KR20220147037A - Analytical Platform of Ligand-Receptor Pairing - Google Patents

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KR20220147037A
KR20220147037A KR1020220050933A KR20220050933A KR20220147037A KR 20220147037 A KR20220147037 A KR 20220147037A KR 1020220050933 A KR1020220050933 A KR 1020220050933A KR 20220050933 A KR20220050933 A KR 20220050933A KR 20220147037 A KR20220147037 A KR 20220147037A
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김광표
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주식회사 니오바이오파마슈티컬스
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Abstract

The present invention relates to an assay platform for the identification of a ligand-receptor pairing. In particular, the present invention relates to a screening method for an immune cell activating condition for a target protein, which comprises the following steps: (a) activating immune cells under the immune cell activating condition; (b) reacting the immune cells activated in step (a) with the target protein; and (c) confirming whether the target protein binds to a receptor expressed on the surface of the immune cells through imaging. Activation conditions of immune cells expressed under various conditions can be confirmed by using an analysis method of the present invention.

Description

리간드-수용체 페어링 분석 플랫폼{Analytical Platform of Ligand-Receptor Pairing}Ligand-Receptor Pairing Analysis Platform {Analytical Platform of Ligand-Receptor Pairing}

본 발명은 리간드-수용체 페어링 확인 및 동정을 위한 분석 플랫폼에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 타겟 단백질을 탑재시킨 형광나노입자 프로브를 활용하여 세포 표면 타겟 수용체를 탐색 및 검증하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an assay platform for the identification and identification of ligand-receptor pairings. Specifically, the present invention relates to a method for detecting and verifying a cell surface target receptor using a fluorescent nanoparticle probe loaded with a target protein.

면역 관문 억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역 관문 단백질의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로서 CTLA-4, PD-1, PD-L1 억제제 등이 있다. 현재 시판 중인 대표적 약제로는, CTLA-4 단클론항체로 이필리무맙(ipilimumab; 상품명: YERVOY®)가 있고, PD-1 단클론항체로 니볼루맙(nivolumab; 상품명: OPDIVO®), 펨브롤리주맙(pembrolizumab; 상품명: KEYTRUDA®) 등이 있으며, PD-L1 단클론항체로 아테졸리주맙(atezolizumab; 상품명: TECENTRIQ®), 두르발루맙(durvalumab; 상품명: IMFINZI®)등이 있다.Immune checkpoint inhibitors are drugs that attack cancer cells by activating T cells by blocking the activation of immune checkpoint proteins involved in T cell suppression, and include CTLA-4, PD-1, and PD-L1 inhibitors. Representative drugs currently on the market include ipilimumab (trade name: YERVOY®) as a CTLA-4 monoclonal antibody, nivolumab (trade name: OPDIVO®) as a PD-1 monoclonal antibody, and pembrolizumab ; brand name: KEYTRUDA®), and PD-L1 monoclonal antibody atezolizumab (trade name: TECENTRIQ®) and durvalumab (trade name: IMFINZI®).

그러나 PD-1/PD-L1 또는 CTLA-4를 표적하는 면역 관문 억제제도 20~30% 내외의 환자에게만 효과를 나타내는 등 여전히 기존 면역 관문 억제제로는 치료되지 않는 암종이 있으므로, 새로운 항암 치료제의 개발이 요구되고 있으며, 이를 위해서는 신규 타겟의 발굴 및 기전 규명이 필요하다. 특히 암세포에 발현되는 리간드, 예컨대 B7H3, B7H4 등의 면역 관문 리간드, 그 외 주요 면역조절 기능 단백질의 타겟 리간드 발굴을 위한 기술 플랫폼은 신규 항암 면역조절 치료제 타겟 발굴 및 기전 규명을 위해 절실히 필요하다.However, immune checkpoint inhibitors that target PD-1/PD-L1 or CTLA-4 are effective in only 20-30% of patients, and there are still cancers that are not treated with existing immune checkpoint inhibitors, so development of new anticancer therapeutics is required, and for this purpose, it is necessary to discover a new target and to elucidate the mechanism. In particular, a technology platform for discovering ligands expressed in cancer cells, such as immune checkpoint ligands such as B7H3 and B7H4, and target ligands for other major immunomodulatory proteins is desperately needed to discover new anticancer immunomodulatory therapeutic targets and to elucidate mechanisms.

면역 관문 리간드로 알려진 B7H3에 대한 T 세포 등 일부 면역 세포의 특정 활성화 조건에서 B7H3의 추정 수용체가 발현되는 것이 알려져 있으나 기능 검증이 미약하며, 또한 이외는 수용체의 발현 여부만이 확인되었을 뿐 재현성 있고 다양한 면역 세포에서 정립된 활성화 조건이 미흡하다. 따라서, B7H3의 추정 수용체가 발현되는 특정 활성화 조건을 확립 및 식별하는 것이 필요하다.It is known that the putative receptor of B7H3 is expressed under certain activation conditions of some immune cells, such as T cells for B7H3, known as an immune checkpoint ligand, but functional verification is weak. The established activation conditions in immune cells are insufficient. Therefore, it is necessary to establish and identify specific activation conditions in which putative receptors of B7H3 are expressed.

효율적인 수용체 발굴을 위해서는 면역 세포의 표적 단백질인 B7H3 추정수용체 최적의 발현 조건 탐색을 위한 고속-대량 스크리닝(high-throughput screening) 분석 플랫 폼을 기반으로 하는 면역 세포의 특정 활성화 조건을 확립하는 것이 필요하다. B7H3를 포함한 다수의 규명되지 않은 면역관문 리간드 발굴은 최적의 분석기술 시스템 접목이 매우 중요하다고 판단된다. 전통적으로 특정 단백질의 표적 면역 세포에서의 발현 정도의 확인을 위해서는 항체를 기반으로 하는 분석 방법(예: FACS)이 주로 사용되고 있다. 그러나 면역 관문 분자의 조절기전은 단백체 상호작용(protein-protein interaction; PPI)에 기인함으로(예: PD/PD-L1) 표적 면역 세포의 표적 단백질 발현 여부는 PPI 분석을 사용시 우수한 측정 민감도를 기대할 수 있다.For efficient receptor discovery, it is necessary to establish specific activation conditions for immune cells based on a high-throughput screening analysis platform to search for optimal expression conditions for the B7H3 putative receptor, a target protein of immune cells. . In order to discover a number of unidentified immune checkpoint ligands, including B7H3, it is judged that it is very important to apply the optimal analysis technology system. Traditionally, antibody-based assay methods (eg, FACS) have been mainly used to determine the expression level of specific proteins in target immune cells. However, the regulatory mechanism of immune checkpoint molecules is due to protein-protein interaction (PPI) (eg PD/PD-L1). have.

본 발명은 계내 화학 교차결합/프로테오믹스(in-situ chemical cross-linking/substractive proteomics) 기술을 융합하여 활성 면역 세포 표면에 발현하는 미발굴 면역 조절 수용체를 효율적으로 발굴할 수 있는 플랫폼 개발을 제공하고자 한다.The present invention aims to provide a platform development that can efficiently discover undiscovered immunomodulatory receptors expressed on the surface of active immune cells by fusion of in-situ chemical cross-linking/substractive proteomics technology. .

구체적으로, 본 발명에서는 형광 나노 입자를 활용한 미발굴 리간드/수용체 발굴 스크리닝 시스템을 구축하고자 하며, 이는 기존에 활용되고 있는 FACS와 같은 기존의 항체 의존성에서 탈피하여 단백질-단백질 직접 결합 여부를 형광 강도와 이미지로 직접 확인함으로써, 여러 종류의 미발굴 리간드/수용체의 세포 활성화에 따른 타겟 단백질 발현 조건 여부 및 특정 단백질과 미발굴 리간드/수용체간의 직접적인(direct) PPI를 확인 및 식별할 수 있는 신속한 형광나노입자 처리 플랫폼을 제공한다.Specifically, in the present invention, an undiscovered ligand/receptor discovery and screening system using fluorescent nanoparticles is to be constructed, which breaks away from the existing antibody dependence such as FACS, which is used in the past, and determines whether protein-protein direct binding or not fluorescence intensity. Rapid fluorescence nanotechnology that can confirm and identify the target protein expression conditions according to cell activation of various types of undiscovered ligands/receptors and direct PPI between specific proteins and undiscovered ligands/receptors It provides a particle handling platform.

즉, 본 발명은 면역 관문 리간드 단백질과 이에 대한 카운터 수용체(즉, 면역 세포 표면 상에 발현된 수용체) 간의 상호작용을 분석하는 방법에 관한 것으로, 특정 리간드에 대한 면역 세포의 활성화 조건(즉, 면역 세포 표면 수용체 발현 조건)을 스크리닝하고, 이를 통해 리간드 단백질에 대해 알려지지 않은 카운터 수용체를 동정하기 위한 방법을 제공한다.That is, the present invention relates to a method for analyzing the interaction between an immune checkpoint ligand protein and its counter receptor (ie, a receptor expressed on the surface of an immune cell), and the conditions for activation of immune cells for a specific ligand (ie, immune system) cell surface receptor expression conditions), thereby providing a method for identifying unknown counter receptors for ligand proteins.

특히 본 발명에서는 형광 나노 프로브 플랫폼을 활용하여 다양한 조건에서 암세포의 면역 체크 포인트 또는 면역세포 활성에 대한 면역 세포 수용체 후보군 발현 조건을 확인할 수 있으며, 이를 통해 추정 발현량이 적어 규명이 어려운 면역 세포의 수용체 발현 여부를 신속하게 판단할 수 있는 고속-대량 스크리닝 방법을 제공한다.In particular, in the present invention, by utilizing the fluorescent nanoprobe platform, it is possible to check the expression conditions of immune checkpoints or immune cell receptor candidates for immune cell activity of cancer cells under various conditions, and through this, receptor expression of immune cells difficult to identify due to the low estimated expression level We provide a high-speed-mass screening method that can quickly determine whether or not

또한 효율적인 미규명 B7 family의 카운터 수용체 확인을 위하여, 형광 나노 프로브를 통해 확인한 면역 세포의 수용체 발현 조건을 확보하고, 미규명 B7 family 단백질과 결합된 활성화된 면역 세포의 이미지를 분석한 후, 계내 교차결합(in-situ crosslinking) 및 프로테오믹스 등의 방법을 통해 미규명 B7 family에 대한 카운터 수용체의 확인 과정을 체계화하는 분석 프로토콜을 제공한다.In addition, in order to efficiently identify the counter receptor of the unidentified B7 family, the receptor expression conditions of the immune cells identified through the fluorescent nanoprobe were secured, and the image of the activated immune cells bound to the unidentified B7 family protein was analyzed, and then crossed in situ. We provide an assay protocol that organizes the identification of counter receptors for the unidentified B7 family through methods such as in-situ crosslinking and proteomics.

본 발명은 면역 세포 활성화 조건, 즉, 면역 세포 표면에 발현되는 수용체 발현 조건을 스크리닝하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for screening for conditions for activating immune cells, that is, conditions for expression of receptors expressed on the surface of immune cells.

구체적으로, 본 발명은Specifically, the present invention

(a) 면역 세포를 면역 세포 활성화 조건에서 활성화시키는 단계;(a) activating the immune cells under conditions of activating immune cells;

(b) 단계 (a)에서 활성화된 면역 세포와 표적 단백질을 반응시키는 단계; 및(b) reacting the immune cells activated in step (a) with the target protein; and

(c) 상기 표적 단백질과 상기 면역 세포 표면에 발현된 수용체의 결합 여부를 이미징을 통해 확인하는 단계(c) confirming through imaging whether the target protein binds to the receptor expressed on the surface of the immune cell

를 포함하는, 표적 단백질에 대한 면역 세포 활성화 조건의 스크리닝 방법에 관한 것이다.It relates to a screening method of immune cell activation conditions for a target protein, comprising a.

일 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 형광 나노 프로브와 컨쥬게이션 된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 형광 나노 프로브는 스트렙타비딘-컨쥬게이션된 비드일 수 있다. 본원에서 용어 "형광 나노 프로브"는 "형광 나노 입자"와 동일한 의미로서 서로 호환가능하게 사용된다.In one embodiment, the target protein may be conjugated to a fluorescent nanoprobe, and more specifically, the fluorescent nanoprobe may be a streptavidin-conjugated bead. As used herein, the term "fluorescent nanoprobe" has the same meaning as "fluorescent nanoparticle" and is used interchangeably with each other.

일 실시태양에서, 상기 면역 세포는 대식세포, 자연살해 세포(NK 세포), 또는 T 세포일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 면역 세포는 말초혈액단핵구 (PBMC) 유래 T 세포, 백혈구 성분채집술 유래 T 세포, 1차 배양(primary) 자연살해 세포, 또는 NK-92 세포주일 수 있다.In one embodiment, the immune cells may be macrophages, natural killer cells (NK cells), or T cells, and more specifically, the immune cells are peripheral blood mononuclear cell (PBMC)-derived T cells, leukocyte apheresis-derived T cells, primary natural killer cells, or NK-92 cell lines.

일 구체적 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 B7H3일 수 있다.In one specific embodiment, the target protein may be B7H3.

또다른 구체적 실시태양에서, 단계 (a)에서의 활성화는 면역 세포를 파이토헤마글루티닌-L (PHA-L), 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA), 이노마이신(inomycin), 및 IL2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 처리하여 활성화시키는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 면역 세포가 T 세포, 예컨대 말초혈액단핵구(PBMC) 유래 T 세포, 백혈구 성분채집술 유래 T 세포인 경우, 파이토헤마글루티닌-L (PHA-L)로 처리하여 활성화시킬 수 있으며, 상기 면역 세포가 NK 세포, 예컨대 1차 배양(primary) 자연살해 세포, 또는 NK-92 세포주인 경우 파이토헤마글루티닌-L (PHA-L)로 처리하거나, 또는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA), 이노마이신(inomycin), 및 IL2 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 처리하여 활성화시킬 수 있다.In another specific embodiment, the activation in step (a) comprises activating immune cells consisting of phytohemagglutinin-L (PHA-L), phorbol myristate acetate (PMA), inomycin, and IL2. It may be activated by treatment with one or more selected from the group. More specifically, when the immune cells are T cells, such as peripheral blood mononuclear (PBMC)-derived T cells or leukocyte apheresis-derived T cells, they can be activated by treatment with phytohemagglutinin-L (PHA-L). and, when the immune cells are NK cells, such as primary natural killer cells, or NK-92 cell line, treated with phytohemagglutinin-L (PHA-L), or phorbol myristate acetate ( PMA), inomycin, and can be activated by treatment with one or more selected from the group consisting of IL2.

본 발명은 또한 타겟 단백질에 대해 면역 세포 표면 상에 발현된 카운터 수용체를 확인 또는 동정(identification)하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for identifying or identifying a counter receptor expressed on the surface of an immune cell for a target protein.

구체적으로, 본 발명은Specifically, the present invention

(a) 면역 세포를 활성화시키는 단계;(a) activating immune cells;

(b) 단계 (a)에서 활성화된 면역 세포와 표적 단백질을 반응시켜, 상기 표적 단백질과 면역 세포 표면에 발현된 수용체를 결합시키는 단계; 및(b) reacting the immune cells activated in step (a) with the target protein, thereby binding the target protein to the receptor expressed on the surface of the immune cell; and

(c) 면역 세포 표면에 발현된 수용체를 확인하는 단계(c) identifying the receptor expressed on the immune cell surface

를 포함하는, 면역 세포 표면에 발현된 수용체의 확인 방법을 제공한다.It provides a method for identifying a receptor expressed on the surface of an immune cell comprising a.

일 실시태양에서, 단계 (a)의 면역 세포 활성화는 상기 스크리닝 방법을 통해 확인된 활성화 조건 하에서 진행되는 것일 수 있다.In one embodiment, the immune cell activation in step (a) may be carried out under the activation conditions confirmed through the screening method.

일 실시태양에서, 단계 (b)에서 표적 단백질과 면역 세포 표면에 발현된 수용체는 계내 교차결합(in-situ crosslinking)을 통해 결합되는 것일 수 있으며, 상 기 표적 단백질은 비오틴과 결합된 것일 수 있다. 이 때 계내 교차결합을 위해서는 종래 공지된 가교제(crosslinker), 예컨대 BS3 가교제를 사용할 수 있다.In one embodiment, the target protein and the receptor expressed on the immune cell surface in step (b) may be bound through in-situ crosslinking, and the target protein may be bound to biotin. . In this case, for in situ crosslinking, a conventionally known crosslinker, for example, a BS3 crosslinking agent may be used.

결합된 표적 단백질과 카운터 수용체는 스트렙타비딘을 통한 면역침강법(IP)을 사용하여 정제되고, 이어서 면역블롯팅 또는 질량분석법 등을 통해 구체적인 카운터 수용체의 종류를 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 위 단계를 통해서 얻은 각각의 시료에 대해 대규모 액체분해능 텐덤 질량분석(LC-MS/MS)을 진행하고, 단백질 데이터베이스 검색 알고리즘을 이용하여 단백질을 확인한 후, 음성 실험군 결과와 대조하여 표적 단백질, 예컨대 B7H3에 대한 카운터 수용체 후보군을 확보할 수 있다. 이때 카운터 수용체 후보군으로는 다음과 같은 조건으로 후보군을 확보할 수 있다.The bound target protein and the counter receptor are purified using an immunoprecipitation method (IP) using streptavidin, and then the specific type of the counter receptor can be identified through immunoblotting or mass spectrometry. For example, large-scale liquid resolution tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) is performed on each sample obtained through the above steps of the present invention, and the protein is identified using a protein database search algorithm, and then the result of the negative test group and the In contrast, it is possible to secure a counter-receptor candidate group for a target protein, such as B7H3. In this case, as the counter-receptor candidate group, a candidate group can be secured under the following conditions.

1) 막단백체 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 막단백질1) Membrane protein comprising a transmembrane domain

2) 세포외(extracellular) IgV 또는 IgC 도메인을 포함하는 단백질2) a protein comprising an extracellular IgV or IgC domain

3) 면역조절기전 관련 단백질3) Proteins related to immunomodulatory mechanisms

구체적 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 B7H3이고, 이 때 확인된 카운터 수용체는 IL20RA일 수 있다.In a specific embodiment, the target protein is B7H3, wherein the identified counter receptor may be IL20RA.

본 발명의 분석 방법을 이용하면 다양한 조건에서 발현되는 면역 세포의 활성화 조건을 확인할 수 있으며, 표적 단백질에 대한 수용체에 대한 발현 여부 등을 손쉽게 확인할 수 있다. 특히 FACS 기반 분석은 항체 의존하는 간접적 단백체 결합을 측정하나, 본 발명의 분석 방법은 형광 나노 프로브를 통해 in-situ 상 B7H3의 표적 면역 세포 표면에 결합하는 이미징 분석 및 형광 측정이 가능하여, 전통적인 항체 기반 분석 방법과는 달리 단백체간의 결합을 직접적으로 측정함으로써 효율적이고 신뢰성 있는 결과를 도출할 수 있다. 또한 본 발명의 형광 나노 프로브 플랫폼을 활용하여, 다양한 조건에서 면역 세포의 B7H3 수용체 후보군 발현 조건을 확인할 수 있으며, 이를 통해 추정 발현량이 적어 규명이 어려운 면역 세포의 수용체 발현 여부를 고속-대량 스크리닝을 통해 빠르게 판단할 수 있을 것으로 기대된다.By using the analysis method of the present invention, it is possible to check the activation conditions of immune cells expressed in various conditions, and it is possible to easily check whether or not expression of a receptor for a target protein is present. In particular, FACS-based analysis measures antibody-dependent indirect proteomic binding, but the analysis method of the present invention enables imaging analysis and fluorescence measurement of binding to the target immune cell surface of B7H3 in situ through a fluorescent nanoprobe, so that a traditional antibody Unlike the based analysis method, it is possible to derive efficient and reliable results by directly measuring the binding between proteomic bodies. In addition, by utilizing the fluorescent nanoprobe platform of the present invention, it is possible to confirm the expression conditions of the B7H3 receptor candidate group of immune cells under various conditions, and through this, it is possible to check whether the receptor expression of the immune cells, which is difficult to identify due to the low estimated expression level, through high-speed-mass screening. We expect to be able to make a decision quickly.

도 1은 본 발명의 분석 방법의 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 분석 방법을 사용하여 B7H6/NKp30 상호결합을 확인한 연구 결과를 보여준다.
도 3은 특정 활성화된 조건에서 활성화된 T 세포 또는 NK 세포가 형광 나노입자에 탑재된 B7H3와 직접 결합함을 보여준다.1 shows a schematic diagram of the analysis method of the present invention.
Figure 2 shows the results of a study confirming the B7H6 / NKp30 cross-binding using the analysis method of the present invention.
Figure 3 shows that under specific activated conditions, activated T cells or NK cells directly bind to B7H3 loaded on fluorescent nanoparticles.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. will be.

실시예 1: B7H6/NKp30 상호결합 확인Example 1: Confirmation of B7H6/NKp30 cross-binding

인간 NKp30은 성숙한 NK 세포에서 발현되는 활성화 수용체이며, 림프종, 백혈병, 위장관 기질 종양 등에서 발현되는 B7H6는 NKp30의 대표적인 리간드로서 알려져 있다.Human NKp30 is an activating receptor expressed in mature NK cells, and B7H6 expressed in lymphoma, leukemia, gastrointestinal stromal tumor, etc. is known as a representative ligand of NKp30.

본 실시예에서는 본 발명의 분석 방법이 실제 유효하게 작동하는지를 검증하기 위해, 본 발명의 분석 방법을 이용하여 B7H6와 NKp30의 상호결합 여부를 확인하였다.In this example, in order to verify whether the analysis method of the present invention actually works effectively, it was confirmed whether B7H6 and NKp30 were mutually bound using the analysis method of the present invention.

1-1: B7H6 단백질 탑재 형광나노입자와 카운터 리셉터 NKp30 과 발현 세포주에 대한 결합 이미징 분석을 통한 플랫폼 검증1-1: Platform validation through binding imaging analysis of fluorescent nanoparticles loaded with B7H6 protein and cell lines expressing counter receptor NKp30

NKp30를 과발현시킨 HEK293 세포주 2 x 106 cells에 B7H6 단백질 탑재 형광 나노 입자를 넣어주고 상온에서 1시간 가볍게 흔들면서 배양을 진행하였다. 세포에 결합하지 않은 형광 나노 입자는 인산 완충 생리식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 3번 세척하였으며, 마지막 세척 후 4% PFA (paraformaldehyde)로 상온에서 15분 동안 고정하였다. 준비된 세포는 현미경 슬라이드에 마운팅 후 LSM880 공초점 현미경(confocal microscope) 63x oil objective (Carl Zeiss)를 사용하여 관찰하였다. 별도로 언급하지 않은 모든 세포 염색 단계 사이에는 PBS 세척 단계를 포함하였다.Fluorescent nanoparticles loaded with B7H6 protein were added to 2 x 10 6 cells of HEK293 cell line overexpressing NKp30, and cultured at room temperature with gentle shaking for 1 hour. The fluorescent nanoparticles not bound to the cells were washed three times with phosphate-buffered saline (PBS), and after the last washing, they were fixed with 4% PFA (paraformaldehyde) at room temperature for 15 minutes. The prepared cells were mounted on a microscope slide and then observed using an LSM880 confocal microscope 63x oil objective (Carl Zeiss). A PBS washing step was included between all cell staining steps unless otherwise noted.

이를 공초점 현미경으로 형광 이미지를 측정한 결과 NKp30이 B7H6와 상호결합하였음을 확인하였다(도 2).As a result of measuring the fluorescence image with a confocal microscope, it was confirmed that NKp30 was cross-coupled with B7H6 (FIG. 2).

이러한 결과는 본 발명의 방법이 표적 리간드 단백질과 이의 카운터 수용체 간의 결합을 분석하는데 효과적임을 보여준다.These results show that the method of the present invention is effective in analyzing the binding between the target ligand protein and its counter receptor.

실시예 2: 계내 교차결합(In-situ cross linking) IP 및 질량분석기기 분석을 통한 B7H3의 카운터 수용체 분석Example 2: Counter-receptor analysis of B7H3 by in-situ cross linking IP and mass spectrometry analysis

본 실시예에서는 본 발명의 분석 방법을 사용하여 B7H3에 대한 카운터 수용체를 확인하고자 하였다(도 1).In this example, it was attempted to identify a counter receptor for B7H3 using the assay method of the present invention (FIG. 1).

2-1. B7H3에 대한 T 세포 활성화 조건 스크리닝2-1. T cell activation condition screening for B7H3

우선 형광 나노 프로브를 이용한 스크리닝 방법을 사용하여, B7H3 수용체 후보군의 발현이 높은 면역 세포의 특정 활성화 조건을 찾고자 하였다. 이를 위해 면역 세포로서 T 세포 및 NK 세포를 스크리닝에 사용하였다.First, by using a screening method using a fluorescent nanoprobe, it was attempted to find a specific activation condition for immune cells with high expression of the B7H3 receptor candidate group. For this purpose, T cells and NK cells as immune cells were used for screening.

PBMC 유래 T 세포의 활성화를 위해 PHA-L로 처리하였다. 구체적으로 5 μg/mL PHA-L를 처리하여 24시간 동안 배양한 2 x 106 PBMC에 50 μg/mL Fc blocker를 처리하여 면역 세포 표면의 Fc 수용체를 블록(block)하였다. 1.76 x 1011 B7H3 단백질 탑재 형광 나노 입자와 CD3 항체를 세포에 넣어주고 상온에서 1시간 배양하였다. 세포에 결합하지 않은 형광 나노 입자 및 CD3 항체를 PBS로 3번 세척 후, 4% PFA 고정, 세포 마운팅 및 공초점 현미경 분석을 실시예 1-1과 동일하게 진행하였으며, 단 CD3 항체는 alexa-647 형광이 접지된 anti-rabbit IgG 항체를 사용하여 표지하였다. CD3는 T세포 마커이다.Treated with PHA-L for activation of PBMC-derived T cells. Specifically, 2 x 10 6 PBMCs cultured for 24 hours by treatment with 5 μg/mL PHA-L were treated with 50 μg/mL Fc blocker to block Fc receptors on the surface of immune cells. 1.76 x 10 11 B7H3 protein-loaded fluorescent nanoparticles and CD3 antibody were added to the cells and incubated at room temperature for 1 hour. Fluorescent nanoparticles and CD3 antibody not bound to cells were washed 3 times with PBS, 4% PFA fixation, cell mounting, and confocal microscopy analysis were performed in the same manner as in Example 1-1, except that CD3 antibody was alexa-647 Fluorescence was labeled using a grounded anti-rabbit IgG antibody. CD3 is a T cell marker.

NK 세포로서 NK-92 세포주를 사용하였고, 이들의 활성화를 위해 IL2로 처리하였다. 본 실시예에서 사용된 B7H3 단백질 탑재 형광 나노 입자는 human IgG Fc-SBP tag 또는 His tag을 가지고 있으므로, 형광 나노 입자 염색에 앞서, NK92 세포주 2 x 106 cells를 50 μg/mL Fc blocker와 상온에서 10분 배양하여 면역 세포 표면에 발현된 Fc 수용체를 블로킹(blocking) 시켰다. 이후 B7H3 단백질 탑재 형광 나노 입자와의 결합 및 공초점 현미경 분석은 실시예 2-1의 이미징 분석과 동일하게 진행하였다.As NK cells, the NK-92 cell line was used and treated with IL2 for their activation. Since the fluorescent nanoparticles loaded with B7H3 protein used in this Example have human IgG Fc-SBP tag or His tag, NK92 cell line 2 x 10 6 cells were incubated with 50 μg/mL Fc blocker at room temperature prior to fluorescent nanoparticle staining. Incubated for 10 minutes to block the Fc receptor expressed on the immune cell surface. Thereafter, binding to the B7H3 protein-loaded fluorescent nanoparticles and analysis by confocal microscopy were performed in the same manner as in the imaging analysis of Example 2-1.

그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이 T 세포와 NK 세포는 각각 B7H3 와 결합함이 확인되었다. 이를 통해 B7H3에 대한 면역 세포는 본 실시예에서 사용된 시약 조건(즉, T 세포의 경우 PHA-L; NK 세포의 경우 IL-2)에서 활성화됨이 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 3 , it was confirmed that T cells and NK cells bind to B7H3, respectively. Through this, it was confirmed that immune cells against B7H3 were activated under the reagent conditions used in this Example (ie, PHA-L for T cells; IL-2 for NK cells).

2-2. 활성화된 면역 세포와 B7H3 (CD276) 단백질 상호결합체 획득 실험2-2. Activated immune cells and B7H3 (CD276) protein cross-conjugate acquisition experiment

실시예 2-1에서 확인된 조건에 따라 활성화된 1ⅹ108의 NK 세포를 1X PBS에 넣고 원심분리기를 이용하여 3번 정도 세척하여 아민기를 함유하는 배양액을 씻어냈다. 마지막은 1,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 500 uL의 1X PBS에 재현탁(resuspension) 하였다. 비오틴화 B7H3 재조합 단백질을 넣어준 뒤, 로테이터에 1시간 30분간 4℃에서 배양하였다. 이후 BS3 crosslinker를 최종 농도 5 mM로 처리하고 로테이터에 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 50 mM Tris- HCl (pH 7.5) 버퍼를 최종 농도 20 mM이 되도록 처리하고 로테이터에 15분간 실온에서 배양하여 반응을 종료시켰다. 1X PBS를 이용하여 3회 세척 후 RIPA 버퍼를 처리하여 세포를 용해하고 BCA 정량을 통해 단백질 양을 측정하였다.1× 10 8 NK cells activated according to the conditions confirmed in Example 2-1 were placed in 1X PBS and washed about 3 times using a centrifuge to wash the culture solution containing the amine group. Finally, after centrifugation at 1,000 rpm for 5 minutes, it was resuspended in 500 uL of 1X PBS. After the biotinylated B7H3 recombinant protein was added, it was incubated at 4° C. for 1 hour and 30 minutes on a rotator. Thereafter, the BS3 crosslinker was treated with a final concentration of 5 mM and incubated at 4° C. on a rotator for 1 hour. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer was treated to a final concentration of 20 mM, and incubated on a rotator at room temperature for 15 minutes to terminate the reaction. After washing 3 times using 1X PBS, cells were lysed by treatment with RIPA buffer, and the amount of protein was measured through BCA quantification.

2-3: 단백질 복합체 질량분석을 통한 B7H3 (CD276) 과 결합하는 막 단백질 동정2-3: Identification of Membrane Protein Binding to B7H3 (CD276) by Protein Complex Mass Spectrometry

2-2에서 획득한 B7H3 단백질과 결합한 단백질 복합체를 분리하기 위하여, 에비딘(avidin) 정제를 수행하여 비오틴화 B7H3과 리간드 단백질 후보군을 함께 분리하였다. 이후, SDS-PAGE로 시료를 분리하여 젤을 분획화한 뒤 겔 내 단백체 절편화(in-gel digestion) 방법으로 펩타이드를 추출하였다. 추출한 펩타이드를 고해상도 질량분석기를 이용하여 3회 반복 분석한 후, SEQUEST 알고리즘을 이용하여 대조군(biotinylated IgG)에서는 나타나지 않고 실험군에서만 한 번 이상 나타나는 단백질을 선별하였다. 선별한 단백질 중 Uniprot protein database에 의한 분류를 이용해 세포막 또는 세포 외 기질에 존재하는 것으로 알려진 단백질을 분류하였으며, 활성화된 NK 세포에서 특이적으로 동정된 단백질을 우선 분류하여 후보군을 확보하였다.In order to isolate the protein complex bound to the B7H3 protein obtained in 2-2, avidin purification was performed to separate biotinylated B7H3 and a candidate ligand protein group together. Thereafter, the sample was separated by SDS-PAGE, the gel was fractionated, and the peptide was extracted by in-gel digestion. After the extracted peptide was analyzed three times using a high-resolution mass spectrometer, a protein that did not appear in the control group (biotinylated IgG) but appeared more than once in the experimental group was selected using the SEQUEST algorithm. Among the selected proteins, proteins known to exist in the cell membrane or extracellular matrix were classified using classification by the Uniprot protein database.

B7H3에 대한 카운터 수용체 단백질은 IL20RA로 판명되었다.The counter receptor protein for B7H3 was identified as IL20RA.

본 발명의 분석 방법을 통해, 다양한 조건에서 B7H3 리간드에 대한 면역 세포 상의 카운터 수용체의 발현(활성화) 조건을 확인하였고, 나아가 B7H3 리간드에 대한 카운터 수용체 단백질의 종류를 확인하였다. 이는 본 발명의 분석 방법이 미지의 카운터 수용체 후보군 도출을 위한 고속-대량 스크리닝 플랫폼으로 이용 가능함을 나타내는 것이다.Through the analysis method of the present invention, the expression (activation) conditions of the counter receptor on immune cells for the B7H3 ligand under various conditions were confirmed, and further, the type of the counter receptor protein for the B7H3 ligand was confirmed. This indicates that the assay method of the present invention can be used as a high-speed-mass screening platform for deriving unknown counter-receptor candidates.

Claims (15)

(a) 면역 세포를 면역 세포 활성화 조건에서 활성화시키는 단계;
(b) 단계 (a)에서 활성화된 면역 세포와 표적 단백질을 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 표적 단백질과 면역 세포의 결합 여부를 이미징을 통해 확인하는 단계
를 포함하는, 표적 단백질에 대한 면역 세포 활성화 조건의 스크리닝 방법.
(a) activating the immune cells under conditions of activating immune cells;
(b) reacting the immune cells activated in step (a) with the target protein; and
(c) confirming through imaging whether the target protein and immune cells are bound
A screening method of immune cell activation conditions for a target protein, comprising a.
 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 형광 나노 프로브와 컨쥬게이션된 것인, 스크리닝 방법.
The screening method according to claim 1, wherein the target protein is conjugated with a fluorescent nano-probe.
 제2항에 있어서, 상기 형광 나노 프로브는 스트렙타비딘-컨쥬게이션된 비드인 것인, 스크리닝 방법.
The screening method according to claim 2, wherein the fluorescent nanoprobe is a streptavidin-conjugated bead.
 제1항에 있어서, 상기 면역 세포는 대식세포, 자연살해 세포, 또는 T 세포인, 스크리닝 방법.
The screening method according to claim 1, wherein the immune cells are macrophages, natural killer cells, or T cells.
 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 B7H3인, 스크리닝 방법.
The screening method according to claim 1, wherein the target protein is B7H3.
 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 면역 세포를 파이토헤마글루티닌-L (PHA-L), 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA), 이노마이신(inomycin), 및 IL2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 처리하여 활성화시키는 것인, 스크리닝 방법.
The method of claim 1, wherein the immune cells in step (a) are selected from the group consisting of phytohemagglutinin-L (PHA-L), phorbol myristate acetate (PMA), inomycin, and IL2. Activation by treatment with one or more.
 제6항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포 또는 자연살해 세포인 경우 파이토헤마글루티닌-L (PHA-L)로 처리하여 활성화시키는 것인, 스크리닝 방법.
The screening method according to claim 6, wherein when the immune cells are T cells or natural killer cells, they are activated by treatment with phytohemagglutinin-L (PHA-L).
 제6항에 있어서, 상기 면역 세포가 자연살해 세포인 경우 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA), 이노마이신(inomycin), 및 IL2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 처리하여 활성화시키는 것인, 스크리닝 방법.
The screening method according to claim 6, wherein when the immune cells are natural killer cells, they are activated by treatment with one or more selected from the group consisting of phorbol myristate acetate (PMA), inomycin, and IL2. .
 (a) 면역 세포를 활성화시키는 단계;
(b) 단계 (a)에서 활성화된 면역 세포와 표적 단백질을 반응시켜, 상기 표적 단백질과 면역 세포 표면에 발현된 수용체를 결합시키는 단계; 및
(c) 면역 세포 표면에 발현된 수용체를 확인하는 단계
를 포함하는, 면역 세포 표면에 발현된 수용체의 확인 방법.
(a) activating immune cells;
(b) reacting the immune cells activated in step (a) with the target protein, thereby binding the target protein to the receptor expressed on the surface of the immune cell; and
(c) identifying the receptor expressed on the immune cell surface
A method of identifying a receptor expressed on the surface of an immune cell comprising a.
 제9항에 있어서, 단계 (a)의 면역 세포 활성화는 제1항의 방법에 따라 스크리닝된 활성화 조건 하에서 진행되는 것인, 확인 방법.
The method of claim 9 , wherein the activation of immune cells in step (a) proceeds under activation conditions screened according to the method of claim 1 .
 제9항에 있어서, 단계 (b)에서 표적 단백질과 면역 세포 표면에 발현된 수용체는 계내 교차결합(in-situ crosslinking)을 통해 결합되는 것인, 확인 방법.
The method according to claim 9, wherein in step (b), the target protein and the receptor expressed on the surface of the immune cell are bound through in-situ crosslinking.
 제9항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 수용체를 면역블롯팅 또는 질량분석법으로 확인하는 것인, 확인 방법.
The method according to claim 9, wherein the receptor is identified by immunoblotting or mass spectrometry in step (c).
 제9항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 표적 단백질은 비오틴과 결합된 것인, 확인 방법.
The method of claim 9, wherein the target protein in step (b) is bound to biotin.
 제9항에 있어서, 상기 표적 단백질은 B7H3인, 확인 방법.
The method of claim 9 , wherein the target protein is B7H3.
 제14항에 있어서, 상기 수용체는 IL20RA인, 확인 방법.

15. The method of claim 14, wherein the receptor is IL20RA.
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