KR20220144773A - 에멀젼의 독립적인 반응 부피를 변위시키기 위한 미세 유체 칩, 키트 및 시스템 - Google Patents

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리디야 말릭
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Abstract

본 발명은 원심 미세 유체 칩 내에서 에멀젼-분할 독립 반응 부피(IRV)를 열처리하고 이미징을 위해 에멀젼을 단층 프리젠테이션 챔버(pc)로 변위시키기 위한 원심 미세 유체 기술에 관한 것이다. 열처리를 위한 심층 처리 챔버(tc)가 제공되며, IRV를 형성하기 위한 유체역학적 반경을 가지는 노즐은 IRV용 샘플을 조밀한 비혼화성 매질로 채워진 tc에 주입하기 위해 제공된다. tc는 tc 내부의 IRV를 집합적으로 열처리하기 위한 열 제어 요소에 인접하며, IRV는 3d 패킹 배열을 형성한다. tc는 IRV가 붕괴 없이 선택적으로 변위될 수 있는 개구에 의해 프리젠테이션 챔버(pc)에 커플링된다. pc는 pc를 검사하기 위한 파장에 투명한 창에 인접한다.

Description

에멀젼의 독립적인 반응 부피를 변위시키기 위한 미세 유체 칩, 키트 및 시스템{MICROFLUIDIC CHIP, KIT, AND SYSTEM FOR DISPLACING INDEPENDENT REACTION VOLUMES OF AN EMULSION}
본 발명은 일반적으로, 규칙적인 크기의 독립 반응 부피(IRV)의 미세유체 에멀젼을 처리 및 취급하는 것에 관한 것으로, 특히 낮은 비용의 미세유체 칩에서 IRV를 붕괴시키지 않으면서 IRV를 단층에서 이산화, 처리 및 제시하는 기술에 관한 것이다.
코비드-19 대유행(Covid-19 pandemic)은 유전자 테스팅 및 정량화를 위한 저렴하고 이용 가능하며 빠른 샘플-응답 시스템에 대한 필요성을 강조했으며, 이는 특히 본 발명에 의해 해결된다.
에멀젼은 복잡한 샘플을 분석하는데 유용하고 우아하며 효율적인 해결책이다. 이미 적은 양의 샘플 체적을 103 내지 105 개(및 잠재적으로 106 개 이상)의 분리된 독립 반응 부피(IRV)로 나누면 더 적은 교란 반응으로 단순화된 반응이 가능하고 세분화된 샘플의 성분을 평가하기 위한 단순화된 판독 공정이 가능하다. 오일 또는 기타 비혼화성 유체의 얇은 웹으로 분리된 각각의 에멀젼 분할 IRV는 동일한 미세 유체 챔버에서 동시에 처리될 수 있다.
현재 IRV를 활용하는 여러 애플리케이션이 있다. 예를 들어, 디지털 액적 PCR(ddPCR)과 같은 핵산 증폭 분석, 및 등온 디지털 액적 증폭(예를 들어, ddLAMP)에는 유화 PCR 또는 등온 증폭 마스터 믹스(프라이머(primer) 및 프로브(probe)는 물론 증폭 완충액 및 적절한 중합효소 포함)뿐만 아니라, 수천 개의 나노리터 규모의 IRV로 분할된 샘플(즉, 핵산 템플릿(nucleic acid template)을 수반하며, 열 처리(ddPCR의 경우 열 순환, 또는 등온 증폭의 경우 단일 온도 적용) 및 판독(예를 들어, 형광 또는 비색(colorimetric))이 이어진다.
불행히도, 일반 크기의 IRV를 형성하고 조작하는 수단은 기술적으로 다소 관련되어 있으며 IRV 기반 기술을 제한하는 고가의 큰 설치 공간을 필요로 하는 장비를 필요로 한다. 상업용 시스템(예를 들어, Biorad™의 QX 100TM 및 QX 200TM) 또는 맞춤형 연구 등급 장치는 완전한 워크플로(workflow)를 구현할 수 있지만, 전형적으로 (1) 액적 생성, (2) 열 순환을 수행하기 위해서 에멀젼화된 액적을 PCR 튜브로 전달 및 (3) 액적을 PCR 튜브에서 이미징 챔버 또는 액적 판독 채널로 다시 전달(Malic 등의, 2019)하는 수동 단계를 필요로 한다. 이들 수동 단계는 힘들고 에멀젼 무결성 및 분석 반복성을 손상시킬 수 있는 피펫팅 오류가 발생하기 쉽다. 또한, 이들 (대)규모의 샘플 부피는 기술 사용을 더욱 제한한다는 점에 유의해야 한다.
모든 서비스 장비와 마찬가지로 완전한 자동화로 매우 제한된 수의 프로토콜을 수행하는 기능과 제한된 자동화로 더 많은 수의 프로토콜을 수행할 수 있는 능력 사이에는 절충점이 있다. 높은 수준의 자동화를 제공하려면 프로토콜이 투자를 보증할 만큼 충분히 일상적이고 충분히 높은 처리량 공정이어야 한다.
예를 들어, BioRAD의 QX200 ddPCR System™에는 28 x 36 x 13(cm) 크기의 액적 생성기, 및 66 x 52 x 29(cm) 판독기뿐만 아니라, 특정 웰 반응 모듈(particular well reaction module)을 갖는 C1000 Touch Thermal Cycler™ 및 PX1 PCR Plate Sealer™를 필요로 한다. 따라서 로딩은 수동 또는 자동이며 공정을 완료하려면 4 개의 장치 사이에서 웰 플레이트를 섞어야 한다.
Biorad로부터의 QX One Droplet Digital PCR SystemTM과 같은 로봇 시스템이 내장된 정교한 기기는 전체 작업 흐름을 자동화할 수 있으나, 시스템은 상당한 실험실 공간(122 x 66 x 38(cm))을 차지하며 수십만 달러의 비용이 소요된다. 따라서, 일부 연구 실험실의 범위를 벗어난다. 시스템은 마이크로리터 샘플에 대한 응답 기능을 위해 샘플을 수행한다.
다른 상용 플랫폼인 Stilla Technologies™의 Naica System™은 자동화된 유화 및 열 순환을 제공하지만, 별도의 이미징 기기(Madic 등의, 2016)를 필요로 한다. Naica 시스템은 유체 역학 네트워크 내의 가압 챔버를 사용하여 유체의 이동을 지시한다. 이는 정교한 계측 및 압력 제어 시스템을 필요로 하므로, 계측기 및 장치 설계가 더욱 복잡해지고 장비 및 유지보수 비용이 추가된다. 압력 제어 시스템이 최신 기술에서 유사한 효과를 달성하기 위해서 원심 미세 유체에 통합될 수 있는 방법은 제한적이다. 이러한 시스템은 사용자 정의를 제한하는 규정된 단일 액적 크기를 기반으로 한다. 또한, BioRAD와 같은 시스템은 20 ml 샘플 용기를 사용하며 본질적으로 매크로 유체이다.
ddPCR 및 ddLAMP 분석을 위한 열 처리 및 PCR 후 이미징과 액적 생성을 통합하기 위해서 몇 가지 원심 미세 유체 시스템(Schuler 등의, 2016a 및 2016b, Li 등의, 2020, Hu 등의, 2019)이 개발되었다. 원심 미세 유체 시스템은 분석을 소형화하고 시약 소비를 줄여 분석의 전체 비용을 줄이고 유화 전, 처리 중 또는 이미징 후 샘플을 처리하기 위해서 다른 미세 유체 기능을 통합할 수 있으며; 이 모든 것은 펌프 기반 유체 시스템에서 제공하는 것과 같은 폐쇄된 공정 라인을 통해 기능을 확장한다. 일회용 원심 미세 유체 칩은 다양한 공정을 위해서 설계될 수 있으며, 더 적은 양의 시약을 통합하고 더 다양한 프로토콜을 제공한다. 그 전체 내용이 원용에 의해 본 발명에 통합된, WO 2015/132743 호에 의해 청구된 것과 같은 재사용 가능한 칩 컨트롤러 기술(공압식 또는 "P-" 블레이드라고 함)은 칩의 하나 이상의 포트에 주소지정 가능한 가압 유체 공급을 제공하며, 모든 오염 물질을 칩에 국한시키면서 칩의 처리 기능을 더욱 확장할 수 있다. 원심 미세유체 장치는 하나의 프로토콜만 수행할 수 있는 특수 목적용 기계와는 달리, 칩 구조, 로딩된 내용물, 및 일부 주변 장치(예를 들어, 이미징 및 열 제어용)에 따라서 매우 다양한 프로토콜을 제공하는데 사용할 수 있는 범용 장치이다.
원심 미세 유체 칩에 대한 몇 가지를 포함하여 입증된 IRV 생산을 위한 몇 가지 미세 유체 전략(Clime 등의. 2020, Schuler 등의 2015)이 있다. 원심 분리기는 자연적으로 IRV를 형성하는데 적합하지만 많은 처리 중에 IRV를 유지하는 것은 IRV를 분리하는 오일 웹의 취약성과 액적에 대한 응력에 달려 있다. 예를 들어, Schuler 2016에서 언급한 것처럼 액체의 기체 용해도는 온도가 상승함에 따라 감소하므로, 샘플을 95 ℃로 가열하는 동안 방출되는 기체의 양은 최소 18 v/v%가 될 수 있다. 원심 환경에서 가스 기포는 오일 웹을 파괴하고 IRV를 병합할 수 있다.
액적 생성, 열 처리 및 단층 생성을 포함하는 완전한 프로토콜의 자동화는 미세유체 환경에서 여전히 어렵다. 이는 주로 열처리 중 IRV 안정성을 제어하기 어렵고 이미징을 위한 IRV 단층 형성에 대한 요구 사항 때문이다. 이는 더 낮은 온도(예를 들어, RPA의 경우 37 ℃, LAMP의 경우 65 ℃)에서 등온 증폭의 경우 문제가 되지 않을 수 있지만, 단층으로 단단히 포장된 IRV(액적 이미징에 필요)는 전형적으로, IRV 병합, 분석에서 오류 유도, 및 샘플링의 균일성과 효율성의 감소 없이 PCR 열 순환 분석에 필요한 것과 같이 상승된 온도(예를 들어, 95 ℃)에서 열 처리를 견딜 수 없다.
또한, 문헌에 설명된 대부분의 장치는 PDMS(실록산)를 사용하여 제조된다. PDMS는 학술 연구에서 자주 사용되며 투명성과 생체 적합성이 우수한 반면에, 이러한 소재는 규모가 있는 제조와 양립할 수 없으며 폴리스티렌(PS) 및 고리형 올레핀 공중합체와 같은 생체 적합성 경질 열가소성 수지가 선호되는 산업(예를 들어, 제약 및 임상 연구)에서는 거의 사용되지 않는다. PDMS는 단백질과 소분자를 흡착하여 최종 분석 결과를 편향시킬 수 있으며, 가스 투과성은 시간이 지남에 따라서 샘플 증발로 이어질 수 있으며, 이는 열 순환 중에 특히 문제가 된다.
Schuler 등에 의해 설명된 원심 카트리지가 단일 플랫폼에서 완전한 워크플로 통합을 허용하지만, 이러한 장치는 액적 생성, 열 순환 및 IRV 판독을 위한 단일 챔버로 구성되어 있으며, 이미징에 필요한 IRV 단층 형성뿐만 아니라 기포 제거를 허용하기 위해서 챔버 바닥 내에서 정의된 경사각으로 복잡한 피라미드 구조를 제작해야 한다. 이는 장치 제조의 복잡성을 증가시키고 단층 형성을 위한 제한된 표면적만을 제공한다. 이미징 챔버에서 500 개의 IRV만이 판독되었으며, 이는 대부분의 분석에 필요한 최소값보다 10 배 낮은 수치이다.
따라서 IRV 생성, 치료 및 이미징을 위한 원심 미세유체 칩, 장치 및 기술, 특히 소형, 조작자 친화적, 견고하고 정밀한 시스템; 및 열가소성 수지 및 열가소성 엘라스토머와 같은 대량 제조 기술과 호환되는 재료로 제조된 칩이 필요하다.
출원인은 저비용으로 만들 수 있고 휴대형으로 만들 수 있는, 낮은 설치 공간, 낮은 전력 소비, 원심 미세 유체 시스템에 대해 응답하기 위한 완전한 프로토콜 샘플을 창안했다. 시스템은 30 x 30 x 30(cm) 미만의 설치 공간을 가질 수 있으며; 신뢰성 있게 분배될 수 있는 다양한 미세 유체 샘플 부피에서 작동할 수 있으며; 보다 완전한 자동화에 적합하다. 이러한 시스템은 기본적으로 적절하게 공급되고 로드된 칩이 있는 범용 원심 미세 유체 장치로 구성된다. 범용 원심 미세 유체 장치는 특히, 원심 미세 유체 장치에 제어된 압력 공급 포트가 장착되어 P-블레이드 플랫폼이 되거나 적어도 공압 슬립 링 또는 칩의 하나 이상의 포트에서 공급되는 압력에 대한 고정자 기반 제어를 위한 가압 유체 전달을 위한 회전 커플링이 있는 경우에 다수의 대안적인 목적에 사용될 수 있다.
적합하게 제공된 칩은 챔버의 네트워크, 및 처리 챔버(tc); 프레젠테이션 챔버(pc); 샘플을 tc로 전달하기 위한 샘플 경로; 및 수축 챔버(rc)를 pc에 커플링하는 수축 경로를 포함하는 상호 연결 채널을 가진다. 네트워크는 적어도 한 면에서 (적어도 하나의)기판의 릴리프 패터닝, 및 다른 기판 또는 단순 커버로 릴리프 패터닝된 표면의 밀봉된 커버링에 의해 제공된다. 칩은 검사 투명한 창이 있어, 커버 또는 기판을 통해, 바람직하게 기판 및 커버의 여러 층을 통하지 않고 길이와 폭에 걸쳐 pc를 이미징할 수 있다. 창은 실질적으로 전체 커버 또는 기판일 수 있으며, 차등화되고 표시가 없을 수 있으므로 시야에서 네트워크의 임의의 부분을 효과적으로 이미징할 수 있다.
적합하게 준비된 칩은 tc의 입구에 있는 하나 이상의 노즐일 수 있는, 샘플 및 비혼화성 유체로부터 IRV를 생성하기 위한 샘플 경로의 노즐; 3D 격자 또는 2D 패킹보다 실질적으로 더 견고한 패킹에 있는 동안 IRV의 처리를 허용하는 비교적 깊은 tc; 단층 이미징을 위한 얕은 pc; 및 IRV를 그대로 전달하기 위해서 pc와 tc 사이의 낮은 저항의 개구를 가진다. 특히, 노즐은 혼합되지 않는 유체로 둘러싸인 에멀젼 분할 IRV로서 이산화된 tc에 샘플을 전달하도록 적응된, 2 내지 120 μm의 유체역학적 반경(rn)을 가진다.
tc는 가장 큰 범위로 tc와 교차하는 칩의 의도된 회전 축으로부터의 광선에 의해 정의되고 평균 길이(ltc); ltc에 수직인 칩 평면의 평균 폭(wtc); 및 lpc,wpc,dtc,lo,wo,do로 각각 표시된 pc 및 개구와 같이 릴리프 방향의 평균 깊이(dtc)를 가진다. 당업자에 의해 예상되는 바와 같이, dtc < ltc, dtc < wtc, dpc < lpc, dpc < wpc 및 do < wo이다. tc(vtc)의 부피는 전형적으로, 애플리케이션에 따라 10 내지 800 μL이지만, 더 작은 규칙적인 반경(rIRV)을 가진 IRV를 정의하기 위해 노즐의 정확도가 증가함에 따라 추가 감소가 예상된다. 에멀젼이 처리를 견딜 수 있도록 하기 위해서 dtc는 5 x rn 내지 2 mm이다. 단층을 제시하기 위해서, dpc는 1.2 x rn 내지 7 x rn, 더 바람직하게 1.6 x rn 내지 6 x rn 및 dtc > 2 dpc, 더 바람직하게 dtc > 3 dpc, 또는 dtc > 5 dpc이다. 따라서 dpc는 1.5 x rIRV 내지 3 x rIRV, 더 바람직하게 1.6 x rIRV 내지 2.8 x rIRV, 또는 1.8 x rIRV 내지 2.5 x rIRV일 수 있다.
개구는 8 x rn보다 큰 최소 유체역학적 반경과 평면 또는 점진적인 호를 가질 수 있는 매끄러운 주변 벽을 가지고 있다. 일반적으로, 둘레로서 매끄러운 원통형 벽에 가까울수록, 단면적에 대한 최소화된 둘레에 가까울수록 이를 통해 흐르는 저항이 적고 IRV가 노출되는 전단 응력이 가장 적다. 슬릿의 평평하고 매끄러운 벽이 충분히 발견되었다.
pc는 이미징을 위해 최소한 1 x 3(cm)의 넓은 설치 공간 영역을 가질 수 있다. 최소 1000 개의 IRV(일부 분석에서는 최소 5000 개가 필요하고 다른 분석에서는 최소 10 내지 12K가 필요함) 및 tc의 0.6 내지 2배의 부피를 가질 수 있으므로 전체 에멀젼이 한번에 이미지화될 수 있다. 대안으로, pc는 더 작은 설치 공간 영역을 가질 수 있고 IRV의 직렬 이미징을 허용하여 칩의 공간을 절약하고 섬세한 IRV를 더 먼 거리로 운송할 필요성을 제거할 수 있다. pc는 IRV 조립체의 이미징을 위한 창과 정렬된다.
pc 이외의 모든 채널과 챔버의 깊이는 같을 수 있다. 이는 칩 설계 및 제작에 편리하고 칩의 설치 공간을 효율적으로 사용할 수 있기 때문이다. dpc가 설치 공간 영역에 비해 충분히 작을 수 있기 때문에 필름과 커버는 칩 외부와 pc 내부의 예상 압력 차이 범위에 걸쳐 만족스럽게 일정한 작업 깊이를 보장하는데 충분하지 않을 수 있다. 칩 내부의 기둥 어레이 및/또는 외부 구조로 칩을 강화하는 것은 주지되어 있다. 강화의 필요성은 dpc 증가; pc와 주변 사이의 압력 차이 감소; pc의 설치 공간 감소에 따라 감소한다. 모든 IRV가 pc에서 한 번에 이미지화되기를 원하는 경우 이들 중 어느 것도 축소할 수 없다. 그렇다면, 기둥 또는 기타 지지 구조를 사용하여 dpc가 매개변수 내에서 유지되도록 pc를 지원할 수 있다.
대안적으로, pc에서 IRV의 작은 부분에 대한 이미징을 즉시 제공할 수 있지만, 오히려 pc 전체에 걸쳐 IRV를 퍼레이드한다. 그렇다면, 보강을 피할 수 있고 폭의 1/5 이하인 길이(축 방향으로부터 반경)와 같이 더 극단적인 종횡비가 제공될 수 있다. 복수의 연속적인 사진에서 색상 변화의 측정은 사진 사이의 타이밍이 이동 속도에 비해 너무 긴 경우, 카운트 정확도와 관련하여 몇 가지 문제가 발생하지만, IRV의 모션은 저렴하고 이미지가 상당히 겹치는 낮은 셔터 속도의 이미징을 허용할 만큼 충분히 느리기 때문에, 여러 이미지를 촬영하고 각각의 IRV에 등록할 수 있다. 또한, 통계적 목적이나 테스트 기록을 위해서 훨씬 더 작은 프레임 속도 캡처가 사용될 수 있다. 사진을 순서대로 분석하면 불완전하거나 의도적으로 변화된 시공간 조명 패턴에 대해 더 높은 정확도의 평가를 제공할 수도 있으며; 예를 들어, 일부 IRV 색상 상태는 일부 조명 대역에서 더 나은 대비를 나타내고 다른 대역에서는 더 나은 대비를 나타낼 수 있다.
wpc를 높이면 프레임당 더 많은 IRV가 이미징되고 최소 lpc는 이미징 체계에 의해 결정된다. IRV의 80%가 한 번만 이미지화되고 10% 중첩이 다중 이미지 IRV를 식별하는데 충분하면 10%는 10행 pc의 전체 맨 아래 행이 될 수 있으며, 이 경우 lpc는 20 x rIRV일 수 있다. 개구를 가로질러 깊이의 경사 또는 계단식 감소를 제공하고 tc로부터의 거리에 따라 폭을 증가시킴으로써, 에멀젼에 대한 전단 변형은 tc 및 pc의 깊이에 필요한 차이와 프리젠테이션을 위한 단층 포맷에 적응하는데 필요한 IRV 재배열 정도를 감안할 때 감소될 수 있다.
tc 치수, 특히 dtc 칩은 중유(즉, 샘플보다 밀도가 높음)와 같은 적절한 매질에 완전히 둘러싸여 있을 때 IRV의 붕괴가 관찰되지 않고 최소 99 ℃의 온도로 열 순환을 허용할 수 있다. 시스템은 바람직하게, 히터 또는 다른 에너지 전달 장치(예를 들어, 초음파, 음향, 전자기 또는 열)와 칩의 긴밀한 접촉을 위해 설계되고, 바람직하게 tc와 장치를 부분적으로 정의하는 기판 또는 커버 사이의 긴밀한 접촉을 제공한다.
원심 미세유체 시스템을 사용하면 에멀젼 분할 독립 반응 부피(IRV)의 유전자 테스트와 같은 샘플 대 응답 테스트가 가능하다. 대부분의 선행 기술 참고문헌은 IRV를 "액적"으로 언급하는데, 이 용어는 설명이 아닌 것처럼 보일 수 있고 목적론적 특성이 부족하고 전체 샘플이 액적의 부피일 수 있다는 점에서 불명확하다. 특히, 본 발명은 전형적으로 많은 분석에 필수적인 그들의 합체(coalescing)를 초래하는 경향이 있는 IRV의 처리를 피하거나, 매우 제한된 표면적 단층 IRV pc를 제공해야 하는 문제를 해결하는데, 이는 미세 유체 챔버에서 IRV 앙상블(ensemble)을 이동하는 것이 IRV를 붕괴시키는 것으로 관찰되었기 때문이다.
출원인은 실패한 IRV 앙상블을 대체하기 위해서 많은 시도를 했다. 본 발명은 IRV 앙상블을 원심분리하는 동안 IRV를 붕괴시키지 않으면서 높은 깊이(tc)에서 단층 깊이(pc)로 큰 앙상블이라 할지라도 이동함으로써 이러한 문제를 해결한다. 결과적으로, 원심 미세유체 시스템, 특히 P-블레이드 특허에 설명된 것과 같은 공압 보조 원심 미세유체 시스템은 IRV의 생산, 처리 및 표시에 활용될 수 있다.
출원인은 tc와 pc 사이의 올바른 경계면과 칩의 해당 포트에 충분히 낮은 압력을 가하여 변위를 구동하면 에멀젼이 실질적인 손실 없이 변위될 수 있음을 발견했다. 전례 없는 수의 IRV가 원심 미세 유체 시스템에서 이미지화되었으며: 샘플이 칩에 로드되고 칩이 칩 컨트롤러에 연결되면 시스템이 자동으로 실행된다. 적합하게 제어된 압력이 가해지면 pc와 tc 사이의 적절한 개구는 변위를 허용한다.
비-공압식(즉, 고전적인) 원심 미세유체에 비해 P-블레이드 플랫폼 사용의 한 가지 장점은 출원인이 “Bouyancy-driven step emulsification on pneumatic centrifugal microfluidic platform” Lab on Chip 2020, 20, 3091, June 22, 2020라는 제목의 논문에서 설명한 대로 원심분리 속도와 적용된 압력을 모두 변경하여 IRV의 치수를 정밀하게 제어할 수 있다는 점이다. 구체적으로, 이 논문은 300 내지 700 rpm의 원심분리 변화와 대기보다 높은 0 내지 40 kPa의 압력을 가하여 IRV 직경이 50 μm 이상 변할 수 있는 칩 배열을 보여준다. 이 논문의 전체 내용과 이에 대한 모든 보충 설명은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
따라서, 원심분리 미세유체 칩은 축을 중심으로 회전하기 위해 원심분리기에 장착하도록 제공되며, 칩은 챔버 네트워크를 포함하고 채널을 상호 연결하며: 챔버는: 10 내지 800 μL의 부피(vtc), 및 dtc < ltc 및 dtc < wtc인 평균 길이(ltc), 평균 폭(wtc) 및 평균 깊이(dtc)를 갖는 처리 챔버(tc); 샘플을 tc로 전달하기 위한 제 1 경로로서, 노즐이 적합한 매질로 채워져 있는 경우 에멀젼 분할 독립 반응 부피(IRV)로서, 이산화된 tc로 샘플을 전달하도록 구성된, 2 내지 120 μm인 유체역학적 반경(rn)을 갖는 노즐을 포함하는, 제 1 경로; IRV가 tc로부터 pc로 선택적으로 변위될 수 있는 개구에 의해서 tc에 커플링된 프리젠테이션 챔버(pc); 적어도 pc의 길이와 폭에 걸쳐 칩을 통해 제공된, pc를 검사하기 위한 투명한 창; 및 pc에 대한 제 2 경로에 의해 커플링된 수축 챔버(rc)를 포함하며; dtc는 5 x rn 내지 2 mm이며; pc는 1.2 x rn 내지 7 x rn의 두께(dpc)를 가지며; dtc > 2 dpc; 개구를 통한 유동 경로는 8 x rn보다 큰 최소 유체역학적 반경을 가진다.
pc는 0.6 내지 1.2 vtc의 부피(vpc)를 가질 수 있으며, 설치 공간은 칩 설치 공간의 3 cm2 내지 80%이다. 챔버 및 채널의 네트워크는 20 ㎛ 내지 5 mm의 공칭 두께를 갖는 제 1 필름의 적어도 제 1 면에 양각으로 생성될 수 있고, 칩은 챔버를 둘러싸기 위해 제 1 면을 덮는 커버 필름을 포함할 수 있고, 채널, 칩 포트에서 멀리 떨어져 있다. pc는 주변에 대한 pc 내의 압력에도 불구하고 dpc가 명목상 유지되도록 하는 지지 미세구조의 어레이를 포함할 수 있다.
노즐은 tc에 대한 제 1 경로의 입구에 위치할 수 있다. 제 1 경로는 노즐의 하나 이상의 추가 사례를 제공하기 위해 분기될 수 있다.
tc와 pc 사이의 개구는 바람직하게 길이보다 넓다. 개구는 dtc로부터 dpc로의 깊이가 변하는 램프, 또는 dtc로부터 dpc로의 중간 깊이의 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 램프는 30° 내지 75°의 기울기를 가질 수 있다.
칩은 2 개 이상의 필름의 스택을 포함할 수 있으며, 필름 중 적어도 하나는 네트워크를 정의하는 릴리프 구조를 가지며, 여기서 각각의 필름은 20 ㎛ 내지 3 mm의 공칭 두께를 가지며; 각각의 필름은 실록산 이외의 경화되거나 고화된 고분자 화합물로 구성되며; 칩의 두께는 0.1 내지 12 mm이다. 칩의 평면 범위는 3 내지 25 cm이거나, 칩은 적어도 2 개의 포트를 가진다.
제 1 또는 제 2 경로는 부피 제어 전달을 위해 오버플로 챔버가 있는 계량 챔버를 포함할 수 있다.
칩은: 제 1 경로 내의 제 1 챔버에서 건조 또는 액체 형태의 PCR 믹스와 같은 샘플 준비 반응 믹스; 제 1 경로 내의 제 2 챔버에 있는 건조 또는 액체 형태의 샘플; 제 1 경로 내에서 샘플 또는 반응 혼합물을 용해 또는 현탁시키기 위한 완충제, 용매 또는 액체; 미세 유체 시스템을 형성하기 위해 tc, pc 또는 dc 내에 로딩된 IRC를 지원하도록 구성된 분산 매질 중 하나 이상이 로딩될 수 있다. 시스템은 칩의 챔버에 저밀도 매질을 더 포함할 수 있으며, 저밀도 매질은 tc의 축 방향-근위 단부에서 tc와 만나는 제3 경로에 의해 tc에 커플링되며, 저밀도 매질 챔버는 샘플, 완충액, 용매 또는 액체, 및 분산 매질보다 밀도가 낮은 액체로 로딩된다.
칩은 카트리지에 포함될 수 있으며, 카트리지는 조작 및 등록을 용이하게 하는 강성 구조를 가지면서 칩의 포트에 대한 액세스를 제공하고 칩의 통기구가 막히는 것을 방지한다.
칩은 칩 컨트롤러가 장착된 키트로 제공되거나 원심분리기에 장착되어 칩과 컨트롤러 모두의 회전을 위해 제공될 수 있으며, 칩 컨트롤러는 pc 내의 유체를 원심 분리 중에 dc로 선택적으로 대체하기 위한 오프칩 흐름 제어 장치를 포함한다. 흐름 제어 장치는 칩의 포트에 커플링하기 위한 가압 유체 공급 라인을 포함할 수 있다. 칩 컨트롤러는 그 일측 상에서 칩을 지지하도록 치수가 정해진 칩 고정 표면을 포함할 수 있으며, 칩 고정 표면은 칩의 처리 챔버를 에너지 장에 선택적으로 노출시키기 위한 에너지 장치를 포함한다. 에너지 장은 치료 챔버에 인접한 칩과 접촉하는 초음파 변환기 또는 전자기장 발생기에 의해 구동되는 열 에너지 소스 또는 싱크일 수 있다. 원심분리 중 또는 칩이 정지해 있을 때 pc를 이미징하기 위한 조명 및 이미징 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 원심 미세유체 시스템을 형성하도록 조립될 수 있다.
에멀젼 분할 반응 부피(IRV)를 공동 처리하고 이를 단층으로 제공하는 방법이 또한, 제공되며, 이 방법은 원심 미세유체 칩의 처리 챔버(tc)에 IRV를 제공하는 단계; 칩이 원심분리되는 동안 원심분리기에 칩이 장착된 에너지 장치를 활성화하여 tc 내의 IRV에 에너지 처리를 적용하는 단계로서, tc가 3 내지 100 개의 IRV를 수용하는 최소 치수를 가지는, 단계; 및 IRV를 실질적인 단층으로 배열하기 위해서 IRV의 평균 직경 및 pc의 깊이보다 큰 폭을 갖는 개구를 통해 tc로부터 프리젠테이션 챔버(pc)로 IRV를 변위시키도록 흐름 제어 장치를 작동시키는 단계로서, 흐름 제어 장치가 15 kPa 미만의 압력차를 적용하는, 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 특징은 다음의 상세한 설명 과정에서 설명되거나 자명해질 것이다.
본 발명을 보다 명확하게 이해하기 위해서, 본 발명의 실시예가 이제, 첨부 도면을 참조하여 예로서 상세하게 설명될 것이며,
도 1은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 원심 미세유체 칩용 패턴 기판의 개략적인 평면도이며;
도 1a는 일반적으로 tc로부터 pc로의 출구를 제공하는 벽을 특징으로 하는 커버 및 노즐을 가지는 도 1의 칩의 부분 단면도이며;
도 1b은 IRV를 형성하고, 이를 처리하고, 도 1의 칩을 사용하여 이를 tc로 변위시키는 공정의 6 단계를 도시하는 스트립이며;
도 2는 더 작은 pc를 가지는, 본 발명의 제 2 실시예에 따른 칩용 패턴화된 기판의 개략적인 평면도이며;
도 2a는 tc와 pc 사이의 개구의 깊이 전이를 도시하는 도 2의 칩의 부분 단면도이며;
도 2b는 IRV를 형성, 처리 및 제공하는 공정의 4 단계에서 도 2의 확대도를 도시하는 스트립이며;
도 3은 IRV를 형성하기 위해서 IRV가 형성되고 노즐로부터 분리되는 방법을 12 단계로 예시하는 스트립이며;
도 4는 완전한 ddPCR 프로토콜을 제공하기 위한 추가 챔버를 가지는, 본 발명의 제 3 실시예에 따른 칩용 패턴화된 기판의 개략적인 평면도이며;
도 5는 제 4 칩 실시예가 장착되는 칩 컨트롤러를 포함하는 시스템의 개략도이며;
도 5a 및 도 5b는 각각 칩의 확대도, 그리고 tc와 만나는 노즐 어레이 및 pc의 지지 미세구조 어레이의 확대도를 제공하며;
도 6은 본 발명을 설명하기 위해서 사용된 칩의 사진이며;
도 7은 원심분리 중에 획득한 프리젠테이션 챔버의 사진이며;
도 7a는 이미지의 작은 영역의 확대도이며;
도 8은 본 발명을 설명하기 위해 만들어진 예를 사용하여 생성된 앙상블의 IRV 직경 분포를 보여주는 막대 차트이다.
여기에서, 에멀젼 분할 독립 반응 부피(IRV)의 유전자 검사와 같은 샘플 대 응답 테스트를 허용하는 원심 미세 유체 기술(칩, 카트리지, 키트, 시스템 및 방법 포함)이 설명된다. 구체적으로, 미세유체 시스템을 형성하기 위한 유체가 로딩된 칩, 칩을 지지하고 원심분리기 또는 칩 컨트롤러에 대한 장착을 용이하게 하는 카트리지, 칩과 칩 컨트롤러가 있는 키트, 및 원심 미세유체 장치를 형성하기 위한 조립 키트는 IRV가 열 처리에 대해 훨씬 더 탄력적으로 만드는 3D 배열에 있도록 보장하는데 필요한 깊이를 갖는 처리 챔버(tc)로부터 IRV 어레이를 이미징용 단층 깊이 프리젠테이션 챔버(pc)로 변위시키는 방법의 문제를 해결하며; 변위는 IRV 분할의 파괴를 덜 또는 실질적으로 덜 유도한다.
원심 미세유체 시스템, 특히 원심분리 동안 칩의 하나 이상의 포트에서 압력 제어를 허용하는, 본 발명에서 확인된 종래 기술의 회전 커플러/공압 슬립 링을 포함하는 앞서 언급한 WO 2015/132743 호에 설명된 것과 같은 공압 보조 원심 미세유체 시스템은 과도한 분산 매체가 수축 챔버(rc)로 떨어지는, 분산 매질 및 IRV를 tc로부터 pc로의 변위를 허용하도록 협력하는 제어된 압력 및 원심 필드를 공급할 수 있다.
도 1은 본 발명의 단순화된 실시예를 제공하는, 칩의 패턴화된 필름(10)의 개략도이다. 칩은 필름(10) 및 적합한 커버에 의해 형성되며, 커버는 필름(10) 측면의 릴리프 패턴으로 정의된 미세유체 네트워크의 관찰을 허용하도록 도시되지 않는다. 릴리프 패턴은 본 발명의 방법, 그 이상을 허용하는 네트워크를 제공한다. 더 복잡한 프로토콜은 더 많은 챔버와 채널을 요구하며, 여기에는 여러 개의 상호 연결된 필름이 필요할 수 있다. 더 복잡한 프로토콜을 수용하기 위해서 층을 상호 연결하기 위한 비아가 있는 층의 스택으로서 칩을 제공하는 것이 공지되어 있다. 대안적으로, 동등하게, 필름(10)은 예를 들어 샘플이 준비되는 칩의 다른 층으로부터 비아로 취해진 샘플 포트(12a)를 갖는 다층 칩의 단일 층인 것으로 이해될 수 있다.
전형적으로 챔버는 통기되며, 이는 챔버에 커플링된 각각의 통기구(12) 유체가 있음을 의미한다. 특히 챔버가 프로토콜 시작 시 내부에 각각의 액체가 로딩되도록 설계된 경우 통기구가 로드 포트 역할을 할 수 있다. 일반적으로 사용되는 용어인 '포트'는 칩의 분위기에 대한 모든 개구인 반면에, 통기구, 비아, 로딩 포트 또는 압력 제어/압력 공급 포트는 포트에 대해 의도된 기능을 지정하며: 통기구는 갇히지 않고(고정 부피의 공기 플러그를 압축하거나 확장하는) 챔버에서 유체 수위를 상승(축을 근위로 이동)하거나 하강(축을 말단으로 이동)하게 하며; 비아는 관통 홀과 다른 칩 층으로 연통하며; 로딩 포트는 챔버 내로 액체의 도입을 허용하는 포트이다(이것은 앞서 언급한 WO 2015/132743에 설명된 바와 같이 원심분리 중 오프 칩 로딩을 위한 일부 공정이 있지만 칩이 정지해 있는 동안 종종 수행된다). 압력 제어 포트는 슬립 링(유체 결합 회전 조인트)을 통해 칩에 연결될 수 있는 압력 공급 장치에 커플링되거나 펌프 공급(장착)될 수 있는 칩 컨트롤러의 압력 공급 챔버에 커플링될 수 있거나, 슬립 링을 통해 공급되지 않는 경우 가압된 캐니스터에 커플링될 수 있다. 어떤 경우에는 가압된 유체 공급이 주변 압력일 수 있으며; 밸브가 열리기 전에 챔버는 예를 들어, 네트워크 내의 공기 플러그를 고려하여 양압 또는 음압 상태에 있을 수 있으며, 밸브를 열면 이러한 압력을 방출할 수 있다. 동등하게, 열린 밸브를 닫으면 원심분리의 결과로 양압 또는 음압을 유발할 수 있다. 전형적으로, 압력은 기체를 통해 공급되지만 원칙적으로 액체를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 칩은 처리 챔버(tc)(15), 제공 챔버(pc)(20) 및 수축 챔버(rc)(25)를 포함하지만, 도시된 바와 같이 배열될 필요는 없다. 챔버는 하나 이상의 채널 및 가능하다면 추가 챔버를 포함하는 채널 및 경로에 의해 상호 연결된다. 구체적으로, 샘플을 tc(15)로 전달하기 위한 전달 경로가 제공되고, pc(20)와 rc(25) 사이에 수축 경로가 제공되어 유체가 pc(20) 내로 분배되고 그로부터 회수될 수 있다.
도 1에 도시된 전달 경로는 포트(12c)를 통해 통기되는 오버플로 챔버(13)에 출구를 갖는 샘플 챔버(14)를 공급하는 샘플 포트(12a)를 포함한다. 샘플 포트(12a)는 샘플 로딩을 용이하게 하기 위해서 다른 포트에 비해 확장된다. 예를 들어, 칩은 예를 들어, 정렬 및 자동 주입을 위한 기계(통기구(12b 또는 12d)에서 매질에 대해 수행될 수 있음), 및 사용자가 주입한 샘플 또는 기타 유체를 수동으로 공급하기 위한 커다란 로딩 포트에 의해서 제어된 환경에서 시약 로딩을 위해 더 작은 로딩 포트를 갖는 것이 논리적이다.
샘플 챔버(14)에 출구를 제공함으로써, 샘플 부피의 정확한 사전 정량화 없이 샘플의 볼륨은 원하는 볼륨을 초과하여 도입될 수 있다. 일단 원심분리가 적용되면 초과 부피는 샘플 챔버(14)를 넘을 것이고, 샘플 챔버(14)의 나머지는 어느 정도 정밀하게 효율적으로 계량될 것이다.
샘플 챔버(14)는 J-형 채널(16)을 통해 샘플 전달을 위해 처리 챔버(15)에 커플링된다. 압력 제어 포트(12a)를 제외하고는 본 실시예에서 도시되지 않았지만, 전달을 중지 또는 시작하고/하거나 샘플의 전달 속도를 제어하기 위한 흐름 제어 장치를 제공하는 것이 어떤 면에서 바람직하다. 원칙적으로, 노즐(18)은 전달 경로 내의 다른 위치에서 공급될 수 있지만, J 채널(16)은 노즐(18)에서 tc(15)와 만난다. 예를 들어, 출원인의 US 10,836,918 호 및 인용된 종래 기술 참고문헌은 캡슐화된 액적의 인라인 생산을 위한 미세유체 구조를 교시한다. 인라인 생산은 IRV를 전달 경로 위로 추가로 생성하는데 사용할 수 있으며, 다른 IRV는 다른 방식으로 tc(15)에 들어가기 전에 다른 처리를 받을 수 있다.
노즐(18)은 칩의 의도된 IRV 크기의 가장 결정적인 단일 특징인 유체역학적 반경(rn)을 가진다. 전형적인 원심분리 속도 및 압력의 경우, IRV의 평균 반경(rIRV)은 rn의 1 배 내지 5 배이고 더 전형적으로 약 1.1 내지 3.5 rn 또는 1.2 내지 2.8 rn이다. IRV는 칩 자체의 일부가 아니므로(시스템의 일부일 수 있음) rn은 칩 청구항을 특징화하는데 사용된다.
따라서 노즐(18)은 tc가 오일과 같은 더 조밀하고 비혼화성 유체로 부분적으로 채워질 때 IRV로 나누어 샘플을 tc(15)에 분배하도록 구성된다. tc는 통기되고(12b) IRV의 에멀젼을 수용하기 위한 부피를 제공한다. 최적의 경우, 매체는 tc에서 샘플 챔버(14)에 의해 측정된 부피를 뺀 값을 채우고 이를 표시하기 위해 기판이나 커버에 충전 라인이 있을 수 있다.
tc(dtc)의 깊이는 바람직하게, 칩이 설계된 IRV(rIRV)의 평균 반경의 5 배 이상이지만 원칙적으로 rIRV의 3.5 배만큼 작아도 여전히 IRV를 3D 패킹 격자에 분산시키는 기능을 할 수 있다. pc는 1.3 내지 3.2 rIRV, 보다 바람직하게는 1.6 내지 2.5 rIRV, 또는 1.8 내지 2.3 rIRV의 깊이(dpc)를 가진다. rIRV 대신에 rn과 관련하여 이해되지만, dpc는 외부 범위로 1.3 내지 15 rn이고 가장 바람직한 범위로 2.16 내지 8.05 rn이지만, 본 발명에서 모든 범위의 모든 중간 범위가 의도된다. rIRV는 30 내지 150 μm, 더 전형적으로 40 내지 110 μm, 현재 전형적으로 50 내지 100 μm 범위일 수 있으므로, 단층 배열을 촉진하기 위해 dpc는 48 내지 450 μm 내지 95 내지 230 μm이며, 본 발명에서 모든 중간 범위가 의도된다. 기술의 발전으로, 더 작은 IRV가 예상되어 더 작은 rn 및 dpc가 필요하다.
tc와 pc 사이의 개구(22)는 램프(23)를 갖는 dtc와 dpc 사이의 깊이 변화를 수용하는 슬릿이며, 이는 도 1 및 도 1a를 참조하여 가장 잘 이해된다.
도 1a는 필름(10) 및 커버 층(11)을 포함하는 칩의 AA 선으로부터의 부분 단면도를 도시한다. 이 도면은 상단 에지에 있는 노즐(18)과 tc(15)와 pc(20) 사이에서 연장하는 개구(22)의 깊이 변화를 모두 보여주는 tc의 축-원위 벽을 특징으로 한다. 구체적으로, 대략 0.3 dtc의 깊이에서 dpc로 연장하는 부드러운 램프(23)가 도시된다. dpc는 대략 ¼ dtc로 표시되지만, 대부분의 애플리케이션에서는 1/5 내지 1/10 dtc의 비율이 더 바람직할 수 있다. rIRV가 작을수록 dpc가 작아지지만 반드시 dtc는 아니다. 램프는 도시된 바와 같이 0.3 dtc보다 낮거나 높게 시작될 수 있으며, 램프가 쉽게 형성되지 않는 경우 하나 또는 바람직하게는 더 많은 단계가 제공될 수 있음을 이해할 수 있다. 상이한 깊이에서의 IRV의 밀도는 개구(22)로부터 tc의 거리에 의존할 수 있다. 커버가 위를 향하는 경우, 매질이 충분히 조밀하다면, 개구(22)에서의 IRV의 밀도는 중력으로 인해 램프(23)의 바닥 에지 미만(0.3 dtc)으로 더 낮을 수 있다. 출원인은 양호한 작동을 위해 램프가 필요하지 않다는 것을 발견했다.
도 1로부터, 램프(23)의 진행은 tc(15)에서 개구 폭의 약 15%인 것으로 볼 수 있고, 개구는 약 38°의 각도로 tc로부터 pc로 플레어(flare) 형상이 된다. 그 때문에, 개구는 한 방향으로 계속 확장되고 다른 방향에서는 수축한다. 폭 방향의 팽창에 의한 깊이 방향의 높은 수축 정도에 대한 부분 보상은 개구(22)를 가로질러 변위하는 동안 IRV에 대한 전단 응력을 감소시킨다. 3D 패킹에서 프리젠테이션 단층을 채택하는데 필요한 IRV의 실질적인 재구성은 원심분리 속도에 대한 적당한 제어 및 칩 포트에서 공칭 압력차의 적용으로 개구의 엔지니어링을 통해 수행될 수 있다. IRV가 이러한 게이트를 그대로 통과하면서 포트(12)에 의해 적용된 공압 공급 장치에 의해 앞으로 추진될 수 있다는 것은 예상치 못한 결과이다.
수축 경로는 rc(25)와 pc(20)의 축 방향 단부를 커플링하는 채널(19), 및 pc와 rc 사이의 제어된 유체 변위를 허용하는 가압 포트(12d)를 포함한다. 포트(12d)는 에지 포트로 도시되며, 이는 칩 조립 및 압력 공급 포트에 대한 밀봉 커플링을 위한 마운팅에 장점을 가질 수 있다. 예를 들어, 모든 포트가 에지 포트인 경우, 최소한의 장비 및 적절한 밀봉으로 약간의 장력을 갖는 적합한 밀봉 구조에 의해 다양한 공급 라인에 대한 다양한 포트의 수동 커플링이 한꺼번에 제공될 수 있다.
필름(10)은 사출 성형, 열성형, 3D 마이크로프린팅 및 미세가공(micromachining)을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 릴리프 패턴화될 수 있다. 이들 각각의 성형 루트는 주로 생산량에 따라 경제적인 장단점이 있으나, 일부는 비교적 일정한 깊이의 바닥이 있는 채널 및 챔버를 생산하는데 특히 적합하고 일부는 단일 챔버 내에서 깊이를 변경하기 위해 특별한 노력이 필요하다. 그 때문에 Schuler가 설명한 챔버 바닥에 요구되는 피라미드 형상은 요구되는 제조 규모에서 칩을 비경제적으로 만들 수 있는 성형에 몇 가지 제한을 부과하다. 모든 방법은 상이한 챔버의 깊이를 제공한다.
도 1b은 IRV 생성, 처리 및 제시 공정의 연속 단계에서 필름(10)의 6 개의 평면 프레임의 스트립이다. 상단 좌측 프레임은 샘플 챔버(14)(오버플로(13)로 소량 분할)의 샘플과 수축 챔버(25)에 로드된 중질 매질를 보여준다. 샘플은 바람직하게, 생물학적 유체 또는 공기의 수성 담체, 물, 식품 또는 완충액을 갖는 토양 샘플(또는 처리된 샘플 또는 유체, 예를 들어 여과액, 잔류물, 용해물, 분획 또는 기타 정제); 하나의 PCR(또는 유사) 반응 믹스에 있는 모든 것; 및 비색 표적 또는 기능화된 입자(이는 ddPCR을 허용할 것임)의 조심스런 혼합물이다. 이러한 프레임은 원심분리기에 로딩 및 장착한 후 초기 회전 후 이미지화된 칩과 일치한다.
제 2 프레임(우측 상단)은 포트(12d)가 막히지 않은 경우 계속 원심분리에서 중질 매질이 수행하는 것처럼 tc에 분배되고 pc를 채우는 중질 매질을 보여준다. 포트(12d)는 타이밍이 필요한 경우, P-블레이드 패턴의 도 12도에서와 같이 중질 매질의 분배 타이밍을 제어하기 위해 주위로 개방된 밸브에 커플링될 수 있다. 그렇지 않으면 샘플이 제 1 프레임에서 위치를 채택하므로 연속적인 분배 공정이 원심분리와 함께 시작될 수 있다. 원심 분리는 주어진 속도로 J 형상의 채널(16)을 통해 샘플을 자연스럽게 끌어당기고 다른 속도로 고밀도 매질을 끌어당기나, 노즐(18)에 대한 이들 두 유체 사이의 임의의 경쟁 조건은 중요하지 않은데, 이는 텅 비어 있든 가득 차 있든 압력차가 공급 경로의 유체 역학적 저항을 압도하기 위해 포트(12b)에 가해질 때까지 J 형상 채널(16)과 노즐(18)의 유체역학적 저항으로 샘플이 tc(15)에 들어가는 것을 방지할 것이기 때문이다. 결과적으로, 제 3 프레임(중앙 좌측)에 표시된 것처럼 샘플이 노즐(18)을 통해 전달되기 전에 오일을 통해 거품으로 분출되는 중질 매질과 샘플 사이에 공기 플러그가 있다.
제 3 프레임은 제 1 IRV(30)가 형성되고 중질 매질을 통해 부력적으로 상승하는 것을 보여준다. 중질 매질은 샘플을 캡슐화하는데 적합한 높은 표면 장력과 접촉각을 가지고 있다. IRV는 tc(15) 내에서 부유에 의해 상승하고 거품을 형성한다. IRV 형성은 tc가 실질적으로 채워지거나 샘플 챔버(14)가 충분히 비워질 때까지 제 4 프레임(우측 중간)에서 계속된다. IRV가 형성된 후 tc(15)에 기포가 유입되도록 하는 것은 바람직하지 않으며, 따라서 포트(12a 및 12b) 사이에 적용된 압력 차이의 지속 시간에 대한 수동 또는 자동 피드백 기반 제어를 위해 샘플 챔버(14)의 시각적(또는 머신 비전) 검사를 허용하는 것이 바람직하며, 이 경우 카메라에 제 2 창이 샘플 챔버(14)의 카메라-기반 이미징을 위해 제공될 수 있다. 대안적으로, 그리고 더 효율적으로, 샘플 챔버(14)가 계량될 때, 압력 공급에 대한 프로그래밍된 제어는 tc(15)로의 초과 분출의 충분히 낮은 위험을 허용하는 규정된 시간으로 부피를 분배하도록 보정될 수 있다. dtc는 IRV가 tc 내에서 3차원 패킹을 형성하도록 하며, 이는 2차원 패킹에서보다 더 확실하게 인접한 IRV를 분리하여 두꺼운 매질의 웹 세트를 제공한다.
tc(15)에서 중질 매질의 공급도 보장되어야 한다. 제 2 프레임에 표시된 중질 매질은 초기 IRV 형성에 충분하지만, IRV가 부력적으로 상승함에 따라 추가된 샘플 질량은 중질 매질을 누르고 수축 챔버(25)의 중질 매질 수준을 높인다. 중질 매질 수준이 노즐(18) 수준 아래로 떨어지면, IRV는 계속 상승할 수 있지만, 가장 고갈된 영역의 일부 IRV가 합쳐질 때까지 모든 IRV의 얇은 웹일 수 있다. 따라서, 사용 시 미리 로딩된 양의 중질 매질은 초기에 pc를 채우고 tc를 충분히 채워서 충전 레벨이 노즐(18) 아래로 떨어지지 않도록 한다. 다른 옵션은 예를 들어, tc(15)를 시각화하고 포트(12d)에 양압을 선택적으로 적용하여 중질 매질이 IRV의 붕괴 전에 노즐(18)의 축 방향 단부로 떨어지기 전에 중질 매질을 들어올리기 위해 부드러운 푸시를 적용하고 tc가 가득 차면 포트(12a)에서 압력을 중지함으로써 중질 매질을 모니터링하고 제어하는 것이다. 캡슐화 액체에 대한 IRV의 부피 비의 변동성이 큰 경우 모니터링이 선호될 수 있다. 이러한 모니터링은 이미지 분석 및 피드백과 함께 온라인으로 제공되거나 작업자가 수동으로 제공할 수 있다.
따라서 프레임(4)과 프레임(5) 사이에서 샘플 챔버(14)가 비워지고 모든 IRV가 형성되고 IRV의 앙상블이 열처리를 받게 된다. 이를 위해, 칩(또는 칩을 지지하는 카트리지)이 있는 블레이드에 바람직하게, 펠티에 히터/쿨러(Peltier heater/cooler)와 같은 온도 제어 장치, 또는 tc(15)에 매우 근접한 열 포획 및 전도 표면이 제공된다. 열 포착 및 전도 표면은 바람직하게, tc에 밀접하게 가깝고 내장 온도 센서를 가질 수 있지만, 바람직하게는 블레이드 또는 블레이드의 칩 컨트롤러에 장착되고 이에 의해 구동되며, 필름(10) 또는 칩의 일부이거나 영구적으로 부착되는 것과는 대조적으로 칩이 더 저렴한 일회용 유형이 되게 한다. 그러나, 필름(10) 또는 커버(11)는 열전도율의 미미한 개선을 위해 선택될 수 있다. 열 포착 및 전도 표면의 목적은 예를 들어, 온-블레이드 레이저, LED 또는 백열전구 열원 또는 스트로브 고정 레이저, LED 또는 백열 전구 열원을 통해 tc를 간헐적으로 정렬하여 tc를 반응적으로 가열하는 것이다.
열처리가 완료되면 중질 매질과 부력이 동반된 IRV(30)의 수축이 제공된다. 제 5 프레임은 이러한 공정이 시작된 것을 보여주고 제 6 프레임에서 수축이 완료되고 수축 챔버(25)가 가득 차고 IRV의 단층이 pc(20)에 표시된다. 칩 컨트롤러 또는 원심 분리기는 pc를 이미징하기 위한 카메라가 당연히 있을 수 있으며, 이는 몇몇 경우에 블레이드에 장착될 수 있지만, 특수 광학 및 조명이 필요할 수 있거나 원심 분리기 내의 스트로빙 라이트(strobing light) 및 카메라에 의해 제공될 수 있거나, 원심분리 후 칩에 추가로 제공될 수 있다. 이미징이 원심분리기에서 수행되거나 원심분리 후에 수행되는 경우, 특히 환기되지 않은 챔버에서 작동 중 가압 공기 플러그가 발생하도록 허용되는 경우 원심분리 중 휴지 상태와 칩이 정지할 때 칩의 내용물이 이동할 수 있다. 이러한 이동의 극단에서 IRV 경계가 파괴될 수 있다. 압축된 공기 플러그가 있거나 없는 칩의 제어된 감속은 손상 없이 IRV가 pc로 이동하는데 영향을 줄 수 있다.
챔버의 형상, 방위 및 치수, 채널 및 포트의 레이아웃, 그리고 층(즉, 필름(10) 및 커버(11))의 재료 또는 조성을 포함한 칩의 미세유체 네트워크의 대부분의 양태는 필수적이지 않다. 제 1 실시예의 변형예에서 특정 방식으로 변경될 수 있는 몇몇 변형예 특징을 예시하기 위해 제공된다. 이들 변형예는 일반적으로 특징의 임의의 조합이 본 발명의 각각의 실시예에서 조립될 수 있다는 점에서 상호 독립적인 것으로 이해된다.
도 2는 이들 주요 측면에서 변하는 기판(10)의 레이아웃이며: pc는 IRV의 비디오그래픽 또는 직렬 이미징을 위한 관통형 챔버이고; tc의 IRV를 토핑하고 열처리 동안 가스 방출을 줄이기 위해 경질 매질 챔버가 제공된다. 도 2는 pc(20)가 이미지화될 수 있는 열 처리 영역(28) 및 창 영역(26)을 고스트 뷰(ghost view)로 추가로 예시한다. 예를 들어, 포트(12a,c)가 결합되는 것과 같이 칩 레이아웃의 약간의 변형예도 제공된다.
경질 매질 챔버(30)는 수성 샘플과 같이 열처리 동안 휘발되기 쉬운 IRV에 적합하다. 오일과 같은 캡핑 경질 매체는 그렇지 않으면 IRV의 부피, 샘플 성분의 용해 및 손상 반응에 영향을 미칠 수 있는 가스 방출을 방지하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.
관통형 pc(20)는 개구(22)와 출구 모두가 대칭적인 플레어링을 갖는다는 점에서 다소 대칭적인 형상을 가진다. 도 2 및 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 램프(23)는 약 20°의 기울기를 갖는 제 1 변형예에서 훨씬 더 완만하다. dtc 및 dpc는 변형예에서 실시예에 필적하기 때문에, 이는 약 4 배 더 긴 램프(23)의 런을 제공함으로써 달성된다. 개구(22)를 통한 흐름은 변형예에서 IRV(30)에 더 낮은 전단 응력을 가할 것으로 예상되며: tc의 3D 패킹에서 pc의 단층으로의 전환은 이러한 낮은 경사 램프(23)를 통해 더욱 점진적으로 제공된다. 램프(23)는 창 영역(26)의 시작 부분과 pc(20)의 시작 부분에서 끝난다. 필요한 것은 아니지만, 수축 채널(19)로 이어지는 pc 출구의 플레어링은 흐름 방향의 급격한 변화에서 전단력을 감소시킬 수 있다. 수축 챔버(25)로 진입하기 전에 IRV의 붕괴를 피하는 것이 실질적으로 바람직하며, 여기서 응집된 수성 IRV 내용물은 pc의 IRV와 상호 작용하지 않고 중질 매질을 통해 부력적으로 상승할 수 있다. 이를 위해, 채널(19)은 IRV 적재 중질 매질에 대한 더 부드러운 전환을 제공하도록 추가로 수정될 수 있다.
도 2a는 필름(10)과 커버(11)로 구성된 칩의, 도 2에 도시된 표시된 부분 단면을 도시한다. 도 2b는 본 발명에 따른 공정의 3 단계를 나타내는 스트립으로, 각각의 프레임은 도 2a의 칩의 확대도를 도시하며, tc, 개구 및 pc는 제 1 프레임에서 중질 매질(상단)로, 제 2 프레임(중간)에서 pc에 들어가기 시작하는 IRV로, 및 제 3 프레임(하단)에서 퍼레이딩으로 각각 채워진다. 칩을 작동시키기 위해 플랫폼에 장착되어 회전하도록 설정된다. 샘플과 중질 매질은 각각 J 채널(16)로 변위되어 pc를 채우고 tc(상단 프레임) 내에서 충전 수준에 도달한다. 일단 중질 매질이 tc의 노즐을 덮으면, 샘플은 공급 챔버(14)와 tc(15)를 연결하는 사이펀 밸브를 극복하는데 충분히 높은 포트(15a)(15c가 막히거나 공동 가압됨)에 양압을 적용하여 샘플 계량 챔버로 전달된다. 샘플이 전달됨에 따라서, 노즐(18)이 샘플을 강제하여 별개의 IRV로서 tc로 들어가도록 함에 따라 유화 과정이 시작되며, 이는 도 3을 참조하여 이후에 추가로 예시되고 설명된다. 따라서 IRV는 tc에서 생성된다. IRV가 만들어지면 포트(12e)에 양압을 적용하여 챔버(30)의 가벼운 매질이 tc로 전달된다. 경질 매질은 (샘플보다 밀도가 낮기 때문에)챔버의 상단으로 상승된다. 그런 다음 제어된 히터를 사용하여 설정 온도(또는 온도 순환 순서)를 적용하여 열처리를 시작한다. 열처리 중에 카트리지가 회전할 때 에멀젼이 중유와 경유 사이에 끼워져 증발을 방지하고 IRV 안정성을 유지한다. 열처리가 완료된 후 원심분리를 중단하지 않고 수축 챔버(25)의 포트에 음압을 적용하여 IRV를 얕은 pc(20)로 전달된다. 중간 프레임은 이러한 시작을 보여주고 하단 프레임은 창을 가로지르는 IRV 퍼레이드(parade)에서 임의의 순간을 보여준다. 그 때문에, 도 2b의 제 1 프레임은 도 1의 프레임(2 내지 4) 중 어느 하나에 대응한다. 제 2 프레임은 충분한 고밀도 매질이 수축 챔버(25)로 수축되고 일부 IRV가 개구(22)로 당겨지는 방법을 보여준다. 그 후 IRV는 pc를 가로질러 진행된다. 이러한 공정은 변위가 느리고 이미징을 용이하게 하고 IRV 붕괴를 방지하기 때문에 시간이 소요될 것으로 예상된다. 실시예와 달리, 변형예는 수축 챔버(25)에서 IRV의 축적, 또는 IRV 내용물의 다른 풀링(pooling) 또는 수집을 허용한다.
도 3은 노즐(18)에서 IRV 형성을 보여주는 스트립이다. 12 개의 프레임 각각은 옆으로 표시되며 프레임의 하단 에지는 tc(15)의 축 방향-원위 벽에 대응하고 우측 에지는 커버(11)의 표면에 대응한다. 각각의 연속적인 프레임에서 더 많은 양의 샘플이 중질 매질에 주입되고 부력이 증가하여 끌어 당겨질 때 위쪽(즉, 원심장 반대)으로 끌어당긴다. 프레임(9)에 의해서, IRV가 형성되었다고 말할 수 있지만 샘플의 끈으로 노즐에 묶여 있다. 부력은 IRV를 노즐에서 점점 더 멀리 변위시켜서, 더 많은 샘플을 tc로 끌어들이지만, 테더는 제 12 프레임에서 스냅되고 샘플 스트링은 자유 표면 에너지가 선호하는 구형 모양으로 다시 스냅되어 다음 IRV를 시딩(seeding)한다.
도 1 및 2가 본 발명의 IRV 형성 및 제시 공정에서 직접적으로 협력하는 것들 이외의 특징이 없는 2 개의 실시예를 도시하지만, 많은 칩이 테스트용 샘플을 생성하기 위해 여러 단계의 샘플 준비 및 처리를 수행하는 것이 바람직하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 도 1 및 도 2의 칩은 ddPCR, ddLAMP, ddRPA 또는 단일 세포 기반 분석을 포함한 이미징을 위한 IRV 생성, 열 조작 및 후속 단층 형성이 필요한 임의의 애플리케이션에 적합하며, 단일 세포는 특정 시약으로 캡슐화되고, 지정된 시간 동안 배양되고 후속적으로 이미지화된다. IRV당 최대 하나의 세포를 제어하기 위해 가장 쉬운 방법은 주어진 샘플 및 IRV 부피에 대해 푸아송 분포(Poisson distribution)에 의해 예측된 대로 IRV당 최대 하나의 세포를 제공하는 적절한 세포 농도로 샘플을 희석하는 것이다. 예를 들어, IRV의 약 15%는 하나의 세포를 포함하고 다른 IRV는 수성 완충액과 용해되거나 운반되는 입자 및 종(species)들만을 포함한다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 액적을 형성하는 노즐에 도달하기 전에 이들 사이에 특정 간격을 두고 채널에서 세포를 제어하거나 배열하기 위해서 흐름 집중 및 기타 기술이 제공될 수 있다.
도 4는 혈액, 타액, 소변 등을 포함하는 다양한 임상적으로 관련된 생체유체로부터 핵산 추출과 같은 분석에 대한 완전한 샘플을 위한 칩을 제공하도록 패턴화된 필름(10)을 예시한다. IRV 생성, 열처리 및 프리젠테이션에 필요한 모든 챔버와 채널을 제공하는 것 외에도 생체 유체로부터 핵산 분리를 위한 추가 챔버가 제공된다. 의도된 사용을 위해 조립될 때, 샘플 챔버(14)에는 건조 시약이 미리 로딩되고 다음 챔버에는 각각, 챔버(30)의 경질 매질; 챔버(36)의 결합 완충액; 챔버(37)의 세척액; 및 챔버(38)의 용리 완충액이 로딩된다. 결합 완충액, 세척액 및 용리 완충액 챔버(36 내지 38)는 비드 층을 포함하는 혼합 챔버(31)에 커플링되며, 비드는 핵산 추출을 위해 기능화된다. 샘플 용해를 위해 혼합 챔버(31)가 제공된다. 또한, 혼합 챔버(31)에 튜브에 의해 커플링된 오프-칩 샘플 바이얼(sample vial)(40)이 있다. 혼합 챔버(31)는 또한, 출원인의 동시 계류 중인 WO2020/100039 호에 교시된 바와 같이 샘플 챔버(14) 및 오프-칩 폐기물 저장소(39)와 유체 연통한다.
샘플은 혼합 챔버(31)로 이동되고 결합 완충액은 각각의 포트를 통해 챔버(36)에 양압을 적용하여 챔버(31)로 이동된다. 결합 완충액은 샘플을 용해하여 샘플에서 핵산을 추출한다. 기능화된 비드(바람직하게, 실리카와 같은 다공성, 고표면적 비드)는 바람직하게, 펠티에 장치에 의해 제공되는 온도 제어의 도움을 받아 핵산을 포획한다. 다음으로, 챔버(31)의 액체 내용물(결합되지 않은 용해물)은 채널을 오프-칩 폐기물(39)에 프라이밍할 만큼 충분하지만, 채널을 샘플 챔버(14)에 프라이밍할 만큼 충분히 길지 않은 긴 기간 동안 혼합 챔버(31)의 포트에 양압을 가함으로써 배출된다. 비드의 직경이 오프칩 폐기물(39)에 대한 혼합 챔버 개구의 직경보다 크기 때문에, 비-결합된 용해물이 빠져나가는 동안 비드가 유지된다. 그 다음, 챔버(31)는 세척물을 챔버(31)로 대체하고 다시 챔버(31)를 배수함으로써 적어도 한 번 세척된다. 핵산 템프릿은 용리 완충액을 챔버(31)로 이동시킴으로써 비드로부터 용리된다. 이는 핵산의 방출을 용이하게 하기 위해서 혼합 챔버(31)를 가열하는 것을 포함할 수 있다. 다음으로, 용리된 템플릿은 예를 들어, 사이펀 밸브 연결 챔버(31 및 14)를 극복하는데 충분한 압력 및 지속 시간으로 포트(12a,b,d)에 음압을 적용하여 샘플 챔버(14)로 전달된다. 사이펀 밸브가 있는 이러한 채널, 샘플 챔버(14) 및 tc(15)에 노즐(18)이 있는 J 채널은 본 실시예에서 전달 경로를 형성한다. 이 시점에서 핵산을 운반하는 용리 완충액이 샘플 챔버(14)를 채우고 건조된 예비혼합물을 수화시키고 용해시킨다. 도움이 되는 경우 포트(12a,b,d)에 압력을 가하여 샘플의 거품 혼합을 유도하여 적절한 용해와 샘플 균질성을 보장할 수 있다. 이러한 작업이 완료되면 이전 예와 같이 유화, 열처리 및 프리젠테이션 공정을 시작할 수 있다.
도 5는 에멀젼 분할 IRV의 열처리 및 디스플레이를 위한 원심 미세유체 시스템의 특정 예이다. 시스템은 축(도면에 없음)을 중심으로 원심분리기에 장착되도록 구성된 원심 블레이드(50)를 포함한다. 블레이드(50)는 양단에 있는 2 개의 칩 수용부(53), 및 칩 수용부(53) 사이의 실질적으로 중간에 연장되는 플레어 형상 또는 둥근 판 몸체를 포함한다. 플레어 형상 판 몸체 섹션은 원심분리기의 균형을 맞추기 위해 질량을 적용하기 위한 위치를 제공한다.
2 개의 칩(55)은 칩 수용부(53)에서 블레이드(50)에 장착되도록 설계되지만, 하나의 경우에는 예시를 위해 제거된 커버(즉, 패턴화된 필름(10))가 도시된다. 칩은 조작을 용이하게 하고 칩의 의도하지 않은 조작에 의해 미리 로딩된 유체의 변위를 방지하고 가열 시스템, 뷰잉 시스템 및 압력 공급 포트와 같은 블레이드(50)의 대응하는 특징과 칩의 정밀한 정렬을 위해 카트리지를 형성하기 위해 자주 칩이 강화된다는 점에 유의해야 하지만; 그러한 보강을 제공하는 구조는 칩을 가리는 경향이 있어 생략되었다.
블레이드(50)의 중심에는 컨트롤러(52)가 있으며, 컨트롤러(52)는 전기 회로, 전원 공급 장치, 가압 유체 소스, 펌프, 흐름 제어 요소, 또는 8 개가 도시된, 각각의 유체 공급 라인(56)에 공급되는 압력을 제어하기 위한 유체, 또는 전력 또는 신호를 공급하기 위한 공압, 유압 및/또는 전기 슬립 링을 가질 수 있다. 공급 커플러(54)는 칩의 각각의 포트(12)를 각각의 유체 공급 라인(56)에 커플링한다. 칩의 두 가지 사례는 중복 테스트를 수행할 수 있거나, 예를 들어 동일한 테스트를 실행하는 다른 샘플 소스를 가질 수 있지만, 전형적으로 두 칩을 동시에 협력하기 위한 중복 압력 공급 라인(56)을 가진다.
도 5a는 필름(10)의 완전한 뷰를 제공하기 위해 커플러(54)가 분해된 제 3 변형예에 따른 필름(10)을 도시한다. 제 3 변형에는 약간의 변경이 있다. 예를 들어, 오버플로인 챔버인 챔버(13) 대신에, 원시 샘플이 내부에 제공되는 건조 시약용 별도 챔버이다. 원심분리 전에 챔버(13)에 제공된 샘플은 확산에 의해 혼합하는데 충분히 오래 건조 시약과 함께 체류하고 챔버(13)의 포트를 제어하여 샘플 챔버(14)로 계량된다. J 채널(16)은 유체역학적 저항을 가지며, 도 5b에 더 잘 도시된 바와 같이 노즐(18)의 어레이로 개방된다. tc(15)는 분배 속도에 대한 제어를 향상시키는 유체역학적 저항을 통해 챔버(30)로부터 공급되는 경질 매질을 위한 완충 공간을 제공하는 오버플로(15')를 가진다. 샘플을 tc에 도입하면 tc의 점유 부피가 확장되는 동시에, 무거운 매질을 수축 챔버(25)로 다시 변위시킨다는 사실이 이러한 부피에 대한 프로비저닝 문제(provisioning issue)를 야기한다. 경질 매질은 부피 차이를 해결하는데 도움이 되지만 IRV를 동반하지 않고 경질 매질이 tc에서 실질적으로 제거되는 지점까지 tc를 과도하게 채우는 능력이 유리하다. 대안적인 이유로, 경질 매질은 오버플로 챔버(15')에서 공기를 대체하는 대신에 챔버(30)로 복귀될 수 있다. 중질 매질 챔버(25)에는 중질 매질의 부피를 보다 정확하게 분배하기 위해 통기된 계량 채널이 제공된다. 계량 채널은 IRV 형성 전의 원심분리 동안 tc 내의 중질 매질의 충전 수준을 확인하는데 유용한 위치를 제공한다. pc(29)는 지지 및 보강을 위한 기둥 어레이와 함께 표시된다. dpc가 매우 작기 때문에 칩의 압력 변화가 사용 깊이를 실질적으로 변경하는 것을 방지하기 위해서 기둥이 필요하다. 이들은 도 5b에 더 잘 예시된다.
도 5a는 또한, 단일 클램핑 구조가 칩(55)의 제공된 포트 각각을 커플러(54)를 통해 각각의 공급 라인(56)과 밀봉 연결로 가압할 수 있는 방법을 도시한다.
도 5b는 제 3 변형예에 따른 필름(10)의 패터닝의 특히 민감한 부분의 부분 확대도를 도시한다. 유체역학적 제한 후에 J 채널(16)의 확장된 매니폴드 세그먼트와 커플링된 것으로 도시된 7 개의 노즐(18)이 있다. 따라서 제한을 통해 압축된 샘플은 매니폴드를 범람하고 7 개의 노즐 각각에 대략 동일한 유속을 분배한다. 멀지 않은 곳에 개구(22)가 나타나 있으며 pc(29)에 배치되고 개구(22)로 우측으로 연장하는 기둥(59)이 보인다. 기둥(59)은 IRV와의 유동 상호작용을 최소화하고 유동 내의 전단 응력을 피하기 위해서 치수, 피치 및 오프셋을 가진다.
예
본 발명은 여러 실험에 의해 입증되었다. 도 6은 본 발명을 테스트하기 위해 사용된 칩의 사진이다. 패터닝은 제 3 변형예와 가장 유사하며, 이미징을 위해 한 번에 모든 IRV를 표시할 수 있는 대형 pc가 있다. 이는 필름을 고온 엠보싱하고 평평한 COC 시트에 접착하여 열가소성 엘라스토머(Mediprene OFTM)로 제작했다. 장치는 아래에 설명된 프로토콜로 IRV를 생성하고, 에멀젼을 열 순환하고, 에멀젼을 pc로 전달하는데 후속적으로 사용되었다. 이 칩에서 dpc는 60 μm이고 dtc는 500 μm이다.
처음에 칩은 IRV를 생성하고 액적 PCR을 실행하는데 필요한 모든 액체로 충전된다. 구체적으로, 수축 챔버에 중유 200 ㎕를 로딩한 후 챔버(13)에 샘플(템플릿과 PCR 혼합) 20 ㎕를 충전하고, 경질 매질 챔버(30)에 광유 20 ㎕를 충전하였다. 다음으로, 장치를 블레이드의 압력 공급 포트로 입구를 밀봉한 원심분리기의 블레이드에 놓고 플랫폼을 400 rpm으로 회전시킨다.
1.5 psi의 양압이 포트(7)(예제 섹션에서 식별된 모든 포트는 도 5b 또는 도 6에서 좌측으로부터 우측으로 번호가 지정됨)에 적용되어 tc(15)(오버플로(15')가 아님)가 완전히 충전될 때까지 중유를 pc, 개구 및 tc(15)로 전달한다. 다음으로 회전 속도를 600 rpm으로 증가시켰다. 이 시점에서 tc 함량은 약 절반 충전 tc까지 내려갔다. 그렇지 않으면, 샘플은 200 ms 동안 포트(3)에서 +1 psi, 펄스를 적용함으로써 챔버(13)로부터 샘플 챔버(14)로 전달된다.
챔버(14)의 샘플을 사용하여 포트(2 및 3)에서 +1.5 psi보다 큰 일정한 압력을 적용하여(그리고 회전 속도를 추가로 제어하여) 다음 단계에서 IRV를 생성할 수 있으며, 이는 J 채널의 저항을 극복하는데 충분하고 노즐을 통한 IRV 생성 공정을 시작한다. 노즐의 제공된 유체역학적 반경과 함께 정확한 압력 및 회전 속도는 IRV 직경과 부피를 결정하며, 이는 필요에 따라 설정하고 특정 애플리케이션에 맞춤화할 수 있다. 이 경우, 노즐의 폭는 10 μm, 깊이는 8 μm이므로 수력학적 반경은 약 4.5 μm인 2(10 x 8)/(2(8 + 10))이다.
압력이 가해지면 IRV가 생성되어 오버플로 챔버(15')까지 완전히 tc를 채우지만, IRV는 오버플로 챔버에 들어가지 않는다. 이는 열처리 동안 IRV 붕괴를 피하기 위해 중요하다. IRV 생성 후 포트(5)에서 +1 psi의 압력을 적용하여 경유가 오버플로 챔버에 분배되었다. 이러한 단계는 열 순환 동안 증발을 방지하고 적용된 특정 PCR 공정에 필요한 상승 온도(즉, 95 ℃)에서 IRV 안정성을 유지하는데 사용되었다.
다음으로, 열 순환 시퀀스는 tc 아래의 블레이드에 위치한 펠티에 히터에 적용되었다. 열 순환이 완료된 후 포트(6 및 7)에 -1 psi의 음압을 적용하여 중유를 수축시켜 에멀젼을 pc로 전달하기 시작했다. 이러한 공정에서 플랫폼이 회전을 멈춘 후 오일이 pc로 역류하는 것을 방지하기 위해서 회전 속도를 300 rpm까지 천천히(10 rpm 증분으로) 감소시킨다. 전송이 완료되면 압력이 꺼지고 회전이 중지되어 IRV의 후속 이미징이 가능하다.
도 7은 이미지화된 pc의 사진으로, 지지 기둥의 어레이가 어두운 점으로 표시된다. IRV의 일부 밴딩, 특히 pc 상단 근처에서의 밴딩이 보일 수 있는 동안에, IRV 붕괴의 일부 영역이 보이지만, 대부분의 pc는 균일한 크기의 IRV로 구성된 육각형 패킹으로 충전된다. 이웃하는 IRV는 열처리 동안 IRV의 효과적인 분리를 보여주는 다른 색상을 가지고 있다. 도 7a는 각각의 IRV가 독립적으로 PCR 형광 반응을 보고하는 단단한 육각형 단층을 보여주는 확대된 영역의 일부(상단)를 도시한다.
도 8은 IRV 직경 카운트를 보여주는 히스토그램으로, 출원인에게 분포의 평균 및 CV를 계산할 기회를 제공하며, 이는 각각 49 μm 및 2.38%이다. 이는 각각의 IRV의 부피가 대부분의 분석에 대해 충분히 일정하다는 것을 보여준다. 위에서 원용에 의해 포함된 LOC 문서에 언급된 바와 같이, 수 마이크론으로부터 최소 100 μm까지의 다양한 직경을 중심으로 합리적으로 좁은 분포를 갖는 IRV 직경을 생성하기 위한 칩 배열은 300 내지 700 rpm 의 원심분리 및 0 내지 40 kPa의 양압 변화로 생성될 수 있다.
제안된 칩 및 시스템의 적용은 자동화된 IRV 생성, 열 순환 및 이미징을 위한 에멀젼 전달에 대해 입증되었다.
열처리를 위한 칩 및 시스템의 필수 기능과 IRV의 에멀젼 변위는 시야를 방해하는 대안적인 요소를 최소화하여 본 발명에 설명되었다. 다수의 센서 및 장치가 블레이드 또는 칩 컨트롤러에 추가될 수 있어서 추가적인 개선을 위한 추가적인 공정 제어 및 피드백을 제공할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 구조에 고유한 다른 장점은 당업자에게 자명하다. 실시예들은 예시적으로 본 발명에서 설명되며 청구된 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다. 전술한 실시예의 변형예는 당업자에게 자명할 것이고 발명자는 다음 청구범위에 포함되도록 의도한다.
참고 문헌:
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Claims (21)

  1. 축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩으로서,
    칩은 챔버 네트워크를 포함하고 채널을 상호 연결하며: 챔버 네트워크는:
    10 내지 800 μL의 부피(vtc), 및 dtc < ltc 및 dtc < wtc인 평균 길이(ltc), 평균 폭(wtc) 및 평균 깊이(dtc)를 갖는 처리 챔버(tc);
    샘플을 tc로 전달하도록 구성된 제 1 경로로서, 노즐이 적합한 매질로 채워져 있는 경우 에멀젼 분할 독립 반응 부피(IRV)로서, 이산화된 tc로 샘플을 전달하도록 구성된, 2 내지 120 μm인 유체역학적 반경(rn)을 갖는 노즐을 포함하는, 제 1 경로;
    IRV가 tc로부터 pc로 선택적으로 변위될 수 있는 개구에 의해서 tc에 커플링된 프리젠테이션 챔버(pc);
    적어도 pc의 길이와 폭에 걸쳐 칩을 통해 제공된, pc를 검사하기 위한 투명한 창; 및
    pc에 대한 제 2 경로에 의해 커플링된 수축 챔버(rc)를 포함하며;
    dtc는 5 x rn 내지 2 mm이며; pc는 1.2 x rn 내지 7 x rn의 두께(dpc)를 가지며; dtc > 2 dpc; 개구를 통한 유동 경로는 8 x rn보다 큰 최소 유체역학적 반경을 가지는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  2. 제 1 항에 있어서,
    pc는 0.6 내지 1.2 vtc의 부피(vpc)를 가지며, 설치 공간은 칩 설치 공간의 3 cm2 내지 80%인,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    챔버의 네트워크 및 채널은 공칭 두께가 20 μm 내지 5 mm인 제 1 필름의 적어도 제 1 면에 양각으로 생성되며, 칩은 칩의 포트로부터 떨어진 챔버 및 채널을 둘러싸기 위해서 제 1 면을 덮는 커버 필름을 포함하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    dpc는 지지하는 미세구조의 배열에 의해 주변 압력에도 불구하고 명목상으로 유지되는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  5. 제 4 항에 있어서,
    노즐은 tc에 대한 제 1 경로의 입구에 위치되는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    tc로 제 1 경로의 진입은 노즐의 하나 이상의 추가 사례를 추가로 제공하도록 분기되는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    tc와 pc 사이의 개구는 길이보다 더 넓은,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개구의 바닥은 깊이가 dtc로부터 dpc로 변하는 램프를 포함하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  9. 제 8 항에 있어서,
    램프는 30°내지 75°의 기울기를 가지는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 개 이상의 필름의 스택을 포함하며, 필름 중 적어도 하나는 네트워크를 한정하는 릴리프 구조를 가지며, 각각의 필름은 20 μm 내지 3 mm의 공칭 두께를 가지며, 각각의 필름은 실록산 이외의 경화되거나 고화된 고분자 화합물로 구성되며, 칩은 0.1 내지 12 mm의 두께를 가지며, 칩은 3 내지 25 cm의 평면 범위를 가지거나, 칩은 적어도 2 개의 포트를 가지는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 또는 제 2 경로는 부피 제어 전달을 위한 오버플로 챔버가 있는 계량 챔버를 포함하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 경로 내의 제 1 챔버에서 건조 또는 액체 형태의 PCR 혼합물과 같은 샘플 준비 반응 혼합물; 제 1 경로 내의 제 2 챔버에 있는 건조 또는 액체 형태의 샘플; 제 1 경로 내에서 샘플 또는 반응 혼합물을 용해 또는 현탁시키기 위한 완충액, 용매 또는 액체; tc, pc 또는 dc 내에 로딩된 IRC를 지원하도록 구성된 분산 매질 중 하나 이상으로 로딩되는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  13. 제 12 항에 있어서,
    tc의 축 방향-근위 단부에서 tc와 만나는 제 3 경로에 의해 tc에 커플링된 저밀도 매질 챔버를 더 포함하며, 샘플, 완충액, 용매 또는 액체, 및 분산 매질의 밀도보다 낮은 밀도를 가지는 액체로 로딩되는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    카트리지에 내장되어 있으며, 카트리지는 조작 및 등록이 용이한 견고한 구조를 갖지만 칩 포트에 대한 액세스를 제공하고 칩 통기구의 폐쇄를 방지하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원심분리기에 장착되거나 장착하기 위해서, 칩과 컨트롤러 모두의 회전을 위해서 칩 컨트롤러와 함께 키트에 공급되며, 칩 컨트롤러는 pc의 유체를 dc로 선택적으로 변위시키기 위한 오프-칩 흐름 제어 장치를 포함하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  16. 제 15 항에 있어서,
    흐름 제어 장치는 칩의 포트에 커플링하기 위한 가압 유체 공급 라인을 포함하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    칩 컨트롤러 또는 카트리지는 그의 한쪽 면에서 칩을 지지할 수 있는 치수의 칩 고정 표면을 포함하며, 칩 고정 표면은 칩의 처리 챔버를 에너지 장에 선택적으로 노출시키기 위한 에너지 장치를 포함하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  18. 제 17 항에 있어서,
    에너지 장은 치료 챔버에 인접한 칩과 접촉하는 열 에너지 소스 또는 싱크, 초음파 변환기, 또는 전자기장 발생기인,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원심분리 중에 또는 칩이 정지해 있을 때 pc를 이미징하기 위한 조명 및 이미징 시스템을 더 포함하는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원심 미세 유체 시스템을 형성하도록 조립되는,
    축을 중심으로 회전하도록 원심분리기에 장착하기 위한 원심분리 미세유체 칩.
  21. 에멀젼 분할 반응 부피(IRV)를 공동 처리하고 이를 단층으로 제공하는 방법으로서,
    원심 미세유체 칩의 처리 챔버(tc)에 IRV를 제공하는 단계;
    칩이 원심분리되는 동안 원심분리기에 칩이 장착된 에너지 장치를 활성화하여 tc 내의 IRV에 에너지 처리를 적용하는 단계로서, tc가 3 내지 100 개의 IRV를 수용하는 최소 치수를 가지는, 단계; 및
    IRV를 실질적인 단층으로 배열하기 위해서 IRV의 평균 직경 및 pc의 깊이보다 큰 폭을 갖는 개구를 통해 tc로부터 프리젠테이션 챔버(pc)로 IRV를 변위시키도록 흐름 제어 장치를 작동시키는 단계로서, 흐름 제어 장치가 15 kPa 미만의 압력차를 적용하는, 단계를 포함하는;
    에멀젼 분할 반응 부피(IRV)를 공동 처리하고 이를 단층으로 제공하는 방법.
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