KR20220143714A - 플라스민-절단 가능한 psd-95 억제제 및 재관류로의 뇌졸중의 병용 치료 - Google Patents
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Abstract
PSD-95의 펩티드 억제제인 Tat-NR2B9c는 혈전용해제에 의해 유도될 수 있는 혈청 프로테아제인 플라스민에 의해 절단된다. 반대로 Tat-NR2B9c는 혈전용해제의 활성에 해로운 영향을 미치지 않는다. 혈전용해제에 의한 Tat-NR2B9c의 불활성화는, Tat-NR2B9c와 플라스민 사이의 혈장 체류에서 실질적인 중복을 피하기 위해 각 제제의 투여 간격 두기, 혈전용해 재관류 대신 기계적 사용 또는 플라스민에 의해 절단 처리되지 않는 PSD-95를 억제하는 활성제, 예를 들어 Tat-NR2B9c의 D-아미노산 변이체 사용을 포함하는 여러 접근 방법에 의해 감소되거나 회피될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
[001] 본 출원은 각각 2020년 2월 19일에 출원된 US 62/978,759 및 US 62/978,792로부터 우선권을 주장하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함된다.
서열 목록
[002]
본 출원은 2021년 2월 17일에 생성된 22,109바이트의 552735SEQLST.TXT라는 명으로 txt 파일에 개시된 서열을 포함하며, 이는 참조로 통합된다.
배경
[003]
Tat-NR2B9c(NA-1 또는 네린티드(nerinetide)로서 또한 공지됨)는 PSD-95를 억제하여 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR) 및 신경 일산화질소 합성효소(nNOS)에 대한 결합을 방해하고 뇌허혈에 의해 유도된 흥분독소를 감소시킨다. 치료는 뇌 손상 및 신경퇴행성 질환 모델에서 경색 크기 및 기능적 결함을 감소시킨다. Tat-NR2B9c는 성공적인 2상 시험(WO 2010144721 및 문헌 [Aarts et al., Science 298, 846-850 (2002), Hill et al., Lancet Neurol. 11:942-950 (2012)] 참조) 및 성공적인 3상 시험(Hill et al, Lancet 395:878-887 (2020))을 거쳤다.
청구된 발명의 개요
[004]
본 발명은 플라스민에 의해 절단 가능한, PSD-95를 억제하는 활성제 및 재관류를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 허혈을 갖거나 이의 위험이 있는 대상체 집단을 치료하는 방법을 제공한다. 대상체의 집단은 PSD-95를 억제하는 활성제 및 기계적 재관류 또는 재관류를 수행하기 위한 혈관확장제 또는 고혈압제가 투여되는 대상체; 및/또는 PSD-95를 억제하는 활성제 및 재관류를 수행하기 위한 혈전용해제가 투여되는 대상체를 포함하며, 여기서 PSD-95를 억제하는 활성제는 혈전용해제보다 적어도 10분 전에 투여되고, 대상체의 집단에는 PSD-95를 억제하는 활성제 투여 전 3시간 안에 또는 투여 후 10분 안에 혈전용해제가 투여되는 대상체가 결여된다.
[005]
임의적으로, 대상체는 허혈성 뇌졸중을 갖는다. 임의적으로, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전 4시간 안에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제 후 10분 안에 투여되는 대상체가 결여된다. 임의적으로, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전 8시간 안에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여한 후 10분 안에 투여되는 대상체가 결여된다. 임의적으로, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여한 후 10분 안에 투여되는 대상체가 결여된다. 임의적으로, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95 억제제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여한 후 20분 안에 투여되는 대상체가 결여된다. 임의적으로, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여한 후 30분 안에 투여되는 대상체가 결여된다. 임의적으로, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여한 후 60분 안에 투여되는 대상체가 결여된다. 임의적으로, 대상체의 집단은 PSD-95를 억제하는 활성제, 및 혈전용해제를 투여받지 않으면서 기계적 재관류가 투여되는 대상체를 포함한다.
[006]
임의적으로, 치료 대상체의 집단은 (a) PSD-95를 억제하는 활성제, 및 혈전용해제 부재하의 기계적 재관류, 혈관확장제 또는 고혈압제가 투여되는 대상체; 및 (b) PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, 혈전용해제는 PSD-95를 억제하는 활성제보다 적어도 10, 20, 30, 60 또는 120분 후에 투여되는, 대상체로 구성된다. 임의적으로, 항목 (b)에 따른 대상체의 적어도 일부는 또한 기계적 재관류 투여된다. 임의적으로, 집단은, 대상체가 뇌졸중 발병 후 3시간 안에 혈전용해제로 처리하기에 적격한 것으로 결정되는 경우 뇌졸중 발병 후 3 또는 4.5시간 초과에서 혈전용해제가 투여되는 대상체를 포함한다. 임의적으로, 집단은 적어도 100명의 대상체를 포함한다. 임의적으로, 집단은, PSD-95를 억제하는 활성제가 10분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 30분에 투여되는 대상체를 포함한다. 임의적으로, 활성제는 모든 L-아미노산의 펩티드이다. 임의적으로, 활성제는 네린티드이다.
[007]
본 발명은 플라스민에 의해 절단 가능한 PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제 둘 모두를 대상체의 일부에 투여하는 단계로서, PSD-95를 억제하는 활성제가 혈전용해제보다 적어도 10, 20, 30, 60 또는 120분 전에 투여되는, 단계, 및 다른 대상체에게 PSD-95를 억제하는 활성제 또는 혈전용해제를 투여하지만 둘 모두를 투여하지는 않는, 단계를 포함하는 허혈성 뇌졸중에 대해 혈관내 혈전절제술을 받은 대상체의 집단을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 임의적으로, PSD-95을 억제하는 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체는 대상체가 혈관내 혈전절제술을 받기 전에 그렇게 된다. 임의적으로, PSD-95을 억제하는 활성제 또는 혈전용해제가 투여되는 대상체는 대상체가 혈관내 혈전절제술을 받기 전에 그렇게 되는데 둘 모두가 투여되는 것은 아니다. 임의적으로, PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제 둘 모두가 투여되는 대상체에서, PSD-95를 억제하는 활성제는 혈전용해제 전 보다 적어도 10분 전에 투여되며, PSD-95를 억제하는 활성제 또는 혈전용해제는 다른 대상체에 투여되는데, 둘 모두가 투여되는 것은 아니다.
[008]
본 발명은 허혈을 갖거나 허혈 위험이 있는 대상체의 집단을 치료하는 방법으로서, PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 대상체 집단은 플라스민에 의해 절단 가능한 PSD-95를 억제하는 제1 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, PSD-95를 억제하는 제1 활성제가 혈전용해제 전 적어도 10, 20, 30, 60 또는 120분으로부터 선택되는 간격을 두고 투여되는, 대상체; 및 플라스민에 의한 절단에 내성이 있는 PSD-95를 억제하는 제2 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전 또는 후 상기 간격 안에 투여되는, 대상체를 포함한다.
[009]
본 발명은 추가로 허혈성 뇌졸중이 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 혈전용해제로 치료할 대상체의 적격성을 결정하는 단계; 플라스민에 의해 절단 가능한, PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 단계, 및 그 후 적어도 10, 20, 30, 60 또는 120분에 혈전용해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 임의적으로, PSD-95를 억제하는 활성제가 10분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 20분에 투여된다. 임의적으로, 활성제는 모든 L-아미노산의 펩티드, 임의적으로 네린티드이다. 임의적으로, 영상화는 허혈성 뇌졸중의 존재와 뇌출혈의 부재를 결정한다. 임의적으로, 적격성은 뇌졸중 발병 후 3시간 안에 결정되고, 혈전용해제는 허혈성 뇌졸중 발병 후 3시간 초과에서 투여된다. 임의적으로, 적격성은 뇌졸중 발병 후 4.5시간 안에 결정되고, 혈전용해제는 허혈성 뇌졸중 발병 후 4.5시간 초과에서 투여된다. 임의적으로, 적격성은 뇌졸중 발병 후 3시간 안에 결정되고, 혈전용해제는 허혈성 뇌졸중 발병 후 4.5시간 넘어서 투여된다.
[010]
임의의 상기 방법에서, PSD-95를 억제하는 활성제는 C-말단에서 [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L](SEQ ID NO:1) 또는 C-말단에서 X1-[T/S]-X2-V(SEQ ID NO:2)을 포함하는 펩티드 (여기서 [T/S]는 대체 아미노산이고, X1은 E, Q 및 A, 또는 이의 유사체 중에서 선택되고, X2는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 또는 이의 유사체 중에서 선택됨), 및 펩티드의 N-말단에 연결된 내재화된 펩티드를 포함할 수 있다. 임의적으로, 내재화 펩티드에 연결된 PSD-95를 억제하는 활성제는 Tat-NR2B9c(네린티드)이다. 임의적으로 혈전용해제는 tPA이다.
[011]
본 발명은 또한 PSD-95를 억제하는, 플라스민-민감성, 즉 플라스민에 의해 절단 가능한 활성제로 뇌졸중을 앓았던 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이에 의해 플라스민-민감성 억제제는 혈전용해제 보다 적어도 10분 전에 투여되거나, 혈전용해제 투여보다 적어도 2, 3, 4시간 이상 후에 투여되거나, 혈전용해제 부재하에 투여된다. 임의적으로, PSD-95를 억제하는 활성제가 10분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 20분에 투여된다. 임의적으로, 활성제는 모든 L-아미노산의 펩티드이다. 임의적으로, 활성제는 네린티드이다.
[012]
본 발명은 또한 PSD-95를 억제하는 플라스민-민감성(즉, 플라스민에 의해 절단 가능) 활성제의 분해를 혈전용해제에 의해 최소화하는 방법으로서, PSD-95를 억제하는 활성제를 혈전용해제보다 적어도 10분 전에 투여하는 단계, 또는 혈전용해제의 투여 후 적어도 2, 3, 4 또는 그 초과의 시간에 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 단계, 또는 혈전용해제 없이 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 단계, 또는 비강내 또는 척수강내 투여에 의해 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 임의적으로, PSD-95를 억제하는 활성제가 10분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 20분에 투여된다. 임의적으로, 활성제는 모든 L-아미노산의 펩티드이다. 임의적으로, 활성제는 네린티드이다.
[013]
본 발명은 또한 허혈성 뇌졸중을 치료하는 방법으로서, 허혈성 뇌졸중을 갖는 대상체에 플라스민에 의해 절단 가능한 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 단계 및 활성제 투여 개시 후 20-40분에 혈전용해제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 임의적으로, PSD-95를 억제하는 활성제는 10분의 기간에 걸쳐 억제되고 혈전용해제는 활성제 투여 개시 후 20-30분에 투여된다.
도면의 간단한 설명
[014] 도 1: 알테플라제 투여 유무에 따른 네린티드의 혈장 수준.
[015] 도 2a: 네린티드 처리군에 의한 수정된 랭킨(Rankin) 척도에 대한 일차 결과 분포를 보여주는 수평 누적 막대 그래프. 막대는 비율로 표지된다.
[016] 도 2b: 일반적인 치료 알테플라제 처리에 따른 네린티드 처리군에 의해 수정된 랭킨 척도에 대한 일차 결과 분포를 보여주는 수평 누적 막대 그래프. 막대는 비율로 표지된다.
[017] 도 3: 사전 지정된 하위그룹에서 네린티드 처리 효과의 산림도. 비교는 다중성을 위해 조정되지 않는다. 일차 분석(알테플라제, 혈관내 접근법, 연령, 성별, NIHSS 스코어, ASPECTS, 발생 위치, 부위)과 동일한 변수에 대해 조정된 효과 크기는 무작위화 계층에 의해 나타내고, 추가적인 사전 지정된 하위그룹에 따라 나타낸다. 2개의 사전 지정된 하위그룹은 이 플롯에 포함되지 않는다: (1) 치료 시작 시간 <=4h 또는 >4h로, 이는 6시간 임계값을 사용한 유사한 그룹화와 중복되었기 때문임; (2) 체중> 105-120 kg vs. 40-105 kg으로, 모델링이 불안정하게 되는 고체중 범주에 속하는 매우 소수의 환자. 일반적 치료에서 후속 시간 범위의 환자는 정맥내 알테플라제로 처리되지 않기 때문에 >6시간의 치료 시작 시간과 알테플라제 비처리 계층 사이에 상당한 중첩이 있다.
[018] 도 4a-e. 네린티드는 플라스민에 의해 절단된다. (a) PBS 중의 플라스민과의 인큐베이션 후 네린티드의 LC/MS 스펙트럼. 네린티드(18 mg/mL) 및 플라스민(1 mg/mL)의 10 uL 분취량을 500 uL 인산염 완충 식염수 튜브에서 37C에서 5min 동안 인큐베이션하고, 테스트할 때까지 -80C로 냉각하여 반응을 중단시켰다. 다양한 피크는 표시된 단편에 상응한다. 삽입: 예측된 트립신 절단 부위 및 실제 절단 부위. (b, c) 래트(b) 및 인간(c) 혈장의 네린티드 함량에 대한 rt-PA의 시험관내 효과. 네린티드는 65 ug/ml 농도에서 t = 0에서 혈장 샘플에 스파이킹된 반면, 알테플라제(rt-PA)는 지시된 농도(d,e)에서 60 min 주입으로 투여되었다. 래트에서 Cmax(D) 및 AUC(E)에 대한 네린티드 및 rt-PA의 동시 투여의 생체내 효과. 네린티드 일시 주입 및 알테플라제(60 min 주입)는 2개의 별도의 정맥 라인을 통해 동시에 시작되었다. 기호는 평균 ± SD를 나타낸다. 네린티드 단독 그룹과 비교할 경우 (b), (c) 및 (d)의 유의한 차이는 별표(*)로 표시된다(사후 Sidak의 다중 비교 테스트로 양방향 ANOVA 반복 측정, *P<0.01). 네린티드 단독 그룹과 비교할 경우 네린티드 플러스 rt-PA(5.4 mg/kg)로부터의 유의한 차이(E)는 별표로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 일원 ANOVA 사후 Tukey 보정, *P<0.01) 도 4a에서 서열에 대한 서열 식별자는 네린티드 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO:3)이다. YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 3)(전장 NA-1, 분해되지 않음), RRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 4), RQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 5), QRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 6), RRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 7), RKLSSIESDV(SEQ ID NO: 8), KLSSIESDV(SEQ ID NO: 9), LSSIESDV(SEQ ID NO: 10).
[019] 도 5a-d. 네린티드 투여와 rt-PA로의 재관류 사이의 투여 분리는 네린티드의 치료 이점의 무효화를 해결한다. 네린티드(7.6 mg/kg)는 rt-PA(5.4 mg/kg, 10% 일시 주입 이어서 60분에 걸쳐 90%)의 60분 주입 시작 30분 전 또는 이와 동시에 정맥내 일시 주입으로 투여되었다. (a). 실험적 타임라인. BP = 혈압. TTC = 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드로의 염색. (b). eMCAo 후 24시간에 반구 경색 부피 측정. (c) eMCAo 후 24시간 반구 뇌 종창의 백분율 및 (d) eMCAo 후 24시간에 신경학적 스코어. 치료제는 (a)에서 표시한 시간에서 정맥내 투여되었다. 막대는 평균 ± SD를 나타내며, 모든 개별 데이터 지점이 플롯팅되었다. 유의한 차이(b) 및 (c)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시되거나 혈전용해제와 비교할 경우 숫자 기호로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 일원 ANOVA 사후 Tukey 보정, 각각 *P<0.01 또는 #P <0.01) N = 12-15 동물/군. 유의한 차이(d에서)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시되거나 혈전용해제와 비교할 경우 숫자 기호로 표시된다(다중 비교 테스트를 위한 사후 Dunn의 보정을 사용하여 순위에 대한 Kruskal-Wallis 분산 분석, 각각 *P<0.01 또는 #P <0.01).
[020] 도 6a-f. D-Tat-L-2B9c는 네린티드와 동일한 표적 친화성을 갖지만 혈전용해제에 의한 절단에 둔감하다. (a). 네린티드 및 D-Tat-L-2B9c는 PSD-95 PDZ2 도메인에 대한 유사한 결합 친화성을 갖는다. PSD-95의 PDZ2 도메인에 대한 지시된 바이오티닐화된 펩티드의 직접적인 ELISA. 네린티드 EC50 = 0.093 uM. D-Tat-L-2B9c EC50 = 0.151 uM. 기호는 삼중 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 모든 상호작용은 여러 번 적정되었으며, 일관된 결과를 보여주었다. (b). rt-PA(135 ug/ml) 또는 플라스민(10 ug/ml)으로의 공격접종 동안 PBS 중 네린티드(65 ug/ml) 또는 D-TAT-L-2B9c(65 ug/ml) 함량의 시간 경과. c,d. rt-PA(135 ug/ml)로의 공격접종 동안 래트 혈장(c) 및 인간 혈장(d)에서 네린티드 또는 D-TAT-L-2B9c 함량의 시간 경과. E,F. 테넥테플라제(TNK, 각각 37.5 ug/ml 또는 6.25 ug/ml)로의 공격접종 동안 래트 혈장(e) 및 인간 혈장(f)에서 네린티드 또는 D-TAT-L-2B9c 함량의 시간 경과. 네린티드 + 플라스민(b), 네린티드 + rt-PA(c,d) 및 네린티드 + TNK(e,f)로부터의 유의한 차이는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시된다. (사후 Sidak의 다중 비교 테스트로 양방향 ANOVA 반복 측정, *P<0.01). 기호는 평균 ± SD이다.
[021] 도 7a-c. 네린티드 및 D-TAT-L-2B9c는 유사한 약동학적 프로파일을 갖는다. (a). 래트에서 네린티드(7.6 mg/kg) 및 D-TAT-L-2B9c(7.6 mg/kg)의 정맥내 일시 투여의 시간 경과. 기호는 평균 ± SD를 나타낸다. 별표(*)는 플라시보 또는 대조군과 비교할 때 통계적 유의성을 나타낸다(*P < 0.01, 사후 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용한 양방향 반복 측정 ANOVA. (b). 시간 0에서 60min까지의 농도-시간 곡선하 영역. *P <0.05 짝을 이루지 않는 스튜던트-t 테스트. (c). 표시된 약동학적 매개변수의 비교(Cmax = 최대 농도, Tmax = Cmax에 도달하는 시간, T1/2 = 반감기, AUC (0-마지막) = 마지막 측정까지의 곡선하 영역, AUC (0-inf) = 무한대로의 외삽된 AUC, Cl = 제거.
[022] 도 8a-d. 뇌졸중 발병 1시간 후 D-Tat-L-2B9c와 rt-PA의 동시 투여는 eMCAO로 처리된 동물에서 경색 부피를 감소시킨다. a. 실험적 타임라인. BP = 혈압. TTC = 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드로 염색. b. 경색 부피, c. 반구 종창 및 d. eMCAo 후 24시간에 신경학적 스코어. D-Tat-L-2B9c 및 네린티드는 eMCAo 60분 후에 일시 주입으로 정맥내 투여하였다. 막대는 도시된 평균 ± SD를 나타내며, 모든 개별 데이터 지점이 플롯팅되었다. 유의한 차이(b) 및 (c)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시되거나 혈전용해제와 비교할 경우 숫자 기호로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 일원 ANOVA 사후 Tukey 보정, 각각 * P<0.01 또는 # P <0.01) N = 10-17 동물/군. 유의한 차이(d)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 사후 Dunn 보정을 사용한 순위에 대한 Kruskal-Wallis 분산 분석, * P<0.01). e. 경색 부피 및 반구 종창 평가를 위한 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색된 표시된 군의 대표적인 관상 뇌 조각.
[023] 도 9: 건강한 인간에게 투여한 후의 네린티드의 혈장 수준.
[024] 도 10a-c: 10분의 네린티드 주입 종료 후 10분에서 알테플라제 투여는 네린티드의 절단을 실질적으로 감소시킨다. 도 10a, 네린티드의 혈장 농도, 도 10b, 곡선하 면적 및 도 10c 약리학적 매개변수의 변화.
[025] 도 11a-b: 네린티드는 (a) 경색 크기 감소 및 (b) 신경학적 결손 감소에서 래트 tMCAo 모델에서 적어도 0.025-25 mg/kg의 용량 범위에 걸쳐 효과적이다.
[014] 도 1: 알테플라제 투여 유무에 따른 네린티드의 혈장 수준.
[015] 도 2a: 네린티드 처리군에 의한 수정된 랭킨(Rankin) 척도에 대한 일차 결과 분포를 보여주는 수평 누적 막대 그래프. 막대는 비율로 표지된다.
[016] 도 2b: 일반적인 치료 알테플라제 처리에 따른 네린티드 처리군에 의해 수정된 랭킨 척도에 대한 일차 결과 분포를 보여주는 수평 누적 막대 그래프. 막대는 비율로 표지된다.
[017] 도 3: 사전 지정된 하위그룹에서 네린티드 처리 효과의 산림도. 비교는 다중성을 위해 조정되지 않는다. 일차 분석(알테플라제, 혈관내 접근법, 연령, 성별, NIHSS 스코어, ASPECTS, 발생 위치, 부위)과 동일한 변수에 대해 조정된 효과 크기는 무작위화 계층에 의해 나타내고, 추가적인 사전 지정된 하위그룹에 따라 나타낸다. 2개의 사전 지정된 하위그룹은 이 플롯에 포함되지 않는다: (1) 치료 시작 시간 <=4h 또는 >4h로, 이는 6시간 임계값을 사용한 유사한 그룹화와 중복되었기 때문임; (2) 체중> 105-120 kg vs. 40-105 kg으로, 모델링이 불안정하게 되는 고체중 범주에 속하는 매우 소수의 환자. 일반적 치료에서 후속 시간 범위의 환자는 정맥내 알테플라제로 처리되지 않기 때문에 >6시간의 치료 시작 시간과 알테플라제 비처리 계층 사이에 상당한 중첩이 있다.
[018] 도 4a-e. 네린티드는 플라스민에 의해 절단된다. (a) PBS 중의 플라스민과의 인큐베이션 후 네린티드의 LC/MS 스펙트럼. 네린티드(18 mg/mL) 및 플라스민(1 mg/mL)의 10 uL 분취량을 500 uL 인산염 완충 식염수 튜브에서 37C에서 5min 동안 인큐베이션하고, 테스트할 때까지 -80C로 냉각하여 반응을 중단시켰다. 다양한 피크는 표시된 단편에 상응한다. 삽입: 예측된 트립신 절단 부위 및 실제 절단 부위. (b, c) 래트(b) 및 인간(c) 혈장의 네린티드 함량에 대한 rt-PA의 시험관내 효과. 네린티드는 65 ug/ml 농도에서 t = 0에서 혈장 샘플에 스파이킹된 반면, 알테플라제(rt-PA)는 지시된 농도(d,e)에서 60 min 주입으로 투여되었다. 래트에서 Cmax(D) 및 AUC(E)에 대한 네린티드 및 rt-PA의 동시 투여의 생체내 효과. 네린티드 일시 주입 및 알테플라제(60 min 주입)는 2개의 별도의 정맥 라인을 통해 동시에 시작되었다. 기호는 평균 ± SD를 나타낸다. 네린티드 단독 그룹과 비교할 경우 (b), (c) 및 (d)의 유의한 차이는 별표(*)로 표시된다(사후 Sidak의 다중 비교 테스트로 양방향 ANOVA 반복 측정, *P<0.01). 네린티드 단독 그룹과 비교할 경우 네린티드 플러스 rt-PA(5.4 mg/kg)로부터의 유의한 차이(E)는 별표로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 일원 ANOVA 사후 Tukey 보정, *P<0.01) 도 4a에서 서열에 대한 서열 식별자는 네린티드 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO:3)이다. YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 3)(전장 NA-1, 분해되지 않음), RRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 4), RQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 5), QRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 6), RRKLSSIESDV(SEQ ID NO: 7), RKLSSIESDV(SEQ ID NO: 8), KLSSIESDV(SEQ ID NO: 9), LSSIESDV(SEQ ID NO: 10).
[019] 도 5a-d. 네린티드 투여와 rt-PA로의 재관류 사이의 투여 분리는 네린티드의 치료 이점의 무효화를 해결한다. 네린티드(7.6 mg/kg)는 rt-PA(5.4 mg/kg, 10% 일시 주입 이어서 60분에 걸쳐 90%)의 60분 주입 시작 30분 전 또는 이와 동시에 정맥내 일시 주입으로 투여되었다. (a). 실험적 타임라인. BP = 혈압. TTC = 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드로의 염색. (b). eMCAo 후 24시간에 반구 경색 부피 측정. (c) eMCAo 후 24시간 반구 뇌 종창의 백분율 및 (d) eMCAo 후 24시간에 신경학적 스코어. 치료제는 (a)에서 표시한 시간에서 정맥내 투여되었다. 막대는 평균 ± SD를 나타내며, 모든 개별 데이터 지점이 플롯팅되었다. 유의한 차이(b) 및 (c)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시되거나 혈전용해제와 비교할 경우 숫자 기호로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 일원 ANOVA 사후 Tukey 보정, 각각 *P<0.01 또는 #P <0.01) N = 12-15 동물/군. 유의한 차이(d에서)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시되거나 혈전용해제와 비교할 경우 숫자 기호로 표시된다(다중 비교 테스트를 위한 사후 Dunn의 보정을 사용하여 순위에 대한 Kruskal-Wallis 분산 분석, 각각 *P<0.01 또는 #P <0.01).
[020] 도 6a-f. D-Tat-L-2B9c는 네린티드와 동일한 표적 친화성을 갖지만 혈전용해제에 의한 절단에 둔감하다. (a). 네린티드 및 D-Tat-L-2B9c는 PSD-95 PDZ2 도메인에 대한 유사한 결합 친화성을 갖는다. PSD-95의 PDZ2 도메인에 대한 지시된 바이오티닐화된 펩티드의 직접적인 ELISA. 네린티드 EC50 = 0.093 uM. D-Tat-L-2B9c EC50 = 0.151 uM. 기호는 삼중 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 모든 상호작용은 여러 번 적정되었으며, 일관된 결과를 보여주었다. (b). rt-PA(135 ug/ml) 또는 플라스민(10 ug/ml)으로의 공격접종 동안 PBS 중 네린티드(65 ug/ml) 또는 D-TAT-L-2B9c(65 ug/ml) 함량의 시간 경과. c,d. rt-PA(135 ug/ml)로의 공격접종 동안 래트 혈장(c) 및 인간 혈장(d)에서 네린티드 또는 D-TAT-L-2B9c 함량의 시간 경과. E,F. 테넥테플라제(TNK, 각각 37.5 ug/ml 또는 6.25 ug/ml)로의 공격접종 동안 래트 혈장(e) 및 인간 혈장(f)에서 네린티드 또는 D-TAT-L-2B9c 함량의 시간 경과. 네린티드 + 플라스민(b), 네린티드 + rt-PA(c,d) 및 네린티드 + TNK(e,f)로부터의 유의한 차이는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시된다. (사후 Sidak의 다중 비교 테스트로 양방향 ANOVA 반복 측정, *P<0.01). 기호는 평균 ± SD이다.
[021] 도 7a-c. 네린티드 및 D-TAT-L-2B9c는 유사한 약동학적 프로파일을 갖는다. (a). 래트에서 네린티드(7.6 mg/kg) 및 D-TAT-L-2B9c(7.6 mg/kg)의 정맥내 일시 투여의 시간 경과. 기호는 평균 ± SD를 나타낸다. 별표(*)는 플라시보 또는 대조군과 비교할 때 통계적 유의성을 나타낸다(*P < 0.01, 사후 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용한 양방향 반복 측정 ANOVA. (b). 시간 0에서 60min까지의 농도-시간 곡선하 영역. *P <0.05 짝을 이루지 않는 스튜던트-t 테스트. (c). 표시된 약동학적 매개변수의 비교(Cmax = 최대 농도, Tmax = Cmax에 도달하는 시간, T1/2 = 반감기, AUC (0-마지막) = 마지막 측정까지의 곡선하 영역, AUC (0-inf) = 무한대로의 외삽된 AUC, Cl = 제거.
[022] 도 8a-d. 뇌졸중 발병 1시간 후 D-Tat-L-2B9c와 rt-PA의 동시 투여는 eMCAO로 처리된 동물에서 경색 부피를 감소시킨다. a. 실험적 타임라인. BP = 혈압. TTC = 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드로 염색. b. 경색 부피, c. 반구 종창 및 d. eMCAo 후 24시간에 신경학적 스코어. D-Tat-L-2B9c 및 네린티드는 eMCAo 60분 후에 일시 주입으로 정맥내 투여하였다. 막대는 도시된 평균 ± SD를 나타내며, 모든 개별 데이터 지점이 플롯팅되었다. 유의한 차이(b) 및 (c)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시되거나 혈전용해제와 비교할 경우 숫자 기호로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 일원 ANOVA 사후 Tukey 보정, 각각 * P<0.01 또는 # P <0.01) N = 10-17 동물/군. 유의한 차이(d)는 대조군/네린티드 단독과 비교할 경우 별표로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 사후 Dunn 보정을 사용한 순위에 대한 Kruskal-Wallis 분산 분석, * P<0.01). e. 경색 부피 및 반구 종창 평가를 위한 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색된 표시된 군의 대표적인 관상 뇌 조각.
[023] 도 9: 건강한 인간에게 투여한 후의 네린티드의 혈장 수준.
[024] 도 10a-c: 10분의 네린티드 주입 종료 후 10분에서 알테플라제 투여는 네린티드의 절단을 실질적으로 감소시킨다. 도 10a, 네린티드의 혈장 농도, 도 10b, 곡선하 면적 및 도 10c 약리학적 매개변수의 변화.
[025] 도 11a-b: 네린티드는 (a) 경색 크기 감소 및 (b) 신경학적 결손 감소에서 래트 tMCAo 모델에서 적어도 0.025-25 mg/kg의 용량 범위에 걸쳐 효과적이다.
정의
[026]
"약학적 제형" 또는 조성물은 활성제가 효과적이게 하고 제형이 투여될 대상체에 독성이 있는 추가 성분이 결여된 제조물이다.
[027]
대문자 한 글자 아미노산 코드의 사용은 문맥에서 달리 지시하지 않는 한 D 또는 L 아미노산을 나타낼 수 있다. 소문자 단일 문자 코드는 D 아미노산을 나타내는데 사용된다. 글리신은 D형과 L형이 없으며, 따라서 대문자 또는 소문자로 상호교환가능하게 표시될 수 있다.
[028]
농도 또는 pH와 같은 숫자 값은 값이 측정될 수 있는 정확도를 반영하는 허용 오차 내에서 제공된다. 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 분수 값은 가장 가까운 정수로 반올림된다. 문맥에서 달리 요구하지 않는 한 값 범위의 언급은 해당 범위 내의 모든 정수 또는 하위 범위가 사용될 수 있음을 의미한다.
[029]
용어 "질병" 및 "질환"은 대상체에서 정상적인 구조 또는 기능의 임의의 방해 또는 중단을 나타내기 위해 동의어로 사용된다.
[030]
지정된 투여량은 상기 투여량이 통상적인 병원 환경에서 측정될 수 있는 정확도에서 고유한 오차 한계(margin of error)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[031]
용어 "분리된" 또는 "정제된"은 목표 종(예를 들어, 펩티드)이 샘플, 예를 들어, 목표 종을 함유하는 자연 공급원으로부터 수득된 샘플에 존재하는 오염물질로부터 정제된 것을 의미한다. 목표 종이 분리되거나 정제되는 경우, 이는 샘플에 존재하는 우세한 거대분자(예를 들어, 폴리펩티드) 종(즉, 몰을 기초로 하여, 이는 조성물의 임의의 다른 개별적 종보다 더 풍부함)이며, 바람직하게는 목표 종은 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50 퍼센트(몰을 기초로 함)를 포함한다. 일반적으로, 분리되거나, 정제되거나, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 80 내지 90 퍼센트 초과를 포함한다. 가장 바람직하게는, 목표 종은 본질적으로 동질성(즉, 통상적인 검출 방법에 의해 조성물 내에서 오염물질 종이 검출될 수 없음)으로 정제되고, 상기 조성물은 단일 거대분자 종을 필수적으로 포함한다. 용어 '분리된' 또는 '정제된'은 분리된 종과 조합하여 작용하는 것이 의도되는 다른 성분의 존재를 반드시 배제하지는 않는다. 예를 들어, 내재화 펩티드는, 활성 펩티드에 연결됨에도 불구하고 분리된 것으로 기재될 수 있다.
[032]
"펩티도미메틱(peptidomimetic)"은 자연 아미노산으로 구성된 펩티드와 실질적으로 동일한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 합성 화학 화합물을 나타낸다. 펩티도미메틱은 완전히 합성인 아미노산의 비-자연 유사체를 함유할 수 있거나, 부분적으로 자연 펩티드 아미노산 및 부분적으로 아미노산의 비-자연 유사체의 키메라 분자일 수 있다. 또한, 펩티도미메틱은 치환이 또한 모방체의 구조 및/또는 억제 또는 결합 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한 임의의 양의 자연 아미노산 보존성 치환을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 모방체 조성물은 통상적으로 a) 자연 아미드 결합("펩티드 결합") 연결이 아닌 잔기 결합 그룹; b) 자연 발생 아미노산 잔기를 대신하는 비-자연 잔기; 또는 c) 이차 구조 모방을 유도, 즉, 이차 구조, 예를 들어, 베타 턴, 감마 턴, 베타 시트, 알파 헬릭스 형태 등을 유도하거나 안정화시키는 잔기의 3개의 구조적 그룹으로부터 유래되는 비자연 구조 성분의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 활성 펩티드 및 내재화 펩티드를 포함하는 키메라 펩티드의 펩티도미메틱에서, 활성 모이어티(moiety) 또는 내재화 모이어티 또는 활성 모이어티 및 내재화 모이어티 둘 모두는 펩티도미메틱일 수 있다.
[033]
용어 "특정 결합"은 많은 다른 다양한 분자의 존재하에서도 또 다른 특정 분자(수용체)와 결합하는, 즉, 분자의 이종성 혼합물에서 또 다른 분자에 대한 한 분자의 우선적 결합을 나타내는 분자(리간드)의 능력을 특징으로 하는, 2개의 분자, 예를 들어, 리간드 및 수용체 사이의 결합을 나타낸다. 수용체에 대한 리간드의 특이적 결합은 또한 과량의 라벨링되지 않은 리간드의 존재(즉, 결합 경쟁 검정)하에서의 수용체에 대한 검출가능하게 라벨링된 리간드의 감소된 결합으로 나타난다.
[034]
흥분독성은 뉴런 및 주변 세포가 흥분 신경전달물질 글루타메이트에 대한 수용체, 예를 들어, NMDA 수용체, 예를 들어, NMDAR 2B 서브유닛을 갖는 NMDA 수용체의 과다활성에 의해 손상되고 사멸되는 병리학적 과정이다.
[035]
용어 "대상체"는 인간 및 수의 동물, 예를 들어, 포유동물 뿐만 아니라 실험실 동물 모델, 예를 들어, 전임상 연구에서 사용되는 마우스 또는 래트를 포함한다.
[036]
tat 펩티드는 5개 이하의 잔기가 서열 내에서 결실되거나, 치환되거나, 삽입되고, 세포로의 결합된 펩티드 또는 다른 제제의 흡수를 촉진하는 능력을 보유하는 RKKRRQRRR (SEQ ID NO:11)을 포함하거나 이로 구성된 펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 임의의 아미노산 변화는 보존성 치환이다. 바람직하게는, 집합체 내의 임의의 치환, 결실 또는 내부 삽입은, 바람직하게는 상기 서열의 것과 유사한 순수 양이온 전하를 갖는 펩티드를 남긴다. 이는 예를 들어, 임의의 R 또는 K 잔기를 치환시키지 않거나 동일한 총 R 및 K 잔기를 보유함으로써 달성될 수 있다. tat 펩티드의 아미노산은 염증 반응을 감소시키기 위해 비오틴 또는 유사한 분자로 유도체화될 수 있다.
[037]
약리학적 제제의 공동-투여는 상기 제제가 혈장에 동시에 존재하는 제제의 검출가능한 양에 대해 시간적으로 충분히 가깝게 투여되고/되거나, 상기 제제가 동일한 질병의 에피소드에 대해 치료 효과를 발휘하거나, 상기 제제가 동일한 질병의 에피소드를 치료하는데 있어서 협력적으로 또는 상승작용적으로 작용하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항-염증 제제는 2개의 제제가 항-염증 제제가 내재화 펩티드에 의해 유도가능한 항-염증 반응을 억제할 수 있도록 시간적으로 충분히 가깝게 투여되는 경우에 tat 펩티드를 포함하는 제제와 협력적으로 작용한다.
[038]
통계적으로 유의함은 <0.05, 바람직하게는 <0.01, 가장 바람직하게는 <0.001인 p-값을 나타낸다.
[039]
질병의 에피소드는 질병의 징후 및/또는 증상이 존재하는 기간이 상기 징후 및/또는 증상이 부재하거나 덜한 정도로 존재하는 더 긴 기간에 접하여 산재된 것을 의미한다.
[040]
약물 투여가 즉각적이지 않은 경우, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 간격은 투여 초기 시점부터 또는 투여 초기 시점까지 계산된다.
[041]
"NMDA 수용체" 또는 "NMDAR"이라는 용어는 하기에 기술되는 다양한 서브유닛 형태를 포함하는 NMDA와 상호작용하는 것으로 알려진 막 관련 단백질을 지칭한다. 이러한 수용체는 인간 또는 비인간(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이)일 수 있다.
상세한 설명
I.
일반적 사항
[042]
본 발명은 PSD-95의 펩티드 억제제, Tat-NR2B9c 및 관련 펩티드가 혈청 프로테아제인 플라스민에 의해 절단되며, 이는 tPA와 같은 혈전용해제에 의해 유도되는 관찰에 부분적으로 기초한다. Tat-NR2B9c 및 혈전용해제가 함께 투여되거나 시간상 충분히 근접하여 혈전용해제에 의해 유도된 플라스민과 Tat-NR2B9c 사이의 혈장 체류가 실질적으로 중첩되는 경우, Tat-NR2B9c의 절단이 발생하여 치료 효과를 감소시키거나 제거할 수 있다. 반대로 Tat-NR2B9c는 혈전용해제의 활성에 해로운 영향을 미치지 않는다. 혈전용해제에 의한 Tat-NR2B9c의 불활성화는, Tat-NR2B9c와 플라스민 사이의 혈장 체류에서 실질적인 중복을 피하기 위해 각 제제의 투여 간격 두기, 혈전용해 재관류 대신 기계적 사용 또는 플라스민에 의해 절단 처리되지 않은, PSD-95를 억제하는 활성제, 예를 들어 Tat-NR2B9c의 D-아미노산 변이체 사용을 포함하는 여러 접근 방법에 의해 감소되거나 회피될 수 있다.
II.
활성제
[043]
본 발명의 활성제는 PSD-95(예를 들어, Stathakism, Genomics 44(1):71-82 (1997))에 특이적으로 결합하여 NMDAR2B(예를 들어, GenBank ID 4099612) 및/또는 NOS(예를 들어, 뉴런 또는 nNOS Swiss-Prot P29475)를 포함하는 NMDA 수용체 2 서브유닛에의 결합을 억제한다. 바람직한 펩티드는 인간 대상체에서 사용하기 위한 PSD-95 NMDAR 2B 및 NOS의 인간 형태를 억제한다. 그러나, 억제는 또한 단백질의 종 변이체에서도 나타날 수 있다. 이러한 제제는 PSD-95 펩티드 억제제 및 내재화 펩티드를 포함하여 세포막 및 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 PSD-95 펩티드 억제제의 통과를 촉진할 수 있다. 이러한 제제에는 염기성 잔기 R 및 K의 정상 이상의 표현이 포함된다. 제제가 통상적인 L 아미노산으로 형성되는 경우, R 및 K 잔기의 과잉제시는 R 및 K 잔기와 C-말단 측의 근접 잔기 사이의 부위에서 플라스민 절단에 특히 민감하게 한다. 네린티드 또는 다른 활성제의 플라스민-민감성은 실시예에서와 같이 입증될 수 있다.
[044]
일부 펩티드 억제제는 이들의 C-말단에서 [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L] (SEQ ID NO:1)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 펩티드는 C-말단 아미노산으로서 ESDV (SEQ ID NO:12), ESEV (SEQ ID NO:13), ETDV (SEQ ID NO:14), ETAV (SEQ ID NO:15), ETEV (SEQ ID NO:16), DTDV (SEQ ID NO:17) 및 DTEV (SEQ ID NO:18)를 포함한다. 일부 펩티드는 이들의 C-말단에서 [I]-[E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L] (SEQ ID NO:19)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 펩티드는 C-말단 아미노산으로서 IESDV (SEQ ID NO:20), IESEV(SEQ ID NO:21), IETDV (SEQ ID NO:22), IETAV (SEQ ID NO:23), IETEV (SEQ ID NO:24), IDTDV (SEQ ID NO:25), 및 IDTEV (SEQ ID NO:26)를 포함한다. 일부 억제제 펩티드는 이들의 C-말단에서 [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L] (SEQ ID NO:1) 또는 C-말단에서 X1-[T/S]-X2V (SEQ ID NO:2)를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 여기서 [T/S]는 대체 아미노산이고, X1은 E, Q 및 A, 또는 이의 유사체 중으로부터 선택되고, X2는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 또는 이의 유사체 중으로부터 선택된다(문헌 [Bach, J. Med. Chem. 51, 6450-6459 (2008)] 및 WO 2010/004003 참조). 일부 억제제 펩티드는 C-말단에서 X3-[T/S]-X4-V (SEQ ID NO:27)를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 여기서 [T/S]는 대체아미노산이고, X3은 E, D, Q 및 A, 또는 이의 유사체 중으로부터 선택되고, X4는 A, Q, D, E, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D, N-Me-E 및 N-Me-N 또는 이의 유사체 중으로부터 선택된다. 임의적으로, 펩티드는 P3 위치(C-말단으로부터 세번째 아미노산, 즉, [T/S]에 의해 점유되는 위치)에서 N-알킬화된다. 펩티드는 사이클로헥산 또는 방향족 치환기와 함께 N-알킬화될 수 있고, 이는 치환기와 펩티드 또는 펩티드 유사체의 말단 아미노기 사이에 스페이서 기를 추가로 포함하며, 상기 스페이서는, 바람직하게는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌으로부터 선택되는 알킬기이다. 방향족 치환기는 1개 또는 2개의 할로겐 및/또는 알킬기로 치환된 나프탈렌-2-일 모이어티 또는 방향족 고리일 수 있다. 일부 억제제 펩티드는 C-말단에서 I-X1-[T/S]-X2-V (SEQ ID NO:28)를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 여기서 [T/S]는 대체아미노산이고, X1은 E, Q 및 A, 또는 이의 유사체 중으로부터 선택되고, X2는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 또는 이의 유사체 중으로부터 선택된다. 일부 억제제 펩티드는 C-말단에서 I-X3-[T/S]-X4-V (SEQ ID NO:29)를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 여기서 [T/S]는 대체아미노산이고, X3은 E, Q, A, 또는 D 또는 이의 유사체 중으로부터 선택되고, X4는 A, Q, D, E, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D, N-Me-E 및 N-Me-N 또는 이의 유사체 중으로부터 선택된다. 예시적인 억제제 펩티드는 서열 IESDV (SEQ ID NO:20), IETDV (SEQ ID NO:22), KLSSIESDV (SEQ ID NO:9), 및 KLSSIETDV (SEQ ID NO:30)를 갖는다. 억제제 펩티드는 일반적으로 3-25개 아미노산(내재화 펩티드 없음), 펩티드 길이 5-10개 아미노산을 가지며, 특히 9개 아미노산(또한, 내재화 펩티드 없음)이 바람직하다.
[045]
내재화 펩티드는 많은 세포 또는 바이러스 단백질이 막을 통과하는 것을 허용하는 널리 공지된 부류의 비교적 짧은 펩티드이다. 이들은 또한 세포 막 또는 혈액 뇌 장벽을 가로질러 연결된 펩티드의 통과를 촉진할 수 있다. 세포막 형질도입 펩티드, 단백질 형질도입 도메인, 뇌 셔틀 또는 세포 투과 펩티드로도 공지된 내재화 핍테드는, 예를 들어, 5-30개의 아미노산을 가질 수 있다. 상기 펩티드는 통상적으로 이러한 막을 통한 통과를 촉진시키는 것으로 생각되는 아르기닌 및/또는 리신 잔기의 상기 일반 표시(일반적으로, 단백질에 대한 표시)로부터 양이온 전하를 갖는다. 일부 상기 펩티드는 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 아르기닌 및/또는 리신 잔기를 갖는다. 예는 안텐나페디아(antennapedia) 단백질(Bonfanti, Cancer Res. 57, 1442-6 (1997))(및 이의 변이체), 인간 면역결핍 바이러스의 tat 단백질, 단백질 VP22, 단순 헤르페스 바이러스 타입 1의 UL49 유전자의 생성물, 페네트라틴(Penetratin), SynB1 및 3, 트랜스포르탄(Transportan), 암피파틱(Amphipathic), gp41NLS, polyArg, 및 여러 식물 및 박테리아 단백질 독소, 예를 들어, 리신(ricin), 아브린(abrin), 모데신(modeccin), 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 탄저병 독소, 열 민감 독소, 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A(ETA)를 포함한다. 다른 예는 다음과 같은 참고문헌에 기재되어 있다(Temsamani, Drug Discovery Today, 9(23):1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390:407-418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15: 1246-1253, 2004; Zhao, Medicinal Research Reviews 24(1):1-12, 2004; Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62:1839-49, 2005); Gao, ACS Chem. Biol. 2011, 6, 484-491, SG3 (RLSGMNEVLSFRWL (SEQ ID NO:31)), Stalmans, PLoS ONE 2013, 8(8) e71752, 1-11 and supplement; Figueiredo et al., IUBMB Life 66, 182-194 (2014); Copolovici et al., ACS Nano, 8, 1972-94 (2014); Lukanowski Biotech J. 8, 918-930 (2013); Stockwell, Chem. Biol. Drug Des. 83, 507-520 (2014); Stanzl et al. Accounts. Chem. Res/ 46, 2944-2954 (2013); Oller-Salvia et al., Chemical Society Reviews 45: 10.1039/c6cs00076b (2016); Behzad Jafari et al., (2019) Expert Opinion on Drug Delivery, 16:6, 583-605 (2019) (모두 참조로서 포함됨). 또 다른 전략은 PSD-95 억제제와 같은 화물 분자의 뇌 전달을 향상시키기 위해 추가 방법 또는 조성물을 사용한다(Dong, Theranostics 8(6): 1481-1493 (2018)).
[046]
바람직한 내재화 펩티드는 HIV 바이러스로부터의 tat이다. 이전의 연구에서 보고된 tat 펩티드는 HIV Tat 단백질에서 발견되는 표준 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)을 포함하거나 이로 구성된다. RKKRRQRRR(SEQ ID NO:11) 및 GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:32)도 사용될 수 있다. 상기 tat 모티프에 측접한 추가의 잔기가 존재(억제제 펩티드에 더함)하는 경우, 잔기는, 예를 들어, tat 단백질로부터의 상기 세그먼트에 측접하는 자연 아미노산, 2개의 펩티드 도메인을 연결시키는데 통상적으로 사용되는 부류의 스페이서 또는 링커 아미노산, 예를 들어, gly (ser)4(SEQ ID NO:33), TGEKP(SEQ ID NO:34), GGRRGGGS(SEQ ID NO:35), 또는 LRQRDGERP(SEQ ID NO:36)(예를 들어, Tang et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410) 참조)일 수 있거나, 측접한 잔기 없이 변이체의 흡수를 부여하는 능력을 유의하게 감소시키지 않는 임의의 다른 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 활성 펩티드가 아닌 측접하는 아미노산의 수는 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)의 어느 한 측에서 10개를 초과하지 않는다. 그러나, 바람직하게는 측접한 아미노산이 존재하지 않는다. YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)의 C-말단에 측접하는 추가의 아미노산 잔기를 포함하는 한 적합한 tat 펩티드 또는 다른 억제제 펩티드는 YGRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO:37)이다. 사용될 수 있는 다른 tat 펩티드는 GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO:38) 및 GRKKRRQRRRP (SEQ ID NO:39)를 포함한다.
[047]
감소된 N-타입 칼슘 채널에 결합하는 능력을 갖는 상기 tat 펩티드의 변이체는 WO/2008/109010호에 기재되어 있다. 상기 변이체는 아미노산 서열 XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:40) (여기서 X는 Y 이외의 아미노산임)을 포함하거나 이로 구성될 수 있거나, 아미노산 서열 GRKKRRQRRR (SEQ ID NO:32)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 바람직한 tat 펩티드는 F로 치환된 N-말단 Y 잔기를 갖는다. 따라서, FGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:41)을 포함하거나 이로 구성된 tat 펩티드가 바람직하다. 또 다른 바람직한 변이체 tat 펩티드는 GRKKRRQRRR (SEQ ID NO:32)을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 tat 펩티드는 RRRQRRKKRG (SEQ ID NO:42) 또는 RRRQRRKKRGY (SEQ ID NO:43)를 포함하거나 이로 구성된다. N-타입 칼슘 채널을 억제함이 없이 억제제 펩티드의 흡수를 촉진하는 다른 tat 유래 펩티드는 하기 제시되는 것들을 포함한다.
[048]
X는 유리 아미노 말단, 하나 이상의 아미노산 또는 컨쥬게이션된 모이어티를 나타낼 수 있다.
[049]
바람직한 활성제는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO:3)를 갖는 Tat-NR2B9c(NA-1 또는 네린티드로도 알려져 있음)이다. 또 다른 바람직한 제제는 YGRKKRRQRRRKLSSIETDV (SEQ ID NO:61)이다. 네린티드의 아미노산 모두는 L-아미노산이다. 이는 또한 상기 기술된 임의의 활성제에 대한 경우일 수 있다. 따라서, 네린티드 및 L-아미노산으로 형성된 기타 활성제는 플라스민 절단에 민감하다.
[050]
일부 활성제는 펩티드의 플라스민-매개된 절단을 감소 또는 제거하기 위한 D-아미노산을 포함한다. 이러한 제제에서, 억제제 펩티드의 적어도 4개의 C-말단 잔기 및 바람직하게는 억제제 펩티드의 5개 C-말단 잔기는 L 아미노산이며, 억제제 펩티드 및 내재화 펩티드의 잔여 잔기 중 적어도 하나는 D 잔기이다. D 잔기를 포함하기 위한 위치는 D 잔기가 임의의 염기성 잔기(즉, 아르기닌 또는 리신) 직후(즉, C-말단 측)에 나타나도록 선택될 수 있다. 플라스민은 이러한 염기성 잔기의 C-말단 측에서 펩티드 결합을 절단함으로써 작용한다. 특히, 염기성 잔기의 C-말단 측에서 절단 부위에 측접하는 D 잔기의 포함은 펩티드 절단을 감소시키거나 제거한다. 염기성 잔기의 C-말단 측 잔기의 일부 또는 전부는 D 잔기일 수 있다. 임의의 염기성 잔기는 D 아미노산일 수 있다.
[051]
일부 활성제는 내재화 펩티드 및 억제제 펩티드 둘 모두에서 적어도 하나의 D-아미노산을 포함한다. 일부 활성제는 내재화 펩티드의 각 위치에서 D-아미노산을 포함한다. 일부 활성제는 L-아미노산인 4개 또는 5개 C-말단 잔기를 제외하고 억제제 펩티드의 각 위치에서 D-아미노산을 포함한다. 일부 억제제 펩티드는 내재화 펩티드의 각 위치에서 및 마지막 4 또는 5개 C-말단 아미노산 잔기를 제외한 억제제 펩티드의 각 위치에서 D-아미노산을 포함하며, 이는 L-아미노산이다.
[052]
Tat-NR2B9c는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO:3)을 갖는다. 일부 활성제는 ESDV(SEQ ID NO:12) 또는 IESDV(SEQ ID NO:20)가 L-아미노산이고, 나머지 아미노산 중 적어도 하나는 D-아미노산인 이 서열의 변이체이다. 일부 활성제에서, C-말단으로부터의 8번째 및 9번째 위치에서 적어도 L 또는 K 잔기, 또는 둘 모두는 D 잔기이다. 일부 활성제에서, N-말단으로부터의 6번째, 7번째, 8번째, 10번째 및 11번째 위치를 차지하는 R, R, Q, R, R 잔기 중 적어도 하나는 D 잔기이다. 일부 활성제에서 이러한 잔기 모두는 D-잔기이다. 일부 활성제에서 잔기 4-8 및 10-13 잔기 각각은 D-아미노산이다. 일부 활성제에서, 각각의 잔기 4-13 또는 3-13은 D-아미노산이다. 일부 활성제에서 내재화 펩티드의 11개 잔기 각각은 D-아미노산이다. 일부 예시적인 활성제는 ygrkkrrqrrrklssIESDV (SEQ ID NO:62), ygrkkrrqrrrklssiESDV (SEQ ID NO:63), ygrkkrrqrrrklsSIESDV (SEQ ID NO:64), ygrkkrrqrrrklSSIESDV (SEQ ID NO:65), ygrkkrrqrrrkssIESDV (SEQ ID NO:66), ygrkkrrqrrrksIESDV (SEQ ID NO:67), 및 ygrkkrrqrrrkIESDV (SEQ ID NO:68)를 포함한다. 다른 활성제는 C-말단으로부터 세 번째 위치에 있는 S가 T로 대체된 상기 서열의 변이체를 포함한다: ygrkkrrqrrrklssIETDV (SEQ ID NO:69), ygrkkrrqrrrklssiETDV (SEQ ID NO:70), ygrkkrrqrrrklsSIETDV (SEQ ID NO:71), ygrkkrrqrrrklSSIETDV (SEQ ID NO:72), ygrkkrrqrrrkssIETDV (SEQ ID NO:73), ygrkkrrqrrrksIETDV (SEQ ID NO:74), 및 ygrkkrrqrrrkIETDV (SEQ ID NO:75). 활성제는 ygrkkrrqrrrIESDV (SEQ ID NO:76) (D-Tat-L-2B5c) 및 ygrkkrrqrrrIETDV (SEQ ID NO:77)를 포함한다.
[053]
본 발명은 또한 NOS에 대한 PSD-95 결합을 억제하는 억제제 펩티드에 예를 들어 융합 펩티드로서 연결된 내재화 펩티드를 포함하는 활성제를 포함하며, 여기서 내재화 펩티드는 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2), GRKKRRQRRR (SEQ ID NO:32), 또는 RKKRRQRRR (SEQ ID NO:11)을 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 억제제 펩티드는 내재화 펩티드 및 억제제 펩티드에서 최대 총 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환 또는 결실을 갖는 KLSSIESDV (SEQ ID NO:9) 또는 이의 변이체를 포함하는 서열을 갖는다. 이러한 활성제에서, 억제제 펩티드의 적어도 4 또는 5개의 C-말단 아미노산은 L-아미노산이며, R 및 K 잔기 모두를 포함하는 아미노산의 연속 분절 및 가장 C-말단에 R 또는 K 잔기에 대해 바로 C-말단에 있는 잔기는 D-아미노산이다. 따라서, 서열 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO:3)을 갖는 펩티드에서, 첫 번째 R에서 L 잔기까지의 연속 분절은 D-아미노산이다.
[054]
허용된 치환의 한 예는 억제제 펩티드의 C-말단에서 모티프 [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L] (SEQ ID NO:1)에 의해 제공된다. 예를 들어, C-말단으로부터의 세 번째 아미노산은 S 또는 T일 수 있다. 바람직하게는, 억제제 펩티드의 5개 C-말단 아미노산 각각은 L-아미노산이다. 바람직하게는, 다른 모든 아미노산은 활성제 ygrkkrrqrrrklssIESDV (SEQ ID NO:78)에서와 같이 D-아미노산이며, 여기서 소문자는 D-아미노산이고, 대문자는 L-아미노산이다.
[055]
D-아미노산을 갖는 바람직한 활성제는 Tat-NR2B9c 또는 달리 동일한 모든 L-할성제와 비교하여 래트 또는 일간 혈장에서 향상된 안정성(예를 들어, 반감기)을 갖는다. 안정성은 실시예에서와 같이 측정될 수 있다. 바람직한 활성제는 Tat-NR2B9c 또는 다른 동일한 모든 L 활성제와 비교하여 향상된 플라스민 내성을 갖는다. 플라스민 내성은 실시예에서와 같이 측정될 수 있다. 활성제는 바람직하게는 Tat-NR2B9c(전체 L)의 1.5배, 2배, 3배 또는 5배 내에서 PSD-95 또는 그렇지 않으면 동일한 모든 L 펩티드에 결합하거나 실험 오차 내에서 구별할 수 없는 결합을 갖는다. 바람직한 활성제는 Tat-NR2B9c, 또는 PSD-95에의 결합을 위한 PDZ 결합 도메인을 함유하는 NMDA 수용체 서브유닛 2 서열의 마지막 15-20개 아미노산을 함유하는 펩티드와 경쟁한다(예를 들어, 10배 과량의 활성제는 Tat-NR2B9c 결합을 적어도 10%, 25% 또는 50% 감소시킴). 경쟁은 활성제가 Tat-NR2B9c와 동일하거나 중첩되는 결합 부위에 결합한다는 표시를 제공한다. 동일하거나 중첩되는 결합 부위의 소유는 또한 PSD-95의 알라닌 돌연변이유발에 의해 나타날 수 있다. 동일하거나 중첩되는 잔기 세트의 돌연변이유발이 활성제 및 Tat-NR2B9c의 결합을 감소시키는 경우, 활성제 및 TAT-NR2B9c는 PSD-95 상의 동일하거나 중첩되는 부위에 결합한다.
[056]
본 발명의 활성제는 변형된 아미노산 잔기, 예를 들어, N-알킬화된 잔기를 함유할 수 있다. N-말단 알킬 변형은, 예를 들어, N-메틸, N-에틸, N-프로필, N-부틸, N-사이클로헥실메틸, N-사이클리헥실에틸, N-벤질, N-페닐에틸, N-페닐프로필, N-(3,4-디클로로페닐)프로필, N-(3,4-디플루오로페닐)프로필, 및 N-(나프탈렌-2-일)에틸)을 포함할 수 있다. 활성제는 또한 레트로 펩티드를 포함할 수 있다. 레트로 펩티드는 역 아미노산 서열을 갖는다. 펩티도미메틱은 또한 원래 C-말단 아미노산이 N-말단에서 보이고, D-아미노산이 L-아미노산 대신 사용되도록 아미노산의 순서가 역전된 레트로 인버소 펩티드를 포함한다 (예를 들어, RI-NA-1로도 공지된, 산 vdseisslkrrrqrrkkrgy (SEQ ID NO:79)).
[057]
펩티드, 펩티도미메틱 또는 다른 제제의 적절한 약리학적 활성은 요망시 영장류에서의 시험 전에 뇌졸중의 이전에 기재된 래트 모델 및 본 출원에 기재된 임상 시험을 이용하여 입증될 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 또한, 예를 들어, 참조로서 포함되는 US 20050059597호에 기재된 검정을 이용하여 PSD-95와 NMDAR 2B 사이의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 유용한 펩티드 또는 기타 제제는 통상적으로 상기 검정에서 50 μM, 25 μM, 10 μM, 0.1 μM 또는 0.01 μM 미만의 IC50 값을 갖는다. 바람직한 펩티드 또는 기타 제제는 통상적으로 0.001 내지 1 μM, 및 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.05, 0.05 내지 0.5 또는 0.05 내지 0.1 μM의 IC50 값을 갖는다. 펩티드 또는 기타 제제가 하나의 상호작용, 예를 들어, NMDAR2B에 대한 PSD-95 상호작용의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 경우, 상기 기재는 펩티드 또는 제제가 또한, 예를 들어, nNOS에 대한 PSD-95 결합의 억제와 같은 또 다른 상호작용을 억제하는 것을 배제하지 않는다.
[058]
상기 기재된 것과 같은 펩티드는 임의적으로 억제제의 결합 친화성을 개선시키거나, 세포막을 가로질러 운반되는 억제제의 능력을 개선시키거나, 안정성을 개선시키기 위해 유도체화(예를 들어, 아세틸화, 인산화, 미리스토일화, 제라닐화(geranylation), 페길화 및/또는 글리코실화)될 수 있다. 특정 예로서, C-말단으로부터의 세번째 잔기가 S 또는 T인 억제제에 대해, 상기 잔기는 펩티드의 사용 전에 인산화될 수 있다.
[059]
내재화 펩티드는 통상적인 방법에 의해 억제제 펩티드에 부착될 수 있다. 예를 들어, 제제는 화학적 결합, 예를 들어, 커플링 또는 컨쥬게이션 제제에 의해 내재화 펩티드에 연결될 수 있다. 다수의 상기 제제는 시판되며, 문헌[S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)]에 의해 개관되어 있다. 가교 시약의 일부 예는 J-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드; N,N'-에틸렌-비스-(아이오도아세트아미드) 또는 6 내지 11개의 탄소 메틸렌 브릿지(비교적 설프히드릴기에 특이적임)를 갖는 다른 상기 시약; 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(아미노 및 티로신기와 비가역적 결합을 형성함)을 포함한다. 다른 가교 시약은 p,p'-디플루오로-m,m'-디니트로디페닐설폰(아미노 및 페놀기와 비가역적 가교를 형성함); 디메틸 아디프이미데이트(아미노기에 특이적임); 페놀-1,4-디설포닐클로라이드(주로 아미노기와 반응함); 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 디이소티오시아네이트, 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트(주로 아미노기와 반응함); 글루타르알데하이드(여러 상이한 측쇄와 반응함) 및 디스디아조벤지딘(주로 티로신 및 히스티딘과 반응함)을 포함한다.
[060]
링커, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 링커는 탠덤(tandem) PDZ 도메인을 함유하는 단백질에 대한 친화성 및 선택성을 향상시키기 위해 펩티드 또는 펩티도미메틱의 활성 모이어티를 이합체화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bach et al., (2009) Angew. Chem. Int. Ed. 48:9685-9689] 및 WO 2010/004003호를 참조. PL 모티프-함유 펩티드는 바람직하게는 2개의 상기 분자의 N-말단을 연결시킴으로써 이합체화되어, C-말단이 자유롭게 된다. Bach는 NMDAR 2B의 C-말단으로부터의 펜타머 펩티드 IESDV(SEQ ID NO:20)가 PSD-95에 대한 NMDAR 2B의 결합을 억제하는데 있어서 효과적임을 추가로 보고한다. IETDV(SEQ ID NO:22)는 또한 IESDV(SEQ ID NO:20) 대신에 사용될 수 있다. 임의적으로, PEG의 약 2-10개 복사체가 링커로서 한 줄로 연결될 수 있다. 임의적으로, 링커는 또한 세포 흡수를 향상시키기 위해 내재화 펩티드에 부착되거나 지질화될 수 있다. 예시적 이합체 억제제의 예가 하기에 제시된다(Bach et al., PNAS 109 (2012) 3317-3322 참조). 본원에 개시된 PSD-95 억제제 중 임의의 PSD-95 억제제가 IETDV(SEQ ID NO:22) 대신 사용될 수 있고, 임의의 내재화 펩티드 또는 지질화 모이어티가 tat 대신 사용될 수 있다. 제시된 것과 다른 링커가 또한 사용될 수 있다.
[061]
내재화 펩티드는 또한 융합 펩티드로서 억제제 펩티드에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 억제제 펩티드의 N-말단에 연결된 내재화 펩티드의 C-말단을 갖는 억제제 펩티드가 자유 C-말단을 갖게 된다.
[062]
내재화 펩티드에 펩티드(또는 다른 제제)를 연결시키는 것 대신 또는 연결시키는 것에 더하여, 상기 펩티드는 펩티드 단독에 비해 컨쥬게이트의 소수성을 증가시킴으로써, 세포막 및/또는 뇌장벽을 가로지르는 연결된 펩티드의 통과를 촉진시키기 위해 지질에 연결(지질화)될 수 있다. 지질화는 바람직하게는 N-말단 아미노산에서 수행되나, 또한 PSD-95와 NMDAR 2B 사이의 상호작용을 억제하는 펩티드의 능력이 50% 초과까지 감소되지 않는 한 내부 아미노산에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 지질화는 5개의 가장 C-말단의 아미노산 중 하나가 아닌 아미노산에 대해 수행된다. 지질은 물에서보다 에테르에서 더욱 가용성인 유기 분자이며, 이는 지방산, 글리세라이드 및 스테롤을 포함한다. 지질화의 적합한 형태는 미리스토일화, 팔미토일화 또는 바람직하게는 10-20개의 탄소의 사슬 길이를 갖는 다른 지방산, 예를 들어, 라우르산 및 스테아르산의 부착, 뿐만 아니라 제라닐화, 제라닐제라닐화(geranylgeranylation), 및 이소프레닐화를 포함한다. 자연 단백질의 번역후 변형을 발생시키는 타입의 지질화가 바람직하다. 펩티드의 N-말단 아미노산의 알파-아미노기에 대한 아미드 결합의 형성을 통해 지방산을 갖는 지질화가 또한 바람직하다. 지질화는 미리 지질화된 아미노산을 포함하는 펩티드 합성에 의해 수행될 수 있거나, 시험관내에서 효소적으로 수행될 수 있거나, 재조합 발현에 의해 수행될 수 있거나, 펩티드의 화학적 가교 또는 화학적 유도체화에 의해 수행될 수 있다. 미리스토일화 및 다른 지질 변형에 의해 변형된 아미노산이 시판된다. 내재화 펩티드 대신 지질을 사용하면 플라스민 절단 부위를 제공하는 K 및 R 잔기의 수가 감소한다. 일부 예시적인 지질화된 분자는 바람직하게는 N-말단에서 지질화를 갖는 KLSSIESDV (SEQ ID NO:9), klSSIESDV (SEQ ID NO:80), lSSIESDV (SEQ ID NO:81), LSSIESDV (SEQ ID NO:10), SSIESDV (SEQ ID NO:82), SIESDV (SEQ ID NO:83), IESDV (SEQ ID NO:20), KLSSIETDV (SEQ ID NO:29), klSSIETDV (SEQ ID NO:84), lSSIETDV (SEQ ID NO:85), LSSIETDV (SEQ ID NO:86), SSIETDV (SEQ ID NO:87), SIETDV (SEQ ID NO:88), IETDV (SEQ ID NO:22)를 포함한다.
[063]
임의적으로 내재화 펩티드에 융합된 억제제 펩티드는 고상 합성 또는 재조합 방법에 의해 합성될 수 있다. 과학 및 특허 문헌, 예를 들어, 문헌[Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234]에 기재된 다양한 절차 및 방법을 이용하여 펩티도미메틱이 합성될 수 있다.
III.
염
[064]
상기 설명된 유형의 펩티드는 전형적으로 고체 상태 합성에 의해 제조된다. 고체 상태 합성은 수지로부터 보호기를 제거하거나 펩티드를 제거하기 위해 트리플루오로아세테이트(TFA)를 사용하기 때문에, 펩티드는 전형적으로 트리플루오로아세테이트 염으로서 초기에 생성된다. 트리플루오로아세테이트는 예를 들어, 펩티드를 고체 지지체, 예컨대 컬럼에 결합시키고, 컬럼을 세척하여 기존 반대이온을 제거하고, 컬럼을 새로운 반대이온을 함유하는 용액으로 평형화한 다음 예를 들어, 아세토니트릴과 같은 소수성 용매를 컬럼 내에 도입시킴으로써 펩티드를 용출시킴으로써 또 다른 음이온으로 대체될 수 있다. 트리플루오로아세테이트의 아세테이트로의 대체는 펩티드가 다른 통상적인 고체 상태 합성에서 용출되기 전 마지막 단계로서의 아세테이트 세척으로 수행될 수 있다. 트리플루오로아세테이트 또는 아세테이트의 클로라이드로의 대체는 염화암모늄으로 세척한 후 용출하여 수행될 수 있다. 소수성 지지체의 사용이 바람직하며, 분취용 역상 HPLC가 이온 교환에 특히 바람직하다. 트리플루오로아세테이트는 클로라이드로 직접적으로 대체되거나 먼저 아세테이트로 대체된 다음 아세테이트는 클로라이드로 대체될 수 있다.
[065]
트리플루오로아세테이트, 아세테이트 또는 염화물이든 반대이온은 Tat-NR2B9c 및 이의 D-변이체, 특히 N-말단 아미노기 및 아미노 측쇄 아르기닌 및 리신 잔기 상의 양으로 하전된 원자에 결합한다. 본 발명의 실시에도 불구하고, Tat-NR2B9c 및 이의 D-변이체의 염에서 음이온에 대한 펩티드의 정확한 화학량론을 이해하는 것에 의존적이지 않지만, 염 분자 당 최대 약 9개의 반대이온 분자가 존재하는 것으로 여겨진다.
[066]
한 반대이온의 또 다른 반대이온에 의한 교체가 효율적으로 발생하지만, 최종 반대이온의 순도는 100% 미만일 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 Tat-NR2B9c 또는 이의 D-변이체의 염화물 염에 대한 언급은 염의 제조에서, 염화물은 염의 집합체에 존재하는 모든 다른 음이온에 비해 중량(또는 몰) 기준으로 우세한 음이온임을 의미한다. 다시 말해서, 염화물은 염 또는 제형에 존재하는 모든 음이온의 중량 또는 몰 기준이 50% 초과, 및 바람직하게는 75%, 95%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 초과를 구성한다. 이러한 염 또는 염으로부터 제조된 제형에서, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트는 조합되어 및 개별적으로 중량 또는 몰 기준으로 염 또는 제형 중의 음이온의 50%, 25%, 5%, 1%, 0.5% 또는 0.1 미만을 구성한다.
IV.
제형
[067]
활성제는 액체 제형 또는 동결건조된 제형에 혼입될 수 있다. 액체 제형은 완충제, 염 및 물을 포함할 수 있다. 바람직한 완충제는 인산나트륨이다. 바람직한 염은 염화나트륨이다. pH는 예를 들어, pH7.0 또는 대략 생리적 pH일 수 있다.
[068]
동결건조된 제형은 활성제, 완충제, 증량제 및 물을 포함하는 사전동결건조된 제형으로부터 제조될 수 있다. 동결 또는 동결보존제와 같은 다른 성분, 등장화제, 약학적으로 허용되는 담체 등이 존재할 수 있거나 존재할 수 있다. 바람직한 완충제는 히스티딘이다. 바람직한 증량제는 트레할로스이다. 트레할로스는 또한 냉동 및 동결-보존제로서 작용한다. 예시적인 사전동결건조된 제형은 활성제, 히스티딘(10-100 mM, 15-100 mM 15-80 mM, 40-60 mM 또는 15-60 mM, 예를 들어, 20 mM 또는 임의적으로 50 mM, 또는 20-50 mM)) 및 트레할로스(50-200 mM, 바람직하게는 80-160 mM, 100-140 mM, 더욱 바람직하게는 120 mM)를 포함한다. pH는 5.5 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 6 내지 7, 더욱 바람직하게는 6.5이다. 활성제의 농도는 20-200 mg/ml, 바람직하게는 50-150 mg/ml, 더욱 바람직하게는 70-120 mg/ml 또는 90 mg/ml이다. 따라서, 예시적인 사전동결건조된 제형은 20 mM 히스티딘, 120 mM 트레할로스 및 90 mg/ml 활성제의 염화물 염이다. 임의적으로, US 10,206,878에 기술된 바와 같이 라이신과 같은 아세틸화 스캐빈저를 포함하여 제형에서 임의의 잔여 아세테이트 또는 트리플루오로아세테이트를 추가로 감소시킬 수 있다.
[069]
동결건조 후, 동결건조된 제형은 낮은 물 함량, 바람직하게는 약 0 중량%-5 중량% 물, 더욱 바람직하게는 2.5 중량% 미만의 물을 갖는다. 동결건조된 제형은 냉동기(예를 들어, -20 또는 -70℃), 냉장기(0-40℃) 또는 실온(20-25℃)에서 보관될 수 있다.
[070]
활성제는 수용액, 바람직하게는 주사용수 또는 임의적으로 일반 식염수(0.8-1.0% 식염수 및 바람직하게는 0.9% 식염수)에서 재구성될 수 있다. 재구성은 사전동결건조된 제형과 동일하거나 더 적거나 더 큰 부피로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 부피는 재구성 후 그 전보다 더 크다(예를 들어, 3-6배 더 큼). 예를 들어, 3-5 ml의 사전동결건조된 부피는 특히 10 mL, 12 mL, 13.5 mL, 15 mL 또는 20 mL 또는 10-20 mL의 부피로 재구성될 수 있다. 재구성 후, 히스티딘의 농도는 바람직하게는 2-20 mM, 예를 들어, 2-7 mM, 4.0-6.5 mM, 4.5 mM 또는 6 mM이며; 트레할로스의 농도는 바람직하게는 15-45 mM 또는 20-40 mM 또는 25-27 mM 또는 35-37 mM이다. 리신의 농도는 바람직하게는, 100-300 mM, 예를 들어, 150-250 mM, 150-170 mM 또는 210-220 mM이다. 활성제는 바람직하게는 10-30 mg/ml, 예를 들어 15-30, 18-20, 20 mg/ml의 활성제 또는 25-30, 26-28 또는 27 mg/mL 활성제의 농도이다. 재구성 후 예시적인 제형은 4-5 mM 히스티딘, 26-27 mM 트레할로스, 150-170 mM 리신 및 20 mg/ml 활성제 (가장 가까운 정수로 반올림된 농도)를 갖는다. 재구성 후 제2 예시적 제형은 5-7 mM 히스티딘, 35-37 mM 트레할로스, 210-220 mM 리신 및 26-28 mg/ml 활성제를 갖는다(가장 가까운 정수로 반올림된 농도). 재구성된 제형은 예컨대, 생리 식염수를 함유하는 유체 백에 첨가함으로써 투여 전에 추가로 희석될 수 있다.
V.
질환
[071]
본 방법은 허혈, 특히 CNS의 허혈, 및 더욱 특히 허혈성 뇌졸중, 예컨대 급성 허혈성 뇌졸중으로 인한 질환을 치료하는데 유용하다. 혈전용해제 또는 기계적 재관류로의 치료는 허혈을 유발하는 혈관의 막힘을 제거하는 작용을 한다. PSD-95를 억제하는 활성제로의 처리는 허혈의 손상 효과를 감소시키는 작용을 한다.
[072]
뇌졸중은 원인에 상관 없이 CNS 내의 손상된 혈류로부터 발생하는 질환이다. 잠재적 원인에는 색전증, 출혈 및 혈전증을 포함한다. 일부 신경 세포는 혈류 장애로 인해 즉시 죽는다. 이들 세포는 글루타메이트를 포함하는 이들의 성분 분자를 방출하고, 이는 차례로 NMDA 수용체를 활성화시키고, 세포내 칼슘 수준, 및 세포내 효소 수준을 상승시켜, 추가의 신경 세포 사멸을 발생시킨다(흥분독성 캐스케이드). CNS 조직의 사멸은 경색증으로 언급된다. 경색 부피(즉, 뇌 내의 뇌졸중으로부터 발생하는 사멸한 신경 세포의 부피)는 뇌졸중으로부터 발생하는 병리학적 손상의 정도의 지표로 사용될 수 있다. 대증 결과는 경색의 부피 및 뇌 내에서의 경색의 위치 둘 모두에 좌우된다. 장애 지수, 예를 들어, 랜킨 뇌졸중 결과 척도(Rankin Stroke Outcome Scale)(Rankin, Scott Med J;2:200-15(1957)) 및 바텔 지수(Barthel Index)가 대증 손상의 척도로 사용될 수 있다. 랜킨 척도는 하기와 같이 대상체의 전체적인 상태를 직접 평가하는 것을 기초로 한다.
0: 증상이 전혀 없음
1: 증상에도 불구하고 유의한 장애가 없음; 모든 일상적인 직무 및 활동을 수행할 수 있음.
2. 약간의 장애; 모든 이전의 활동을 수행할 수 없으나, 도움 없이 자신의 일을 돌볼 수 있음.
3: 약간의 도움을 필요로 하는 중간 장애, 그러나 도움 없이 보행할 수 있음
4. 중등도 내지 중증의 장애; 도움 없이 보행할 수 없고, 도움 없이 자신의 신체적 용무를 수행할 수 없음.
5: 중증 장애; 누워 있음, 실금, 및 항시적인 간호 및 주의를 필요로 함.
[073]
바텔 지수는 대상체의 일상의 10개의 기본적인 활동을 수행하는 능력에 관한 일련의 질문을 기초로 하고, 0 내지 100의 스코어를 발생시키며, 낮은 스코어는 더욱 심한 장애를 나타낸다(Mahoney et al., Maryland State Medical Journal 14:56-61 (1965)).
[074]
대안적으로, 뇌졸중 중증도/결과는 월드 와이드 웹 ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf에서 이용가능한 NIH 뇌졸중 척도를 이용하여 측정될 수 있다.
[075]
상기 척도는 대상체의 의식, 운동, 감각 및 언어 기능의 수준의 평가를 포함하는 11개 그룹의 기능을 수행하는 대상체의 능력을 기초로 한다.
[076]
허혈성 뇌졸중은 더욱 특히 뇌로의 혈류의 봉쇄에 의해 야기되는 뇌졸중의 한 유형을 나타낸다. 상기 유형의 봉쇄에 대한 기초적 질환은 가장 일반적으로는 혈관벽 내층의 지방 침착의 발생이다. 이러한 질환은 죽상경화증으로 언급된다. 이들 지방 침착은 2개 유형의 폐색을 야기시킬 수 있다. 뇌혈전증은 혈관의 막힌 부분에서 발생하는 혈전(혈병)을 나타낸다. "뇌색전증"은 일반적으로 순환계, 일반적으로 심장 및 상부 흉부 및 목의 대동맥 내의 또 다른 위치에서 형성되는 혈병을 나타낸다. 이후, 혈병의 일부가 방출되고, 혈류로 진입하고, 통과하기에 너무 작은 혈관에 도달할 때까지 뇌의 혈관을 통해 이동한다. 색전증의 두번째의 중요한 원인은 동맥 세동으로 공지된 불규칙한 심박이다. 이는 혈병이 심장에서 형성되고, 이동하고, 뇌로 전해질 수 있는 질환을 발생시킨다. 허혈성 뇌졸중의 추가의 잠재적 원인은 출혈, 혈전증, 동맥 또는 정맥의 박리, 심장 정지, 출혈을 포함하는 임의의 원인의 쇼크, 및 의인성 원인, 예를 들어, 뇌 또는 심장 수술을 초래하는 뇌혈관 또는 혈관들에 대한 직접적인 외과적 손상이다. 허혈성 뇌졸중은 모든 뇌졸중 사례의 약 83 퍼센트에 해당한다.
[077]
일과성 허혈 발작(TIA)은 작은 또는 경계 뇌졸중이다. TIA에서, 허혈성 뇌졸중을 나타내는 질환이 존재하고, 통상적인 뇌졸중 경계 징후가 발생한다. 그러나, 폐색(혈병)이 단기간 동안 발생하고, 일반적인 메커니즘을 통해 자연히 해소되는 경향이 있다. 심장 수술을 겪는 환자는 일과성 뇌 허혈 발작의 위험이 특히 존재한다.
[078]
출혈성 뇌졸중은 뇌졸중 사례의 약 17 퍼센트에 해당한다. 이는 파열되고, 주위 뇌로 출혈되는 약해진 혈관으로부터 발생한다. 혈액은 축적되고, 주위 뇌 조직을 압박한다. 출혈성 뇌졸중의 2개의 일반적 유형은 뇌내 출혈 및 거미막밑 출혈이다. 출혈성 뇌졸중은 약해진 혈관의 파열로부터 발생한다. 약해진 혈관으로부터의 파열의 잠재적 원인은 높은 혈압이 혈관의 파열을 야기시키는 고혈압성 출혈, 또는 뇌 동맥류, 동정맥 기형(AVM) 또는 해면 기형을 포함하는 파열된 뇌 혈관 기형과 같은 약해진 혈관의 또 다른 기초적 원인을 포함한다. 출혈성 뇌졸중은 또한 경색 내의 혈관을 약화시키는 허혈성 뇌졸중의 출혈성 전환, 또는 비정상적으로 약한 혈관을 함유하는 CNS에서의 원발성 또는 전이성 종양으로부터의 출혈로부터 발생할 수 있다. 출혈성 뇌졸중은 또한 의인성 원인, 예를 들어, 뇌혈관에 대한 직접적인 외과적 손상으로부터 발생할 수 있다. 동맥류는 혈관의 약해진 영역의 풍선확장이다. 치료되지 않고 방치되는 경우, 동맥류는 파열되고, 뇌로 출혈될 때까지 지속적으로 약해진다. 동정맥 기형(AVM)은 비정상적으로 형성된 혈관의 집단이다. 해면 기형은 약해진 정맥 구조로부터 출혈을 야기시킬 수 있는 정맥 이상이다. 상기 혈관 중 어느 하나가 파열되고, 또한 뇌로의 출혈을 야기시킬 수 있다. 출혈성 뇌졸중은 또한 신체적 외상으로부터 발생할 수 있다. 뇌의 한 부분에서의 출혈성 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중에서 손실된 혈액의 부족을 통해 또 다른 부분에서 허혈성 뇌졸중을 초래할 수 있다.
[079]
치료를 받을 수 있는 한 대상체는 뇌, 또는 뇌 또는 CNS에 공급하는 혈관을 포함하거나 포함할 수 있는 외과적 절차를 받은 대상체이다. 일부 예는 심폐 우회술, 스텐트 삽입술, 대동맥궁의 뇌 또는 관상 동맥의 진단성 혈관조영술, 혈관 수술 절차 및 신경외과 절차를 받은 대상체이다. 이러한 대상체의 추가적인 예는 상기 IV 단락에서 논의된다. 뇌동맥류가 있는 환자가 특히 적합하다. 이러한 대상체는 동맥류를 잘라내어 혈액을 차단하거나, 작은 코일로 동맥류를 차단하거나 동맥류가 나오는 혈관에 스텐트를 삽입하는 혈관내 수술을 수행하거나, 마이크로카테터를 삽입하는 것을 포함하는 다양한 수술 절차로 치료될 수 있다. 혈관내 절차는 동맥류를 자르는 것보다 덜 침습적이며, 더 나은 대상체 결과와 관련이 있지만, 결과는 여전히 작은 경색의 높은 발병률을 포함한다. 이러한 대상체는 NMDAR 2B 및 특히 상기 기재된 활성제와의 PSD95 상호작용의 억제제로 치료될 수 있다. 수술 수행과 관련된 투여 시점은 임상 시험에 대해 위에서 설명한 바와 같을 수 있다.
[080]
대상체의 또 다른 부류는 ESCAPE-NA1 시험 (NCT02930018)과 같이 혈전을 제거하기 위한 혈관내 혈전절제술의 후보인 허혈성 뇌졸중이 있는 대상체이다. 약물은 혈전을 제거하기 위해 수술 전 또는 후에 투여될 수 있으며, 뇌졸중 자체 및 상기 논의된 바와 같은 절차와 관련된 임의의 잠재적 의원성 뇌졸중 모두로부터의 결과를 개선할 것으로 예상된다. 또 다른 예는 영상 기준을 사용하지 않고 잠재적인 뇌졸중으로 진단받고 뇌졸중 후 몇 시간 이내에, 바람직하게는 처음 3시간 이내에 치료를 받지만 임의적으로 뇌졸중 발병 후 처음 6, 9 또는 12시간 이내에 치료를 받는 대상체이다(NCT02315443과 유사).
VI.
재관류와 PSD-95를 억제하는 활성제의 공동-투여
[081]
허혈을 야기시키는 플라크 및 혈병(색전으로도 공지됨)은 약리학적 및 물리적 수단 둘 모두에 의해 용해되거나, 제거되거나, 회피될 수 있다. 플라크 및 혈병의 용해, 제거 및 결과로서 발생하는 혈류의 회복은 재관류로 언급된다. 한 부류의 제제는 혈전용해에 의해 작용한다. 혈전용해제는 플라스미노겐으로부터의 플라스민의 생성을 촉진함으로써 작용한다. 플라스민은 가교된 섬유소 망(혈병의 백본)을 청소하여 혈병을 가용성이 되도록 만들고, 다른 효소에 의한 추가 단백질분해에 적용되도록 하며, 폐색된 혈관에서 혈류를 회복시킨다. 혈전용해제의 예는 조직 플라스미노겐 활성제 t-PA, 알테플라제(ACTIVASE°), 레테플라제(reteplase)(RETAVASE°), 테넥테플라제(tenecteplase)(TNKase°), 아니스트레플라제(anistreplase)(EMINASE°), 스트렙토키나제(streptokinase)(KABIKINASE°, STREPTASE°), 및 유로키나제(urokinase)(ABBOKINASE®)를 포함한다.
[082]
재관류에 사용될 수 있는 또 다른 부류의 약물은 혈관확장제이다. 이들 약물은 혈관을 이완시키고 개방시켜, 이에 따라 폐색 주위로 혈액이 유동하는 것을 가능케 함으로써 작용한다. 혈관확장제 유형의 일부 예는 알파-아드레날린수용체 길항제(알파-차단제), 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), β2-아드레날린수용체 효능제, 칼슘-채널 차단제(CCB), 중추적으로 작용하는 교감신경차단제, 직접 작용하는 혈관확장제, 엔도텔린 수용체 길항제, 신경절 차단제, 니트로딜레이터(nitrodilator), 포스포디에스테라제 억제제, 포타슘-채널 개방제, 및 레닌 억제제를 포함한다.
[083]
재관류에 사용될 수 있는 또 다른 부류의 약물로는 고혈압제(즉, 혈압을 상승시키는 약물), 예컨대, 에피네프린(epinephrine), 페닐에프린(phenylephrine), 슈도에페드린(pseudoephedrine), 노르에피네프린(norepinephrine); 노르에페드린(norephedrine); 터부탈린(terbutaline); 살부타몰(salbutamol); 및 메틸에페드린(methylephedrine)이 있다. 증가된 관류 압력은 폐색 주위의 혈액의 흐름을 증가시킬 수 있다.
[084]
재관류의 기계적 방법은 혈관성형술, 카테터삽입, 및 동맥 우회 이식 수술, 스텐팅(stenting), 색전제거술, 또는 혈관내 혈전절제술을 포함한다. 이러한 절차는 플라크의 기계적 제거에 의해 플라크 유동을 복원시키고, 혈관을 개방된 채로 유지시켜, 혈액이 플라크 주위로 유동할 수 있거나 플라크를 우회할 수 있다.
[085]
재관류의 다른 기계적 방법은 신체의 다른 영역으로부터 뇌로 혈류를 전환시키는 장치의 사용을 포함한다. 한 예는 대동맥을 부분적으로 폐색시키는 카테터, 예를 들어, 최근에 무작위화 시험에 적용되었고, 뇌졸중 치료에 대해 FDA 승인을 얻게될 수도 있는 CoAxia NeuroFlo™ 카테터 장치이다. 이러한 장치는 허혈의 발생 최대 14시간 후까지 뇌졸중을 나타내는 대상체에 사용되어왔다.
[086]
본 방법은 재관류 및 PSD-95를 억제하는 활성제 둘 모두를 치료에 기여할 수 있도록 투여하기 위한 요법을 제공한다. 이러한 요법은, PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제에 의해 유도된 플라스민 둘 모두가 혈장에서 실질적으로 공존하여 PSD-95를 억제하는 활성제의 절단 및 PSD-95를 억제하는 활성제의 감소되거나 제거된 활성을 초래하는, 플라스민 절단에 민감한 PSD-95를 억제하는 활성제(예를 들어, 모든 L-아미노산)와 혈전용해제의 시간상 충분히 근접한 투여를 회피한다. Tat-NR2B9c를 따르는 설명의 많은 부분에서 예시로 언급되지만, 동일한 방법은 본원에 기술된 PSD-95를 억제하는 다른 활성제를 언급하는 것으로 이해되어야 한다.
[087]
Tat-NR2B9c는 인간 혈장에서 약 10분의 혈장 반감기를 갖는다. 이는 Tat-NR2B9c가 일반적으로 혈장에서 10분 후에 반분해된다는 것을 의미하는 것이 아니라, 그 보다는 Tat-NR2B9c가 10분의 반감기로 혈장 밖으로 이동된다는 것을 의미한다. 알테플라제(tPA의 재조합 형태)는 인간 혈장에서 단지 약 5분의 반감기를 갖는다. 그러나, 현재 목적의 더욱 중요한 것은 플라스민의 반감기이며, 이는 알테플라제 및 기타 혈전용해제에 의해 유도되고 Tat-NR2B9c의 절단을 담당한다. 플라스민은 인간 혈장에서 약 4-8hr의 반감기를 갖는 것으로 보고되었다.
[088]
Tat-NR2B9c 및 플라스민의 각각의 반감기로부터, 혈전용해제를 투여하기 전에 Tat-NR2B9c의 적어도 하나의 혈장 반감기(즉, 약 10분)에 Tat-NR2B9c를 투여함으로써 둘 사이의 상호작용을 피할 수 있음을 알 수 있다. Tat-NR2B9c가 혈전용해제보다 적어도 20분 또는 30분 전에 투여되는 2 또는 3 반감기의 더 긴 간격은 혈장 내 공존을 더욱 추가로 감소시키며, 결과적으로 Tat-NR2B9c 및 혈전용해제의 불활성화 가능성을 감소시킨다. 적어도 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 5시간과 같이 혈전용해제보다 심지어 더 먼저 Tat-NR2B9c를 투여하면 Tat-NR2B9c의 비활성화 가능성이 훨씬 더 감소한다. 일반적으로 Tat-NR2B9c를 10분 기간에 걸쳐 투여하는 경우 Tat-NR2B9c 투여 시작 후 20분의 기간은 Tat-NR2B9c 투여 종료 후 10분에 해당하며, Tat-NR2B9c 투여 시작 후 30분의 기간은 종료 후 20분에 해당한다.
[089]
PSD-95를 억제하는 플라스민-민감 활성제와 혈전용해제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 별개의 조성물로 동시에 공동-투여되어서는 안된다.
[090]
혈전용해제를 먼저 투여하는 경우, 플라스민 절단에 민감한 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하기 전에 충분한 시간이 경과하게 하여, 혈전용해제에 의해 유도된 플라스민의 혈장 농도가 유의하게 감소되어야 한다. 예를 들어, 간격은 적어도 3시간, 4시간, 8시간, 12시간 또는 24시간일 수 있다.
[091]
혈전용해제 이외의 약물 부류에 의해 유도된 재관류 또는 재관류의 기계적 방법은 활성제의 어떠한 불활성화 발생 없이 PSD-95를 억제하는 활성제의 투여와 관련하여 언제든지 수행될 수 있다. 이는 또한 플라스민 절단에 내성인 PSD-95를 억제하는 활성제의 D-변이체의 투여에 대한 경우이다. PSD-95를 억제하는 활성제의 절단은 또한 혈액을 통과하지 않고 뇌에 도달하도록 하는 경로, 예를 들어 비강내 또는 척추강내 투여와 같은 비정맥내 투여에 의해 감소될 수 있다.
[092]
허혈이 있거나 있는 것으로 의심되는 대상체로서 아직 어떠한 치료도 받지 않았으며 상대적인 치료 순서를 조절할 수 있는 경우, 혈전용해제가 신경 세포의 진행 중인 사멸을 완화하기 위해 가능한 빨리 그리고 뇌졸중 발병 후 적어도 3시간 또는 4.5시간 안에 투여되어야 한다는 분야의 통상적인 통념에도 불구하고 일반적으로 PSD-95를 억제하는 활성제로 먼저 처리한 다음 상기 논의된 바와 같이 적합한 간격을 두어 혈전용해제를 투여하는 것이 바람직하다. PSD-95를 억제하는 활성제와 혈전용해제 투여 사이의 간격은 허혈성 뇌졸중의 존재를 확인하고 혈전용해제의 투여가 반대-표시되는 출혈성 뇌졸중 또는 기타 출혈의 존재 또는 위험을 제거하기 위한 추가 테스트를 수행하는데 사용될 수 있다. PSD-95를 억제하는 활성제의 사전 투여는 또한 혈전용해제가 허혈 발병 후 효과적일 가능성이 있는 기간을 연장하는 이점을 가졌다. PSD-95를 억제하는 활성제가 없는 경우 기간은 약 3-4.5시간에 불과하지만 PSD-95를 억제하는 활성제에 의해 적어도 5, 6, 9, 12 또는 24시간 연장될 수 있다.
[093]
대상체가 허혈성 뇌졸중을 가지며, 혈전용해제로 치료하기에 적격인 것으로 이미 결정된 경우(예를 들어, 출혈 부족)에도, PSD-95를 억제하고 플라스민-절단에 민감한 활성제를 혈전용해제 투여 전 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120 또는 180분의 간격을 두고 투여하는 것이 여전히 바람직한데, 이것이 혈전용해제가 통상적인 지식으로 비효과적이라고 간주하는 3 또는 4.5시간 후 투여됨을 의미한다 하더라고 그러하다.
[094]
그러나, 재관류 투여를 기다리는 것이 그 효능을 감소시키는 허용할 수 없는 위험을 나타내는 것으로 간주되는 경우, 재관류는 기계적 재관류 또는 혈전용해제 이외의 약물 부류 예컨대, 혈관확장제 또는 고혈압제를 사용하여 수행될 수 있다.
[095]
이미 혈전용해제를 투여받은 허혈 대상체에서, 플라스민에 의해 절단되는 PSD-95 억제 활성제를 대상체에 투여하기 전 상기 논의된 바와 같이 적어도 약 3시간의 적절한 간격이 있어야 한다. 대안적으로, 이 간격은 예를 들어, 간격 동안 발생할 대상체의 상태 악화로 인해 허용되지 않을 것으로 간주되는 경우, 플라스민 절단에 내성인 PSD-95를 억제하는 활성제가 사용될 수 있다.
[096]
PSD-95를 억제하는 활성제 및 재관류 둘 모두를 투여받은 허혈 치료를 받고 있는 대상체 집단은 상이한 형태의 치료를 받은 개체를 포함할 수 있다. 이러한 집단은 예를 들어, 동일한 의사 또는 동일한 기관에서 치료되는 대상체를 대표할 수 있다. 이러한 집단은 적어도 10, 50, 100 또는 500명 대상체를 포함할 수 있다. 이러한 집단의 일부 대상체는 PSD-95를 억제하는 활성제 및 기계적 재관류 또는 재관류를 수행하기 위한 혈관확장제 또는 고혈압제로의 치료를 받는다. 이러한 형태의 재관류는 PSD-95를 억제하는 활성제의 투여와 함께 임의의 순서로 수행될 수 있다. 집단의 일부 대상체는 플라스민 절단에 민감한 PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제를 투여받고, 여기서 PSD-95를 억제하는 활성제는 혈전용해제보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120 또는 180분 전에 투여된다. 이러한 대상체의 어떤 대상체도 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여받기 전 3시간 안에 또는 투여 후 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120 또는 180 분 안에 혈전용해제를 투여받지 않는다. 일부 집단에는 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 혈전용해제가 투여되는 대상체가 없다. 일부 집단에는 억제제를 억제하는 활성제의 투여 후 30분 안에 혈전용해제가 투여되는 대상체가 결여되어 있다. 일부 집단은 PSD-95를 억제하는 활성제가 투여되고 혈전용해제를 투여받지 않고 기계적 재관류되는 대상체를 포함한다. 일부 집단은 (a) PSD-95를 억제하는 활성제가 투여되고 혈전용해제 없이 기계적 재관류되는 대상체; 및 (b) PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제가 투여된 대상체로서, 혈전용해제는 PSD-95를 억제하는 활성제보다 적어도 10분 후에 투여되는 대상체로 구성된다. 임의적으로, (b)의 대상체의 적어도 일부는 또한 기계적 재관류 투여된다.
[097]
대안적으로, 플라스민 절단에 민감한 PSD-95를 억제하는 활성제 및 플라스민 절단에 내성인 PSD-95를 억제하는 상이한 활성제 둘 모두가 입수가능한 경우, 허혈을 갖거나 허혈 위험이 있는 개체 집단은 플라스민에 의해 절단가능한 PSD-95 억제 제1 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, PSD-95를 억제하는 활성제는 혈전용해제보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120 또는 180분 전의 간격을 두고 투여되는, 대상체; 및 플라스민에 의한 절단에 내성인 PSD-95를 억제하는 제2 활성제 및 혈전용해제가 투여된 대상체로서, 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 제2 활성제 전 또는 후의 상기 기간 내에 투여되는, 대상체를 포함할 수 있다.
[098]
활성제 및 재관류 요법으로의 처리 둘 모두는 독립적으로 허혈로 인한 경색 크기 및 기능적 결함을 감소시키는 능력을 갖는다. 본 발명의 방법에 따라 조합하여 사용되는 경우, 경색 크기 및/또는 기능 결손에서의 감소는 바람직하게는 조합(즉, 협력)을 위한 것이 아닌 동등한 요법하에서 단독으로 투여되는 어느 한 제제 또는 절차의 사용으로부터의 감소보다 더 크다. 더욱 바람직하게는, 경색 크기 및/또는 기능 결손에서의 감소는 조합을 제외하면 동등한 요법하에서 제제(또는 재관류 절차) 단독에 의해 달성되는 감소에 적어도 추가적이거나 바람직하게는 추가적인 것보다 더한(즉, 상승작용적)이다. 일부 요법에서, PSD-95를 억제하는 활성제의 동시 투여 또는 투여 전에 대해서는 효과가 없을 경우 재관류 요법은 허혈의 발생 후 시간(예를 들어, 4.5시간 초과)에서 경색 크기 및/또는 기능적 시간을 감소시키는데 효과적이다. 달리 말하면, 대상체에게 활성제 및 재관류 요법이 제공되는 경우, 재관류 요법은 바람직하게는 적어도 활성제 없이 더 이른 시간에 제공되는 경우만큼 효과적이다. 따라서, 활성제는 재관류 요법이 효과를 발생시키기 전 또는 효과를 발생시킴에 따라 허혈의 하나 이상의 손상 효과를 감소시킴으로써 재관류 요법의 효능을 효과적으로 증가시킨다. 따라서, 활성제는 지연이 대상체의 최초 증상의 위험을 인지하는데 있어서의 대상체에서의 지연, 병원 또는 다른 의료 시설로 대상체를 수송하는데 있어서의 지연, 또는 허혈의 존재 및/또는 출혈 또는 이의 허용되지 않는 위험의 부재를 확립하는 진단 절차를 수행하는데 있어서의 지연으로부터의 지연인지 아닌지 간에 재관류 요법을 제공하는데 있어서의 지연을 벌충시킬 수 있다. 추가적 또는 상승작용적 효과를 포함하는 활성제 및 재관류 요법의 통계적으로 유의한 조합된 효과가 임상 시험에서의 집단 사이 또는 전임상 연구에서 동물 모델의 집단 사이에서 입증될 수 있다.
VII.
효과적인 투여 요법
[099]
활성제는 치료할 질환을 갖고 있는 대상체에서 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 추가적 악화를 치유하거나, 감소시키거나, 억제하는데 효과적인 투여량, 투여 빈도 및 투여 경로로 투여된다. (투여 전) 치료학적 유효량 또는 투여 후 치료학적으로 유효한 혈장 농도는 본 발명의 제제로 처리되지 않은 질병으로부터 고통받는 대상체(또는 동물 모델)의 대조군 집단에서의 손상에 비해 본 발명의 제제로 처리된 질병으로부터 고통받는 대상체(또는 동물 모델)의 집단에서 치료할 질병 또는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 추가적인 악화를 유의하게 치유하거나, 감소시키거나, 억제하기에 충분한 제제의 양 또는 수준을 의미한다. 상기 양 또는 수준은 또한 개별 처리된 대상체가 본 발명의 방법에 의해 처리되지 않은 동등한 대상체의 대조군 집단에서의 평균 결과보다 더 유리한 결과를 달성하는 경우 치료학적으로 효과적인 것으로 간주된다. 치료학적으로 효과적인 요법은 의도된 목적을 달성하는데 필요한 투여 빈도 및 경로로 치료학적 유효량의 투여를 포함한다.
[100]
뇌졸중 또는 기타 허혈성 질환을 앓고 있는 대상체의 경우, 활성제는 뇌졸중 또는 기타 허혈성 질환의 손상 효과를 감소시키기에 효과적인 투여량, 투여 빈도 및 투여 경로를 포함하는 요법으로 투여된다. 치료가 필요한 질병이 뇌졸중일 때, 개별 치료 대상체가 랭킨 척도 2 이하, 바르텔 척도 75 이상의 장애를 나타내는 경우 또는 처리된 대상체의 집단이 유사한 처리되지 않은 집단보다 장애 척도에서 유의하게 개선된(즉, 덜 장애의) 점수 분포를 보여주는 경우, 결과는 경색 부피 또는 장애 지수에 의해 결정될 수 있다 (문헌 [Lees et al., N. Engl. J. Med. 2006;354:588-600] 참조). 단일 용량의 제제는 뇌졸중 치료에 충분할 수 있다.
[101]
본 발명은 또한 장애의 위험이 있는 대상체에서 장애의 예방을 위한 방법 및 제형을 제공한다. 일반적으로 이러한 대상체는 대조군 집단에 비해 장애(예를 들어, 질환, 병, 장애 또는 질병)가 발생할 가능성이 증가하였다. 예를 들어, 대조군 집단은 장애의 진단을 받지 않았거나 가족력이 있는 일반적인 집단(예를 들어, 연령, 성별, 인종 및/또는 민족에 의해 매칭됨)으로부터 무작위로 선택되는 하나 이상의 개체를 포함할 수 있다. 해당 장애와 관련된 "위험 요소"가 해당 대상체와 관련된 것으로 밝혀지는 경우 대상체는 장애에 대한 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 위험 인자는 예를 들어, 대상체의 집단에 대한 통계적 또는 역학 연구를 통해 주어진 장애와 관련된 모든 활동, 특성, 사건 또는 속성을 포함할 수 있다. 따라서, 기본 위험 요소를 식별하는 연구에 대상체가 구체적으로 대상체를 포함하지 않는 경우에도 대상체는 장애의 위험이 있는 것으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 심장 수술을 받지 않은 대상체의 집단과 비교하여 심장 수술을 받은 대상체의 집단에서 일과성 뇌허혈 발작의 빈도가 증가하기 때문에 심장 수술을 받은 대상체는 일과성 뇌허혈 발작의 위험이 있다.
[102]
뇌졸중의 다른 일반적인 위험 요소로는 연령, 가족력, 성별, 뇌졸중의 이전 발병률, 일과성 허혈 발작 또는 심장 마비, 고혈압, 흡연, 당뇨병, 경동맥 또는 기타 동맥 질환, 기타 심장 질환, 예컨대 심장 질환, 심부전, 확장성 심근병증, 심장 판막 질환 및/또는 선천성 심장 결함; 높은 혈중 콜레스테롤, 및 포화 지방, 트랜스 지방 또는 콜레스테롤이 많은 식단을 포함한다.
[103]
예방에서, 활성제 또는 절차는 질병의 위험이 있지만 아직 질병을 갖지 않은 대상체에 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 발생을 예방, 지연 또는 억제하기에 충분한 양, 빈도 및 경로로 투여된다. 투여 전 예방적 유효량 또는 투여 후 혈장 수준은 본 발명의 활성제로 치료되지 않은 질환의 위험이 있는 대상체(또는 동물 모델)의 대조군 집단과 비교하여 제제로 관련 처리된 질환의 위험이 있는 대상체(또는 동물 모델)의 집단에서 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 예방, 억제 또는 지연시키기에 현저하게 충분한 제제의 양 또는 수준을 의미한다. 상기 양 또는 수준은 또한 개별 처리된 대상체가 본 발명의 방법에 의해 처리되지 않은 유사 대상체의 대조군 집단에서의 평균 결과보다 더 유리한 결과를 달성하는 경우 예방학적으로 효과적인 것으로 간주된다. 예방학적으로 효과적인 요법은 의도된 목적을 달성하는데 필요한 투여 빈도 및 경로의 예방학적 유효량의 투여를 포함한다. 뇌졸중 위험이 임박한 대상체(예를 들어, 심장 수술을 받은 대상체)에서 뇌졸중 예방을 위해 일반적으로 단일 용량의 제제로 충분하다.
[104]
제제에 따라, 투여는 비경구, 정맥내, 폐내, 비, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 수막강내, 복막내, 국소, 비내 또는 근내 투여일 수 있다.
[105]
정맥내 투여에 있어서, 청구된 제제는 항염증제 없이, 예를 들어 최대 3 mg/kg, 0.1-3 mg/kg, 2-3 mg/kg 또는 2.6 mg/kg 또는 더 높은 투여량으로, 예를 들어, 항염증제와 함께 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25 mg/kg(적어도 0.25 mg/kg 내지 25 mg/kg 범위에 걸쳐 효능을 나타냄, 도 11a, b 참조)으로 투여될 수 있다. 피하, 비강내, 폐내 또는 근육내와 같은 경로에 있어서, 용량은 항염증제의 존재 또는 부재하에 최대 10, 15, 20 또는 25 mg/kg일 수 있다. 더 높은 용량의 항염증제의 필요성은 대안적으로 더 긴 기간에 걸친 활성제의 투여에 의해 감소되거나 제거될 수 있다(예를 들어, 1분 미만, 1-10분 및 10분 초과의 투여는 일정 투여량을 위해 히스타민이 방출되는 대안적인 요법을 구성하며, 항염증제에 대한 필요성은 기간이 증가함에 따라 감소되거나 제거된다).
[106]
활성제는 단일 용량 또는 다중 용량 요법으로 투여될 수 있다. 단일 용량 요법은 경색 및 인지 결손을 감소시키기 위해 급성 허혈성 뇌졸중과 같은 급성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 용량은 질환의 시기가 예컨대 신경혈관 수술을 받는 대상체와 같이 예측 가능한 경우 질환의 발병 전에 또는 질환이 진행된 후 기간 내에서(예를 들어, 최대 1, 3, 6 또는 12시간 후) 투여될 수 있다.
[107]
다회 요법은 장기간, 예컨대 적어도 1, 3, 5 또는 10일 또는 적어도 1개월, 3개월, 6개월 또는 무기한과 같은 장기간에 걸쳐 혈장에서 검출가능한 수준으로 활성제를 유지하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 활성제는 매시간, 일당 2, 3, 4, 6 또는 12회, 매일, 격일로, 매주 등으로 투여될 수 있다. 이러한 요법은 단일 용량 투여에 있어서 급성 질환으로부터의 초기 결손을 감소시킬 수 있으며, 그 후 여전히 발생하는 결핍으로부터의 회복을 촉진할 수 있다. 이러한 요법은 또한 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 만성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 활성제는 때때로 다중 투여 요법에 사용하기 위해 제어된 방출 제형으로 통합된다. 대안적으로, 히스타민 방출을 촉발하지 않으면서 신경보호를 달성하기 위해 더 짧은 기간에 걸쳐 더 적은 다회 용량이 투여될 수 있거나 정맥내 투여되는 경우 느린 주입으로서 제공될 수 있다.
[108]
활성제는 제어된 제형 또는 코팅과 같은 체내로부터의 신속한 제거에 대해 화합물을 보호하는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 담체(또한, 많은 약물의 매일 투여에 충분한 변형, 지연, 연장 또는 지속 방출 또는 위 체류 투여 형태, 예컨대 제제가 위에서 팽창하고 약 8시간 동안 유지되는 중합체에 의해 캡슐화되는 DEPOMED GR™ 시스템). 제어 방출 시스템에는 미세 캡슐화된 전달 시스템, 임플란트 및 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 콜라겐, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산, 매트릭스 제어 방출 장치, 삼투 제어 방출 장치, 다중미립자 제어 방출 장치, 이온 교환 수지, 장용 코팅, 다층 코팅, 미소구체, 나노입자, 리포솜 및 이들의 조합을 포함한다. 활성제의 방출 속도는 또한 활성제의 입자 크기를 변화시킴으로써 변형될 수 있다: 변형된 방출의 예는 예를 들어, 미국 특허 번호 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5,674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,639,480; 5,733,566; 5,739,108; 5,891,474; 5,922,356; 5,972,891; 5,980,945; 5,993,855; 6,045,830; 6,087,324; 6,113,943; 6,197,350; 6,248,363; 6,264,970; 6,267,981; 6,376,461; 6,419,961; 6,589,548; 6,613,358; 및 6,699,500에 기술된 것들을 포함한다.
VIII.
항염증제와의 공동-투여
[109]
투여 용량 및 경로에 따라, 본 발명의 활성제는 비만 세포 탈과립화 및 히스타민의 방출을 특징으로 하는 염증 반응 및 이의 후유증을 유도할 수 있다. 예를 들어, 적어도 3 mg/kg의 투여량은 IV 투여의 경우 히스타민 방출과 관련되고, 적어도 10 mg/kg의 투여량은 다른 경로와 관련이 있다.
[110]
염증 반응의 하나 이상의 양태를 억제하기 위해 다양한 항염증제가 용이하게 이용가능하다. 바람직한 부류의 항염증제는 비만 세포 탈과립화 억제제이다. 이러한 부류의 화합물에는 크로몰린(5,5'-(2-하이드록시프로판-1,3-디일)비스(옥시)비스(4-옥소-4H-크로멘-2-카르복실산)(크로모글리케이트로도 알려짐) 및 2-카르복실라토크로몬-5'-일-2-하이드록시프로판 유도체, 예컨대 비스(아세톡시메틸), 디소듐 크로모글리케이트, 네도크로밀(9-에틸-4,6-디옥소-10-프로필-6,9-디하이드로-4H-피라노[3,2-g]퀴놀린-2,8-디-카르복실산) 및 트라닐라스트 (2-{[(2E)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로프-2-에노일]아미노}), 및 로독사미드(2-[2-클로로-5-시아노-3-(옥살로아미노)아닐리노]-2-옥소아세트산)이 포함된다. 특정 화합물에 대한 언급은 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 크로몰린은 비강, 경구, 흡입 또는 정맥내 투여를 위한 제형으로 쉽게 입수할 수 있다. 본 발명의 실시가 기전의 이해에 의존적이지 않지만, 이들 제제는 내재화 펩티드에 의해 유도된 염증 반응의 초기 단계에서 작용하며, 따라서 일시적인 혈압 감소를 포함하는 이의 후유증의 발생을 억제하는데 가장 효과적인 것으로 여겨진다. 하기 논의된 다른 부류의 항염증제는 히스타민이 H1 또는 H2 수용체에 결합하는 것을 억제하는 것과 같이 비만 세포 탈과립으로 인한 하나 이상의 다운스트림 이벤트를 억제하는 역할을 하지만, 비만 세포 탈과립의 모든 후유증을 억제하지 않을 수 있거나 더 많은 투여량을 필요로 할 수 있거나 조합을 이용하여 그렇게 할 수 있다. 하기 표 4는 본 발명과 함께 사용될 수 있는 몇몇 비만 세포 탈과립 억제제의 명칭, 화학식 및 FDA 상태를 요약한다.
표 4
[111]
항염증제의 또 다른 부류는 항히스타민 화합물이다. 이러한 제제는 히스타민과 이의 수용체의 상호작용을 억제하여 상기에서 언급한 염증의 결과적인 후유증을 억제한다. 많은 항히스타민이 시중에서 입수가능하며, 일부는 처방전 없이 구입할 수 있다. 항히스타민의 예는 아자타딘, 아젤라스틴, 부르프롤린, 세티리진, 사이프로헵타딘, 독산트로졸, 에토드록시진, 포스콜린, 하이드록시진, 케토티펜, 옥사토미드, 피조티펜, 프록시크로밀, N,N'-치환된 피페라진 또는 터펜아딘이 있다. 항히스타민은 말초 수용체뿐만 아니라 CNS에서 항히스타민을 차단하는 능력이 다양하며, 2세대 및 3세대 항히스타민은 말초 수용체에 대한 선택성을 갖는다. 아크리바스틴(Acrivastine), 아스테미졸(Astemizole), 세티리진(Cetirizine), 로라타딘(Loratadine), 미졸라스틴(Mizolastine), 레보세티리진(Levocetirizine), 데슬로라타딘(Desloratadine) 및 펙소펜아딘(Fexofenadine)은 2세대 및 3세대 항히스타민의 예이다. 항-히스타민은 경구 및 국소 제형으로 널리 이용 가능하다. 사용할 수 있는 일부 다른 항히스타민은 아래 표 5에 요약되어 있다.
표 5
[112]
염증 반응을 억제하는데 유용한 항염증제의 또 다른 부류는 코르티코스테로이드이다. 이들 화합물은 전사 조절인자이며, 비만 세포 탈과립화로 인한 히스타민 및 기타 화합물의 방출에 의해 시작되는 염증 증상의 강력한 억제제이다. 코르티코스테로이드의 예로는 코르티손(Cortisone), 하이드로코르티손(Hydrocortisone) (코르테프(Cortef)), 프레드니손(Prednisone) (델타손(Deltasone), 메티코르텐(Meticorten), 오라손(Orasone)), 프레드니솔론(Prednisolone) (델타-코르테프, 페디아프레드(Pediapred), 프렐론(Prelone)), 트리암시놀론(Triamcinolone) (아리스토코르트(Aristocort), 케나코르트(Kenacort)), 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone) (메드롤(Medrol)), 덱사메타손(Dexamethasone) (데카드론(Decadron), 덱손(Dexone), 헥사드롤(Hexadrol)), 및 베타메타손(Betamethasone) (셀레스톤(Celestone))이 있다. 코르티코스테로이드는 경구, 정맥내 및 국소 제형으로 널리 이용 가능하다.
[113]
비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)이 또한 사용될 수 있다. 이러한 약물에는 아스피린 화합물(아세틸살리실레이트), 비-아스피린 살리실레이트, 디클로페낙, 디플루니살, 에돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트, 나프록센, 나프록센 소듐, 페닐부타존, 술린닥 및 토메틴을 포함한다. 그러나, 이러한 약물의 항염증 효과는 항히스타민 또는 코르티코스테로이드의 것보다 덜 효과적이다. 더 강력한 항염증 약물, 예컨대 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 류케란 및 사이클로스포린이 또한 사용될 수 있으나, 효과가 더 느리고/거나 부작용과 관련되거 있기 때문에 선호되지 않는다. Tysabri® 또는 Humira®와 같은 생물학적 항염증제도 사용할 수 있지만 같은 이유로 선호되지는 않는다.
[114]
염증 반응을 억제하기 위해 다양한 부류의 약물을 조합하여 사용할 수 있다. 바람직한 조합은 비만 세포 탈과립 억제제 및 항히스타민이다.
[115]
내재화 펩티드에 연결된 PSD-95 억제제가 항염증제와 함께 투여되는 방법에서, 두 물질은 항염증제가 내재화 펩티드에 의해 유도되는 염증 반응을 억제할 수 있는 시간상 충분히 근접해서 투여된다. 항염증제는 활성제 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 바람직한 시간은 부분적으로 항염증제의 약동학 및 약력학에 의존적이다. 항염증제는 활성제가 투여되는 시간에 항염증제가 최대 혈청 농도에 근접하도록 활성제 전에 간격을 두고 투여될 수 있다. 전형적으로, 항염증제는 활성제 전 6시간과 활성제 후 1시간 사이에 투여된다. 예를 들어, 항염증제는 활성제 전 1시간 내지 활성제 후 30분에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 항염증제는 활성제 전 30분 내지 활성제 후 15분, 및 더욱 바람직하게는 활성제 전 15분 안에 및 활성제와 동일한 시간에 투여된다. 일부 방법에서, 항염증제는 활성제가 투여되기 전 15, 10 또는 5분의 기간 안에 활성제 전에 투여된다. 일부 방법에서, 항염증제는 활성제 전 1-15, 1-10 또는 1-5분에 투여된다.
[116]
항염증제가 내재화 펩티드에 연결된 억제제 펩티드의 염증 반응을 억제할 수 있다고 말할 때, 이것이 의미하는 것은, 반응이 특정 대상체에서 발생하는 경우 이 둘이 항염증제가 내재화 펩티드에 연결된 억제제 펩티드에 의해 유도 가능한 염증 반응을 억제하는 시간에 충분히 근접하여 투여됨을 의미하며, 이러한 반응이 반드시 해당 대상체에서 발생함을 의미하지 않는다. 일부 대상체는 제어된 임상 또는 비임상 시험에서 통계적으로 유의한 수의 대상체에서 염증 반응과 관련된 내재화 펩티드에 연결된 일정량의 억제제 펩티드로 치료된다. 반드시 모두가 내재화 펩티드에 연결된 내재화 펩티드에 대한 항염증 반응을 발달시킬 필요는 없지만 상당한 비율의 이러한 대상체가 그러할 것으로 합리적으로 가정될 수 있다. 일부 대상체에서, 내재화 펩티드에 연결된 억제제 펩티드에 대한 염증 반응의 징후 또는 증상이 검출되거나 검출가능하다.
[117]
개별 대상체의 임상 치료에서, 항염증제의 존재 및 부재 하에 내재화 펩티드에 연결된 억제제 펩티드로부터의 염증 반응을 비교하는 것은 일반적으로 불가능하다. 그러나, 제어된 임상 또는 전임상 시험에서 동일한 또는 유사한 공동-투여 조건 하에 유의한 억제가 관찰되는 경우 항염증제가 펩티드에 의해 유도가능한 항염증 반응을 억제하는 것으로 합리적으로 결론내릴 수 있다. 대상체의 결과(예를 들어, 혈압, 심박수, 두드러기)는 또한 개별 대상체에서 억제가 발생하였는지의 여부에 대한 지표로서 임상 시험에서 대조군의 전형적인 결과와 비교될 수 있다. 일반적으로, 항염증제는 약리학적 제제 투여 후 1시간의 기간 내의 어느 시점에서 검출가능한 혈청 농도로 존재한다. 많은 항염증제의 약동학은 널리 알려져 있으며, 항염증제의 상대적 투여 시기가 이에 따라 조정될 수 있다. 항염증제는 일반적으로 말초적으로, 즉 혈액 뇌장벽에 의해 뇌로부터 분리되어 투여된다. 예를 들어, 항염증제는 해당 제제에 따라 경구, 비강, 정맥내 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 항염증제를 약리제와 동시에 투여하는 경우에는 이 두개는 조합 제형으로서 또는 개별적으로 투여될 수 있다.
[118]
일부 방법에서, 항염증제는 적어도 뇌에서 검출가능한 약리학적 활성을 발휘하기에 충분한 양으로 경구 또는 정맥내 투여될 때 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않는 것이다. 이러한 제제는 그 자체가 뇌에서 어떠한 검출가능한 치료 효과를 발휘하지 않으면서 말초에서 활성제의 투여로 인한 비만 세포 탈과립화 및 이의 후유증을 억제할 수 있다. 일부 방법에서, 항염증제는 혈액 뇌 장벽의 투과성을 증가시키거나 항염증제를 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 능력을 증가시키도록 유도체화 또는 제형화하기 위해 임의의 공동-처리 없이 투여된다. 그러나, 다른 방법에서, 항염증제는 그 성질, 유도체화, 제형 또는 투여 경로에 의해 뇌에 유입되거나 그렇지 않으면 뇌의 염증에 영향을 주어 비만-세포 탈과립 및/또는 내재화 펩티드로 인한 이의 말초 후유증 억제 및 뇌의 염증 억제에서의 이중 효과를 발휘할 수 있다. 스트르비안(Strbian) 등의 WO 04/071531은 비만 세포 탈과립화 억제제인 크로모글리케이트를 i.c.v.로 투여하지만 정맥내로 투여하지 않는 동물 모델에서 경색을 억제하는 데 직접적인 활성을 갖는다고 보고하였다.
[119]
일부 방법에서, 대상체는 또한 활성제와의 공동-투여 전날, 전주 또는 전달 및/또는 후 활성제와 공동-투여된 동일한 항염증제로 처리되지 않는다. 일부 방법에서, 대상체가 반복적 섭생(예를 들어, 동일한 양, 전달 경로, 투여 빈도, 투여 일의 시간)에서 활성제와 공동-투여된 동일한 항염증제로 달리 처리되는 경우, 활성제와 항염증제의 공동-투여는 투여량, 전달 경로, 투여 빈도 또는 투여 일의 시간 중 일부 또는 전부에서 반복 요법에 적합하지 않다. 일부 방법에서, 대상체는 본 방법에서 활성제와 공동투여되는 항염증제의 투여를 필요로 하는 염증성 질병 또는 질환을 앓고 있는 것으로 알려져 있지 않다. 일부 방법에서, 대상체는 비만 세포 탈과립 억제제로 처리 가능한 천식 또는 알레르기 질환을 앓고 있지 않다. 일부 방법에서, 항염증제 및 활성제는 각각 질병의 에피소드 당 상기 정의된 바와 같은 기간 내에서 단지 한번 및 한번 투여되며, 에피소드는 증상이 없거나 감소하는 더 긴 기간에 인접하여 질병의 증상이 존재하는 비교적 짧은 기간이다.
[120]
항염증제는 이러한 염증 반응이 항염증의 부재 하에 발생하는 것으로 알려진 조건 하에 내재화 펩티드에 대한 염증 반응을 억제하기에 효과적인 양, 빈도 및 경로의 요법으로 투여된다. 항염증제의 결과로서 염증의 징후 또는 증상에 어떠한 감소가 존재하는 경우, 염증 반응이 억제된 것이다. 염증 반응의 증상은 발적, 두드러기와 같은 발진, 열, 부기, 통증, 따끔거림, 가려움, 메스꺼움, 발진, 구강 건조, 무감각, 기도 혼잡을 포함할 수 있다. 염증 반응은 또한 혈압이나 심박수와 같은 징후를 측정하여 모니터링될 수도 있다. 대안적으로, 염증 반응은 비만 세포 탈과립에 의해 방출되는 히스타민 또는 기타 화합물의 혈장 농도를 측정함으로써 평가될 수 있다. 비만 세포 탈과립화에 의해 방출되는 히스타민 또는 기타 화합물의 수치 상승, 혈압 감소, 두드러기와 같은 피부 발진 또는 감소된 심박수의 존재는 대량 세포 탈과립화의 지표이다. 실제적인 문제로서, 위에서 논의된 대부분의 항염증제의 투여량, 요법 및 투여 경로는 Physicians' Desk Reference 및/또는 제조사로부터 입수가능하며, 그러한 항염증은 그러한 일반적인 지침과 일치하는 본 방법에서 사용될 수 있다.
[121]
본 발명은 이해의 명료함의 목적으로 상세하게 기재되었으나, 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정 변형이 실시될 수 있다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 등록 번호 및 특허 문헌은, 이들 각각이 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 상기 범위에서, 하나 초과의 서열이 다양한 시점에서 등록 번호와 관련되는 경우, 이는 본 출원의 유효 출원일일부터의 등록 번호와 관련된 서열을 의미한다. 유효 출원일은 당해 등록 번호를 개시하는 가장 이른 우선권 출원일의 날짜이다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않은 한, 본 발명의 임의의 구성요소, 구체예, 단계, 특징 또는 양태는 임의의 다른 구성요소, 구체예, 단계, 특징 또는 양태와 조합하여 수행될 수 있다.
실시예
실시예 1
[122]
본 발명자들은 정맥내 알테플라제로의 일반적인 치료의 존재 또는 부재하에 네린티드로의 치료가 현재 혈전절제술(EVT)에 의해 달성가능한 신속한 재관류 설정에서 영상 기준에 의해 결정되는 잠재적으로 구제가능한 뇌를 지닌 큰 혈관 폐색으로 인한 허혈성 뇌졸중 환자에 대한 결과를 개선할 것인지의 여부를 결정하고자 하였다.
방법
연구 디자인
[123]
ESCAPE-NA1은 혈전절제술을 받도록 선택된 급성 허혈성 뇌졸중 환자에서 정맥내 네린티드의 효능과 안전성을 결정하기 위한 다기관, 무작위, 이중 맹검, 플라시보 대조, 병렬 그룹, 단일 용량 연구이다. 환자를 1:1 비율로 무작위 배정하여 10+1분에 걸쳐 전달되는 단일의 2.6 mg/kg(최대 용량 270 mg 이하) 정맥내 용량의 네린티드 또는 식염수 플라시보를 투여하였다. 네린티드 및 플라시보는 번호가 매겨진 냉장 바이알에 무색 용액으로 제조하였다.
무작위화 및 마스킹
[124]
실시간, 동적, 인터넷 기반, 계층화된 무작위 최소화 절차를 사용한 네린티드 또는 플라시보에 대한 1:1 비율의 무작위 배정이 발생하였다. 정맥내 알테플라제(예/아니오)와 표기된 초기 혈전절제 장치(스텐트-리트리버 또는 흡인 장치)의 사용에 대한 계층화가 발생하였다. 계층화에 대한 선택은 약물-약물 또는 약물-장치 상호작용의 가능성을 기반으로 하였다. 연령, 성별, 기준선 NIHSS(National Institutes of Health Stroke Scale) 스코어(범위, 0 내지 42, 스코어가 높을수록 더 큰 뇌졸중 중증도를 나타냄), 동맥 폐색 부위, 기준선 Alberta Stroke Program Early Computed Tomography Score (ASPECTS; 범위, 0 내지 10, CT 스캔에서 각 규정된 영역의 조기 허혈 변화의 임의의 증거에 대해 1점 감점) 및 임상 부위와 관련하여 분포 균형을 달성하기 위해 계층 내에서 발생하는 무작위 최소화.
참가자
[125]
적격 환자는 무작위 배정 당시 장애를 가진 허혈성 뇌졸중(기준선 NIHSS > 5)이 있는 18세 이상의 성인으로, 이는 뇌졸중 전에 지역사회에서 독립적으로 기능하고 있었다(바텔 지수 스코어 >90 [범위, 0 내지 100, 더 높은 스코어는 일상 생활 활동을 완료하는 더 큰 능력을 나타냄])1. 등록은 뇌졸중 증상 발생 후 최대 12시간에 발생하였다(최종 확인 시간). 비조영 CT 및 다상 CTA는 두개내 경동맥 또는 중뇌동맥의 첫 번째 분절 또는 이 둘 모두로 정의되는 확인된 근위 두개내 동맥 폐색이 있는 환자를 식별하기 위해 혈전절제술 센터에서 수행하였다. 환자는 경증 내지 중등도 허혈성 코어(5 내지 10의 ASPECTS로 정의됨, 범위: 0-10; Alberta Stroke Program Early CT Score; aspectsinstroke.com; 더 낮은 스코어는 더 큰 범위의 급성 허혈성 변화를 시사함) 및 중등도 내지 양호한 측부 순환((aspectsinstroke.com/부수적-스코어링)을 가졌으며, CTA에서 중뇌 동맥 연락 동맥 순환의 50% 이상을 채우는 것으로 정의된다.
절차
[126]
적격한 이미징 후, 환자를 현재 사용가능한 장치를 사용하여 신속한 EVT로 처리하였다. 일부 환자는 EVT 전 또는 동안, 이송 전 일차 병원 또는 혈관내 센터에서 국가 또는 지역 지침에 따라 일반적인 치료에 따라 정맥내 알테플라제를 투여받았다. 치료 지침의 해석은 치료 팀의 재량에 달려 있다. 뇌졸중 발병으로부터 4.5시간 초과 후 알테플라제로 처리된 환자는 이러한 이유만으로는 시험에서 제외되지 않았다. 환자는 ECT 병원에서 포함 및 제외 기준을 충족해야 하였다. 환자는 전용 정맥 라인을 사용하여 추정 또는 실제 체중(알고 있는 경우)을 기준으로 하여 2.6 mg/kg의 단일 용량에서 270 mg의 최대 용량까지 시험 약물을 투여 받았다. 시험 약물은 무작위 배정 후 가능한 한 빨리 투여되었다.
[127]
시간 목표는 무작위화 영상화 ≤ 30분, 연구 약물 투여를 위한 영상화 ≤ 60분, 및 동맥 접근/천자 영상화 ≤ 60분이었다. 영상화에서 재관류까지의 목표는 90번째 백분위수 ≤ 90분 및 중앙값 ≤ 75분이었다. 일반적으로, 사건의 순서는 EVT 치료에 대한 적격성 결정을 위한 영상화, 연구 무작위 배정, 알테플라제 투여(일부 환자에서), 네린티드 투여 및 EVT 수행이었다.
임상 평가 및 결과
[128]
모든 환자는 인구통계학적 특성, 병력, 실험실 수치 및 뇌졸중 중증도(NIHSS 스코어)에 대한 표준 평가를 받았다. 일부 환자에서 네린티드 수준의 약동학 분석을 위해 투여 후 최대 6개의 연속 혈액 샘플을 채취하였다.
[129]
일차 결과는 랭킨 척도(mRS)의 스코어링에서 인증된 인원에 의한 무작위 배정 후 90일차에 직접적으로 또는 직접 방문이 불가능한 경우, 전화에 의해 신경학적 기능 장애2 평가에 대해 수정된 랭킨 척도(mRS)에서 0-2 스코어(범위, 0[무증상] 내지 6[사망])로 정의된 바와 같은 양호한 결과였다. 이차 효능 결과는 NIHSS에 의해 정의된 바와 같이 0-2의 신경학적 결과, 바텔 지수 스코어 ≥ 95로 정의된 바와 같은 일상 생활 활동의 기능적 독립성, mRS에서 0-1 스코어로 정의된 바와 같은 우수한 기능적 결과 및 사망률이었다. 3차 결과는 24시간 영상화(MR 또는 CT 뇌)에서 뇌졸중 부피 평가를 포함하였다. 사전 지정된 안전 결과는 모든 심각한 부작용 및 사망이었다. 영상화 해석은 중앙 핵심 실험실에서 수행되었으며, 임상 데이터는 독립적인 모니터에 의해 확인되었다. 경색 부피는 축 영상화(CT에서 636/1099 (57.9%) 및 MRI에서 463/1099 (42.1%))에서 경색의 수동 평면 측정 경계의 합계에 의해 측정되었다.
통계 분석
[130]
이 시험은 네린티드 그룹과 플라시보 그룹에서 무작위 배정 후 90일차에 mRS 0-2를 달성한 환자 비율 간의 8.7% 절대 차이를 탐지하는 80% 검정력을 갖도록 설계되었다. 무작위 최소화를 사용하였기 때문에 사후 순열 테스트가 5000개의 시뮬레이션으로 사용되었으며, 처리 그룹 간의 공변량 균형을 생성하는 무작위 배정 과정의 무결성을 확인하였다. 샘플 크기는 2-면 알파 수준 0.05를 사용하였으며, 600명의 환자가 O'Brien-Fleming 경계를 사용하여 알파 지출에 대한 90일 추적 조사를 완료한 경우 단일 중간 분석을 담당하였다 (Z=2.784, p=0.003).
[131]
일차 분석은 치료 의도(intention-to-treat)(ITT) 집단에서 수행되었으며, 치료, 및 정맥내 알테플라제 및 표기된 초기 혈관내 접근법의 계층화 변수를 포함하는 효과 크기의 조정 추정치, 및 연령, 성별, 기준선 NIHSS 스코어, 기준선 ASPECTS, 폐색 위치 및 임상 부위의 기준선 공변량이었다. 본 발명자들은 Huber-White 강력 분산 추정기와 함께 다변수 푸아송 회귀를 사용하여 유래된 위험 비율을 보고하였다. 이는 효과의 조정되지 않은 추정치와의 직접 비교를 허용하며, 치료 효과 크기의 표현을 보다 직관적으로 이해할 수 있게 한다. 하기 순서로 일차 결과에서 시작하여 2차 결과로 진행하는 다중 비교를 제어하기 위해 계층적 접근법이 이용되었다: mRS 척도에 걸친 비례 확률 모델에서 90일 mRS의 교대 분석, 90일차에서 NIHSS 0-2 vs. 3 이상, 90일차에서 95-100의 BI vs. 0-90 사망률, 및 90일차에서 0-1의 mRS 스코어를 갖는 대상체의 비율. 양측 p>0.05로 차이가 없음을 입증한 이후의 모든 결과는 탐색적인 것으로 간주되었으며, 다중성에 대해 조정되지 않았다. 약물-약물 및 약물-장치 상호작용을 평가하기 위해 치료 효과의 이질성에 대한 탐색적 분석은 알테플라제 사용 및 표기된 초기 혈관내 장치 선택의 두가지 계층화 변수에 대해 수행하였다. 통계 분석 계획에서 선험적으로 식별된 11개의 추가 관심 하위 그룹에 대한 탐색적 분석이 수행되었다. 경색 부피는 치우친 분포를 보였주었으며, 중앙값 및 사분위수 범위로 보고되었다; 치료 그룹 별 경색 부피는 세제곱근 변환 부피에 대한 t-테스트를 사용하여 비교하였다. Cox 비례 위험 모델은 치료 할당에 따른 사망까지의 상대적 시간의 조정된 위험 비율을 제공하였다.
[132]
분석은 받은 치료에 무관하게 시험에 무작위로 배정된 모든 환자로 정의되는, 치료 의도(ITT) 집단에 대해 수행되었다. 사망한 환자는 mRS 스코어 6, 바텔 지수 0 및 NIHSS 42로 ITT 집단에 포함되었다. 누락된 일차 결과(n=9)는 가능한 최악의 스코어로 귀속되고, 불량한 결과(mRS 3-6 이분법)로 계산되고, 사망률 분석의 경우 사망으로 귀속되었다. 모든 분석은 SAS 소프트웨어(v9.4, SAS Institute) 또는 STATA(v16.0)를 사용하여 수행되었다.
발견
환자
[133]
2017년 3월 1일부터 2019년 8월 12일 사이에 1,105명의 환자가 등록되었으며 549명은 네린티드를 투여 받고, 556명은 플라시보를 투여 받도록 할당되었다. 9명의 환자에 대한 일차 결과 데이터가 누락되었다(0.81%; 추적 관찰 실패: 2, 동의 철회: 7). 이들 환자는 무반응자로 간주되었다. 기준선 특성은 두 그룹에서 유사하였다(표 1).
[134]
등록된 1105명의 환자 중 4명(0.4%; 각 그룹에서 2명) 환자는 어떠한 연구 약물도 투여받지 않았으며, 25명(2.3%; 14명 플라시보, 11명 네린티드)은 올바른 약물을 투여받았으나, 용량 또는 기간이 올바르지 않았다. 크로스오버는 없었다. 모든 환자에게 EVT를 시도하였다; 8명은 선택적 뇌혈관조영술을 완료하지 않았다; 1명은 EVT 전에 동의를 철회하였다. 정맥내 알테플라제를 이용한 통상적인 치유 처리는 네린티드 환자 330명(60.1%) 및 플라시보 환자에서 329명(59.2%)에서 발생하였다. 표기된 제1 장치는 네린티드 환자 및 플라시보 환자로 균등하게 나눈 850명(76.9%) 환자에서의 스텐트 리트리버였다. 전체 작업 흐름(무작위화에 대한 영상화, 연구 약물에 대한 영상화, 재관류에 대한 연구 약물) 및 재관류 질(뇌허혈의 확장된 혈전용해(eTICI) 척도)은 알테프라제 비처리 계층에서 더 긴 치료 시간 개시를 제외하고, 두 군에서 유사하였다(표 1). 뇌졸중의 발병으로부터 무작위화 시간은 알테플라제 비처리 플라시보, 알테플라제 비처리 네린티드, 알테플라제 플라시보 및 알테플라제 네린티드 계층 각각에서 160-537 min (평균 275 min), 142-541 min (평균 270 min), 112-228 min (평균 161 min) 및 109-240 min (평균 152 min)이었다. 즉, 알테플라제 비처리 계층은 알테플라제 계층보다 뇌졸중 발병 후 약 2시간 후 네린티드로 처리하였다. 시간이 뇌를 의미한다는 격언을 특징으로 하는 조건에서, 알테플라제 비처리 계층은 알테플라제 계층보다 치료하기 훨씬 더 어려운 환자 하위 집단을 나타낸다.
[135]
네린티드 혈장 수준은 ESCPAE-NA1의 22명 대상체로부터 수득하였으며, 단일 용량 2.6 mg/kg 네린티드를 정맥내 투여한 이전에 8명의 건강한 지원자로부터 수득된 데이터로부터 수득하였다. 시간 0은 주입전 시점이다. 알테플라제를 투여받은 ESCAPE-NA-1 환자 중 알테플라제를 투여받지 않은 환자 및 알테플라제를 투여받지 않은 과거 비뇌졸중 환자와 비교하여 네린티드 혈장 농도 감소가 있었다. 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 도 1은 알테플라제의 부재하에 네린티드가 10분 후 최고 수준에 도달하였으며, 약 120분 후 배경으로 감소함을 보여준다. 알테플라제의 존재하에, 네린티드 최대 수준은 50% 초과만큼 감소하였으며, 60분까지 배경 수준으로 감소하였다. AUC는 유사하게 감소하였다. (p=0.0119, 혼합 효과 선형 회귀).
결과
[136]
90일차에 mRS 0-2를 달성한 환자 비율의 일차 결과는 네린티드에서 61.4%였으며, 플라시보에서 59.2%였다(adj RR = 1.04; CI95 0.96-1.14; p = 0.350). 이차 결과는 표 2a에 제시되고, 도 2a, b 및 도 3에서 탐색 하위그룹에 제시되었다.
[137]
참가자 특징은, 알테플라제를 투여받지 않은 대상체가 뇌졸중 발병으로부터 무작위 배정까지의 평균 시간이 더 긴 것을 제외하고 각각의 장치 및 알테플라제 계층 내에서 균형을 잘 이루었다. 이는 알테플라제를 투여받은 대상체가 일반적으로 알테플라제 치료 지침에 의해 지시된 기간 내에 등록된 반면(마지막으로 알려진 웰로부터 <4.5시간의 치료 기간), 알테플라제를 투여받지 않은 대상체는 프로토콜에 의해 허용된 전체 12시간 등록 기간에 걸쳐 등록되었기 때문이었다. 표기된 첫 번째 혈관내 장치 선택에 의한 치료 효과 수정의 증거는 없었다. 대조적으로, 통상적인 치료 정맥내 알테플라제 사용에 의한 치료 효과 수정의 증거가 있다(표 2b, 도 2b).
[138]
알테플라제를 투여받지 않은 계층에서, 네린티드를 투여받은 환자의 59.3%가 플라시보를 투여받은 49.8%와 비교하여 mRS 0-2를 달성하였다(adj RR 1.18, CI95 1.01-1.38). 90일차에 사망의 절대 위험은 7.5% 감소하였다. 이는 사망 위험을 대략 절반 감소시켰다(adj HR 0.56, CI95 0.35-0.95). 알테플라제를 투여받은 계층에서 mRS 0-2를 달성한 환자의 비율은 유사하였다(62.7% 네린티드 대 65.7% 플라시보(adj RR 0.97, CI95 0.87-1.08). 관찰된 알테플라제에 의한 치료 효과 수정은 알테플라제 계층에서 최대 혈장 네린티드 수준의 감소에 의해 지지된다(도 1). 다른 사전 지정된 탐구 관심 하위그룹은 차별적 치료 효과의 증거를 나타내지 않았다(도 3).
[139]
네린티드 그룹의 경색 부피 중앙값은 플라시보 그룹에서 26.0 (iqr 6.6-101.5) ml 및 23.7 (iqr 6.4-78.9) ml이었다. 표기된 혈관내 장치 계층에 의해 네린티드 그룹과 플라시보 그룹 사이의 경색 부피에는 차이가 없었다. 알테플라제 계층에서, 처리 그룹 사이의 경색 부피 중앙값(21.1 vs. 22.7 ml)에 차이가 없었다. 알테플라제 비처리 계층에서, 네린티드 그룹의 경색 부피 중앙값이 감소하였다(39.2 vs. 26.7 ml) (표 2b).
안전성
[140]
안전성 집단은 임의의 양의 연구 약물을 투여받은 모든 환자를 포함하였다(n=1101). 중요한 안전성 결과에는 차이가 없었다(표 3).
해석
[141]
알테플라제 비처리 계층에서, 네린티드는 개선된 결과와 관련이 있으며, 알테플라제 계층에서 플라시보를 선호하는 약간의 절대 위험 차이(유의하지 않음)로 관찰된 이점이 없었다.
[142]
네린티드에 대한 알테플라제에 의한 효과 수정의 관찰은 예상치 못하였다. 전임상 동물 연구로부터의 입수가능한 데이터는 네린티드가 알테플라제 후 투여될 경우, 네린티드의 처리 효과가 보존되었음을 시사하였다. 인간에서 네린티드 처리 반응에 대한 알테플라제의 효과의 큰 규모는 예측되지 못하였다. 이러한 발견은, 알테플라제 비처리 계층에서 9.4% 절대 이점(10-11명의 환자의 치료 필요 수) 및 알테플라제 계층에서 네린티드의 치료 효과를 무효화하는 알테플라제와 네린티드의 약물-약물 상호작용에 의해 설명될 수 있다. 알테플라제 계층에서 이러한 네린티드 효과 결여는 생물학적으로 그럴듯하다. 네린티드는 알테플라제의 활성에 영향을 미치지 않는다3. 그러나, 네린티드는 조직-플라스미노겐 활성화제(예컨대 알테플라제)에 의해 순환하는 플라스미노겐으로부터 생성되는 세린 프로테아제인 플라스민에 의해 절단되는 아미노산 서열을 가지며, 동물에서 알테플라제에 의해 절단된다. 알테플라제 계층에서 네린티드 이점 결여는, 시험 참가자의 서브세트의 약동학적 데이터에 의해 뒷받침되는 바와 같이, 플라스민에 의한 네린티드의 효소적 절단이 치료 수준 이하의 네린티드 농도로 이어질 수 있기 때문일 수 있다. 네린티드의 절단은 알테플라제의 간접적인 효과이기 때문에, 알테플라제 주입과 네린티드 투여 간의 기간은 활성 기간 및 진행중인 플라스민 생성과 비교하여 덜 중요할 수 있다. 약동학적 관찰과 결합된 알테플라제 비처리 계층에서 임상 결과의 개선, 사망률 감소 및 경색 부피 감소는 효과 수정의 임상 관찰이 우연한 발견이 아니라는 강력한 증거를 제공한다.
[143]
알테플라제 계층의 환자는 일반적으로 알테플라제의 치료 기간(뇌졸중 발병 후 최대 4.5시간) 내에 등록되는 반면, 알테플라제 비처리 계층의 환자는 시험의 12시간 뇌졸중 발병에서 무작위 배정 기간 전체에 걸쳐 등록되었다. 일반적으로, 알테플라제 사용 사이에는 시간에 따른 공선성이 있었다; 알테플라제 비처리 계층은 발병에서 무작위 배정 시간이 더 긴 환자를 포함할 가능성이 훨씬 더 높았다.
[144]
네린티드 그룹과 플라시보 그룹 둘 모두에서 동일한 수의 심각한 부작용이 발생하였다. 고용량 동물에서 네린티드는 프로타민 및 반코마이신과 같은 고도로 하전된 양이온 분자에 의해 초래되는 것과 유사한 비면역 매개된 비만 세포 탈과립으로 인한 것으로 생각되는 순환 히스타민의 일시적인 상승을 유발한다. 이는 저혈압, 홍조, 두드러기 및 소양증과 같은 히스타민 촉발 부작용을 유발할 수 있다. 플라시보와 비교하여 네린티드로 처리된 환자에서 유해 사례의 비율에는 유의한 차이가 없었다. 그러나, 플라시보와 비교하여 약물 처리시 일시적 저혈압, 폐렴 및 울혈성 심부전 사례가 수치적으로 더 많았다. 알테플라제 비처리 계층 중에서 네린티드 그룹은 플라시보와 비교하여 뇌졸중 진행, 재발성 뇌졸중 및 출혈성 변형 사례가 수치적으로 더 낮았다.
표 1 - 기준선 특성
*N = 546(3 결측 데이터);
**N = 1090 누락되거나 스코어를 매길 수 없는 영상화로 인함;
§. 뇌졸중이 목격되지 않은 상황에서, 뇌졸중 발병은 마지막으로 관찰된 시간으로서 정의되었다. 이것은 종종 깨어났을 때 뇌졸중의 경우 환자가 잠자리에 드는 시간을 의미하였다.
모든 값은 중앙값(iqr) 또는 n(%)으로 표시됨
NIHSS = 국립보건원 뇌졸중 척도; ECG = 심전도; ASPECTS = 알버타 뇌졸중 프로그램 조기 CT 스코어; ICA = 내경동맥; EVT = 혈관내 혈전절제술; eTICI = 대뇌 허혈에서 확장된 혈전용해
표 2A - 전체 결과
* 중앙값의 절대 부피 차이.
** 베타 계수는 대조군과 비교하여 네린티드(NA-1)를 사용하여 조정된 세제곱근 부피(ml1/3) 감소를 나타낸다. N=1099 영상화에서 누락되거나 측정할 수 없는 부피로 인함. 평균 부피는 73.1 ml(플라시보) 및 71.1 ml(네린티드)였다.
§ 결측 결과가 있는 9명의 환자를 사망으로 전가하지 않으면서, 플라시보 그룹에서 74/550(13.5%)의 사망이 있고 네린티드 그룹에서 64/546(11.7%)의 사망이 있었다; RR 0.87 (CI95 0.64-1.19)
mRS = 수정된 랭킨 척도; NIHSS = 국립보건원 뇌졸중 척도; BI = 수정된 바텔 지수; RR = 위험 비율; CI95 = 95% 신뢰 구간
주의: 위험 비율은 Huber-White 강력 분산 추정기와 다변수 푸아송 회귀를 사용하여 유래된다. 이 접근 방식은 검토자와 편집자 둘 모두의 동료 검토 시 권장되었기 때문에 SAP(다변수 로지스틱 회귀에서 오즈비를 보고한다고 명시)와 상이하다. 비례 오즈 가정이 충족되지 않았으므로(스코어 테스트) 수정된 랭킨 척도에서 '이동'에 대한 공통 오즈비가 보고되지 않았다. 연령(y), 성별, 기준선 NIHSS 스코어, 핵심 연구소에서 판독한 ASPECTS 스코어, MCA vs. ICA로서의 폐색 위치, 표기된 혈관내 접근법 및 부위에 대한 조정.
표 2B - 알테플라제에 의한 결과
* 중앙값의 절대 부피 차이.
** 베타 계수는 대조군과 비교하여 네린티드(NA-1)를 사용한 세제곱근 부피(ml1/3) 감소를 나타낸다. 경색 부피 결과에 있어서 네린티드에 대한 알테플라제의 효과 수정, p상호작용 = 0.0400. 알테플라제 비처리 그룹에서, 평균 부피는 87.2 ml (플라시보) 및 67.8 ml (네린티드)였다. 알테플라제 그룹에서, 평균 부피는 63.3 ml (플라시보) 및 73.3 ml (네린티드)였다.
§ 결측 결과가 있는 9명의 환자를 사망으로 전가하지 않음: (1) 알테플라제 비처리 계층 - 플라시보 그룹에서 43/224(19.2%) 사망 및 네린티드 그룹에서 25/216(11.6%) 사망이 있다; RR 0.60(CI95 0.38-0.95); (2) 알테플라제 계층 - 플라시보 그룹에서 31/326(9.5%) 사망 및 네린티드 그룹에서 39/330(11.8%) 사망이 있다; RR 1.24 (CI95 0.80-1.94)
참고: mRS 0-2 결과에 있어서 네린티드에 대한 알테플라제의 효과 수정, p상호작용 = 0.0330. 가능한 최악의 스코어로 전가된 이진 결과에 대한 결측 데이터(알테플라제 비처리 계층, 대조군 3, 네린티드 3; 알테플라제 계층, 대조군 3, 네린티드 0). 위험 비율은 Huber-White 강력 분산 추정기와 다변수 푸아송 회귀를 사용하여 유래된다. 이 접근 방식은 검토자와 편집자 둘 모두의 동료 검토 시 권장되었기 때문에 SAP(다변수 로지스틱 회귀에서 오즈비를 보고한다고 명시)와 상이하다. 비례 오즈 가정이 충족되지 않았으므로(스코어 테스트) 수정된 랭킨 척도에서 '이동'에 대한 공통 오즈비가 보고되지 않았다. 연령(y), 성별, 기준선 NIHSS 스코어, 핵심 연구소에서 판독한 ASPECTS 스코어, MCA vs. ICA로서의 폐색 위치, 표기된 혈관내 접근법 및 부위에 대한 조정.
mRS = 수정된 랭킨 척도; NIHSS = 국립보건원 뇌졸중 척도; BI = 수정된 바텔 지수; RR = 위험 비율; CI95 = 95% 신뢰 구간
표 3 - MedDRA 우선 용어에 의한 치료 응급 중대 유해 사례
* 미조정
참고: 안전성 집단은 임의의 용량의 연구 약물을 투여받은 환자만을 포함한다(N=1101); RR = 위험 비율.
대증 두개내 출혈(ICH)은 다음과 같은 MedDRA PT 코드를 포함한다: 혈관 시술 합병증, 뇌졸중의 출혈성 변형, 출혈성 뇌졸중, 두개내 출혈, 뇌출혈, 지주막하 출혈
폐렴은 MedDRA PT 코드를 포함한다: 폐렴, 흡인성 폐렴, 세균성 폐렴.
요로 감염은 MedDRA PT 코드를 포함한다: 요로 감염 및 요로패혈증
** 네린티드 그룹의 1건은 투여 후 11일차에 발생하였으며, 나머지 저혈압 사례는 투여 당일에 발생하였다.
실시예 2.
[145]
이 실시예는 플라스민에 의한 네린티드의 절단을 조사하고, 플라스민 절단에 내성이 있는 PSD-95를 억제하는 변이체 활성제를 설명한다.
결과
네린티드는 플라스민에 의해 절단된다.
[146]
네린티드는 임의의 고유의 섬유소 용해 활성을 갖지 않으며, 알테플라제 또는 테넥테플라제와 같은 혈전용해제의 활성에 영향을 미치지 않지만 그 반대는 상이하다. 세린 프로테아제인 플라스민은 혈전용해제에 의해 활성화되어 피브린 혈전을 용해하고 수 시간 동안 지속된다(Chandler et al., Haemostasis 30, 204-218 (2000). 플라스민은 염기성 잔기의 C-말단 쪽에 절단 특이성을 가지며, 따라서 네린티드의 N-말단에서 잔기 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 및 12 다음에 발생할 수 있다. 이러한 절단 부위와 일치하는 절단 생성물은 37℃에서 인산염 완충 식염수에서 플라스민(1 mg/mL)과 네린티드(18 mg/mL)를 인큐베이션하고 LC/MS로 샘플을 분석한 후 관찰되었다(도 4a). 본 발명자들은 37℃에서 혈장에서 65 ug/ml의 네린티드와 알테플라제를 인큐베이션하고, HPLC로 네린티드 수준을 테스트하여 래트와 인간 혈장 둘 모두에서 이것을 직접 테스트하였다(도 4b, c). 65 ug/ml의 네린티드 농도는 2.6 mg/kg 용량을 일시 투여한 75 kg 사람의 이론상 최고 농도를 나타낸다. 알테플라제를 60분에 걸쳐 첨가하여 임상 투여 방식(방법)을 시뮬레이션하였다. 알테플라제의 농도(도 4b[래트] 및 도 4c[인간]에 표시)는 0.9 mg/kg 투여량(22.5 ug /ml)의 초기 10% 일시 투여 종료시 사람에게 예상되는 최고 농도뿐만 아니라, 래트 섬유소용해 시스템은 인간 재조합 tPA에 덜 민감할 수 있기 때문에 래트에서 그 용량의 3배 및 6배를 시뮬레이션하기 위해 선택하였다(Korninger, Thromb Haemost 46, 561-565 (1981)). 알테플라제의 첨가는 농도 의존적 방식으로 래트 혈장의 네린티드 함량을 감소시켰으며(도 4b), 22.5 ug/ml 알테플라제의 "인간 등가" 용량의 효과는 래트와 인간 혈장 간에 유사하였다(도 4b, c).
[147]
ESCAPE-NA1 시험에서 네린티드의 효과가 알테플라제에 의해 무효화되었기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 래트에서 네린티드의 약동학(PK)에 대한 알테플라제의 효과를 평가하였다. 알테플라제는 임상 프로토콜(10% 일시 주입 후 나머지 60분 주입)을 시뮬레이션하는 주입으로 0.9 mg/kg (인간 용량) 및 5.4 mg/kg (인간 용량의 6배) 투여되었다. 네린티드는 7.6 mg/kg의 알테플라제 주입 시작 시 정맥내 일시 투여로 투여되었다. 이는 이전 뇌졸중 연구(5, 7, 15)에서 래트에 가장 일반적으로 사용되는 용량이며, 이는 ESCAPE-NA1에 사용된 용량인 2.6 mg/kg을 투여받은 인간에서 생성된 것과 유사한 래트에서 Cmax로 이어진다. 인간 용량의 알테플라제와 네린티드의 공동-투여는 네린티드의 Cmax 및 AUC의 유의하지 않은 감소를 발생시켰다(도 4d, e). 그러나, 인간 용량(5.4 mg/kg)의 6배에서 알테플라제는 네린티드의 평균 Cmax 및 AUC를 유의하게 저하시켰다(각각 49.5% 및 44%). 동물에서 이 발견은 알테플라제 치료된 환자가 더 낮은 네린티드의 혈장 수준을 나타낸 ESCAPE-NA1 시험의 PK 데이터를 지지한다.
[148]
고용량 알테플라제에 의한 전장 네린티드의 절단은 불완전하여, 신경보호를 달성하기 위해 일부 활성 약물이 여전히 남아있을 가능성을 증가시켰다. 이는 일시적 중간 대뇌 동맥 폐색(tMCAO) 모델에서 네린티드의 용량 반응 연구에 의해 래트에서 뒷받침되었다. 네린티드 및 요오독사미드를 tMCAo 후 60분에 일시 주사로 래트에 정맥내 투여하였다. 도 11a는 tMCAo 후 24시간에 반구 경색 부피 측정을 보여준다. A에서의 막대는 평균 ± SD를 나타내며, 모든 개별 데이터 지점이 플롯팅되었다. A의 별표는 비히클 그룹과 비교할 때 P<0.01을 나타낸다(다중 비교 테스트를 위한 일원 ANOVA 사후 Tukey 보정) N = 12-14마리 동물/그룹. 도 11b는 tMCAo 후 24시간에 신경학적 스코어를 보여준다. 유의한 차이는 비히클 그룹과 비교할 경우 별표로 표시된다(다중 비교 테스트에 대한 사후 Dunn 보정을 사용한 순위에 대한 Kruskal-Wallis 분산 분석, *P<0.01). 비히클: PBS 단독. 스크램블: PSD-95에 결합할 수 없는 ADA 펩티드. 0.25 mg/kg만큼 낮은 용량은 경색 부피의 유의한 감소(P=0.01)와 신경 기능의 개선을 가져왔다. 0.025 mg/kg만큼 적은 용량도 또한 효과적이었다. 적어도 25 mg/kg 이하의 용량도 또한 효과적이었고 최고 효능은 약 15 mg/kg에서 달성되었다. 관찰된 넓은 치료 범위는 히스타민 방출로 인한 잠재적인 저혈압을 피하기 위해 모든 용액에 존재하는, 비만 세포 탈과립 억제제 요오독사미드가 아니라 네린티드에 기인하였다.
용량 분리는 네린티드의 치료 이점을 회복시킨다
[149]
인간과 동등한 농도로 래트와 인간 모두에서 네린티드의 반감기는 약 5-10분이었고(도 4d), 이는 건강한 인간 지원자에서 네린티드의 반감기와 유사하다(도 9). 래트 및 인간에서 네린티드의 짧은 반감기는 분해에 의해 설명되지 않는데, 왜냐하면 혈장에서의 분해가 느리기 때문이다(도 4b 및 4d 비교). 이는 네린티드가 다른 조직으로 분할되면서 혈관내 구획을 빠르게 빠져나감을 시사한다. 그렇다면, 알테플라제 전에 네린티드를 투여하면 혈류에서 네린티드의 절단을 없애고, 이의 신경보호 효과를 보존할 수 있다.
[150]
이를 테스트하기 위해 수컷 Sprague-Dawley 래트(10-12 주령; 270-310 g; Charles River, Montreal, QC, Canada)를 중간 대뇌 동맥으로의 자가 혈전의 도입에 의해 생성된, 색전성 중간대뇌동맥 폐색(eMCAO)으로 처리하였다. 재관류는 허혈 발생 후 90분에 시작하여 총 용량 5.4 mg/kg의 정맥내 알테플라제 처리에 의해 달성되었다. 알테플라제는 총 용량의 10%가 일시 투여하고 용량의 나머지 90%는 60분 주입에 걸쳐 제공되는 인간 주사 프로토콜을 사용하여 투여하였다. 알테플라제의 용량은, 래트 섬유소용해 시스템이 인간 재조합 tPA에 덜 민감할 수 있다는 예상에서 인간 용량의 6배였다. 이 용량은 파일럿 연구에서 고용량의 알테플라제(10x 인간 용량)가 뇌졸중의 출혈성 전환으로 인해 허용할 수 없는 사망률을 생성하였기 때문에 선택되었다. 네린티드는 7.6 mg/kg의 용량으로 알테플라제 투여 시작 30분 전 또는 동시에 투여하였다(도 5a). 이 용량은 2.6 mg/kg의 임상 유효 용량을 투여받은 인간에서 달성된 것과 유사한 PK 매개변수(Cmax 및 AUC)를 발생시켰다(도 4d를 도 9와 비교). 경색 부피, 반구 종창 및 신경학적 스코어를 24시간에 평가하였다.
[151]
eMCAO 후 60분에 단독 투여된 네린티드는 경색 부피를 59.2% 감소시킨 반면(427 ± 27 mm3에서 175 ± 40 mm3), 알테플라제 단독은 eMCAO 후 60분에 투여했을 때 경색 부피를 26% 및 90분에 투여했을 때 18% 감소시켰다(도 5b). 네린티드의 유익한 효과는 eMCAO 후 60분에 알테플라제와 동시에 투여되는 경우 완전히 제거되었다. 대조적으로, 네린티드는 60분에 투여하고 30분 후에 알테플라제를 투여할 경우 매우 효과적이었다(70% 경색 부피 감소). 네린티드와 알테플라제 사이의 30분 투여 분리의 이러한 유익한 효과는 eMCAO 후 반구 종창을 감소시키고(도 5c) 신경학적 스코어를 개선하는데 있어서(도 5d) 유사하게 반영되었다. 그룹 간에 생리학적 매개변수, 사망률 또는 제외에 차이가 없었다.
[152]
본 발명자들은 분해를 완화하기 위해 필요한 투여 분리 간격을 조사하기 위해 PK 연구를 수행하였다. 이들 연구는 인간과의 관련성을 최대화하기 위해 사이노몰구스 마카퀘스(cynomolgus macaques)(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))에서 수행되었다. 네린티드를 2.6 mg/kg의 용량으로 10분 동안 정맥내 주입하였다. 이 투여 요법은 LVO에 의해 뇌졸중에 노출된 원숭이에서 신경보호적이며(Cook et al., Nature 483, 213-217 (2012)), 2상 ENACT 시험 (Lancet Neurol 11, 942-950 (2012)) 및 ESCAPE-NA1 시험 (Lancet 395, 878-887 (2020)) 둘 모두에서 이용되었다. 본 발명자들은 알테플라제 투여가 네린티드 주입 시작과 동시에, 10분 네린티드 주입 종료시, 또는 네린티드 주입 종료 후 10분에 시작되는 시나리오를 조사하였다. 알테플라제(1 mg/kg)를 10% 일시 주입으로 별도의 정맥 라인을 통해 투여한 후 나머지 90%는 임상 용도에 따라 1시간에 걸쳐 주입하였다.
[153]
네린티드와 알테플라제의 공동-투여는 Cmax의 47.4% 감소 및 네린티드의 AUC 53.9% 감소를 유도하였다(도 10a-c). 네린티드 주입 종료시 알테플라제 시작은 Cmax의 적당한 23.1% 감소 및 AUC의 32.3% 감소를 발생시켰으나, 동물 모델을 기반으로 하여 효과적인 것 같은 혈장 농도를 여전히 달성하였다. 10분 네린티드 주입 종료 후 10분을 기다리면(또는 동등하게는 주입 시작으로부터 20분을 기다리면) 오차 막대로 나타낸 측정 오차 범위 내로 알테플라제에 의해 Cmax 또는 AUC의 저하를 제거하였다(도 10a-c).
[154]
이러한 결과에 기초하여, 용량 분리 접근법은 알테플라제로 처리된 동물에서 네린티드에 의한 신경보호를 보존하기 위한 실용적인 전략이다.
D-아미노산은 네린티드를 혈전용해제에 의한 절단에 둔감하게 만든다
[155]
본 발명자들은 PSD-95 PDZ2에 대한 특이적 결합이 C-말단 아미노산의 L-거울상이성질체 구성을 필요로 할 수 있지만, Tat 부분은 D-아미노산을 L-아미노산으로 대체함으로써 프로테아제 분해에 내성이 될 수 있다고 추론하였다. 그렇게 함으로써 본 발명자들은 GluN2B C-말단의 9개 L-아미노산에 융합된 Tat의 11개 D-아미노산을 포함하는 D-Tat-L-2B9c라는 펩티드를 생성하였다(ygrkkrrqrrrKLSSIESDV SEQ ID NO:89). 이 펩티드는 ELISA 검정에서 PSD95의 표적 PDZ2 도메인에 대한 네린티드와 실질적으로 유사한 결합을 가졌다(도 6a). 결합은 결합에 실패한 마지막 3개 C-말단 잔기에서 이중 점 돌연변이를 함유하는 동일한 D-Tat-L-2B9c 작제물(Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ala-Asp-Ala (SEQ ID NO:90); D-Tat-L-2B9cAA로 명명됨)과 같이 특이적이었다.
[156]
네린티드 또는 D-Tat-L-2B9c 단독은 37℃에서 인산염 완충 식염수에서 안정적이지만, 플라스민과의 네린티드의 인큐베이션은 이의 신속한 분해를 발생시킨다(도 6b). 대조적으로, D-Tat-L-2B9c는 동일한 조건하에서 유의한 분해를 나타내지 않았다. 네린티드가 아닌 플라스미노겐이 알테플라제에 대한 직접적인 기질이기 때문에 어느 것도 알테플라제와의 공동-인큐베이션에 의해 영향을 받지 않았다(도 6b). 유사하게, 네린티드와 D-Tat-L-2B9c 단독 둘 모두는 알테플라제의 부재하에 래트와 인간 혈장 둘 모두에서 안정적이었다(도 6c, d). 그러나, 알테플라제(rt-PA; 135 ug/ml)의 첨가는 네린티드의 빠른 분해를 발생시켰으나, D-Tat-L-2B9c에는 그렇게 하지 않았다(도 6c, d). 본 발명자들은 또한, 뇌졸중에 대한 인기를 얻을 수 있는 급성 심근경색의 치료에 현재 사용 중인 조직 플라스미노겐 활성제인 테넥테플라제(TNK)로 유사한 실험을 수행하였다. 래트 및 인갈 혈장 둘 모두에의 TNK의 첨가는 네린티드의 신속한 제거를 발생시켰으나, D-Tat-L-2B9c에는 그렇게 하지 않았다(도 6e, f).
[157]
래트에 정맥내 일시 투여할 경우, 네린티드 및 D-Tat-L-2B9c 둘 모두는 실질적으로 유사한 약동학적 프로파일을 나타내었으며, D-Tat-L-2B9c가 약간 더 선호되었다(더 높은 Cmax 및 AUC). 혈전용해제의 부재하에, 이들의 상대적인 혈장 안정성(도 6c-f)에도 불구하고 혈관내 구획으로부터의 이 둘 모두의 신속한 제거(도 7a-c)는 이 둘 모두의 약동학이 단백질 분해 파괴보다는 조직으로의 신속한 분포에 의해 더 많이 좌우된다는 가설을 뒷받침한다.
D-Tat-L-2B9c는 알테플라제와 공동-투여될 경우 효과적인 신경보호제이다
[158]
D-Tat-L-2B9c와 네린티드는 tMCAO의 래트 모델에서 경색 부피 감소, 반구 종창 감소 및 신경학적 스코어 개선에 동등하게 효과적이었다. 따라서 본 발명자들은 알타플라제의 동시 투여로 D-Tat-L-2B9c의 효과가 보존되는지 여부를 조사하였다.
[159]
수컷 Sprague-Dawley 래트는 이미 설명한 대로 eMCAO로 처리하였다. 네린티드(7.6 mg/kg) 또는 D-Tat-L-2B9c(7.6 mg/kg)를 60분에 일시 주사로 제공하였다. 알테플라제(60분에 걸쳐 5.4 mg/kg)는 또한 PSD-95를 억제하는 활성제와 동시에 eMCAO 후 60분에 시작하였다. 신경학적 스코어, 경색 부피 및 반구 종창은 24시간에 평가하였다(도 8a).
[160]
eMCAO 후 60분에 투여된 네린티드 단독은 알테플라제가 없을 때 경색 부피를 실질적으로 감소시켰다(458 ± 39 mm3에서 296 ± 66 mm3로). 이 효과는 네린티드와 알테플라제 둘 모두가 모두 제공되었을 때 완전히 제거되었다(도 8b). 대조적으로, D-Tat-L-2B9c로의 처리는 알테플라제의 부재하에 네린티드 단독만큼 효과적이었으며, 이러한 효과는 D-Tat-L-2B9c와 알테플라제 둘 모두가 함께 제공될 때에도 지속되었다(도 8b). D-Tat-L-2B9c의 유익한 효과는 경색 부피(도 8b), 반구 종창(도 8c) 및 신경학적 스코어(도 8d)를 측정할 때 분명하였다. 그룹 간에 생리학적 매개변수, 사망률 또는 배제에 차이가 없었다.
논의:
[161]
본 발명자들은 알테플라제 처리의 시작 전 짧은 시간 동안 네린티드를 투여하면 알테플라제에 의한 네린티드의 불활성화를 완전히 제거한다는 것을 보여주었다(도 6a-f). 이 접근법은 인간과 래트 간에 유사한 PK 고려 사항에 의해 주도되며(도 4d), 섬유소 용해 생물학의 종 간 차이에 대해 애그노스틱이다. 혈장 내 반감기가 짧기 때문에, 네린티드는 혈관 내 구획을 빠져나가며, 알테플라제가 30분 후에 투여될 때 더 이상 알테플라제에 의해 실질적으로 절단되지 않는다.
[162]
투여 분리에 대한 대안으로서, PSD-95의 단백질-단백질 상호작용은 프로테아제-비민감성 억제제로 해결될 수 있다. 본 발명자들은 혈전용해제에 의한 절단에 대해 네린티드를 민감하지 않게 만드는 실용적인 접근 방식은 플라스민-민감성 잔기(즉, 적어도 Tat 단백질 변환 도메인)를 D-아미노산으로 전환하는 것임을 보여주었다. PDZ-도메인 결합 [T/S]-XV 모티브로 종결되는 콘센서스 서열은 보존되어, PSD-95에 대한 동등한 결합 및 신경보호 효능을 갖는 네린티드 및 D-Tat-L-2B9c 둘 모두를 생성하였다.
[163]
D-Tat-L-2B9c와 같은 제제는 현재 FRONTIER 시험에서 네린티드의 경우와 같이 심지어 병원에 도착하기 전에 뇌졸중이 확인되는 즉시 투여될 수 있다. 또한, 이는 치료 전문가가 적절하다고 판단되는 경우 혈전용해제 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 뇌졸중 환자의 치료 경로에서 임의의 다른 시간에 투여될 수 있다.
재료 및 방법:
동물
[164]
실험은 10-12주령에 체중이 270-320 g인 마취된 수컷 Sprague-Dawley 래트에 대해 수행되었다(Charles River; Montreal, QC, Canada). 래트를 멸균 케이지에 수용하고 실험 내내 자유롭게 움직이고 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다.
연구 약물
[165]
네린티드를 합성하고 NoNO Inc.에 의해 18 mg/ml로 제형화하였다(Toronto, Canada. 플라시보는 시각적으로 동일한 바이알에 제공된 인산염 완충 식염수를 포함하였다. 동결건조된 D-TAT-L-2B9c는 Genscript(China)에 의해 합성하였으며, 펩티드 가수분해 및 아미노산 액체 크로마토그래피 분석으로 처리하여 펩티드 함량의 정확한 측정치를 얻었다. 재구성된 펩티드는 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 인간 rt-PA(Alteplase/CathFlo; Roche, San Franscisco, U.S.A.)를 주사용 멸균수(USP 3ml, AirLife, AL7023)에서 최종 농도 1 mg/ml로 재구성하고 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 보관하였다. 안정성 연구를 위한 TNK(용액용 50 mg 분말, Hoffmann-La Roche Limited)를 주사용 멸균수(SWFI)에서 37.5 ug/ml 또는 6.25 ug/m의 최종 농도로 재구성하고 사용할 때까지 2 내지 8℃에서 보관하였다. 모든 동물 실험에서, 네린티드 또는 D-Tat-L-2B9c를 일시 주사로 제공하였다. 비만 세포 탈과립 억제제인 로독사미드는 양이온성 펩티드의 잠재적 효과인 히스타민 방출로 인한 잠재적인 저혈압을 피하기 위해 둘 모두와 함께 공동-투여하였다(0.1 mg/kg). 모든 실험에서 rt-PA는 60분에 걸쳐 투여하였다(10%를 일시 투여한 후 나머지 90%를 60분 주입).
다른 시약
[166]
달리 명시되지 않는 한 모두 Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada)로부터 구입하였다. HPLC 등급 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산 및 물은 Fisher Scientific(Fair Lawn, NJ, USA)에서 구입하였다. TRIS, 과염소산 및 인산염 완충 식염수는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 상업용 래트 혈장(Innovative Research Inc, NA-EDTA를 갖는 Rat Sprague Dawley 혈장[카탈로그 번호: IRTSDPLANAE10ML]) 및 인간 혈장(Innovative Research Inc, NA-EDTA를 갖는 Pooled Human 혈장[카탈로그 번호: IPLANAE10ML])을 사용하였다.
뇌졸중 연구
[167]
연구는 p = 0.05에서 대조군과 처리군 사이의 40% 절대 차이를 검출하기 위해 80% 검정력을 갖도록 설계되었다. 동물 무작위 배정, 약물 할당 및 치료 약물 제조는 수술 또는 결과 평가와 직접적으로 관련되지 않은 연구 동료에 의해 수행되었다. 네린티드 및 D-Tat-L-2B9c는 500 uL 분취량에서 7.6 mg/mL 농도로 새로 제조하였다. 알테플라제는 동결건조된 약물로부터 제조하였으며, 매칭 플라시보와 마찬가지로 동일한 유리관에 보관하였다. 약물을 사용 전 10분까지 4℃에서 보관하였다. 외과의와 수술, 뇌졸중 부피 측정, 행동 평가 및 통계 분석을 담당하는 조사자들은 처리 할당에 대해 맹검이었다.
[168]
수술을 받은 모든 동물은 MCA 폐색 전에 생리학적 매개변수를 측정하였다. 평균 동맥 혈압의 침습적 모니터링을 위한 및 기준선 [혈액 가스 카트리지 CG8+, VetScan i-STAT 1 분석기]에서 혈액 가스(pH, PaO2 및 PaCO2), 전해질(Na+, K+, iCa) 및 혈장 글루코스를 측정하기 위해 혈액 샘플을 얻기 위한 PE-50 폴리에틸렌 튜빙을 오른쪽 대퇴 동맥에 삽입하였다. 체온은 직장 프로브로 지속적으로 모니터링하고, 가열 램프로 37.0 ± 0.7℃로 유지하였다. tMCAO는 종래 설명된 대로 수행하였다(5, 7). eMCAO는 문헌 [Henninger et al., Stroke 37, 1283-1287(2006)]에 설명된 대로 달성하였다. 간략히 말해서, 폐색 전 24시간에 동일한 래트로부터 채취한 전혈로부터 생성된 18-22 mm 길이의 자가 혈전을 내경동맥에 도입된 PE 튜빙으로부터의 압출에 의해 중대뇌동맥으로 도입하였다. 레이저 도플러 모니터(Perimed, Jrflla, Stockholm, Sweden)를 사용한 상대적 구역 대뇌 혈류(rCBF) 측정을 사용하여 성공적인 eMCAO(rCBF에서 >65% 감소)와 알테플라제로의 재관류를 확인하였다.
[169]
경색 부피 및 반구 종창은 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드로 염색된 표준 뇌 조각으로부터 뇌졸중 후 24시간에 평가하였다(Sigma Aldrich, St. Louis, MD, USA)(7). 신경학적 스코어는 뇌졸중 발병 후 24시간에 정면 시각 배치, 옆으로 시각 배치, 정면 촉각 배치, 옆으로 촉각 배치 및 수직 촉각 배치를 포함하는 앞다리 배치 테스트를 사용하여 수행하였다(최대 손상을 나타내는 최대 12에 대한 각 구성 요소의 스코어 범위는 0-2이다).
시험관 내 펩티드 분해 검정
[170]
혈장 중 rt-PA의 존재하에 네린티드 안정성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 HPLC에 의한 시험관 내 펩티드 함량 분석을 사용하였다. 간략히 말해서, 네린티드 또는 D-Tat-L-2B9c는 65 ug/ml 농도로 래트 또는 인간 혈장에 스파이킹되었다. rt-PA는 기준 시점이 수집된 후 지정된 농도에서 추가하였다. rt-PA 투여는 Harvard 장치 펌프를 사용하는 임상 투여 접근법[10% 일시 투여 후 60분 주입(용량의 90%)]을 따랐다. IV 일시 투여 후 샘플 수집은 투여 후 5분, 15분, 30분 및 45분에 수행하였다. 각 시점에서 새로운 주사기를 사용하여 각 바이알에서 약 100 uL의 혈장을 수집하였다. 그런 다음 혈장을 수집하고 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
생체 내 약동학 분석
[171]
이 연구의 목표는 순환하는 rt-PA 및 플라스민의 존재하에 있을 때 네린티드 PK 매개변수 변화를 평가하는 것이었다. 수컷 나이브 래트에게 네린티드 단독, 네린티드 + rt-PA(0.9 mg/kg) 또는 네린티드 + rt-PA(5.4 mg/kg)를 정맥내 투여하였다. 샘플 수집은 투여 전 및 투여 후 0분, 5분, 10분, 20분, 50분에 수행하였다. 각 시점에서 새 주사기를 사용하여 각 동물로부터 약 300 uL의 혈액을 샘플링하였다. 혈액 샘플을 미리 준비된 에펜도르프 튜브[30 ul의 EDTA 2.5%]에서 수집하고 20분 동안 원심분리하여 혈장 및 세포 성분을 분리하였다. 그런 다음 혈장 샘플을 수집하고 HPLC에 의해 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
고압 액체 크로마토그래피
[172]
혈장 샘플은 분석될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 네린티드 또는 D-Tat-L2B9c를 1M 과염소산으로 침전시켜 추출하였다. 모든 분석은 Agilent 1260 Infinity Quaternary LC 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)과 25cm [YMAA12S052546WT] C-18 RP-HPLC 컬럼(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에서 수행하였다. 컬럼은 40℃에서 0.1% TFA가 포함된 10% 아세토니트릴로 평형화하였다. 용리액의 흐름은 1.5 ml/분이었다(0.1% TFA 중 10%에서 35% 아세토니트릴로의 구배). UV 자취는 220 nm에서 기록하였다. 네린티드 또는 D-Tat-L-2B9c의 농도는 제제를 혈장에 스파이킹하여 얻은 보정 표준에서 유래되었다.
ELISA 검정
[173]
ELISA 플레이트를 4C에서 밤새 50 mM 중탄산염 완충액 중 1 ug/ml PSD95PDZ2로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 PBST(0.05%) 중 2% BSA에서 차단하였다. 그런 다음 표시된 농도(도 4a)에서 비오티닐화된 리간드(네린티드, D-tat-L2B9c 또는 D-Tat-L-AA)와 인큐베이션하고 4C에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T로 세척한 후 플레이트를 (1:3000) SA-HRP로 30분 동안 인큐베이션하고, 다시 세척하고 TMB 용액으로 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 ul H2SO4로 반응을 중단시켰다. 흡광도는 시너지 H1 판독기로 450 nm에서 측정하였다.
통계
[174]
펩티드 농도의 변화는 양방향 반복 측정 ANOVA를 사용하여 분석한 후 다중 비교를 위해 Sidak 보정을 수행하였다. 피크 혈장 농도(Cmax)의 약동학(PK) 매개변수 및 0부터 마지막 측정 농도(AUC)까지의 혈장 농도-시간 곡선 하 면적은 비구획 분석을 사용하고 선형 보간을 이용하여 PKsolver Software (USA)로 수득하였다. 뇌졸중 연구의 경우 다중 비교를 위한 Tukey 보정과 일원 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 차이를 테스트하였다. 신경학적 스코어 평가에서 그룹 간의 차이는 사후 Dunn 보정과 함께 순위에 대한 분산의 비모수적 Kruskal-Wallis 분석을 사용하여 분석하였다. 지주막하 출혈 또는 출혈성 변형을 포함하는 임의의 이유로 조기 사망을 경험하는 동물에 대한 값은 모든 동물에 걸쳐 달성된 최악의 신경학적 스코어 및 최대 뇌졸중 부피를 반영하도록 귀속되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> NoNO INC.
TYMIANSKI, MICHAEL
GARMAN, JONATHAN D.
<120> COMBINATION TREATMENT OF STROKE WITH PLASMIN-CLEAVABLE PSD-95
INHIBITOR AND REPERFUSION
<130> 057769-552735
<150> US 62/978,792
<151> 2020-02-19
<150> US 62/978,759
<151> 2020-02-19
<160> 90
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
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<220>
<223> Synthesized
<220>
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<220>
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<220>
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Xaa Xaa Xaa Xaa
1
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<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Ala, Gln, Asp, Asn, N-Me-Ala, N-Me-Gln, N-Me-Asp,
N-Me-Asn, or an analog thereof
<400> 2
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1
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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20
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 4
Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 5
Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
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<220>
<223> Synthesized
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Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
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<220>
<223> Synthesized
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<223> Synthesized
<400> 8
Arg Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
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<211> 9
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<220>
<223> Synthesized
<400> 9
Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
1 5
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthesized
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<220>
<223> Synthesized
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<223> Synthesized
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1
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
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1
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthesized
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1
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<223> Synthesized
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<220>
<223> Synthesized
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Ser or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is Asp, Glu, Gln, or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is Val or Leu
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Ile Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
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1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 22
Ile Glu Thr Asp Val
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 23
Ile Glu Thr Ala Val
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 24
Ile Glu Thr Glu Val
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 25
Ile Asp Thr Asp Val
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 26
Ile Asp Thr Glu Val
1 5
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Glu, Asp, Gln, Ala, or an analog thereof
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Ala, Gln, Asp, Glu, Asn, N-Me-Ala, N-Me-Gln, N-Me-Asp,
N-Me-Glu, N-Me-Asn, or an analog thereof
<400> 27
Xaa Xaa Xaa Val
1
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Glu, Gln, Ala, or an analog thereof
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is Ala, Gln, Asp, Asn, N-Me-Ala, N-Me-Gln, N-Me-Asp,
N-Me-Asn, or an analog thereof
<400> 28
Ile Xaa Xaa Xaa Val
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Glu, Gln, Ala, or Asp, or an analog
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is Ala, Gln, Asp, Glu, Asn, N-Me-Ala, N-Me-Gln, N-Me-Asp,
N-Me-Glu, N-Me-Asn, or an analog thereof
<400> 29
Ile Xaa Xaa Xaa Val
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 30
Lys Leu Ser Ser Ile Glu Thr Asp Val
1 5
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 31
Arg Leu Ser Gly Met Asn Glu Val Leu Ser Phe Arg Trp Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 32
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 33
Gly Ser Ser Ser Ser
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 34
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 35
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 36
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 37
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 37
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 38
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln
1 5 10
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 39
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro
1 5 10
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is an amino acid other than Tyr
<400> 40
Xaa Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 41
Phe Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 42
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 43
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 44
Gly Lys Lys Lys Lys Lys Gln Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 45
Gly Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 46
Ala Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 47
Gly Arg Lys Ala Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 48
Arg Lys Ala Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 49
Gly Arg Lys Lys Ala Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 50
Arg Lys Lys Ala Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 51
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Ala Arg Arg
1 5 10
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 52
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Ala Arg Arg
1 5
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 53
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Ala Arg
1 5 10
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 54
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Ala Arg
1 5
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 55
Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 56
Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 57
Arg Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ala Arg Arg
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 58
Arg Arg Arg Pro Arg Arg Arg Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 59
Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 60
Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg
1 5
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 61
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Thr Asp Val
20
<210> 62
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> D-amino acids
<400> 62
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Ser Asp Val
20
<210> 63
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> D-amino acids
<400> 63
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Ser Asp Val
20
<210> 64
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> D-amino acids
<400> 64
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Ser Asp Val
20
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> D-amino acids
<400> 65
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Ser Asp Val
20
<210> 66
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> D-amino acids
<400> 66
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Ser Ile Glu
1 5 10 15
Ser Asp Val
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> D-amino acids
<400> 67
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asp Val
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> D-amino acids
<400> 68
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ile Glu Ser Asp
1 5 10 15
Val
<210> 69
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> D-amino acids
<400> 69
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Thr Asp Val
20
<210> 70
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> D-amino acids
<400> 70
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Thr Asp Val
20
<210> 71
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> D-amino acids
<400> 71
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Thr Asp Val
20
<210> 72
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> D-amino acids
<400> 72
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Thr Asp Val
20
<210> 73
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> D-amino acids
<400> 73
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Ser Ile Glu
1 5 10 15
Thr Asp Val
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> D-amino acids
<400> 74
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ser Ile Glu Thr
1 5 10 15
Asp Val
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> D-amino acids
<400> 75
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Ile Glu Thr Asp
1 5 10 15
Val
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> D-amino acids
<400> 76
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ile Glu Ser Asp Val
1 5 10 15
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> D-amino acids
<400> 77
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ile Glu Thr Asp Val
1 5 10 15
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> D-amino acids
<400> 78
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Ser Asp Val
20
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> D-amino acids
<400> 79
Val Asp Ser Glu Ile Ser Ser Leu Lys Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Gly Tyr
20
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> D-amino acids
<400> 80
Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> D-amino acid
<400> 81
Leu Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 82
Ser Ser Ile Glu Ser Asp Val
1 5
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 83
Ser Ile Glu Ser Asp Val
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> D-amino acids
<400> 84
Lys Leu Ser Ser Ile Glu Thr Asp Val
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> D-amino acid
<400> 85
Leu Ser Ser Ile Glu Thr Asp Val
1 5
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 86
Leu Ser Ser Ile Glu Thr Asp Val
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 87
Ser Ser Ile Glu Thr Asp Val
1 5
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 88
Ser Ile Glu Thr Asp Val
1 5
<210> 89
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> D-amino acids
<400> 89
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile
1 5 10 15
Glu Ser Asp Val
20
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized
<400> 90
Lys Leu Ser Ser Ile Glu Ala Asp Ala
1 5
Claims (43)
- 플라스민에 의해 절단 가능하며 PSD-95를 억제하는 활성제 및 재관류를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 허혈을 갖거나 이의 위험이 있는 대상체 집단을 치료하는 방법으로서, 대상체 집단은
PSD-95를 억제하는 활성제, 및 기계적 재관류 또는 재관류를 수행하기 위한 혈관확장제 또는 고혈압제가 투여되는 대상체; 및/또는
PSD-95를 억제하는 활성제 및 재관류를 수행하기 위해 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, PSD-95를 억제하는 활성제는 혈전용해제보다 적어도 10분 전에 투여되는, 대상체를 포함하며,
대상체 집단은 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 투여 전 3시간 안에 또는 투여 후 10분 안에 투여되는 대상체가 결여되는, 방법. - 제1항에 있어서, 대상체가 허혈성 뇌졸중을 갖는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전 4시간 안에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제 후 10분 안에 투여되는 대상체가 결여되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전 8시간 안에 및 PSD-95를 억제하는 활성제 투여 후 10분 안에 투여되는 대상체가 결여되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제 투여 후 10분 안에 투여되는 대상체가 결여되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제 투여 후 20분 안에 투여되는 대상체가 결여되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제 투여 후 30분 안에 투여되는 대상체가 결여되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단에는 혈전용해제가 PSD-95를 억제하는 활성제 전에 또는 PSD-95를 억제하는 활성제 투여 후 60분 안에 투여되는 대상체가 결여되는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 집단은 PSD-95를 억제하는 활성제, 및 혈전용해제가 투여되지 않으면서 기계적 재관류가 투여되는 대상체를 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료 대상체의 집단이
(a) PSD-95를 억제하는 활성제, 및 혈전용해제 부재 하의 기계적 재관류, 혈관확장제 또는 고혈압제가 투여되는 대상체; 및
(b) PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, 혈전용해제는 PSD-95를 억제하는 활성제보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 120분 후에 투여되는 대상체로 구성되는, 방법. - 제10항에 있어서, 항목 (b)에 따른 대상체의 적어도 일부가 또한 기계적 재관류 투여되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 집단이 대상체가 뇌졸중 발병 후 3시간 안에 혈전용해제로 치료하기에 적격인 것으로 결정되는 경우 뇌졸중 발병보다 3 또는 4.5시간 초과 후에 혈전용해제가 투여되는 대상체를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 집단이 비강내 또는 경막내로 PSD-95를 억제하는 활성제가 투여되는 대상체를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 집단이 적어도 100명의 대상체를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 집단이 PSD-95를 억제하는 활성제가 10분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 20분에 투여되는 대상체를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 활성제가 모든 L-아미노산의 펩티드인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 활성제가 네린티드(nerinetide)인, 방법.
- 허혈성 뇌졸중에 대해 혈관내 혈전절제술을 받은 대상체 집단을 치료하는 방법으로서,
플라스민에 의해 절단가능하며 PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제 둘 모두를 대상체 일부에 투여하는 단계로서, 여기서 PSD-95를 억제하는 활성제는 혈전용해제보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 120분 전에 투여되는, 단계, 및
PSD-95를 억제하는 활성제 또는 혈전용해제를 집단의 다른 대상체에 투여하지만 둘 모두를 투여하지는 않는 단계를 포함하는, 방법. - 제18항에 있어서, PSD-95을 억제하는 활성제 및 혈전용해제를 투여받는 대상체가 대상체가 혈관내 혈전절제술을 받기 전에 그렇게 되는, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, PSD-95을 억제하는 활성제 또는 혈전용해제를 투여받으나 둘 모두를 투여받지는 않는 대상체가, 대상체가 혈관내 혈전절제술을 받기 전에 그렇게 되는, 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제 둘 모두를 투여받은 대상체에서, PSD-95를 억제하는 활성제가 혈전용해제보다 적어도 10분 전에 투여되며, PSD-95를 억제하는 활성제 또는 혈전용해제가 다른 대상체에 투여되는데, 둘 모두가 투여되는 것은 아닌, 방법.
- PSD-95를 억제하는 활성제 및 혈전용해제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 허혈을 갖거나 이의 위험이 있는 대상체 집단을 치료하는 방법으로서, 대상체 집단은
플라스민에 의해 절단가능하며 PSD-95를 억제하는 제1 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, PSD-95를 억제하는 제1 활성제는 혈전용해제보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 120분 전으로부터 선택되는 간격을 두고 투여되는, 대상체; 및
플라스민에 의한 절단에 내성인 PSD-95를 억제하는 제2 활성제 및 혈전용해제가 투여되는 대상체로서, 혈전용해제는 PSD-95를 억제하는 활성제 전 또는 후에 간격을 두고 투여되는, 대상체를 포함하는, 방법. - 허혈성 뇌졸중이 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서,
혈전용해제로 치료할 대상체의 적격성을 결정하는 단계;
플라스민에 의해 절단가능하며 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 단계; 및
그 후 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 120분에 혈전용해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 제23항에 있어서, PSD-95를 억제하는 활성제가 10분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 20분에 투여되는, 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 활성제가 모든 L-아미노산의 펩티드인, 방법.
- 제25항에 있어서, 활성제가 네린티드인, 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화가 허혈성 뇌졸중의 존재 및 뇌출혈의 부재를 결정하는, 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적격성이 허혈성 뇌졸중의 발병 후 3시간 안에 결정되고, 혈전용해제가 허혈성 뇌졸중의 발병 후 3시간을 초과하여 투여되는, 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적격성이 허혈성 뇌졸중 발병 후 4.5시간 안에 결정되고, 혈전용해제가 허혈성 뇌졸중 발병 후 4.5시간을 초과하여 투여되는, 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적격성이 허혈성 뇌졸중의 발병 후 3시간 안에 결정되고, 혈전용해제가 허혈성 뇌졸중의 발병 후 4.5시간을 초과하여 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, PSD-95를 억제하는 활성제가 C-말단에서 [E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L](SEQ ID NO:1) 또는 C-말단에서 X1-[T/S]-X2V(SEQ ID NO:2)을 포함하는 펩티드(여기서 [T/S]는 대체 아미노산이고, X1은 E, Q 및 A, 또는 이의 유사체 중에서 선택되고, X2는 A, Q, D, N, N-Me-A, N-Me-Q, N-Me-D 및 N-Me-N 또는 이의 유사체 중에서 선택됨) 및 펩티드의 N-말단에 연결된 내재화된 펩티드를 포함하는, 방법.
- 제31항에 있어서, PSD-95를 억제하는 활성제가 네린티드인, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 혈전용해제가 tPA인, 방법.
- 플라스민에 의해 절단 가능하며 PSD-95를 억제하는 활성제로 뇌졸중을 앓았던 대상을 치료하는 방법으로서, 활성제는
혈전용해제보다 적어도 10분 전에 투여되거나,
혈전용해제 투여보다 적어도 2, 3, 4시간 또는 그 초과 후에 투여되거나,
혈전용해제 없이 투여되는, 방법. - 제34항에 있어서, PSD-95를 억제하는 활성제가 10분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 20분에 투여되는, 방법.
- 제34항에 있어서, 활성제가 모든 L-아미노산의 펩티드인, 방법.
- 제35항에 있어서, 활성제가 네린티드인, 방법.
- 플라스민에 의해 절단 가능하며 PSD-95를 억제하는 활성제의 혈전용해제로의 분해를 최소화하는 방법으로서,
혈전용해제보다 적어도 10분 전에 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하거나,
혈전용해제 투여보다 적어도 2, 3, 4시간 또는 그 초과 후에 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하거나,
혈전용해제 없이 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하거나,
비강내 또는 경막내 투여에 의해 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 것을 포함하는, 방법. - 제38항에 있어서, PSD-95를 억제하는 활성제가 십분 기간에 걸쳐 투여되고, 혈전용해제가 활성제 투여 시작으로부터 적어도 20분에 투여되는, 방법.
- 제38항에 있어서, 활성제가 모든 L-아미노산의 펩티드인, 방법.
- 제38항에 있어서, 활성제가 네린티드인, 방법.
- 허혈성 뇌졸중을 치료하는 방법으로서, 허혈성 뇌졸중을 갖는 대상체에 플라스민에 의해 절단 가능하며 PSD-95를 억제하는 활성제를 투여하는 단계 및 활성제 투여 개시보다 20-40분 후에 혈전용해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제42항에 있어서, PSD-95를 억제하는 활성제는 10분의 기간에 걸쳐 억제되고 혈전용해제는 활성제 투여 개시보다 20-30분 후에 투여되는, 방법.
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