서, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-오브젝트를 챔버로 도입한 후, 그리고 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생한다. 일부 실시형태들에서, 배양 배지는 제 1 배지와 동일할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 배양 배지는 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스 내에서 배양중인 세포들의 생존력은 마이크로유체 디바이스 내에서 배양되는 세포들을 자극하거나 또는 아니면 지원하는 보조 생체분자들을 제공하는 피더 세포들의 상청액 배양 배지의 부분을 포함시킴으로써 향상될 수도 있다. 피더 세포들 자체는 마이크로유체 디바이스 내에 존재하지 않을 수도 있지만 표준 반응 용기들에서 배양될 수도 있다. 마이크로유체 디바이스로의, 피더 세포들의 존재에 의해 컨디셔닝된 배양 배지의 부분들의 수확 및 전달이 수행될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 용존 산소의 양은 원하는대로 측정되어 변경될 수도 있으며, 이는 배양 웰플레이트들, 쉐이크 플라스크들 및 기타 등등에서의 이러한 조정과 비교하여, 본원에서 설명되는 마이크로유체 환경 내에서 순쉬운 프로세스일 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 마이크로유체 환경 내 배양 배지의 pH 는 모니터링되어 변경될 수도 있으며, 역시, 표준적으로 사용되는 플라스틱제품 (plasticware) 보다 더 손쉬운 프로세스이다.
또한 다른 실시형태들에서, 소진된 성장 배지가 마이크로유체 환경에 첨가될 수도 있으며, 이는 마이크로유체 환경 내 어느 클론들이 분비된 분석물질을 여전히 더 용이하게 생산할 수 있는지 또는 웰플레이트들, 쉐이커 플라스크들 및 생물반응기들을 포함할 수도 있는, 다양한 유형들의 반응 용기들의 스케일업 환경을 근사화하는데 사용될 수 있는지를 분석하는 선택 메커니즘으로서 기능할 수 있다. 또한 다른 실시형태들에서, 마이크로유체 환경 내 세포들을 자극하여 더 빨리 생성하거나 또는 자극 성분의 도입하기 전과는 상이한 분석물질들을 생성할 수도 있는, (CD28 을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 항체들, 시토킨들, 성장 인자들, 및 기타 등등과 같은, 가용성 자극 성분들. 다른 실시형태들에서, 세포들이 서로 그리고 챔버들에 부착하는 것을 방지하도록 구성된 하나 이상의 화합물들 및/또는 시약들이 배양 배지에 첨가될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 배양 배지에의 이들 첨가들 중 하나 이상은 챔버들 내 세포들 중 하나 이상에 대해 선택 압력을 가할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 2 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들에 대한 확산 프로파일의 모델링에 기초할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분일 수도 있다.
본 방법은 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 챔버로부터 확산시키는 단계로서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 챔버로부터 확산되는 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 상기 확산시키는 단계를 더 포함할 수도 있다. 검출하는 단계는 비결합된 리포터 분자들을 검출하는 단계 및 RMSA 복합체들의 부분인 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 2 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 3 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 복합체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함할 수도 있으며, 여기서, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 더 이상이 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 일부 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 배경 신호는 리포터 분자들이 검출될 때마다 측정되지 않을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 배경 신호는 기지의/표준 조건들 (예컨대, 칩 유형, 칩 내 챔버의 위치, 검출가능한 라벨의 유형, 제 1 유체 배지의 성분들) 에 기초하여 미리 결정될 수도 있다.
본 방법은 생물학적 마이크로-오브젝트를 챔버로 도입하기 이전의 시간에, 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 분석물질의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 생성물의 분비의 레벨을 정량화하는 것은 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도와 같은 다수의 측정치들 중 임의의 측정치에 기초할 수도 있으며, 이들 중 어느 쪽이든 그 관측 시야에서의 비네팅 (vignetting) 에 대해 정규화될 수도 있다. 본 방법은 챔버에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 분비 스코어는 검출된 및/또는 정규화된 형광 신호를 프로세싱하는 방법들을 기술하는 다음 섹션들에서의 방법들 중 임의의 방법에 따라서 결정될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 분비된 분석물질은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분비된 분석물질은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 분비된 분석물질은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 가질 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 임의의 것의 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함할 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-오브젝트에 의해 분비된 분석물질은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-오브젝트에 의해 분비된 분석물질은 항체일 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-오브젝트에 의해 분비된 분석물질은 항체 이외의 단백질일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 배치하는 스텝은 복수의 챔버들 중 적어도 일부분 내에 생물학적 마이크로-오브젝트를 배치하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들의 챔버들의 서브-세트의 각각의 챔버에 대한 분비의 레벨을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버들의 스코어들을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 본 방법은 분비의 레벨을 정량화하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 이상을 선택하고 선택된 하나 이상의 챔버들로부터 생물학적 마이크로-오브젝트 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-오브젝트들의 개체군을 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 결과적인 서브클론 개체군들을 추가로 팽창 및 분석함으로써 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 한다. 이것은 선택된 클론 개체군을 마이크로유체 디바이스 내 다른 챔버들의 세트로 이동시키고 선택된 개체군의 각각의 개개의 세포에 대해 다시 팽창시킴으로써 달성될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 본 방법은 선택된 생물학적 마이크로-오브젝트 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-오브젝트들의 개체군을 마이크로유체 디바이스로부터 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 챔버들로부터 채널로 또는 챔버 및/또는 채널로부터 마이크로유체 디바이스로 배출하는 스텝은 각각의 선택된 챔버 상에서 개별적으로 수행될 수도 있다 (예컨대, 선택된 챔버들의 세트로부터의 세포들은 일련의 배출 스텝들로, 한번에 하나의 챔버씩 배출될 수도 있다). 일부 실시형태들에서, 챔버 내에 배치된 세포들은 이전에 분석된 챔버로부터 발생될 수 있어, 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 절대 또는 상대 값이 특정의 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는이데 사용될 수도 있다. 이와 유사하게, 단백질들 (예컨대, IgG 도메인을 가진 항체들) 의 패밀리의 절대 또는 상대 값이 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는데 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분비된 분석물질의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 챔버로부터의 모든 세포들이 칩의 동일한 챔버 또는 다른 포함된 영역에서 선택 및 팽창될 것이다. 다른 실시형태들에서, 분비된 분석물질의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 동일한 챔버로부터의 세포들 중 하나 이상이 상이한 챔버들에서 선택 및 팽창될 것이다. 일부 실시형태들에서, 상대 또는 절대 값을 발생시키는 위에서 설명된 스텝들은 팽창된 세포들 상에서 (1X, 2X, 3X, 4X, 또는 더 이상의 배수로) 반복적으로 수행될 수도 있다.
다른 실시형태에서, 이 방법의 적용은 반복된 분석들로부터의 피드백으로, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 가능하게 할 수도 있다. 예를 들어, 분비된 분석물질의 대규모 생산에 밀접하게 관련된 조건들 및 물질들이, 추가적인 검사을 위해 가장 적합한 클론들을 찾아내고 특성화하기 위해, 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극을 위한 다양한 자극 프로토콜들이 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜보다 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교할 수 있을 만큼 분석될 수도 있다.
여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공된다. 그 방법은 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 흐름 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함할 수 있다. 방법은 생물학적 마이크로-객체 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군이 외인성 태그를 포함하는 분석물을 챔버 내의 제1 유체 배지 내로 분비하도록 하는 단계, 및 유동 영역 내로 제2 유체 배지를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 제2 유체 배지는 복수의 리포터 분자를 포함한다. 방법은 복수의 리포터 분자의 일부가 챔버 내로 확산되고 그 안에서 분비된 분석물에 결합하도록 하여 복수의 리포터 분자: 분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성하는 단계, 및 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치한 리포터 분자를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부를 포함한다. 리포터 분자(또는 각각의 리포터 분자)는 분비된 분석물의 외인성 태그에 결합하도록 구성된 결합 성분, 및 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에 따르면, 컴퓨터로 하여금, 생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의해 생성되는 분석물의 양을 결정하기 위해 외인성 태그를 이용하기 위한 방법을 수행하도록 시스템에 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체가 제공된다. 이를 위한 예시적인 컴퓨터 시스템은 본 교시들의 실시형태들이 구현될 수도 있는 컴퓨터 시스템 (3100) 을 예시하는 도 25 의 블록도에 의해 제공된다. 컴퓨터 시스템(3100)의 세부사항은 아래에 제공될 것이다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가질 수 있으며, 격리 영역 및 연결 영역은 격리 영역에서의 유체 배지의 성분들이 유동 영역에서의 유체 배지의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성된다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 생물학적 마이크로-객체는 생물학적 세포이고, 여기서 방법 챔버 내의 생물학적 세포를 생물학적 세포의 클론 개체군으로 확장하는 단계를 추가로 포함한다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 방법은 유동 영역을 배양 배지로 관류하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 관류하는 단계는 생물학적 마이크로-객체를 챔버에 도입한 후 및 제2 유체 배지를 유동 영역에 도입하기 전에 발생할 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 제2 유체 배지를 유동 영역에 도입하는 단계는 제1 기간 동안 유동 영역을 통해 제2 유체 배지를 흐르게 하는 단계를 포함할 수 있다. 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분일 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 검출가능한 라벨은 가시, 발광, 인광 또는 형광 라벨을 포함할 수 있다. 리포터 분자의 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수 있고, 여기서 상기 리포터 분자를 검출하는 것은 관심 영역 내의 리포터 분자의 형광 라벨로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 방법은 제2 기간 동안 리포터 분자의 형광 라벨을 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 대해 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 일부를 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 관심 영역 내에서 형광 방출을 검출하는 단계는 제2 기간 후에 수행될 수 있고, 제3 기간 동안 2회 이상 수행될 수 있고; 및/또는 제3 기간 동안 실질적으로 연속적으로 수행될 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 방법은 제4 기간 동안 전자기 방사선에 대한 챔버의 적어도 일부를 포함하지만 유동 영역은 포함하지 않는 미세유체 디바이스의 일부를 노출시키는 단계로서, 여기서 제4 기간은 챔버의 일부에 존재하는 임의의 리포터 분자의 형광 라벨을 광표백하기에 충분한, 상기 미세유체 디바이스의 일부를 노출시키는 단계; 및 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계는 제4 기간 후에 수행될 수 있고, 제5 기간 동안 2회 이상 수행될 수 있고; 및/또는 제5 기간 동안 실질적으로 연속적으로 수행될 수 있다. 더욱이, 제4 기간 동안 노출시키는 단계 및 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계는 1회 이상 반복될 수 있다. 분비된 분자의 온칩 농도 측정(즉, 분비 속도)을 행하기 위한 챔버 상의 에어리어 (영역, 관심 에어리어, 또는 관심 영역)의 광표백 후 형광 회복 (FRAP) 의 프로세스는 아래에서 더 자세히 설명된다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 방법들은 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 임의의 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 챔버로부터 확산시키는 단계로서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 챔버로부터 확산되는 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 상기 확산시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 방법은 분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 챔버에 대한 분비물 스코어를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 분비된 분석물의 외인성 태그는 펩티드 시퀀스를 포함할 수 있다. 펩티드 시퀀스는 FLAG 에피토프, 폴리히스티딘 시퀀스, 헤마글루티닌(HA) 에피토프, 또는 Myc 에피토프를 포함할 수 있다. 펩티드 시퀀스는 아미노산 시퀀스 (N-말단에서 C-말단까지) DYKDDDDK(SEQ ID NO: 11) 을 포함할 수 있다. 펩티드 시퀀스는 아미노산 시퀀스 (N-말단에서 C-말단까지) HHHHHH (SEQ ID NO: 12) 을 포함할 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 리포터 분자의 결합 성분은 항체이다. 리포터 분자의 결합 성분은 킬레이트제를 포함할 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질을 포함할 수 있다. 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체일 수 있다.
생물학적 마이크로-객체, 또는 그로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하기 위해 외인성 태그를 이용하는 다양한 실시형태에 따르면, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다. 방법은 복수의 챔버 중 적어도 2개의 챔버의 챔버에 대한 분비물의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 적어도 2개의 챔버들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및 선택된 챔버들의 각각으로부터 미세유체 디바이스 밖으로 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이제 도 17 을 참조하면, 워크플로우 (1700) 가 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 챔버들에 존재하는 분비된 분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 기능들을 예시하기 위해 도 17 에 제시된다.
박스 1702 에서, 분비된 분석물을 발생시키는 생물학적 마이크로-객체들이 미세유체 디바이스에서의 하나 이상의 챔버들에서 유지된다. 예를 들어, 생물학적 마이크로-객체들은 챔버들 내에서 배양될 수도 있거나, 또는 광학적으로 구동될 수도 있는 유전영동력들 및/또는 중력을 포함한 다양한 수단을 이용하여 챔버들로 로드될 수도 있다. 각각의 챔버는 단일 생물학적 마이크로-객체 또는 복수의 생물학적 마이크로-객체들을 포함할 수도 있다. 복수의 생물학적 마이크로-객체들은 단일 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군 (예컨대, 세포들의 클론 개체군) 일 수도 있거나, 또는 생물학적 마이크로-객체들의 이종 개체군일 수도 있다.
박스 1704 에서, 분비된 분석물을 결합하는 결합 성분 및 신호 성분을 가지는 리포터 분자가 채널 및 챔버들에 제공된다. 예를 들어, 리포터 분자는 채널로 유동될 수도 있으며 채널로 개방되는 챔버들로 확산되도록 허용될 수도 있다. 리포터 분자를 채널에 제공하는 다른 수단이 사용될 수 있다.
박스 1706 에서, 리포터 분자가, 그의 비결합된 상태에서 정상-상태 농도 평형에 도달할 때까지, 미세유체 디바이스 내에서 (예컨대, 채널 및 챔버들 내에서) 확산하도록 허용된다. 리포터 분자의 분자량에 따라서, 정상-상태 농도 평형을 달성하는데 요구되는 시간의 양은 변할 수 있다.
박스 1708 에서, 리포터 분자는 챔버에 존재하는 분비된 분석물들을 결합한다. 일부 실시형태들에서, 유동이 채널 내에서 재개되며, 비결합된 리포터 분자가 챔버로부터 확산된다.
박스 1710 에서, 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 복합체들을 포함하는 챔버(들) 및 채널(들) 의 이미지가 발생된다. 리포터 분자의 신호 성분에 따라서, 신호 성분을 가시화하기 위해 미세유체 디바이스를 특정의 광에 노출시키거나 (예컨대, 형광단을 광의 특정의 주파수에 노출시키거나) 또는 추가적인 시약을 도입하는 것이 필요할 수도 있다.
박스 1712 에서, 챔버(들) 및 채널(들) 의 이미지가 챔버(들) 에 존재하는 분비된 분석물의 양을 계산하기 위해 분석된다.
여기서 논의된 다양한 실시형태에 따르면, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함할 수 있으며, 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다. 또한, 클론주 개발을 예시적인 방법이 제공되며, 그 방법은 복수의 챔버 중 적어도 2개의 챔버의 챔버에 대한 분비물의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다. 또, 방법은 복수의 챔버로부터 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각 챔버는 그 안에 포함된 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자라는 것을 나타내는 스코어를 갖는, 상기 챔버들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계; 대응하는 반응 용기에서 선택된 챔버들 세트의 각 챔버로부터 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 확장하는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비되는 분석물의 레벨을 결정하여, 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비물의 레벨을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에 따르면, 컴퓨터로 하여금 클론주 개발을 위한 방법의 적어도 일부를 수행하도록 시스템에 지시하게 하기 위한 프로그램이 저장되는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다. 시스템은 선택된 챔버 세트의 각 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계를 포함하여 배출하는 단계까지, 적어도 위의 단계들을 수행할 수 있다. 이를 위한 예시적인 컴퓨터 시스템은 본 교시들의 실시형태들이 구현될 수도 있는 컴퓨터 시스템 (3100) 을 예시하는 도 25 의 블록도에 의해 제공된다. 컴퓨터 시스템(3100)의 세부사항은 아래에 제공될 것이다.
이제 도 18 을 참조하면, 워크플로우 (1800) 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 분비된 분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 계산하기 위해 수행되는 기능들을 예시하기 위해 도 18 에 제시된다.
박스 1802 에서, 채널(들) 및 챔버(들) 을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미지가 시스템 에러를 보정하기 위해 정규화된다. 위에서 설명한 바와 같이, 다수의 상이한 정규화 알고리즘들이 시스템 에러를 보정하기 위해 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 이득-보정 인자가 이미지를 정규화하기 위해 사용된다. 일부 실시형태들에서, 챔버에 인접한 채널에 존재하는 형광 신호의 양이 이미지를 정규화하기 위해 사용된다. 일부 실시형태들에서, 자발-형광 이미지가 정규화 동안 미세유체 디바이스의 이미지로부터 감산된다.
박스 1804 에서, 챔버 내 분비된 분석물의 소스 (예컨대, 챔버 내 세포들) 로부터 챔버에 근위인 채널까지의 예상된 확산 궤적의 축을 나타내는 라인이 식별된다. 예상된 확산 궤적의 축을 따라서 정렬되며 챔버 내로부터 채널로 연장되는 AOI 가 식별된다. AOI 의 적어도 일부는 신호 강도에 대해 가장 큰 감도를 가지는 영역을 포함하지만, 또한 챔버 내 세포 위치에 불감하다. 위에서 설명한 바와 같이, AOI, 및 신호에 대해 가장 큰 감도를 가지거나/세포 위치에 불감한 개별 영역은 챔버의 기하학적 구조, 챔버 내 분비된 분석물의 소스의 위치, 분비된 분석물의 분자량 및 채널 내 유동의 존재 (또는, 부재) 를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 파라미터들을 계산적으로 모델링함으로써 결정될 수도 있다.
박스 1806 에서, 하나 이상의 농도 값들이 세포 위치에 불감하며 신호 분산에 가장 민감한 AOI 의 적어도 일부분을 포함하는 AOI 에 기초하여 발생된다. 이 실시형태에 따르면, 농도 값들은 AOI 내에서 픽셀들을 샘플링하는 것 또는 AOI 를 픽셀들의 그룹들로 세그먼트화하는 것에 기초하여, 계산될 수도 있다.
박스 1808 에서, 하나 이상의 농도 값들이 각각의 챔버에 존재하는 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값을 계산하기 위해 사용된다. 위에서 설명한 바와 같이, 주어진 챔버에 대해 계산된 하나 이상의 농도 값들은 각각의 챔버에 존재하는 생물학적 마이크로-객체들 (예컨대, 세포들) 의 개수에 기초하여 정규화될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 농도 값들이 분비된 분석물의 소스로부터 채널까지의 확산 프로파일을 나타내는 곡선 또는 다른 합성 값을 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 이들 실시형태들에서, 농도 값들 (또는, 다른 합성 값) 의 곡선에 피팅된 라인의 구배는 챔버들과 연관된 분비 스코어를 평가할 수도 있으며, 다른 챔버들에 대한 각각의 챔버 내에 존재하는 분비된 분석물의 양 (즉, 분비된 분석물의 상대적인 값) 을 평가하기 위해 사용될 수도 있다.
다른 양태에서, 클론주 개발의 방법이 제공되며, 본 방법은, 개개의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버들의 각각으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 더 포함하며, 그리고 복수의 챔버들의 각각은 유동 영역에 유체 연결되며 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 복수의 챔버들의 각각으로 도입하는 단계; 각각의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 하여금, 분석물을 대응하는 챔버에 포함된 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 복수의 각각의 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물의 적어도 일부분에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 챔버들의 각각에서 복수의 리포터 분자:분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 복수의 각각의 챔버에 대해, 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계로서, 관심 영역은 대응하는 챔버의 적어도 일부분을 포함하며, 그리고 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 적어도 일부분은 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출되는, 상기 신호의 강도를 검출하는 단계; 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 검출된 신호 강도에 기초하여, 복수의 각각의 챔버에 대해, 스코어를 결정하는 단계; 복수의 챔버들 중에서 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각각의 챔버는 그 안에 포함된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자임을 표시하는 스코어를 가지는, 상기 챔버들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각각의 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출시키는 단계; 대응하는 반응 용기들에서 선택된 챔버들의 세트의 각각의 챔버으로부터의 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 팽창시키는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비된 분석물의 레벨을 결정하고, 이에 의해 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다. 상위 분석물 생산자는 생산자들의 상위 50% 중 하나일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 상위 분석물 생산자는 분석물들을 상위 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 생산성 클론들 또는 더 이상 중의 레이트로 생산한다. 대안적으로, 상위 생산자는 분석물을 임계치 양보다 많이 생산할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 스코어는 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도일 수 있거나, 또는 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도에 기초하여 계산될 수 있다.
복수의 챔버들의 각각의 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가질 수도 있으며, 격리 영역 및 연결 영역은 격리 영역에서의 유체 배지의 성분들이 유동 영역에서의 유체 배지의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들 중 일부 또는 모든 챔버들 내 개개의 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 팽창시키는 단계를 더 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 여기서, 관류시키는 것은, 개개의 생물학적 마이크로-객체들을 복수의 챔버들로 도입한 후 그리고 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생한다. 배양 배지는 제 1 배지와 동일할 수도 있다. 관류시키는 것은 연속적으로 또는 간헐적으로 수행될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 배양 배지는 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내에서 배양중인 세포들의 생존력은 미세유체 디바이스 내에서 배양되는 세포들을 자극하거나 또는 아니면 지원하는 보조 생체분자들을 제공하는 피더 세포들의 상청액 배양 배지의 부분을 포함시킴으로써 향상될 수도 있다. 피더 세포들 자체는 미세유체 디바이스 내에 존재하지 않을 수도 있지만, 표준 반응 용기들에서 배양될 수도 있다. 미세유체 디바이스로의, 피더 세포들의 존재에 의해 컨디셔닝된 배양 배지의 부분들의 수확 및 전달이 수행될 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 용존 산소의 양은 원하는대로 측정되어 변경될 수도 있으며, 이는 배양 웰플레이트들, 쉐이크 플라스크들 및 기타 등등에서의 이러한 조정과 비교하여, 본원에서 설명되는 미세유체 환경 내에서 순쉬운 프로세스일 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 배양 배지의 pH 는 모니터링되어 변경될 수도 있으며, 역시, 표준적으로 사용되는 플라스틱제품 (plasticware) 보다 더 손쉬운 프로세스이다.
또한 다른 실시형태들에서, 소진된 성장 배지가 미세유체 환경에 첨가될 수도 있으며, 이는 미세유체 환경 내 어느 클론들이 분비된 분석물을 여전히 더 용이하게 생산할 수 있는지 또는 웰플레이트들, 쉐이커 플라스크들 및 생물반응기들을 포함할 수도 있는, 다양한 유형들의 반응 용기들의 스케일업 환경을 근사화하는데 사용될 수 있는지를 분석하는 선택 메커니즘으로서 기능할 수 있다. 또한 다른 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 세포들을 자극하여 더 빨리 생성하거나 또는 자극 성분의 도입하기 전과는 상이한 분석물들을 생성할 수도 있는, (CD28 을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 항체들, 시토킨들, 성장 인자들, 및 기타 등등과 같은, 가용성 자극 성분들. 다른 실시형태들에서, 세포들이 서로 그리고 챔버들에 부착하는 것을 방지하도록 구성된 하나 이상의 화합물들 및/또는 시약들이 배양 배지에 첨가될 수도 있다.
본 방법의 다양한 실시형태들에서, 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 2 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함할 수도 있다. 제 1 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들에 대한 확산 프로파일의 모델링에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 챔버로부터 확산시키는 단계로서, 복수의 각각의 챔버의 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 것은 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 챔버로부터 확산되는 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 상기 확산시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 2 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 3 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 복합체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 시간 기간은 약 20 분 내지 약 50 분일 수도 있다.
방법의 다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다.
본 방법의 다양한 실시형태들에서, 복수의 각각의 챔버의 대응하는 관심 영역으로부터 방출되는 신호의 강도를 검출하는 단계는 배경-감산된 신호 강도를 결정하기 위해 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산하는 단계를 포함할 수도 있다. 배경 신호는 리포터 분자들이 검출될 때마다 측정되지 않을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 배경 신호는 기지의/표준 조건들 (예컨대, 칩 유형, 칩 내 챔버의 위치, 검출가능한 라벨의 유형, 제 1 유체 배지의 성분들) 에 기초하여 미리 결정될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 생물학적 마이크로-객체들을 챔버들로 도입하기 전 시간에서, 복수의 각각의 챔버의 대응하는 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 대응하는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 복수의 챔버들의 스코어들은 검출된 및/또는 정규화된 형광 신호를 프로세싱하는 방법들을 기술하는 다음 섹션들에서의 방법들 중 임의의 방법에 따라서 결정된다.
다양한 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 가질 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 임의의 것의 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함할 수도 있다. 어떤 다른 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체일 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 이외의 단백질일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 반응 용기들은 웰-플레이트 내의 웰들, 쉐이커 플라스크들, 또는 생물-반응기들일 수도 있다. 반응 용기들은 약 20 마이크로리터들, 약 100 마이크로리터들, 약 1 밀리미터, 약 10 밀리미터, 약 100 mL, 약 1 L, 또는 그 이상의 체적을 가질 수도 있다. 생물-반응기는 O2 및 CO2 의 독립적인 제어에 의한 pH 및 용존 산소 (DO) 의 폐 루프 제어, 20 L, 50 L, 50 gal, 200 gal, 또는 이 이상의 체적을 가질 수도 있는 분비된 분석물의 대량 생산에 사용되는 반응기의 환경을 가깝게 근사화할 수도 있는, 반응기 셋업, 공급들, 염기 첨가 및 샘플링을 위한 자동화된 액체 처리와 같은, 특징들 중 하나 이상을 가질 수도 있다. 생물-반응기는 10 mL 또는 15 mL 와 같은 비교적 소용량을 가질 수도 있다 (예컨대, ambr15TM (TAP Biosystems) 생물 반응기). 생물-반응기는 통합된 생존력 분석 능력들을 가질 수도 있다.
워크플로우 (1900) 는 본 개시물의 일부 실시형태들에 따른, 세포들의 클론 개체군에서의 분비된 분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 평가하기 위해 수행되는 기능들을 예시하기 위해 도 19 에서 제시된다.
박스 1902 에서, 단일 세포가 팽창을 위해 선택된다. 위에서 설명한 바와 같이, 세포는 분석의 결과들에 기초하여 선택될 수도 있거나 또는 세포는 표현형 및/또는 모폴로지와 같은 다른 특성들에 기초하여 선택될 수도 있다.
박스 1904 에서, 단일 세포가 세포들의 클론 개체군으로 팽창된다. 일부 실시형태들에서, 세포들의 클론 개체군의 양태들은 세포들이 증식함에 따라 분석될 수도 있다. 예를 들어, 증식 속도, 세포들의 모폴로지 및 세포 부착력이 세포들의 전체 건강 및/또는 생존력을 평가하기 위해 분석될 수도 있다.
박스 1906 에서, 세포들의 클론 개체군에 의해 발생되는 분비된 분석물의 절대 또는 상대 값이 평가된다. 일부 실시형태들에서, 절대 또는 상대 값은 도 12a 내지 도 12c 및 도 15 와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 평가될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 절대 또는 상대 값은 미국 특허출원 번호 제 14/964,025호에 기술된 방법들과 같은 다른 방법들을 이용하여 평가될 수도 있으며, 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
박스 1908 에서, 세포들의 클론 개체군으로부터의 세포들 중 하나 이상은 세포들의 클론 개체군에 의해 발생되는 분비된 분석물의 절대 또는 상대 값에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 세포들은 위에서 설명한 바와 같이, 세포 증식 동안 관측되는 세포들의 클론 개체군의 양태들에 기초하여 선택될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 선택된 세포들은 분석 또는 추가적인 팽창 (예컨대, 분비된 분석물을 생산하기 위한 세포주로서의 팽창) 를 위해 배출될 수도 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 일부 실시형태들에서, 분비된 분석물의 생산을 위해 단일 세포를 팽창시켜 클론 개체군을 분석하는 프로세스는 제 2 분비된 분석물의 절대 또는 상대 양을 평가하기 위해 또는 단일 세포가 박스 1906 에서 정량화된 분비된 분석물을 안정되게 생산하는지 여부를 평가하기 위해, 반복될 수도 있다.
분비된 분석물 농도: 적정 곡선의 절대 값. 일부 실시형태들에서, 확산의 이론적 모델이 챔버들 중 하나에서의 생물학적 마이크로-객체의 분비된 분석물의 하나 이상의 농도 값들 및/또는 기지의 양에 기초하여 절대 값을 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 실시형태에 따라서, 상이한 확산의 이론적 모델들이 하나 이상의 농도 값들에 기초하여 분석물의 절대 값을 계산하는데 사용될 수도 있다. 실시형태에 따라서, 이론적 모델은 다양한 현상을 모델링하거나 또는 상이한 가정들을 평가할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 적정 곡선이 생물학적 마이크로-객체의 분비된 분석물의 절대 값을 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 이들의 경우, 분석물의 다양한 기지의 양들이 미세유체 디바이스로 도입될 수도 있으며, 분석물의 기지의 양들을 나타내는 절대 값들을 발생시키는데 사용될 수도 있다. 분석물의 기지의 양들을 나타내는 절대 값들이 절대 값들과 분석물의 다양한 기지의 양들 사이의 선형 관계를 부분적으로 나타내는 적정 곡선을 발생시키는데 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 분석물의 기지의 양들에 대응하는 다수의 절대 값들은, 적정 곡선이 다양한 시스템 파라미터들 (즉, 선형 관계를 가지는 절대 값을 발생시키는 분석물의 최고 및 최저 양) 이 주어지면, 분석물의 정확한 정량화의 상한 및 하한을 나타내는 "동적 범위" 를 포함하도록, 발생될 수도 있다.
실시형태에 따라서, 예상된 확산 프로파일을 복제하는 다양한 방법들이 분석물의 기지의 농도들에 대한 농도 값들을 챔버 내 소스에서 (예컨대, 챔버 내 세포에 의해) 발생된 분석물과 동일한 방법으로 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 다양한 기지의 농도들의 관심 분석물이 리포터 분자와 함께 인큐베이트된다. 대부분의 실시형태들에서, 리포터 분자의 농도는 분석물의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 리포터 분자의 양을 초과할 것이다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 농도는 분석물의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 양의 대략 5-200 배일 것이다. 그러나, 이 범위는 분석물에 대한 리포터 분자의 결합 친화력에 기초하여 변할 수 있다. 예를 들어, 실시형태들에서, 리포터 분자가 분석물에 대한 강한 결합 친화력을 가지는 경우, 리포터 분자의 농도는 분석물의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 양의 2-200 배의 범위일 수도 있다. FITC-라벨링된 CPD 4 (테이블 1) 가 IgG 를 결합하는데 사용되는 특정의 실시형태에서, FITC-라벨링된 CPD 4 의 농도는 IgG 의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 양의 5-100 배의 범위일 수도 있다. 본 방법은 CPD 4 의 사용에 한정되지 않으며, 그러나, 확산 분석 자체에 적합한 임의의 리포터 분자를 이용할 수도 있다. 예를 들어, 형광으로 라벨링된 CPD 1, CPD 2, CPD 3, CPD 5, CPD 6 (테이블 1) 이 적정 곡선을 발생시기키 위해 사용될 수도 있으며, 형광단은 Alexa Fluor® 594 또는 HiLyte FluorTM 555 와 같은, 임의의 적합하게 선택된 형광단일 수도 있다.
일부 실시형태에서, 비결합 리포터 분자를 분비된 분석물을 포함하는 챔버에 제공함으로써 예상되는 확산 프로파일이 생성될 수 있다. 시간이 지남에 따라 리포터 분자 및 리포터 분자: 분석물 복합체는 결합되지 않은 리포터 분자와 결합된 리포터 분자: 분석물 복합체가 평형에 도달하는 충분한 기간(예를 들어, 평형 주기) 후에 미세유체 디바이스의 챔버 및 채널에 걸쳐 평형 상태에 도달한다. 어떤 경우에는 평형 상태에 접근하여 및/또는 평형 상태에서 이미지를 촬영한다. 예시적인 기간 또는 평형 주기는 1-3시간이다. 그러나, 평형 주기는 10분 초과, 30분 초과, 1시간 초과, 1.5시간 초과, 2시간 초과, 2.5시간 초과, 3시간 초과, 3.5시간 초과, 4시간 초과, 또는 4.5시간 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, RMSA 복합체 및 결합되지 않은 리포터 분자가 평형 상태에 도달한 후 또는 평형 주기가 지난 후, 채널은 리포터 분자를 포함하지 않는 액체 매질로 유동 영역에서의 액체 매질을 교체함으로써 리포터 분자를 제거하는 (즉, 플러싱하는) 다른 배지의 흐름이 제공될 수도 있다. 그런 경우. 이와 같이 채널 및 챔버의 스윕된 영역으로부터의 RMSA 복합체 및 결합되지 않은 리포터 분자가 흐름 영역 밖으로 플러싱된다. 또한, 챔버 내에 배치된 RMSA 복합체 및 결합되지 않은 리포터 분자는 챔버에서 채널로 확산된다. 그러나, 위에서 설명한 바와 같이, 비결합된 리포터 분자들은 RMSA 복합체보다 더 높은 확산의 레이트를 갖는다. 따라서 결합되지 않은 리포터 분자는 더 큰 질량과 더 큰 반경을 갖는 RMSA 복합체보다 훨씬 빠르게 미세유체 디바이스 밖으로 확산된다. 반경이 더 큰 분자는 더 천천히 확산되고(아래의 스톡스-아인슈타인 방정식 참조) 반경이 더 작은 분자는 더 빨리 확산되기 때문에, (반경이 더 작은) 유리 시약은 분비된 분석물과 결합된 리포터를 포함하는 RMSA 복합체보다 더 빠르게 펜 밖으로 확산될 것이다.
Figure pct00004
이러한 차이는 도 12a 내지 도 12c 및 도 15 와 관련하여 위에서 설명되고, 그리고 특정의 데이터 조작과 관련하여 아래에서 설명되는 바와 같은 AOI (관심 영역) 의 서브-영역들에 대한 중간 강도 값들에 기초하여 농도 값들의 정량화를 가능하게 한다.
도 20 은 특정의 실시형태에 따라서 발생된 적정 곡선을 도시한다. 구체적으로 설명하면, 도 20 은 (X-축 상에 micrograms/mL 로 도시된) IgG 의 기지의 양들에 대응하는 (Y-축 상에 "온칩 분석 역가 스코어들" 로서 라벨링된) 일련의 절대 값들을 도시한다. 구체적으로 설명하면, 도 20 에 나타낸 적정 곡선을 발생시키는데 사용되는 IgG 의 기지의 양들은 0.001526, 0.003052, 0.006104, 0.012207, 0.024414, 0.048828, 0.097656, 0.195313, 0.390625, 0.78125, 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5 micrograms/ml 이었다.
도 20 에 나타낸 (분석 스코어들로서 라벨링된) IgG 의 기지의 양들을 나타내는 절대 값들을 발생시키기 위해, 기지의 양들의 IgG 는 FITC-라벨링된 CPD 4 를 포함하는 용액에서 인큐베이트시켰다. IgG 의 모든 복제본들의 결합 및 검출을 보장하기 위해, IgG 의 모든 복제본들을 결합하는데 필요한 FITC-라벨링된 CPD 4 의 양의 6배를 용액 내에 포함시켰다. 미세유체 디바이스를 그후 45 분 동안 용액으로 관류시켰으며, 그후 채널들을 세포주 배지들 (ThermoFisher CD CHO 배지들) 로 10 마이크로리터들/초의 속도로 플러싱시켰다. 채널들을 플러싱한 후, FITC-라벨링된 CPD 4 및 IgG 가 챔버로부터 채널로 10 분 동안 확산하도록 하였다. 미세유체 디바이스를 그후 이미징하여, 아래에서 설명되는 바와 같이 미세유체 디바이스에서의 챔버들의 각각에 대해 분석 스코어들을 발생시키는데 사용한다. 이 프로세스를 IgG 의 최고 양 (즉, 12.5 micrograms/mL) 으로 처음에 수행하였으며, 매회 더 낮은 양의 IgG 를 이용하여 연속적으로 반복하였다.
미세유체 디바이스를 이미징한 후, 미세유체 디바이스에서의 각각의 챔버에 대해 발생된 개개의 절대 값들의 평균을 취함으로써 IgG 의 각각의 기지의 양에 대한 분석 스코어들을 계산하였다. 개개의 절대 값들의 각각은 도 12 내지 도 15 와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 챔버에 대해 발생된 농도 값들의 구배를 취함으로써, 발생되었다. 구체적으로 설명하면, 선택된 AOI 에 기초하여 발생된 농도 값들에 기초하여 각각의 챔버에 대한 구배를 계산하였다. 농도 값들을 발생시키기 전에, 이미지를 정규화하여, 도 13a 내지 도 13b 와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 이득-보정 인자로 처리하였다. 각각의 챔버에 대해 구배들을 계산한 후, 미세유체 디바이스에서의 챔버들의 모두에 대한 모든 구배들의 평균을 분석 스코어로서 사용하였다.
일단 발생되면, 도 20 에 도시된 것과 같은, 적정 곡선을 사용하여, 분비된 분석물의 미지의 양들의 절대 값들을 발생시킬 수도 있다. 도 20 에 나타낸 바와 같이, 적정 곡선에서의 분석 스코어들은 절대 값 (즉, 분석 스코어들) 과 분석물 (즉, IgG) 의 기지의 양들 사이의 관계를 정의하는 구배 수식을 발생시키기 위해 임의의 라인-피팅 알고리즘과 피팅될 수도 있다. 그후, 실험 조건들 하에서 관측된 분석 스코어들이 주어지면, 실험 조건들 (즉, 미지의 양들의 분석물을 생성하는 세포들) 하에서 존재하는 분석물의 양을 나타내는 절대 값을 발생시키기 위해 구배 수식이 사용될 수도 있다. 도 20 에 나타낸 적정 곡선을 발생시키기 위해, Tableau 소프트웨어를 이용하여, 분석 스코어들의 표준 편차에 기초한 95% 신뢰 구간들을 이용한 로그 피트 모델을 생성하였다.
도 20 에 나타낸 바와 같이, IgG 의 기지의 양들에 대한 분석 스코어들은 대략 1 microgram/ml 에서 시작하는 선형 관계를 나타낸다. 즉, 분석 스코어들은 IgG 의 증가하는 양들에 응답하여 비례하는 증가를 나타낸다. 1 mcirogram/ml 아래의 농도들에서, 어떤 선형 관계도 관측되지 않는다. 따라서, 도 20 에 나타낸 적정 곡선은 대략 1microgram/ml 에서 정확한 정량화의 하한을 가지는 동적 범위를 나타낸다. 도 20 에 나타낸 적정 곡선은, IgG 의 최고 양에 대응하는 분석 스코어가 IgG 의 기지의 양들과 선형 관계를 나타내는 분석 스코어의 범위 이내에 있기 때문에, 상한을 나타내지 않는다.
도 20 에 도시된 곡선에 나타낸 바와 같이, 실험 조건들 (즉, IgG 를 분비하는 챔버들 내 세포들) 하에서 일반적으로 관측되는 분석 스코어들은 적정 곡선 상에 회색으로 표시되며 "분석 역가들의 전형적인 범위" 로 라벨링된다. 실험 조건들 하에서 관측되는 분석 스코어들이 IgG 의 기지의 양들과의 선형 관계들을 나타내는 분석 스코어들의 범위 내에 있기 때문에, 도 20 에 대해 발생된 구배가 실험 조건들 하에서 일반적으로 생성되는 IgG 의 양을 계산하는데 사용될 수 있다.
키트들. 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 분석물의 분비 레벨들의 평가를 위한 키트들이 제공될 수도 있으며, 상기 키트들은 유동 영역을 가지는 인클로저; 및 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 유동 영역 및 챔버는 유체 배지; 및 검출가능한 라벨 및 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분을 포함하는 리포터 분자를 포함하도록 구성된다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가질 수도 있으며, 격리 영역 및 연결 영역은 유체 배지의 성분들이 챔버의 유동 영역과 격리 영역 사이에 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성된다. 다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 인클로저는 유동 영역 및 챔버가 배치되는 기부를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 인클로저의 기부는 유전영동 구성을 가지는 기판을 포함할 수도 있다. 유전영동 구성은 광학적으로 구동될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 유동 영역은 채널일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 본원에서 설명하는 바와 같은 임의의 챔버와 유사하게 구성될 수도 있는 복수의 챔버들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 적어도 하나의 내측 표면은 공유결합으로 개질된 표면을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 키트의 미세유체 디바이스는 본원에서 설명되는 임의의 미세유체 디바이스와 유사하게 구성될 수도 있으며, 임의의 컴포넌트, 치수들, 및/또는 다수의 미세유체 회로 엘리먼트들을 임의의 조합으로 가질 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 펩티드 또는 단백질 결합 성분은 인간 또는 쥐 IgG 를 결합하는 펩티드 또는 단백질일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 CPD 1, CPD 2, CPD 3, CPD 4, CPD 7, CPD 8, CPD 9, CPD 10, CPD 11, CPD 12, CPD 13 또는 CPD 14 중 임의의 것일 수도 있다 (테이블 1 참조). 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 CPD 1, CPD 2, CPD 3 또는 CPD 4 일 수도 있다 (테이블 1 참조). 일부 실시형태들에서, 인간 또는 쥐 IgG 를 결합하는 단백질 결합 성분은 CPD 1 또는 CPD 2 일 수도 있다 (테이블 1 참조). 다른 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 압타머는 CPD 5 또는 CPD 6 일 수도 있다 (테이블 1). 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 압타머 결합 성분은 IgG 의 Fc 에 결합한다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨이다. 형광 라벨은 로다민, 형광물질, 또는 시아닌 형광 염료일 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 키트는 또한 유체 배지를 포함할 수도 있다. 유체 배지는 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 선택적 압력을 유지, 팽창 또는 제공하도록 구성될 수도 있다.
키트의 다양한 실시형태들에서, 키트는 또한 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들을 조절하도록 구성된 시약을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 시약은 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들을 공유결합으로 개질되도록 구성될 수도 있다.
여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 분비된 분석물의 레벨을 평가하는 키트가 제공된다. 키트는 미세유체 디바이스와 리포터 복합체를 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는 흐름 영역을 갖는 인클로저 및 복수의 챔버들을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 챔버는 상기 흐름 영역에 유체 연결되며, 상기 흐름 영역 및 상기 챔버들은 유체 배지를 포함하도록 구성된다. 리포터 복합체는 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 제1 복합체 성분, 및 제1 복합체 성분에 결합되고 검출가능한 라벨을 포함하는 제2 복합체 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 분비된 분석물의 제1 복합체 성분에 대한 결합은 제1 복합체 성분에 대한 제2 복합체 성분의 결합을 금지하거나 방지한다.
컴퓨터-구현 시스템.
컴퓨터-구현 시스템. 도 25 는 여러 실시형태들이 구현될 수도 있는 컴퓨터 시스템 3100 을 예시하는 블록도이다. 여러 실시형태들에 따르면, 컴퓨터 시스템 3100 은 정보를 통신하기 위한 버스 3102 또는 다른 통신 메커니즘, 및 정보를 프로세싱하기 위해 버스 3102 와 커플링된 프로세서 3104 를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 3100 은 또한 프로세서 3104 에 의해 실행될 명령들을 결정하기 위해 버스 3102 에 커플링된, 도시된 바와 같은 랜덤 액세스 메모리 (RAM) 또는 다른 동적 저장 디바이스일 수 있는, 메모리 3106 를 포함할 수 있다. 메모리 3106 는 또한 프로세서 3104 에 의해 실행될 명령들의 실행 동안 임시 변수들 또는 다른 중간 정보를 저장하는데 사용될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 3100 은 프로세서 3104 에 대한 정적 정보 및 명령들을 저장하기 위해 버스 3102 에 커플링된 판독 전용 메모리 (ROM) 3108 또는 다른 정적 저장 디바이스와 같은 다른 메모리 3108 를 더 포함할 수 있다. 정보 및 명령들을 저장하기 위해 자기 디스크 또는 광 디스크와 같은, 저장 디바이스 3110 를 제공하여, 버스 3102 에 커플링할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 컴퓨터 시스템 3100 은 컴퓨터 사용자에게 정보를 디스플레이하기 위해, 버스 3102 를 통해서 음극선관 (CRT) 또는 액정 디스플레이 (LCD) 와 같은 디스플레이 3112 에 커플링될 수 있다. 정보 및 지령 선택들을 프로세서 3104 로 통신하기 위해, 영숫자 및 다른 키들을 포함한, 입력 디바이스 3114 가, 버스 3102 에 커플링될 수 있다. 사용자 입력 디바이스의 다른 유형은 방향 정보 및 지령 선택들을 프로세서 3104 로 통신하고 디스플레이 3112 상에서의 커서 이동을 제어하기 위한 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향 키들과 같은 커서 제어기 3116 이다. 이 입력 디바이스 3114 는 일반적으로 디바이스로 하여금 평면에서의 위치들을 지정가능하게 하는 2개의 축들, 즉, 제 1 축 (즉, x) 및 제 2 축 (즉, y) 에서 2개의 자유도들을 갖는다. 그러나, 3 차원 (x, y 및 z) 커서 이동을 허용하는 입력 디바이스들 3114 이 또한 본원에서 고려될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
여기의 여러 실시형태들에 따르면, 프로세서 3104 가 메모리 3106 에 포함된 하나 이상의 명령들의 하나 이상의 시퀀스들을 실행하는 것에 응답하여 컴퓨터 시스템 3100 에 의해 결과들이 제공될 수 있다. 이러한 명령들은 다른 컴퓨터-판독가능 매체 또는 컴퓨터-판독가능 저장 매체, 예컨대 저장 디바이스 3110 로부터 메모리 3106 로 판독될 수 있다. 메모리 3106 에 포함된 명령들의 시퀀스들의 실행은 프로세서 3104 로 하여금 본원에서 설명되는 프로세스들을 수행가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 하드-와이어드 (hard-wired) 회로부가 본 교시들을 구현하기 위해 소프트웨어 명령들 대신 또는 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 교시들의 실시형태들은 하드웨어 회로부와 소프트웨어의 임의의 특정의 조합에 한정되지 않는다.
용어 "컴퓨터-판독가능 매체" (예컨대, 데이터 스토어, 데이터 스토리지, 등) 또는 "컴퓨터-판독가능 저장 매체" 는, 본원에서 사용될 때, 명령들을, 실행을 위해, 프로세서 3104 에 제공하는데 참여하는 임의의 매체들을 지칭한다. 이러한 매체는 비-휘발성 매체들, 휘발성 매체들, 및 송신 매체들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 다수의 형태들을 취할 수 있다. 비-휘발성 매체들의 예들은 저장 디바이스 3110 와 같은, 광학, 고체 상태, 자기 디스크들을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 휘발성 매체들의 예들은 메모리 3106 와 같은, 동적 메모리를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 송신 매체들의 예들은 버스 3102 를 포함하는 와이어들을 포함한, 동축 케이블들, 구리 와이어, 및 광섬유를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
컴퓨터-판독가능 매체들의 일반적인 형태들은 예를 들어, 플로피 디스크, 가요성 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드들, 종이 테이프, 홀들의 패턴들을 가진 임의의 다른 물리적인 매체, RAM, PROM, 및 EPROM, 플래시-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 또는 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 유형의 매체를 포함한다.
컴퓨터 판독가능 매체에 더해서, 명령들 또는 데이터가 하나 이상의 명령들의 시퀀스들을 실행을 위해 컴퓨터 시스템 3100 의 프로세서 3104 에 제공하기 위해 통신 장치 또는 시스템에 포함된 송신 매체들 상에 신호들로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 통신 장치는 명령들 및 데이터를 나타내는 신호들을 가지는 트랜시버를 포함할 수도 있다. 명령들 및 데이터는 하나 이상의 프로세서들로 하여금, 본 명세서의 개시물에 개요된 기능들을 구현가능하게 하도록 구성된다. 데이터 통신 송신 접속들의 대표적인 예들은 전화기 모뎀 접속들, 광역 네트워크들 (WAN), 근거리 네트워크들 (LAN), 적외선 데이터 접속들, NFC 접속들, 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 설명한 방법론들, 플로우 차트들, 다이어그램들 및 첨부된 개시물이 컴퓨터 시스템 3100 을 스탠드얼론 디바이스로서 이용하여 또는 클라우드 컴퓨팅 네트워크와 같은, 공유된 컴퓨터 프로세싱 리소스들의 분산 네트워크 상에서 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
분석물 정량화기 시스템.
분석물 정량화기 시스템. 다양한 실시형태들에 따르면, 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템들 및 방법들이 개시된다. 분석물은 예를 들어, 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 분석물은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 항체, 항원, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 분석물의 양은 아래에서 설명되는 바와 같이 상대 량일 수 있다.
도 26 은 다양한 실시형태들에 따른, 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템의 개략도이다. 본원에서 도시된 바와 같이, 시스템 3200 은 데이터를 출력하고 사용자 입력을 연관된 입력 디바이스 (미도시됨) 를 통해서 수신하기 위해, 이미지 획득 유닛 3202, 이미지 프로세싱 유닛 3204, 및 디스플레이 3212 를 포함할 수 있다.
(위의 도 1 에 도시된 이미징 모듈 (164) 과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 이미지 획득 유닛 (3202) 은 (위의 도 1 및 도 3b 에 도시된 지지 구조(104, 300)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 미세유체 디바이스 홀더(3214) 및 (위에서 참조된 이미징 디바이스 (194) 와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 이미징 엘리먼트 (3216) 를 포함할 수 있다.
미세유체 디바이스 홀더 3214 는 미세유체 디바이스를 고정하도록 배향되고 설계될 수 있다. 미세유체 디바이스는 (상기 도 1b-도 1c, 도 2a-도2b, 도 2d, 도 2g-도 2h, 도 3a, 도 4a-도4c, 도 5a-도5c, 도 9b, 도 10b, 도 11a-도 11b 및 도 12a-도 12b 에 도시된 미세유체 디바이스 (200, 230, 250, 280, 290, 320, 400, 500, 900, 1000, 1100 및 1200) 와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 본원에서 설명되는 다양한 예들 중 임의의 예를 포함할 수 있다. 대안적으로, 홀더 3214 는 미세유체 디바이스와 통합될 수 있다. 미세유체 디바이스는 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결될 수 있는 챔버, 또는 복수의 챔버들을 포함할 수 있으며, 여기서, 챔버들의 각각은 하나 이상의 마이크로-객체들을 수용할 수 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 챔버들은 예를 들어, 챔버들일 수 있다. 챔버들은 이들이 사용되는 특정의 애플리케이션에 의해 요구되는 따라 임의의 형상, 사이즈 또는 방위일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 전술한 바와 같이, 유동 영역은 (상기 도 1a 및 도 2a-도 2c 에 도시된 채널 (122), 및 상기 도 2d-도 2f 에 도시된 유동 채널 (264) 과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 단일 미세유체 채널, 또는 복수의 미세유체 유동 채널들일 수 있으며, 이는 단일 유동 경로 또는 복수의 유동 경로 (예를 들어, 상기 도 1a 내지 도 2b에 도시된 유동 경로(106), 및 도 2c-도 2d, 도 4a-도 4c, 도 5a, 도 9a, 도 10b, 도 12a 에 도시된 바와 같은 배지 (242 및 278) 의 흐름과 같으나 이에 제한되지 않는) 를 제공한다. 유동 영역은 단일, 또는 복수의 챔버들과 유체 연통할 수 있다. 대안적으로, 유동 영역은 예를 들어, 밸브와 같은 가역성 클로져를 통해, 단일 챔버, 또는 복수의 챔버들과 유체 연통할 수도 있다. 유동 영역은 앞에서 설명된 바와 같이 입구를 통해서 물질의 유동을 수용하도록 구성될 수 있다. 물질의 유동은 예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제 또는 시약들의 유동, 또는 그 물질을 포함하는 배지의 유동을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는 유동 통로를 통한 그리고 챔버들로의 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 유동을 수용하도록 더 구성될 수 있다. 결합제는 분석물에 결합 시, 결합제의 검출가능한 라벨 (예컨대, 형광, UV, 등) 에 의해 방출되는 광과 같은, 전자기 방사선을 방출할 수도 있다. 분석물은 예를 들어, 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 분석물은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 항체, 항원, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다.
이미징 엘리먼트 (216) 는 미세유체 디바이스의 복수의 챔버들 및 흐름 영역의 하나 이상의 분석 이미지들 (3222) (도 27 참조) 을 캡쳐하도록 구성될 수 있다. 이미징 엘리먼트 (3216) 는 아래에서 자세히 설명되는 바와 같이 하나 이상의 분석 이미지들 (3222) 과 함께 분석되고 구현될, 하나 이상의 대응하는 배경 이미지들 (3218) (도 27 참조) 및/또는 하나 이상의 대응하는 신호 참조 이미지들 (3220) (도 3 참조) 을 캡쳐하도록 더 구성될 수 있다.
배경 이미지(3218)(예를 들어, 도 27 참조)는 (예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제, 또는 다른 시약들과 같은) 임의의 이물질이 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 이미징 엘리먼트 3216 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 해서, 배경 이미지 3218 는 아래에서 추가로 설명되는, 디바이스에서, 특히 관심 영역에서, 임의의 배경 잡음을 캡쳐한다. 배경 잡음은 예를 들어, 아티팩트들, 또는 기구 셋업 및 이미징 파라미터들-예를 들어, 여기 소스로부터의 광, 카메라 잡음, 및 주변 광에 기인할 수 있다. 또한, 배경 잡음은 예를 들어, 샘플들, 용기들, 이미징 배지들의 자발-형광, 또는 특정의 타겟들에 결합되지 않은 형광들로 인한 형광에 의해 주어지는 배경 형광에 기인할 수 있다. 어떤 이미지 영역이 배경 이미지에 포함되는지는 그 이미지가 시스템 상에서 어떻게 구현되는지에 의존한다. 예를 들어, 아래에서 자세하게 설명되는 바와 같이, 사용되는 교정 방법들에 따라서, 상이한 배경 이미지 영역이 요망될 수도 있다.
배경 이미지(3220)(예를 들어, 도 27 참조)는 결합제 농도가 관심 영역 ("AOI") 에서 평형을 이루는 레벨까지 결합제가 챔버들로 도입된 후, 이미징 엘리먼트 3216 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 함으로써, 신호 참조 이미지 3220 는 디바이스에서 이미지 획득 왜곡들을 캡쳐한다. 이러한 왜곡들은 예를 들어, 미세유체 또는 이미징 엘리먼트 설계에 기인할 수 있다. 이미지 왜곡 유형들은 예를 들어, 이미지 에지 효과들, 원근 왜곡, 배럴 왜곡, 핀쿠션 왜곡, 머스타치 (mustache) 왜곡, 및 색 수차를 포함할 수 있다. 신호 참조 이미지 영역은 AOI 의 이미지, 챔버에 인접한 유동 영역 및 연관된 AOI, 또는 양자를 포함할 수 있다. 어떤 이미지 영역이 신호 참조 이미지에 포함되는지는 그 이미지가 시스템에 의해 어떻게 구현되는지에 의존한다. 예를 들어, 아래에서 좀더 상세히 제공되는 바와 같이, 시스템에 의해 구현되는 교정 방법들에 따라서, 상이한 신호 참조 이미지 영역이 이용될 수도 있다.
도 26 의 시스템 (3200) 의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 3204 은 관심 영역 결정 엔진 3206 (AOI 엔진 3206) 및 스코어링 엔진 3210 을 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛 3204 의 부분으로서 도시되는 (그리고, 본원에서 설명되는) 각각의 컴포넌트 (예컨대, 엔진, 모듈, 등) 가 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합으로서 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 3204 은 이미지 획득 유닛 3202 과의 통합된 기구 시스템 어셈블리로서 구현될 수 있다. 즉, 이미지 프로세싱 유닛 3204 및 이미지 획득 유닛 3202 은 동일한 하우징 어셈블리 내에 하우징될 수 있으며 종래의 디바이스/컴포넌트 접속 수단 (예컨대, 직렬 버스, 광학적 케이블링, 전기적 케이블링, 등) 을 통해서 통신할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 광학, 직렬 포트, 네트워크 또는 모뎀 접속을 통해서 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속된 (상기 도 26 에 나타낸 바와 같은) 스탠드얼론 컴퓨팅 디바이스로서 구현될 수 있다. 예를 들어, 이미지 프로세싱 유닛은 분석의 이미지 프로세싱 유닛 3204 으로의 이미지 획득 유닛 3202 에 의해 획득된 이미징 데이터의 송신을 가능하게 하는 LAN 또는 WAN 접속을 통해서 접속될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 3204 의 기능들은 WAN (또는, 등가물) 접속을 통해서 이미지 획득 유닛 3202 에 통신가능하게 접속된 (클라우드 컴퓨팅 네트워크와 같은) 공유된 컴퓨터 프로세싱 리소스들의 분산 네트워크 상에서 구현될 수 있다. 예를 들어, 이미지 프로세싱 유닛 3204 의 기능들은 AMAZON WEB SERVICES™ 과 같은 클라우드 프로세싱 서비스 상의 하나 이상의 컴퓨팅 노드들에서 구현되도록 분할될 수 있다.
관심 영역 결정 엔진 3206 (AOI 엔진 3206) 은 캡쳐된 분석시험 이미지를 이미징 엘리먼트 3216 로부터 수신하고 분석시험 이미지에 묘사된 각각의 챔버에 대해 AOI 를 정의하도록 설계 및 구성될 수 있다. 관심 영역 결정 엔진 3206 은 AOI 내에, 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감한 챔버 내 이미지 영역을 포함시킴으로써, 적합한 AOI 를 정의하도록 프로그래밍될 수 있다. 예를 들어, 이것은 광 방출들 (예컨대, 형광, UV, 등) 과 같은, 전자기 방사선에서의 가장 작은 변동들이 이미징 엘리먼트 3216 에 의해 측정될 수 있는 챔버 내 영역일 수 있다. 또한, 이미지 영역은 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 이미지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 광 방출들 (예컨대, 형광, UV, 등) 과 같은, 전자기 방사선의 측정들의 감도가 챔버 내 마이크로-객체들의 존재에 의해 가장 적게 영향을 받는 챔버 내 영역일 것이다. AOI 는 개별 챔버와 개별 챔버와 유체 연통하는 흐름 영역 사이에서, 확산 축 (3302) (도 28 참조) 을 따라서 연장되도록, 심지어 더 정의될 수 있다. 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 이 AOI는 또한 예를 들어 도 32 에 도시된 바와 같이 챔버의 스윕되지 않은 영역일 수 있다.
도 28 에 도시된 예시적인 실시형태에서, 확산 축 3302 은 미세유체 디바이스 및 그의 대응하는 챔버들에 관한 공간 정보를 이용하여 결정될 수 있다. 그 공간 정보는 시스템 3200 에 포함된 CAD 모델, 연관된 소프트웨어, 또는 별개의 소프트웨어 패키지로부터 도출되어, 정의된 비정렬된 AOI 3224 를 생성할 수 있다. 이미징 엘리먼트 및 미세유체 디바이스에 대한 교정 알고리즘들은 그후 이미지 데이터를 이 CAD 모델에 맵핑하여 적합한 확산 축 3302 을 획득할 수 있다. 이 맵핑에 기초하여 공간 정정 변환 3226 을 적용하면, 관심 영역 결정 엔진 3206 은 정렬된 AOI들 3228 의 세트를 생성할 수 있다. AOI 는 관심 영역 결정 엔진 3206 으로부터 자동적으로 결정될 수 있거나 또는 디스플레이 3212 에의 사용자 입력을 통해서 수동으로 결정될 수 있다.
도 26 의 시스템 3200 의 스코어링 엔진 3210 은 각각의 챔버의 관심 영역 내 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 설계 및 구성될 수 있다. 더욱이, 스코어가 분석물의 상대 량, 또는 농도를 표시하기 위해 스코어링 엔진 3210 에 의해 다른 스코어들과 비교될 수 있는 무차원 값일 수 있기 때문에, 결정된 스코어는 사용자를 위한 농도의 단위들로 변환될 수 있다.
스코어를 결정하기 위해, 스코어링 엔진 3210 은 다양한 모델들을 사용할 수 있다. 일부 모델들은, 아래에서 설명되는 바와 같이, 예를 들어, 각각의 챔버, 유동 영역, 또는 양자에서 분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 양을 정량화하는 형광 데이터를 이용하는 모델들일 수 있다. 분석물은 예를 들어, 챔버 내 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 스코어링 엔진 3210 은 특히, AOI 에 걸쳐, (예를 들어, 형광 값들과 같은) 결합된 리포터 분자 데이터를 이용하여, 그 챔버 내 분석물의 양을 표시하는, 개별 챔버에 대한 스코어를 결정할 수 있다. 스코어링 모델들의 비한정적인 예들은 선형 회귀 분석을 각각의 챔버의 AOI 의 이미지 영역의 부분에 걸쳐서 광 방출 데이터 (예컨대, 형광 값들 또는 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 에 적용하는 것, S자형 모델을 AOI 에 적용하는 것, 관심 분석물을 방출하는 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 불변량인 AOI 의 평균 강도를 이용하는 것, 또는 각각의 챔버의 AOI 의 이미지 영역의 부분에 걸쳐서 광 방출 데이터 (예컨대, 형광 값들 또는 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 를 통합하는 것을 포함한다.
S자형 모델링은, 예를 들어, S자형, 또는 기호논리학, 곡선들, 수식들 및 세부 사항들에 의해 AOI 에서 확산 구배를 근사화한다. 예를 들어, 생장률, 점근선들 사이의 차이, 및 변곡점 위치와 같은, 파라미터들의 조합을 이용한 정량 모델은 필요한 정확도 및/또는 정밀도를 산출할 수도 있다. 모델의 파라미터들은 예를 들어, 사용된 S자형 곡선의 정확한 유형에 따라서 비선형 회귀 또는 곡선 회귀에 의해 추정될 수 있다. 일반적인 모델 파라미터 추정 기법들은 예를 들어, Levenberg-Marquardt, 심플렉스, 및 시뮬레이트된 어닐링을 포함한다. 휴리스틱 기법들이 비선형 회귀와 같은 반복 피팅 기법들 동안 수렴을 보장하는 것을 추가로 돕기 위해 파라미터들을 초기화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상부 및 하부 점근선들이 AOI 의 극치에서의 서브-영역들의 평균들에 의해 거칠게 추정될 수 있다.
대안적으로, 도 27 의 실시형태에 도시된 바와 같이, AOI 에 대해 상기 스코어링 모델들을 적용하기 전에, 스코어링 엔진 (3210) 은 정렬된 AOI (3228) 를 별개의 세그먼트들 (3230) 로 확산 축 (3302) 을 따라서 파티션할 수 있다 (도 28 참조). 도 28 는 유동 영역 3308, 챔버 3306, 확산 축 3302, 복수의 세그먼트들 3304 및 마이크로-객체 3310 를 포함한, 미세유체 디바이스의 부분의 일 예를 도시한다. 세그먼트들 3304 의 개수는 필수 스코어링 모델을 수행하기 위해 필요에 따라 변할 수 있다. 세그먼트들 3304 의 개수는 예를 들어, 20 개일 수 있다. 세그먼트들 3304 에 대해, 스코어링 엔진 3210 은 중간 값 3232 을 계산할 수도 있으며, 여기서, 값은 예를 들어, 각각의 챔버 3306, 유동 영역 3308, 또는 양자 내 분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 양을 표시하는, 형광 값들과 같은, 전자기 방사선 값들일 수 있다. 분석물은 예를 들어, 마이크로-객체 3310 로부터의 분비물들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 스코어링 엔진 3210 은 그후 하위섹션 정량화 프로세스 3234 를 통해서 파라미터들의 세트에 기초하여 세그먼트들 3304 (또는 빈들) 의 서브세트를 결정할 수 있다.
스코어링 엔진 3210 은 하위섹션 정량화 프로세스 3234 를 통해서, 스코어링 엔진 3210 에 (예를 들어, 무선으로, 원격 소프트웨어 프로그램으로, 사용자 입력으로) 원격으로 인코딩되거나 또는 제공되는 명령들의 세트를 이용하여, 세그먼트들 3304 (또는 빈들) 의 서브세트를 결정할 수 있다. 명령들의 세트는 예를 들어, 마이크로-객체 유형들, 챔버 내 마이크로-객체 카운트들, 세그먼트 카운트들 (또는 빈 카운트들), 하위섹션 카운트들 및 하위섹션 위치들의 상이한 조합들을 이용하여 수행되는, 예를 들어, 이전의 수치 시뮬레이션들에 기초할 수 있다. 이 데이터를 이용하여, 관심 마이크로-객체를 다양한 수치 시뮬레이션들과 연관시켜 관심 생물학적 마이크로-객체의 분석에 적합한 세그먼트들의 서브세트를 결정하는 명령들이 인코딩될 수 있다.
세그먼트들 3304 의 서브세트는 상기 챔버 3306 에 대한 스코어를 결정하는데 필요한 전체 세그먼트 카운트 내 임의의 세그먼트들의 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제공된 파라미터들 또는 명령들의 세트에 기초하여, 스코어링 엔진 3210 은 빈들 9-13 을 특정의 챔버에 대한 스코어를 결정할 때에 사용되는 빈들의 서브세트로서 결정할 수 있다. 이전에 설명된 것들과 같은, 스코어링 모델들을 적용하면, 스코어링 엔진 3210 은 그후 상기 챔버에 대한, 분비 스코어 3236 와 같은, 스코어를 결정할 수 있다.
대안적으로, 여러 실시형태들에 따르면, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 예를 들어 도 26 및 도 27 에 도시된 바와 같은 교정 엔진 (3208) 을 더 포함할 수 있다. 교정 엔진 3208 은 미세유체 디바이스로부터의 배경 잡음에 의해 그리고 분석시험 이미지 캡쳐 동안 초래되는 이미지 왜곡들에 대해 각각의 챔버의 AOI 정규화 프로세스 3238 를 적용하도록 설계 및 구성될 수 있다. 결과적인 교정된 이미지 AOI 가 그후 스코어링 엔진 3210 에 의해 스코어링될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 배경 잡음은 예를 들어, 아티팩트들, 또는 기구 셋업 및 이미징 파라미터들-예를 들어, 여기 소스로부터의 광, 카메라 잡음, 및 주변 광에 기인할 수 있다. 또한, 배경 잡음은 예를 들어, 샘플들, 용기들, 이미징 배지들의 자발-형광, 또는 특정의 타겟들에 결합되지 않은 형광들로 인한 형광에 의해 주어지는 배경 형광에 기인할 수 있다. 분석시험 이미지 캡쳐 동안의 이미지 왜곡들은 예를 들어, 미세유체 디바이스 설계 또는 이미징 디바이스 설계에 기인할 수 있다. 이미지 왜곡 유형들은 예를 들어, 이미지 에지 효과들, 프로젝터 불-균일성, 카메라 비네트, 원근 왜곡, 배럴 왜곡, 핀쿠션 왜곡, 머스타치 왜곡, 및 색 수차를 포함할 수 있다.
교정 엔진 3208 은 분석시험 이미지 캡쳐 동안 도입되거나 및/또는 도입 전 미세유체 디바이스로부터의 이미지 왜곡들에 대해, 각각의 챔버의 AOI, 또는 적어도 각각의 챔버의 AOI 의 이미지 영역을 정규화하도록 설계 및 구성될 수 있다. 교정 엔진 3208 은 분석시험 이미지 및/또는 신호 참조 이미지로부터 배경 이미지를 감산하고 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 이를 달성할 수 있다. 결과적인 정규화된 이미지 AOI 가 그후 스코어링 엔진 3210 에 의해 스코어링될 수 있다.
피쳐 추출 및 비정상 검출을 위해 이미지를 정규화하는 다양한 모델들이 존재한다. 일 실시형태에서, 통계적 추론을 통한 데이터 배제가 AOI 를 정규화하기 전에 비정상들을 제거할 수 있다. 매우 낮거나 또는 매우 높은 강도들을 가질 수도 있는, 이물질과 같은 비정상들이 모든 AOI 데이터의 분포 내 주어진 데이터 지점의 z-스코어를 계산하는 것과 같은, 기본적인 통계적 변환들로 검출될 수 있다.
여러 실시형태에 따르면, 통계적 추론을 통한 데이터 배제는 AOI 를 정규화하기 전에 비정상들을 제거할 수 있다. 이상적인 확산 프로파일이 일반적으로 확산 축에 직교한 임의의 라인을 따라서 상수 값을 갖기 때문에, 이물질과 같은, 비정상들이 AOI 에 존재하는지 여부를 통계적으로 추론하고 모델링으로부터 이들 데이터 지점들을 제외하는 것이 가능하다. AOI 에서의 각각의 데이터 지점은 무작위 변화로 인한 그의 발생의 확률을 표시하는 z-스코어로 변환될 수 있다. 예를 들어, AOI 가 주어지고, 여기서, I 가 주어진 지점에서의 강도 값이고, μ 가 평균 강도 값이고, σ 가 표준 편차이고, y 가 확산의 방향을 표시하고 x 가 그것에 직교하면, 주어진 지점에서의 z-스코어는 하기 수식 (1) 을 통해서 계산될 수 있다:
Figure pct00005
상기 수식에 의해 발생되는 z-스코어들이 주어진 임계치보다 큰 z-스코어 크기들을 가진 데이터를 제외시키기 위해 사용될 수 있다. 이 프로세스는 상이한 사이즈들 및 강도들의 비정상들을 반복적으로 제거하기 위해 반복될 수 있다.
여러 실시형태들에 따르면, 구분적 모델링은 AOI 를 정규화하기 전에 비정상들을 제거할 수 있다. 확산 프로파일이 확산 축에 직교한 임의의 방향을 따라서 이상적으로 일정하다는 원리에 기초하여, AOI 의 N 개의 칼럼들에 걸쳐서 독립적으로 분석 모델을 피팅할 수 있다. 이상적인 시스템에서, 이들 모델들은 동일한 파라미터 추정치들을 모두 산출할 것이다. 실제는, 이들은 정상적으로 분포될 것이다. 그러나, 오정렬 또는 이물질의 존재와 같은, 비정상들의 경우, 파라미터 추정들의 분포에서 추가적인 양식들 (modalities) 이 존재할 것이다. AOI-칼럼의 데이터에 대한 모델들의 상관 관계와 같은 정보를 모든 파라미터 추정들의 분포 내에서의 주어진 파라미터의 크기의 출현율과 결합함으로써, 어느 모델들이 비정상 결과를 반영하는지를 결정할 수도 있으며, 따라서, 추가적인 분석으로부터 배제되어야 한다. 이것은 관심 데이터를 적합하게 정규화하기 위해 위에서 설명된 z-스코어 기법과 함께 사용될 수도 있다.
여러 실시형태들 따르면, 지점 x,y 에서의 분석 이미지에 대한 정규화된 값들 (ICorrected) 은 하기 수식 (2) 에 따라, 배경 이미지 "a" 및 신호 참조 이미지 "c" 데이터를 이용하여 발생 및 캡쳐될 수 있다:
Figure pct00006
여러 실시형태에 따르면, G 스코어는 AOI 에서의 모든 데이터 지점들을 정규화하기 위해 발생된다. 배경 이미지 "a" 및 신호 참조 이미지 "c" 를 캡쳐한 후, 보정 인자 "G" 는 하기 수식 (3) 에 따라서 계산될 수 있다:
Figure pct00007
보정 인자 G 는 그후, 다음과 같이 적용되어, AOI 의 스코어링을 위한 수식 (4) 에 따라서 분석 이미지에 대한 정규화된 값들 (ICorrected) 이 결정될 수 있다:
Figure pct00008
분석시험 이미지에 대한 정규화된 값들을 이용하여, 스코어링 엔진 3210 은 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분을 분석하여 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 더 설계 및 구성될 수 있다. 상술한 바와 같이, 스코어링 모델들의 예들은 선형 회귀 분석을 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 적용하는 것, 또는 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 걸쳐서 형광 값들 (또는, 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 을 통합하는 것을 포함한다.
대안적으로, 여러 실시형태에 따르면, AOI 의 신호 참조 이미지 및 배경 이미지를 이용하기 보다는, 교정 엔진 3208 은 챔버(들) 에 인접한 유동 영역 및 연관된 AOI(들) 뿐만 아니라, 생물학적 마이크로-객체들을 포함하지 않는 미세유체 디바이스의 다른 영역들의 신호 참조 이미지 및/또는 배경 이미지를 이용한 교정을 위해 상기 실시형태들을 적용할 수도 있다. 이들 "비-AOI" 이미지들은 위에서 자세하게 설명된 바와 같이 분석 이미지 데이터를 정규화하기 위해 분석 이미지 데이터와 함께 사용될 수 있다.
다양한 실시형태들에 따르면, 이미지 획득 유닛 3202 및 이미지 프로세싱 유닛 3204 은 단일 물리 유닛으로 통합될 수 있다. 대안적으로, 이미지 획득 유닛 3202 및 이미지 프로세싱 유닛 3204 은, 유닛들이 여전히 정보를 교환하도록 통신가능하게 접속되도록 독립적인 유닛들로 제공되면, 분리가능하게 배향될 수 있다.
위에서 설명된 이미지 프로세싱 유닛 3204 의 각각의 컴포넌트는 하드웨어일 수도 있거나 또는 부분적으로 또는 전체적으로 소프트웨어 모듈일 수도 있다.
도 29 는 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법을 나타내는 예시적인 플로우차트이다. 본원에서 도시된 바와 같이, 스텝 (3410) 은 도 26 의 시스템 (3200) 의 이미지 획득 유닛 (3202) 의 관심 영역 엔진 (3206) 에 의해 이용될 수 있는 예시적인 작업흐름을 상술한다. 단계 3410 에서, 관심 영역 엔진 3206 은 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결된 복수의 챔버들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하며, 여기서, 이미징 데이터는 배경 잡음 이미지, 신호 참조 이미지 및 분석물 분석시험 이미지 중 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 배경 이미지는 (예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제, 또는 다른 시약들과 같은) 임의의 이물질이 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 이미징 엘리먼트 3216 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 해서, 배경 이미지는 시스템 3200 및 디바이스 상의 영역들의 이미지 캡쳐들과 연관된 임의의 배경 잡음을 캡쳐한다. 배경 잡음의 예들은 앞에 설명되어 있다. 신호 참조 이미지는 결합제 농도가 디바이스에서 평형을 이루는 레벨까지 결합제가 챔버들로 도입된 후 이미징 엘리먼트 3216 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 함으로써, 신호 참조 이미지는 시스템 3200 과 연관되고 디바이스 상의 영역들의 이미지 캡쳐들과 연관된 이미지 획득 왜곡들을 캡쳐한다.
수신된 이미징 데이터는 예를 들어, 하나 이상의 챔버들, 유동 영역, 또는 양자에서 분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제로부터 방출된 형광으로부터 결정된 형광 방출 데이터를 포함할 수 있다. 분석물은 예를 들어, 마이크로-객체들로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체들은 생물학적 마이크로-객체들일 수 있다. 생물학적 마이크로-객체들로부터의 분비물들은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 가지는 유기 분자, 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 챔버들은 예를 들어, 챔버들일 수 있다.
본원에서 도시된 바와 같이, 스텝들 (3420 및 3430) 은 도 26 의 시스템 (3200) 의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 스코어링 엔진 (3210) 에 의해 이용될 수 있는 예시적인 작업흐름을 상술한다. 단계 (3420) 에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 각각의 챔버에 대한 관심 영역 ("AOI") 을 정의할 수 있다. AOI 는 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감한 챔버 내 이미지 영역을 포함할 수 있다. AOI 는 분석물 변동들이 측정될 때 챔버 내 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 이미지 영역을 더 포함할 수 있으며, 심지어, 이미지 영역은 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장될 수 있다.
단계 3430 에서, 스코어링 엔진 3210 은 각각의 챔버에 대한 AOI 의 부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정할 수 있다. 챔버 당 스코어를 결정하기 위해, 스코어링 엔진 3210 은 위에서 설명한 바와 같은 다양한 모델들을 이용할 수 있다. 일부 모델들은 예를 들어, 분석물에 결합하는 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 양을 정량화하는 형광 데이터를 이용하는 모델들일 수 있다. 분석물은 예를 들어, 챔버 내 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 스코어링 엔진 3210 은 특히, AOI 에 걸쳐, 결합된 리포터 분자 데이터 (또는, 형광 값들) 를 사용하여, 그 챔버 내 분석물의 양을 표시하는, 개별 챔버에 대한 스코어를 결정할 수 있다. 스코어링 모델들의 비한정적인 예들은 선형 회귀 분석을 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 적용하는 것, 또는 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 걸쳐 형광 값들 (또는, 어떤 다른 유형의 검출가능한 신호) 을 통합하는 것을 포함한다.
도 30 은 분석물 분석시험 이미지에서 챔버들의 각각에 대한 정규화된 AOI 를 획득하기 위해 이미징 데이터에 적용될 수 있는 교정 방법을 예시한다. 본원에서 도시된 바와 같이, 스텝들 (3510 내지 3530) 은 도 26 의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 의 교정 엔진 (3208) 에 의해 이용될 수 있는 교정 방법에 대한 예시적인 작업흐름을 상술한다.
단계 3510 에서, 교정 엔진 3208 은 이전에 논의된 바와 같이 배경 이미지, 신호 참조 이미지 및 분석물 분석시험 이미지의 이미징 데이터의 하나 또는 조합을 포함할 수 있는 이미지 획득 유닛 3202 로부터 이미징 데이터를 수신할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이미징 데이터는 미세유체 디바이스 상의 챔버 당 관심 영역으로부터의 형광 값들의 형태일 수 있다. 이미징된 형광은 (배경 이미지에 대해) 배경 잡음으로부터, (신호 참조 이미지에 대해) 관심 영역을 채우는 결합제로부터, 또는 예를 들어, 챔버 내에 존재하는 생물학적 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수도 있는 분석물에 결합하는 (예를 들어, 분석물 분석 이미지를 위한, 리포터 분자와 같은) 결합제에 의한 방출들로부터, 유래하는 것일 수 있다.
단계 3520 에서, 교정 엔진 3208 은 신호 참조 이미지 및 분석물 분석시험 이미지 값들로부터 배경 이미지 값들을 감산할 수 있다. 그렇게 함으로써, 시스템에 이미 존재하는 임의의 배경 잡음이 잡음에 의해 더 이상 영향을 받지 않는 양자의 이미지들에 대해 배경 보정된 값들을 획득하기 위해 신호 참조 이미지 및 분석물 분석시험 이미지 값들로부터 제거된다.
단계 3530 에서, 교정 엔진 3208 은 신호 참조 이미지를 통해서 식별될, 이전에 설명된 이미지 획득 왜곡들을 고려하기 위해, 신호 참조 이미지의 배경 보정된 값들과 분석물 분석시험 이미지 값들을 비교함으로써, 분석물 분석시험 이미지 값들을 추가로 보정할 수 있다. 이 비교는 특히, AOI 내에서, 정규화된 분석물 분석시험 이미지 값들을 발생시킬 것이다. 정규화된 값들을 결정하는 연관된 수식들 및 계산들의 예들은 위에 제공되어 있다.
정규화된 데이터를 이용하여, 스코어링 엔진 3210 은 각각의 챔버에 대한 현재 정규화된 AOI 의 부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 설명된 방법론들은 애플리케이션에 의존하여 다양한 수단에 의해 구현될 수도 있다. 예를 들어, 이들 방법론들은 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합에서 구현될 수도 있다. 하드웨어 구현을 위해, 프로세싱 유닛은 하나 이상의 주문형 집적회로들 (ASICs), 디지털 신호 프로세서들 (DSPs), 디지털 신호 프로세싱 디바이스들 (DSPDs), 프로그래밍가능 로직 디바이스들 (PLDs), 필드 프로그래밍가능 게이트 어레이들 (FPGAs), 프로세서들, 제어기들, 마이크로-제어기들, 마이크로프로세서들, 전자 디바이스들, 본원에서 설명되는 기능들을 수행하도록 설계된 다른 전자 유닛들, 또는 이들의 조합 내에서 구현될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 교시의 방법은 펌웨어 및/또는 소프트웨어 프로그램 및 C, C ++ 등과 같은 종래의 프로그래밍 언어로 작성된 애플리케이션으로 구현 될 수도 있다. 펌웨어 및/또는 소프트웨어로서 구현되는 경우, 여기에 기술된 실시형태들은 컴퓨터로 하여금 전술한 방법을 수행하게 하는 프로그램이 저장된 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체 상에 구현될 수있다. 본원에서 설명되는 다양한 엔진들이 도 25 의 컴퓨터 시스템 (3100) 과 같은 컴퓨터 시스템 상에 제공될 수 있으며, 이에 의해 프로세서 (3104) 가 메모리 컴포넌트들 (3106/3108/3110) 및 입력 디바이스 (3114) 를 통해서 제공되는 사용자 입력 중 임의의 하나, 또는 이들의 조합에 의해 제공되는 명령들에 따라, 이들 엔진들에 의해 제공되는 분석들 및 결정들을 실행할 것으로 이해되어야 한다.
후크 영역 시뮬레이션
챔버 및 유동 영역으로 구성된 지오메트리 내부의 층류 및 확산 수송은 RMSA 복합체(예를 들어, 결합된 RMSA 복합체, 결합된 복합체 등) 신호에 민감한 챔버 내의 위치를 결정하기 위해 모델링되었다. 단일 챔버 지오메트리는 모델을 매개변수화하는 데 사용되었다. 시뮬레이션에 사용된 경계 조건은 도 40a에 나와 있다. 가용성 리포터 분자들 (예를 들어, 리포터 분자, 리포터 등) 을 갖지 않는 액체 배지가 가용성 리포터 분자가 있는 액체 매질이 유동 영역으로 이전에 흘려진 후 유동 영역을 통해 미세유체로 유입되는 경우, 유체 유동장은 분석의 플러시 단계 동안 실험적으로 사용된 1.7μL/s 체적 유량과 일치하도록 4.8mm/s의 입력 유량으로 시간에 따라 일정하다. 각각의 종들 (예를 들어, 가용성 리포터 분자, RMSA 복합체 등) 은 독립적으로 간주되고 자유 가용성 리포터 분자의 초기 농도는 지오메트리 전반에 걸쳐 1 mol/m3 로 설정된다. 농도는 확산 방정식에서 상수항이며, 따라서 이 값은 표준 곡선의 각 조건에 대한 실제 값으로 정규화될 수 있다. t=0에서 농도는 분석을 수행하기 전에 플러싱과 일치하도록 입구에서 0으로 설정된다. 채널의 출구는 자유 경계이어서 지오메트리 밖으로 유체 및 분자 수송을 허용한다.
확산 계수는 스톡스-아인슈타인 방정식(D = kT/(6πηr))을 사용하여 추정되며, 여기서 k는 볼츠만 상수, T는 절대 온도, η는 액체 동점도, r은 분자 반경이다. 자유 리포터 분자의 반경은 Rmin = 0.066M1/3로 추정될 수 있으며, 여기서 M은 달톤 단위의 분자의 분자량이고, Rmin 은 나노미터 단위이다. 이것은 패킹된 구체라고 가정할 때 리포터 분자의 가장 작은 추정 크기를 제공한다.
분자량 및 추정된 확산 계수와 함께 관심의 예시적인 가용성 리포터 분자는 일부 대표적인 분자량에 대한 확산 계수에 추가하여 표 3 에 나열되어 있다.
Figure pct00009
표 3. 분자량 및 추정 확산 계수
예시적인 리포터 분자, SpotLight Hu3 를 사용한 표준 곡선 실험을 수행하여 CV (분산 계수)를 최소화하고 검출 하한을 최대화하여 형광 측정을 수행해야 하는 시기를 결정했다. 표준 곡선에서 가용성 리포터 분자와 분비된 분석물 분자의 혼합물을 96웰 플레이트에서 배양한 다음 칩으로 가져왔다. 평형 후, 혼합물은 0.17 μL/s로 채널에서 플러싱되었다. 이 플러시 동안 칩에서 형광 이미징을 수행하여 챔버 외부로 리포터 분자와 RMSA 복합체의 확산을 관찰했다. 사용된 조건은 표 4에 요약하였다. 모든 조건에서 리포터 분자는 분비된 분석물의 몰 과량으로 8배 이상이다.
Figure pct00010
표 4 IgG1-SpotLight Hu3의 표준 곡선 조건
이러한 조건은 다음 가정을 사용하여 수치 시뮬레이션에서 재현된다. 첫째, 결합 동역학은 모든 표적 분자가 리포터 분자에 의해 결합되고 해리가 측정 기간보다 느리다는 가정에 따라 무시되었다. 따라서 리포터 분자와 RMSA 복합체의 확산은 초기 농도로 독립적으로 처리될 수 있다. [RMSA 복합체] = [분비된 분석물], 및 [리포터 분자] = [리포터 분자]0 - [분비된 분석물]. 또 다른 가정은 가용성 리포터 분자의 평형화와 분석 플러시 사이의 플러싱 단계가 무시된다는 것이다. 또한 챔버 간의 확산 상호 작용도 무시되었다.
표준 곡선을 모델링하기 위해 표 3에 나열된 확산 계수를 사용하여 리포터 분자 및 결합 RMSA 복합체에 대해 두 가지 독립적인 시뮬레이션을 수행했다. 각 시뮬레이션의 조건은 리포터 분자(작은 분자량, 더 확산됨) 및 결합된 RMSA 복합체(더 큰 분자량, 덜 확산됨)에 대해 확산 계수가 변한다는 점을 제외하고는 거의 동일하다. 1시간(3600초) 동안 10초 분해능으로 도 40B에 도시된 경계 조건을 사용하여 펜 외부로의 리포터 분자 및 결합된 RMSA 복합체 확산에 대한 시간 종속 시뮬레이션이 생성되었다. 각 시점에서 농도는 공간의 모든 지점에 대해 계산된다. 이는 분석의 원리를 예시하는 도 40C에 도시되어 있다. 리포터 분자와 결합된 RMSA 복합체는 모두 동일한 농도에서 시작하지만 더 확산되는 리포터 분자의 농도는 결합된 RMSA 복합체보다 펜에서 더 빠르게 감소한다. 결과적으로, 분비된 분석물을 분비하는 생물학적 마이크로-객체가 있는 챔버는 분비된 분석물을 분비하는 생물학적 마이크로-객체가 없는 챔버보다 더 큰 형광 강도를 나타낼 것이다.
고정된 공간 지점에서 시뮬레이션의 농도를 샘플링하여 펜으로부터의 확산을 분석할 수 있다. 결합된 RMSA 복합체에 대한 챔버 내 3개의 다른 위치의 시간 과정이 도 40D에 나와 있다. 챔버의 연결 영역에 있는 십자형 (도 40D의 A 및 B)은 분자가 2차 흐름에 의해 스윕되고 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 감소함에 따라 처음 2분 동안 초 기하급수적으로 감소한다. 그러나 챔버의 후크 영역(도 40D의 C)은 전체 시간 경과에 따라 기하급수적으로 감소한다. 분석은 도 40D의 A와 B 사이에서 챔버의 연결 영역 바닥에서 형광 신호의 슬로프를 취함으로써 스코어링된다. 장비가 여러 시야에 걸쳐 미세 유체 칩을 이미지화하고 단일 시야에서 공간적 변화를 이미지화할 때 정규화는 한 측정 내에서 시간 변동을 수정하기 위해 적용된다. 분석이 스코어링되는 방법이 더 복잡할 수 있지만 분석 영역에 걸친 농도의 선형 슬로프는 스코어에 비례한다.
자유 리포터 분자와 결합된 복합체(RMSA 복합체) 시뮬레이션을 결합하여 확산 구배 분석을 위한 모델을 구축했다. 표준 곡선 조건에 대한 총 형광 신호 및 분석 스코어는 리포터 분자와 RMSA 복합체(예를 들어, 결합된 RMSA 복합체) 농도 시뮬레이션 결과의 선형 조합을 사용하여 생성될 수 있다. 모든 표적 분비 분석물은 표준 곡선 측정 동안 리포터 분자와 결합되는 것으로 가정하므로 [RMSA 복합체] = [분비된 분석물]이고 [리포터] = [리포터]0 - [분비된 분석물] 를 제공하는 리포터 분자 농도에서 순전히 뺀다. 이 값에 시뮬레이션 값(초기 농도 1로 시작)을 곱하여 총 신호(농도 단위)를 얻을 수 있다.
Figure pct00011
분석 스코어는 도 40D와 같이 챔버의 연결 영역에서 두 위치에 걸친 신호의 슬로프이지만, 공간 거리는 모든 조건에서 동일하므로 다음과 같이 스코어를 단순화할 수 있다:
Figure pct00012
여기서 x-치수는 미크론이고 원점은 챔버의 연결 영역 개구부의 중심이고 흐름 영역 깊이는 40미크론이다. 이 경우 스코어의 단위는 Δ 농도이다.
신호 및 스코어에 대한 관계를 사용하여 리포터 분자 및 RMSA 복합체의 시뮬레이션에서 표준 곡선에 대한 조건을 생성할 수 있다. 분석 영역 및 분석 스코어의 평균 신호는 32μg/mL(213nM)의 분비된 분석물 및 4μg/mL(1.7μM)의 리포터에 대한 개별 성분 기여도가 플롯된 도 40E에 나와 있다. 초기 리포터 분자 몰 농도가 훨씬 더 높기 때문에 총 신호 및 분석 스코어는 초기에 리포터 분자 기여에 의해 지배된다. 리포터 분자 기여도는 확산성이 높기 때문에 RMSA 복합체보다 빠르게 감소한다. 분석 스코어에 대한 리포터 분자 및 표적의 기여는 약 830초에 패리티에 도달한 후 RMSA 복합체 기여가 분석 스코어를 지배한다. 도 6은 표준 곡선에 사용된 다양한 항체 농도에 대한 분석 스코어를 보여준다. 580초 동안의 단일 표준 곡선이 도 6의 삽입에 나와 있다. 분비된 분석물과 리포터(예를 들어, 가용성 리포터 분자) 사이의 더 큰 상대적 분리가 시간이 증가함에 따라 관찰되는 도 40F에서와 동일한 경향이 관찰되지만, 총 신호도 또한 실질적으로 감소한다.
측정을 하기에 적당한 시기는 표준곡선의 슬로프로 표시되는 목표 농도의 변화에 가장 민감할 때이다. 시간의 함수로서 표준 곡선의 슬로프 (ΔnM 신호/nM 표적) 는 도 40G에 도시되어 있다. 슬로프는 분석 노출 시간이 신호 참조 이미지(예를 들어, 형광 참조 이미지)에서 설정된다는 가정을 기반으로 리포터 분자의 농도로 정규화되었다. 분비 분석 중에 동일한 노출 시간이 사용되는 경우, 이것은 측정 동적 범위의 상한을 설정할 것이다. 수치는 플러싱을 시작한 후 8-10분 후에 수행한 분석이 가장 높은 감도를 가지는 것을 나타내며, 최대값은 540초에서이다. 이 접근 방식은 리포터 분자와 RMSA 복합체의 차등 확산과 펜으로부터의 전체 확산 간의 경쟁을 강조한다. 초기에는 신호가 리포터 분자에 의해 지배되는 반면 나중에는 전체 신호가 감소된다. 이 분석에 대한 궁극적인 관심은 서로 다른 챔버 사이의 분비를 구별하는 것이다. 이 접근 방식은 측정의 최상의 시간은 표준 곡선의 슬로프가가 최대화될 때라는 것을 나타낸다.
이 예측은 12분이라는 경험적으로 결정된 시간에 가깝고 이 접근법이 다른 분자량 조합에 적용할 수 있는 장점이 있을 수 있음을 시사한다. 플러싱 동안 미세유체 칩이 리포터 분자가 없는 배지를 보기까지의 실제 시간은 분석을 위한 타이머가 시작된 후 발생하는 펌프 작동으로 인해 11분에 가까울 수 있다. 또한 확산 계수에 대한 논의에서 언급했듯이 두 종의 확산성은 과대 평가될 것이므로 예측이 더 이른 시점에서 측정을 제안하는 이유에 기여할 수도 있다.
관심의 상이한 분자량 조합의 예는 표적 항체에 결합하기 위해 2차 항체를 사용하는 것이다. 이 경우 리포터 분자의 분자량은 150kD이고 RMSA 복합체는 300kD이다. 표 3에 제공된 확산 계수를 사용하여 64 μg/mL의 리포터 분자 농도를 사용하여 유사한 분석을 수행했으며 표준 CLD 분석에 대한 결과 감도는 도 8에 나와 있다. 이것은 표준 CLD 분석에 사용된 SpotLight Hu3의 농도보다 약 4배 낮은 몰 농도이므로 감도는 SpotLight Hu3-IgG1 조건으로 동일한 몰 비율을 사용하는 경우 표시되는 것보다 4배 더 크다. 그러나 우리는 또한 KD 가 모든 표적이 리포터 분자 홀드와 결합되도록 하기에 충분히 낮다고 가정해야 한다. 어떤 경우든, 이 접근법은 이 분자량 조합에 대한 분석 감도를 최대화하기 위해 20-22분 사이에 플러싱을 제안한다. 리포터 분자와 표적 분자가 유사한 분자량을 갖는 확산 구배 분석을 수행하는 것이 가능할 수 있다고 추론할 수 있다.
요약하면, 확산 구배 분석의 수치 모델은 분석의 감도를 최대화하기 위한 최적의 플러시 시간을 예측하기 위해 생성되었다. 관류 중 펜에서 리포터 분자 및 RMSA 복합체의 확산에 대한 독립적인 모델을 결합하여 시간의 함수로서의 표준 곡선을 생성하여 펜의 항체 농도 변화에 가장 민감한 시간을 결정할 수 있다. 이 접근 방식은 최적의 측정 시간이 배지로 채널을 플러싱한 후 8-10분 후인 반면 실험적으로 결정된 시간은 12분이라고 예측한다. 이 예측은 12분이라는 실험적으로 결정된 시간에 가까워서 이 접근법이 다른 분자량 조합에 적용할 수 있는 장점이 있을 수 있음을 시사한다. 마지막으로, 더 낮은 몰 농도에서 항체 크기의 리포터 분자가 고려되었고, 비록 저분자량 리포터 분자를 사용하는 것보다 절대 감도가 낮지만 분석 감도가 플러싱 20-22분 후에 최대화되는 것으로 결정되었다.
또한 분석이 가장 민감해야 할 때를 추정하는 방법이 생성되었으며 이 방법을 사용하여 챔버 내에서 표적 분자 농도의 변화에 가장 민감한 위치를 결정하는 데 사용할 수도 있다. 하나의 후보 위치는 챔버의 후크 내에 있다. 이 위치는 펜의 스윕 영역에서 더 멀리 떨어져 있으므로 여기에서의 신호 감쇠는 순전히 확산성이며 펜이 너무 자라지 않는 한 목에 세포가 없어야 한다. 도 S2에서 볼 수 있듯이 슬로프 대신 평균 신호를 사용하고 본문에 설명된 동일한 방법을 따르면 현재 방법(8 -10 분) 과 대략 동일한 최적의 창으로 560 초에서 0.02718% 동적 범위/nM 항체의 최대 민감도을 생성한다. 후크의 평균 신호 대 목의 신호 슬로프를 측정하면 현재 분석과 동일한 조건에서 분석 감도가 2.8배 증가한다. 이 발견은 실험적으로 검증되어야 하지만 이 접근 방식은 측정하기에 가장 좋은 위치에 대한 정량적 추정을 제공하는 데 사용할 수 있다.
분석물 정량화기 시스템
분석물 정량화기 시스템. 다양한 실시형태들에 따르면, 위에서 논의된 바와 같이, 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템들 및 방법들이 논의된다. 분석물은 예를 들어, 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 분석물은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 항체, 항원, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다. 분석물의 양은 아래에서 설명되는 바와 같이 상대 량일 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 도 26 은 다양한 실시형태들에 따른, 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템의 개략도이다. 본원에서 도시된 바와 같이, 시스템 3200 은 데이터를 출력하고 사용자 입력을 연관된 입력 디바이스 (미도시됨) 를 통해서 수신하기 위해, 이미지 획득 유닛 3202, 이미지 프로세싱 유닛 3204, 및 디스플레이 3212 를 포함할 수 있다.
상술된 바와 같이, (위의 도 1 에 도시된 이미징 모듈 (164) 과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 이미지 획득 유닛 (3202) 은 (위의 도 1 및 도 3b 에 도시된 지지 구조(104, 300)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 미세유체 디바이스 홀더(3214) 및 (위에서 참조된 이미징 디바이스 (194) 와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 이미징 엘리먼트 (3216) 를 포함할 수 있다.
상술된 바와 같이, 미세유체 디바이스 홀더 3214 는 미세유체 디바이스를 고정하도록 배향되고 설계될 수 있다. 미세유체 디바이스는 (상기 도 1b-도 1c, 도 2a-도2b, 도 2d, 도 2g-도 2h, 도 3a, 도 4a-도4c, 도 5a-도5c, 도 9b, 도 10b, 도 11a-도 11b 및 도 12a-도 12b 에 도시된 미세유체 디바이스 (200, 230, 250, 280, 290, 320, 400, 500, 900, 1000, 1100 및 1200) 와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 본원에서 설명되는 다양한 예들 중 임의의 예를 포함할 수 있다. 대안적으로, 홀더 3214 는 미세유체 디바이스와 통합될 수 있다. 미세유체 디바이스는 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결될 수 있는 챔버, 또는 복수의 챔버들을 포함할 수 있으며, 여기서, 챔버들의 각각은 하나 이상의 마이크로-객체들을 수용할 수 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 챔버들은 예를 들어, 챔버들일 수 있다. 챔버들은 이들이 사용되는 특정의 애플리케이션에 의해 요구되는 따라 임의의 형상, 사이즈 또는 방위일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 전술한 바와 같이, 흐름 영역은 (상기 도 1a 및 도 2b 에 도시된 유동 경로 (106), 및 상기 도 2c-도 2d, 도 4a-도 4c, 도 5a, 도 9b, 도 10b, 도 12a 에 도시된 바와 같은 배지 (242 및 278) 의 유동과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 단일 유동 경로 또는 복수의 유동 경로들을 제공하는, (상기 도 1a 및 도 2a-도 2c 에 도시된 바와 같은 채널 (122), 및 상기 도 2d-도 2f 에 도시된 바와 같은 유동 채널들 (264) 과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는) 단일 미세유체 채널, 또는 복수의 미세유체 유동 채널들일 수 있다. 유동 영역은 단일, 또는 복수의 챔버들과 유체 연통할 수 있다. 대안적으로, 유동 영역은 예를 들어, 밸브와 같은 가역성 클로져를 통해, 단일 챔버, 또는 복수의 챔버들과 유체 연통할 수도 있다. 유동 영역은 앞에서 설명된 바와 같이 입구를 통해서 물질의 유동을 수용하도록 구성될 수 있다. 물질의 유동은 예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제 또는 시약들의 유동, 또는 그 물질을 포함하는 배지의 유동을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는 유동 통로를 통한 그리고 챔버들로의 (예를 들어, 리포터 분자와 같은) 결합제의 유동을 수용하도록 더 구성될 수 있다. 결합제는 분석물에 결합 시, 결합제의 검출가능한 라벨 (예컨대, 형광, UV, 등) 에 의해 방출되는 광과 같은, 전자기 방사선을 방출할 수도 있다. 분석물은 예를 들어, 마이크로-객체로부터의 분비물들을 포함할 수 있으며, 여기서, 마이크로-객체는 생물학적 마이크로-객체일 수 있다. 분석물은 예를 들어, 단백질, 사카라이드, 핵산, 항체, 항원, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수 있다.
이제 다양한 실시형태에 따라 분석물의 양을 평가하기 위한 개략도의 예를 예시하는 도 34를 참조하면, 이미징 엘리먼트(216)는 미세유체 디바이스의 복수의 챔버 및 흐름 영역의 하나 이상의 분석 이미지(3822)를 캡처하도록 구성될 수 있다. 이미징 엘리먼트 3216 는 아래에서 자세히 설명되는 바와 같이 하나 이상의 분석 이미지들 3822 과 함께 분석되고 구현될, 하나 이상의 대응하는 배경 이미지들 3818 및/또는 하나 이상의 대응하는 신호 참조 이미지들 3820 을 캡쳐하도록 더 구성될 수 있다.
배경 이미지 3818 는 (예를 들어, 마이크로-객체들, 결합제, 또는 다른 시약들과 같은) 임의의 이물질이 미세유체 디바이스로 도입되기 전에 이미징 엘리먼트 3216 (도 26 참조) 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 해서, 배경 이미지 3818 는 아래에서 추가로 설명되는, 디바이스에서, 특히 관심 영역에서, 임의의 배경 잡음을 캡쳐한다. 배경 잡음은 예를 들어 및 이전에 논의된 바와 같이, 아티팩트들, 또는 기구 셋업 및 이미징 파라미터들-예를 들어, 여기 소스로부터의 광, 카메라 잡음, 및 주변 광에 기인할 수 있다. 배경 잡음은 또한, 예를 들어 및 이전에 논의된 바와 같이, 샘플들, 용기들, 이미징 배지들의 자발-형광, 또는 특정의 타겟들에 결합되지 않은 형광들로 인한 형광에 의해 주어지는 배경 형광에 기인할 수 있다. 어떤 이미지 영역이 배경 이미지에 포함되는지는 그 이미지가 시스템 상에서 어떻게 구현되는지에 의존한다. 예를 들어, 이전에 설명된 바와 같이, 사용되는 교정 방법들에 따라서, 상이한 배경 이미지 영역이 요망될 수도 있다.
신호 참조 이미지 3220 는 결합제 (예를 들어, 리포터) 농도가 관심 영역 ("AOI") 에서 평형을 이루는 레벨까지 결합제가 챔버들로 도입된 후, 이미징 엘리먼트 3216 (도 26 참조) 에 의해 취해질 수 있다. 그렇게 함으로써, 신호 참조 이미지 3820 는 디바이스에서 이미지 획득 왜곡들을 캡쳐한다. 이러한 왜곡들은 예를 들어, 미세유체 또는 이미징 엘리먼트 설계에 기인할 수 있다. 이미지 왜곡 유형들은 예를 들어, 이미지 에지 효과들, 원근 왜곡, 배럴 왜곡, 핀쿠션 왜곡, 머스타치 (mustache) 왜곡, 및 색 수차를 포함할 수 있다. 신호 참조 이미지 영역은 AOI 의 이미지, 챔버에 인접한 유동 영역 및 연관된 AOI, 또는 양자를 포함할 수 있다. 어떤 이미지 영역이 신호 참조 이미지에 포함되는지는 그 이미지가 시스템에 의해 어떻게 구현되는지에 의존한다. 예를 들어, 아래에서 좀더 상세히 제공되는 바와 같이, 시스템에 의해 구현되는 교정 방법들에 따라서, 상이한 신호 참조 이미지 영역이 이용될 수도 있다. 일부 예에서, 신호 참조 이미지는 결합제(예를 들어, 리포터)가 없는 유체 배지의 도입에 후속하여 촬영될 수 있으며, 여기서 결합제가 없는 유체 배지는 결합제를 포함하는 유체 배지가 미세유체 디바이스 내로 도입된 후 관류된다; 그러한 경우에 신호 참조 이미지는 "확산 참조 이미지"로 지칭될 수도 있다.
이전에 논의된 바와 같이, 도 26 의 시스템 (3200) 의 이미지 프로세싱 유닛 (3204) 은 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속될 수 있다. 유사하게, 도 34 의 이미지 프로세싱 유닛 (3804) 은 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 3804 은 관심 영역 결정 엔진 3806 (AOI 엔진) 및 스코어링 엔진 3810 을 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛 3804 의 부분으로서 도시되는 (그리고, 본원에서 설명되는) 각각의 컴포넌트 (예컨대, 엔진, 모듈, 등) 가 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합으로서 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 3804 은 이미지 획득 유닛 3202 (도 26 참조) 과의 통합된 기구 시스템 어셈블리로서 구현될 수 있다. 즉, 이미지 프로세싱 유닛 3804 및 이미지 획득 유닛 3202 은 동일한 하우징 어셈블리 내에 하우징될 수 있으며 종래의 디바이스/컴포넌트 접속 수단 (예컨대, 직렬 버스, 광학적 케이블링, 전기적 케이블링, 등) 을 통해서 통신할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 (3804) 은 광학, 직렬 포트, 네트워크 또는 모뎀 접속을 통해서 이미지 획득 유닛 (3202) 에 통신가능하게 접속된 (상기 도 31 에 나타낸 바와 같은) 스탠드얼론 컴퓨팅 디바이스로서 구현될 수 있다. 예를 들어, 이미지 프로세싱 유닛은 분석의 이미지 프로세싱 유닛 3204 으로의 이미지 획득 유닛 3202 에 의해 획득된 이미징 데이터의 송신을 가능하게 하는 LAN 또는 WAN 접속을 통해서 접속될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 이미지 프로세싱 유닛 3804 의 기능들은 WAN (또는, 등가물) 접속을 통해서 이미지 획득 유닛 3202 에 통신가능하게 접속된 (클라우드 컴퓨팅 네트워크와 같은) 공유된 컴퓨터 프로세싱 리소스들의 분산 네트워크 상에서 구현될 수 있다. 예를 들어, 이미지 프로세싱 유닛 3804 의 기능들은 AMAZON WEB SERVICES™ 과 같은 클라우드 프로세싱 서비스 상의 하나 이상의 컴퓨팅 노드들에서 구현되도록 분할될 수 있다.
관심 영역 결정 엔진(3806)(AOI 엔진)은 이미징 엘리먼트(3216) (도 26 참조) 로부터 캡처된 분석 이미지를 수신하고 분석 이미지에 묘사된 각 챔버에 대한 AOI를 정의도록 설계 및 구성될 수 있다. 관심 영역 결정 엔진 3806 은 AOI 내에, 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감한 챔버 내 이미지 영역을 포함시킴으로써, 적합한 AOI 를 정의하도록 프로그래밍될 수 있다. 예를 들어, 이것은 광 방출들 (예컨대, 형광, UV, 등) 과 같은, 전자기 방사선에서의 가장 작은 변동들이 이미징 엘리먼트 3216 (도 26 참조) 에 의해 측정될 수 있는 챔버 내 영역일 것이다. 또한, 이미지 영역은 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 이미지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 광 방출들 (예컨대, 형광, UV, 등) 과 같은, 전자기 방사선의 측정들의 감도가 챔버 내 마이크로-객체들의 존재에 의해 가장 적게 영향을 받는 챔버 내 영역일 수 있다. AOI 는 심지어 챔버 3702 (도 35 참조) 의 스윕되지 않은 영역 내로 더 정의될 수 있다.
도 35 에 도시된 미세유체 디바이스의 챔버(3706)의 예시적인 단면을 참조하면, 확산 축 3702 은 미세유체 디바이스 및 그의 대응하는 챔버들에 관한 공간 정보를 이용하여 결정될 수 있다. 그 공간 정보는 시스템 3200 에 포함된 CAD 모델, 연관된 소프트웨어, 또는 별개의 소프트웨어 패키지로부터 도출되어, 정의된 비정렬된 AOI 3824 (도 34 참조) 를 생성할 수 있다. 이미징 엘리먼트 및 미세유체 디바이스에 대한 교정 알고리즘들은 그후 이미지 데이터를 이 CAD 모델에 맵핑하여 관심 영역 3702 을 획득할 수 있다. 도 35 에 도시된 예시적인 장치의 구성요소 및 특징은 하기에서 더 상세히 논의될 것이다.
도 34 를 참조하면, 이 맵핑에 기초하여 공간 정정 변환 3826 을 적용하면, 관심 영역 결정 엔진 3806 은 정렬된 AOI들 3828 의 세트를 생성할 수 있다. AOI 는 관심 영역 결정 엔진 3806 으로부터 자동적으로 결정될 수 있거나 또는 디스플레이 3212 에의 사용자 입력을 통해서 수동으로 결정될 수 있다. (도 26 참조)
상술된 바와 같이, 도 26 (및 도 27) 의 시스템 (3200) 의 스코어링 엔진 (3210) 은 각각의 챔버의 관심 영역 내의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 설계 및 구성될 수 있다. 더욱이, 스코어가 분석물의 상대 량, 또는 농도를 표시하기 위해 스코어링 엔진 3210 에 의해 다른 스코어들과 비교될 수 있는 무차원 값일 수 있기 때문에, 결정된 스코어는 사용자를 위한 농도의 단위들로 변환될 수 있다. 도 34 의 스코어링 엔진은 실질적으로 동일한 방식으로 작동할 수 있다.
다양한 실시형태에 따라, 스코어를 결정하기 위해, 스코어링 엔진(3810)은 도 26 및 도 27 을 참조하여 위에서 논의된 것과 같은 다양한 모델을 사용할 수 있다. 더욱이, 이미지 프로세싱 유닛(3204)을 참조하여 위에서 개시된 것과 유사하게, 이미지 프로세싱 유닛(3804)은 교정 엔진(3808)을 더 포함할 수 있다. 교정 엔진 3808 은 미세유체 디바이스로부터의 배경 잡음에 의해 그리고 분석시험 이미지 캡쳐 동안 초래되는 이미지 왜곡들에 대해 각각의 챔버의 AOI 정규화 프로세스 3838 를 적용하도록 설계 및 구성될 수 있다. 결과적인 교정된 이미지 AOI 가 그후 스코어링 엔진 3810 에 의해 스코어링될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 배경 잡음은 예를 들어, 아티팩트들, 또는 기구 셋업 및 이미징 파라미터들-예를 들어, 여기 소스로부터의 광, 카메라 잡음, 및 주변 광에 기인할 수 있다. 배경 잡음은 또한, 예를 들어, 샘플들, 용기들, 이미징 배지들의 자발-형광, 또는 특정의 타겟들에 결합되지 않은 형광들로 인한 형광에 의해 주어지는 배경 형광에 기인할 수 있다. 분석시험 이미지 캡쳐 동안의 이미지 왜곡들은 예를 들어, 미세유체 디바이스 설계 또는 이미징 디바이스 설계에 기인할 수 있다. 이미지 왜곡 유형들은 예를 들어, 이미지 에지 효과들, 프로젝터 불-균일성, 카메라 비네트, 원근 왜곡, 배럴 왜곡, 핀쿠션 왜곡, 머스타치 왜곡, 및 색 수차를 포함할 수 있다.
교정 엔진 3808 은 분석시험 이미지 캡쳐 동안 도입되거나 및/또는 도입 전 미세유체 디바이스로부터의 이미지 왜곡들에 대해, 각각의 챔버의 AOI, 또는 적어도 각각의 챔버의 AOI 의 이미지 영역을 정규화하도록 설계 및 구성될 수 있다. 교정 엔진 3808 은 분석시험 이미지 및/또는 신호 참조 이미지로부터 배경 이미지를 감산하고 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 이를 달성할 수 있다. 결과적인 정규화된 이미지 AOI 가 그후 스코어링 엔진 3810 에 의해 스코어링될 수 있다. 스코어링 엔진(3810)은 분비 스코어(3836)를 결정할 때 AOI 정량화 프로세스(3834)를 적용하도록 설계 및 구성될 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 특징 추출 및 비정상 검출을 위해 이미지를 정규화하는 다양한 모델들이 존재한다. 이들은 여기서 자세히 설명하지 않겠지만 위에서 자세히 논의된다.
다양한 실시형태들에 따르면, 이미지 획득 유닛 3802 및 이미지 프로세싱 유닛 3604 은 단일 물리 유닛으로 통합될 수 있다. 대안적으로, 이미지 획득 유닛 3202 (도 26 참조) 및 이미지 프로세싱 유닛 3804 은 유닛들이 여전히 정보를 교환하도록 통신가능하게 접속되도록 독립적인 유닛들로 제공되면, 분리가능하게 배향될 수 있다.
위에서 설명된 이미지 프로세싱 유닛 3804 의 각각의 컴포넌트는 하드웨어일 수도 있거나 또는 부분적으로 또는 전체적으로 소프트웨어 모듈일 수도 있다.
본 명세서에서 설명된 방법론들은 애플리케이션에 의존하여 다양한 수단에 의해 구현될 수도 있다. 예를 들어, 이들 방법론들은 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 이들의 임의의 조합에서 구현될 수도 있다. 하드웨어 구현을 위해, 프로세싱 유닛은 하나 이상의 주문형 집적회로들 (ASICs), 디지털 신호 프로세서들 (DSPs), 디지털 신호 프로세싱 디바이스들 (DSPDs), 프로그래밍가능 로직 디바이스들 (PLDs), 필드 프로그래밍가능 게이트 어레이들 (FPGAs), 프로세서들, 제어기들, 마이크로-제어기들, 마이크로프로세서들, 전자 디바이스들, 본원에서 설명되는 기능들을 수행하도록 설계된 다른 전자 유닛들, 또는 이들의 조합 내에서 구현될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 교시의 방법은 펌웨어 및/또는 소프트웨어 프로그램 및 C, C ++ 등과 같은 종래의 프로그래밍 언어로 작성된 애플리케이션으로 구현 될 수도 있다. 펌웨어 및/또는 소프트웨어로서 구현되는 경우, 여기에 기술된 실시형태들은 컴퓨터로 하여금 전술한 방법을 수행하게 하는 프로그램이 저장된 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체 상에 구현될 수있다. 본원에서 설명되는 다양한 엔진들이 도 1 의 컴퓨터 시스템 (3100) 과 같은 컴퓨터 시스템 상에 제공될 수 있으며, 이에 의해 프로세서 (3104) 가 메모리 컴포넌트들 (3106/3108/3110) 및 입력 디바이스 (3114) 를 통해서 제공되는 사용자 입력 중 임의의 하나, 또는 이들의 조합에 의해 제공되는 명령들에 따라, 이들 엔진들에 의해 제공되는 분석들 및 결정들을 실행할 것으로 이해되어야 한다.
위에서 상세히 논의된 바와 같이, 도 17은 다양한 실시형태에 따라 챔버에 존재하는 분비된 분석물의 양을 정량화하기 위해 수행되는 기능을 예시한다. 위에서 상세히 논의된 바와 같이, 도 18 은 여러 실시형태들에 따른, 분비된 분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 계산하기 위해 수행되는 기능들을 예시한다. 위에서 상세히 논의된 바와 같이, 도 19 는 여러 실시형태들에 따른, 세포들의 클론 개체군에서의 분비된 분석물의 양을 나타내는 절대 또는 상대 값을 평가하기 위해 수행되는 기능들을 도시한다. 분비된 분석물의 양을 정량화하고, 분비된 분석물의 양을 나타내는 절대값 또는 상대값을 계산하거나, 세포의 클론 집단에서의 분비된 분석물의 양을 나타내는 절대값 또는 상대값을 평가하기 위한 방법의 다양한 추가 실시형태가 아래에서 상세히 논의된다.
방법 1
여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체, 또는 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공된다. 상기 방법의 예는 예를 들어 도 36에 예시되어 있다. 도 36을 참조하면, 생물학적 마이크로-객체(3710)(도 35 참조)는 단계 3910에서 미세유체 디바이스의 챔버 또는 챔버 내로 도입된다. 도 35를 참조하면, 미세유체 디바이스는 유동 영역(3708)을 갖는 인클로저를 포함할 수 있고, 여기서 챔버(3706)(또는 챔버(3706))는 유동 영역(3708)에 유체적으로 연결되고, 챔버는 베이스 유체 배지를 포함한다. 상기 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군은 분석물을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하는 것이 허용된다.
도 36으로 돌아가면, 복수의 리포터 분자를 함유하는 제1 유체 배지가 단계 3920에서 유동 영역(들) 및 챔버(들) 내로 도입된다. 각각의 리포터 분자는 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 영역, 및 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다.
챔버 내로 확산되는 복수의 리포터 분자의 일부는 그 안에서 분비되는 분석물에 결합할 수 있고, 이에 의해 단계 3930에서 복수의 리포터 분자:분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성할 수 있다.
제2 유체 배지는 단계 3940에서 유동 영역 내로 도입되며, 여기서 제2 유체 배지는 임의의 리포트된 분자를 포함하지 않는다. 결합되지 않은 리포터 분자는 그후 단계 3950에서 챔버 밖으로 확산될 수 있다. 리포터 분자는 그후 연관된 챔버(들) 및 유동 영역(들)의 이미지를 통해 미세유체 디바이스(3960) 내의 관심 영역 내에서 검출된다. 그 다음, 이미지는 단계 3970에서 챔버(들) 내의 분비된 생성물의 레벨을 계산하기 위해 분석된다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역은 예를 들어 3702에서 도 35에 도시된 바와 같이 챔버의 스윕되지 않은 영역 내에 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 세포의 위치에 가장 덜 민감한 챔버의 영역에 위치된다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 생물학적 객체 (예를 들어, 세포) 로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9미크론 또는 10 미크론에 위치될 것이다. 관심 영역은 또한 챔버의 가장자리에 의해 생성된 인공 배경 신호에 가장 덜 민감한 챔버 영역에 위치할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버의 가장자리 또는 벽으로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9 미크론 또는 10 미크론에 위치할 것이다.
일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합함으로써, RMSA 복합체의 리포터 분자: 분비된 분석물의 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 2:2, 4:2, 및 기타 등등의 화학양론을 가질 수도 있는 RMSA 복합체를 형성할 수도 있다.
여러 실시형태들에서, 리포터 분자들을 검출하는 단계는 비결합된 리포터 분자들을 검출하는 단계 뿐만 아니라, RMSA 복합체들의 부분인 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함할 수도 있다.
도 35 를 참조하면, 다양한 실시형태들에 따르면, 챔버는 격리 영역 3705 및 격리 영역 3705 을 유동 영역 3708 에 유체 연결하는 연결 영역 3704 을 가질 수도 있으며, 여기서, 격리 영역 3705 및 연결 영역 3704 은 격리 영역 3705 에서의 임의의 구현된 유체 배지의 성분들이 실질적으로 단지 확산에 의해서만, 유동 영역 3708 에서의 임의의 구현된 유체 배지의 성분들과 교환되도록 구성된다.
분석물의 분비의 레벨을 평가 또는 결정하는 다양한 실시형태들에 따르면, 본 방법은 챔버 내 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 팽창시키는 단계를 더 포함한다.
분석물의 분비의 레벨을 평가 또는 결정하는 다양한 실시형태들에 따르면, 본 방법은 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함할 수도 있으며, 여기서, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입한 후, 그리고 제 1 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 생물학적 마이크로-객체가 도입될 때 챔버 내의 베이스 유체 배지와 동일할 수 있다. 배양 배지는 예를 들어 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내에서 배양중인 세포들의 생존력은 미세유체 디바이스 내에서 배양되는 세포들을 자극하거나 또는 아니면 지원하는 보조 생체분자들을 제공하는 피더 세포들의 상청액 배양 배지의 부분을 포함시킴으로써 향상될 수도 있다. 피더 세포들 자체는 미세유체 디바이스 내에 존재하지 않을 수도 있지만, 표준 반응 용기들에서 배양될 수도 있다.
미세유체 디바이스로의, 피더 세포들의 존재에 의해 컨디셔닝된 배양 배지의 부분들의 수확 및 전달이 수행될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 용존 산소의 양은 원하는대로 측정되어 변경될 수도 있으며, 이는 배양 웰플레이트들, 쉐이크 플라스크들 및 기타 등등에서의 이러한 조정과 비교하여, 본원에서 설명되는 미세유체 환경 내에서 더 순쉬운 프로세스일 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 배양 배지의 pH 는 모니터링되어 변경될 수도 있으며, 역시, 표준적으로 사용되는 플라스틱제품 (plasticware) 보다 더 손쉬운 프로세스이다.
여러 실시형태들에서, 소진된 성장 배지가 미세유체 환경에 첨가될 수도 있으며, 이는 미세유체 환경 내 어느 클론들이 분비된 분석물을 여전히 더 용이하게 생산할 수 있는지 또는 웰플레이트들, 쉐이커 플라스크들 및 생물반응기들을 포함할 수도 있는, 다양한 유형들의 반응 용기들의 스케일업 환경을 근사화하는데 사용될 수 있는지를 분석하는 선택 메커니즘으로서 기능할 수 있다. 여러 실시형태들에서, (CD28 을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 항체들, 시토킨들, 성장 인자들, 및 기타 등등과 같은, 가용성 자극 성분들은 미세유체 환경 내 세포들을 자극하여 더 빨리 생성하거나 또는 자극 성분의 도입하기 전과는 상이한 분석물들을 생성하도록 미세유체 환경에 추가될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 세포들이 서로 그리고 챔버들에 부착하는 것을 방지하도록 구성된 하나 이상의 화합물들 및/또는 시약들이 배양 배지에 첨가될 수도 있다.
여러 실시형태들에서, 배양 배지에의 상기 언급된 첨가들 중 하나 이상은 챔버들 내 세포들 중 하나 이상에 대해 선택 압력을 가할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 1 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들에 대한 확산 프로파일의 모델링에 기초할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분일 수도 있다.
상술된 바와 같이, 여러 실시형태들에 따르면, 본 방법은 제 2 유체 배지를 유동 영역(들) 및 펜(들)로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 챔버로부터 확산시키는 단계로서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 챔버로부터 확산되는 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 상기 확산시키는 단계를 더 포함할 수도 있다. 검출하는 단계는 비결합된 리포터 분자들을 검출하는 단계 및 RMSA 복합체들의 부분인 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 2 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 2 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 제 2 시간 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 복합체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함할 수도 있으며, 여기서, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 여러 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 더 이상이 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 여러 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 배경 신호는 리포터 분자들이 검출될 때마다 측정되지 않을 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 배경 신호는 기지의/표준 조건들 (예컨대, 칩 유형, 칩 내 챔버의 위치, 검출가능한 라벨의 유형, 베이스 유체 배지의 성분들) 에 기초하여 미리 결정될 수도 있다.
여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입하기 이전의 시간에, 관심 영역 내의 배경 신호의 강도가 측정될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 생물학적 객체들 (예를 들어, 세포들) 의 수에 대해 정규화될 수도 있다.
여러 실시형태들에서, 분석물의 분비의 레벨이 정량화될 수도 있고, 여기서 정량화는 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도와 같은 다수의 측정들 중 임의의 측정에 기초할 수도 있으며, 이들 중 어느 쪽이든 시야에서의 비네팅 (vignetting) (이미지 중심과 비교하여 주변을 향하여 이미지의 밝기 또는 채도의 감소) 에 의해 정규화될 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 챔버에 대한 분비 스코어가 제공되거나 결정될 수 있다. 분비 스코어링은 이하에서 상세히 논의할 것이다.
다양한 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 가질 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 임의의 것의 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 예를 들어 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체일 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 이외의 단백질일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 배치하는 스텝은 복수의 챔버들 중 적어도 일부분 내에 생물학적 마이크로-객체를 배치하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 도 36 에서 예시화된 본 방법은 복수의 챔버들의 챔버들의 서브-세트의 각각의 챔버에 대한 분비의 레벨을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버들의 스코어들을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 본 방법은 분비의 레벨을 정량화하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 이상을 선택하고 선택된 하나 이상의 챔버들로부터 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다.
여기의 여러 실시형태들에 따른 방법들은 결과적인 서브클론 개체군들을 추가로 팽창 및 분석함으로써 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 이것은 예를 들어 선택된 클론 개체군을 미세유체 디바이스 내 다른 챔버들의 세트로 이동시키고 선택된 개체군의 각각의 개개의 세포에 대해 다시 팽창시킴으로써 달성될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 본 방법은 선택된 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 유동 영역 (또는 채널) 으로 또는 미세유체 디바이스 밖으로 배출하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 챔버들로부터 채널로 또는 챔버 및/또는 채널로부터 미세유체 디바이스로 배출하는 스텝은 각각의 선택된 챔버 상에서 개별적으로 수행될 수도 있다 (예컨대, 선택된 챔버들의 세트로부터의 세포들은 일련의 배출 스텝들로, 한번에 하나의 챔버씩 배출될 수도 있다). 여러 실시형태들에서, 챔버 내에 배치된 세포들은 이전에 분석된 챔버로부터 발생될 수 있어, 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 절대 또는 상대 값이 특정의 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는이데 사용될 수도 있다. 이와 유사하게, 단백질들 (예컨대, IgG 도메인을 가진 항체들) 의 패밀리의 절대 또는 상대 값이 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는데 사용될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 챔버로부터의 모든 세포들이 칩의 동일한 챔버 또는 다른 포함된 영역에서 선택 및 팽창될 것이다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 동일한 챔버로부터의 세포들 중 하나 이상이 상이한 챔버들에서 선택 및 팽창될 수 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 상대 또는 절대 값을 생성하는 것은 팽창된 세포들 상에서 (1X, 2X, 3X, 4X, 또는 더 이상의 배수로) 반복적으로 수행될 수도 있다.
여기서 논의된 여러 방법들의 적용은, 여러 실시형태들에 따르면, 반복된 분석들로부터의 피드백으로, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 가능하게 할 수도 있다. 예를 들어, 분비된 분석물의 대규모 생산에 밀접하게 관련된 조건들 및 물질들이, 추가적인 검사을 위해 가장 적합한 클론들을 찾아내고 특성화하기 위해, 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극을 위한 다양한 자극 프로토콜들이 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜보다 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교할 수 있을 만큼 분석될 수도 있다.
방법 2
여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체, 또는 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공된다. 상기 방법의 예는 예를 들어 도 37에 예시되어 있다. 도 37 을 참조하면, 복수의 리포터 분자를 포함하는 제1 유체 배지가 단계 4010에서 유동 영역(들) (채널들) 및 챔버(들)로 제공된다. 여러 실시형태들에서, 이들 리포터 분자들은 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분, 및 검출가능한 라벨을 포함한다.
챔버(들) 및 흐름 영역(들)의 이미지는 단계 4020에서 관심 영역 내에서 검출 가능한 신호의 강도를 측정하기 위해 촬영된다. 임의의 리포터 분자를 함유하지 않는 제2 유체 배지는 그 다음 단계 4030에서 유동 영역(들) 내로 도입된다. 그런 다음 4040에서 생물학적 마이크로-객체(들)가 챔버(들)로 도입된다. 생물학적 마이크로-객체는 분석물을 챔버 내의 배지로 분비하도록 허용된다. 복수의 리포터 분자를 포함하는 제3 유체 배지는 그 다음 단계 4050에서 유동 영역 내로 도입된다. 챔버 내로 확산되는 복수의 리포터 분자의 일부는 그 안에서 분비되는 분석물에 결합할 수 있고, 이에 의해 단계 4060에서 복수의 리포터 분자:분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성할 수 있다. 리포터 분자는 그후 연관된 챔버(들) 및 유동 영역(들)의 이미지를 통해 미세유체 디바이스(4070) 내의 관심 영역 내에서 검출된다. 그 다음, 이미지는 단계 4080에서 챔버(들) 내의 분비된 생성물의 레벨을 계산하기 위해 분석된다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함한다. 일 예가 도 28 에 제공된다. 도 27 및 도 28에 도시된 바와 같이, 관심 영역은 복수의 세그먼트(3230)로 분할될 수 있다. 평균 신호는 세그먼트(3232) 각각에 대해 계산될 수 있고 빈(3234)의 서브섹션에 대해 정량화될 수 있다. 이것은 분비 스코어 3236을 결정하는 데 사용할 수 있다.
[방법 3] 대안적으로, 다양한 실시형태에 따르면, 관심 영역은 예를 들어 3702에서 도 35에 도시된 바와 같이 챔버의 스윕되지 않은 영역 내에 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 세포의 위치에 가장 덜 민감한 챔버의 영역에 위치된다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 생물학적 객체 (예를 들어, 세포) 로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9미크론 또는 10 미크론에 위치될 것이다. 관심 영역은 또한 챔버의 가장자리에 의해 생성된 인공 배경 신호에 가장 덜 민감한 챔버 영역에 위치할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버의 가장자리 또는 벽으로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9 미크론 또는 10 미크론에 위치할 것이다.
여러 실시형태들에서, 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합함으로써, RMSA 복합체의 리포터 분자: 분비된 분석물의 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 2:2, 4:2, 및 기타 등등의 화학양론을 가질 수도 있는 RMSA 복합체를 형성할 수도 있다.
여러 실시형태들에서, 리포터 분자들을 검출하는 단계는 비결합된 리포터 분자들을 검출하는 단계 뿐만 아니라, RMSA 복합체들의 부분인 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함할 수도 있다.
분석물의 분비의 레벨을 평가 또는 결정하는 다양한 실시형태들에 따르면, 본 방법은 챔버 내 생물학적 마이크로-객체를 생물학적 마이크로-객체들의 클론 개체군으로 팽창시키는 단계를 더 포함한다.
분석물의 분비의 레벨을 평가 또는 결정하는 다양한 실시형태들에 따르면, 본 방법은 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함할 수도 있으며, 여기서, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입한 후, 그리고 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 생물학적 마이크로-객체가 도입될 때 챔버 내의 제2 배지와 동일할 수 있다. 배양 배지는 예를 들어 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내에서 배양중인 세포들의 생존력은 미세유체 디바이스 내에서 배양되는 세포들을 자극하거나 또는 아니면 지원하는 보조 생체분자들을 제공하는 피더 세포들의 상청액 배양 배지의 부분을 포함시킴으로써 향상될 수도 있다. 피더 세포들 자체는 미세유체 디바이스 내에 존재하지 않을 수도 있지만, 표준 반응 용기들에서 배양될 수도 있다.
미세유체 디바이스로의, 피더 세포들의 존재에 의해 컨디셔닝된 배양 배지의 부분들의 수확 및 전달이 수행될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 용존 산소의 양은 원하는대로 측정되어 변경될 수도 있으며, 이는 배양 웰플레이트들, 쉐이크 플라스크들 및 기타 등등에서의 이러한 조정과 비교하여, 본원에서 설명되는 미세유체 환경 내에서 더 순쉬운 프로세스일 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 미세유체 환경 내 배양 배지의 pH 는 모니터링되어 변경될 수도 있으며, 역시, 표준적으로 사용되는 플라스틱제품 (plasticware) 보다 더 손쉬운 프로세스이다.
여러 실시형태들에서, 소진된 성장 배지가 미세유체 환경에 첨가될 수도 있으며, 이는 미세유체 환경 내 어느 클론들이 분비된 분석물을 여전히 더 용이하게 생산할 수 있는지 또는 웰플레이트들, 쉐이커 플라스크들 및 생물반응기들을 포함할 수도 있는, 다양한 유형들의 반응 용기들의 스케일업 환경을 근사화하는데 사용될 수 있는지를 분석하는 선택 메커니즘으로서 기능할 수 있다. 여러 실시형태들에서, (CD28 을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 항체들, 시토킨들, 성장 인자들, 및 기타 등등과 같은, 가용성 자극 성분들은 미세유체 환경 내 세포들을 자극하여 더 빨리 생성하거나 또는 자극 성분의 도입하기 전과는 상이한 분석물들을 생성하도록 미세유체 환경에 추가될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 세포들이 서로 그리고 챔버들에 부착하는 것을 방지하도록 구성된 하나 이상의 화합물들 및/또는 시약들이 배양 배지에 첨가될 수도 있다.
여러 실시형태들에서, 배양 배지에의 상기 언급된 첨가들 중 하나 이상은 챔버들 내 세포들 중 하나 이상에 대해 선택 압력을 가할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함할 수도 있으며, 여기서, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 여러 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 더 이상이 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다. 여러 실시형태들에서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 배경 신호는 리포터 분자들이 검출될 때마다 측정되지 않을 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 배경 신호는 기지의/표준 조건들 (예컨대, 칩 유형, 칩 내 챔버의 위치, 검출가능한 라벨의 유형, 유체 배지의 성분들) 에 기초하여 미리 결정될 수도 있다.
여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입하기 이전의 시간에, 관심 영역 내의 배경 신호의 강도가 측정될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 생물학적 객체들 (예를 들어, 세포들) 의 수에 대해 정규화될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 본 방법은 분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 생성물의 분비의 레벨을 정량화하는 것은 이전에 논의된 것과 같은 다수의 측정들 중 임의의 것을 기반으로 할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 가질 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 가질 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들: 1 내지 10 중 임의의 것의 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다. 여러 실시형태들에서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 예를 들어 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 검출가능한 라벨은 형광 라벨일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체일 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 이외의 단백질일 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 배치하는 스텝은 복수의 챔버들 중 적어도 일부분 내에 생물학적 마이크로-객체를 배치하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 예를 들어 도 37 에서 예시화된 방법은 복수의 챔버들의 챔버들의 서브-세트의 각각의 챔버에 대한 분비의 레벨을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버들의 스코어들을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 본 방법은 분비의 레벨을 정량화하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 이상을 선택하고 선택된 하나 이상의 챔버들로부터 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다.
이전에 상세히 논의된 바와 같이, 여기의 여러 실시형태들에 따른 방법들은 결과적인 서브클론 개체군들을 추가로 팽창 및 분석함으로써 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 이것은 예를 들어 선택된 클론 개체군을 미세유체 디바이스 내 다른 챔버들의 세트로 이동시키고 선택된 개체군의 각각의 개개의 세포에 대해 다시 팽창시킴으로써 달성될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 예를 들어 도 37 에서 예시화된 방법은 선택된 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 유동 영역 (또는 채널) 으로 또는 미세유체 디바이스 밖으로 배출하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 챔버들로부터 채널로 또는 챔버 및/또는 채널로부터 미세유체 디바이스로 배출하는 스텝은 각각의 선택된 챔버 상에서 개별적으로 수행될 수도 있다 (예컨대, 선택된 챔버들의 세트로부터의 세포들은 일련의 배출 스텝들로, 한번에 하나의 챔버씩 배출될 수도 있다). 여러 실시형태들에서, 챔버 내에 배치된 세포들은 이전에 분석된 챔버로부터 발생될 수 있어, 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 절대 또는 상대 값이 특정의 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는이데 사용될 수도 있다. 이와 유사하게, 단백질들 (예컨대, IgG 도메인을 가진 항체들) 의 패밀리의 절대 또는 상대 값이 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는데 사용될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 챔버로부터의 모든 세포들이 칩의 동일한 챔버 또는 다른 포함된 영역에서 선택 및 팽창될 것이다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 동일한 챔버로부터의 세포들 중 하나 이상이 상이한 챔버들에서 선택 및 팽창될 수 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 상대 또는 절대 값을 생성하는 것은 팽창된 세포들 상에서 (1X, 2X, 3X, 4X, 또는 더 이상의 배수로) 반복적으로 수행될 수도 있다.
여기서 논의된 여러 실시형태들의 적용은, 위에서 논의된 바와 같이, 반복된 분석들로부터의 피드백으로, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 허용할 수도 있다. 예를 들어, 분비된 분석물의 대규모 생산에 밀접하게 관련된 조건들 및 물질들이, 추가적인 검사을 위해 가장 적합한 클론들을 찾아내고 특성화하기 위해, 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극을 위한 다양한 자극 프로토콜들이 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜보다 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교할 수 있을 만큼 분석될 수도 있다.
방법 3(방법 2 의 목 영역 실시형태에 대한 대안적인 후크 영역을 논의하는 방법 2 섹션 참조)
방법 4
여러 실시형태들에 따르면, 생물학적 마이크로-객체, 또는 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공된다. 도 38은 이 방법의 예시의 프로세스를 설명하는 워크플로를 보여준다. 단계 4110 에서, 복수의 리포터 분자를 포함하는 제1 유체 배지가 유동 영역(들) (채널들) 및 챔버(들)로 제공된다. 여러 실시형태들에서, 이들 리포터 분자들은 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분, 및 검출가능한 라벨을 포함한다.
도 38 로 돌아가면, 단계 4120 에서, 챔버(들) 및 흐름 영역(들)의 이미지는 관심 영역 내에서 검출 가능한 신호의 강도를 측정하기 위해 촬영된다. 임의의 리포터 분자를 함유하지 않는 제2 유체 배지는 그 다음 단계 4130에서 유동 영역 내로 도입된다. 그런 다음 4140에서 생물학적 마이크로-객체가 챔버로 도입된다. 생물학적 마이크로-객체는 분석물을 챔버 내의 배지로 분비하도록 허용된다.
복수의 리포터 분자를 포함하는 제3 유체 배지는 그 다음 단계 4150에서 유동 영역 내로 도입된다. 또한, 복수의 리포터 분자의 일부가 챔버 내로 확산되도록 허용된다. 단계 4160에서, 리포트된 분자는 그 안에서 분비된 분석물에 결합하여 복수의 리포터 분자:분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성한다.
단계 4170에서, 챔버(들) 및 유동 영역(들)의 이미지는 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내의 리포터 분자를 검출하기 위해 취해진다. 단계 4180에서, 어떠한 리포터 분자도 포함하지 않는 제4 유체 배지가 챔버(들) 및 유동 영역(들)에 제공되어, 챔버 밖으로 리포터 분자의 확산을 촉진한다. 리포터 분자는 그후 연관된 챔버(들) 및 유동 영역(들)의 이미지를 통해 미세유체 디바이스(4190) 내의 관심 영역 내에서 검출된다. 그 다음, 이미지는 단계 4195에서 챔버(들) 내의 분비된 생성물의 레벨을 계산하기 위해 분석된다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함한다. 일 예가 도 28 에 제공된다. 도 27 및 도 28에 도시된 바와 같이, 관심 영역은 복수의 세그먼트(3230)로 분할될 수 있다. 평균 신호는 세그먼트(3232) 각각에 대해 계산될 수 있고 빈(3234)의 서브섹션에 대해 정량화될 수 있다. 이것은 분비 스코어 3236을 결정하는 데 사용할 수 있다.
[방법 5] 대안적으로, 다양한 실시형태에 따르면, 관심 영역은 예를 들어 3702에서 도 35에 도시된 바와 같이 챔버의 스윕되지 않은 영역 내에 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 세포의 위치에 가장 덜 민감한 챔버의 영역에 위치된다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 생물학적 객체 (예를 들어, 세포) 로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9미크론 또는 10 미크론에 위치될 것이다. 관심 영역은 또한 챔버의 가장자리에 의해 생성된 인공 배경 신호에 가장 덜 민감한 챔버 영역에 위치할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버의 가장자리 또는 벽으로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9 미크론 또는 10 미크론에 위치할 것이다.
형성된 RMSA 복합체의 화학량론 및 이의 검출에 관해서는 위의 상세한 논의를 참조하라.
다양한 실시형태에 따른, 챔버 및 유동 영역의 특징과 관련하여, 위의 상세한 설명을 참조하라.
마이크로-객체의 클론 개체군, 배양 배지로 유동 영역 관류, 배양 배지 조성, 고갈된 성장 배지, 가용성 자극 성분, 관심 영역, 배경 감산된 신호, 신호 정규화, 분비 스코어, 분비된 분석물 분자량, 리포트된 분자 조성(예를 들어, 아미노산, 핵산), 검출 가능한 라벨 특징 및 특성, 및 분비된 분석물 조성과 관련된 논의에 대해서는 위의 상세한 논의를 참조하라.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 배치 또는 제공하는 단계는 복수의 챔버들 중 적어도 일부분 내에 생물학적 마이크로-객체를 배치 또는 제공하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들의 챔버들의 서브-세트의 각각의 챔버에 대한 분비의 레벨을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버들의 스코어들을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 본 방법은 분비의 레벨을 정량화하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 이상을 선택하고 선택된 하나 이상의 챔버들로부터 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다.
여기의 여러 실시형태들에 따른 방법들은 결과적인 서브클론 개체군들을 추가로 팽창 및 분석함으로써 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 이것은 예를 들어 선택된 클론 개체군을 미세유체 디바이스 내 다른 챔버들의 세트로 이동시키고 선택된 개체군의 각각의 개개의 세포에 대해 다시 팽창시킴으로써 달성될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 본 방법은 선택된 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 유동 영역 (또는 채널) 으로 또는 미세유체 디바이스 밖으로 배출하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 챔버들로부터 채널로 또는 챔버 및/또는 채널로부터 미세유체 디바이스로 배출하는 스텝은 각각의 선택된 챔버 상에서 개별적으로 수행될 수도 있다 (예컨대, 선택된 챔버들의 세트로부터의 세포들은 일련의 배출 스텝들로, 한번에 하나의 챔버씩 배출될 수도 있다). 여러 실시형태들에서, 챔버 내에 배치된 세포들은 이전에 분석된 챔버로부터 발생될 수 있어, 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 절대 또는 상대 값이 특정의 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는이데 사용될 수도 있다. 이와 유사하게, 단백질들 (예컨대, IgG 도메인을 가진 항체들) 의 패밀리의 절대 또는 상대 값이 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는데 사용될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 챔버로부터의 모든 세포들이 칩의 동일한 챔버 또는 다른 포함된 영역에서 선택 및 팽창될 수 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 동일한 챔버로부터의 세포들 중 하나 이상이 상이한 챔버들에서 선택 및 팽창될 것이다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 상대 또는 절대 값을 생성하는 것은 팽창된 세포들 상에서 (1X, 2X, 3X, 4X, 또는 더 이상의 배수로) 반복적으로 수행될 수도 있다.
다른 실시형태에서, 이 방법의 적용은 반복된 분석들로부터의 피드백으로, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 가능하게 할 수도 있다. 예를 들어, 분비된 분석물의 대규모 생산에 밀접하게 관련된 조건들 및 물질들이, 추가적인 검사을 위해 가장 적합한 클론들을 찾아내고 특성화하기 위해, 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극을 위한 다양한 자극 프로토콜들이 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜보다 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교할 수 있을 만큼 분석될 수도 있다.
방법 5 [위 단락 참조]
방법 6
여러 실시형태들에 따르면, 복수의 생물학적 마이크로-객체, 또는 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 걸친 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법이 제공된다. 도 39은 이 방법의 예시의 프로세스를 설명하는 워크플로를 보여준다. 도 39에 도시된 바와 같이, 방법은 선택적인 단계(4210, 4220, 4230, 4270, 4280)를 포함하며, 이것은 다양한 실시형태에 따라 예를 들어 신호 대 잡음비를 증가시키거나 배경 잡음을 제거하거나실험 동안의 시스템적 오류를 정정하기 위해 선택적으로 수행될 수 있다. 각각의 선택적 단계(4210, 4220, 4230, 4270, 4280)는 아래에서 더 설명된다.
도 39를 참조하면, 단계 4240 에서 방법은 복수의 생물학적 마이크로-객체를 포함하는 제1 유체 배지를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버에 도입하는 것을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 갖는 인클로저를 포함하고, 여기서 복수의 챔버의 각각의 챔버는 유동 영역에 유체적으로 연결된다. 미세유체 디바이스 내에서, 복수의 생물학적 마이크로-객체, 또는 생물학적 마이크로-객체들의 개체군은 가용성 분석물을 복수의 챔버들 내의 제 1 유체 배지로 분비하는 것이 허용된다.
단계 4250에서, 방법은 제2 유체 배지를 유동 영역에 도입하는 단계를 포함한다. 제2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자를 함유하고, 여기서 각각의 가용성 리포터 분자는 다양한 실시형태에 따라 분비된 분석물 및 검출가능한 라벨에 결합하도록 구성된 결합 성분을 함유한다. 또한, 복수의 가용성 리포터 분자의 일부가 챔버들 내로 확산되도록 허용된다.
단계 4260에서, 가용성 리포트된 분자는 그 안에서 분비된 분석물에 결합하여 복수의 가용성 리포터 분자:분비된 분석물(RMSA) 복합체를 생성한다. 그런 다음 단계 4290에서 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치한 가용성 리포터 분자를 이미징하고 단계 4295 에서 이미지(들)을 분석하여 미세유체 디바이스의 챔버 내의 분비물 또는 분비 생성물의 상대적 레벨을 계산함으로써 이러한 복합체를 검출한다.
다양한 실시형태에서, 복수의 챔버의 각각의 챔버는 유동 영역에서 제2 유체 배지의 2차 유동으로부터 격리된 격리 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 복수의 챔버의 각각의 챔버는 유동 영역에서 제2 유체 배지의 직접 유동으로부터 격리된 연결 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 복수의 생물학적 마이크로-객체 중 개개의 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버 중 개개의 챔버에 배치된다. 다양한 실시형태에서, 가용성 리포터 분자의 농도는 분석물에 대한 가용성 리포터 분자의 KD 의 약 1-10 배이다.
다양한 실시형태에서, 흐름 영역 내의 제2 유체 배지는 약 0.1-10초의 리프레시 레이트 (refresh rate) 로 리프레시되고, 리프레시 레이트는 유동 영역 내의 유체의 전체 체적을 교체하는 시간의 지속기간이다.
다양한 실시형태에서, 복수의 리포터 분자의 일부가 복수의 챔버 내로 확산되도록 하는 단계는 복수의 리포터 분자가 유동 영역 및 복수의 챔버에 걸쳐 평형 상태를 달성하도록 하는 것을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 평형 상태는 제2 유체 배지의 도입으로부터 3시간 이내에 달성된다.
다양한 실시형태에서, 방법은 복수의 챔버 각각에 대한 분비물의 레벨 또는 분비물 스코어를 획득하는 단계; 및 획득된 분비물 스코어에 기초하여 복수의 챔버의 순위를 매기는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태에서, 가용성 리포터 분자는 각각 상이한 라벨을 갖는 적어도 2개의 상이한 리포터 분자를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 각각의 챔버는 유동 영역에 대한 단일 개구를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 유동 영역은 미세유체 채널을 포함하고, 각각의 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 미세유체 채널에 유체적으로 연결하는 연결 영역을 포함한다. 연결 영역은 미세유체 채널에 대한 근위 개구와 격리 영역에 대한 원위 개구를 갖는다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함한다. 일 예가 도 28 에 제공된다. 도 27 및 도 28에 도시된 바와 같이, 관심 영역은 복수의 세그먼트(3230)로 분할될 수 있다. 평균 신호는 세그먼트(3232) 각각에 대해 계산될 수 있고 빈(3234)의 서브섹션에 대해 정량화될 수 있다. 이것은 분비 스코어 3236을 결정하는 데 사용할 수 있다. 대안적으로, 다양한 실시형태에 따르면, 관심 영역은 예를 들어 3702에서 도 35에 도시된 바와 같이 챔버의 스윕되지 않은 영역 내에 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 세포의 위치에 가장 덜 민감한 챔버의 영역에 위치된다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버 내의 생물학적 객체 (예를 들어, 세포) 로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9미크론 또는 10 미크론에 위치될 것이다. 관심 영역은 또한 챔버의 가장자리에 의해 생성된 인공 배경 신호에 가장 덜 민감한 챔버 영역에 위치할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버의 가장자리 또는 벽으로부터 적어도 1 미크론, 2 미크론, 3 미크론, 4 미크론, 5 미크론, 6 미크론, 7 미크론, 8 미크론, 9 미크론 또는 10 미크론에 위치할 것이다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역은 챔버의 격리 영역 내에 적어도 부분적으로 존재한다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역이 챔버의 후크 (hook) 영역 내에 존재한다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역이 복수의 생물학적 마이크로-객체 중 생물학적 마이크로-객체가 위치하는 영역에 근접한다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역이 복수의 챔버와 흐름 영역 사이의 확산 축을 따라 (예를 들어, 복수의 챔버의 격리 영역과 미세유체 채널 사이의 확산 축을 따라, 예를 들어 연결 영역에 의해 정의된 확산 축을 따라) 존재한다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역이 복수의 챔버와 흐름 영역 사이의 확산 축을 따라 (예를 들어, 복수의 챔버의 격리 영역과 미세 유체 채널 사이의 확산 축을 따라, 또는 연결 영역에 의해 정의된 확산 축을 따라) 존재하지 않는다.
다양한 실시형태들에서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 및 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 복수의 챔버의 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치한 가용성 리포터 분자를 검출하는 것은 리포터 분자의 복수의 챔버 내로의 확산 후에 수행되고 그 안에서 분비된 분석물에 대한 리포터 분자의 결합은 정상 상태 조건에 또는 근처에 있다.
도 39 에 도시된 바와 같이, 방법은 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 선택적 단계 (4280) 를 포함하며, 여기서 제3 유체 배지는 비결합 가용성 리포터 분자들의 적어도 일부가 복수의 챔버 외부로 확산되도록 증진 또는 허용하도록 임의의 리포터 분자들을 포함하지 않는다.
다양한 실시형태에서, 제2 유체 배지로부터의 복수의 가용성 리포터 분자는 제1 복수의 가용성 리포터 분자이고, 복수의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버에 도입하기 전에. 다양한 실시형태에서, 방법은 선택적 단계 4210에서 제4 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계를 선택적으로 포함하고, 여기서 제4 유체 배지는 제2 복수의 가용성 리포터 분자를 포함한다.
방법은 선택적인 단계 4220 에서 복수의 챔버 및 유동 영역을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미지를 획득하는 단계, 그후 선택적 단계 4230 에서 유동 영역 내로 제5 유체 배지를 도입하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제5 유체는 배지는 가용성 리포터 분자를 포함하지 않는다.
다양한 실시형태에서, 이미지는 t = 0에서 획득된 제1 이미지이고, 가용성 리포터 분자를 검출하는 것은 선택적 단계 4270에서 t = 1에서 제2 이미지를 획득하는 것을 포함한다. t = 1에서 유동 영역과 복수의 챔버 사이의 비결합 리포터 분자들의 확산은 정상 상태에 접근했다. 다양한 실시형태에서, 제2 이미지는 흐름 영역과 복수의 챔버 사이의 비결합 리포터 분자의 확산이 정상 상태에 도달했는지 여부를 결정하는 데 사용된다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제2 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 적어도 일부를 포함하는 관심 영역에서 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양을 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 관심 영역에서 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양은 가용성 RMSA 복합체의 양 변화에 대한 선형 근사화를 생성하는 데 사용되며, 선형 근사화의 슬로프를 사용하여 챔버 간 분비된 분석물의 생산을 비교한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제2 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 후크 (hook) 영역이고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제2 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 후크 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 후크 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양은 챔버들에 걸친 가용성 분비 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 방법은 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제2 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태에서, 제1 복수 및 제2 복수의 가용성 리포터 분자가 동일한 라벨을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 제1 복수 및 제 2 복수의 가용성 리포터 분자는 각각 상이한 라벨을 갖는 2개의 상이한 리포터 분자를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 이미지는 t = 0에서 획득된 제1 이미지이고, 방법은 제3 유체 배지를 유동 영역에 도입하기 전 및 복수의 가용성 리포터 분자의 일부가 복수의 챔버 내로 확산하고 그안에 분비된 가용성 분석물에 결합하도록 허용한 후, 미세유체 디바이스의 제2 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 리포터 분자의 검출은 미세유체 디바이스의 제3 이미지를 획득하는 것을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제3 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 복수의 서브 영역들 각각 내의 가용성 RMSA 복합체의 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 복수의 서브 영역들의 일부에서의 가용성 RMSA 복합체의 양은 챔버 사이의 분비된 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 방법은 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지, 제2 이미지, 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태에서, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 후크 (hook) 영역이고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제3 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 후크 영역 내의 RMSA 복합체의 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 후크 영역 내의 RMSA 복합체의 양은 챔버들 사이의 분비된 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
다양한 실시형태에서, 방법은 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 상기 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지, 제2 이미지, 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 가진다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 가진다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물은 가용성 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 가진다. 다양한 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체이다.
다양한 실시형태에서, 리포터 분자의 결합 성분이 항체 중쇄 H1 도메인에 결합한다. 다양한 실시형태에서, 리포터 분자의 결합 성분이 항체 경쇄(예를 들어, 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프)에 결합한다. 다양한 실시형태에서, 리포트 분자의 결합 성분이 람다 경쇄(예를 들어, 람다 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프)에 결합한다. 다양한 실시형태에서, 리포트 분자의 결합 성분이 카파 경쇄(예를 들어, 카파 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프)에 결합한다.
다양한 실시형태에서, 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들 각각으로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다.
다양한 실시형태에서, 방법은 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들의 챔버들에 대한 분비의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다. 다양한 실시형태에서, 방법은 복수의 챔버 중 하나보다 많은 챔버의 분비물 스코어들을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스의 복수의 챔버 내로 복수의 생물학적 마이크로-객체를 도입하는 단계가 생물학적 마이크로-객체를 선택하고 선택된 생물학적 마이크로-객체를 복수의 챔버 내로 선택적으로 이동시키는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 선택은 양성 선택이다(예를 들어, 생물학적 마이크로-객체는 건강한 세포 또는 세포의 게놈에서 발현 구성의 성공적인/표적화 통합을 나타내는 마커로 염색되고, 양성 염색되는 생물학적 마이크로-객체가 선택됨). 다양한 실시형태에서, 선택이 음성 선택인 방법이 제공되며(예를 들어, 생물학적 마이크로-객체는 건강하지 않은 세포 또는 세포의 게놈에서 발현 구성의 성공적이지 않은 통합을 나타내는 마커로 염색되고, 염색되지 않은 생물학적 마이크로-객체가 선택됨). 양성 또는 음성 선택에 사용될 수 있는 마커의 비제한적 예는 세포 생존력을 평가할 수 있는 제제(예를 들어, Annexin V, propidium iodide 등), 대사 상태를 평가할 수 있는 제제(예를 들어, 미토콘드리아 막 전위 시약 "미토 ID 염색"), IgG 발현을 평가할 수 있는 제제(예를 들어, 단백질-A FITC, 폴리클로날 Ab, 항-Fc 형광단 등), 하나 이상의 세포 표면 마커를 표적으로 하는 항원 특이적 염색인 제제, 및/또는 포도당 흡수 시약(예를 들어, 2-NBDG)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
다양한 실시형태에서, 복수의 챔버로부터 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각 챔버는 그 안에 포함된 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자라는 것을 나타내는 스코어를 갖는, 상기 챔버들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계; 대응하는 반응 용기에서 선택된 챔버들 세트의 각 챔버로부터 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 확장하는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비되는 분석물의 레벨을 결정하여, 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비물의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는, 클론주 개발의 방법이 제공된다.
형성된 RMSA 복합체의 화학량론 및 이의 검출에 관해서는 위의 상세한 논의를 참조하라.
다양한 실시형태에 따른, 챔버 및 유동 영역의 특징과 관련하여, 위의 상세한 설명을 참조하라.
마이크로-객체의 클론 개체군, 배양 배지로 유동 영역 관류, 배양 배지 조성, 고갈된 성장 배지, 가용성 자극 성분, 관심 영역, 배경 감산된 신호, 신호 정규화, 분비 스코어, 분비된 분석물 분자량, 리포트된 분자 조성(예를 들어, 아미노산, 핵산), 검출 가능한 라벨 특징 및 특성, 및 분비된 분석물 조성과 관련된 논의에 대해서는 위의 상세한 논의를 참조하라.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함할 수도 있으며, 여기서, 배치 또는 제공하는 단계는 복수의 챔버들 중 적어도 일부분 내에 생물학적 마이크로-객체를 배치 또는 제공하는 단계를 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들의 챔버들의 서브-세트의 각각의 챔버에 대한 분비의 레벨을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버들의 스코어들을 비교하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 본 방법은 분비의 레벨을 정량화하는 스텝을 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 본 방법은 복수의 챔버들 중 하나 이상을 선택하고 선택된 하나 이상의 챔버들로부터 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 배출하는 스텝을 더 포함할 수도 있다.
여기의 여러 실시형태들에 따른 방법들은 결과적인 서브클론 개체군들을 추가로 팽창 및 분석함으로써 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 이것은 예를 들어 선택된 클론 개체군을 미세유체 디바이스 내 다른 챔버들의 세트로 이동시키고 선택된 개체군의 각각의 개개의 세포에 대해 다시 팽창시킴으로써 달성될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 본 방법은 선택된 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군을 유동 영역 (또는 채널) 으로 또는 미세유체 디바이스 밖으로 배출하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 챔버들로부터 채널로 또는 챔버 및/또는 채널로부터 미세유체 디바이스로 배출하는 스텝은 각각의 선택된 챔버 상에서 개별적으로 수행될 수도 있다 (예컨대, 선택된 챔버들의 세트로부터의 세포들은 일련의 배출 스텝들로, 한번에 하나의 챔버씩 배출될 수도 있다). 여러 실시형태들에서, 챔버 내에 배치된 세포들은 이전에 분석된 챔버로부터 발생될 수 있어, 서브클론들의 서브클로닝 및 비교 분석을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 절대 또는 상대 값이 특정의 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는이데 사용될 수도 있다. 이와 유사하게, 단백질들 (예컨대, IgG 도메인을 가진 항체들) 의 패밀리의 절대 또는 상대 값이 항체의 높은 체적을 발생시키는 세포들을 선택 및 팽창시키는데 사용될 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 챔버로부터의 모든 세포들이 칩의 동일한 챔버 또는 다른 포함된 영역에서 선택 및 팽창될 수 있다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 양을 나타내는 상대 또는 절대 값과 연관된 동일한 챔버로부터의 세포들 중 하나 이상이 상이한 챔버들에서 선택 및 팽창될 것이다. 여러 실시형태들에서, 분비된 분석물의 상대 또는 절대 값을 생성하는 것은 팽창된 세포들 상에서 (1X, 2X, 3X, 4X, 또는 더 이상의 배수로) 반복적으로 수행될 수도 있다.
다른 실시형태에서, 이 방법의 적용은 반복된 분석들로부터의 피드백으로, 세포들에 대한 특정의 조건들의 효과들의 검사를 가능하게 할 수도 있다. 예를 들어, 분비된 분석물의 대규모 생산에 밀접하게 관련된 조건들 및 물질들이, 추가적인 검사을 위해 가장 적합한 클론들을 찾아내고 특성화하기 위해, 사용될 수도 있다. 다른 예에서, B-세포 항체 자극을 위한 다양한 자극 프로토콜들이 보다 재현가능한 방법으로 검사될 수도 있으며, 다른 프로토콜보다 하나의 프로토콜의 이점들을 더 비교할 수 있을 만큼 분석될 수도 있다.
문제 해결
앞서 언급한 바와 같이, 미세유체 어셈블리는 일반적으로 일련의 챔버 또는 샘플 위치를 포함한다. 이러한 어셈블리 중 다수는 일반적으로 미세유체 어셈블리 내에서 반응 및 검출을 용이하게 하기 위해 챔버 또는 샘플 위치 안팎으로 샘플, 시약, 프로브 등을 이동시키기 위한 하나 이상의 입구 및 출구를 포함한다. 종종 챔버 또는 샘플 위치가 입구와 출구에 대해 직렬로 배치되어 특정 챔버는 입구에 더 가깝게 위치하고 다른 챔버는 출구에 더 가깝게 위치하는 경우가 발생한다. 따라서 이러한 구성은 입구 및/또는 출구에 대한 챔버의 근접성으로 인해 샘플, 시약 또는 마이크로-객체의 농도에 고유한 구배를 생성할 수 있기 때문에 기술적 문제가 발생하며, 이것은 우연히 챔버들 간의 평형 값들을 비교할 때 측정들에서의 시스템 바이어스로 이어질 수 있다.
이 기술적인 문제를 설명하기 위해, 리포터 분자가 문제의 입구를 통해 전달되고 있는 경우, 입구에 인접한 챔버가 종종 출구에 인접한 챔버보다, 입구에 대한 근접성이 주어지는 경우, 더 많은 리포터 분자를 수용한다는 점을 고려하라. 이와 같이, 각 챔버 내부의 형광 검출이 평형 상태에 도달하기 위해 상이한 기간이 필요할 수도 있으며, 이 기간은 입구 및/또는 출구에 대한 챔버의 위치에 의존한다. 시간 의존적 현상의 상대적 측정이 미세유체 디바이스의 복수의 챔버에 걸쳐 얻어지는 경우들에서, 기술적인 문제는 칩을 가로질러 평형 상태에 도달하는 데 걸리는 시간의 불일치를 통해 이를 표면화한다. 이러한 불일치는 칩에 걸친 각 챔버에 대한 측정된 현상을 덜 정확하게 나타내고, 및/또는 분석될 수 있는 측정된 성분들의 동적 범위를 제한하는 상대적 측정 (스코어, 값 등) 을 야기할 수 있다.
이 기술적 문제는 예를 들어 어셈블리가 이전에 어셈블리에 전달된 것 (예를 들어, 이 경우 리포터 분자) 을 제거하기 위한 플러시 절차를 포함하는 상황까지 확장된다. 예시의 경우에, 리포터 분자의 플러시는 또한 다양한 챔버들에 걸쳐 고르지 않은 성능을 갖기 때문에 기술적 문제가 다시 나타난다. 위의 예와 같이, 이러한 유형의 플러시 상황에서, 입구에 인접한 챔버는 더 많은 리포터 분자를 갖지만, 입구에 대한 근접성 때문에, 출구에 인접한 챔버보다 해당 챔버로부터 더 많은 리포터 분자가 성공적으로 플러시된다. 이와 같이, 각 챔버는 입구에서의 전방 챔버에 근접한 채널의 영역과 출구에 근접한 후자 챔버에 근접한 채널의 영역 사이에서, 채널을 가로질러 농도 구배를 형성하는 챔버 밖으로 그리고 채널 내로 확산되는 샘플, 시약 또는 마이크로-객체로 인해 미세유체 어셈블리의 다른 챔버에 비해 리포터 분자의 상대적으로 동일한 분포가 다시 부족할 수 있다. 채널과 챔버에서의 측정된 구성 요소 (예를 들어, 샘플, 시약 또는 마이크로-객체 등) 간의 농도 차이는 확산 속도 상수에 정비례하기 때문에, 측정된 구성 요소의 확산과 관련된 임의의 상대적 측정 또는 스코어는 시스템 바이어스를 가질 것이다.
따라서 일련의 챔버 또는 샘플 위치, 입구 및 출구를 포함하는 미세 유체 어셈블리의 경우, 해결해야 할 기술적 문제는 임의의 전달된 구성 요소(예를 들어, 샘플, 시약 또는 프로브)의 동일하지 않은 분포가 발생할 때 예를 들어 챔버 내 가용성 분비 분석물의 상대 농도와 같은 각 챔버와 관련된 상대 메트릭이 오류가 발생할 수 있다는 것이다.
도 37 및 도 38 에 의해 예시된 예시적인 실시형태와 같은 본 명세서에서 제공되는 다양한 실시형태는 적어도 다음과 같은 이유로 설명된 기술적 문제를 해결한다.
출원인은 미세유체 어셈블리(예를 들어, 미세유체 칩)에 대한 일련의 챔버 또는 샘플 위치에 걸친 시스템 오류의 기술적 문제가 예를 들어, 약 0.1-10초와 같은 최적화된 리프레시 레이트 (예를 들어, 유체 교환 레이트, 교환 레이트) 를 통해 감소될 수 있다는 것을 유연히 발견하였다. 리프레시 레이트는 유속에 대한 채널 부피의 비율, 즉 채널의 전체 부피가 새 시약으로 교체되는 비율일 수 있다. 따라서 리프레시 레이트를 최적화하는 것은 유체 채널을 더 나은 시약 소스(예를 들어, 미세유체 디바이스에 걸쳐 더 일관된 시약 농도)로 만든다. 이것은 유동 영역(예를 들어, 채널)이 미세 유체 칩에 걸쳐 보다 일관된 "소스"가 됨에 따라 조건(예를 들어, 채널을 가로질러 챔버로 들어가는 자유 리포터의 구배)이 챔버에서 분비된 분석물에 근접한 영역들 또는 "싱크"에서 더 일관되게 되고, 따라서 챔버 외부로 확산되는 RMSA 복합체로부터 발생하는 신호의 신호/잡음 비율을 개선하기 때문에 중요하다.
미세유체 어셈블리(예를 들어, 미세유체 칩)의 일련의 챔버 또는 샘플 위치에 걸친 시스템 오류의 기술적 문제는 칩에 걸친 잡음 효과를 극복하기 위해 획득한 이미지를 정정함으로써 또한 해결될 수 있다 (예를 들어, 플랫 필드 정정). 정정은 논의된 바와 같이 배경 참조 및 신호 참조(예를 들어, 형광 참조 및 확산 참조)를 사용하여 달성될 수 있다. 또한 다수의 이미지를 획득하는 것은 잡음을 평균화하는 데 추가로 도움이 될 수 있다.
미세유체 어셈블리, 예를 들어 칩에 걸친 시스템 오류(예를 들어, 입구의 챔버 환경 및 출구의 챔버 환경에서의 오류)를 줄이는 것은 시스템에 걸쳐 챔버의 상대적 스코어링의 정확도를 향상시킨다. 시스템에 걸친 개선된 상대적 랭킹/스코어링은 예를 들어 리포터가 (플러시 단계 전에) 채널로 유입될 때 평형 (즉, 정상 상태) 분석을 사용하여 이미징함으로써 발생한다. 그렇게 하는 것은 또한 작동 매개변수의 예기치 않은 발견을 야기했다. 예를 들어, 채널에 도입된 가용성 리포터의 최적 농도는 Kd (해리 상수, 농도로 표시됨)의 약 1-10배 범위에 있는 것으로 밝혀졌다. 추가로 예를 들어, 채널과 챔버를 가로지르는 시약의 평형을 위한 시간은 약 1-3시간 내에 발생하도록 구성될 수 있다. 이들 및 최적화된 매개변수의 다른 예는 측정의 신호 대 잡음을 증가시켜 칩 전체에 걸쳐 챔버의 랭킹/스코어링을 개선한다.
기술적 문제를 해결하는 것 외에도 이러한 매개변수는 집합적으로 상이한 분자량의 시약을 사용하여 그리고 상이한 분자량의 분비된 분석물에 대해 분석이 수행되는 것을 또한 가능하게 한다. 다양한 실시형태에서, 상이한 분자량의 시약의 다양한 조합으로 및 상이한 분자량의 분비된 분석물에 대해 동일한 프로토콜이 사용된다. 다양한 실시형태에서, 상이한 중량의 분비된 분석물을 검출하기 위한 단일 시약으로 동일한 프로토콜이 사용된다. 다양한 실시형태에서, 상이한 분자량의 분비된 분석물에 대해 상이한 분자량의 시약으로 동일한 프로토콜이 사용된다.
또한, 평형(예를 들어, 정상 상태) 분석을 사용하여 이미징하는 것은 시간에 독립적이기 때문에 여러 이미지들을 획득하여 잡음을 평균화하는 데 사용할 수 있다. 평형 분석은 더 민감하고, 더 정확하며, 이 분석을 수행할 수 있는 다양한 새로운 표적 분비 분자 및 새로운 검출 시약을 지원한다.
확산 분석 성능을 최적화할 때 중요한 고려 사항은 채널과 챔버 (예를 들어, 펜) 사이의 확산 및 이것이 다양한 단계 동안 미세유체 어셈블리(예를 들어, 칩)에 걸쳐 어떻게 변할 수 있는지를 이해하는 것이다. 평형 동안, 검출 시약을 반입하여 채널로부터 챔버(예를 들어, 펜) 내로 확산할 수 있으며, 이는 채널에서의 검출 시약의 농도를 감소시킨다. 이 경우 채널은 "소스"(고농도 영역)로 작동하고 챔버(예를 들어, 펜)는 "싱크"(저농도 영역)로 작동한다. 표적 단백질은 챔버(예를 들어, 펜)의 검출 시약을 분비 세포와 결합하여 사실상 챔버(예를 들어, 펜)의 용량을 증가시켜 더 큰 싱크로 작용한다. 일정한 농도(일정한 소스)를 유지하려면 검출 시약을 지속적으로 관류하여 채널에 지속적으로 검출 시약을 보충해야 한다. 따라서 최적화된 리프레시 레이트는 약 0.1-10초이다.
유체가 바늘을 통해 미세유체 칩으로 유입되는 경우 입구(펌프에 가장 가까운 칩 포트)에서 출구(바늘에 가장 가까운 칩 포트)로 또는 그 반대로 방향성 흐름이 있기 때문에 분자의 농도는 칩을 가로질러 챔버(예를 들어, 펜) 내로 확산됨에 따라 고갈된다. 그 결과 출구의 챔버(예를 들어, 펜)는 시스템이 완전히 평형화될 때까지 칩을 가로질러 구배를 생성하는 채널에서 검출 시약의 더 낮은 농도를 갖는다. "소스"와 "싱크"의 이러한 상호 작용은 분자를 분비하는 세포를 갖는 챔버(예를 들어, 펜)에서도 작동한다. 이 경우 챔버(예를 들어, 펜)는 소스 역할을 하고 채널은 분비된 분자의 싱크이다. 채널로 확산되는 분비된 분자는 유체 채널의 경로 길이를 따라 축적된다. 이 작용은 증가하는 분비 분자의 흐름 방향으로 (입구에서 출구로) 구배를 생성한다.
두 경우 모두에서, 이 효과는 채널이 보다 균일한 "소스" 또는 "싱크" 역할을 하도록 더 빠른 유속으로 완화될 수 있다. 챔버(예를 들어, 펜)의 유체는 주로 확산에 의해 제어되지만 채널의 층류는 챔버(예를 들어, 펜) 내에서 작은 와류를 생성한다. 이러한 와류의 존재는 채널과 챔버(예를 들어, 펜) 사이의 교환 속도를 증가시킬 수 있으며 더 나아가 층류 속도가 증가함에 따라 교환 속도가 증가할 수 있다.
정상 상태 또는 평형 분석은 추가 기술 문제를 해결한다. 예를 들어, 도 41a 및 도 41b 에 예시된 바와 같이 (평균 스코어 대 채널 분율), 플러시 분석의 시스템 바이어스는 채널 분율의 함수로 측정되었다. 도 41a 및 도 41b 에 도시된 예의 경우, 단일 클론 세포주를 칩 상에 로딩하고 POR 플러시 분석 및 프로토타입 BKM 평형 분석 둘 모두로 칩을 분석함으로써 데이터를 생성하였다.
각 펜의 스코어는 다양하지만 각 채널 부분의 평균 스코어는 이론적으로 유사해야 한다 (파란색으로 표시). 그러나 플러시 분석에서 상당한 슬로프 (입구에서 출구까지 평균 스코어의 37% 변화)는 상당한 바이어스를 나타내는 반면, 평형(예를 들어, 정상 상태) 분석 (또는 플러시 동안 촬영된 이미지가 아닌 유리 시약의 평형 중에 촬영된 이미지) 은 채널 분율의 함수로서 바이어스가 거의 또는 전혀 표시되지 않는다. 플러시 분석에서 시스템 오류의 근본 원인은 칩에 걸친 불완전한 평형의 결과이거나 평형 동안 느린 관류 속도의 결과일 수 있다. 예를 들어, 느린 관류 속도는 흐름 영역에서 분비된 단백질을 제거하지 않고 채널을 신선한 배지로 교체하는 반면 분비된 단백질은 (예를 들어, 입구에 가장 가까운) 채널에 걸친 구배에서 상류 챔버 밖으로 그리고 흐름 영역(예를 들어, 채널) 내로 및 후속적으로 (예를 들어, 출구에 가장 가까운) 하류 챔버 내로 확산하고 있다. 유동 영역으로 및 하류 챔버에 근접한 유동 영역으로 흐르는 상류 유동 영역에서 분비된 단백질로부터의 이러한 구배는 차례로 하류 펜에서 정상 상태 평형을 변화시키고, 이에 따라 하류 펜에 근접한 유동 영역에서의 RMSA 의 농도를 증가시키고 따라서 하류 펜의 스코어에 오류를 도입한다.
프록시 분석 표준 곡선으로부터의 추가 데이터는 펜 내의 농도의 함수로서의 바이어스 및 시야(FOV)의 함수로서의 이미징 순서를 보여준다 (데이터는 표시되지 않음). 현재 분석에서, 확산 참조는 시간의 함수로서 유리 시약의 확산으로 인한 신호의 변화를 정정하기 위해 정정된 이미지 또는 이미지들의 세트일 수 있다. 이 정정은 높은 분비 챔버에서 가장 두드러진 것처럼 챔버 밖으로 확산되는 결합된 복합체의 더 높은 농도 구배에 의해 구동되는 신호의 시간 의존성을 정정하지 않는다. (픽 (Fick) 의 법칙에 설명된 대로 확산 속도는 구배의 크기에 따라 달라진다. 구배가 클수록 시간에 따른 농도 변화가 더 커진다.) 정상 상태 평형 하에서 신호에 대한 시간 의존성이 없기 때문에 평형은 이러한 오류와 확산 참조 정정의 필요성을 제거한다.
요약하면, 평형 분석은 채널 분율과 FOV/시간 시스템 오류를 모두 제거하여 측정 정확도를 향상시킨다. 그것은 넓은 범위의 분자량에 대해 작동하는 단일 평형 시간을 사용을 허용한다. 예를 들어, 2 내지 2.5 시간의 평형 시간을 사용하는 것은 150 kDa 미만의 모든 시약에 대해 99% 평형을 야기한다. 더욱이, 작은 분자는 챔버 밖으로 빠르게 확산되어 챔버에 많이 축적되지 않지만, 큰 검출 시약을 사용하면 결합된 복합체가 더 커져 챔버 밖으로 확산이 느려진다. 시스템이 검출 시약이 있는 상태에서 정상 상태로 평형을 이루면 챔버에 있는 표적 단백질의 양이 증가하여 더 높은 신호와 개선된 감도를 야기한다.
앞서 논의한 바와 같이 여러 이미지를 획득하면 잡음을 평균화하여 신호 대 잡음비를 개선하는 데 추가로 도움이 될 수 있다. N 개의 이미지를 평균화하면 N 의 제곱근만큼 잡음이 감소한다. 예를 들어, 4개의 이미지를 함께 평균하면 잡음이 2배 감소하고 9개 이미지를 평균화하면 잡음이 3배 감소한다. 예를 들어, 클론들의 랭크 순서의 일관성 향상 및 따라서 측정의 정확도를 입증하기 위해, 시스템이 완전히 평형화된 후 10분 간격으로 11개의 순차적인 이미지들의 세트를 촬영했다. 도 42a 및 42b 를 참조하면, 상위 분비 클론들의 서브세트(상위 65개 클론 중 63개, 2개의 높은 이상값 제외)의 상관관계에 대한 분석이 수행되었다. 도 42a는 단일 이미지 간의 상관관계를 도시한 반면 도 42b는 처음 5개의 이미지로부터의 스코어의 평균과 마지막 6개의 이미지의 평균의 비교를 예시한다. 현재 스코어는 스코어링 영역에서의 영역들 9-13 을 사용하여 계산된다. 스코어(즉, 구배의 슬로프)를 계산하기 위해 영역을 5-15 로 확장하면 잡음이 더욱 감소했다. 단일 이미지 간의 평균 상관관계는 R2 = 0.75 +/- 0.1 로 향상되었고 5 및 6 이미지 평균을 비교하면 R2 = 0.90 으로 상관 관계가 향상되었다. 또한, 단일 이미지의 선택을 비교하면, 평균 상관 관계(R2)은 최소 0.15, 최대 0.62로 0.33 +/- 0.25(095% CI)였다. 처음 5개의 이미지로부터의 평균 스코어의 마지막 6개의 이미지의 평균과의 비교, R2 는 0.71 로 향상되었다.
분비된 분석물
분비된 분석물들. 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 가지는 유기 분자, 소포, 바이러스, 및 이들의 임의의 조합일 수도 있다. 분비된 분석물은 자연적으로 발현된 분석물일 수도 있거나 (예컨대, 자연적으로 발현될 수도 있거나) 또는 생체공학적 분석물 (예컨대, 유전자 삽입, 결실, 변형 및 기타 등등에 기인하는 생성물) 일 수도 있다. 핵산인 분비된 분석물은 리보 또는 디옥시 핵산일 수도 있으며, 천연 또는 비천연 뉴클레오티드들을 포함할 수도 있다. 바이러스인 분비된 분석물은 바이러스 입자, 벡터 또는 파지일 수도 있다. 사카라이드인 분비된 분석물은 모노-, 디- 또는 폴리사카라이드일 수도 있다. 사카라이드들의 비한정적인 예들은 글루코스, 트레할로스, 마노스, 아라비노오스, 프룩토오스, 리보오스, 잔탄 또는 키토산을 포함할 수도 있다. 분비된 작은, 유기 분자는 바이오연료들, 오일들, 중합체들, 또는 조제약들, 예컨대 매크로라이드 항생제들을 포함할 수도 있지만, 이에 한정되지 않는다. 단백질인 분비된 분석물은 항체 또는 항체의 단편일 수 있다. 단백질인 분비된 분석물은 혈액 단백질, 예컨대 알부민, 글로불린 (예컨대, 알파2-고분자글로불린, 감마 글로불린, 베타-2 저분자글로불린, 합토글로불린), 보충 단백질 (예컨대, 컴포넌트 3 또는 4), 트랜스페린, 프로트롬빈, 알파 1 항트립신, 및 기타 등등; 호르몬, 예컨대 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 성장 호르몬, 성장 인자들 (예컨대, FGF, HGF, NGF, EGF, PDGF, TGF, 에리스로포이에틴, IGF, TNF), 난포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 렙틴, 및 기타 등등; 섬유 단백질, 예컨대 실크 또는 세포외 기질 단백질 (예컨대, 파이브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 비트로넥틴, 테나신, 베르시칸, 골 시알로단백질); 효소, 예컨대 메탈로프로테아제 (예컨대, 기질 매트릭스 메탈로프로테나제 (MMP)) 또는 다른 유형의 프로테아제 (예컨대, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 아스파라긴 펩티드 리아제), 아밀라아제, 셀룰라아제, 카탈라아제, 펙티나아제, 및 기타 등등; 박테리아, 효모, 또는 원생동물 단백질; 식물 단백질; o 또는 바이러스 단백질, 예컨대 캡시드 또는 엔벨로프 단백질일 수 있다. 단백질인 분비된 분석물은 항체, 항체의 단편, (단백질 분해 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는) 효소, 예를 들어, 알부민과 같은 조작된 (통상적으로는 세포내 단백질) 단백질, 및/또는 (누에 실크 또는 거미 실크를 포함하지만 이에 한정되지 않는) 구조 단백질일 수 있다. 이 리스트에는 제한이 없으며, 분비되도록 조작될 수도 있는 임의의 단백질이 이 방법들에 의해 평가될 수도 있다. 분비된 분석물은 항체-약물 접합체일 수도 있다. 단백질, 사카라이드, 핵산, 3Kd 미만의 분자량을 갖는 유기 분자, 및/또는 바이러스의 조합을 가질 수도 있는 분비된 분석물의 비한정적인 예는 프로테오글리칸 또는 당단백질을 포함할 수 있다.
리포터 분자들 및 이들의 특성들. 리포터 분자는 분비된 분석물에 결합하도록 설계된 결합 성분을 포함할 수도 있으며, 또한 검출가능한 라벨을 포함할 수도 있다. 결합 성분은 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 임의의 적합한 결합 파트너일 수도 있다. 결합 성분은 단백질, 펩티드, 핵산 또는 3Kd 미만인 분자량을 가지는 소형 유기 분자일 수도 있다. 예를 들어, 결합 성분은 다른 핵산 시퀀스를 특이적으로 결합하는 핵산 시퀀스, 또는 단백질 (예컨대, 특정의 항체를 인식하는 에피토프) 에 특이적으로 결합하는 펩티드일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 결합 성분은 생물학적 마이크로-객체의 분비된 분석물들의 패밀리에 비특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 결합 성분은 IgG 도메인에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 핵산 시퀀스들의 패밀리에 존재하는 도메인에 결합하는 핵산일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자는 다가이며, 분비된 분석물의 하나 보다 많은 복제본에 결합하기 위해 또는 분비된 분석물들의 패밀리의 하나 보다 많은 멤버에 결합하기 위해 하나 보다 많은 결합 성분을 포함한다. 설명의 용이성을 위해, 용어 분비된 분석물은, 본원에서 사용될 때, 특정의 분비된 분석물 분자 또는 분비된 분석물들의 패밀리를 지칭할 수 있다. 따라서, RMSA 복합체의 화학양론은 변할 수 있다. 예를 들어, 분비된 분석물의 하나의 복제본을 결합하는 리포터 분자는 1:1 화학양론을 갖는 RMSA 복합체를 가질 수도 있다. 대안적으로, RMSA 복합체는 리포터 분자: 분비된 분석물의 2:1, 3:1, 4:1, 2:2, 4:2, 또는 다른 화학양론을 가질 수도 있다. 리포터 분자는 분자량에 의존하는 리포터 분자:분석물 착체의 확산 특성들에 의해 정의된 바와 같은, 겉보기 "사이즈" 가 비결합된 리포터 분자들과 RMSA 착체들 사이의 차동 확산을 관측하기 위해 리포터 분자 자체보다 충분히 "더 크다" 는 규정에 따라, 임의의 적합한 분자량을 가질 수도 있다. 리포터 분자는 분비된 분석물의 분자량의 약 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 동일 분자량인 분자량을 가질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 리포터 분자의 분자량은 분비된 분석물의 분자량의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만이다. RMSA 복합체의 분자량은 리포터 분자의 분자량보다, 적어도 2X, 4X, 10X, 20X, 30X, 40X, 50X 또는 이들 사이의 임의의 수일 수도 있다. RMSA 복합체의 분자량은 비결합된 리포터 분자의 분자량보다 2 배, 4 배 또는 50 배 더 클 수도 있다.
실험
시스템 및 미세 유체 장치: OptoSelectTM 디바이스, 즉, Berkeley Lights, Inc. 에 제조되고 또한 Berkeley Lights, Inc. 에 의해 제조된 광학 기구에 의해 제어되는 나노유체 디바이스를 채용하였다. 기구는 온도 제어기에 커플링된 칩용 마운팅 스테이지; 펌프 및 유체 배지 조정 컴포넌트; 및 카메라 및 칩 내 포토트랜지스터들을 활성화하기에 적합한 구조화된 광원을 포함하는 광학 트레인을 포함한다. OptoSelect 디바이스는 포토트랜지스터-활성화된 OET 힘을 제공하는 OptoElectroPositioning (OEP™) 기술로 구성된 기판을 포함한다. 칩은 또한 복수의 미세유체 채널들을 포함하며, 각각의 미세유체 채널들은 그에 유체 연결된 복수의 나노펜™ 챔버들 (또는, 챔버들) 을 갖는다. 각각의 챔버의 체적은 대략 1x106 입방 마이크론이다.
생물학적 세포들. 인간 항체를 표현하도록 조작된 CHO 세포들을 사용하였다. 세포 수들 및 생존력을 카운트하였으며 OptoSelect 디바이스 상으로 세포들을 로딩하기 위해 세포 밀도를 5x105/ml 로 조절하였다.
디바이스 프라이밍 (priming). 250 마이크로리터들의 100% 이산화탄소를 OptoSelect 디바이스로 12 마이크로리터들/초의 레이트로 유동시킨 후, 0.1% Pluronic® F27 (Life Technologies® Cat# P6866) 을 함유하는 250 마이크로리터들의 PBS 를 12 마이크로리터들/초로 유동시키고, 최종적으로 250 마이크로리터들의 PBS 를 12 마이크로리터들/초로 유동시킨다. 배양 배지의 도입은 다음과 같다.
배지: CD CHO 배지 (ThermoFisher Scientific Cat. # 10743029), 시중에서 입수가능한 무 단백질 및 무 혈청 매질, 즉, 화학적으로 정의된 매질을 사용하였다.
배양 동안 배지들 관류. 다음 2개의 방법들 중 어느 하나에 따라서 OptoSelect 디바이스를 통해서 배지를 관류시킨다:
1. 2시간 동안 0.01 마이크로리터들/초로 관류시키고; 64 초 동안 2 마이크로리터들/초로 관류시키고; 그리고 반복시킨다.
2. 100 초 동안 0.02 마이크로리터들/초로 관류시키고; 유동을 500 초 중지시키고; 64 초 동안 2 마이크로리터들/초로 관류시키고; 그리고 반복시킨다.
예 1: 펩티드 리포터 분자를 이용하여 항체의 상대적인 생산을 평가하기.
리포터 분자. HiLyte FluorTM 555 NHS 에스테르 (AnaSpec Inc., Cat. # AS-81251, 869da (유리 산의 MW), Ex/Em 550/566 nm (Cy3 필터)) 로 N-말단 라벨링된, 2.4Kd 의 분자량을 가지는 IgG 결합 펩티드.
어두운 참조 이미지 컬렉션: 세포들의 도입 전에, OptoSelect 디바이스를 먼저 어떤 배지도 없고 리포터 분자도 존재하는 상태에서 이미징하여, 배경을 제거하고 각각의 나노펜 챔버의 이미지를 정규화하는 본원에서 설명된 바와 같은 프로세스에서 사용되는 암 참조 이미지를 획득하였다.
신호 참조 이미지 수집: 형광 화합물이 확산되어 나노펜 챔버들과 미세유체 채널 사이에 평형 분포를 달성될 때까지, N-말단 라벨링된 HiLyte FluorTM 555 IgG 결합 펩티드 (리포터 분자) 를 1 microgram/ml 의 농도로 함유하는 배양 배지를, OptoSelect 디바이스로 45 분 간 0.005 마이크로리터들/초로 유동시켰다. 그 때, 신호 참조 이미지를 획득하였다. 그런 다음 OptoSelect 장치를 리포터 분자가 없는 0.03마이크로리터/초의 배양 배지로 25분 동안 플러싱했다. 이 플러싱 기간은 리포터 분자가 NanoPen 챔버 밖으로 실질적으로 완전히 확산되도록 하여 NanoPen 챔버 내에 리포터 분자가 전혀 남지 않거나 또는 미미하게 남아 있게 했다. 신호 참조 이미지는 대안적으로, 형광 염료 자체를 동일한 몰 농도로 유동시킴으로써 얻어질 수도 있으며, 형광으로 라벨링된 리포터 분자가 채용될 필요가 없다.
분비 세포들을 미세유체 디바이스에 도입하기. CHO 세포들을 OptoSelect 디바이스로 도입하고, 디바이스의 OEP 기술의 유전영동력들을 이용하여 나노펜 챔버들에 선택적으로 위치시켰다. 세포들을 나노펜 챔버 당 하나의 세포로 배치하였다. 배양 배지를 6 일의 기간 동안 상기와 같이 관류시켰다. 명시야 이미지들을 매일 찍어서, 각각의 나노펜 챔버 내 세포 팽창을 기록하였다. 제 1 분석 전 6일 배양 기간의 선택은 생물학적 세포들 및 분비된 분석물의 특정의 요건들에 따라서 다양할 수도 있다. (명시야 이미지를 포함할 수도 있는) 연장된 배양 기간의 매일 분석하는 것이 바람직할 수도 있거나, 또는 배양 기간 동안 선택된 일자들에서 하나 이상의 분석들을 수행할 수도 있다.
분석 신호 수집. 분석의 초기 스텝으로서, 각각의 나노펜 챔버 내 세포 개수와 위치를 연관시키기 위해 명시야 이미지를 얻었다. 명시야 이미지의 수집 후, 1 microgram/ml 의 농도의 형광 리포터 분자를 45 분의 기간 동안 미세유체 채널로 0.05 마이크로리터들/초로 유동시켜, 리포터 분자가 각각의 나노펜 챔버로 충분히 확산하도록 충분한 시간을 주었다. 나노펜 챔버으로의 리포터 분자의 도입 후, 어떤 형광 리포터 분자도 포함하지 않는 배양 배지의 유동을 위에서 결정된 바와 같은 확산 레이트에 기초하여, 25 분의 기간 동안 0.03 마이크로리터들/초로 재개하였다. 형광 이미지를 얻었다. 분석은 원할 경우, 특정의 세포들 및/또는 이로부터의 분비된 분석물에 적합한 것으로 결정된 배양/팽창의 추가적인 기간들에 걸쳐서, 반복될 수도 있다.
분석물의 상대적인 생산의 결정. 폭 약 20 픽셀들 및 길이 200 픽셀들의 영역을 포괄하는, 나노펜 챔버 내로부터의 확산 축을 따른 관심 영역 (AOI) 을 각각의 나노펜 챔버 내에서 식별하였으며, 여기서, AOI 의 하부 (제 1) 말단을, 격리 영역 내에, 세포들이 배치되지 않은 미세유체 채널로의 개구에 원위에 있는 나노펜 챔버의 기부로부터 선택된 거리에 있도록 선택하였다. AOI 의 길이의 제 2 (상부) 말단을 미세유체 채널 자체 내에 있도록 선택하였으며, 이는 AOI 내에 그리고 채널 내에 상주하는 픽셀들이 실질적으로 어떤 신호도 갖지 않도록 보장하였다. AOI 의 폭은 나노펜 챔버의 격리 영역으로부터 OptoSelect 디바이스의 채널까지 예상된 확산의 궤적을 따라서 집중된다. 앞에서 설명한 바와 같이, AOI 를 20 픽셀들의 폭 및 10 픽셀들의 예상된 확산 궤적을 따른 길이를 각각 갖는 20 개의 서브-영역들 (빈들) 로 세분하였다.
시스템 에러들, 및 시야의 불완전한 조명으로 인한 신호 이미지의 롤 오프 (roll off) 를 감소시키기 위해, 암 참조 및 신호 참조 이미지들을 이용하여, 본원에서 설명된 바와 같이 형광 분석시험 이미지를 정규화/교정하였다. AOI 에서의 각각의 픽셀은 다음과 같이 프로세싱된다:
Figure pct00013
서브-영역에서의 각각의 픽셀에 대한 신호 강도들을 추가함으로써, 20 개의 서브-영역들의 각각에 대한 중간 강도를 결정하였다. 각각의 서브-영역에 대한 정규화된 중간 강도 값들을 플롯한 결과로 나타나는 곡선의 표현이 도 12b 에 도시되며, 여기서, x 축은 서브-영역들 1 내지 20 을 나열한다. 서브- 영역 1 은 채널로부터 가장 원위에 있는 AOI 의 서브-영역이며, 서브-영역 20 은 채널까지 가장 멀리있는 AOI 의 서브-영역이다. 서브-영역들 9-13 (도 12b 에서 영역 (1156)) 에 대한 정규화된 중간 강도 값들을 플롯하는 곡선의 섹션에 대해 선형 회귀를 수행하였다. 위에서 설명한 바와 같이, 관측된 신호 강도가 나노펜 챔버의 격리 영역의 하부 (채널로부터 가장 원위에 있는) 부분 내 생물학적 세포들의 위치에 민감하지 않은 영역 내에 있도록, 이들 서브-영역들을 결정하였다. 이 동작으로부터 얻어진 구배의 값을 임의의 단위들 (A.U.) 로 스코어로서 사용하였다. 더 큰 구배들 (스코어) 은 그 나노펜 챔버 내 세포들에 의한 더 큰 분석물의 분비를 나타내었다.
도 21 에 나타낸 바와 같이, 관측된 신호의 강도와 명확하게 상관된 식별 번호 및 스코어가 시인가능한 나노펜 챔버들의 각각에 대해 표시된다 (상부 숫자는 그 나노펜 챔버에 대한 식별 번호이고, 하부 숫자는 그 나노펜 챔버에 대한 스코어이다). 10.01 및 8.67 의 낮은 스코어들을 각각 갖는, 나노펜 챔버들 563 및 941 은 분석물을 생산하는 적어도 하나의 세포를 가지고 있었지만, 낮은 양들의 리포터 분자: 항체 복합체가 이들 나노펜 챔버들의 각각으로부터 확산되었다. 13.15 및 17.26 의 스코어들을 각각 갖는, 나노펜 챔버들 563 및 949 은 중간-범위 스코어들을 보였다. 마지막으로, 25.26, 29.99 및 27.95 의 스코어들을 각각 가지는, 나노펜 챔버들 560, 566, 및 942 은 더 많은 양들의 항체 분석물을 생산하였다. 본원에서 나타낸 스코어들은 존재하는 세포들의 수에 대해 보정되지 않는다. 그러나, 그 계산이 본원에서 나타낸 스코어들에 대해 부과될 수도 있다. 어느 나노펜 챔버들이 고 생산성 세포주들을 개발하려는 노력에서 추가로 검사될지를 결정하는 것을 돕기 위해, 나노펜 챔버들을 더 용이하게 순위를 정하는데, 미가공 스코어들 또는 세포-카운트-보정된 스코어들을 이용할 수도 있다. 각각의 나노펜 챔버 내 분비된 분석물의 생산의 레벨을 정량화하기 위해, 곡선 아래의 영역 또는 본원에서 설명되는 다른 방법들과 같은, 나노펜 챔버로부터 채널까지 농도 변화의 레이트를 계산하는 다른 방법들이 또한 채용될 수도 있다.
상대 생산성의 측정. 스코어들은 도 22a 내지 도 22b 에 나타낸 바와 같이, 나노펜 챔버 당 세포들의 수에 대해 보정될 수도 있다. 이 실험에서, 세포 유형, 매질들, 리포터 분자, 사전-배양 이미지 획득, 배양 조건들, 및 분석 조건들은 상기와 동일하였다. 도 22 는 도 21 의 상부 로우에 이미지들에 나타낸 바와 같이, 0일, 및 3, 4, 5, 6일에 명시야 이미지가 획득된 단일 나노펜 챔버의 이미지들을 나타낸다. 추가적으로, 위에서 설명한 바와 같은 분석을 3, 4, 5, 6 일에 각각에 수행하였으며, 동일한 단일 나노펜 챔버에 대한 3, 4, 5, 및 6 일 각각의 형광 이미지들은 그 날에 대한 대응하는 명시야 이미지 아래에 정렬되어 도시되어 있다. 명시야 이미지를 이용하여 존재하는 세포들의 수를 카운트하였으며, 이는 자동화된 프로세스로 수행될 수도 있으며, 클론 개체군이 팽창됨에 따라, 선택된 나노펜 챔버에 대해: 0 일째 (1 개의 세포); 3 일째 (8 개의 세포들); 4 일째 (25 개의 세포들); 5 일째 (65 개의 세포들); 6 일째 (123 개의 세포들) 을 나타내었다. (음의 구배를 나타내는) 위에서 설명한 바와 같이 얻어진 분석 스코어들은 또한 3 일째 (195 A.U.); 4 일째 (566 A.U.); 5 일째 (1431 A.U.); 6 일째 (2842) 로, 꾸준히 증가되었다. 따라서, 3 일째에, 나노펜 챔버 내 8개의 세포들은 195 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 4 일째에, 동일한 나노펜 챔버는 이제 25 개의 세포들을 가지고 있어, 566 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 5 일째에, 동일한 나노펜 챔버는 65 개의 세포들을 가지고 있어, 1431 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 마지막으로, 하루 6 일째에, 동일한 나노펜 챔버는 123 개의 세포들을 가지고 있어, 2843 (A.U.) 의 스코어를 얻었다. 도 22 의 그래프는 나노펜 챔버 내에서의 세포 배양의 시작 이후, 일자 단위인 분석 시점 (X-축) 에 대해 플롯된 분석 스코어들 (y-축) 을 나타낸다. 챔버 내 세포들의 수에 대해 정규화된 스코어를 제공하기 위해, 절대 스코어들을 그 시점에 존재하는 세포들의 수로 나누었다. 이는 선택된 나노펜 챔버 내 세포들의 생산성 (rQp) 의 정규화된 측정치를 산출했으며, 세포 당 22.6 내지 24.1 A.U. 사이의 범위에 여전히 있었다.
예 2. 대규모 생산 및 세포주 개발과 항체 생산의 인-시츄 (in-situ) 스코어링의 상관 관계.
시스템 및 디바이스: 위와 같다.
세포 : 실험 1 에서와 같은 CHO 세포들.
배지들: 실험 1 에서와 같다.
리포터 분자: 실험 1 에서와 같다.
6 일 동안 배양을 수행하였으며, 2.4Kd 의 분자량을 가지는 HiLyte FluorTM 555 라벨링된 IgG 결합 펩티드를 이용한 확산 기반의 분석을 실험 1 에서와 같이 수행하였다. 본원에서 정의된 바와 같은 AOI 내에서 관측된 신호의 강도들에 기초하여 스코어를 할당하는 분석을 수행하였다. OptoSelect 디바이스 내 각각의 나노펜 챔버에 대해 스코어들을 평가하였다. 도 22a 및 도 22b 에서, OptoSelect 디바이스의 각각의 나노펜 챔버를 플롯하였으며, 여기서, 수평축은 칩 상에서 얻어진 역가 ("스코어", 또는 이 경우, 세포 위치 불감 서브-영역 (전체 AOI 에 대해 1-20 의 서브-영역들 9-13) 을 따른 중간 강도 값들의 구배) 이다. 각각의 나노펜 챔버를 (명시야 이미지로부터 얻어진) 분석시점 시점에 개별 나노펜 챔버에서 카운트된 세포들의 수를 나타내는 그래프의 Y-축 (도 23a) 상에 플롯하였다. 분석물의 분비에 대한 낮은 스코어들 (800 A.U. 미만의 컷오프); 분석물 분비에 대한 중간-레벨들 스코어들 (800 A.U. 미만 내지 약 1400 A.U.) 및 분석물 분비에 대한 높은 스코어들 (약 1400 내지 약 2400 A.U.) 을 가지는 3개의 나노펜 챔버들의 그룹들을 선택함으로써, 제 1 선택을 하였다. 이들 선택된 그룹들의 각각 내에서, 큰, 중간 및 낮은 개수들의 세포들을 가지는 나노펜 챔버들이 있었다.
도 23b 에 나타낸 바와 같이, 빠른 성장을 가지는 나노펜 챔버들을 선택하기 위해 추가적인 선택을 포함시켰으며; 챔버들은 중간 레이트의 세포 배증 (doubling) 을 나타내었으며, 제 3 그룹을 단지 느리게 증식하는 세포들의 개수들만을 갖도록 선택하였다. 이들 그룹들의 각각에서, 높은, 중간 및 낮은 레벨들의 분석물 생산을 나타내었다 (스코어들은 도 23b 의 전체 수평축을 가로지르는 범위이다). 성장/분비 프로파일들의 모든 9개의 서브-유형들 중 하나 내에서 개개의 나노펜 챔버들의 선택을 하였으며, (별개의 클론 개체군을 각각 보유하는) 선택된 챔버들을 개별적으로, 먼저 웰 플레이트들로 배출시켰다. IgG 에 대한 ELISA 분석을 통해 역가들을 얻었다. 클론 개체군들을 함유하는 낮은, 중간 및 높은 분비하는 웰들의 추가적인 선택을 125 ml 쉐이커 플라스크들로 도입하여 추가로 스케일 업시켰다.
스케일 업된 125ml 쉐이커 플라스크들에서의 클론 개체군들을 IgG 에 대한 ELISA 분석을 통해 분석하였다. 선택된 클론들이 도 24 에 도시되며, 여기서, 각각의 125ml 쉐이커 플라스크의 역가는 Y-축 상에 표시되며, 세포들이 유래되는 개별 나노펜 챔버에 대한 온 칩 역가 (위에서 설명된 분석에서 얻어진 바와 같은, A.U. 단위인 스코어) 는 X-축 상에 나타내어진다. 제 1 그룹 2405 은 낮은 온칩 역가들 (스코어들) 을 가지는 나노펜 챔버들 내 세포들로부터 유래하였다. 그룹 2405 은 125 ml 쉐이커 플라스크로 스케일링되면 임의의 높은 생산성 클론들을 포함하지 않았다. 제 2 그룹 2415 은 온칩 역가 (스코어) 의 중간 범위를 가지는 나노펜 챔버들 내 세포들로부터 유래하였으며, 125 쉐이커 플라스크로부터 ELISA 역가 값들의 중간 범위를 나타내었다. 최종 그룹 2425 은 모두 139.1 micrograms/mL 의 풀 평균 (pool average) 보다 더 높은, 높은 역가 값들을 가지며, 또한 높았던 온칩 역가들 (A.U. 단위인 스코어) 을 가지는 나노펜 챔버들로부터의 세포들과 높은 상관관계를 보였다. 따라서, 중간 내지 높은 온 칩 역가들 (스코어들, 또는, 특정의 실시형태에서, 구배) 을 가지는 나노펜 챔버들 내 세포들에 대해, 대규모 개체군에서 얻어진 역가의 레벨에 대해 우수한 상관관계가 있음이 입증되었다. 따라서, 본원에서 설명된 바와 같은 OptoSelect 디바이스 내에서 수행되는 분석은 세포주 개발을 위해 더 많은 수의 고 생산성 클론들을 더 빨리 식별하는 의미 있는 접근법을 산출하였다. 추가적으로, 도 16b 와 관련하여 위에서 설명된 바와 같이, 각각의 클론 개체군을 개별적으로 스크리닝하는 능력은 다른 비-생산성 클론 개체군들만큼 빠르게 성장하지 않을 수도 있는 생산성 클론들을 식별하는 능력을 제공한다. 이들 더 느리게 성장하는, 보다 생산적인 클론들은 벌크 팽창의 조건 하에서 식별될 확률이 낮을 것이다.
예 3. 압타머를 이용하여 항체의 상대적인 생산을 평가하기.
시스템 및 디바이스: 위와 같다.
세포 : 실험 1 에서와 같은 CHO 세포들.
배지들: 실험 1 에서와 같다.
리포터 분자: 인간 면역글로불린 G 에 대한 압타머, (Apta-IndexTM, Apt 8, ID# 44, 23-mer, MW. 7.4Kd, Fc 도메인에 대한 친화력, Aptagen L.L.C. 시퀀스 5'- rGp-rGp-rAp-rGp-rGp-fUp-fCp-fCp-rGp-rAp-rAp-rAp-rGp-rGp-rAp-fCp-fUp-fCp-fCp-3'. 시퀀스 표기에서, r- 접두부는 리보뉴클레오티드를 표시하며; f- 접두부는 2-플루오로 뉴클레오티드를 표시하며; -p 접미부는 포스페이트를 표시하며; 그리고 G, A, C, U 는 표준 뉴클레오티드 약어들이다. 이것은 Alexa Fluor® 594 (AF594, ThermoFisher Scientific, Cat. No. A20004 (NHS 에스테르)) MW 819.8, Ex/Em590/617nm) 로 라벨링된다.
Alexa Fluor® 594 또는 Alexa Fluor 594 라벨링된 압타머를 2 micrograms/ml 의 농도로 함유하는 배양 배지를, 형광 화합물이 확산되어 나노펜 챔버들과 미세유체 채널 사이에 평형 분포를 달성할 때까지, 45 분 동안 OptoSelect 디바이스로 유동시킨다. 신호 참조 이미지를 획득한다. 그후, OptoSelect 디바이스를 어떤 리포터 분자도 갖지 않는 배양 배지로 30 분 동안 0.03 마이크로리터들/초로 플러싱한다. 이 플러싱의 기간은 리포터 분자들이 나노펜 챔버로부터 실질적으로 완전히 확산되도록 보장한다.
CHO 세포들을 OptoSelect 디바이스로 도입하고 디바이스의 OEP 기술의 유전영동력들을 이용하여 나노펜 챔버들로 선택적으로 위치시킨다. 세포들을 나노펜 챔버 당 하나의 세포로 배치한다. 6 일의 기간 동안, 배양 배지를 상기와 같이 관류시킨다. 각각의 나노펜 챔버 내 세포 팽창을 기록하기 위해 매일 명시야 이미지들을 찍는다. 실험의 3, 4, 5 및 6 일의 각각의 일자에 항체 생산을 검출하기 위한 분석들을 수행한다.
분석 신호 수집. 각각의 나노펜 챔버 내 세포 개수와 위치를 상관시키기 위해 명시야 이미지를 얻는다. 명시야 이미지의 수집 후, 2 microgram/ml 의 농도의 형광 리포터 분자, 즉, 압타머-AlexaFluor 594 를 50 분의 기간 동안 미세유체 채널로 유동시켜, 리포터 분자가 각각의 나노펜 챔버로 확산되도록 충분한 시간을 준다. 나노펜 챔버으로의 리포터 분자의 도입 후, 어떤 리포터 분자도 포함하지 않는 배양 배지의 유동을 대략 7Kd 의 분자에 대한 확산 레이트에 기초하여, 30 분의 기간 동안 0.03 마이크로리터들/초로 재개한다. 형광 이미지를 얻는다.
나노펜 챔버 내로부터의 확산 축을 따른 관심 영역 (AOI) 이 상기 실험 1 에서 설명한 바와 같이 위치된, 폭 약 20 픽셀들 및 길이 200 픽셀들의 영역을 포괄하는 각각의 나노펜 챔버 내에서 식별된다. AOI 의 폭은 나노펜 챔버의 격리 영역으로부터 OptoSelect 디바이스의 채널까지 예상된 확산의 궤적을 따라서 집중된다. AOI 를, 20 픽셀들의 폭 및 10 픽셀들의 예상된 확산 궤적을 따른 길이를 각각 갖는 20 개의 서브-영역들 (빈들 또는 세그먼트들) 로 세분한다. 시스템 에러들, 및 시야의 불완전한 조명으로 인한 신호 이미지의 롤 오프 (roll off) 를 감소시키기 위해, 암 참조 및 신호 참조 이미지들을 이용하여, 본원에서 설명된 바와 같이 형광 분석시험 이미지를 정규화/교정한다.
서브-영역에서의 각각의 픽셀에 대한 신호 강도들을 추가함으로써, 20 개의 서브-영역들의 각각에 대한 중간 강도를 결정한다. 각각의 서브-영역에 대한 정규화된 중간 강도 값들의 곡선을 발생시켜, 서브-영역들 9-13 에 대한 정규화된 중간 강도 값들을 플롯하는 곡선의 섹션에 대해 선형 회귀를 수행한다. 이 동작으로부터 얻어진 구배의 값을 스코어로서, 임의의 단위들 (A.U.) 로, 사용한다. OptoSelect 디바이스의 3500 개의 전체 나노펜 챔버들의 선택된 수의 개별 나노펜 챔버들은 200-250 A.U. 보다 큰 스코어들을 가지며 팽창 및 추가적인 개발을 위해 배출되도록 선택될 것으로 예상된다.
본 교시들은 다양한 실시형태들과 함께 설명되지만, 본 교시들은 이러한 실시형태들에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본 교시들은 당업자들이 주지하고 있는 바와 같이, 다양한 대안들, 변경들, 및 등가물들을 포괄한다.
또한, 다양한 실시형태들을 설명하는데 있어서, 명세서는 방법 및/또는 프로세스를 단계들의 특정 시퀀스로서 제시하였을 수도 있다. 그러나, 그 방법 또는 프로세스가 본원에서 개시된 스텝들의 특정의 순서에 의존하지 않는 한, 본 방법 또는 프로세스는 설명된 스텝들의 특정의 시퀀스에 한정되지 않아야 한다. 당업자가 주지하고 있는 바와 같이, 다른 스텝들의 시퀀스들이 가능할 수도 있다. 따라서, 명세서에서 개시된 스텝들의 특정의 순서는 청구범위에 대한 한정들로서 간주되지 않아야 한다. 게다가, 본 방법 및/또는 프로세스에 관한 청구범위는 서술된 순서로 이들의 스텝들의 수행에 한정되어서는 안되며, 당업자는 시퀀스들이 다양할 수도 있으며 여전히 다양한 실시형태들의 정신 및 범위 내에 있음을 쉽게 알 수 있다.
본원에서 설명하는 실시형태들은, 핸드-헬드 디바이스들, 마이크로프로세서 시스템들, 마이크로프로세서-기반 또는 프로그래밍가능 가전제품, 미니 컴퓨터들, 메인프레임 컴퓨터들 및 기타 등등을 포함한, 다른 컴퓨터 시스템 구성들로 실시될 수 있다. 실시형태들은 또한 태스크들이 네트워크를 통해서 링크된 원격 프로세싱 디바이스들에 의해 수행되는 분산 컴퓨팅 환경들에서 실시될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 설명하는 실시형태들이 컴퓨터 시스템들에 저장된 데이터를 포함하는 다양한 컴퓨터-구현 동작들을 채용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이들 동작들은 물리량들의 물리적인 조작을 필요로 하는 동작들이다. 대개, 반드시는 아니지만, 이들 양들은 저장, 전달, 결합, 비교, 및 기타 조작이 가능한 전기 또는 자기 신호들의 형태를 취한다. 또, 수행되는 조작들은 발생, 식별, 결정, 또는 비교와 같은, 용어들로 종종 지칭된다.
본 명세서에서 설명하는 실시형태들의 부분을 형성하는 동작들 중 임의의 동작은 유용한 머신 동작들이다. 본 명세서에서 설명되는, 실시형태들은, 또한 이들 동작들을 수행하는 디바이스 또는 장치에 관한 것이다. 본 명세서에서 설명되는 시스템들 및 방법들은, 요구된 목적들을 위해 특별히 구성될 수 있거나 또는 컴퓨터에 저장된 컴퓨터 프로그램에 의해 선택적으로 활성화되거나 또는 구성되는 범용 컴퓨터일 수도 있다. 특히, 다양한 범용 머신들이 본 명세서에서의 교시들에 따라서 작성된 컴퓨터 프로그램들과 함께 사용될 수도 있거나, 또는 요구된 동작들을 수행하기 위해 보다 특수화된 장치를 구성하는 것이 더욱 편리할 수도 있다.
어떤 실시형태들은 또한 컴퓨터 판독가능 매체 상에 컴퓨터 판독가능 코드로서 구현될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 데이터를 저장할 수 있는 임의의 데이터 저장 디바이스이며, 이후 컴퓨터 시스템에 의해 판독될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체의 예들은 하드 드라이브들, NAS (network attached storage), 판독 전용 메모리, 랜덤-액세스 메모리, CD-ROM들, CD-R들, CD-RW들, 자기 테이프들, 및 다른 광학적, 플래시 메모리 및 비-광학적 데이터 저장 디바이스들을 포함한다. 컴퓨터 판독가능 매체는 또한 컴퓨터 판독가능 코드가 분산된 방식으로 저장 및 실행되도록 네트워크 커플링된 컴퓨터 시스템들 상에 걸쳐서 분산될 수 있다.
선택된 실시형태들의 설명
실시형태 1. 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템으로서, 미세유체 디바이스를 고정할 수 있는 미세유체 디바이스 홀더로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결된 복수의 챔버들을 포함하며, 복수의 챔버들의 각각은 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 수용할 수 있는, 상기 미세유체 디바이스 홀더, 및 미세유체 디바이스의 복수의 챔버들 및 유동 영역의 하나 이상의 분석시험 이미지들을 캡쳐하도록 구성된 이미징 엘리먼트를 포함하는 이미지 획득 유닛; 및 각각의 캡쳐된 분석시험 이미지를 수신하고 분석시험 이미지에 묘사된 각각의 챔버에 대한 관심 영역을 정의하도록 구성된 관심 영역 결정 엔진으로서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 챔버 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함하는, 상기 관심 영역 결정 엔진, 및 각각의 챔버의 관심 영역 내 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성된 스코어링 엔진을 포함하는, 이미지 획득 유닛에 통신가능하게 접속된 이미지 프로세싱 유닛을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 2. 실시형태 1 의 시스템에 있어서, 배경 잡음에 의해 초래되거나 및/또는 분석시험 이미지 캡쳐 동안 도입되는 이미지 왜곡들에 대해 적어도 각각의 챔버의 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하도록 구성된 교정 엔진을 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 3. 실시형태 1 또는 2 의 시스템에 있어서, 이미징 엘리먼트는 하나 이상의 대응하는 배경 이미지들 및 하나 이상의 대응하는 신호 참조 이미지들을 캡쳐하도록 더 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 4. 실시형태 3 의 시스템에 있어서, 교정 엔진은 분석시험 이미지로부터 대응하는 배경 이미지를 감산함으로써 이미지 왜곡들에 대해 적어도 각각의 챔버의 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하도록 구성되며; 및/또는 교정 엔진은 대응하는 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 이미지 왜곡들에 대해 적어도 각각의 챔버의 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 5. 실시형태들 2-4 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 스코어링 엔진은 각각의 챔버의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하여 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 6. 실시형태 5 의 시스템에 있어서, 스코어링 엔진은 각각의 챔버의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 부분에 걸쳐서 선형 회귀 분석을 광도 값들에 적용하여 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 7. 실시형태 5 의 시스템에 있어서, 스코어링 엔진은 각각의 챔버의 정규화된 관심 영역의 부분에 걸쳐서 광도 값들을 통합하여 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 8. 실시형태들 1 내지 7 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 이미지 획득 유닛 및 이미지 프로세싱 유닛은 별개로 배향되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 9. 실시형태들 1 내지 7 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 이미지 획득 유닛 및 이미지 프로세싱 유닛은 단일 유닛으로 통합되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 10. 실시형태들 1 내지 9 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 관심 영역은 이미지 프로세싱 유닛에 의해 자동적으로 정의되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 11. 실시형태들 1 내지 10 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 미세유체 디바이스는 생물학적 마이크로-객체들에 의해 발생된 분석물에 결합하며 검출가능한 라벨을 포함하는 결합제의 유동을 수신하도록 구성되며, 스코어링 엔진은 분석시험 이미지로부터 결정되는 바와 같이, 결합제의 검출가능한 라벨에 의해 방출되는 광의 양에 기초하여, 각각의 챔버에서의 분석물 양을 결정하도록 구성되는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 시스템.
실시형태 12. 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법으로서, 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결된 복수의 챔버들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 단계로서, 이미징 데이터는 분석물 분석시험 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함하는, 상기 수신하는 단계; 각각의 챔버에 대한 관심 영역을 정의하는 단계로서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하고, 그리고 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 챔버 내 이미지 영역을 포함하는, 상기 정의하는 단계; 및 각각의 챔버에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 13. 실시형태 12 의 방법에 있어서, 이미징 데이터는 생물학적 마이크로-객체들에 의해 발생된 분석물에 결합하는 리포터 분자로부터 방출된 광으로부터 결정된 광 방출 데이터를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 14. 실시형태 12 또는 13 의 방법에 있어서, 배경 잡음 이미지에서 캡쳐된 배경 잡음을 감산함으로써 분석물 분석시험 이미지에서 적어도 챔버들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계; 및/또는 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 분석물 분석시험 이미지에서 적어도 챔버들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 15. 실시형태들 14 의 방법에 있어서, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 챔버에 대한 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 16. 실시형태들 14 의 방법에 있어서, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 챔버의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분에 걸쳐서 선형 회귀 분석을 광 방출 데이터에 적용하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 17. 실시형태들 14 의 방법에 있어서, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 챔버의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분에 걸쳐서 광 방출 데이터를 통합하는 단계를 더 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 18. 실시형태들 12 내지 17 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법.
실시형태 19. 컴퓨터로 하여금 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 이미지 프로세싱 방법을 수행하게 하는 프로그램이 저장되는 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 방법은 유동 영역 및 유동 영역에 유체 연결된 복수의 챔버들을 포함하는 미세유체 디바이스의 이미징 데이터를 수신하는 단계로서, 이미징 데이터는 분석물 분석시험 이미지, 및 배경 잡음 이미지 및 신호 참조 이미지 중 하나 또는 양자를 포함하는, 상기 수신하는 단계; 각각의 챔버에 대한 관심 영역을 정의하는 단계로서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하고, 그리고 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는, 챔버 내 이미지 영역을 포함하는, 상기 정의하는 단계; 및 각각의 챔버에 대한 관심 영역의 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석함으로써 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계를 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 20. 실시형태 19 의 방법에 있어서, 이미징 데이터는 생물학적 마이크로-객체들에 의해 발생된 분석물에 결합하는 리포터 분자로부터 방출된 광으로터 결정된 광 방출 데이터를 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 21. 실시형태 19 또는 20 의 방법에 있어서, 배경 잡음 이미지에서 캡쳐된 배경 잡음을 감산함으로써 분석물 분석시험 이미지에서 적어도 챔버들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계; 및/또는 신호 참조 이미지에서 캡쳐된 이미지 획득 왜곡들을 고려함으로써 분석물 분석시험 이미지에서 적어도 챔버들의 각각에 대한 관심 영역의 이미지 영역을 정규화하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 22. 실시형태들 21 의 방법에 있어서, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 챔버에 대한 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 23. 실시형태들 21 의 방법에 있어서, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 챔버의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분으로부터의 광 방출 데이터에 선형 회귀 분석을 적용하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 24. 실시형태들 21 의 방법에 있어서, 각각의 챔버에서의 분석물의 양을 표시하는 스코어들을 결정하는 단계는 각각의 챔버의 관심 영역의 정규화된 이미지 영역의 적어도 일부분에 걸쳐서 광 방출 데이터를 통합하는 단계를 더 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 25. 실시형태들 19 내지 24 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체.
실시형태 26. 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법으로서, 그 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 분석물을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제1 기간 동안 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 28. 실시형태 27에 있어서, 리포터 분자의 검출가능한 라벨은 형광 라벨이고, 여기서 상기 리포터 분자를 검출하는 것은 관심 영역 내의 리포터 분자의 형광 라벨로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다.
실시형태 29. 실시형태 26 또는 27 에 있어서, 제2 기간 동안, 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 일부를 리포터 분자의 형광 라벨을 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 30. 실시형태 29에 있어서, 제2 기간 후에 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 제3 기간 동안 2회 이상 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 및/또는 관심 영역 내의 형광 방출이 제3 기간 동안 실질적으로 지속적으로 수행되는 것을 검출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 31. 실시형태 30에 있어서, 제4 기간 동안 전자기 방사선에 대한 챔버의 적어도 일부를 포함하지만 유동 영역은 포함하지 않는 미세유체 디바이스의 일부를 노출시키는 단계로서, 여기서 제4 기간은 챔버의 일부에 존재하는 임의의 리포터 분자의 형광 라벨을 광표백하기에 충분한, 상기 미세유체 디바이스의 일부를 노출시키는 단계; 및 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 32. 실시형태 31에 있어서, 제4 기간 후에 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 제5 기간 동안 2회 이상 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 및/또는 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출이 제5 기간 동안 실질적으로 지속적으로 수행되는 것을 검출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 33. 실시형태 31에 있어서, 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출을 검출하는 것은 상기 제4 기간 동안 노출하는 것 후 (예를 들어, 광표백되지 않은 형광 라벨을 포함하는 리포터 분자가 상기 챔버 내로 확산된 후) 약 5초 내지 약 20초 후에 발생한다.
실시형태 34. 실시형태 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 챔버의 광표백된 부분은 관심 영역에 의해 구성된다.
실시형태 35. 실시형태 31 내지 34 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제4 기간 동안 노출시키는 단계 및 챔버의 광표백된 부분에서 형광 방출을 검출하는 단계가 1회 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5회 이상) 반복된다.
실시형태 36. 실시형태 27 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가지며, 격리 영역 및 연결 영역은 격리 영역에서의 유체 배지의 성분들이 유동 영역에서의 유체 배지의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성된다.
실시형태 37. 실시형태 27 내지 36 중 어느 한 실시형태에 있어서, 생물학적 마이크로-객체는 생물학적 세포이고, 방법은 챔버 내의 생물학적 세포를 생물학적 세포의 클론 개체군으로 확장하는 것을 추가로 포함한다.
실시형태 38. 실시형태 27 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입시킨 후 그리고 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생한다.
실시형태 39. 실시형태 38 의 방법에 있어서, 배양 배지는 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함하는, 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의해 발생되는 (및/또는 분비되는) 분석물의 레벨을 평가하는 방법.
실시형태 40. 실시형태 27 내지 39 중 어느 하나에서, 제 1 기간은 약 30 분 내지 약 60 분이다.
실시형태 41. 실시형태들 27 내지 40 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 임의의 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 챔버로부터 확산시키는 단계로서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 챔버로부터 확산되는 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 상기 확산시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 42. 실시형태 41 의 방법에 있어서, 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 추가적인 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 3 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 43. 실시형태 42 의 방법에 있어서, 추가적인 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 복합체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택된다.
실시형태 44. 실시형태 42 의 방법에 있어서, 추가적인 기간은 약 20 분 내지 약 50 분이다.
실시형태 45. 실시형태들 27 내지 44 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함한다.
실시형태 46. 실시형태들 27 내지 45 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다.
실시형태 47. 실시형태 46 의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 48. 실시형태 46 또는 47 의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입하기 이전의 시간에 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 49. 실시형태들 46 내지 48 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화된다.
실시형태 50. 실시형태들 27 내지 49 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 51. 실시형태들 27 내지 50 중 어느 하나의 방법에 있어서, 챔버에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 52. 실시형태 51 의 방법에 있어서, 분비 스코어는 실시형태들 12 내지 25 중 어느 하나의 방법에 따라서 결정된다.
실시형태 53. 실시형태들 27 내지 52 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 갖는다.
실시형태 54. 실시형태들 27 내지 52 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 더 큰 분자량을 갖는다.
실시형태 55. 실시형태들 27 내지 52 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 더 큰 분자량을 갖는다.
실시형태 56. 실시형태들 27 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
실시형태 57. 실시형태들 27 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함한다.
실시형태 58. 실시형태 57 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들:1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함한다.
실시형태 59. 실시형태 57 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다.
실시형태 60. 실시형태들 27 내지 55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함한다.
실시형태 61. 실시형태들 27 내지 60 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질, 사카라이드, 핵산, 단백질, 사카라이드, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함한다.
실시형태 62. 실시형태들 27 내지 61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체이다.
실시형태 63. 실시형태들 27 내지 61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 옵션적으로 글리코실화된 단백질인, 항체 이외의 단백질이다.
실시형태 64. 실시형태들 27 내지 63 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다.
실시형태 65. 실시형태 64 의 방법에 있어서, 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들의 챔버들에 대한 분비의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 66. 실시형태 64 의 방법에 있어서, 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버의 분비 스코어들을 비교하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 67. 실시형태들 64 내지 66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 2개의 챔버들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 68. 실시형태 67 의 방법에 있어서, 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스로부터 추가로 배출된다.
실시형태 69. 실시형태 68 의 방법에 있어서, 선택된 챔버들은 개별적으로 배출된다.
실시형태 70. 실시형태들 27 내지 69 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 챔버 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
실시형태 71. 실시형태 70 의 방법에 있어서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어진다.
실시형태 72. 제 28 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자동화된다.
실시형태 73. 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법으로서, 그 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 분석물을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제1 기간 동안 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 74. 실시형태 73 의 방법에 있어서, 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가지며, 격리 영역 및 연결 영역은 격리 영역에서의 유체 배지의 성분들이 유동 영역에서의 유체 배지의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성된다.
실시형태 75. 실시형태 73 또는 74 에 있어서, 생물학적 마이크로-객체는 생물학적 세포이고, 방법은 챔버 내의 생물학적 세포를 생물학적 세포의 클론 개체군으로 확장하는 것을 추가로 포함한다.
실시형태 76. 실시형태 73 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입시킨 후 그리고 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생한다.
실시형태 77. 실시형태 76 의 방법에 있어서, 배양 배지는 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태 78. 실시형태들 73 내지 77 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 2 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 79. 실시형태 78 의 방법에 있어서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분이다.
실시형태 80. 실시형태들 73 내지 79 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함한다.
실시형태 81. 실시형태 80에 있어서, 리포터 분자의 검출가능한 라벨은 형광 라벨이고, 여기서 상기 리포터 분자를 검출하는 것은 관심 영역 내의 리포터 분자의 형광 라벨로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다.
실시형태 82. 실시형태 81 에 있어서, 제2 기간 동안, 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 일부를 리포터 분자의 형광 라벨을 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 83. 실시형태 82에 있어서, 제2 기간 후에 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 제3 기간 동안 2회 이상 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 및/또는 관심 영역 내의 형광 방출이 제3 기간 동안 실질적으로 지속적으로 수행되는 것을 검출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 84. 실시형태 83에 있어서, 제4 기간 동안 전자기 방사선에 대한 챔버의 적어도 일부를 포함하지만 유동 영역은 포함하지 않는 미세유체 디바이스의 일부를 노출시키는 단계로서, 여기서 제4 기간은 선택적으로 관심 영역에 의해 이루어지는 챔버의 일부에 존재하는 임의의 리포터 분자의 형광 라벨을 광표백하기에 충분한, 상기 미세유체 디바이스의 일부를 노출시키는 단계; 및 챔버의 광표백된 부분 내에서 형광 방출을 검출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 85. 실시형태 84에 있어서, 제4 기간 후에 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 제5 기간 동안 2회 이상 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 및/또는 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출이 제5 기간 동안 실질적으로 지속적으로 수행되는 것을 검출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 86. 실시형태 85에 있어서, 챔버의 광표백된 부분 내의 형광 방출을 검출하는 것은 상기 제4 기간 동안 노출하는 것 후 (예를 들어, 광표백되지 않은 형광 라벨을 포함하는 리포터 분자가 상기 챔버 내로 확산된 후) 약 5초 내지 약 20초 후에 발생한다.
실시형태 87. 실시형태 84 내지 86 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제4 기간 동안 노출시키는 단계 및 챔버의 광표백된 부분에서 형광 방출을 검출하는 단계가 1회 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5회 이상) 반복된다.
실시형태 88. 실시형태들 73 내지 87 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 임의의 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 도입하는 단계; 및 비결합된 리포터 분자들의 적어도 일부분을 챔버로부터 확산시키는 단계로서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것은 챔버로부터 확산되는 비결합된 리포터 분자들의 양이 챔버로부터 확산되는 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생하는, 상기 확산시키는 단계를 더 포함한다.
실시형태 89. 실시형태 77 의 방법에 있어서, 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 추가적인 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 3 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 90. 실시형태 89 의 방법에 있어서, 추가적인 기간은 비결합된 리포터 분자들 및 RMSA 복합체들에 대한 확산 프로파일들의 모델링에 기초하여 선택된다.
실시형태 91. 실시형태 89 의 방법에 있어서, 추가적인 기간은 약 20 분 내지 약 50 분이다.
실시형태 92. 실시형태들 73 내지 91 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함한다.
실시형태 93. 실시형태들 73 내지 92 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다.
실시형태 94. 실시형태 93 의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 95. 실시형태 93 또는 94 의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입하기 이전의 시간에 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 96. 실시형태들 93 내지 95 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화된다.
실시형태 97. 실시형태들 73 내지 96 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 98. 실시형태들 73 내지 97 중 어느 하나의 방법에 있어서, 챔버에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 99. 실시형태 98 의 방법에 있어서, 분비 스코어는 실시형태들 12 내지 25 중 어느 하나의 방법에 따라서 결정된다.
실시형태 100. 실시형태들 73 내지 99 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 갖는다.
실시형태 101. 실시형태들 73 내지 99 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 분석물은 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 더 큰 분자량을 갖는다.
실시형태 102. 실시형태들 73 내지 99 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 분석물은 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 더 큰 분자량을 갖는다.
실시형태 103. 실시형태들 73 내지 102 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분비된 분석물의 외인성 태그는 펩티드 시퀀스를 포함한다.
실시형태 104. 실시형태 103 에 있어서, 펩티드 시퀀스는 FLAG 에피토프, 폴리히스티딘 시퀀스, 헤마글루티닌(HA) 에피토프, 또는 Myc 에피토프를 포함한다.
실시형태 105. 실시형태 103 에 있어서, 펩티드 시퀀스는 아미노산 시퀀스 (N-말단에서 C-말단까지) DYKDDDDK(SEQ ID NO: 12) 을 포함한다.
실시형태 106. 실시형태 103 에 있어서, 펩티드 시퀀스는 아미노산 시퀀스 (N-말단에서 C-말단까지) HHHHHH (SEQ ID NO: 13) 을 포함한다.
실시형태 107. 실시형태들 103 내지 106 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질을 포함한다.
실시형태 108. 실시형태 107 에 있어서, 결합 성분의 단백질은 항체이다.
실시형태 109. 실시형태 108 에 있어서, 항체는 FLAG 에피토프를 인식한다.
실시형태 110. 실시형태 106 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 킬레이트제를 포함한다.
실시형태 111. 제 110 항에 있어서, 킬레이트제는 니트릴로트리아세트산 (NTA) 을 포함한다.
실시형태 112. 실시형태 73 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 단백질을 포함한다.
실시형태 113. 실시형태들 112 에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체이다.
실시형태 114. 실시형태들 112 에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 옵션적으로 글리코실화된 단백질인, 항체 이외의 단백질이다.
실시형태 115. 실시형태들 73 내지 114 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다.
실시형태 116. 실시형태 115 의 방법에 있어서, 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들의 챔버들에 대한 분비의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 117. 실시형태 115 의 방법에 있어서, 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버의 분비 스코어들을 비교하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 118. 실시형태들 115 내지 117 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 2개의 챔버들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 119. 실시형태 118 의 방법에 있어서, 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스로부터 추가로 배출된다.
실시형태 120. 실시형태 119 의 방법에 있어서, 선택된 챔버들은 개별적으로 배출된다.
실시형태 121. 실시형태들 73 내지 120 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 챔버 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
실시형태 122. 실시형태 121 의 방법에 있어서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어진다.
실시형태 123. 제 73 항 내지 제 122 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자동화된다.
실시형태 124. 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법으로서, 그 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 분석물을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제1 기간 동안 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 리포터 복합체들을 포함하며, 각각의 리포터 복합체는 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 제1 복합체 성분 및 제1 복합체에 결합된 제2 복합체 성분을 포함하고, 제2 복합체 성분은 검출가능한 라벨을 포함하고, 분비된 분석물에 대한 제1 복합체 성분의 결합은 제1 복합체 성분에 대한 제2 복합체 성분의 결합을 감소 또는 제거하는, 상기 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 복합체들의 부분으로 하여금 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 제1 복합체 성분: 분비된 분석물 (FCCSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 제2 복합체 성분들을 검출하는 단계로서, 관심 영역은 챔버의 적어도 일부분을 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 125. 실시형태 124에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함한다.
실시형태 126. 실시형태 124에 있어서, 제2 복합체 성분의 검출가능한 라벨은 형광 라벨이고, 여기서 상기 제2 복합체 성분을 검출하는 것은 관심 영역 내의 제2 복합체 성분의 형광 라벨로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다.
실시형태 127. 실시형태 124 또는 126 에 있어서, 제2 기간 동안, 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 일부를 제2 복합체 성분의 형광 라벨을 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 128. 실시형태 127에 있어서, 제2 기간 후에 관심 영역 내의 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 제3 기간 동안 2회 이상 형광 방출이 수행되는 것을 검출하는 단계, 및/또는 형광 방출이 제3 기간 동안 실질적으로 지속적으로 수행되는 것을 검출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 129. 실시형태 124 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 챔버는 격리 영역 및 격리 영역을 유동 영역에 유체 연결하는 연결 영역을 가지며, 격리 영역 및 연결 영역은 격리 영역에서의 유체 배지의 성분들이 유동 영역에서의 유체 배지의 성분들과 실질적으로 단지 확산에 의해서만 교환되도록 구성된다.
실시형태 130. 실시형태 124 내지 129 중 어느 한 실시형태에 있어서, 생물학적 마이크로-객체는 생물학적 세포이고, 방법은 챔버 내의 생물학적 세포를 생물학적 세포의 클론 개체군으로 확장하는 것을 추가로 포함한다.
실시형태 131. 실시형태 124 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입시킨 후 그리고 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생한다.
실시형태 132. 실시형태 131 의 방법에 있어서, 배양 배지는 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태 133. 실시형태들 124 내지 132 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 2 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 134. 실시형태 133 의 방법에 있어서, 제 1 시간 기간은 약 30 분 내지 약 60 분이다.
실시형태 135. 실시형태들 124 내지 134 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 챔버 내로부터 유동 영역 밖으로 확산 축을 따라서 정렬된 챔버의 적어도 일부분을 포함한다.
실시형태 136. 실시형태들 124 내지 135 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 제2 복합체 성분들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 제2 복합체 성분들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다.
실시형태 137. 실시형태 136 의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 제2 복합체 성분들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 138. 실시형태 136 또는 137 의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입하기 이전의 시간에 관심 영역 내 배경 신호의 강도를 측정하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 139. 실시형태들 136 내지 138 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화된다.
실시형태 140. 실시형태들 124 내지 139 중 어느 하나의 방법에 있어서, 분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 141. 실시형태들 124 내지 139 중 어느 하나의 방법에 있어서, 챔버에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 142. 실시형태 141 에 있어서, 분비물 스코어는 실시형태 12 내지 25 중 어느 하나의 방법에 따라(즉, 선택된 실시형태의 인용으로부터) 결정된다.
실시형태 143. 실시형태 124 내지 142 중 어느 하나의 방법으로서, 분비된 분석물은 5kD 미만의 분자량을 갖는다.
실시형태 144. 실시형태 124 내지 142 중 어느 하나의 방법으로서, 분비된 분석물은 2kD 미만의 분자량을 갖는다.
실시형태 145. 실시형태 124 내지 142 중 어느 하나의 방법으로서, 분비된 분석물은 1kD 미만의 분자량을 갖는다.
실시형태 146. 실시형태들 124 내지 145 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 복합체의 제1 복합체 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
실시형태 147. 실시형태들 124 내지 145 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 복합체의 제1 복합체 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함한다.
실시형태 148. 실시형태 124 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 리포터 복합체의 제2 복합체 성분은 SEQ ID 번호들:1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함한다.
실시형태 149. 실시형태 124 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 리포터 복합체의 제2 복합체 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다.
실시형태 150. 실시형태들 124 내지 147 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 제2 복합체 성분은 압타머를 포함한다.
실시형태 151. 실시형태 124 내지 147 어느 하나에 있어서, 리포터 복합체의 제2 복합체 성분은 분비된 분석물의 전부 또는 일부(예를 들어, 분비된 분석물의 제1 복합체 성분에 대한 결합을 위해 필요한 부분)를 포함한다.
실시형태 152. 실시형태 124 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 분비된 분석물이 제1 복합 성분에 대한 제2 복합 성분의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
실시형태 153. 실시형태 124 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 분비된 분석물이 제1 복합 성분에 대한 제2 복합 성분의 결합을 비경쟁적으로 억제한다.
실시형태 154. 실시형태 153 에 있어서, 분비된 분석물이 알로스테릭 메커니즘에 의해 제1 복합 성분에 대한 제2 복합 성분의 결합을 억제한다.
실시형태 155. 실시형태 124 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 펩티드, 당류, 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오시드를 포함한다.
실시형태 156. 실시형태들 124 내지 154 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 대사물질 또는 단백질, 당류, 또는 핵산 이외의 유기 분자이다.
실시형태 157. 실시형태들 124 내지 156 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다.
실시형태 158. 실시형태 157 의 방법에 있어서, 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들의 챔버들에 대한 분비의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 159. 실시형태 157 의 방법에 있어서, 복수의 챔버들 중 하나 보다 많은 챔버의 분비 스코어들을 비교하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 160. 실시형태들 157 내지 159 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 2개의 챔버들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 161. 실시형태 160 의 방법에 있어서, 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스로부터 추가로 배출된다.
실시형태 162. 실시형태 161 의 방법에 있어서, 선택된 챔버들은 개별적으로 배출된다.
실시형태 163. 실시형태들 124 내지 162 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 챔버 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
실시형태 164. 실시형태 163 의 방법에 있어서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어진다.
실시형태 165. 제 124 항 내지 제 164 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자동화된다.
실시형태 166. 클론주 개발의 방법으로서, 그 방법은 실시형태들 66, 117, 및 159 중 임의의 하나의 방법을 수행하는 단계; 복수의 챔버로부터 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각 챔버는 그 안에 포함된 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자라는 것을 나타내는 스코어를 갖는, 상기 챔버들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계; 대응하는 반응 용기에서 선택된 챔버들 세트의 각 챔버로부터 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 확장하는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비되는 분석물의 레벨을 결정하여, 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비물의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다.
실시형태 167. 실시형태들 166 에 있어서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 챔버 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
실시형태 168. 실시형태 167 의 방법에 있어서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어진다.
실시형태 169. 제 166 항 내지 제 168 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자동화된다.
실시형태 170. 생물학적 마이크로-객체 또는 이로부터 생성된 생물학적 마이크로-객체의 개체군에 의해 분비되는 분석물의 레벨의 평가를 위한 키트로서, 그 키트는 유동 영역 및 복수의 챔버를 갖는 인클로저를 포함하는 미세유체 디바이스로서, 여기서 각각 챔버는 유동 영역에 유체적으로 연결되고, 유동 영역 및 챔버는 유체 배지를 포함하도록 구성되는, 상기 미세유체 디바이스; 및 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 제1 복합체 성분 및 제1 복합체 성분에 결합하도록 구성되고 검출가능한 라벨을 포함하는 제2 복합체 성분을 포함하는 리포터 복합체로서, 여기서 분비된 분석물의 제1 복합체 성분에 대한 결합은 제2 복합체 성분의 제1 복합체 성분에 대한 결합을 억제 또는 방지하는, 상기 리포터 복합체를 포함한다.
실시형태 171. 실시형태 170 에 있어서, 상기 리포터 복합체의 상기 제1 복합체 성분은 적어도 하나의 아미노 산 및/또는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
실시형태 172. 실시형태 170 의 키트에 있어서, 리포터 복합체의 제1 복합체 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함한다.
실시형태 173. 실시형태 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 리포터 복합체의 제2 복합체 성분은 SEQ ID 번호들:1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함한다.
실시형태 174. 실시형태 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 리포터 복합체의 제2 복합체 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다.
실시형태 175. 실시형태들 170 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 리포터 분자의 제2 복합체 성분은 압타머를 포함한다.
실시형태 176. 실시형태 170 내지 172 어느 하나에 있어서, 리포터 복합체의 제2 복합체 성분은 분비된 분석물의 전부 또는 일부(예를 들어, 분비된 분석물의 제1 복합체 성분에 대한 결합을 위해 필요한 부분)를 포함한다.
실시형태 177. 실시형태 170 내지 176 중 어느 하나에 있어서, 분비된 분석물이 제1 복합 성분에 대한 제2 복합 성분의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
실시형태 178. 실시형태 170 내지 176 중 어느 하나에 있어서, 분비된 분석물이 제1 복합 성분에 대한 제2 복합 성분의 결합을 비경쟁적으로 억제한다.
실시형태 179. 실시형태 178 에 있어서, 분비된 분석물이 알로스테릭 메커니즘에 의해 제1 복합 성분에 대한 제2 복합 성분의 결합을 억제한다.
실시형태 180. 컴퓨터로 하여금, 생물학적 마이크로-객체에 의해 발생되는 분석물의 양을 결정하는 방법을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 방법은 청구항 45 내지 47, 96 내지 98, 및 138 내지 140 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 181. 실시형태 180 에 있어서, 상기 시스템은 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나의 시스템이다.
실시형태 182. 컴퓨터로 하여금, 클론주 개발을 위한 방법 중 적어도 일부분을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체가 제공되며, 상기 방법은 실시형태들 166 내지 169 중 임의의 하나의 방법이며, 상기 시스템은 선택된 챔버들의 세트의 각각의 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계를 포함하여 배출하는 단계까지, 적어도 위의 단계들을 수행한다.
실시형태 183. 실시형태 182 에 있어서, 상기 시스템은 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나의 시스템이다.
실시형태 184. 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군에 의한 분석물의 분비의 레벨을 평가하는 방법으로서, 그 방법은, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 챔버는 유동 영역에 유체 연결되며, 챔버는 제 1 유체 배지를 포함하는, 상기 미세유체 디바이스의 챔버로 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 분석물을 챔버 내 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제1 기간 동안 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버로 확산하게 하여 그 안에 분비된 분석물에 결합하게 하고, 이에 의해 복수의 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 185. 실시형태 184 에 있어서, 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계로서, 제3 유체 배지는 임의의 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 제3 유체 배지를 유동 영역 내로 도입하는 단계; 및 비결합 리포터 분자들의 적어도 일부가 챔버 외부로 확산되도록 하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 186. 실시형태 185 에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 것이 챔버 밖으로 확산된 비결합 리포터 분자들의 양이 챔버 밖으로 확산된 RMSA 복합체들의 양보다 적어도 2배 크도록 선택된 시간에서 발생한다.
실시형태 187. 실시형태들 185 내지 186 중 어느 하나의 방법에 있어서, 제 3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계는 제 1 시간 기간 동안 유동 영역을 통해서 제 3 유체 배지를 유동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 188. 실시형태 185-187 중 어느 하나에서, 제 1 기간은 약 30 분 내지 약 60 분이다.
실시형태 189. 실시형태 187 또는 188 중 어느 하나에 있어서, 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치한 리포터 분자를 검출하는 단계는 제2 기간 후; 제2 기간 동안 두 번 이상; 또는 제2 기간 동안 실질적으로 연속적으로 수행된다.
실시형태 190. 실시형태들 184-189 중 어느 하나에 있어서, 분석물의 분비의 레벨을 정량화하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 191. 실시형태들 184 내지 190 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 분석물은 항체 또는, 옵션적으로, 글리코실화된 항체이다.
실시형태 192. 실시형태들 184 내지 191 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 항체 또는 당화 항체의 Fc 영역에 결합한다.
실시형태 193. 실시형태들 184-192 중 어느 하나에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분이 항체 중쇄(예를 들어, 중쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프)에 결합한다.
실시형태 194. 실시형태들 184-193 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 마이크로-객체는 생물학적 세포이다.
실시형태 195. 실시형태들 184-194 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
실시형태 196. 실시형태들 184-195 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
실시형태 197. 실시형태들 184-196 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 압타머를 포함한다.
실시형태 198. 실시형태들 184-197 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 펩티드 또는 단백질을 포함한다.
실시형태 199. 실시형태 198 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 SEQ ID 번호들:1 내지 10 중 어느 하나의 시퀀스를 가지는 펩티드를 포함한다.
실시형태 200. 실시형태 198 의 방법에 있어서, 리포터 분자의 결합 성분은 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 의 IgG-결합 단편을 포함한다.
실시형태 201. 실시형태들 184-200 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 라벨은 가시광, 발광, 인광, 또는 형광 라벨을 포함한다.
실시형태 202. 실시형태 201에 있어서, 리포터 분자의 검출가능한 라벨은 형광 라벨이고, 여기서 상기 리포터 분자를 검출하는 것은 관심 영역 내의 리포터 분자의 형광 라벨로부터 형광 방출을 검출하는 것을 포함한다.
실시형태 203. 실시형태 202 에 있어서, 제3기간 동안, 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 일부를 리포터 분자의 형광 라벨을 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 전자기 방사선에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 204. 실시형태 203 에 있어서, 제4 기간 동안, 유동 영역이 아닌 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스의 부분을 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 제4 기간은 챔버 내에 존재하는 임의의 리포터 분자들의 형광 라벨을 광표백하기에 충분하다.
실시형태 205. 실시형태 204 에 있어서, 제4 기간 동안의 노출하는 단계는 상기 관심 영역 내의 형광 방출을 검출하는 단계 전에 수행된다.
실시형태 206. 실시형태 204 또는 205 에 있어서, 관심 영역 내의 형광 방출을 검출하는 것은 상기 제4 기간 동안 노출하는 것 후 (예를 들어, 광표백되지 않은 형광 라벨을 포함하는 리포터 분자가 상기 챔버 내로 확산된 후) 약 5초 내지 약 20초 후에 발생한다.
실시형태 207. 실시형태 204-206 중 어느 하나에 있어서, 제4 기간 동안 노출시키는 단계 및 형광 방출을 검출하는 단계가 1회 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5회 이상) 반복된다.
실시형태 208. 실시형태 184-206 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지로 유동 영역을 관류시키는 단계를 더 포함하며, 관류시키는 것은 생물학적 마이크로-객체를 챔버로 도입시킨 후 그리고 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하기 전에 발생한다.
실시형태 209. 실시형태 208 에 있어서, 배양 배지는 가용성 피더 세포 성분, 정의된 용존 산소 성분, 정의된 pH 성분, 소진된 성장 배지 성분, 및/또는 가용성 자극 성분 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태 210. 실시형태들 184-209 중 어느 하나의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 관심 영역으로부터 오는 검출가능한 신호의 강도를 측정하는 단계를 포함하며, 검출가능한 신호의 적어도 일부는 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들의 검출가능한 라벨로부터 방출된다.
실시형태 211. 실시형태 210 의 방법에 있어서, 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 검출가능한 신호의 측정된 강도로부터 배경 신호의 강도를 감산함으로써 배경-감산된 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 212. 실시형태 211 에 있어서, 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 챔버에 도입하기 전에, 복수의 리포터 분자를 포함하는 제4 유체 배지를 유동 영역에 도입하고, 리포터 분자가 유동 영역과 챔버 사이에서 평형에 도달하도록 허용함으로써, 배경 신호가 결정된다.
실시형태 213. 실시형태들 184-212 중 어느 하나의 방법에 있어서, 검출가능한 신호의 측정된 강도 또는 배경-감산된 신호 강도는 챔버 내에서 관측된 세포들의 수에 대해 정규화된다.
실시형태 214. 실시형태들 184-213 중 어느 하나의 방법에 있어서, 챔버에 대한 분비 스코어를 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 215. 실시형태 214 에 있어서, 분비물 스코어는 실시형태 12 내지 25 중 어느 하나의 방법에 따라(즉, 선택된 실시형태의 인용으로부터) 결정된다.
실시형태 216. 실시형태들 184-215 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미세유체 디바이스의 챔버 내로 생물학적 마이크로-객체를 도입하는 단계는 생물학적 마이크로-객체를 선택하는 단계 및 선택된 생물학적 마이크로-객체를 챔버 내로 선택적으로 이동시키는 단계를 포함한다.
실시형태 217. 실시형태 216 에 있어서, 선택은 양성 선택이다(예를 들어, 생물학적 마이크로-객체는 건강한 세포 또는 세포의 게놈에서 발현 구성의 성공적인/표적화 통합을 나타내는 마커로 염색되고, 양성 염색되는 생물학적 마이크로-객체가 선택됨).
실시형태 218. 실시형태 216 에 있어서, 선택이 음성 선택이다(예를 들어, 생물학적 마이크로-객체는 건강하지 않은 세포 또는 세포의 게놈에서 발현 구성의 성공적이지 않은 통합을 나타내는 마커로 염색되고, 염색되지 않은 생물학적 마이크로-객체가 선택됨).
실시형태 219. 실시형태 218 에 있어서, 상기 생물학적 마이크로-객체들은 아넥신 v 에 대해 염색된다.
실시형태 220. 실시형태들 184-219 중 어느 하나의 방법에 있어서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들 각각으로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행된다.
실시형태 221. 실시형태들 220 에 있어서, 적어도 2개의 챔버들 중 하나 이상을 선택하는 단계; 및 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 배출하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 222. 실시형태 221 에 있어서, 선택된 챔버들의 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스로부터 추가로 배출된다.
실시형태 223. 실시형태 222 의 방법에 있어서, 선택된 챔버들은 개별적으로 배출된다.
실시형태 224. 실시형태 222 또는 223 중 어느 하나에 있어서, 선택된 챔버 각각으로부터의 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체 각각은 클론 생존력을 지원하도록 최적화된 배지로 배출된다.
실시형태 225. 실시형태 184-224 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 자동화된다.
실시형태 226. 클론주 개발의 방법으로서, 그 방법은 실시형태들 184-225 중 임의의 하나의 방법을 수행하는 단계; 복수의 챔버로부터 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각 챔버는 그 안에 포함된 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자라는 것을 나타내는 스코어를 갖는, 상기 챔버들의 세트를 선택하는 단계; 선택된 챔버들의 세트의 각 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계; 대응하는 반응 용기에서 선택된 챔버들 세트의 각 챔버로부터 배출된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체를 확장하는 단계; 및 각각의 대응하는 반응 용기에서 분비되는 분석물의 레벨을 결정하여, 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비물의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다.
실시형태 227. 실시형태 226 에 있어서, 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고 분석물 변동들이 측정될 때 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감하며 챔버와 유동 영역 사이에서 확산 축을 따라서 연장되는 챔버 내 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함한다.
실시형태 228. 실시형태 227 의 방법에 있어서, 관심 영역은 이미지 영역으로 본질적으로 이루어진다.
실시형태 229. 실시형태 226-228 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 자동화된다.
실시형태 230. 컴퓨터로 하여금, 생물학적 마이크로-객체에 의해 생성되는 분석물의 양을 결정하는 방법을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시성 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 방법은 청구항 184-229 중 어느 하나의 방법이다.
실시형태 231. 제 230 항에 있어서, 상기 시스템은 실시형태 1 의 시스템이다.
실시형태 232. 컴퓨터로 하여금, 클론주 개발을 위한 방법 중 적어도 일부분을 수행하도록 시스템에게 지시하게 하는 프로그램이 저장된 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체가 제공되며, 상기 방법은 실시형태 230 또는 231 의 방법이며, 상기 시스템은 선택된 챔버들의 세트의 각각의 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 미세유체 디바이스로부터 배출하는 단계를 포함하여 배출하는 단계까지, 적어도 위의 단계들을 수행한다.
실시형태 233. 제 232 항에 있어서, 상기 시스템은 실시형태 1 의 시스템이다.
실시형태 234. 복수의 생물학적 마이크로-객체들, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군들에 걸친 가용성 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법으로서, 그 방법은, 복수의 생물학적 마이크로-객체를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 복수의 챔버들의 각 챔버는 유동 영역에 유체 연결되고 제1 유체 배지를 포함하며 포함하는, 상기 도입하는 단계; 복수의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군의 각각의 생물학적 마이크로-객체로 하여금 가용성 분석물을 챔버 내의 제 1 유체 배지로 분비하게 하는 단계; 제 2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하며, 그리고, 각각의 가용성 리포터 분자는 분비된 분석물을 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 복수의 가용성 리포터 분자들의 부분으로 하여금 복수의 챔버 내로 확산하게 하여 그 안에 분비된 가용성 분석물에 결합하게 하여, 복수의 가용성 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 리포터 분자를 포함하지 않는 제3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계; 비결합 가용성 리포터 분자가 챔버 밖으로 확산하는 것을 허용하는 단계; 및 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 235. 실시형태 234에 있어서, 챔버가 격리 영역을 포함하고, 격리 영역이 2차 흐름으로부터 격리된다.
실시형태 236. 실시형태 234 또는 235 에 있어서, 상기 챔버는 유동 영역에서의 유체 배지의 직접 유동으로부터 격리된 연결 영역을 포함한다.
실시형태 237. 실시형태 234-236 중 어느 하나에 있어서, 복수의 생물학적 마이크로-객체 중 개개의 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버 중 개개의 챔버에 배치된다.
실시형태 238. 실시형태 234-237 중 어느 하나에 있어서, 가용성 리포터 분자의 농도는 분석물에 대한 가용성 리포터 분자의 KD 의 약 1-10 배이다.
실시형태 239. 실시형태 234-238 중 어느 하나에 있어서, 흐름 영역 내의 제2 유체 배지는 약 0.1-10초의 리프레시 레이트 (refresh rate) 로 리프레시되고, 리프레시 레이트는 유동 영역 내의 유체의 전체 체적을 교체하는 시간의 지속기간이다.
실시형태 240. 실시형태 234-239 중 어느 하나에 있어서, 관심 영역이 챔버의 후크 영역 내에 있다.
실시형태 241. 실시형태 234-240 중 어느 하나에 있어서, 복수의 챔버 각각에 대한 분비의 상대적 레벨 또는 분비 스코어를 획득하는 단계; 및 획득된 분비 스코어에 기초하여 복수의 챔버의 순위를 매기는 단계; 및 상기 순위에 기초하여 복수의 챔버를 순서화하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 242. 실시형태 234-241 중 어느 하나에 있어서, 복수의 리포터 분자는 각각 상이한 라벨을 갖는 적어도 2개의 상이한 리포터 분자를 포함한다.
실시형태 243. 복수의 생물학적 마이크로-객체들, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군들에 의한 가용성 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법으로서, 그 방법은, 제1 유체 배지를 미세유체 디바이스의 복수의 챔버로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버에 유체적으로 연결된 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 제1 유체 배지는 제1 복수의 가용성 리포트 분자들을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 미세유체 디바이스의 이미지를 획득하는 단계; 가용성 리포터 분자들을 포함하지 않는 제2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계; 복수의 챔버들의 서브세트 내에 복수의 생물학적 마이크로-객체들의 서브세트를 도입하는 단계; 복수의 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 가용성 분석물을 챔버 내에서 분비하게 하는 단계; 제3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 제2 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하며, 그리고, 각각의 가용성 리포터 분자는 가용성 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 제2 복수의 가용성 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버 내로 확산하게 하여 그 안에 분비된 가용성 분석물에 결합하게 하여, 복수의 가용성 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 및 미세유체 디바이스 내의 하나 이상의 관심 영역 내에 위치된 가용성 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 244. 실시형태 243에 있어서, 챔버가 격리 영역을 포함하고, 격리 영역이 2차 흐름으로부터 격리된다.
실시형태 245. 실시형태 243 또는 244 에 있어서, 상기 챔버는 유동 영역에서의 유체 배지의 직접 유동으로부터 격리된 연결 영역을 포함한다.
실시형태 246. 실시형태 243-245 중 어느 하나에 있어서, 복수의 생물학적 마이크로-객체 중 개개의 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버 중 개개의 챔버에 배치된다.
실시형태 247. 실시형태 243-246 중 어느 하나에 있어서, 가용성 리포터 분자의 농도는 분석물에 대한 가용성 리포터 분자의 KD 의 약 1-10 배이다.
실시형태 248. 실시형태 243-247 중 어느 하나에 있어서, 흐름 영역 내의 제2 유체 배지는 약 0.1-10초의 리프레시 레이트 (refresh rate) 로 리프레시되고, 리프레시 레이트는 유동 영역 내의 유체의 전체 체적을 교체하는 시간의 지속기간이다.
실시형태 249. 실시형태 243-248 중 어느 하나에 있어서, 이미지는 t = 0 에서 획득된 제1 이미지이고, 가용성 리포터 분자를 검출하는 단계는 t = 1에서 제2 이미지를 획득하는 것을 포함하며, 여기서 t = 1에서 유동 영역과 복수의 챔버 사이의 비결합 가용성 리포터 분자의 확산은 정상 상태에 도달했다.
실시형태 250. 실시형태 243-249 중 어느 하나에 있어서, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제2 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 적어도 일부를 포함하는 관심 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양을 결정하는 단계를 더 포함하고, 여기서 관심 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양은 가용성 RMAS 복합체의 양에서의 변화의 선형 근사화를 생성하기 위해 사용되고, 그 선형 근사화의 슬로프는 챔버들 사이의 분비된 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
실시형태 251. 실시형태 250 에 있어서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제2 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 252. 실시형태 243-249 중 어느 하나에 있어서, 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하고, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 후크 영역이고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제2 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 후크 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 후크 영역 내의 가용성 RMSA 복합체의 상대적인 양은 챔버들에 걸친 가용성 분비 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
실시형태 253. 실시형태 252 에 있어서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제2 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 254. 실시형태 243-253 중 어느 하나에 있어서, 제4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제2 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 255. 실시 양태 243-254 중 어느 하나에 있어서, 제 1 복수의 및 제 2 복수의 가용성 리포터 분자들은 동일한 라벨을 포함한다.
실시형태 256. 실시 양태 243-254 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수 및 제 2 복수의 가용성 리포터 분자는 각각 상이한 라벨을 갖는 2개의 상이한 리포터 분자를 포함한다.
실시형태 257. 복수의 생물학적 마이크로-객체들, 또는 이로부터 발생된 가용성 생물학적 마이크로-객체들의 개체군들에 걸친 가용성 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법으로서, 그 방법은, 제1 유체 배지를 미세유체 디바이스의 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저 및 유동 영역에 유체적으로 연결된 챔버를 포함하며, 제1 유체 배지는 제1 복수의 리포터 분자들을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 미세유체 디바이스의 제1 이미지를 획득하는 단계; 리포터 분자들을 포함하지 않는 제2 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계; 챔버 내로 생물학적 마이크로-객체를 도입하는 단계; 생물학적 마이크로-객체, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군으로 하여금 가용성 분석물을 챔버 내에서 분비하게 하는 단계; 제3 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계로서, 제 3 유체 배지는 제2 복수의 리포터 분자들을 포함하며, 그리고, 각각의 가용성 리포터 분자는 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 도입하는 단계; 제2 복수의 리포터 분자들의 부분으로 하여금 챔버 내로 확산하게 하여 그 안에 분비된 가용성 분석물에 결합하게 하여, 복수의 가용성 리포터 분자: 분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 발생시키는 단계; 미세유체 디바이스의 제2 이미지를 획득하는 단계; 리포터 분자를 포함하지 않는 제4 유체 배지를 유동 영역으로 도입하는 단계; 및 미세유체 디바이스의 하나 이상의 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 258. 실시형태 257에 있어서, 챔버가 격리 영역을 포함하고, 격리 영역이 2차 흐름으로부터 격리된다.
실시형태 259. 실시형태 257 또는 258 에 있어서, 상기 챔버는 유동 영역에서의 유체 배지의 직접 유동으로부터 격리된 연결 영역을 포함한다.
실시형태 260. 실시형태 257-259 중 어느 하나에 있어서, 복수의 생물학적 마이크로-객체 중 개개의 생물학적 마이크로-객체는 복수의 챔버 중 개개의 챔버에 배치된다.
실시형태 261. 실시형태 257-260 중 어느 하나에 있어서, 가용성 리포터 분자의 농도는 분석물에 대한 가용성 리포터 분자의 KD 의 약 1-10 배이다.
실시형태 262. 실시형태 257-261 중 어느 하나에 있어서, 흐름 영역 내의 제2 유체 배지는 약 0.1-10초의 리프레시 레이트 (refresh rate) 로 리프레시되고, 리프레시 레이트는 유동 영역 내의 유체의 전체 체적을 교체하는 시간의 지속기간이다.
실시형태 263. 실시형태 257-262 중 어느 하나에 있어서, 리포터 분자의 검출은 미세유체 디바이스의 제3 이미지를 획득하는 것을 포함한다.
실시형태 264. 실시형태 263 에 있어서, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제3 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 복수의 서브 영역들 각각 내의 가용성 RMSA 복합체의 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 복수의 서브 영역들의 일부에서의 가용성 RMSA 복합체의 양은 챔버 사이의 분비된 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
실시형태 265. 실시형태 264 에 있어서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 266. 실시형태 264 에 있어서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지, 제2 이미지, 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 267. 실시형태 263 에 있어서, 관심 영역은 복수의 챔버의 각 챔버의 후크 (hook) 영역이고, 방법은 정정된 이미지를 생성하기 위해 제3 이미지로부터 적어도 제1 이미지를 감산하는 단계; 및 정정된 이미지를 분석하여 복수의 챔버의 적어도 일부에 대한 후크 영역 내의 RMSA 복합체의 양을 정량화하는 단계를 더 포함하고, 여기서 후크 영역 내의 RMSA 복합체의 양은 챔버들 사이의 분비된 분석물의 생산을 비교하기 위해 사용된다.
실시형태 268. 실시형태 267 에 있어서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 269. 실시형태 268 에 있어서, 제1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 및 제3 이미지에서 적어도 제1 이미지, 제2 이미지, 및 배경 이미지를 감산하여 정정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 270. 실시형태 257-262 중 어느 하나에 있어서, 제2 이미지는 흐름 영역과 챔버 사이의 비결합 리포터 분자의 확산이 정상 상태에 도달했는지 여부를 결정하는 데 사용된다.
실시형태 271. 실시형태 257-270 중 어느 하나에 있어서, 복수의 챔버 각각에 대한 분비의 상대적 레벨 또는 분비 스코어를 획득하는 단계; 및 획득된 분비 스코어에 기초하여 복수의 챔버의 순위를 매기는 단계; 및 상기 순위에 기초하여 복수의 챔버를 순서화하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 272. 실시 양태 257-271 중 어느 하나에 있어서, 제 1 복수의 및 제 2 복수의 가용성 리포터 분자들은 동일한 라벨을 포함한다.
실시형태 273. 실시 양태 257-271 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수 및 제 2 복수의 가용성 리포터 분자는 각각 상이한 라벨을 갖는 2개의 상이한 리포터 분자를 포함한다.
<110> BERKELEY LIGHTS INC. <120> METHODS, SYSTEMS AND KITS FOR IN-PEN ASSAYS <130> 59882.00018WO01 (BL003092-PCT) <140> PCT/US2021/021417 <141> 2021-03-08 <150> 62/986,786 <151> 2020-03-09 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG binding peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(4) <223> Any amino acid or absent <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Cys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(11) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(20) <223> Any amino acid or absent <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG binding peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(4) <223> Any amino acid or absent <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Cys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(9) <223> Any amino acid <220> 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Artificial Sequence: Synthetic IgG binding peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Any amino acid or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Cys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> Any amino acid <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG binding peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Any amino acid or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Cys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Ala, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Leu or Met <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> Any amino acid or absent <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG binding peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Ser, Arg or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Cys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Ala, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> His or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Leu or Met <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> Glu, Ser, Thr or Val <400> 8 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Xaa 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG binding peptide <400> 9 Asp Ser Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG binding peptide <400> 10 Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr 1 5 10 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG binding aptamer <220> <221> 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Claims (54)

  1. 생물학적 마이크로-객체들, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 개체군들에 걸친 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법으로서,
    미세유체 디바이스의 복수의 챔버들로 복수의 생물학적 마이크로-객체들을 도입하는 단계로서, 상기 미세유체 디바이스는 유동 영역을 가지는 인클로저를 포함하며, 상기 복수의 챔버들의 각각의 챔버는 상기 유동 영역에 유체 연결되며, 상기 복수의 챔버들은 제 1 유체 배지를 함유하는, 상기 복수의 생물학적 마이크로-객체들을 도입하는 단계;
    상기 복수의 생물학적 마이크로-객체들, 또는 이로부터 발생된 생물학적 마이크로-객체들의 상기 개체군들이 가용성 분석물을 상기 복수의 챔버들 내의 상기 제 1 유체 배지로 분비하는 것을 허용하는 단계;
    상기 유동 영역으로 제 2 유체 배지를 도입하는 단계로서, 상기 제 2 유체 배지는 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하며, 각각의 리포터 분자는: 상기 분비된 분석물에 결합하도록 구성된 결합 성분; 및 검출가능한 라벨을 포함하는, 상기 제 2 유체 배지를 도입하는 단계;
    상기 복수의 가용성 리포터 분자들의 일부가 상기 복수의 챔버들 내로 확산하고 그 안에서 분비되는 상기 가용성 분석물에 결합하여, 복수의 가용성 리포터 분자:분비된 분석물 (RMSA) 복합체들을 생성하는 것을 허용하는 단계; 및
    상기 미세유체 디바이스 내의 관심 영역 내에 위치된 상기 가용성 리포터 분자들을 검출하는 단계를 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 챔버들의 각각의 챔버는 상기 유동 영역에서 상기 제 2 유체 배지의 2차 유동으로부터 격리된 격리 영역을 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 챔버들의 각각의 챔버는 상기 유동 영역에서 상기 제 2 유체 배지의 직접 유동으로부터 격리된 연결 영역을 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 생물학적 마이크로-객체들 중 개개의 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 개개의 챔버에 배치되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    가용성 리포터 분자들의 농도는 상기 분석물에 대한 상기 가용성 리포터 분자들의 KD 의 약 1-10 배인, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유동 영역 내의 상기 제 2 유체 배지는 약 0.1-10초의 리프레시 레이트로 리프레시되고, 상기 리프레시 레이트는 상기 유동 영역 내의 유체의 전체 체적을 교체하는 시간의 지속기간인, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 리포터 분자들의 일부가 상기 복수의 챔버들 내로 확산하는 것을 허용하는 단계는 상기 복수의 리포터 분자들이 상기 유동 영역 및 상기 복수의 챔버들에 걸쳐 평형 상태를 달성하는 것을 허용하는 단계를 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 평형 상태는 상기 제 2 유체 배지의 도입으로부터 3시간 이내에 달성되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서
    상기 복수의 챔버들 각각에 대한 분비의 레벨 또는 분비 스코어를 획득하는 단계; 그리고
    획득된 상기 분비 스코어에 기초하여 상기 복수의 챔버들의 순위를 매기는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 복수의 리포터 분자들은 각각 상이한 라벨을 갖는 적어도 2개의 상이한 리포터 분자들을 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    각각의 챔버는 상기 유동 영역에 대한 단일 개구를 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 유동 영역은 미세유체 채널을 포함하고 각각의 챔버는 격리 영역 및 상기 격리 영역을 상기 미세유체 채널에 유체적으로 연결하는 연결 영역을 포함하고, 상기 연결 영역은 상기 미세유체 채널에 대한 근위 개구 및 상기 격리 영역에 대한 원위 개구를 갖는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 챔버의 격리 영역 내에 적어도 부분적으로 존재하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 챔버의 후크 영역 내에 있는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역이 상기 복수의 생물학적 마이크로-객체들 중 생물학적 마이크로-객체가 위치되는 영역에 근접하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 복수의 챔버들과 상기 유동 영역 사이의 확산 축을 따라 (예를 들어, 상기 복수의 챔버들의 상기 격리 영역과 상기 미세유체 채널 사이의 확산 축을 따라, 예를 들어 상기 연결 영역에 의해 정의된 확산 축을 따라) 존재하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 복수의 챔버들과 상기 유동 영역 사이의 확산 축을 따라 (예를 들어, 상기 복수의 챔버들의 상기 격리 영역과 상기 미세유체 채널 사이의 확산 축을 따라, 또는 상기 연결 영역에 의해 정의된 확산 축을 따라) 존재하지 않는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 분석물 농도 변동들을 측정하는데 가장 민감하고, 및 분석물 변동들이 측정될 때 상기 챔버에서의 생물학적 마이크로-객체들의 위치에 가장 적게 민감한 상기 복수의 챔버들의 챔버 내의 영역에 대응하는 이미지 영역을 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스 내의 상기 관심 영역 내에 위치된 리포터 분자들을 검출하는 단계는 리포터 분자들의 상기 복수의 챔버들 내로의 확산 후에 수행되고 그 안에서 분비된 상기 분석물에 대한 리포터 분자들의 결합은 정상 상태 조건들에 또는 근처에 있는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서
    상기 유동 영역으로 제 3 유체 배지를 도입하는 단계로서, 상기 제 3 유체 배지는 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 제 3 유체 배지를 도입하는 단계; 및
    비결합된 가용성 리포터 분자들의 적어도 일부가 상기 복수의 챔버들 밖으로 확산하는 것을 허용하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  21. 제 1 항 또는 제 20 항에 있어서,
    상기 제 2 유체 배지로부터의 상기 복수의 가용성 리포터 분자들은 제 1 복수의 가용성 리포터 분자들이고, 상기 복수의 생물학적 마이크로-객체들을 상기 미세유체 디바이스의 상기 복수의 챔버들에 도입하기 전에, 상기 방법은,
    상기 유동 영역 내로 제 4 유체 배지를 도입하는 단계로서, 상기 제 4 유체 배지는 제 2 복수의 가용성 리포터 분자들을 포함하는, 상기 제 4 유체 배지를 도입하는 단계;
    상기 미세유체 디바이스의 이미지를 획득하는 단계; 그리고
    상기 유동 영역으로 제 5 유체 배지를 도입하는 단계로서, 상기 제 5 유체 배지는 가용성 리포터 분자들을 포함하지 않는, 상기 제 5 유체 배지를 도입하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 이미지는 t = 0 에서 획득된 제1 이미지이고, 상기 가용성 리포터 분자들을 검출하는 단계는 t = 1 에서 제2 이미지를 획득하는 단계를 포함하며, 여기서 t = 1 에서 상기 유동 영역과 상기 복수의 챔버들 사이의 비결합 가용성 리포터 분자들의 확산은 정상 상태에 도달한, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 복수의 챔버들 중 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 상기 방법은,
    정정된 이미지를 생성하기 위해 상기 제 2 이미지로부터 적어도 상기 제 1 이미지를 감산하는 단계; 그리고
    상기 복수의 챔버들의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 적어도 일부를 포함하는 상기 관심 영역에서 가용성 RMSA 복합체들의 상대적인 양을 결정하기 위해 상기 정정된 이미지를 분석하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 관심 영역에서 가용성 RMSA 복합체들의 상기 상대적인 양은 가용성 RMSA 복합체들의 양의 변화들의 선형 근사화를 생성하는 데 사용되며, 상기 선형 근사화의 슬로프는 챔버들 간 분비된 분석물의 생성을 비교하는 데 사용되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서
    상기 제 4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 그리고
    상기 제 2 이미지에서 적어도 상기 제 1 이미지 및 상기 배경 이미지를 감산하여 상기 보정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 복수의 챔버들 중 각 챔버의 후크 영역이고, 상기 방법은,
    정정된 이미지를 생성하기 위해 상기 제 2 이미지로부터 적어도 상기 제 1 이미지를 감산하는 단계; 그리고
    상기 복수의 챔버들의 적어도 일부에 대한 상기 후크 영역에서의 가용성 RMSA 복합체들의 상대적 양을 정량화하기 위해 상기 정정된 이미지를 분석하는 단계를 더 포함하며,
    상기 후크 영역에서의 가용성 RMSA 복합체들의 상기 상대적 양은 챔버들에 걸쳐 가용성 분비 분석물의 생성을 비교하는 데 사용되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서
    상기 제 4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 그리고
    상기 제 2 이미지에서 적어도 상기 제 1 이미지 및 상기 배경 이미지를 감산하여 상기 보정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  28. 제 21 항에 있어서,
    상기 제 1 복수의 및 상기 제 2 복수의 가용성 리포터 분자들은 동일한 라벨을 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  29. 제 21 항에 있어서,
    상기 제 1 복수의 및 상기 제 2 복수의 가용성 리포터 분자들은 각각 상이한 라벨을 갖는 2개의 상이한 리포터 분자들을 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  30. 제 21 항에 있어서,
    상기 이미지는 t = 0 에서 획득된 제 1 이미지이고,
    상기 방법은, 상기 제 3 유체 배지를 상기 유동 영역에 도입하기 전 및 상기 복수의 가용성 리포터 분자들의 일부가 상기 복수의 챔버들 내로 확산하고 그안에 분비된 상기 가용성 분석물에 결합하는 것을 허용한 후, 상기 미세유체 디바이스의 제 2 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 리포터 분자들의 상기 검출은 상기 미세유체 디바이스의 제 3 이미지를 획득하는 단계를 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 복수의 챔버들 중 각 챔버의 연결 영역의 적어도 일부를 포함하고, 상기 방법은,
    정정된 이미지를 생성하기 위해 상기 제 3 이미지로부터 적어도 상기 제 1 이미지를 감산하는 단계; 그리고
    상기 복수의 챔버들의 적어도 일부에 대한 각 연결 영역의 복수의 서브 영역들 각각에서 가용성 RMSA 복합체들의 양을 정량화하기 위해 상기 정정된 이미지를 분석하는 단계를 더 포함하며,
    상기 복수의 서브 영역들의 일부에서의 가용성 RMSA 복합체들의 양은 선형 근사화를 생성하는 데 사용되며, 상기 선형 근사화의 슬로프는 챔버들 간의 분비된 분석물의 생성을 비교하는 데 사용되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서
    상기 제 4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 그리고
    상기 제 3 이미지에서 적어도 상기 제 1 이미지 및 상기 배경 이미지를 감산하여 상기 보정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서
    상기 제 4 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 그리고
    상기 제 3 이미지에서 적어도 상기 제 1 이미지, 상기 제 2 이미지, 및 상기 배경 이미지를 감산하여 상기 보정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  35. 제 31 항에 있어서,
    상기 관심 영역은 상기 복수의 챔버들 중 각 챔버의 후크 영역이고, 상기 방법은,
    정정된 이미지를 생성하기 위해 상기 제 3 이미지로부터 적어도 상기 제 1 이미지를 감산하는 단계; 그리고
    상기 복수의 챔버들의 적어도 일부에 대한 상기 후크 영역에서의 RMSA 복합체들의 양을 정량화하기 위해 상기 정정된 이미지를 분석하는 단계를 더 포함하며,
    상기 후크 영역에서의 RMSA 복합체들의 상기 양은 챔버들 간에 분비 분석물의 생성을 비교하는 데 사용되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서
    상기 제 1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 그리고
    상기 제 3 이미지에서 적어도 상기 제 1 이미지 및 상기 배경 이미지를 감산하여 상기 보정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서
    상기 제 1 유체 배지를 도입하기 전에 배경 이미지를 획득하는 단계; 그리고
    상기 제 3 이미지에서 적어도 상기 제 1 이미지, 상기 제 2 이미지, 및 상기 배경 이미지를 감산하여 상기 보정된 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  38. 제 30 항에 있어서,
    상기 제 2 이미지는 상기 유동 영역과 상기 복수의 챔버들 사이의 비결합 리포터 분자들의 확산이 정상 상태에 도달했는지 여부를 결정하는 데 사용되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  39. 제 1 항에 있어서,
    상기 분비된 분석물은 상기 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 2배 큰 분자량을 갖는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  40. 제 1 항에 있어서,
    상기 분비된 분석물은 상기 가용성 리포터 분자들의 분자량보다 적어도 4배 큰 분자량을 갖는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  41. 제 1 항에 있어서,
    상기 분비된 분석물은 상기 가용성 리포터 분자의 분자량보다 적어도 10배 큰 분자량을 갖는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  42. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 마이크로-객체들에 의해 분비되는 상기 분석물은 단백질, 당류, 핵산, 단백질, 당류, 또는 핵산 이외의 유기 분자, 소포, 또는 바이러스를 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  43. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 마이크로-객체에 의해 분비된 상기 분석물은 항체 또는, 선택적으로, 당화 항체인, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  44. 제 1 항에 있어서,
    상기 리포터 분자의 상기 결합 성분이 항체 중쇄 H1 도메인에 결합하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  45. 제 1 항에 있어서,
    상기 리포터 분자의 상기 결합 성분이 항체 경쇄 (예를 들어, 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 포함하는 에피토프) 에 결합하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  46. 제 1 항에 있어서,
    상기 리포트 분자들의 상기 결합 성분이 람다 경쇄 (예를 들어, 람다 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프) 에 결합하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  47. 제 1 항에 있어서,
    상기 리포터 분자의 상기 결합 성분이 카파 경쇄 (예를 들어, 카파 경쇄 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 포함하는 에피토프) 에 결합하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  48. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스는 복수의 챔버들을 포함하며, 생물학적 마이크로-객체는 상기 복수의 챔버들 중 적어도 2개의 챔버들 각각으로 도입되며, 상기 방법의 나머지는 상기 적어도 2개의 챔버들의 각각에 대해 수행되는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  49. 제 1 항에 있어서
    상기 복수의 챔버들 중 상기 적어도 2개의 챔버들의 챔버들에 대한 분비의 레벨을 비교하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서
    상기 복수의 챔버들 중 하나보다 많은 챔버의 분비 스코어들을 비교하는 단계를 더 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  51. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스의 상기 복수의 챔버들 내로 상기 복수의 생물학적 마이크로-객체들를 도입하는 단계는 상기 생물학적 마이크로-객체들을 선택하는 단계 및 선택된 상기 생물학적 마이크로-객체들을 상기 복수의 챔버들 내로 선택적으로 이동시키는 단계를 포함하는, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 선택은 양성 선택인, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  53. 제 51 항에 있어서,
    상기 선택은 음성 선택인, 분석물의 분비의 상대적 레벨을 평가하는 방법.
  54. 클론주 개발의 방법으로서,
    제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항의 방법을 수해하는 단계;
    상기 복수의 챔버들 중에서 챔버들의 세트를 선택하는 단계로서, 상기 세트의 각각의 챔버는 그 안에 포함된, 생물학적 마이크로-객체, 또는 클론 개체군이 상위 분석물 생산자임을 표시하는 스코어를 가지는, 상기 선택하는 단계;
    상기 선택된 챔버들의 세트의 각각의 챔버 내에 포함된 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 상기 미세유체 디바이스로부터 배출시키는 단계;
    대응하는 반응 용기들에서 선택된 상기 챔버들의 세트의 각각의 챔버로부터의 배출된 상기 하나 이상의 생물학적 마이크로-객체들을 증식시키는 단계; 및
    각각의 대응하는 반응 용기에서 분비된 분석물의 레벨을 결정하고, 이에 의해 각각의 생물학적 마이크로-객체 또는 클론 개체군에 대한 분비의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 클론주 개발의 방법.
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